Bài giảng điện tử Môn: Di truyền học (45 tiết) Trương Thị Bích Phượng Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế Chương Bản chất vật chất di truyền Mục tiêu chương Giới thiệu chất vật chất di truyền DNA, thành phần, cấu trúc phân tử DNA, dạng DNA khác tế bào Số tiết: Nội dung I DNA vật chất di truyền Năm 1968, Frederich Miescher (Thụy Điển) phát nhân tế bào bạch cầu chất protein gọi nuclein Về sau thấy chất có tính acid nên gọi acid nucleic Acid nucleic có loại desoxyribonucleic (DNA) ribonucleic (RNA) Năm 1914, R Feulgen (nhà hóa học người Đức) tìm phương pháp nhuộm màu đặc hiệu DNA Sau nghiên cứu cho thấy DNA nhân giới hạn NST Nhiều kiện cho gián tiếp cho thấy DNA chất di truyền Mãi đến năm 1944 vai trị mang thơng tin di truyền DNA chứng minh đến năm 1952 công nhận Các chứng minh gián tiếp Nhiều số liệu cho thấy có mối quan hệ DNA chất di truyền - DNA có tế bào tất vi sinh vật, thực vật, động vật giới hạn nhân thành phần chủ yếu nhiễm sắc thể Đó cấu trúc mang nhiều gen xếp theo đường thẳng - Tất tế bào dinh dưỡng loại sinh vật chứa lượng DNA ổn định, không phụ thuộc vào phân hóa chức trạng thái trao đổi chất Ngược lại, số lượng RNA lại biến đổi tùy theo trạng thái sinh lý tế bào - Số lượng DNA tăng theo số lượng bội thể tế bào Ở tế bào sinh dục đơn bội (n) số lượng DNA 1, tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) có số lượng DNA gấp đơi - Tia tử ngoại (UV) có hiệu gây đột biến cao bước sóng 260nm Đây bước sóng DNA hấp thu tia tử ngoại nhiều Tuy nhiên số liệu trên, thành phần cấu tạo NST ngồi DNA cịn có protein Do cần có chứng minh trực tiếp khẳng định vai trò vật chất di truyền DNA Thí nghiệm biến nạp DNA (Transformation) Hiện tượng biến nạp Griffith phát vào năm 1928 vi khuẩn Diplococcus pneumoniae (gây sưng phổi động vật có vú) Vi khuẩn có hai dạng: - Dạng S (gây bệnh): có vỏ bao tế bào polysaccharid, ngăn cản bạch cầu phá vỡ tế bào Dạng tạo khuẩn lạc láng môi trường agar - Dạng R (không gây bệnh) khơng có vỏ bao tế bào polysaccharid, tạo khuẩn lạc nhăn Thí nghiệm tiến hành sau: a Tiêm vi khuẩn dạng S sống gây bệnh cho chuột, sau thời gian nhiễm bệnh, chuột chết b Tiêm vi khuẩn dạng R sống không gây bệnh cho chuột, chuột sống c Tiêm vi khuẩn dạng S bị đun chết cho chuột, chuột chết d Tiêm hỗn hợp vi khuẩn dạng S bị đun chết trộn với vi khuẩn R sống cho chuột, chuột chết Trong xác chuột chết có vi khuẩn S R Hình 1.1 Thí nghiệm biến nạp chuột Hiện tượng cho thấy vi khuẩn S tự sống lại sau bị đun chết, tế bào chết truyền tính gây bệnh cho tế bào R Hiện tượng gọi biến nạp Đến 1944, ba nhà khoa học T Avery, Mc Leod, Mc Carty tiến hành thí nghiệm xác định rõ tác nhân gây biến nạp Nếu tế bào S bị xử lý protease RNAase hoạt tính biến nạp cịn, cứng tỏ RNA protein tác nhân gây bệnh Nhưng tế bào chết S bị xử lý DNAase hoạt tính biến nạp khơng cịn nữa, chứng tỏ DNA nhân tố biến nạp Kết thí nghiệm tóm tắc sau: DNA S + tế bào R sống  chuột chết (có S, R ) Kết luận: tượng biến nạp chứng minh sinh hóa xác nhận DNA mang tín hiệu di truyền Nhưng vai trị DNA chưa cơng nhận cho thí nghiệm cịn protein Hình 1.2 Vật chất di truyền phage DNA Sự xâm nhập DNA virus vào vi khuẩn Năm 1952, A Hershey M Chase tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2 xâm nhập vi khuẩn E.coli Phage T2 cấu tạo gồm vỏ protein bên ruột DNA bên Thí nghiệm nhằm xác định xem phage nhiễm vi khuẩn bơm chất vào tế bào vi khuẩn: DNA, protein hay hai Vì DNA chứa nhiều phosphor, khơng có lưu huỳnh; cịn protein chứa lưu huỳnh khơng chứa phosphor nên phân biệt DNA protein nhờ đồng vị phóng xạ Phage nuôi vi khuẩn mọc môi trường chứa đồng vị phóng xạ P32 S35 S35 xâm nhập vào protein P32 xâm nhập vào DNA phage Thí nghiệm: phage T2 nhiễm phóng xạ tách đem nhiễm vào vi khuẩn không nhiễm phóng xạ, chúng gắn lên mặt ngồi tế bào vi khuẩn Cho phage nhiễm khoảng thời gian đủ để bám vào vách tế bào vi khuẩn bơm chất vào tế bào vi khuẩn Dung dịch lắc mạnh ly tâm để tách rời tế bào vi khuẩn khỏi phần phage bám bên ngồi vách tế bào Phân tích phần tế bào vi khuẩn thấy chứa nhiều P32 (70%) S35, phần bên tế bào vi khuẩn chứa nhiều S35 P32 Thế hệ phage chứa