CHƯƠNG VI-DI TRUYỀN HỌC VI KHUẨN (8 tiết) BSTY Nguyễn Xuân Hòa – PGS TS Phạm Hồng Sơn -Tóm tắt: Trong thời gian dài, nghiên cứu di truyền học tiến hành sinh vật nhân thực (Eukaryote), vi khuẩn (Prokaryote) chưa cho sinh sản hữu tính Tuy nhiên vào năm 40, tái tổ hợp vi khuẩn chứng minh Những nghiên cứu biến nạp, tải nạp giao nạp có ý nghĩa quan trọng cho phát triển di truyền học phân tử góp phần xây dựng kỹ thuật lắp gép gen Những kiển thức di truyền học vi khuẩn viết tóm tắt với hình ảnh minh họa sinh động 26 trang phục vụ cho tiết giảng -Mục tiêu: Sinh viên cần nắm khái niệm, chế, điều kiện để xẩy tượng biến nạp, tải nạp giao nạp nghiên cứu di truyền vi khuẩn Về đặc tính di truyền biến dị vi khuẩn người học cần nắm vững, tượng biến dị hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc Nguyên nhân biểu đột biến vi khuẩn Di truyền: đặc tính chung sinh vật, giữ lại truyền cho cháu đặc điểm cấu tạo phát triển tổ tiên Biến dị: đặc tính chung sinh vật, mang khác biệt nhiều chi tiết so với bố mẹ chúng với cá thể khác loài Đối tượng nghiên cứu di truyền học tượng di truyền mà biến dị Tính biến dị đặc tính độc lập với tính di truyền thực ra, khác biệt cá thể loài nhiều trường hợp liên quan đến biến đổi sở vật chất di truyền sinh vật Ở vi sinh vật, biến dị thể mức độ lớn sinh vật bậc cao, nhờ số cá thể quần thể lớn, sinh sản đồng loạt, giai đoạn sinh dưỡng ngắn, tần số đột biến tần số tái tổ hợp cao có khả trao đổi di truyền loài Dù chế xuất biến dị di truyền nữa, phần lớn trường hợp tạo thích ứng tốt với điều kiện ngoại cảnh Người ta phân biến dị làm hai loại, biến dị kiểu gen biến dị kiểu hình Biến dị kiểu hình: thích ứng toàn quần thể có kiểu gen Hiệu biến dị hoạt động gen, lệ thuộc vào điều kiện cụ thể ngoại cảnh Sự biến dị này, đảo ngược lại, không bền tính di truyền Biến dị kiểu gen hay đột biến: thay đổi đột ngột tính chất, mà tính chất di truyền Giữa quần thể đồng nhất, người ta thấy xuất bất thường biến chủng, nghĩa cá thể khác, di truyền cho hệ sau tính chất khác với type bình thường Toàn hệ sau, sinh từ cá thể độc hình thành chủng II CƠ SỞ VẬT CHẤT DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN [1] 2.1 ADN nhiễm sắc thể, ARN protein Cũng sinh vật khác, vi sinh vật giống tổ tiên hầu hết đặc điểm qua nhiều hệ Đơn vị thông tin di truyền gen Gen đoạn ADN đảm nhiệm chức định trình truyền thông tin di truyền Ở vi khuẩn, thông tin di truyền nằm ADN, số loại virus, thông tin di truyền nằm ARN Phần lớn gen nằm nhân tế bào, gặp gen nằm nhiễm sắc thể Plasmid (Plasmid F, Plasmid R, ) Mọi sinh vật, trừ số virus, dòng thông tin di truyền từ nhiễm sắc thể đến tế bào chất diễn sau: 114 ADN → ARN → Protein Bản chất tượng di truyền ADN ARN có khả tự nhân lên, trình gọi trình tự chép Sau ADN dùng để làm khuôn tổng hợp ARN trình phiên mã Một số loại virus thông tin di truyền nằm ARN để lắp genom thân vào NST tế bào chủ, virus phải tổng hợp ADN trung gian từ sợi khuôn ARN Quá trình gọi trình phiên mã ngược, cuối cùng, sinh tổng hợp protein diễn phức hợp bao gồm sợi mARN, ribosom 2.1.1 Sao chép (tự sao) [2] Là trình tổng hợp vật chất di truyền (ADN vi sinh vật ARN số virus) Về trình chép ADN tế bào vi sinh vật giống Nhưng trình nghiên cứu chi tiết vi khuẩn E coli Gen vi khuẩn E coli sợi ADN kép, đóng vòng kín Sao chép bắt đầu gốc (Oric) diễn liên tục kết thúc Một đơn vị chất di truyền có khả tự chép từ đầu đến cuối gọi replicon Sau số protein nhận điểm gốc Oric, hai sợi ADN tách thành hai chạc chép, ADN tổng hợp theo hai hướng đối Sao chép E coli diễn sau: Một số protein nhận gốc Oric cởi xoắn Hai phân tử helicase gắn vào hai đoạn sợi đơn tiếp tục cởi xoắn Các protein liên kết sợi đơn (SSB) tiếp với hai đoạn sợi đơn sau helicase Trên sợi khuôn 3/-5/ primase tổng hợp ngòi nhất, sau pol-III lắp tiếp nucleotid vào đầu 3/-OH ngòi Sợi chép liên tục gọi sợi dẫn đầu Trên sợi khuôn đối diện, primase phải tổng hợp nhiều ngòi, pol-III lắp tiếp nucleotit vào đầu 3/-OH ngòi lại tạo thành đoạn ADN khoảng 1000-2000 nucleotit gọi đoạn Okazaki Pol-I cắt bỏ ngòi đồng thời chép bổ sung đoạn Okazaki đứng sau Enzyme ligase ''hàn'' chỗ hỗng đoạn Okazaki Như sợi tạo thành sợi khuôn 5/-3/ chép theo kiểu gián đoạn gọi sợi muộn 115 2.1.2 Phiên mã Quá trình phiên mã diễn theo hướng /- 3/ Ở E coli enzyme xúc tác cho trình phiên mã ba loại ARN ARN- polymerase gồm có chuỗi peptide: 2α; β; β/; σ (xích ma), chuỗi đầu gắn chặt với (2αββ/) có hoạt tính polymerase gọi enzyme tối thiểu Chuỗi σ gắn lỏng lẻo vào enzyme tối thiểu, hướng dẫn enzyme gắn chặt xác vào vị trí mở đầu gen (promotor) Khác với chép, phiên mã diễn sợi, chí đoạn sợi khuôn ADN Hơn ARN-polymerase không cần ngòi hoạt tính nuclease Phiên mã E coli diễn sau: Nhờ sợi ''dẫn đường'' yếu tố σ (xích ma) ARN-polymerase gắn vào vị trí promoto sợi khuôn ADN cởi xoắn Phiên mã bắt đầu Nucleotit thứ ATP GTP gắn vào chuỗi β Sau phiên mã khoảng 12 nucleotit, σ tách khỏi phức hợp để lại liên kết với enzyme tối thiểu khác Khi phiên mã xong, gen ARN-polymerase gặp hai tín hiệu kết thúc sau đây: -Tín hiệu mạnh: không cần yếu tố protein bổ sung cấu tạo dạng cặp tóc -Tín hiệu yếu: có cấu trúc dạng cặp tóc thiếu đoạn oligo (U) cần yếu tố protein Rho; Rho nhận gắn vào đoạn ARN sợi đơn, thủy phân ATP di động đến tách tách ARN khỏi phức hợp Sự mở đầu phiên mã E coli, bị kìm hãm chất kháng sinh rifamixin chất liên kết cạnh tranh vào vị trí gắn nucleotit chuỗi β Đáng ý chức phiên mã, yếu tố σ có vai trò điều hòa hoạt động gen Chẳng hạn, E coli , yếu tố σ70 (do có trọng lượng 70000 kDa) làm nhiệm vụ hướng dẫn việc phiên mã gen điều kiện bình thường Tuy nhiên điều kiện bị sốc nhiệt (tăng nhiệt độ nuôi từ 37-420C) tế bào tổng hợp yếu tố β β32 (32000kDa)- liên kết với enzyme tối thiểu bình thường (2αββ/σ32) hướng dẫn enzyme gắn vào promoto gen sốc nhiệt Kết 17 protein sốc nhiệt HSP (heart shock protein) tạo thành, protein có chức bảo vệ enzyme chống lại biến tính nhiệt Sự tạo thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtillis cạn chất dinh dưỡng coi biều sốc khác Trong điều kiện Bacillus subtillis tổng hợp yếu tố σ có vai trò việc tạo thành nội bào tử 116 Ở tế bào nhân thật kể vi sinh vật, tồn ARN-polymerase : pol I gặp hạch nhân (tổng hợp rARN lớn), pol II gặp dịch nhân tổng hợp tiền tARN, pol III gặp dịch nhân tổng hợp tARN số ARN nhỏ khác Ty thể chứa ARNpolymerase riêng 2.1.3 Dịch mã [3] Cũng chép phiên mã, dịch mã diễn tế bào giống nghiên cứu kỹ E coli Tham gia vào trình có ba thành phần chính: Ribosom, mARN, tARN Ở E coli (và bào quan ty thể, lục lạp) ribosom thuộc loại 70S, phân li thuận nghịch thành hai hạt nhỏ 30S, 50S Hạt 50S chứa 34 protein hai loại rARN (23S 5S), hạt 30S chứa 21 protein loại rARN (16S) Trên ribosom có hai vị trí gắn tARN: vị trí A gắn acid amine-tARN vị trí P gắn vào peptidil-tARN ARN gồm 70-90 nucleotit, chứa nhiều base cải biến (dihydro, pseudotioridin, ), có cấu trúc chẻ ba với cuống thùy, gọi DHU (Dihydro Uridin), AC (Anticodon) TψX Vì acid amine mở đầu metionin nên tế bào cần hai