ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH T RƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ KIM LOAN SẢN XUẤT β - CYCLODEXTRIN BẰNG CGTASE CỐ ĐỊNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC TP HCM - 2009 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn TS TRẦN CÁT ĐÔNG tận tình giúp đỡ hướng dẫn em thực đề tài Xin cảm ơn tập thể phòng thí nghiệm Vi sinh công nghệ dược đặc biệt bạn VŨ THANH THẢO hết lòng giúp đỡ suốt thời gian qua Cảm ơn bạn BÙI HỮU TRUNG tạo điều kiện cho thực đề tài thời gian lưu lại trường Khoa Học Tự Nhiên Cảm ơn bố mẹ, gia đình suốt thời gian qua động viên giúp đỡ hoàn thành đề tài Và cuối cảm ơn người xung quanh nhắc nhỡ động viên giúp đỡ nhiều để hoàn thành tốt báo cáo Xin cảm ơn tất i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG LỜI MỞ ĐẦU i ii iv vii ix Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Tổng quan Cyclodextrin 10 1.1.1 Tên gọi [10] 10 1.1.2 Công thức [10, 23] 10 1.1.3 Cấu trúc 11 1.1.4 Tính chất 12 1.1.5 Một số dẫn xuất cyclodextrin [7, 9, 19] 15 1.1.6 Sản xuất β-CD [9, 23, 25] 15 1.1.7 Ứng dụng Cyclodextrin [8, 9, 23] 19 1.1.8 Tình hình nghiên cứu nước 24 1.2 Tổng quan enzym CGTase [7, 20] 25 1.2.1 Enzym 4-a-Glucanotransferase 25 1.2.2 Tác động 4-a-glucanotranferase [7, 19, 20, 23] 26 1.2.3 Phân loại 4-a-glucanotranferase [7, 15] 26 1.3 Tổng quan enzym cố định 32 1.3.1 Khái niệm enzym cố định [15, 22] 32 1.3.2 Đặc điểm enzym cố định [15, 26] 32 1.3.3 Các ưu nhược điểm enzym cố định [15] 33 1.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến cố định enzym [4] 34 1.3.5 Các phương pháp cố định enzym [15, 21, 22] 35 1.3.6 Vật liệu cố định enzym [15, 21] 43 1.3.7 Reactor (Bình phản ứng) [1] 48 1.3.8 Ứng dụng enzym cố định [1, 17] 48 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51 2.1 Bước cố định enzym CGTase 51 2.1.1 Vật liệu 51 2.1.2 Phương pháp 52 2.2 Bước xác định hàm lượng hoạt tính CGTase cố định 61 2.2.1 Phương pháp Bradford [12] 61 ii 2.2.2 Phương pháp Kaneko 62 2.2.3 Xác định hoạt tính tái sử dụng E sau cố định 66 2.3 Bước sản xuất β-CD [5] 66 2.3.1 Các giai đoạn sản xuất 66 2.3.2 Định lượng β-CD 67 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 70 3.1 Bước cố định CGTase 70 3.1.1 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford 70 3.1.2 Xác định hoạt tính chế phẩm Toruzyme® 3.0L 71 3.1.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định CGTase EuC 72 3.1.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định Sepharose 83 3.1.5 Khảo sát thông số cố định CGTase Chitosan 86 3.1.6 Khảo sát hiệu suất tái sử dụng CGTase cố định EuC 91 3.2 Bước sản xuất β-CD 91 3.3 Bàn luận 93 3.3.1 Đối với bước cố định 93 3.3.2 Đối với bước sản xuất β-CD 93 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 94 4.1 Kết luận 94 4.1.1 Đối với bước cố định 94 4.1.2 Đối với bước sản xuất β-CD 94 4.2 Đề nghị 94 4.2.1 Đối với bước cố định 94 4.2.2 Đối với bước sản xuất β-CD 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CD Cyclodextrin α -CD α-Cyclodextrin β-CD β -Cyclodextrin γ-CD γ –Cyclodextrin 4αG 4α glucanotransferase CGTase Cyclodextrin glucanotransferase HP-β-CD Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin SEM Scaning electron microscope BSA Bovine serum Albimin MOS Maltooligosacharide TMED Tetramethyleneethylenediamine EuC Eupergit C HEMDA Hexamethylenediamine iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc α, β γ-cyclodextrin 11 Hình 1.2 Cấu trúc thứ cấp β-CD 11 Hình 1.3 Cyclodextrin tạo phức với phân tử ngoại lai 14 Hình 1.4 Tóm tắt quy trình sản xuất cyclodextrin dùng dung môi 17 Hình 1.5 Quy trình sản xuất cyclodextrin không dùng dung môi 19 Hình 1.6 Cyclodextrin tạo phức với thuốc ứng dụng ngành dược 20 Hình 1.7 Enzym CGTase từ Bacillus 25 Hình 1.8 Enzym CGTase tạo loại cyclodextrin từ tinh bột 27 Hình 2.1 Sơ đồ bước cố định CGTase EuC theo phương pháp hấp phụ 53 Hình 2.2 Sơ đồ bước hoạt hóa EuC theo phương pháp cộng hóa trị 55 Hình 2.3 Sơ đồ bước cố định CGTase EuC họat hóa theo phương pháp cộng hóa trị 55 Hình 2.4 Sơ đồ bước cố định CGTase sepharose theo phương pháp hấp phụ 56 Hình 2.5 Sơ đồ bước cố định CGTase Chitosan theo phương pháp hấp phụ 58 Hình 2.6 Sơ đồ bước cố định CGTase Chitosan theo phương pháp cộng hóa trị 61 Hình 2.7Sơ đồ bước sản xuất β-CD 69 Hình 3.1 Độ hấp thu theo nồng độ albumin 70 Hình 3.2 Đường chuẩn độ hấp thu theo nồng độ protein 71 Hình 3.3 Độ hấp thu theo nồng độ β-CD 71 Hình 3.4 Đường chuẩn độ hấp thu theo nồng độ theo β-CD 72 Hình 3.5 Hiệu suất cố định EuC theo thời gian, tỷ lệ chất mang/enzym, pH cố định 75 Hình 3.6 Hiệu suất hoạt tính cố định EuC theo thời gian, tỷ lệ chất mang/enzym, pH cố định 76 Hình 3.7 Hiệu suất cố định theo độ pH thời gian lắc với tỷ lệ chất mang/enzym 1.1 phương pháp cộng hóa trị EuC 77 v Hình 3.8 Hiệu suất hoạt tính cố định theo độ pH thời gian lắc với tỷ lệ chất mang/enzym 1.1 phương pháp cộng hóa trị EuC 79 Hình 3.9 Hiệu suất cố định theo phương pháp cố định thời gian lắc với nồng độ đệm la` 0.1M EuC 81 Hình 3.10 Hiệu suất hoạt tính cố định theo phương pháp cố định thời gian lắc với nồng độ đệm 0,1M EuC 82 Hình 3.11 EuC trước cố định (a), sau cố đinh hấp phụ (b) cộng hóa trị (c) 83 Hình 3.12 Hiệu suất cố định Sepharose theo độ pH, thời gian lắc loại Sepharose 84 Hình 3.13 Hiệu suất hoạt tính cố định Sepharosetheo độ pH, thời gian lắc, loại Sepharose 86 Hình 3.14 Sepharose trước (a) sau (b) cố định 86 Hình 3.15 Hiệu suất cố định Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm thời gian lắc 87 Hình 3.16 Hiệu suất hoạt tính cố định Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm thời gian lắc 89 Hình 3.17 Chitosan trước (a) sau (b) cố định, Hình (b) hình bên trái làchitosan cố định theo phương pháp hấp phụ, hình bên phải chitosan cố định theo phương pháp cộng hóa trị 90 Hình 3.18 β-CD trước (trái) sau (phải) chưng cất lọc 92 Hình 3.19 β-CD Rhodia (a) β-CD sản xuất 92 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt tính chất vật lý cyclodextrin quan trọng 12 Bảng 1.2 Một số tính chất cấu trúc CD 13 Bảng 1.3 Các tác nhân dùng sản xuất cyclodextrin quy trình dung môi 17 Bảng 1.4 Một số dạng chế phẩm có sử dụng CD 21 Bảng 1.5 Tính chất enzym CGTase số chủng 28 Bảng 1.6 Một số tính chất sepharose 47 Bảng 2.1 Cách pha giai mẫu cho đường chuẩn xác định nồng độ protein 61 Bảng 2.2 Cách pha giai mẫu cho đường chuẩn định lượng β-CD 63 Bảng 2.3 Cách pha giai mẫu cho trình xác định hoạt tính enzym 64 Bảng 3.1 Độ hấp thu theo nồng độ albumin 70 Bảng 3.2 Nồng độ protein ban đầu dựa theo đường chuẩn 71 Bảng 3.3 Độ hấp thu theo nồng độ β-CD 71 Bảng 3.4 Hoạt tính riêng chế phẩm enzym 72 Bảng 3.5 Hiệu suất cố định EuC theo thời gian, tỷ lệ chất mang/enzym, độ pH 74 Bảng 3.6 Hiệu suất hoạt tính cố định EuC theo thời gian, tỷ lệ chất mang/enzym, pH pH cố định 