khoảng 30% P32 ban đầu Thí nghiệm chứng minh trực tiếp DNA phage T2 xâm nhập vào tế bào vi khuẩn sinh sản để tạo hệ phage mang tính di truyền có khả đến nhiễm vào vi khuẩn khác Hình 1.3 Sự xâm nhập DNA virus vào vi khuẩn II Thành phần cấu tạo hóa học acid nucleic DNA RNA hợp chất cao phân tử Các đơn phân nucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần - H3PO4 - Đường desoxyribose (DNA ), ribose ( RNA) - Nitrogenous base + Purin + Pyrimidin DNA RNA Adenin (A) Adenin (A) Guanin (G) Guanin (G) Cytosin (C) Cytosin (C) Timin (T) Uracin (U) (a) (b) (c) Hình 1.4 Thành phần đường base nucleotide (a) Base purin pyrimidin (b) Đường ribose deoxyribose (c) Sự khác Thymine Uracil Trong nucleotide, base purin gắn với C1 đường ỏ N9 Nếu pyrimidin gắn với C1 đường N3 C5 đường gắn với nhóm phosphate Trong mạch, nucleotide nối với nhờ mối liên kết nhóm -OH đường với nhóm -OH H3PO4, phân tử nước Nếu phân tử gồm đường nitrogenous base gọi nucleoside DNA 1.1 Cấu tạo hóa học DNA Hình 1.5 Sự bắt cặp bổ sung base hai mạch đơn Trên sở nghiên cứu mình, Chargaff (1951) đưa kết luận: + Số lượng A = T, G = C + Tỉ số đặc trưng cho loài sinh vật Các base acid nucleic bắt cặp bổ sung Cũng thời gian này, Wilkins Franklin (người Anh) nghiên cứu, phân tích tán xạ tia rơnghen, kết luận: + Các purin pyrimidin có cấu trúc phẳng, mặt phẳng chúng xếp vuông góc với trục dài mạch polynucleotide xếp chồng lên kia, khoảng cách trung tâm hai mặt phẳng kề 3,4Ao + Mạch polynucleotide xoắn thành lò xo quanh trục giữa, bước xoắn 34Ao (ứng với 10 nu) + Việc so sánh nồng độ DNA đo với số liệu tính tốn sở không gian nguyên tử cho thấy DNA có nhiều mạch polynucleotide Năm 1951, J Watson F Crick: tổng hợp số liệu phân tích hóa học tán xạ tia X, để xây dựng nên mơ hình cấu trúc phân tử DNA Theo mơ hình này, phân tử DNA có đặc trưng chủ yếu cấu trúc không gian sau: Hình 1.6 Mối liên kết hydro A-T G-C Phân tử DNA gồm hai chuỗi polynucleotide xoắn song song ngược chiều quanh trục chung Các gốc base quay vào phía vịng xoắn, cịn gốc H3PO4, pentose quay ngồi tạo phần mặt hình trụ Các mặt phẳng phân tử đường nằm phía phải base Cịn base xếp mặt phẳng song song với thẳng góc với trục phân tử Khoảng cách cặp base 3,4 Ao Chúng lệch góc 360 nên 10 gốc (10 nucleotide) tạo nên vịng quay Hình 1.7 Chuỗi xoắn kép DNA Chiều cao vòng xoắn 34 Ao, gồm 10 bậc thang 10 cặp base tạo nên Đường kính vịng xoắn 20 Ao Hai chuỗi polynucleotide gắn với qua liên kết hydro hình thành cặp base đứng đối diện theo nguyên tắc bổ sung cặp đôi nghiêm ngặt: A luôn liên kết với T mối liên kết hydro, G liên kết với X mối liên kết hydro Do phân tử DNA tổng số base loại pirimidin tổng số base loại purin (quy luật Chargaff) + Khoảng cách hai mạch polynucleotide xác định, không thay đổi Khoảng cách kích thước base loại purin cộng với kích thước base loại pirimidin + A ln ln với T base có khả hình thành nên hai liên kết hydrro vị trí N6 - O6 N1 - N1 G luôn với X base tạo liên kết hydro vị trí N6 - O6, N1 -N1 N2 - O2 Vì mà A liên kết với T G liên kết với C Tính chất bổ sung cặp base dẫn đến tính chất bổ sung hai chuỗi polynucleotide DNA Do biết thành phần, trật tự xếp nucleotide chuỗi suy thành phần, trật tự xếp nucleotide chuỗi Đặc điểm quan trọng mô hình đối song song (antiparallel) Để bazơ tương ứng đối diện nhau, hai mạch cần phải bố trí: đầu sợi đối diện với đuôi sợi Mơ hình Watson-Crick đời từ năm 1953 vịng 25 năm cơng nhận sử dụng rộng rãi Mãi đến năm 70, nhờ dùng phân tích xác nhiều dạng DNA phát hiện, dạng thường gặp dạng B theo mơ hình Watson-Crick, cấu trúc phổ biến cho hầu hết sinh vật Mỗi dạng DNA dịng họ phân tử có kích thước dao động quanh trị số trung bình Hai số dùng để đánh giá DNA - Chỉ số h: chiều cao hai nu kề - Chỉ số n: số nucleotide vịng xoắn Ngồi DNA dạng B, nhiều dạng xoắn phải khác (A, C, D ) chúng phân biệt với DNA dạng B khoảng cách base độ nghiêng chúng so với trục phân bố chuỗi kép Gần đây, người ta phát dạng DNA có khung zigzag đóng xoắn theo chiều trái, gọi DNA xoắn trái hay DNA Z, vịng xoắn có tới 12 cặp base Giải thích tồn DNA Z có nhiều quan niệm khác nhau: Theo Watson, điều