loại tARN: vận chuyển Met mở đầu chuỗi vận chuyển Met chuỗi Met mở đầu chuỗi , sau gắn với tARN, phải focmin hóa (nhờ enzyme transformilase) thành focmin-metioniltARN Vì tARN mở đầu dịch mã tARN chuyển Met vào chuỗi ký hiệu ARNfMet ARNmMet Trước tham gia vào tổng hợp protein acid amine phải hoạt hóa qua hai phản ứng enzyme aa-tARRN-sinterase: acid amine + ATP → aa∼ AMP + PP aa∼ AMP + tARN→ aa∼ tARN +AMP Như nói trên, khác với tế bào nhân thật, mARN E coli chóp m7G ' đầu (guanin methyl hóa cacbon số 7) đuôi poly A (có khoảng 100-200 base adenin) đuôi 3' Hơn nữa, tế bào nhân thật, mARN monocystron (chỉ đọc mã cho chuỗi polypeptide) vi khuẩn, kể E coli, mARN polcystron (đọc mã lớn chuỗi polypeptide) Điều đáng ý vi khuẩn mARN thường không gặp dạng nguyên vẹn, phiên mã sợi khuôn ADN, ribosom gắn 117 vào đầu 5' mARN để tiến hành tổng hợp protein Nghĩa là, tế bào nhân nguyên thủy, phiên mã dịch mã diễn đồng thời không gian thời gian Có thể chia trình dịch mã làm ba chặng: mở đầu, kéo dài kết thúc a, Mở đầu Tham gia vào chặng thành phần kể có ba yếu tố protein gọi yếu tố mở đầu: IF-1, IF-2, IF-3 Trước hết, nhờ kích thích IF-3, mARN liên kết với hạt ribosom 30 (trước IF-3 liên kết với ribosom 30S không cho ribosom 50S liên kết tùy tiện với ribosom 30S) Tiếp theo phức hợp fMet-ARNfMet dạng phức hợp (fMet-ARNfMet-IF-2-GTP) chuyển vào vị trí P (gắn vào peptidin) hạt 30S ứng với codon mở đầu AUG metionin Nhưng bên mARN có nhiều codon AUG khác Vậy riêng fMet-tARN với codon AUG tương ứng chưa đủ tín hiệu mở đầu cho dịch mã Shine Dalgarno nhận thấy đầu 5/ mARN đầu 3/ rARN 16S có 3-9 nucleotit ghép đôi với Nhờ đoạn ghép đôi mà codon AUG chuyển xác vào vị trí mở đầu, IF3 bị tách Vai trò IF-1 chưa rõ có mặt cần cho tác dụng IF-2 Sau fMet-ARNfMet gắn xác vào vị trí mở đầu hạt 50S liên kết tiếp vào thành monosom 70S đồng thời GTP bị thủy phân IF-2, lượng thủy phân dùng để đẩy IF-1 IF-2 Kết phức hợp mở đầu tạo thành: (70S-mARNfMet-ARNfMet) thành." b, Kéo dài Ngoài thành phần biết, chặng cần protein bổ sung gọi yếu tố kéo dài EF-T EF-G Riêng yếu tố T lại gồm protein, Tu Ts, liên kết lỏng lẻo với Từ acid amine thứ hai trở đi, liên kết aa-ARN vào ribosom cần kích thích Tu GTP phức hợp [aan-ARN-Tu-GTP] Trước hết [aa2-ARN-Tu-GTP] gắn vào vị trí A (acid amine) với codon tương ứng Rồi (tương tự chặng mở đầu), GTP bị thủy phân Tu Tu-GTP bị đẩy Liên kết peptide thứ hình thành -COOH acid amine thứ (Met) với -NH2 acid amine thứ hai Để dịch mã tiếp tục, phức hợp [fMet-aa2- tARN] phải từ vị trí A chuyển vị trí P đồng thời đẩy tARNfMet trống Sau phức hợp [aa3-tARN-Tu-GTP] lại sẵn sàng vào vị trí A bước diễn kết thúc c, Kết thúc Sau tổng hợp xong chuỗi polypeptide, ribosom gặp codon kết thúc codon vô nghĩa (không mã hóa acid amine) UAA, UAG, UGA Chuỗi polypeptide tách khỏi ARN Tiếp theo ribosom 70S bị phân li với ARNt Điều đáng ý là, dịch mã invivo không diễn monosom 70S đơn độc mà diễn đồng thời nhóm ribosom liên kết cạnh tranh với sợi tARN gọi polysom Hơn sau tổng hợp số acid amine, nhánh focmin nhiều trường hợp nhánh metionin, bị cắt khỏi chuỗi Hầu hết chất kháng sinh thông dụng kìm hãm tổng hợp protein ribosom 70S, 80S hai Ở tế bào nhân thật acid amin mở đầu metionin không cần formin hóa Hơn dịch mã ribosom 80S bị kìm hãm chất độc điển hình, độc tố bạch hầu tiết Điều đáng ngạc nhiên hệ thống miễn dịch tế bào vi khuẩn cổ lại có đặc điểm giống với tế bào nhân thật (acid amine mở đầu metionin không cần formin hóa, không bị kìm hãm chloramphenicol mà độc tố bạch hầu) 118 2.2 Khái niệm phân loại Plasmid[5] Khái niệm: nhiều loại sinh vật, vi khuẩn vi sinh vật đơn bào, hệ gen có nhiều gen chịu trách nhiệm tổng hợp nhiều loại sản phẩm khác cho trình sống, sinh trưởng phát triển chúng Điều đặc biệt có nhiều gen quan trọng vi khuẩn lại không nằm hệ gen chúng mà định vị ADN vòng tách biệt, nằm rải rác nguyên sinh chất vi khuẩn gọi plasmid Plasmid phân tử ADN, có cấu trúc khép lại thành vòng tròn độc lập, có khả tồn nhân lên cách độc lập với hệ gen tế bào chủ tương tác, hoạt động vững bền với tế bào chủ Giữa chúng hệ gen tế bào chủ có tương tác cộng sinh chi phối lẫn Do plasmid loại vi khuẩn thích nghi với loại vi khuẩn Tương tự, vi khuẩn tiếp nhận plasmid mà chúng tế bào chủ loại plasmid Trong nhiều trường hợp plasmid tái tổ hợp với nhiễm sắc thể gọi episom Một vài phage coi plasmid, xét mặt cấu trúc, chúng ADN vòng khép kín, độc lập, xét mức độ cộng sinh (tức hai bên có lợi) phage không đáp ứng yêu cầu Phage xâm nhập vào vi khuẩn tồn thời gian ngắn đủ để chúng nhân lên sau phá hủy tế bào chủ mà chúng xâm nhập Rồi tiếp tục gây nhiễm tế bào khác Vì chúng plasmid theo nghĩa Plasmid có vai trò quan trọng lĩnh vực y, sinh, nông, dược môi trường, chúng có chức đa dạng tối cần thiết Chúng chủ nhân chứa gen sản xuất kháng sinh, đồng thời chủ nhân gen sản xuất sản phẩm kháng lại kháng sinh Ở số vi sinh vật gây bệnh cho người động vật, chúng chủ nhân số gen sản xuất loại độc tố protein có hoạt tính cao có chức tăng cường độc lực cho vi khuẩn Nhiều plasmid có lợi ví dụ plasmid có vi khuẩn cố định nốt sần họ đậu, có khả tạo cho vi khuẩn nốt sần thu nhận nitơ khí trời để sản xuất protein Plasmid có loại chứa gen sản xuất kháng sinh mà tận dụng để sản xuất kháng sinh chữa bệnh cho người động vật Rất nhiều loại protein chứa gen sản xuất loại men đặc biệt để phân giải hợp chất hữu độc, chất thải công nghiệp, hóa chất, thuốc trừ sâu, chất sát trùng, Xét mặt chuyển giao gen môi trường, plasmid phương tiện linh hoạt, vận chuyển ADN từ cá thể sang cá thể khác Người ta coi plasmid phương tiện dẫn truyền gen thiên nhiên Khai thác đặc tính sinh học plasmid, ngày plasmid ứng dụng cách rộng rãi công nghệ sinh học di truyền Nhiều loại plasmid (chủ yếu E coli ) thu nhận từ nhiên nhiên, thiết kế lại gen sử dụng plasmid dẫn truyền Phân loại plasmid: dựa vào nhiều phương pháp khác để phân loại plasmid Một phân loại phổ biến dựa vào đặc tính plasmid mà thành viên nhóm có đặc tính chung tương đối Có thể tạm thời chia làm nhóm plasmid chính: Nhóm plasmid R: loại plasmid chứa hay nhiều gen có khả sản xuất loại men có khả phân giải kháng sinh thành sản phẩm vô hoạt Như plasmid Col: loại plasmid chứa gen sản xuất kháng sinh colicin giúp cho vi khuẩn chống lại vi khuẩn khác Plasmid F: quy định tổng hợp pili giới tính cho vi khuẩn Vận chuyển tái tổ hợp thông tin di truyền [7] Ở tế bào nhân thật thụ tinh, gen đơn bội kết hợp với tạo thành hợp tử lưỡng bội Qua trình nguyên phân liên tiếp, hợp tử diễn tái tổ hợp 119 hai gen hay hình thành bắt chéo, xẩy nhiễm sắc thể tương đồng tiếp hợp Trong trình này, nhiễm sắc thể đứt nối điểm tương ứng Vì nguyên liệu di truyền trao đổi nhiễm sắc tử với Trao đổi chéo kiện ngẫu nhiên dẫn đến tái tổ hợp di truyền làm nẩy sinh hệ gen Trao đổi chéo xẩy nơi nhiễm sắc thể, nói chung có hai ba bắt chéo hình thành nhiễm sắc thể người tình tạo giao tử Các giao tử chứa tổ hợp gen gọi kiểu tái tổ hợp với giảm phân (phân bào giảm nhiễm) thành gen đơn bội (giao tử) Tái tổ hợp tế bào