75 Bảng 3.7 Hiệu suất cố định EuC theo độ pH thời gian lắc với tỷ lệ chất mang/enzym 1.1 phương pháp cộng hóa trị 76 Bảng 3.8 Hiệu suất hoạt tính cố định theo độ pH thời gian lắc với tỷ lệ chất mang/enzym 1.1 phương pháp cộng hóa trị EuC 77 Bảng 3.9 Hiệu suất cố định theo phương pháp cố định thời gian lắc với nồng độ đệm 0.1M EuC 80 Bảng 3.10 Hiệu suất hoạt tính cố định theo phương pháp cố định thời gian lắc với nồng độ đệm 0,1M EuC 81 Bảng 3.11 Hiệu suất cố định Sepharose theo độ pH, thời gian lắc loại Sepharose 84 Bảng 3.12 Hiệu suất hoạt tính cố định Sepharosetheo độ pH, thời gian lắc, loại Sepharose 85 vii Bảng 3.13 Hiệu suất cố định Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm thời gian lắc 87 Bảng 3.14 Hiệu suất hoạt tính cố định Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm thời gian lắc 88 Bảng 3.15 Hiệu suất hoạt tính sau lần tái sử dụng CGTase cố đinh EuC 91 Bảng 3.16 Hiệu suất sản xuất hiệu suất thu trung bình β-CD 92 viii LỜI MỞ ĐẦU Trên giới, cyclodextrin ứng dụng từ lâu nhiều lĩnh vực đa dạng cấu trúc đặc biệt chúng Trong công nghiệp thực phẩm dùng để che giấu mùi, vị khó chịu, để ổn định bảo vệ thành phần chức acid amin, vitamin thực phẩm, làm phụ gia độn, tạo độ nhớt,… Trong mỹ phẩm chúng dùng để tạo dạng hương liệu, nước hoa có mùi bền, Trong công nghiệp hóa CD ứng dụng việc tách chiết đồng phân quang học, làm cột sắc ký hay giá mang phản ứng Đối với ngành dược CD tá dược quan trọng giúp tăng độ tan dược chất không tan nước, giúp tăng độ hấp thu sinh khả dụng kiểm soát tốc độ phóng thích thuốc, giúp che dấu mùi, vị khó chịu nhiều hoạt chất Tuy nhiên, tá dược đắt tiền phải nhập ngoại hoàn toàn.[11, 16, 18, 24] Việc sản xuất CD thực cách chuyển hóa tinh bột với xúc tác enzym cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) Nhưng sản xuất β-CD theo phương pháp cổ điển dùng enzym tự sản phẩm không đảm bảo độ tinh Mặt khác, việc sử dụng CGTase theo phương pháp cổ điển sử dụng enzym lần gây lãng phí Do việc cố định CGTase giá mang giúp tiết kiệm chi phí sản xuất (tăng ổn định khả thu hồi enzym) β-CD thu tinh khiết (enzym không lẫn vào sản phẩm) mà hướng nhiều tiềm tiếp cận mặt công nghệ kỹ thuật, công nghệ enzym Việc sản xuất β-cyclodextrin nước giúp tự chủ nguồn nguyên liệu làm thuốc tạo điều kiện để công nghiệp dược phẩm nước ứng dụng bào chế chế phẩm có chất lượng cao, cạnh tranh với sản phẩm ngoại nhập Mặt khác, nguyên liệu để sản xuất β-cyclodextrin từ tinh bột giúp tạo giá trị gia tăng cho tinh bột, qua thúc đẩy phát triển ngành công nghiệp chế biến nông sản ix Khóa luận thạc sĩ sinh học (a) Kết bàn luận (b) (c) Hình 3.11 EuC trước cố định (a), sau cố đinh hấp phụ (b) cộng hóa trị (c) 3.1.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định Sepharose Tiến hành cố định CGTase vật liệu Q-Shephaose SP-Sepharose với nồng độ đệm 20 mM; pH đệm 6, 7, 8; thời gian lắc 2h, 4h, 6h; 25oC Võ Thị Kim Loan 83 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận Bảng 3.11 Hiệu suất cố định Sepharose theo độ pH, thời gian lắc loại Sepharose Thời Loại gian Sepharose pH Q 2h SP Q 4h SP Q 6h SP Lượng protein ban đầu (mg) Lượng protein không cố định (mg) Lượng protein cố Hiệu suất cố định (mg) định (%) 7,17 4,74 2,43 33,86 7,17 3,09 4,08 56,86 7,17 3,92 3,25 45,36 7,17 3,51 3,66 51,11 7,17 2,68 4,49 62,62 7,17 3,30 3,87 53,99 7,17 3,71 3,46 48,24 7,17 2,27 4,90 68,37 7,17 2,68 4,49 62,62 7,17 3,30 3,87 