kiện đặc biệt, nồng độ muối cao vùng chứa trình tự GCGCGC chuyển sang cấu hình Z, ngược lại nồng độ muối thấp chúng quay trở lại dạng B Điều chứng tỏ DNA Z đóng vai trị giảm sức căng cục phân tử DNA siêu xoắn tương tác đặc thù với protein điều hòa Tuy nhiên A Rich cho DNA Z xảy tự nhiên mà chứng có mặt ruồi giấm bình thường Có thể vùng DNA Z nằm xen kẻ với vùng DNA B chúng xoay hình dáng thành dạng B xảy biến đổi hóa học làm cho DNA Z trở nên khơng ổn định Rich cịn gợi ý gen nằm vùng bị xoay tháo xoắn sau bắt đầu phiên mã Nhờ mà protein tổng hợp Mặc dù giả thiết song khám phá cung cấp công cụ tiềm cho nghiên cứu hoạt động gen DNA.Việc phát dạng DNA cho thấy DNA tế bào không đơn điệu tùy trạng thái sinh lý mà DNA dạng dạng khác Hình 1.8 DNA dạng xoắn kép Z a Mơ hình dạng B Watson-Crick, dạng xoắn phải với trục b Mô hình dạng Z, dạng xoắn trái với trục khơng 1.2 DNA cuộn lại tế bào Hầu hết thể sinh vật, DNA có chiều dài dài nhiều lần so với chiều dài tế bào Ví dụ: phage T2 có chiều dài tế bào khoảng 0,16 m, chiêu dài ADN chúng khoảng 50 m Hình 1.9 Các dạng thẳng, vịng trịn xiêu xoắn DNA Do DNA tế bào phải cuộn xoắn Sự cuộn xoắn tinh vi trình tồn tại, gen phải hoạt động, phải chất có hoạt tính thường xun Người ta thấy DNA dạng cấu trúc: - Dạng siêu xoắn: mạch kép vặn xoắn lại thành hình số Đây dang tự nhiên vi khuẩn - Dạng vịng trịn: sợi DNA căng trịn có DNA siêu xoắn bị cắt đứt hai mạch kép - Dạng thẳng: DNA bị cắt đứt hai mạch Mơ hình gen E coli Ở E coli, chiều dài DNA rút ngắn đáng kể, cuộn lại thực nhờ vào RNA nối Khi RNA nối bị cắt DNA bung dài ra, thuận lợi cho chép DNA Nếu mạch DNA bị cắt, DNA tháo xoắn, căng thuận lợi cho tổng hợp protein Hình 1.10 Mơ hình cấu trúc nhiễm sắc thể (bộ gen) E coli (Theo Pettijohn Hecht, 1974) Hình 1.11 Sự tháo xoắn DNA tế bào vi khuẩn RNA Ở sinh vật như: thực khuẩn thể, virus động vật, virus thực vật vật liệu di truyền RNA Ở sinh vật bậc cao có RNA mã DNA RNA có cấu tạo từ đơn phân ribonucleotide Giống với nucleotide, ribonucleotide gồm ba thành phần: đường ribose, H3PO4, bazơnitric (T thay U) Trong tế bào có ba loại RNA: 2.1 RNA riboxom (ribosomal RNA-rRNA) rRNA với protein cấu tạo nên ribosome rRNA chiếm tỷ lệ cao tế bào đến 75% tổng RNA Ở ribosome khác có rRNA khác nhau, chúng đặc trưng số lắng S: - Eukaryote : ribosome có hệ số lắng ly tâm 80S, gồm hai đơn vị: + Đơn vị lớn ( 60S) có rRNA 28S; 5,8S; 5S + Đơn vị nhỏ (40S) có rRNA 18S - Prokaryote lục lạp, ty thể có hệ số lắng ly tâm 70S, gồm đơn vị: + Đơn vị lớn (50S): có loại rRNA 23S; 5S + Đơn vị nhỏ (30S): có rRNA 16S RNA ribosom có cấu trúc bậc I (mạch thẳng) cấu trúc bậc hai Trong ribosome, rRNA tồn dạng cấu trúc bậc hai RNA ribosom có cấu tạo sợi xoắn có nhiều vùng liên kết đơi theo ngun tắc bổ sung A liên kết với U, G liên kết với X có G liên kết với U Trong tế bào rRNA chiếm tỷ lệ cao lên đến 75-80% tổng số RNA Hình 1.12 rRNA cấu tạo nên ribosom 2.2 RNA vận chuyển (Transfer RNA - tRNA) Mỗi tRNA gắn với phân tử amino acid, mang đến ribosome để tham gia tổng hợp protein Mỗi tRNA đặc hiệu cho loại amino acid Có 20 loại tRNA khác tương ứng với 20 loại amino acid Trong thực tế, người ta thấy số lượng tRNA lớn nhiều so với số lượng amino acid amino acid có nhiều ba mã hóa Đồng thời ba mã hóa, có nhiều tRNA tượng biến đổi nucleotide tRNA tạo nên loại tRNA trình tổng hợp tRNA, sau hình thành chuỗi polynucleotide cịn chịu tác động yếu tố môi trường nội ngoại bào làm nucleotide bị biến đổi, tạo tRNA Các tRNA tham gia vận chuyển acid amin izoaceptor Số lượng izoaceptor thay đổi tùy acid amin Cấu trúc bậc I tRNA: tRNA vận chuyển có phân tử lượng nhỏ: 25.000-30.000, gồm 75-90 nucleotide, có số lắng 4S Trong thành phần cấu trúc tRNA có khoảng 10% nucleotide với khoảng 30 loại khác Mọi cấu trúc tRNA có đầu 5' 3' giống nhau: đầu 5' ln chứa G với gốc P tự do, cịn đầu 3' ln có nucleotide CCA 3'-OH Nhóm 3'-OH A liên kết với acid amin để tạo phức hợp tRNA-aminoacyl Chuỗi polynucleotide cuộn lại có đoạn tạo mạch xoắn kép, hình thành cấu trúc bậc hai tRNA Hình 1.13 Cấu trúc tRNA Enzyme aminoacyl tRNA synthetase gắn amino acid với tRNA tương ứng