nhân nguyên thủy có điểm khác với tế bào nhân thật (vì vi khuẩn luôn tế bào đơn bội) Hợp tử chúng sản phẩm kết hợp tế bào Thường phần phân tử ADN chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận, xuất hợp tử phần ADN tế bào nhận phần ADN tế bào cho ghép đôi trao đổi đoạn Khi phân chia nhân phân bào xuất tế bào chứa nhiễm sắc thể tái tổ hợp Tùy theo cách vận chuyển ADN, ta phân biệt ba kiểu vận chuyển tính trạng di truyền vi khuẩn: chuyển nạp, tải nạp tiếp hợp, sau ADN chuyển, tế bào nhận diễn tái tổ hợp ADN tế bào cho lắp vào ADN tế bào nhận (thể tái tổ hợp) 5.1 Chuyển nạp Chuyển nạp biến đổi genotyp vi khuẩn, ảnh hưởng ADN nhận từ vi khuẩn cho ADN thể dung dịch tự do, chiết rút từ vi khuẩn sang vi khuẩn nhận, can thiệp nhân tố cấu trúc nhiễm sắc thể, epixom phage, vi khuẩn vectơ Như nòi vi khuẩn bị biến đổi mặt di truyền tiếp thu mảnh ADN vi khuẩn thuộc nòi khác Có hai loại chuyển nạp: chuyển nạp tự nhiên chuyển nạp nhân tạo +Chuyển nạp tự nhiên: tượng chuyển nạp xẩy nuôi cấy vi khuẩn điều kiện bình thường +Chuyển nạp nhân tạo: nhiều vi khuẩn nuôi cấy biều kiện bình thường không xẩy chuyển nạp Nhưng ủ tế bào dung dịch cation hóa trị hai với nồng độ cao xẩy tượng chuyển nạp Hiện hai hệ thống chuyển nạp tự nhiên nghiên cứu sâu thể khác biệt Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Loại Streptococcus pneumoniae coi điển hình cho kiểu chuyển nạp tự nhiên vi khuẩn Gram dương Haemophilus influenzae điển hình cho kiểu chuyển nạp tự nhiên vi khuẩn Gram âm Tuy nhiên, thực tế không hẳn Việc nghiên cứu chuyển nạp tự nhiên plasmid cho thấy khác biệt chế chuyển nạp không thiết tương ứng với tính chất vách tế bào 5.1.1 Những thí nghiệm F Griffith chuyển nạp 1928 Đối tượng nghiên cứu ông vi khuẩn Staphylococcus pneumoniae (sách cũ viết Diplococcus pneumoniae), song cầu khuẩn Gram dương, gây bệnh viêm phổi Khả gây bệnh vi khuẩn phụ thuộc vào vỏ nhầy Phế cầu khuẩn tồn hai kiểu hình dạng khuẩn lạc bóng láng S dạng nhám xù xì R nuôi cấy môi trường đặc Những tế bào S có độc hại, bao bọc giáp mô cấu tạo polysaccharit, hình thành khuẩn lạc bóng láng (S=Smooth) Những tế bào không độc, giáp mô, hình thành khuẩn lạc nhám xù xì (R=Rough) Mỗi type có tính di truyền, vi khuẩn nhân lên cách sinh dưỡng bảo tồn tính trạng đặc biệt nhiều hệ Trong thí nghiệm Griffith dùng vi khuẩn S R để tiêm truyền cho chuột 120 5.1.2 Thí nghiệm in vitro tượng chuyển nạp Nhiều nhà nghiên cứu sau xác minh kết Griffith Quan trọng chuyển nạp in vitro tế bào R thành S Người ta nuôi cấy tế bào R ống nghiệm chứa tế bào S bị giết chết nhiệt Sau canh khuẩn người ta tìm thấy tế bào S sống với tế bào chết cho vào lúc đầu Như vậy, chất chứa tế bào S chết có khả làm biến đổi yếu tố di truyền tế bào R, người ta gọi chất nhân tố chuyển nạp 121 5.1.3 Bản chất nhân tố chuyển nạp [5] Bản chất nhân tố chuyển nạp Avery, MacLeod McCaty làm sáng tỏ năm 1941 Trong công trình nghiên cứu chất có khả ức chế hoạt động nhân tố chuyển nạp, họ chứng minh nhân tố chuyển nạp ADN Người ta dùng chất tinh chế từ ADN vi khuẩn S cho tác động đến vi khuẩn R thấy: số vi khuẩn R biến thành vi khuẩn S cho vào tế bào rời ADN xử lý deoxyribonucease, enzyme làm tan rã ADN không thấy tượng chuyển nạp Đây thay đổi đặc hiệu, nghĩa tổn thương genotyp tế bào để thâm nhập phân tử ADN tế bào thuộc genotyp khác Những thành phần phân tử lớn khác vi khuẩn protein, hoạt tính chuyển nạp Như ADN có hoạt động di truyền đặc hiệu, vật chất di truyền Chỉ cần nồng độ nhỏ (vài µg/ml ADN tinh khiết để tiến hành chuyển nạp Người ta chứng minh rằng, số lượng vi khuẩn chuyển nạp, tỷ lệ thuận với nồng độ ADN có nồng độ bảo hòa Như ADN có đặc tính di truyền nguyên liệu vectơ tính trạng di truyền Cấu trúc thứ cấp ADN cho thấy rõ tính đặc hiệu di truyền trình tự bazơ bố trí theo chiều dài mạch ADN 122 5.1.4 Điều kiện để có chuyển nạp -Vi khuẩn cần chuyển nạp, phải tình trạng sinh lý đặc biệt, trạng thái tiếp thu (khoảng 10-15% tế bào quần thể, thông thường giai đoạn sinh trưởng giảm) Đó trạng thái sinh lý giao thời cần thiết cho kết hợp ADN để sau xâm nhập vào hệ gen Đó tính trạng di truyền, xuất điều kiện nuôi cấy định, thay đổi tùy theo loài vi khuẩn (pH, nhiệt độ, thăng ion, khuấy lắc, ) Sự thay đổi thành tế bào điều kiện cần thiết cho xâm nhập ADN -Kích thước số lượng ADN: tượng chuyển nạp xẩy với đoạn ADN có trọng lượng phân tử vừa phải, từ 105-107 Các đoạn nhỏ 105 lớn 107 khả chuyển nạp Mỗi đoạn ADN chuyển nạp tương đương với đoạn 1/200-1/500 hệ gen tế bào cho Có nghĩa phải chia nhỏ chuỗi ADN tế bào cho 200-500, đoạn nhỏ đoạn có khả chuyển nạp -Sự phân tích tượng chuyển nạp cho thấy độ 50 mảnh ADN vi khuẩn kết hợp để biến nạp cho tính trạng Số lượng tương đương với số lượng mảnh ADN có phân tử lượng 1x107 nhân giải phóng vi khuẩn dung giải -Nghiên cứu khả chuyển nạp Haemophilus vi khuẩn có khả tiếp nhận chừng 10 đoạn ADN chuyển nạp Và thế, người ta nghĩ bề mặt tế bào nhận có thụ thể (receptor) tiếp nhân cách chọn lọc -Số lượng tính trạng truyền tùy thuộc vào bố trí gen tương ứng nhiễm sắc thể Mỗi mảnh ADN có phân tử lượng 1x107 chứa vài chục gen khác vi khuẩn chứa vài nghìn gen -Thành phần môi trường ảnh hưởng đến tần số chuyển nạp Ví dụ có albumin phosphat môi trường làm tăng tần số chuyển nạp, trái lại cazein làm giảm tần số chuyển nạp - Nhiệt độ thích hợp 29-32 0C 123 5.1.6 Ứng dụng chuyển nạp nghiên cứu di truyền học Hiện tượng chuyển nạp phương tiện phân tích di truyền Nó cho phép định vị đồ di truyền nòi vi khuẩn, vùng nhỏ gen định tính trạng Người ta làm vô hoạt cách gây đột biến nhiều enzyme vi khuẩn tái tổ hợp cách chuyển nạp Chuyển nạp cho phép nghiên cứu đặc tính chức vi khuẩn mà nghiên cứu tiếp hợp được, tượng chuyển nạp phát kiểm soát gen hình thành giáp mô, đề kháng với kháng sinh, nghiên cứu trình hình thành nha bào, đặc tính cố định nitơ phân tử vi khuẩn Rhizobium, Hiện tượng chuyển nạp có tầm quan trọng to lớn sinh học cho phép xác định tổng hợp protein đặt kiểm soát ADN Nó mở đường cho di truyền hóa học Cho thấy đột biến có biến đổi ADN Nhờ tượng chuyển nạp mà người ta nghiên cứu cấu trúc gen biết rằng: gen chưa phải đơn vị nhỏ vật chất di truyền Trong gen có locus khác, loại locus xác định dấu hiệu mà gen xác định, vị trí khác gen, locus tái tổ hợp trình chuyển nạp Với vi khuẩn Gram dương thuộc chi Bacillus Streptomyces việc sử dụng thể nguyên sinh chất để chuyển nạp có ý nghĩa thực tế rõ rệt Ơ vi khuẩn hấp thụ ADN plasmid cảm ứng với polyetilenglicol thực qua thể nguyên sinh chất thiếu vách, hay trường hợp chuyền ADN nhiễm sắc thể qua dung hợp trực tiếp thể nguyên sinh chất Các thể nguyên sinh chất dung hợp kết hợp gen hai tế bào bố mẹ, tái sản thành tế bào nguyên vẹn điều kiện thực nghiệm xác định Các thể tái tổ hợp xuất từ dung hợp mang tính trạng hai bố mẹ nhờ trình tái tổ hợp tương đồng Gần đây, phương pháp xung điện có hiệu cao đưa vào sử dụng Phương pháp tạp cho màng sinh học dễ thấm dễ dung hợp nhờ kích thích điện trường, ứng dụng cho tế bào nhân thật lai tế bào thực vật Tuy nhiên nhiều