53,99 7,17 1,65 5,52 76,99 7,17 1,86 5,31 74,12 7,17 4,95 2,22 30,98 7,17 3,51 3,66 51,11 7,17 4,33 2,84 39,61 7,17 3,09 4,08 56,86 7,17 1,86 5,31 74,12 7,17 2,47 4,70 65,49 Hiệu suất cố định (%) 90.00 80.00 70.00 2h.Q 60.00 4h.Q 50.00 6h.Q 40.00 2h.SP 30.00 4h.SP 20.00 6h.SP 10.00 0.00 Độ pH Hình 3.12 Hiệu suất cố định Sepharose theo độ pH, thời gian lắc loại Sepharose Võ Thị Kim Loan 84 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận Kết hiệu suất hoạt tính cố định Bảng 3.12 Hiệu suất hoạt tính cố định Sepharosetheo độ pH, thời gian lắc, loại Sepharose Loại Shepharose Họat tính riêng CGTase ban Họat tính riêng CGTase Hiệu suất hoạt đầu (U/mg) sau cố định (U/mg) tính cố định (%) 59,54 4,10 6,89 59,54 6,31 10,59 59,54 6,11 10,27 59,54 1,46 2,45 59,54 5,17 8,69 59,54 5,36 9,00 59,54 2,76 4,64 59,54 4,18 7,01 59,54 4,12 6,92 59,54 1,04 1,74 59,54 3,59 6,03 59,54 2,99 5,02 59,54 2,56 4,30 59,54 3,81 6,39 59,54 3,37 5,66 59,54 0,45 0,76 59,54 2,97 4,98 59,54 2,02 3,39 pH Q 2h SP Q 4h SP Q 6h Hiệu suất hoạt tính cố định (%) SP 12.00 2h.Q 10.00 4h.Q 8.00 6h.Q 6.00 2h.SP 4h.SP 4.00 6h.SP 2.00 0.00 Độ pH Võ Thị Kim Loan 85 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận Hình 3.13 Hiệu suất hoạt tính cố định Sepharosetheo độ pH, thời gian lắc, loại Sepharose Nhận xét chung: - Đối với loại Shepharose hiệu suất cố định SP (76,99%) lại hẳn Q (68,37%), hiệu suất hoạt tính lại thấp (của Q 10,59%, SP 7,06%), đặc tính đặc biệt Q SP - Đối với pH pH7 pH tốt - Đối với thời gian lắc hiệu suất cố định sau 4h tốt (76,99%) hiệu suất hoạt tính sau 2h (10,59%) tốt tác động vật lý làm giảm hoạt tính enzym => Như cố định Sepharose điều kiện thích hợp độ pH đệm 7, lắc 25oC 2h với Q-Sepharose Nhưng hiệu suất thấp nhiều so với cố định EuC Nên Sepharose không chọn làm chất mang thích hợp để cố định CGTase Hình 3.14 Sepharose trước (a) sau (b) cố định 3.1.5 Khảo sát thông số cố định CGTase Chitosan Quá trình cố định Chitosan khảo sát thông số sau - Phương pháp cố định hấp phụ (hp) cộng hóa trị (cht) - Thời gian lắc ngày, ngày, ngày - pH đệm 6, 7, Kết hiệu suất cố định Võ Thị Kim Loan 86 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận Bảng 3.13 Hiệu suất cố định Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm thời gian lắc Thời gian Phương pháp Lượng protein ban pH đầu (mg) cố định Lượng protien Lượng protein không cố định cố định được (mg) (mg) Hiệu suất cố định (%) 7,17 5,67 1,50 20,92 7,17 5,52 1,65 23,03 Ngày 7,17 6,43 0,74 10,37 7,17 5,37 1,80 25,14 7,17 5,07 2,10 29,35 7,17 5,44 1,73 24,08 7,17 5,75 1,42 19,86 7,17 5,22 1,95 27,25 Ngày 7,17 5,52 1,65 23,,03 7,17 5,29 1,88 26,19 7,17 4,69 2,48 34,63 7,17 5,07 2,10 29,35 7,17 5,59 1,58 21,97 7,17 4,08 3,09 43,06 Ngày 7,17 4,91 2,26 31,46 7,17 3,93 3,24 45,17 7,17 3,33 3,84 53,61 7,17 4,23 2,94 40,95 hp cht hp cht hp cht Hiệu suất cố định (%) 60.00 50.00 Ngày 1.hp 40.00 Ngày 2.hp Ngày 3.hp 30.00 Ngày 1.cht 20.00 Ngày 2.cht Ngày 3.cht 10.00 0.00 Độ pH Hình 3.15 Hiệu suất cố định Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm thời gian lắc Võ Thị Kim Loan 87 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận Kết hiệu suất hoạt tính Thời Phương pháp Họat tính riêng CGTase ban Họat tính riêng CGTase Hiệu suất hoạt gian cố định đầu (U/mg) sau cố định (U/mg) tính cố định (%) 59,54 13,49 22,66 59,54 16,32 27,41 Ngày 59,54 14,47 24,30 59,54 9,60 16,12 59,54 13,22 22,20 59,54 