Mỗi enzyme đặc hiệu cho loại amino acid riêng biệt xúc tác phản ứng gắn với tRNA nhờ lượng ATP tạo aminoacyl tRNA Phức hợp aminoacyl tRNA đến ribosome gắn với mRNA nhờ ba đối mã (anticodon) tRNA bắt cặp bổ sung với ba mã hóa (codon) mRNA Các tRNA có số đặc tính cấu trúc chung: chiều dài khoảng 73-93 nucleotide, cấu trúc gồm mach cuộn lại hình chẻ ba nhờ bắt cặp bên phân tử Đầu mút có trình tự kết thúc CCA, amino acid ln gắn vào đầu Đầu chứa gốc phosphate G Mỗi tRNA có có 4-5 vùng với chức khác nhau: - Vịng DHU: có chứa nucleotide dihydrouridin, vùng có chức nhận biết aminoacyl tRNA synthetase - Vòng anticodon: đọc mã mRNA theo nguyên t ắc kết cặp anticodon codon - Vịng phụ: khơng có số RNA - Vịng TφC: có chứa nucleotide pseudouridin, vùng có chức nhận biết ribosom để vào vị trí tiếp nhận aminoacyl tRNA (vị trí A) - Đấu CCA: vị trí gắn với acid amin tRNA chiểm khoảng 15% tổng số RNA tế bào 2.3 RNA thông tin (messenger RNA mRNA) RNA thông tin làm nhiệm vụ truyền đạt thông tin di truyền từ DNA đến protein mRNA chiểm khoảng 5% tổng số RNA tế bào Cấu trúc mRNA: DNA polymerase khởi phiên mã đoạn nằm trước vùng mã hóa gọi đoạn khơng mã hóa (5 -non coding) Do mRNA có đoạn đầu mang tín hiệu cho ribosome nhận biết để gắn vào dịch mã Ở sau dấu kết thúc có đoạn khơng mã hóa nới gắn poly-A Các mRNA prokaryote có thời gian (half life) tồn ngắn trung bình phút Các mRNA Eukaryote có thời gian tồn khoảng 30 phút - 24 Hình 1.14 mRNA Prokaryote Hình 1.15 mRNA eukaryote 2.4 Ribozym self- splicing Vào 1981, phát minh vai trò xúc tác số phân tử RNA làm đảo lộn quan điểm chất Các phân tử rRNA loài nguyên sinh động vật, lúc đầu tổng hợp với số lượng lớn tiền chất, từ số rRNA có tạo cách tự cắt nối (self splicing) Q trình cắt nối xảy in vitro vắng mặt protein Điều cho thấy trình tự intron tự có hoạt tính xúc tác tương tự enzyme Phản ứng self-splicing trình tự intron tự xúc tác trình tự cắt rời khỏi phân tử rRNA loài Tetrahymena qua bước: + phản ứng bắt đầu nucleotide G gắn vào trình tự intron, đồng thời cắt mạch RNA + Đầu RNA vừa tạo gắn vào đầu bên intron hồn thành phản ứng nối liền Hình 1.16 Hoạt động cắt intron nối exon mRNA Trình tự intron dài 400 nucleotide tổng hợp ống nghiệm cuộn lại tạo phức hợp bề mặt có hoạt tính tương tự enzyme phản ứng với RNA khác Mặc dù splicing phần lớn không thực tự động Tetrahymena tượng phát sinh vật khác, nấm vi khuẩn Các RNA có khả tự xúc tác gọi ribozyme Phát có ý nghĩa quan trọng việc tìm hiểu chế nguồn gốc sống Hình 1.17 Phản ứng self-splicing RNA III Các tính chất DNA Biến tính (denaturation) hồi tính (renaturation) Hai mạch đơn phân tử AND gắn với nhờ liên kết hydro.Khi đun nóng DNA từ từ, vượt nhiệt độ sinh lý (khoảng 80-95oC), liên kết hydro mạch bị đứt chúng Cơ chế xác định giới tính người động vật Đặc điểm di truyền liên kết với giới tính Cơ sở hình thành nhiễm sắc thể tái tổ hợp Nêu ứng dụng di truyền liên kết với giới tính Chứng minh trao đổi chéo xảy giai đoạn chromatid Cơ sở tế bào học trao đổi chéo So sánh quy luật di truyền liên kết hồn tồn quy luật hốn vị gen Di truyền học Morgan bổ sung cho di truyền học Mendel nào? Tài liệu tham khảo Trịnh Văn Bảo, Phan Thị Hoan, Trần Thị Thanh Hương, Trần Thị liên, Trần Đức Phấn, Phạm Đức Phùng, Nguyễn Văn Rực, Nguyễn Thị Trang 2002 Các nguyên lý sinh học NXB Y học Hà Nội Phạm Thành Hổ (2000) Di truyền học NXB Giáo Dục Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998) Cơ sở di truyền học NXB Giáo Dục Hoàng Trọng Phán (1995) Di truyền học phân tử Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J F Griffiths, Susan R Wessler, Richard C Lewontin, William M Gelbart, David T Suzuki, Jeffrey H Miller 2004 An introduction to genetics analysis W.H Freeman Publishers Harlt D.L., Jones E.W (1998) Genetics - Principle and analysis Jone and Bartlett Publshers Toronto, Canada Stansfield W.D 1991 Schaum’s outline of theory and problems of genetics McGraw-Hill, Inc., New York Chương Di truyền học Vi khuẩn Mục tiêu chương Giới thiệu tượng di truyền vi khuẩn, chuyển vị sở di truyền tính kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh Số tiết: Nội dung I Ưu đặc điểm đối tượng vi sinh vật Thời gian hệ ngắn, tốc độ sinh sản nhanh Trong điều kiện thuận lợi, tế bào E.coli phân chia lần 20 phút, cịn bacteriophage thời gian 30-40 phút tạo hàng trăm cá thể, nấm men chia tế bào Đặc điểm nghiên cứu di truyền học theo dõi qua nhiều hệ nên đối tượng vi sinh vật giúp rút ngắn đáng kể thời gian thí nghiệm Nếu so sánh thời gian hệ ruồi giấm (2 tuần), chuột (2 tháng), người (20 năm) vi sinh vật ưu Có tăng vọt số lượng cá thể Trong điều kiện đủ dinh dưỡng vi sinh vật sinh sản nhanh tạo quần thể có số lượng cá thể đủ lớn, có số lượng 1010 -10 12 tế bào Tế bào E.coli có đường kính m đủ dinh dưỡng 44 tạo sinh khối đất Ruồi dấm đối tượng thuận lợi cho nghiên cứu di truyền học quần thể, đạt 105 - 106 cá thể Nhờ số lượng cá thể lớn phát kiện di truyền hoi với tần số 10-8- 10-11 Như số lượng cá thể lớn giúp nâng cao suất phân giải di truyền tức khả phát đột biến tái tổ hợp có tần số xuất nhỏ Ngồi việc ni cấy vi sinh vật khơng cồng kềnh, tốn diện tích, mơi trường ni cấy dễ kiểm sốt theo cơng thức chặt chẽ Có cấu tạo máy di truyền đơn giản Ở vi sinh vật có cấu tạo máy di truyền DNA trần, dễ tiến hành thí nghiệm trực tiếp DNA dễ chiết tách, tinh sạch, số locus so với sinh vật khác Các vi nấm vi tảo tồn dạng đơn bội với thời gian dài chu trình sống nên gen lặn biểu kiểu hình Ngồi vi sinh vật kể cịn có trạng thái lưỡng bội (2n) nên dễ dàng thực phân tích tái tổ hợp Các tính trạng vi sinh vật đơn giản Đối với tính trạng sinh hóa hay tính đề kháng dễ sử dụng mơi trường chọn lọc để phát Dễ nghiên cứu kỹ thuật vật lý hóa học Đa số vi sinh vật có cấu tạo đơn bào nên quần thể chúng có độ đồng cao so với sinh vật có máy đa bào bắt nguồn từ nhiều loại mô khác Cấu tạo tế bào vi sinh vật đơn giản, dễ chết tách tinh DNA Có thể ni vi sinh vật đồng tức đa số tế bào giai đoạn phát triển gần giống Ví dụ: nấm men ni mơi trường có bổ sung acetat, tất tế bào nấm men tạo bào tử Tảo Chlorella nuôi tối 18-19 giờ, tất chúng thực phân chia giảm nhiễm II Đặc điểm di truyền vi sinh vật - Khuẩn lạc (dòng tế bào) cụm tế bào có nguồn gốc từ tế bào ban đầu - Chủng: dòng tế bào mang đặc điểm di truyền Các đột biến vi sinh vật thường phát theo biến đổi tính trạng sau: - Hình thái: kích thước, hình dạng tế bào hay khuẩn lạc, có màng nhân hay khơng - Sinh hóa: diện sắc tố, màu sắc đặc trưng - Nuôi cấy: kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng, nhu cấu đòi nhân tố tăng trưởng - Tính đề kháng: kháng thuốc, kháng phage, chịu nhiệt - Miễn nhiễm: phản ứng kháng nguyên, kháng thể Các đột biến xuất ngẫu nhiên hay gây tạo nhờ tác nhân gây đột biến Mỗi gen có tần số đột biến đặc trưng Đặc điểm tái tổ hợp vi khuẩn: Các sinh vật Prokaryote vi khuẩn, virus có q trình sinh sản tương đương sinh sản hữu tính gọi trình sinh sản cận hữu tính (parasexuality), q trình có đặc điểm: - Sự truyền thơng tin chiều từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận - Sự tạo thành hợp tử phần (merozygote) Tế bào thể cho (donor) chuyển đoạn gen sang tế bào thể nhận (recipient), nên lưỡng bội phần, phần khác đơn bội - Bộ gen thường DNA trần, nên có nhóm liên kết gen tái tổ hợp thực chất lai phân tử III Sinh học vi khuẩn Cấu tạo tế bào sinh sản: Tế bào E.coli có chiều dài khoảng m Bên ngồi có vách tế bào, kề màng sinh chất Mezosome cấu trúc xếp lại màng sinh chất liên quan đến phân bào chất di truyền tạo nên nucleotid Các tiêm mao giúp cho vận động tế bào Thông tin tế bào vi khuẩn nằm phân tử DNA mạch kép vòng tròn đơn gọi genophore, hay "NST" Gần phát thấy số vi khuẩn DNA tạo thành phức hợp với protein có tính base để hình thành sợi nhiễm sắc histon NST Eukaryote Ngoài số vi khuẩn cịn có thêm plasmid phân tử DNA vịng trịn nhỏ có khả chép độc lập Phân tử DNA gắn trực tiếp vào màng sinh chất Sự chép DNA tạo gắn chung màng sinh chất Khi tế bào kéo dài DNA tách xa phần màng chúng lớn dần Kiểu sinh sản vơ tính gọi ngắt đôi (Binary fission) Tế bào vi khuẩn chia nhanh nhiều so với tế bào Eukaryote Quá trình chép DNA điểm xuất phát Ori kéo dài phiasong song với trình kéo dài màng sinh chất, nơi có điểm gắn vào DNA gen, mọc dài tách phân tử DNA tế bào Hình 7.1 tế bào vi khuẩn E coli Hình 7.2 Tế bào vi khuẩn phân chia theo trực phân Đặc điểm ni cấy Tế bào vi khuẩn ni mơi trường lỏng có bổ sung muối vơ thiết yếu Mật độ đạt 109 tế bào/ml Có thể ni vi khuẩn mơi trường rắn có agar hộp petri để tế bào mọc thành khuẩn lạc dễ quan sát IV Biến nạp ( Transformation) Hiện tượng điều kiện - Định nghĩa: biến nạp tượng truyền thông tin di truyền DNA Hình 7.3 Biến nạp vi khuẩn Trong biến nạp DNA trần từ tế bào vi khuẩn thể cho truyền sang tế bào vi khuẩn thể nhận khác Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ làm tan, DNA vòng tròn chúng mơi trường thành đoạn thẳng với chiều dài khác có khả gây biến nạp cho tế bào thể nhận khác Hiện tượng biến nạp nghiên cứu nhiều đối tượng: Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus parainfluenzae - Điều kiện thực biến nạp: Hiệu biến nạp phụ thuộc vào yếu tố: + Tính dung nạp tế bào thể nhận Những tế bào dung nạp bề mặt có nhân tố dung nạp Người ta tạo khả dung nạp tế bào thể nhận số xử lý Ví dụ: Streptococcus pneumoniae: 30 - 80 điểm nhận Haemophilus influenzae: 4-8 điểm nhận + DNA thực biến nạp thể cho phải dạng mạch kép, DNA bị biến tính dạng mạch đơn riêng lẻ không cho hiệu biến nạp Thường DNA biến nạp đoạn nhỏ Ở vi khuẩn E.coli đoạn DNA biến nạp khoảng 1/250 - 1/500 genom vi khuẩn Đoạn từ tế bào cho xâm nhập vào tế bào nhận gọi đoạn ngoại lai (exogenote), DNA nguyên vẹn tế bào nhậ gọi đoạn nội (endogenote) Tế bào vi khuẩn nhận đoạn ngoại lai lưỡng bội phần gen gọi hợp tử phần (merozygote) Tuy nhiên, đoạn ngoại lai mạch đơn không bền vững bị phân hủy không gắn vào gen thể nhận Q trình trao đổi thơng tin di truyền chuyển phần vật liệu di truyền từ tế bào sang tế bào khác gọi giao nạp phần (meromixis) Cơ chế biến nạp 2.1 Xâm nhập DNA Ở giai đoạn này, DNA gắn với điểm nhận màng tế bào.Q trình gắn thuận nghịch, gắn vào nhả Sợi DNA mạch kép dòng vi khuẩn S sau chui qua màng tế bào dịng vi khuẩn R mạch S bị nuclease tế bào cắt, cịn lại mạch ngun Hình 7.4 Cơ chế biến nạp tự nhiên 2.2 Bắt cặp DNA thể nhận R biến tính tách rời mạch đoạn để bắt cặp với đoạn DNA thể cho S vừa chui vào Đoạn DNA R đoạn có DNA S bắt cặp bị cắt đứt đẩy Trong q trình bắt cặp, có đoạn khơng tương đồng hình thành nên vịng lồi, đoạn gọi Heteroduplex Cịn đoạn bắt cặp tương đồng gọi Homoduplex 2.3 Sao chép Sau bắt cặp tạo phân tử DNA có đoạn lai R-S, tiến hành chép để tạo hai sợi kép: sợi kép R-R sợi kép khác có mang đoạn DNA thể nhận S-S Hình 7.5 Sơ đồ giai đoạn biến nạp V Tải nạp (Transduction) Phage nhân tố chuyển gen Thí nghiệm tiến hành ống hình chữ U Giữa hai ống hình chữ U ngăn cách màng lọc vi khuẩn, màng có lỗ nhỏ vi khuẩn không qua phage qua Nhánh A ống chứa vi khuẩn có khả tổng hợp tryptophan (trp+), cịn nhánh B ni vi khuẩn khác khả tổng hợp tryptophan (trp-) Sau nuôi thời gian, nhánh B xuất vi khuẩn có khả tổng hợp tryptophan Nếu dùng màng ngăn khơng cho virus lọt qua khơng thấy tượng Qua nhiều lần thí nghiệm, việc tải gen trp+ từ nhánh A sang nhánh B chứng minh Hình 7.6 Thí nghiệm chứng minh tượng tải nạp chế Quá trình xâm nhiễm phage vào vi khuẩn xảy sau: Tải nạp chuyển gen từ vi khuẩn A sang B nhờ phage Đầu tiên phage bám bề mặt vi khuẩn Sau 4’, phage bơm DNA vào tế bào Sau chúng sinh sản khoảng 1/2 sau chúng làm tan tế bào vi khuẩn giải phóng phage Khi DNA phage xâm nhập vào tế bào vi khuẩn A, chúng cắt DNA vi khuẩn A thành nhiều đoạn đồng thời DNA phage chép nhiều phân tử vỏ phage tạo thành Sau vỏ lắp ruột DNA vào, phá vỡ tế bào vi khuẩn tiếp tục xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn khác Trong trình lắp ráp khoảng 1-2% phage vơ tình mang đoạn DNA vi khuẩn có chứa gen Phage mang gen vi khuẩn A xâm nhiễm vi khuẩn B, trình tái tổ hợp xảy làm gen vi khuẩn A gắn vào gen vi khuẩn B Hình 7.7 Chuyển gen từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận nhờ phage Phân biệt dạng tải nạp - Tải nạp chung (general transduction): phage mang gen vi khuẩn A sang vi khuẩn B Tải nạp chung có đặc điểm: + Bất kỳ gen vi khuẩn tải nạp + Tải nạp gói nhầm DNA tế bào chủ phage trưởng thành + Các thể tái hợp đơn bội tạo - Tải nạp chuyên biệt (Special transduction) hay tải nạp hạn chế: trình tải nạp chuyển vài gen định, có đặc điểm: + Những gen chuyển nằm sát chỗ phage gắn vào + Chỉ prophage kiểu  thực + Do kết cắt sai prophage tách khỏi NST tế bào chủ Ví dụ: phage  (kí sinh E.coli) chuyển gen gal (đồng hóa đường galactose) từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác Điểm gắn phage  vào gen vi khuẩn nằm gen gal (galactose) bio (tổng hợp biotin) Đầu phage chứa lượng DNA giới hạn, nên prophage tách từ DNA vi khuẩn tải nạp gen gal bio Sự cắt sai phage  nên tải nạp hạn chế có tần số thấp Hình 7.8 Tải nạp chuyên biệt VI Giao nạp (Conjugation) - Định nghĩa: giao nạp tượng truyền vật chất di truyền từ tế bào thể cho sang thể nhận qua cầu tế bào chất Hình 7.9 Sơ đồ lai vi khuẩn Chứng minh có lai vi khuẩn Vào năm 1946, J Lederberg E Tatum sử dụng dòng đột biến khuyết dưỡng khác nhau: -Dịng A: có kiểu gen met-bio -thr+leu+thi+ (có khả tổng hợp threonin, leucine, thiamin khơng có khả tổng hợp methionin biotin) - Dịng B: có kiểu gen met+bio+thr-leu-thi- (có khả tổng hợp methionin, biotion khơng có khả tổng hợp threonin, leucine, thiamin) Từng dòng riêng rẻ cấy lên mơi trường tối thiểu khơng có khả mọc lên khuẩn lạc Trộn chung hai dòng ống nghiệm, cấy lên môi trường tối thiểu Các khuẩn lạc mọc mơi trường tối thiểu, chứng tỏ có dạng lai, chúng mọc nhờ bù đắp cho nhu cầu dinh dưỡng Các dạng lai có kiểu gen met+bio+thr+leu+thi+ Sự phân hóa giới tính vi khuẩn 1953, Hayes phát vi khuẩn có dạng khác tương tự giống đực sinh vật bậc cao Các dạng kí hiệu tế bào F+ tế bào F- F+ tương tự giống đực sinh vật bặc cao, truyền sạng F- Tần số lai F+ với F- khoảng 10-6 Khi F+ tiếp xúc với F- thời gian, F- biến thành F+ nhận phần tử di truyền episome Episome F+ phần tử di truyền ngồi NST, tồn dạng DNA vòng tròn tự chép gắn vào phân tử DNA tế bào chủ Episome F+ gọi nhân tố giới tính Về sau dạng Hfr (high frequency ò recombination) phát hiện, dạng có tần số lai với F- cao F+ đến 104 lần Hình 7.10 Sơ đồ cấu tạo plasmid Plasmid định nghĩa phân tử DNA vịng trịn nhỏ có khả chép độc lập với tế bào chủ khơng có khả gắn vào NST tế bào chủ Plasmid mang số gen khác Hiện plasmid dùng cho nghĩa episome plasmid Plasmid tồn độc lập gắn vào gen vi khuẩn Bản chất di truyền dòng F-, F+ Hfr xác định plasmid sau: F- không chứa plasmid F+ chứa plasmid dạng độc lập Hfr có plasmid gắn vào gen Hình 7.11 Sự gắn plasmid vào nhiễm sắc thể vi khuẩn tạo vi khuẩn Hfr - Tái tổ hợp trình tự IS plasmid trình tự IS loại nhiễm sắc thể vi khuẩn tạo nhiễm sắc thể Hfr - Tái tổ hợp xảy IS plasmid với IS tương ứng nhiễm sắc thể vi khuẩn tạo nhiều chủng Hfr khác Các nhân tố F' tính nạp (Sexduction) Sự cắt rời nhân tố F từ NST dòng Hfr nhiều khơng xác lúc đoạn gen vi khuẩn thay cho phần F Trong trường hợp nhân tố F' hình thành chuyển gen vi khuẩn cách độc lập với tính trạng tế bào thể cho Hiện tượng cịn gọi tính nạp, nghĩa chuyển gen kèm theo nhân tố giới tính Nhờ tính nạp mà nhận thể lưỡng bội phần (merodiploid) theo gen gắn vào F+ Cơ chế tái tổ hợp Khi có tiếp xúc hai loại tế bào khác dấu Hrf F- F+ F- Dòng tế bào mang nhân tố F+ coi tế bào đực có khả tạo protein pilin, từ protein tạo ống giao nạp gọi pilus Sự co lại pilus nối tế bào làm chúng gần Tế bào F- coi tế bào cái, sau giao nạp tế bào F- trở thành tế bào F+ Việc chuyển gen thực plasmid gắn vào gen vi khuẩn Trong trình chuyển vật chất di truyền sang F- DNA tế bào chủ chép mạch có Ori đầu F cuối Quá trình chuyển DNA từ F+ sang F- bị ngắt quãng Các gen a, b, c chuyển chiều từ Hfr sang F- Dịng Hfr có tần số lai cao nhiều plasmid nằm sẵn gen Cịn F+ phải qua giai đoạn plasmid gắn vào gen chuyển gen Hình 7.12 Thí nghiệm giao nạp để lập đồ ngắt quảng khoảng thời gian khác Sự truyền DNA từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhân Trong điều kiện thí nghiệm 370C, nguyên gen tế bào E.coli chuyển sang tế bào nhận vòng 90 phút Thường giao nạp bị ngắt quãng chừng cầu pilus bị gãy, lúc tế bào F- tế bào F- Bằng cách ngắt quãng trình giao nạp mà đồ di truyền E.coli xây dựng nên có dạng vịng trịn VII Cơ sở di truyền tính kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh người Ý nghĩa transposon vi khuẩn Các transposon vi khuẩn yếu tố làm thay đổi vị trí gen, kiểm sốt tính kháng thuốc thuốc kháng sinh thuốc chống vi khuẩn khác Chúng dễ dàng truyền từ tế bào sang tế bào khác Ngay sau đó, người ta xác định gen kháng thuốc thường có plasmid Các plasmid truyền từ tế bào mẹ sang tế bào tế bào vừa phân chia Trong điều kiện thực nghiệm cho thấy 100% quần thể tế bào nhạy cảm thuốc trở thành kháng thuốc sau thời gian trộn với vi khuẩn kháng thuốc Các gen kháng thuốc truyền từ plasmid cho NST vi khuẩn, cho virus cho vi khuẩn lồi khác Mọi plasmid R có tối thiểu thành phần: - Một đoạn mang gen truyền AD tiếp hợp (tương tự transposon plasmid F) - Một đoạn mang gen kháng thuốc Đoạn thứ gọi yếu tố làm vật truyền tính kháng (RTF - Resistance transfer vector) Đoạn thứ hai mang gen kháng gọi yếu tố kháng R (R - determinant) Ở số plasmid R, yếu tố kháng R cài đoạn xen IS Trong nhiều trường hợp chúng làm cho yếu tố kháng vận động từ plasmid R sang plasmid R khác Các đoạn IS thúc đẩy tiến hóa nhanh plasmid vi khuẩn ngày mang nhiều yếu tố kháng thuốc Không phải plasmid truyền phạm vi lồi vi khuẩn Mà chúng cịn truyền qua lồi dịng di truyền khác vi khuẩn Ví dụ: plasmid R E.coli phát số giống proteus, Samonella, Haemophilus, Pastugella Tất loài loài gây bệnh Ngày người ta thấy tần số tăng lên rõ rệt vi khuẩn mang plasmid R với yếu tố kháng R có sức kháng ghê gớm với thuốc kháng sinh: penicylin, tetracylin, streptomycin kanamycin Các nghiên cứu Nhật Bản cho biết vòng 10 năm trở lại đây, quần thể vi khuẩn tự nhiên (trong cống, rãnh, hồ, ao bị ô nhiễm) tăng hẳn lên, từ tần số thấp 1% plasmid R có kháng thuốc lên đến tần số cao 50-80% Các kết nêu cho thấy, cần hạn chế lưu ý sử dụng kháng sinh có nhiễm trùng khơng nên lạm dụng trường hợp nhẹ Nếu khơng hạn chế tươpng lai thuốc giảm hiệu không cịn hiệu Tính kháng thuốc ngày phát nhiều loại gen gây bệnh gen thương hàn, viêm dày, ruột, dịch hạch, sốt cao, viêm màng não, lậu Câu hỏi ôn tập Phân biệt nòi vi khuẩn F+, F- Hfr E coli Trình bày chế biến nạp Phân biệt tải nạp chung tải nạp đặc hiệu So sánh biến nạp tải nạp Thể tái tổ hợp gen khác theo thời gian xảy giao nạp nào? Đặc điểm tái tổ hợp vi khuẩn Tế bào F- hình thành tế bào F+ tế bào Hfr nào? Tài liệu Tham khảo Phạm Thành Hổ 2000 Di truyền học NXB Giáo Dục Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998) Cơ sở di truyền học NXB Giáo dục Hoàng Trọng Phán 1995 Di truyền học phân tử Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J F Griffiths, Susan R Wessler, Richard C Lewontin, William M Gelbart, David T Suzuki, Jeffrey H Miller 2004 An introduction to genetics analysis W.H Freeman Publishers Cann AJ 2001 Priciple of molecular virolory Academic Press London, UK Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM 2000 Principles of Virology Molecular Biology, Pathogenesis, and Control ASM Press, Washington DC Printed in the United States of America Harlt D.L., Jones E.W 1998 Genetics - Principle and analysis Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada Hartwell et al 2003 Genetics: From genes to genomes, Second editor The McGraw-Hill Companies Old RW & Primrose SB 1989 Principles of gene manipulation Blackwell Scientific Publication Stansfield W.D 1991 Schaum’s outline of theory and problems of genetics McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R 2004 Molecular biology of the gene Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America ... tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (19 98) Cơ sở di truyền học NXB Giáo Dục Hoàng Trọng Phán (19 95) Di truyền học phân tử Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J F... Đại học Huế Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (19 98) Cơ sở di truyền học NXB Giáo Dục Hoàng Trọng Phán (19 95) Di truyền học phân tử Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J F Griffiths, Susan R... nhân tố di truyền để nhân tố này, giao tử chứa nhân tố lai tạo loại giao tử Để chứng minh điều này, ông đem lai phân tích (Test cross) F1 F1 : Aa x aa  1Aa : 1aa Hiện gen hiểu nhân tố di truyền