ADN plasmid vi khuẩn Gram dương gram âm chuyển nạp nhờ xung điện 125 Ngày tượng chuyển nạp ứng dụng nhiều sinh học phân tử, đặc biệt trình đưa vectơ tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli tượng chuyển nạp giúp gắn kết đoạn gen vào tế bào vi khuẩn để từ phát tính chất đoạn gen Nhờ tượng chuyển nạp nên phát chất tượng kháng kháng sinh vi khuẩn 5.2 Tải nạp[9] 126 Tải nạp truyền mảnh nhỏ nguyên liệu di truyền, từ vi khuẩn vi khuẩn nhận qua vài trung gian phage vi khuẩn (thực khuẩn thể: Bacteriophage) gọi phage vectơ phage tải nạp Muốn hiểu tượng cần phải biết chất chu kỳ nhân lên phage vi khuẩn trình sinh tan, hoàn toàn khác trình tải nạp có kết hợp với 5.2.1 Khái niệm phage vi khuẩn vi khuẩn sinh tan Phage vi khuẩn phage mảnh có tính chất virus mức độ phân hóa sâu sắc hơn, hòa tan vi khuẩn Phage phân bố rộng rãi tự nhiên, nước cống, ruột, phân nơi có vi khuẩn sinh sôi nẩy nở Phage độc hay phage hoạt động, có khả hòa tan nhanh chóng vi khuẩn non sống Chúng hấp phụ bề mặt vi khuẩn cách đặc hiệu Có thể quan sát dung giải vi khuẩn môi trường lỏng, cách cho hỗn dịch phage đặc hiệu vào canh khuẩn nước thịt dinh dưỡng ủ vài Môi trường trở nên sáng hoàn toàn Trên môi trường đặc, dung giải phage biểu hiện: có vùng nhỏ sáng, vệt vô khuẩn, chứa triệu mảnh phage 5.2.1.1 Phage độc- chu kỳ dung giải Những phage độc phage T2, T3, T4, T5 phá hủy nhanh chóng cấu trúc nhiễm sắc thể, ADN chúng thâm nhập vào tế bào vi khuẩn, vỏ bọc protein chúng độc cho vi khuẩn Trộn phage tỷ lệ thích hợp với lượng canh khuẩn nước thịt 127 non, cấy vi khuẩn cảm ứng điều kiện định chúng phát triển cho chu kỳ dung giải hoàn toàn, bao gồm hình thành hàng trăm mảnh phage mới, dẫn tới dung giải tất vi khuẩn mà chúng gây nhiễm Chu kỳ dung giải gồm giai đoạn sau a- Sự hấp thụ (đặc hiệu) phage thành vi khuẩn qua đầu mút đuôi Sự hấp thụ tiến hành có điều kiện thuận lợi môi trường, có số yếu tố cần thiết acid amine, b- Sự xâm nhập phage vào vi khuẩn theo chế sau Lovop (A Lwoff) Sau trình hấp thụ, endolizim đầu mút đuôi phage, xuất dãy trùng hợp mucopolysaccharit thành vi khuẩn Những sản phẩm thủy phân mucopolysaccharit khởi động co giãn ống cấu tạo loại protein co giản gần miozin (mỗi phage có 110 phân tử ATP) Ống chọc thủng màng vi khuẩn xâm nhập vào bào tương ADN truyền qua ống thâm nhập vào vi khuẩn, màng virion tồn bên không đóng vai trò nhân lên phage Phage mang thông tin di truyền đến nhiễm sắc thể vi khuẩn, làm đứt phá hủy nhiễm sắc thể vi khuẩn, làm sai lệch chuyển hóa tế bào vi khuẩn hướng tế bào vào tổng hợp ADN protein thuộc thân phage Phage hệ thống enzyme lượng vật ký sinh bắt buộc tế bào chủ c- Thời kỳ sinh dưỡng: thời kỳ nhân lên phage, gồm có hai giai đoạn: - Giai đoạn (biến mất) Trong vài phút đầu thời kỳ sinh dưỡng, vi khuẩn không chứa virion (lõi ADN phage), người ta lấy lizozim để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn thấy dịch dung giải không chứa mảnh ADN gây nhiễm Khi phage bắt đầu nhiễm vào, vi khuẩn ngừng sinh trưởng, tổng hợp ADN vi khuẩn ngừng lại Sau nhiễm phage 2-3 phút, nhiễm sắc thể vi khuẩn bị deoxyribonuclease làm tan rã Thông tin di truyền vi khuẩn bị phá hủy Những acid nucleic phage không bị phá hủy chứng tỏ chúng có sai khác khác với acid nucleic vi khuẩn Tỷ lệ = 0,55 ADN phage T2 (5'H- 5-Hydroximetylxitozin bazơ không bình thường virus dọc mã tổng hợp nên tương ứng Cytosin) Trái lại tỷ lệ = ADN E coli Người ta thấy phân tử thứ tổng hợp hệ thống vi khuẩnphage ARN type phage có tỷ lệ = 0,55 -Giai đoạn hình thành virion: đến phút thứ 12 sau xâm nhập, sợi ADN phage tổng hợp ngưng tụ lại Protein phage xếp xung quanh sợi ADN này, làm hình thành mảnh virus thành thục, vi khuẩn trở thành túi nhỏ chứa 12g phage thành thục Phage tiết endolizin phá hủy thành tế bào d- Sự dung giải vi khuẩn: phá hủy thành tế bào làm cho vi khuẩn vỡ bị dung giải, phage giải phóng gây nhiễm vi khuẩn khác Phage độc giết tất vi khuẩn mà chúng nhiễm vào - Sự ký sinh bắt buộc phage: phage hoàn toàn thông tin di truyền cho tổng hợp hệ thống enzyme cần thiết cho cung cấp lượng Nó thông tin di truyền với enzyme cần thiết cho tổng hợp chất chuyển hóa chủ yếu Như phải sử dụng lượng chất chuyển hóa chủ yếu vật chủ, hệ thống enzyme tồn tiếp tục hoạt động sau bị nhiễm phage, gen vật chủ cần thiết cho tổng hợp đại phân tử protein bị phá hủy Như vi khuẩn sinh sản protein vi khuẩn nữa: hệ thống vi khuẩn phage sinh sản 128 nguyên liệu phage Người ta thấy phage tất virus vật ký sinh nội bào Như tải nạp đóng vai trò trong: - Lan truyền độc tính - Lan truyền kháng nguyên thân - Nâng cao khả tổng hợp chất, yếu tố sinh trưởng 5.2.1.2 Phage ôn hòa-sự sinh tan Một phage ''ôn hòa'' đủ hoạt lực để làm dung giải tất vi khuẩn trộn với mảnh phage Một số vi khuẩn sống sót, tác động phage ôn hòa trở thành vi khuẩn sinh tan Nhóm phage gồm có phage P P2 nhiễm vào vi khuẩn E coli, Shigella dysenteriae, phage P22 Salmonella typhi murium, phage λ E coli K12 Như vi khuẩn sinh tan có truyền cho hệ khả sinh sản phage tượng gây nhiễm Một vi khuẩn sinh tan chứa phage Quá trình sinh tan - Tiền phage: trình sinh tan, ADN phage đoạn lại tái tổ hợp vào vùng đặc hiệu NST vi khuẩn Sau hấp thụ vi khuẩn, tự lại nhanh chóng phân tán vi khuẩn để theo chu kỳ dung giải, hệ gen phage lại tái tổ hợp vào NST vật chủ thâm nhập vào tồn dạng tiền phage vài phút sau xâm nhập Tiền phage (tiền thực khuẩn thể) thực khuẩn thể hoàn chỉnh mà genotype phage thành phần liên tục NST vi khuẩn Tiền phage lại (nhân đôi) lúc với NST vi khuẩn truyền sang tế bào nhiều hệ liên tiếp Những vi khuẩn tiếp thu đặc tính dung túng tiền phage NST chúng trì khả sản sinh phage cho hệ sau gọi sinh tan Phần lớn vi khuẩn sinh tan nhân lên không sản sinh phage tự trì tính sinh tan Chỉ có số sản sinh phage thành thục bị dung giải (102-106 cho hệ) Mỗi tiền phage có số trường hợp biến thành phage sinh dưỡng nhân lên vi khuẩn, sau giải phóng phage hoàn toàn, cảm ứng tự phát mà thường phải có chất gây cảm ứng để tiền phage thành phage như: việc xử lý vi khuẩn sinh tan tác nhân gây đột biến hóa học vật lý (tia tử ngoại, tia X, ) Sự cảm ứng tiếp hợp hình thành hợp tử tế bào đực Hfr( λ)+ tế bào F-(λ)- Đó cảm ứng hợp tử 5.2.1.3 Hiện tượng tải nạp nhân tố tải nạp Trong tượng tải nạp, phage vi khuẩn đóng vai trò vectơ Nó chuyển ADN vào tế bào vi khuẩn Trong trình nhân lên tế bào vật chủ, phage nuốt mảnh nhỏ ADN tế bào vật chủ Do ảnh hưởng mảnh nhỏ gen phage nên hệ gen vi khuẩn có biến đổi đặc tính di truyền Hiện tượng tải nạp Zinder Lederberg phát năm 1952 nghiên cứu lai loài Salmonella Các tác giả dùng ống thủy tinh hình chữ U, có hai nhánh ngăn cách với lọc thủy tinh xốp Cho vào nhánh thứ canh khuẩn nước thịt cấy Salmonella (A) nhánh thứ hai canh khuẩn cấy Salmonella (B) Vi khuẩn Salmonella (A) không bị đột biến mang ký hiệu 2A có genotype T + (có khả tổng hợp Tryptophan) Vi khuẩn Salmonella (B) đột biến mang ký hiệu 22A có genotype T- (không có khả tổng hợp Tryptophan) 129 Sau thời gian ủ chung, người ta mang vi khuẩn Salmonella (B) có genotip T-cấy môi trường Triptophan Nếu mọc có nghĩa tự tổng hợp Triptopan genotype từ T- biến thành T+ Qua thời gian nuôi cấy tủ ấm người ta nhận thấy đĩa hộp lồng nuôi cấy Salmonella (B) 22A xuất khuẩn lạc Như có số tế bào 22A mang đặc điểm 2A Vậy nhân tố truyền đặc điểm 2A cho 22A? chúng không tiếp xúc với (màng lọc ngăn cách vi khuẩn) Người ta giả thiết đột biến tự nhiên, ta thấy đột biến tự nhiên Salmonella thường xẩy với tần số thấp (10-9) mà tế bào có khả tổng hợp Triptophan xuất với tần số 10 -5( nghĩa 105 tế bào có tế bào có khả tổng hợp triptophan) cao so với đột biến tự nhiên 10.000 lần tượng đột biến Người ta lại giả thiết nhân tố nhân tố chuyển nạp Nhưng điều không ống hình chữ U người ta không tìm thấy đoạn ADN tự Vậy phải có vật trung gian thấm qua màng lọc vi khuẩn mang thông tin di truyền nòi vi khuẩn truyền cho nòi vi khuẩn Đó nhân tố tải nạp Thực khuẩn thể ôn hòa PTL 22 (hay P22) có khả làm tan tế bào nòi 2A Sau lọt qua màng lọc thủy tinh, thực khuẩn thể làm tan tế bào nòi 2A giải phóng tác nhân FA, tác nhân lại thấm qua màng lọc Dưới ảnh hưởng FA số tế bào nòi 22A nhận tính chất di truyền đặc hiệu, đặc trưng cho nòi mà từ FA tiết 5.2.2 Các kiểu tải nạp Tải nạp tiến hành theo kiểu sau a, Tải nạp chung hay tải nạp không đặc hiệu Là kiểu tải nạp phage tải nạp truyền tính trạng khác từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác loài Như khả tổng hợp acid amin, đặc tính lên men, di động, đề kháng với chất kháng sinh, Phage tải nạp P22 Salmonella typhymurium có khả tải nạp tính trạng di truyền số nhiều tính trạng riêng lẻ hay liên kết mang chức khác Salmonella, ADN đính vào đoạn hệ gen vi khuẩn ADN vi khuẩn cho ADN phage tải nạp có trao đổi chéo ADN vi khuẩn cho liên kết tạm thời với ADN phage Tải nạp hoàn toàn: trường hợp tải nạp ADN vi khuẩn cho vào vi khuẩn nhận có liên kết chéo với đoạn ADN tương đương gắn hẳn vào hệ gen vi khuẩn nhận, ADN truyền cho hệ cháu, tải nạp hòan toàn Tải nạp hạn chế: trường hợp ADN vi khuẩn cho không gắn vào hệ gen vi khuẩn nhận nên chép ADN tồn tế bào mà tất tế bào hệ cháu, tải nạp ngừng trệ chiếm tỷ lệ lớn trường hợp tải nạp: Tỷ lệ tải nạp ngừng trệ tải nạp hoàn toàn 10/1 Quá trình xâm nhập vào vi khuẩn sinh sản tóm tắt sau phage bám bề mặt tế bào vi khuẩn, sau phút bơm ADN vào tế bào , sau chúng sinh sản khonảg 30 phút sau làm tan vi khuẩn giải phóng phage Khi phage xâm nhập vào vi khuẩn A chúng cắt ADN vi khuẩn A thành nhiều đoạn, đồng thời ADN phage chép thành nhiều phân tử vỏ phage tạo thành Sau vỏ lắp ráp ruột ADN vào, phá vỡ tế bào vi khuẩn tiếp tục xâm nhập vi khuẩn Trong trình lắp rắp khoảng 1-2% phage vô 130 tình mang đoạn ADN vi khuẩn có chứa gen Phage mang gen vi khuẩn A xâm nhập vào vi khuẩn B, trình tái tổ hợp xẩy làm gen A gắn vào gen B b, Tải nạp đặc hiệu Đó tải nạp phage có khả tải nạp tính trạng di truyền, ADN phage tải nạp kết hợp với đoạn xác định hệ gen vi khuẩn Ví dụ: phage λ E coili K12, phage làm tan nòi dại E coli K12 nhân lên vi khuẩn dạng tiền phage, trừ tác nhân gây đột biến tia tử ngoại tác nhân cảm ứng, biến đổi thành phage thành thục hoàn toàn cảm ứng sau dung giải vi khuẩn Đây phage đặc hiệu dính vào NST Tiền phage λ luôn dính NST locus bên cạnh locus gal (galactose)- phage λ thành thục E coli gal (+) truyền cho nòi E coli gal (-) locus gal (+), nghĩa khả tổng hợp enzyme chuyển hóa galactoza Nó khả truyền tính trạng di truyền khác (khả tải nạp hạn chế hay tải nạp đặc hiệu) Hiện tượng giải thích phân tích di truyền vi khuẩn (E coli) gal(-) bị nhiễm phage tải nạp λ biến thành vi khuẩn gal(+) Hệ gen trở thành dị hợp tử gal(+), gal(-) hay đồng hợp tử hai vùng gal tương tự mặt di truyền học Một vi khuẩn tạm thời sông bội locus gal 5.2.3 Cơ chế chung tải nạp Từ nhân tố kiểu loại tải nạp, ta rút chế chung tải nạp sau: +Tải nạp trình truyền đoạn ADN từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ phage +Phage vi khuẩn tiếp xúc với Phage phá vỡ tế bào vi khuẩn vào tế bào chất vi khuẩn, lấy cắp ADN vi khuẩn chui Đem ADN cho vi khuẩn thể nhận khác +Mỗi phage có đặc hiệu riêng với loại vi khuẩn +Đoạn ADN tế bào cho gắn lên ADN phage thông qua tượng trao đổi chéo Nghĩa ADN phage gắn lên hệ gen vi khuẩn xẩy tái tổ hợp đoạn gen vi khuẩn phần ADN phage 5.2.4 Ứng dụng trình tải nạp - Tải nạp giúp ích nhiều cho việc phân tích chất phức tạp vùng ADN mà người ta gọi gen, tức vùng riêng biệt kiểm soát tính trạng (hay nói kiểm soát việc hình thành enzyme) - Tải nạp phương pháp phân tích di truyền học có hai ưu điểm lớn sau: + Phát tượng tượng tái tổ hợp xảy hai thể dị dưỡng không giống hệt nhau, chí trường hợp tải nạp thực với tần số thấp + Trong tải nạp ngừng trệ, có tính trạng giống trạng thái dị hợp tử sinh vật bậc cao, nghĩa tế bào, có gen giống hệt mang biến đổi khác 5.3 Giao nạp (tiếp hợp) Giao nạp vi khuẩn kết hợp thời hai tế bào có kiểu bắt cặp đối nhau, tiếp nối cách chuyển phần vật chất di truyền từ tế bào cho sang tế bào nhận qua cầu tế bào chất sau tế bào tách Kiểu chép sigma (σ) vi khuẩn sử dụng giao nạp để truyền phân tử ADN dạng thẳng sang tế bào khác Về thuật ngữ tài liệu cũ người ta dùng khái niệm 131 “tiếp hợp” để trình này, song theo (Nguyễn Lộc - Trịnh Bá Hữu, 1975) dùng giao nạp tốt phản ảnh chất trình tránh nhầm lẫn với tiếp hợp nhiễm sắc thể 5.3.1 Chứng minh có tượng lai vi khuẩn Năm 1946, J.Lederberg E Tatum sử dụng dòng đột biến khuyết dưỡng khác E coli để chứng minh có tái tổ hợp dòng vi khuẩn khác Cụ thể dòng A có kiểu gen met-bio-thr+leu+thi+ (có khả tổng hợp threonin, leucine vitamin B1 (thiamin) khả tổng hợp methionin biotin) Còn dạng B ngược lại có kiểu gen met+bio+thr-leu-thi- (có khả tổng hợp methionin biotin khả tổng hợp threonin, leucine thiamin) Trộn A vào B ống nghiệm, sau cấy lên môi trường tối thiểu Các khuẩn lạc mọc môi trường tối thiểu chứng tỏ có dạng lai, chúng mọc lên nhờ bù đắp cho nhu cầu dinh dưỡng Dạng lai có kiểu gen met+bio+thr+leu+thi+ dạng A dạng B riêng lẻ không mọc môi trường tối thiểu 5.3.2 Sự phân hóa giới tính Năm 1953, Hayes phát vi khuẩn có dạng khác tương tự giống đực giống sinh vật bậc cao Các dạng ký hiệu F + va F- (fertility-hữu thụ) F+ tương tự giống đực sinh vật bậc cao, truyền gen sang F- Tần số lai F+ F- khoảng 10-6 tức lai triệu tế bào có tế bào lai Tiếp hợp truyền ADN qua tiếp xúc trực tiếp hai tế bào vi khuẩn, truyền định hướng từ tế bào cho (đực) sang tế bào nhận (cái) 5.3.3 Episome plasmid Khi tiếp xúc với F+ thời gian, F- biến thành F+ Về sau dạng Hfr (Hight frequency of recombination) phát hiện, dạng có tần số lai với F - cao F+ lên đến 104 lần Khi tiếp xúc với F+ thời gian, F- biến thành F+ nhận phân tử di truyền gọi episome Episome F+ phân tử di truyền nhiễm sắc thể, tồn dạng phân tử ADN vòng tròn tự chép gắn vào phân tử ADN tế bào chủ (ví dụ phage λ) episome F+ coi nhân tố giới tính (sex factor) Plasmid: lúc đầu định nghĩa ADN vòng tròn nhỏ có khả chép độc lập với nhiễm sắc thể tế bào chủ khả gắn vào nhiễm sắc thể Plasmid mang số gen đề kháng thuốc (Plasmid R đề kháng nhiều thuốc kháng sinh), Hiện Plasmid dùng cho hai nghĩa episome lẫn Plasmid Các plasmid tồn độc lập gắn vào gen vi khuẩn Về sau người ta phát vi khuẩn có nhiều Plasmid khác (Plasmid bám dính, Plasmid độc tính, ) 5.3.4 Nhân tố F/ 132 Sự cắt rời nhân tố F từ nhiễm sắc thể dòng Hfr nhiều không xác lúc đoạn gen vi khuẩn thay phần F truowngf hợp nhân tố F / tạo thành có khả chuyển gen vi khuẩn cách độc lập, với tính trạng tế bào cho Hiện tượng gọi tính nạp, nghĩa chuyển gen kèm theo nhân tố giới tính Nhờ tính nạp nhận thể lưỡng bội phần theo gen gắn vào F+ 5.3.5 Tái tổ hợp Muốn xẩy tái tổ hợp hai dòng vi khuẩn phải tiếp xúc với (F +x F-) (Hfr x F ) Dòng tế bào mang nhân tố F+ coi tế bào đực có khả tạo protein pilin, từ protein tạo ống giao nạp gọi pillus Sự co lại pilus nối hai tế bào làm chúng tiến lại gần Tế bào F- gọi sau giao nạp tế bào F- biến thành F+ Việc chuyển gen thực plasmid gắn vào gen vi khuẩn Trong trình chuyển vật chất di truyền sang F- ADN mạch chủ chép mạch có ori đầu F cuối Quá trình chuyển ADN từ F+ sàng F- bị ngắt quảng Các gen chuyển chiều từ Hfr sang F- Các dòng Hfr có tần số lai cao nhiều plasmid nằm sẵn gen F + phải qua giai đoạn plasmid gắn vào gen chuyển gen Trong điều kiện thí nghiệm 370C nguyên gen vi khuẩn E coli chuyển sang tế bào nhận vòng 90 phút Thường giao nạp bị ngắt chừng pilus bị gãy, nên gen chuyển nguyên vẹn vào tế bào nhận Lúc tế bào F- F2.3 Biến dị vi khuẩn 2.3.1 Sự thích nghi Vi sinh vật sinh vật khác, tất hệ sinh giống hoàn tàn bố mẹ, trái lại nhiều trường hợp hệ xuất đặc tính Ở vi sinh vật thường quan sát thấy tượng biến đổi kiểu trao đổi chất chuyển từ hô hấp yếm khí sang hiếu khí, từ sử dụng nguồn C vô sang hữu cơ, Những biểu nêu thể thích nghi vi sinh vật ngoại cảnh, biến dị vi sinh vật Khả biến dị vi sinh vật lớn, hẳn nhiều so với sinh vật khác Sự thay đổi chúng ngoại hình bên mà thay đổi hoạt tính sinh lý tạo biến dị di truyền Nhưng biến dị có phải kết thích nghi? Lewis dùng phương pháp nghiên cứu tách riêng tế bào nhận thấy vi khuẩn E coli (bình thường khả lên men galactose) sau nuôi cấy môi trường có nguồn C galactose xuất khả lên men đường biến đổi thích ứng tế bào quần thể tồn từ trước tế bào có khả lên men loại đường Sự xuất số tế bào có biến đổi sinh lý người ta gọi đột biến Theo lewis tỷ lệ đột biến dinh dưỡng E coli 1/100.000 Và nuôi cấy E coli môi trường galactose tế bào đột biến phát triển nhanh tế bào khác bị tiêu diệt dần Galactose môi trường đóng vai trò nhân tố chọn lọc, điều kiện tế bào phát triển thành tập đoàn Như thích nghi dứt khoát thực xuất thể đột biến hầu hết thể đột biến cố định Tuy chứng kiến có đặc tính tính hệ không di truyền gọi biến dị không di truyền 2.3.2 Các loại biến dị Có thễ xẩy hai loại biến dị biến dị kiểu hình (phenotyp) biến dị kiểu gen (genotyp) 133 2.3.2.1 Biến dị phenotyp Là biến dị tính trạng bên ngoài, tạm thời thuận nghịch không ổn định toàn quần thể vi sinh vật Biến dị xuất tác động nhân tố ngoại cảnh (môi trường, điều kiện nuôi cấy, ) Biến dị xuất chậm biến điều kiện tác động bị làbiến dị không di truyền Một số dạng điển hình biến dị phenotyp -Biến dị hình thái vi sinh vật : Hình thái vi sinh vật thay đổi ảnh hưởng yếu tố khác có liên quan đến tuổi tế bào điều kiện môi trường, thấy biến dị kích thước tế bào thườg xẩy trình sinh trưởng oqr giai đoạn đầu tế bào thường to kích thước nhỏ điển hình giai đoạn sinh trưởng logarid Ngoài thấy biến dị sinh nha bào số vi khuẩn Biến dị hình thái chịu ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh +Thành phần hóa học cấu tạo môi môi trường +Điều kiện nuôi cấy pH, nhiệt độ, áp suất, +Chất độc sát chất sát trùng, chất kháng sinh +Biến dị hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc dòng tế bào khiết sinh từ tế bào Do tổn thường cấu trúc tế bào vi khuẩn tạo nên biến dạng khuẩn lạc, bình thường môi trường đặc, vi khuẩn tạo thành hai dạng khuẩn lạc dạng S dạng R Những biến dị hình dạng khuẩn lạc phát triển môi trường đặc, từ vi khuẩn loài (khuẩn lạc ướt, nhầy, bóng láng, nhám) coi biến dị gây ngoại cảnh Những tổn thương cấu trúc vi khuẩn, hình thành khuẩn lạc riêng biệt Khi canh khuẩn khiết đem nuôi cấy môi trường đặc, xuất nhiều loại hình khuẩn lạc, thuộc hai dạng dạng S bóng láng dạng R nhám xù xì, hai dạng có dạng trung gian không ổn định, số trường hợp hình thành khuẩn lạc con, số khuẩn lạc khác khuẩn lạc D (dward: lùn nhỏ) khuẩn lạc G hình thành mặt rìa khuẩn lạc bình thường Ngoài số vi sinh vật số môi trường xuất khả sinh sắc tố làm biến đổi màu sắc môi trường nuôi cấy +Biến dị hình thái ảnh hưởng ngoại cảnh Tất điều kiện sống làm thay đổi hình thái vi khuẩn: - Cấu tạo hóa học môi trường làm cho vi khuẩn có dạng khuẩn lạc khác nhau, tùy theo nuôi cấy môi trường nước thịt giàu dinh dưỡng, môi trường tổng hợp hay bệnh phẩm - pH, sức căng bề mặt môi trường tăng, làm hình thành khuẩn lạc mập hơn, ngắn Brucella nhiệt độ 370C có hình ngắn, hình thoi, cầu khuẩn 210C có hình trực khuẩn nhỏ Tốc độ phân chia tế bào chậm nhiệt độ thấp Những điều kiện không thuận lợi khác làm thay đổi hình thái vi khuẩn - Canh khuẩn già thường có dạng thoái hóa, hình thái nhiều khác với vi khuẩn bình thường kéo dài hình sợi (ở trực khuẩn) dạng phân nhánh hai đầu - Những tác nhân ức chế, kìm khuẩn diệt khuẩn nồng độ thấp có khả biến đổi hình thái vi khuẩn Vi khuẩn thay đổi hình dạng, hình thành vi khuẩn dạng L (không có thành tế bào sinh đột biến) 134 2.4 Biến dị genotyp - đột biến a, Khái niệm Cũng sinh vật bậc cao, vi khuẩn có đột biến Cùng genotype, biểu phenotype phụ thuộc vào điều kiện môi trường Sinh vật bậc cao đột biến thường xuất tế bào mầm, chịu ảnh hưởng môi trường, vi khuẩn môi trường ảnh hưởng trực tiếp gây nên biến đổi genotype Như đột biến sai khác với bố mẹ kiểu gen liên quan đến vật chất di truyền b, Bản chất đột biến Bộ nucleotit ADN thuộc gen mật mã thông tin, tương ứng với cấu trúc protein đặc hiệu Mọi thay đổi nucleotit dẫn đến thay đổi cấu trúc chức protein đó, hình thành tính trạng đột biến Như đột biến thay đổi sở vật chất di truyền mức phân tử c, Tính chất đột biến Đột biến mang tính chất di truyền, gián đoạn, hiếm, ngẫu nhiên, độc lập, đặc hiệu d, Biểu đột biến Mọi đột biến dù ngẫu nhiên hay cảm ứng thay đổi nucleotit xảy theo hai kiểu: + Thay đôi base khác (đột biến điểm) + Cắt khung pentose-phosphat ADN gây tổn hại, đảo ngược đoạn hai điểm cắt (đột biến đoạn) Đột biến thường không biến đảo Ví dụ: Sợi (-) T A G C A C T G Sợi (+) A T C G T G A C ARNt A U C G U G A C Nếu đột biến điểm xảy vị trí ba mã thứ T thay C ba thứ mã hóa cho AUC (izolơxin) sau đột biến cho GUC (valin) e, Nguyên nhân gây đột biến +Ngẫu nhiên: chưa biết rõ nguyên nhân này, có lẽ sai sót ngẫu nhiên liên kết nu bị thay đổi cách ngẫu nhiên +Vật lý (tia tử ngoại (UV) gây đột biến điểm), +Hóa học: ethidium bromide, acid, hóa chất khác, +Sinh học: 2.4.2 Các dạng đột biến thường gặp 2.4.1 Đột biến ngẫu nhiên Trong quần thể vi khuẩn, luôn xuất đột biến mà không cần có can thiệp thực nghiệm Đó đột biến ngẫu nhiên Một nguyên nhân đột biến ngẫu nhiên có lẽ sai sót ngẫu nhiên liên kết nucleotit bị thay đổi cách ngẫu nhiên Chẳng hạn bình thường T tồn trạng thái keto ghép đôi với A, chép T chuyển sang dạng enol ghép đôi với G Hậu quả: sợi ADN mang cặp CG lẽ vị trí AT -Tần số đột biến tốc độ đột biến: Tần số đột biến (tức số lượng cá thể đột biến quần thể tế bào) khác tính trạng cá thể, đạt từ 10-4-10-14 phụ thuộc vào tốc độ đột biến, điều kiện môi trường tuổi huyễn dịch Xác suất đột biến tế bào hệ 135 gọi tốc độ đột biến, tốc độ đột biến ngẫu nhiên gen khoảng 10-5, với cặp nucleotit khoảng 10-8 - Đột biến yên lặng Nhiều acid amine có >1 codon tương ứng nên có > ARN tương ứng Do thoái hóa mã mà đột biến biểu phenotype Với nhiều ba, thay đổi base thứ ba không gây hậu (đột biến yên lặng hay đột biến nguyên nghĩa) Ngay thay đổi base thứ hay thứ hai Mặc dù cấu trúc bậc cao phân tử protein quy định từ cấu trúc bậc acid amine riêng rẽ có ý nghĩa khác cấu trúc protein Ví dụ đột biến AUC (izolơxin)  GUC (valin) dẫn đến thay nhóm ưa lipit thành nhóm ưa lipit khác Trái lại CUU (lơxin)  CCU (prolin) khiến cho chuỗi polypeptide bị sai lệch làm thay đổi sâu sắc cấu trúc bậc cao Vì loạt thể đột biến có gen cấu trúc enzyme bị thay đổi, xuất nhiều mức độ hoạt tính khác nhau, từ hoạt tính không đáng kể đến hoàn toàn Hồi biến hoàn tổ Đột biến điểm, thuận nghịch, nghĩa thể đột biến đột biến trở lại phục hồi đặc tính trước Có hai loại hồi biến: Loại thứ nhất, hồi biến vị trí đột biến phục hồi hoạt tính, diễn vị trí đột biến ban đầu Loại thứ hai, vị trí đột biến xảy vị trí khác phân tử ADN, phục hồi phenotype dạng hoang dại Một số đột biến át chế thuộc loại đột biến Ví dụ: đột biến vị trí khác gen phục hồi chức enzyme, đột biến gen khác phục hồi phenotype loài hoang dại 4.2.2 Đột biến cảm ứng Có thể nâng cao tần số đột biến cách xử lý tế bào tác nhân gây đột biến Đó cảm ứng đột biến tế bào sinh gọi thể đột biến cảm ứng Tác nhân gây đột biến lý, hóa hay sinh học ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRUYỀN NHIỄM Quy trình thường quy để chẩn đoán bệnh vi sinh vật Bệnh truyền nhiễm bệnh gây tác nhân như: vi khuẩn, virus, nấm, nguyên trùng (protozoa) 1- Lấy mẫu: lấy đúng, bảo quản thích hợp, vận chuyển nhanh, mẫu phải có ghi chép thông tin đầy đủ 2- Nuôi cấy phân lập (nuôi cấy khởi đầu) Mục đích: nuôi cấy khởi đầu để tạo phát triển vi khuẩn, tạo lứa cấy khiết Phân lập (cấy chuyển vi khuẩn từ khuẩn lạc đặc trưng vào Bệnh phẩm → Môi trường nuôi cấy khởi đầu → môi trường khác, thu lứa cấy Nuôi cấy vào môi trường tăng sinh khiết) 3- Nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa 136 4- Nghiên cứu tính gây bệnh 5- Nghiên cứu type huyết học 6- Thử kháng sinh đồ 7- Kết luận: - Căn nguyên, loài, type vi khuẩn gây bệnh - Khả sử dụng kháng sinh - Nguồn gốc dịch (nếu có dịch) Những trở ngại chẩn đoán vi khuẩn học Có loại vi khuẩn phát triển nhanh khoảng 18-24 có loại phát triển phải vài tháng (trực khuẩn lao tuần-2tháng) Cũng có loại vi khuẩn nuôi cấy mà không mọc (vi khuẩn gây bệnh phong) Chú ý: Trong trình lấy mẫu: mẫu phải lấy vật chưa chết, chết, vật chết vật khả miễn dịch, vi khuẩn đường ruột xâm nhập vào tất quan Phương pháp nhân ADN (PCR: polymerase chain reaction) [4] Phản ứng PCR phát vào năm 1980 đưa lại cách mạng di truyền học phân tử Đây phương pháp hoàn toàn việc nghiên cứu gen hệ gen Khó khăn lớn trước việc phân tích hệ gen chỗ, chúng mục tiêu riêng rẽ nhỏ hệ gen khỏng lồ Chẳng hạn hệ gen động vật bậc cao chứa 100.000 gen Kỹ thuật PCR đời làm thay đổi tất cả, giúp tạo số lượng lớn ADN mong muốn Nguyên lý: PCR phản ứng sinh hóa phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm trình chép ADN với tham gia loại ADN-polymerase chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn ADN sợi làm mồi, dùng đoạn ADN mạch đợn làm khuôn để tổng hợp nên sợi bổ sung với Vì để khởi đầu cho trình tổng hợp, ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài khoảng 6-30 nucleotid) Đoạn gắn kết với ADN khuôn điểm khởi đầu chép, enzyme ADN-polymerase điều khiển để tổng hợp nên sợi ADN đặc thù Các sợi ADN làm khuôn tạo theo cách đơn giản nâng nhiệt độ lên 900C (92-980C) mà thường 940C cho chuỗi ADN xoắn kép bung Cả hai sợi ADN dùng làm khuôn cho trình tổng hợp đoạn mồi (oligonucleotit hay primer) cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho hai sợi Trong kỹ thuật PCR, đoạn mồi chọn nằm hai đầu đoạn ADN cần nhân lên, cho sợi ADN tổng hợp bắt đầu đoạn mồi kéo dài phía đoạn mồi nằm sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm hai đoạn mồi Độ dài sản phẩm PCR vài trăm đến hàng ngàn chí hàng chục ngàn nucleotit Như vậy, sau chu kỳ điểm bám cho đoạn mồi lại xuất sợi ADN tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại nâng nhiệt độ lên thích hợp cho sợi ban đầu tách khỏi sợi tổng hợp, sợi sau dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm bước: gắn mồi, tổng hợp ADN tách rời đoạn Kết cuối phản ứng PCR sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta có 2n phân tử ADN mạch kép nằm hai đoạn mồi Như vậy, kết đoạn ADN định trước nhân lên với lượng lớn Ví dụ: sau 30 chu kỳ số lượng ADN PCR 1.073.741.842 Do ưu điểm tuyệt đối nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR nhanh chóng ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh virus, vi khuẩn, bệnh ký sinh trùng cho kết xác Mặt khác việc xác định thành phần trật tự nuceotit phân tử ADN hệ gen có giá trị lớn phân loại loài vi sinh vật 137 Tiến hành phản ứng: vật liệu khởi đầu cho PCR ADN có chứa đoạn cần nhân lên, gọi khuôn ADN, hàm lượng ADN cần cho phản ứng nhỏ thí nghiệm bình thường cần 1-100ng ADN tổng số hệ gen đủ Thành phần chủ yếu phản ứng PCR: 1- ADN làm khuôn (tức bệnh phẩm nghi) 2- Hai đoạn enzyme để xác định điểm bắt đầu tổng hợp ADN 3- Enzyme chịu nhiệt ADN-polymerase (phổ biến Taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus) 4- Hỗn hợp dung dịch đệm loại deoxynucleotit (A, T, G, C) 5- Môi trường đệm cung cấp ion Mg+và nước tinh khiết (không có ADNase; ARNase, ) Các giai đoạn phản ứng PCR Phản ứng PCR có giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt) cho chu kỳ [4] 1- Bung liên kết ADN: thực nhiệt độ 90-980C vài giây đến vài phút Tại nhiệt độ phân tử ADN mạch kép bị tách ra, tạo thành sợi đơn dùng để làm khuôn cho đoạn mồi bám vào enzyme ARN-polymerase xúc tác tổng hợp 2- Gắn mồi (hay gọi ủ với mồi): Sau bước một, nhiệt độ hạ xuống 37-680C để đoạn mồi bám vào với trình tự bổ sung tương ứng phân tử ADN làm khuôn 3- Tổng hợp (hay gọi kéo dài): Nhiệt độ nâng lên 68-72 0C vài chục giây đến vài phút để ADN tổng hợp xoắn vào với tạo thành sợi ADN kép, sản phẩm PCR Cứ vậy, phản ứng xảy 25-40 chu kỳ tiếp tục chu kỳ cuối cùng, nhiệt độ trì 720C 5-10 phút cho tất sợi đơn có phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR, cuối nhiệt độ hạ xuống 40C để bảo quản sản phẩm Sản phẩm phản ứng PCR đoạn ADN mà ta cần nhân lên Sản phẩm kiểm tra cách chạy điện di thạch agarose nồng độ 0,8-2%, ADN PCR nhìn rõ tác dụng tia cực tím sau nhuộm Ethidium Bromid, loại hóa chất có khả bám làm hiển thị ADN Độ dài ADN sản phẩm tính cách so sánh với thị ADN (ADN Marker) sử dụng thông dụng ADN thực khuẩn thể Lamda cắt enzyme giới hạn Hindll Phương pháp PCR không cần đòi hỏi ADN với lượng lớn, nên sử dụng trực tiếp ADN mẫu vật để làm khuôn, mà không cần phải nuôi cấy, loại trừ ảnh hưởng vật chủ môi trường nuôi cấy với đối tượng nghiên cứu -Câu hỏi ôn tập: Biến nạp thực với điều kiện nào? Nồng độ ADN ảnh hưởng đến biến nạp nào? Biến nạp tải nạp, giống khac điểm nào? Tải nạp chung tải nạp chuyên biệt khac giống điểm nào? Tế bào F- biến thành F+ Hfr không ? cánh nào? -Tài liệu tham khảo: Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000) Nhà xuất giáo dục Hà Nội Lê Thành Hòa (2004) Sinh học phân tử: Nguyên lý ứng dụng Viện công nghệ sinh học Phạm Thành Hổ (1999) Di truyền học Nhà xuất giáo dục, trang 320-422 138 Biền Văn Minh, Phạm Văn Ty, Kiều Hữu ảnh, Phạm Hồng Sơn, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thị Thu Thủy (2006) Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Huế Hoàng Thủy Nguyên, Đặng Đức Trạch, Ninh Đức Dự, Nguyễn Hồng Điệt, Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Thị Oanh (1974) Vi sinh y học tập I Nhà xuất Y học Hà Nội Nguyễn Vĩnh Phước(1976) Vi sinh vật học Thú y tập III Nhã xuất đại học trung học chuyên nghiệp Hà Nội Nguyễn Khắc Tuấn(1999) Vi sinh vật học, nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Giải thích thuật ngữ: Transformation: truyền thông tin si truyền thông qua ADN tự Temperat virus: Virus nhiễm vào tế bào không gây tan tế bào genom chúng chép theo genom tế bào chủ Shine-Dagarno sequence: đoạn nucleotit ngắn nằm trước vị trí khởi đầu dịch mã phân tử mARN prokaryote giúp bám vào vị trí 3’ rARN 16S(vì mARN prokaryote mủ) Receptor: điểm tiếp nhận bề mặt tế bào nơi virus bám vào Replicon: đoạn ADN tính từ điểm khởi đầu theo hai phía đến hai điểm kết thúc chép 6.Ribozyme: Phân từ ARN xúc tác phản ứng hóa học enzyme Primer: đoạn nucleotit (thường ARN) có trình tự bổ trợ với đoạn đầu ADN Phenotype: đặc điểm quan sát thể 9.Okazaki fragment: đoạn ADN đoen tổng hợp gián đoạn khuôn sợi muộn sau nói với ligaza 10.Oligonucleotit: đonạ nucleotit ngắn 139 [...]... xuất hiện các đặc tính mới Ở vi sinh vật thường quan sát thấy hiện tượng biến đổi kiểu trao đổi chất như chuyển từ hô hấp yếm khí sang hiếu khí, từ sử dụng nguồn C vô cơ sang hữu cơ, Những biểu hiện nêu trên thể hiện sự thích nghi của vi sinh vật đối với ngoại cảnh, đó chính là sự biến dị vi sinh vật Khả năng biến dị của vi sinh vật rất lớn, hơn hẳn nhiều so với các sinh vật khác Sự thay đổi của chúng... Thị Kê, Nguyễn Thị Oanh (1974) Vi sinh y học tập I Nhà xuất bản Y học Hà Nội 6 Nguyễn Vĩnh Phước(19 76) Vi sinh vật học Thú y tập III Nhã xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội 7 Nguyễn Khắc Tuấn(1999) Vi sinh vật học, nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội Giải thích thuật ngữ: 1 Transformation: sự truyền thông tin si truyền thông qua ADN tự do 2 Temperat virus: Virus khi nhiễm vào tế bào không... của vật chủ, trong đó những hệ thống enzyme tồn tại tiếp tục hoạt động sau khi bị nhiễm phage, nhưng những gen của vật chủ cần thiết cho sự tổng hợp những đại phân tử protein đều bị phá hủy Như thế vi khuẩn không thể sinh sản những protein mới của vi khuẩn được nữa: hệ thống vi khuẩn phage sinh sản duy 128 nhất nguyên liệu của phage Người ta thấy rằng phage cũng như tất cả virus là một vật ký sinh. .. một vi khuẩn sinh tan có và truyền cho thế hệ của nó khả năng sinh sản những phage nhưng không có hiện tượng gây nhiễm Một vi khuẩn sinh tan chứa một phage Quá trình sinh tan - Tiền phage: trong quá trình sinh tan, ADN của phage hoặc một đoạn sao lại của nó tái tổ hợp vào một vùng đặc hiệu trên NST của vi khuẩn Sau khi hấp thụ trên vi khuẩn, đáng lẽ nó tự sao lại và nhanh chóng phân tán trong vi khuẩn... chúng và duy trì khả năng sản sinh phage cho các thế hệ sau gọi là sự sinh tan Phần lớn những vi khuẩn sinh tan có thể nhân lên nhưng không sản sinh phage tự do và duy trì tính sinh tan Chỉ có một số sản sinh những phage thành thục và bị dung giải (102-1 06 cho mỗi thế hệ) Mỗi tiền phage có thể có trong một số trường hợp biến thành một phage sinh dưỡng và nhân lên trong vi khuẩn, sau đó giải phóng những... thuận nghịch không ổn định trong toàn bộ quần thể vi sinh vật Biến dị xuất hiện do sự tác động của những nhân tố ngoại cảnh (môi trường, điều kiện nuôi cấy, ) Biến dị xuất hiện chậm và biến mất khi điều kiện tác động bị mất do đó đây làbiến dị không di truyền Một số dạng điển hình của biến dị phenotyp -Biến dị hình thái vi sinh vật : Hình thái vi sinh vật có thể thay đổi do ảnh hưởng của những yếu tố... của vi khuẩn, tạo được lứa cấy thuần khiết Phân lập (cấy chuyển vi khuẩn từ những khuẩn lạc đặc trưng vào các Bệnh phẩm → Môi trường nuôi cấy khởi đầu → môi trường khác, thu được lứa cấy Nuôi cấy vào môi trường tăng sinh thuần khiết) 3- Nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa 1 36 4- Nghiên cứu tính gây bệnh 5- Nghiên cứu type huyết thanh học 6- Thử kháng sinh đồ 7- Kết luận: - Căn nguyên, loài, type vi. .. 1.073.741.842 Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng cho kết quả chính xác Mặt khác vi c xác định thành phần trật tự nuceotit trên phân tử ADN trong hệ gen có giá trị lớn trong phân loại các loài vi sinh vật 137 Tiến hành phản ứng: vật liệu khởi đầu cho PCR là ADN có chứa đoạn... Sinh học phân tử: Nguyên lý ứng dụng Vi n công nghệ sinh học 3 5 Phạm Thành Hổ (1999) Di truyền học Nhà xuất bản giáo dục, trang 320-422 138 4 Biền Văn Minh, Phạm Văn Ty, Kiều Hữu ảnh, Phạm Hồng Sơn, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thị Thu Thủy (20 06) Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất bản Đại học Huế 5 Hoàng Thủy Nguyên, Đặng Đức Trạch, Ninh Đức Dự, Nguyễn Hồng Điệt, Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Thị Oanh (1974) Vi. .. nó là vật ký sinh bắt buộc ở tế bào chủ c- Thời kỳ sinh dưỡng: đó là thời kỳ nhân lên của phage, gồm có hai giai đoạn: - Giai đoạn (biến mất) Trong một vài phút đầu của thời kỳ sinh dưỡng, vi khuẩn không chứa virion (lõi ADN của phage), nếu người ta lấy lizozim để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn thì thấy dịch dung giải không chứa những mảnh ADN gây nhiễm Khi phage bắt đầu nhiễm vào, vi khuẩn ngừng sinh ... nêu thể thích nghi vi sinh vật ngoại cảnh, biến dị vi sinh vật Khả biến dị vi sinh vật lớn, hẳn nhiều so với sinh vật khác Sự thay đổi chúng ngoại hình bên mà thay đổi hoạt tính sinh lý tạo biến... sao) [2] Là trình tổng hợp vật chất di truyền (ADN vi sinh vật ARN số virus) Về trình chép ADN tế bào vi sinh vật giống Nhưng trình nghiên cứu chi tiết vi khuẩn E coli Gen vi khuẩn E coli sợi ADN... F2.3 Biến dị vi khuẩn 2.3.1 Sự thích nghi Vi sinh vật sinh vật khác, tất hệ sinh giống hoàn tàn bố mẹ, trái lại nhiều trường hợp hệ xuất đặc tính Ở vi sinh vật thường quan sát thấy tượng biến đổi