11,70 19,64 59,54 7,45 12,51 59,54 9,83 16,51 Ngày 59,54 6,41 10,77 59,54 6,14 10,31 59,54 7,33 12,31 59,54 5,93 9,95 59,54 6,72 11,29 59,54 8,36 14,04 Ngày 59,54 6,38 10,71 59,54 5,90 9,91 59,54 6,46 10,85 59,54 4,24 7,11 hp cht hp cht hp cht pH Bảng 3.14 Hiệu suất hoạt tính cố định Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm thời gian lắc Võ Thị Kim Loan 88 Hiệu suất hoạt tính cố định (%) Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận 30.00 25.00 Ngày 1.hp 20.00 Ngày 2.hp Ngày 3.hp 15.00 Ngày 1.cht 10.00 Ngày 2.cht Ngày 3.cht 5.00 0.00 Độ pH Hình 3.16 Hiệu suất hoạt tính cố định Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm thời gian lắc Nhận xét - Cũng cố định chất mang trước, phương pháp cộng hóa trị Chitosan có hiệu suất cố định cao (53,61%) đến lúc biểu hoạt tính lai thấp phương pháp hấp phụ (27,41%) - pH đệm thích hợp pH - Thời gian lắc đến ngày thứ có lẽ hoạt tính giảm tác động vật lý thời gian dài ảnh hưởng đến trung tâm hoạt động enzym, hoạt tính vào ngày cao => Cố định Chitosan thích hợp dùng dung dịch đệm pH7, thời gian lắc ngày theo phương pháp hấp phụ Tuy nhiên hiệu suất hoạt tính cố định thấp so với cố định EuC Nên Chitosan không chọn cho bước sản xuất β-CD (a) Võ Thị Kim Loan (b) 89 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận Hình 3.17 Chitosan trước (a) sau (b) cố định, Hình (b) hình bên trái làchitosan cố định theo phương pháp hấp phụ, hình bên phải chitosan cố định theo phương pháp cộng hóa trị => Như ta chọn quy trình tối ưu cho bước sản xuất β-CD là: Cố định EuC với đệm phosphate 1M pH7 lắc 25oC thời gian ngày theo phương pháp hấp phụ Võ Thị Kim Loan 90 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận 3.1.6 Khảo sát hiệu suất tái sử dụng CGTase cố định EuC Thu kết sau Bảng 3.15 Hiệu suất hoạt tính sau lần tái sử dụng CGTase cố đinh Số lần tái sử dụng Hoạt tính riêng enzym Hiệu suất hoạt tính so với sau cố định (U/mg enzym) lần (%) 59,17 100 50,29 85 44,97 76 30,18 51 14,20 24 EuC Nhận xét - Sau lần tái sử dụng hoạt tính CGTase 50%, hiệu suất tái sử dụng cao - Hiệu suất tái sử dụng giảm nhiều có lẽ CGTase chưa gắn chặt vào chất mang, phương pháp hấp phụ phần làm hoạt tính enzym 3.2 Bước sản xuất β-CD Tiến hành theo bước mục 2.3.1 với: - Tinh bột sử dụng bột sắn mì - Điều kiện phản ứng: pH7, nhiệt độ 25oC, thời gian phản ưng120 - Thành phần 100 ml phản ứng: tinh bột sắn mì 8,5 g, 1g enzym cố định, dung môi cyclohexan 30 ml Võ Thị Kim Loan 91 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận Hình 3.18 β-CD trước (trái) sau (phải) chưng cất lọc Hình 3.19 β-CD Rhodia (a) β-CD sản xuất Thu kết sau Bảng 3.16 Hiệu suất sản xuất hiệu suất thu trung bình β-CD Mẫu Lượng β-CD thu (g) ∆OD Hiệu suất β-CD Hiệu suất sản thu (%) xuất (%) 2,65 0,186 40,09 12,50 3,25 0,217 46,77 17,88 3,08 0,194 41,81 15,15 42,89 15,18 Trung bình Nhận xét - Hiệu suất β-CD thu không cao (42,89%) hoạt tính enzym giảm nhiều so với enzym tự - Hiệu suất sản xuất thấp chứng tỏ trình chiết tách chưa tốt làm lượng lớn β-CD Võ Thị Kim Loan 92 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết bàn luận 3.3 Bàn luận Kết thực không cao nguyên nhân sau: 3.3.1 Đối với bước cố định - Điều kiện tiến hành không giống tài liệu tham khảo Enzym tài liệu tham khảo dạng bột không đủ điều kiện hóa chất nên sử dụng enzym dạng lỏng Khi dạng lỏng, nồng độ enzym bị pha loãng nên làm giảm khả tiếp xúc enzym với chất mang nên làm giảm khả cố định - Đối với EuC bỏ qua bước khảo sát nhiệt độ điều kiện thí nghiệm, 25oC chưa phải nhiệt độ tối ưu - Đối với Sepharose điều kiện thí nghiệm chưa khảo sát đầy đủ yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định, dựa vào tài liệu tham khảo chọn quy trình tối ưu Có thể quy trình chưa tối ưu 3.3.2 Đối với bước sản xuất β-CD - Do enzym cố định nên bước dịch hóa tinh bột diễn thời gian dài làm giảm chất lượng tinh bột ảnh hưởng đến hiệu sản xuất β-CD - Hexan có lẽ chưa đủ để lôi kéo hết dung môi làm ảnh hưởng đến độ tinh sản phẩm Võ Thị Kim Loan 93 Khóa luận thạc sĩ sinh học Kết luận đề nghị Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thực xong đề tài rút kết luận sau 4.1.1 Đối với bước cố định - Thử nghiệm loại chất mang thu kết sau: Đối với EuC đạt hiệu suất cố định cao 84,04 % hiệu suất hoạt tính cố định cao 59,17%, với Sepharose tương ứng 76,99% 10,59%, với Chitosan 53,61% 27,41% EuC với hiệu tái sử dụng 50% sau lần dùng xứng đáng chất mang chọn cho bước sản xuất β-CD - pH thích hợp pH7 - Thời gian tùy thuộc vào loại chất mang EuC Chitosan ngày, Sepharose 4h - Nồng độ đệm loại đệm tùy thuộc vào chất mang EuC 1M Chitosan Sepharose 0,1M - Phương pháp hấp phụ phương pháp thích hợp 4.1.2 Đối với bước sản xuất β-CD - Hiệu suất β-CD thu 42,89% hiệu suất sản xuất 15,18% - Thu hồi sản phẩm phương pháp đông khô - Dùng Hexan chất loại dung môi với thể tích 50 ml 4.2 Đề nghị 4.2.1 Đối với bước cố định - Cần nghiên cứu khảo sát điều kiện tối ưu enzym dạng bột - Khảo sát thêm yếu tố khác ảnh hưởng đến trình cố đinh CGTase Võ Thị Kim Loan 94 Khóa luận thạc sĩ sinh học - Kết luận đề nghị Nghiên cứu thêm loại chất mang khác thích hợp với CGTase dể đạt hiệu cố định cao 4.2.2 Đối với bước sản xuất β-CD - Tìm thêm chất khác hexan để loại dung môi hiệu - Cần tìm thêm cách thu hồi sản phẩm tinh rẻ tiền áp dụng quy mô công nghiệp Võ Thị Kim Loan 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đồng Thanh Thu in Giáo trình sinh hóa 2004, Tủ sách ĐH Khoa Học Tự Nhiên p 100-110 Tài liệu tiếng Anh [2] bioscience, Amersham Q Sepharose™ High Performance and SP Sepharose High Performance 2002 Wilstroms, Sweden: p 1-10 [3] Katchalski-Katzir, Ephraim, Dieter M Kraemer Eupergitw C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2000 10: p 157-176 [4] a., Biwer, G Antranikian, E.Heizle Enzymatic production of cyclodextrins Appl Microbiol Biotechnol 2002 59(6): p 609-617 [5] Bucker, Christopher Methods in biotechnology Humana Press, Totowa, new jersey, 1999: p 89-101 [6] C.A., SOBRAL KELI, REGINA M.O RODRIGUES, ROGE’RIO D DEOLIVERIA immobillization of Cyclodextringlycosyltransferase (CGTase) from Bacillus firmus in Comerical Chitosan Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2002 44: p 383-386 [7] E.Harding, Stephen Biotechnology & genetic engineering reviews Intercept Ltd, 1999: p 529-550 [8] Feynman, Richard Cyclodextrin and Nanotechnology CyclolabCyclodextrin research, 2005 [9] H.Kibbe, Arthur Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association anh Pharmaceutical Press, 2000: p 165168 [10] H.Kibby, Arthur Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association anh Pharmaceutical Press, 2000: p 165168 [11] Hitoshi, Hashimoto Present Status of Industrial Application of Cyclodextrins in Japan Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 2002 44: p 57-62 [12] J., Kurger Nicholas The Bradford Method for Protein Quantitan, John M Walker, Editor 1996, Humana Press New Jersye [13] K.A., Sobral, R.O Rodrigues, R.D Oliveia Evaluation of support and methods for immobillization of enzyme cyclodextrintransferase Appl Biochem Biotechnol 2003 105-108: p 809-819 [14] Knezevic, Zorica, Nenad Milosavic, Dejan Bezbradica, et al Immobilization of lipase from Candida rugosa on Eupergit® C supports by covalent attachment Biochemical Engineering Journal, 2006 30(269-278) [15] M., Guisan Jose, John M Walker Immobilization of Enzymes and Cell ed Methods in Biotechnology Humana Press, 2006 [16] M., Kata, Haragh L., Pintye-Hodi K Production and investigating of tablets containing furosemide and beta-cyclodextrin Acta Pharm Hung 1990 60(1): p 40-45 [17] Mart, M Teresa, Francisco J Plou Immobilization on Eupergit C of cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) and properties of the immobilized biocatalyst Jounal of Molecular Catalysis, 2003: p 299308 [18] Q, Qi, Zimmermann W Cyclodextrin glucanotransferase: from gene to applications Appl Microbiol Biotechnol 2005 66(5): p 476-485 [19] Singh, Mamata, Rohit Sharma Biotechnological applications of cyclodextrin Biotechnology Advances, 2002: p 341-359 [20] Tonkava, Alexandra Bacterial cyclodextrin glucanotransferase Enzyme and Microbial Technoloty, 1998: p 678-686 [21] V., Nedovic, R Willaert Applications of Cell Immobilisation Biotechnology 2005 [22] Wilhelm, Tischer, Frank Wedekind Immobilized Enzymes: Methods and Application Topics in Curent Chemistry, 1999 [23] Wimmer, Thomas cyclodextrin in Ulmann’s Encylopedia of Inductrial Chemistry Wiley-VCH Verlag, 2004 [24] Z., Li, Wang M., Wang F gamma-Cyclodextrin: a review on enzymatic production and applications Appl Microbiol Biotechnol, 2007 [25] A.Biwer, G.Antranikian, E.Heinzle Enzymatic production of cyclodextrin Apple Microbiotic Biotechnol, 2002 59: p 609-617 [26] Andreas, Kirschning Immobilized Catalysts Topics in Curent Chemisty, 2005 [...]... α-cycloamylose, α-dextrin, cyclohexaamylose, cyclomaltohexose - - Cyclodextrin: betadex, - cycloamylose, - dextrin, cycloheptaamylose, cyclomaltohepto, cycloheptaagglucan - γ -Cyclodextrin: cyclooctaamylose 1.1.2 Công thức [10, 23] - α -Cyclodextrin: C36H60O30, phân tử lượng: 972,85 - - Cyclodextrin: C42H70O35, phân tử lượng: 1135,00 - γ -Cyclodextrin: C48H80O40, phân tử lượng 1297,14 x Khóa luận thạc... b-CD, tuy nhiên các dẫn xuất có cải thiện về độ tan trong nước và giảm độc tính so với CD Dẫn xuất của CD được chia thành các nhóm chính sau -CD-OH àCD-O-R Với R – akyl, hydroxyalky (ether) R=acyl(ester) R = glycosyl R – SO3, PO3 -CD –OHàCD-X Với X – I, Br X – NH2, NHR, NH2 X= SH, SR -CD-CH2-OHàCD-CO2H Oxi hoá ở C6 1.1.6 Sản xuất - CD [9, 23, 25] CD được sản xuất bằng cách phân giải tinh bột với CGTase. .. tiến hành đề tài Sản xuất - CD bằng CGTase cố định nhằm khảo sát các loại chất mang, các phương pháp cố định khác nhau v.v để đạt hiệu quả tối ưu nhất cho quá trình sản xuất Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Cyclodextrin 1.1.1 Tên gọi [10] - Cyclodextrin: oligosaccharide vòng, cycloamylose, glucan vòng, Schardinger dextrin - α -Cyclodextrin: alfadex, α-cycloamylose, α-dextrin, cyclohexaamylose,... hydro Sự ổn định của phức phụ thuộc vào đặc tính kỵ nước của phân tử lạ Các phân tử phân cực mạnh tạo thành phức yếu 1.1.5 Một số dẫn xuất của cyclodextrin [7, 9, 19] Bằng cách thay thế hoặc gắn thêm các nhóm chức vào vị trí của các nhóm hydroxyl trên bề mặt của b-CD Người ta thu được các dẫn xuất như dimethylb-CD, 2-hydroxylethyl-b-CD, 2-hydroxypropyl-b-CD, 3-hydroxypropyl-b-CD, trimethyl-b-CD…Vai trò... 60 b-CD 88 4, 5-4 ,7 45 b-CD Bacillus coagulans A-147 - 6,5 65 b-CD Bacillus coagulans 36 6,5 65 b-CD 71 7,0 6 0-6 ,2 b-CD Bacillus ohbensis - 5,5 50 b-CD Bacillus subtilis 64 8,0 65 b-CD Thermoanaerobacterium 68 55 50 b-CD Thermosulfurigenes EMI 68 4, 5-7 ,0 8 0-8 5 b-CD 110 9,0 55 b-CD Alkalophilus ATCC 21783 Bacillus halophilus INMIA 3849 Bacillus agaradhaerens LS-3C 1.2.3.2 4aGTase loại II (D-enzym hay amylomaltase)... vai trò của nhóm enzym 4-a-glucanotransferas (1,4-a-D-glucan, 1-4 -aD-glucan, 4-a-D-glucanotranferase, viết tắt là 4Gtase-a) Đây là nhóm enzym liên quan đến chuyển hoá a-1, 4-glucan mà chức năng của chúng rất khác nhau và ít được hiểu biết cặn kẽ Các enzym này bẽ gãy liên kết a-1,4 và chuyển phần glucan thu được đến một phân tử nhận thông qua một liên kết a-1,4 Hình 1.7 Enzym CGTase từ Bacillus Võ Thị... γ-CD trên quy mô công nghiệp, một enzym γ -CGTase chuyên biệt được phát triển Võ Thị Kim Loan 16 Khóa luận thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu Bảng 1.3 Các tác nhân dùng sản xuất cyclodextrin trong quy trình dung môi α-CD - CD 1-decanol Tricycloethylene Toluen Cyclohexan Ethanol n-butanol γ-CD Bromobenzen α-napthol Cyclohexadec-8-enzym-1-on Dịch tinh bột (làm nóng) CGTase Dung môi Enzym chuyển hóa Tạo phức... oxytaca,…… Các bước trong quá trình sản xuất CD: - Hồ hóa tinh bột - Thuỷ phân tinh bột với amylase - Cho tinh bột phản ứng với CGTase - Bất hoạt enzym bằng nhiệt - Tách CD ra khỏi hỗn hợp phản ứng - Tinh chế và kết tinh CD từ nước Về mặt công nghệ có 2 cách sản xuất CD là dùng dung môi và không dùng dung môi 1.1.6.1 Sản xuất cyclodextrin dùng dung môi Thường thì CGTase tạo ra cả 3 loại CD trong dung... loại I (CGTase) Định nghĩa Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, 1m4-a-D-glucan: 1,4a- Dglucacotran-nferase, EC 2.4.1.19) là enzym duy nhất có khả năng chuyển hoá tinh bột và các chất tương tự thành hỗn hợp cyclodextrin với các mức độ Võ Thị Kim Loan 26 Khóa luận thạc sĩ sinh học Tổng quan tài liệu polyme hoá từ 6,7 và 8 đơn vị glucose (ứng với a-CD, b-CD v g-CD) và các dextrin khử Hầu hết các CGTase. .. quan tài liệu α -Cyclodextrin - Cyclodextrin γ -Cyclodextrin Công thức C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40 Khối lượng phân tử 9712,85 1135,00 1297,14 14,5 1,85 23,2 Độ ẩm(%) 10,2 1 3-1 5 8-1 8 [α]D20 +150,5 +162,0 177,4 Điểm chảy, oC 25 0-2 60 25 5-2 65 24 0-2 45 pKa (25oC) 12,331 12,202 12,081 Độ tan (25oC, g/ml H2O) 1.1.4.2 Tính chất hóa học [9, 23] CD là các oligosaccharid dạng vòng không có tính khử Bằng cách oxi ... hin vai trũ ca nhúm enzym 4-a-glucanotransferas (1,4-a-D-glucan, 1-4 -aD-glucan, 4-a-D-glucanotranferase, vit tt l 4Gtase-a) õy l nhúm enzym liờn quan n chuyn hoỏ a-1, 4-glucan m chc nng ca chỳng... sn xut cyclodextrin quy trỡnh dung mụi -CD -CD 1-decanol Tricycloethylene Toluen Cyclohexan Ethanol n-butanol -CD Bromobenzen -napthol Cyclohexadec-8-enzym-1-on Dch tinh bt (lm núng) CGTase Dung... cyclomaltohexose - -Cyclodextrin: betadex, -cycloamylose, -dextrin, cycloheptaamylose, cyclomaltohepto, cycloheptaagglucan - -Cyclodextrin: cyclooctaamylose 1.1.2 Cụng thc [10, 23] - -Cyclodextrin: