CHƯƠNG III- SINH LÝ HỌC VI KHUẨN -Giảng viên: BSTY Nguyễn Xuân Hòa – PGS.TS Phạm Hồng Sơn -Tóm tắt: Chương thời lượng 10 tiết giảng với 32 trang lý thuyết xen kẽ hình ảnh minh họa Nội dung chương nghiên cứu thành phần hóa học tế bào vi khuẩn, chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào vi khuẩn sinh trưởng phát triển Hiểu biết chất dinh dưỡng thúc đẩy phát triển vi khuẩn có lợi đồng thời tìm cách ức chế phát triển vi sinh vật có hại Tìm hiểu trình vận chuyển chất vào tế bào vi khuẩn giới thiệu phương pháp xác định số lượng vi khuẩn - Mục tiêu: Sinh viên cần nắm thành phần hóa học tế bào vi khuẩn, số trình lên men, phản ứng sinh hóa xẩy tế bào, phương thức vận chuyển chất dinh dưỡng phương pháp định lượng I DINH DƯỠNG Ở VI KHUẨN [1] 1.1 Thành phần hóa học tế bào vi khuẩn Chất dinh dưỡng vi sinh vật, chất vi sinh vật hấp thụ từ môi trường xung quanh chúng sử dụng làm nguyên liệu cho trình sinh tổng hợp tạo thành phần tế bào để cung cấp cho trình trao đổi lượng Quá trình hấp thụ chất dinh dưỡng để thỏa mãn nhu cầu sinh trưởng phát triển gọi trình dinh dưỡng Hiểu biết trình dinh dưỡng sở tất yếu để nghiên cứu, ứng dụng ức chế vi sinh vật Không phải thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật xem chất dinh dưỡng Một số chất cần thiết cho vi sinh vật làm nhiệm vụ bảo đảm điều kiện oxi hóa khử, pH, áp suất thẩm thấu, cân ion, Chất dinh dưỡng phải chất có tham gia vào trình trao đổi chất nội bào Thành phần hóa học tế bào vi sinh vật định nhu cầu dinh dưỡng chúng Thành phần hóa học tế bào vi sinh vật gồm có nước (nước tự nước liên kết) vật chất khô (muối khoáng hợp chất hữu cơ) Lượng chứa nguyên tố vi sinh vật khác không giống Các điều kiện nuôi cấy vi sinh vật khác nhau, giai đoạn khác nhau, lượng chứa nguyên tố loài vi sinh vật không giống 1.1.1 Nước Nước thành phần thiếu thể sống Nước chiếm khoảng 70-90% khối lượng thể vi sinh vật Tất phản ứng xẩy tế bào vi sinh vật đòi hỏi có tồn nước Trong vi khuẩn lượng chứa nước thường 70-85%, nấm sợi 85-90% Từ thời cổ xưa người ta biết sấy khô loại thực phẩm để đình phát triển vi sinh vật Việc dùng muối đường để bảo quản thực phẩm chẳng qua tạo khô cạn sinh lý không thích hợp cho phát triển vi sinh vật Nước tế bào thường tồn hai trạng thái khác nhau: nước tự nước liên kết Nước tự nước không tham gia vào cấu trúc hợp chất hóa học tế bào nên dễ bay sấy khô Nước liên kết nước tham gia vào cấu tạo hợp chất hữu tế bào, nước liên kết khó tách sấy Yêu cầu vi sinh vật nước biểu thị cách định lượng độ hoạt động nước môi trường ký hiệu aw Độ hoạt động nước hay độ hoạt động thủy phần môi trường xác định: aw= Ở P áp lực nước dung dịch, Po áp lực nước nguyên chất, dung dịch có nồng độ cao P nhỏ Nước nguyên chất có aw=1, nước biển có aw=0,98, máu người aw=0,995, cá muối có aw= 0,75 Mỗi vi sinh vật thường có aw tối thích aw tối thiểu, số vi sinh vật phát triển môi trường có áp suất thẩm thấu cao người ta gọi chúng vi sinh vật chịu áp lực cao Chẳng hạn aw chấp nhận Saccharoces rouxii 0,85, Halococcus 0,75 Khả chịu khô hạn nấm cao so với vi sinh vật khác Phần nước tham gia vào trình trao đổi chất vi sinh vật gọi nước tự Phần lớn nước vi sinh vật tồn dạng nước tự Nước kết hợp nước liên kết với hợp chất hữu cao phân tử tế bào (L, P, hydrate carbon, ), nước liên kết khả hòa tan lưu động 1.1.2 Vật chất khô - Muối khoáng Muối khoáng phần lại đốt cháy hoàn toàn chất hữu chúng chiếm khoảng 2-5 % khối lượng khô tế bào Chúng thường tồn dạng muối sulphate, phosphate, carbonate, clorua, tế bào chúng thường dạng ion Dạng cation : Mg2+, Ca2+, K+, Na+, Dạng anion HPO4-, SO42-, Cl-, Các ion tế bào vi sinh vật tồn tỷ lệ định nhằm trì pH áp suất thẩm thấu cho loài vi sinh vật Thành phần hoá học của một tế bào vi khuẩn  Phân tử % khối lượng khô Protein 55 Polysaccharide Lipid 9,1 ADN 3,1 ARN 20,5 Tổng đơn phân tử 3,5 Acid amine tiền thể 0,5 Đường tiền thể Nucleotit tiền thể 0,5 Các ion vô -Chất hữu Chất hữu tế bào vi sinh vật chủ yếu cấu tạo từ nguyên tố C, H, O, N, P, S, Riêng nguyên tố C, H, O, N chiếm tới 90-97% toàn chất khô tế bào Đó nguyên tố chủ chốt cấu tạo nên protein, nucleic acid, lipid, hydrate carbon Trong tế bào vi khuẩn hợp chất đại phân tử thường chiếm tới 96% khối lượng khô, chất đơn phân tử chiếm 3,5%, ion vô có 1% +Protein: Cấu tạo chủ yếu từ nguyên tố: C, O, N, H, S có lượng nhỏ nguyên tố khác P, Fe, Zn, Mn, Ca, Đơn phân cấu tạo nên protein acid amine Các acid amine phân tử protein đuợc liên kết với liên kết peptide (liên kết cộng hoá trị -CO-NH-) Liên kết tạo thành phản ứng kết hợp nhóm carboxil (COO- )của acid amine nhóm amine (NH+3) acid amine khác loại phân tử nước + H3N - CH(R1) - COO- + +H3N - CH(R2) - COO-→+H3N CH(R1) - C(O) - NH - CH(R2) - COO- + H2O Tùy theo số lượng acid amine liên kết với mà ta có dipeptide , tripeptide, tetrapeptide, phân tử có 15 liên kết peptide trở lên gọi polypeptide, protein hình thành từ vài chuỗi polypeptide Có 20 loại acid amine tham gia vào cấu trúc protein, số acid amine lớn nên tạo nhiều loại protein khác Các protein xếp loại theo hình dạng, theo cấu trúc theo chức năng: +Xếp loại theo hình dạng: Protein hình sợi, Protein hình cầu + Xếp loại theo cấu trúc: Protein đơn giản, protein phức tạp (protein kết hợp) Nucleoprotein (Protein + acid nucleic) Glycoprotein (Protein +hidrate carbon) Lipoprotein (Protein +lipid) Mucoprotein (Protein + mucopolysaccharide) Phosphorprotein (Protein + acidphosphoric) +Xếp loại theo chức năng: Protein phi hoạt tính (kiến tạo, dự trữ, ) Protein hoạt tính (xúc tác, vận tải, chuyển động, truyền xung thần kinh, bảo vệ, ) Trong tế bào vi sinh vật acid amine tham gia cấu trúc protein có acid amine trạng thái tự +Acid nucleic: Cấu tạo chủ yếu nguyên tố, C, H, O, N, P, vào phân tử đường pentose phân tử mà acid nucleic chia làm hai loại: ADN (acid deoxiribonucleic, chứa deoxiribose) ARN (acid ribonucleic, chứa ribose) Các sản phẩm thủy phân loại acid nucleic sau: +ARN → Polynucleotit→ Nucleotit (acid phosphoric, nucleozit (D-Ribose, bazơ nitơ)) Bazơ nitơ ( Adenin-A, Guanin-G, Uraxin-U, Cytozin-C) +ADN → Polynucleotit→ Nucleotit (Ax phosphorric, nucleozit) Nucleozit: (D-2-Deoxibose, bazơ nitơ) Bazơ nitơ ( Adenin-A, Guanin-G, Thymin-T, Cytozin-C) Tỷ lệ G + C vi sinh vật khác không giống Đây tiêu quan trọng phân loại Ví dụ: Chi G+C mol % Clostridium 26-34 Proteus 38-42 Staphylococcus 30-40 +Lipid: gồm có hai loại, lipid phân cực lipid trung tính Lipid phân cực: trạng thái hoạt động, tham gia vào cấu trúc màng (lypoprotein, phosphorlipid, glycolipid) Lipid trung tính dạng dự trữ (các hạt lipid dự trữ tế bào chất) Mesosom nơi chuyển hóa phosphor lipid từ dạng trung tính dự trữ sang dạng hoạt động, mạng lưới nội chất vi sinh vật Tế bào phát triển màng tế bào rộng lipid từ dạng dự trữ chuyển sang dạng hoạt động để tham gia cấu trúc +Glucide: (gluxit) Tế bào vi khuẩn thường chứa lượng glucide, khoảng 12-18 % trọng lượng chất khô Các glucide thường gặp gồm dạng đường đơn (ose), đường kép (osie) đường đa Các loại đường đa thường gặp vi sinh vật là: glucan (glucarl), dextran (dextrane), amylose, chitin, cellulose , Glucide tham gia cấu tạo acid nucleic, vào cấu trúc thành tế bào, vỏ nhầy, vi sinh vật Vỏ nhầy việc hình thành vỏ nhầy liên quan đến độc lực trình bảo vệ vi khuẩn Một số polysaccharide phối hợp với protein để hình thành glucoprotein Gluco-protein kháng nguyên thể vi sinh vật, polysaccharide đóng vai trò bán kháng nguyên Một số polysaccharide vi sinh vật có khả kích thích thể sản sinh kháng thể Glucide nguồn dự trữ lượng sản phẩm trung gian trình trao đổi lượng tế bào vi sinh vật +Vitamine: nhóm chất hữu vi sinh vật cần không tự tổng hợp cần với lượng Nhu cầu vitamine loại vi khuẩn khác không giống Có loại vi sinh vật tự dưỡng chất sinh trưởng, chúng tự tổng hợp vitamine cần thiết Nhưng có loại vi sinh vật dị dưỡng chất sinh trưởng, chúng đòi hỏi phải cung cấp hay nhiều loại vitamine khác vitamine có vai trò quan trọng trình phát triển vi sinh vật Với lượng nhỏ vitamine giúp cho vi sinh vật phát triển bình thường vitamine xem chất xúc tác sinh học phần lớn vitamine nguyên liệu để cấu tạo men Nhiều vitamine có vai trò quan trọng trình chuyển hóa vật chất (như chu trình Crebs, trình quang hợp, ) Trong tự nhiên có số vi sinh vật muốn phát triển bình thường phải cần cung cấp nhiều loại vitamine khác Có số nòi có mức độ phát triển tỷ lệ thuận với nồng độ vitamine định môi trường Người ta sử dụng chúng để kiểm tra định lượng vitamine Dạng coenzyme Vitamine Chức Oxi hoá khử carboxil ketoacid, chuyển nhóm aldehyd B1 (Tiamine) Tiamine pirophosphate (TPP) B2 (Riboflavin) Flavinmononucleotit (FMN), Chuyển hydro flavin adenin dinucleotit (FAD) Oxi hoá ketoacid tham gia vào trao đổi chất acid béo B3 (Acid pantotenic) CoenzymeA B5 (Niaxin) Nicotin adenin (NAD) NADP B6 (Pyridoxin) Pyridoxin phosphate Chuyển amine, khử amine B7 (Biotin) Biotin Chuyển CO2 nhóm cacboxilic D2 Vitamine 1,25-dihydroxicole - canxiferol Trao đổi canxi phốt dinucleotit Khử chuyển hydro Dưới lượng chứa vitamine vài loại vi sinh vật (γ/g trọng lượng khô) Vitamine Enterobacter acrogenes Pseudomonas Clostridium fluorescens butyricum Torulopin utilis Acid nicotinic 249 210 250 500 Riboflavin 44 67 55 49 Thiamine 11 26 6.2 Piridoxin 6 - Acid pantotenic 140 91 93 130 Acid folic 14 2.8 Biotin - 1.8 +Enzyme: Như sinh vật khác vi sinh vật luôn xẩy trình trao đổi vật chất Nói cách khác, trình sống, trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật bao gồm nhiều phản ứng trình phân giải tổng hợp Các phản ứng tiến hành điều kiện bình thường thể vi sinh vật có nhiều loại men Men có nguồn gốc protein hay nói cách khác có chất protein Dựa vào chất hóa học chia men làm hai loại -Men đơn giản: tương ứng với lớp protein đơn giản, gồm loại có thành phần túy acid amine tính xúc tác sinh học chúng quy định cấu trúc phân tử protein - Men phức tạp: thành phần gọi protein (apoenzyme hay apofecment) có phần protein (gọi nhóm thêm hay coenzyme hay cofecment) vitamine hay khoáng Men phải có phân tử lượng lớn có trình chuyển hóa cấu hình không gian từ xúc tác phản ứng hóa học Mỗi men có trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động nơi chất tham gia phản ứng gắn kết vào tác động men Dựa vào vị trí tác dụng men thể vi sinh vật người ta chia men làm hai loại Men nội bào men ngoại bào Men nội bào (endoenzyme) tế bào vi khuẩn phát huy tác dụng xúc tác chuyển hóa tế bào Men ngoại bào exoenzyme) phát huy tác dụng thể vi sinh vật Trong thể vi khuẩn chúng có hàng trăm loại men chúng hoạt động nhịp nhàng Kết hoạt động chúng giúp cho hoạt động sống sinh vật diễn bình thường Ngược lại lý men không hoạt động xúc tác bình thường thể bị ảnh hưởng, trình sống vi sinh vật bị trì trệ đảo lộn, vi khuẩn bị tê liệt hay bị chết + Sắc tố: Khuẩn lạc nhiều vi sinh vật có màu sắc rõ rệt Màu sắc có xuất khuẩn lạc, có hòa tan vào nước khuếch tán môi trường xung quanh Việc tạo thành màu sắc đặc điểm thường sử dụng phân loại vi sinh vật (nhất nấm mốc xạ khuẩn) Ngoài sắc tố quang hợp (được sinh từ vi sinh vật dinh dưỡng quang năng) có nhiều sắc tố khác Sắc tố vi sinh vật thuộc nhiều nhóm hợp chất khác nhau: carotenoit, phenazim, piaron, araquinon, antoxiamine, Khi có mặt sắc tố carotenoit khuẩn lạc có màu đỏ da cam (Sarcina, Micrococcus, Mycobacterium, Corynebacterium, ) Các sắc tố carotenoit phân bố màng nguyên sinh chất tế bào Loại sắc tố giúp cho vi khuẩn tránh khỏi ảnh hưởng có hại ánh sáng mặt trời ánh sáng tử ngoại Các sắc tố với bacteriochlorophill có hoạt tính quang hợp Sắc tố puncherimin tạo thành nấm men Candida puncherima Sắc tố môi trường có chứa Fe tạo nên màu đỏ tối Sắc tố prodigiozin làm cho khuẩn lạc Serratia marcescens (Bacterium prodigiosum) có màu đỏ sáng Sắc tố indigoidin Pseudomonas indigofera nhiều vi khuẩn khác làm cho vi khuẩn có màu lam Vi khuẩn mủ xanh Pseudomonas acruginosa tạo thành sắc tố piocianin số sắc tố khác Một số sắc tố có tính chất kháng sinh Chính nhiều vi sinh vật có màu sắc có khả sinh chất kháng sinh II CÁC KIỂU DINH DƯỠNG Ở VI KHUẨN [2] Khi nuôi cấy vi sinh vật người ta phải pha chế môi trường dạng lỏng đặc Trong môi trường có loại chất hữu có loại chất vô vô Không phải thành phần môi trường gọi chất dinh dưỡng Một số thành phần môi trường có nhiệm vụ đảm bảo điều kiện thích hợp oxi hóa, pH, áp suất thẩm thấu, cân ion, Chất dinh dưỡng phải chất có tham gia vào trao đổi chất tế bào Quá trình hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường xung quanh vào thể sinh vật gọi trình dinh dưỡng 2.1 Nhu cầu thức ăn vi sinh vật Các chất dinh dưỡng sau vào tế bào chế biến lại để tạo thành chất riêng thể trình gọi trình đồng hóa, trình cần lượng Ngược lại với trình đồng hóa trình dị hóa Các sản phẩm trình dị hóa thải môi trường xung quanh phần sử dụng lại cho trình đồng hóa Căn vào nhu cầu vi sinh vật người ta chia thức ăn làm ba loại: -Thức ăn lượng: thức ăn sau hấp thu cung cấp cho vi sinh vật số lượng cần thiết cho hoạt động sống tế bào Các loại protein, glucid, lipid, thức ăn lượng thường gặp -Thức ăn kiến tạo: thức ăn loại sau hấp thụ tham gia xây dựng cấu trúc vi sinh vật Trong thực tế loại thức ăn vừa nguồn lượng vừa nguyên liệu để xây dựng cấu trúc -Chất sinh trường: chất cần thiết cho hoạt động sống loại vi sinh vật mà không tự tổng hợp Căn vào, nguồn bon, nguồn lượng, chất nhận điện tử cuối cùng, người ta phân chia vi sinh vật thành kiểu dinh dưỡng sau Căn vào nguồn carbon: người ta chia vi sinh vật làm hai nhóm, dị dưỡng carbon tự dưỡng carbon + Dị dưỡng carbon: vi sinh vật dị dưỡng carbon loại vi sinh vật sử dụng nguồn carbon tự nhiên từ hợp chất hữu Từ hợp chất hữu nguồn carbon vi sinh vật thu nguồn lượng cần thiết cho hoạt động sống Số lượng trình chuyển hóa hấp thu khác tùy loại vi sinh vật +Tự dưỡng carbon: nhóm vi sinh vật sử dụng nguồn bon từ chất vô CO2 muối carbonate Quá trình cần lượng, vi sinh vật sử dụng hai nguồn lượng như: sử dụng trực tiếp lượng ánh sáng mặt trời, sử dụng lượng hóa học nhờ oxi hóa hợp chất vô Căn vào nguồn lượng: chia vi sinh vật thành dinh dưỡng quang dinh dưỡng hóa +Dinh dưỡng quang năng: vi sinh vật nhờ có sắc tố quang hợp mà có khả hấp thu lượng từ ánh sáng mặt trời chuyển hóa thành lượng hóa học (tích lũy dạng ATP) +Dinh dưỡng hóa năng: vi sinh vật sử dụng lượng chứa hợp chất hóa học Căn vào nguồn carbon nguồn lượng: người ta chia vi khuẩn thành kiểu dinh dưỡng sau: a- Tự dưỡng: -Tự dưỡng quang năng: Nguồn C CO2, nguồn lượng ánh sáng -Tự dưỡng hoá năng: Nguồn C CO2, nguồn lượng số hợp chất vô đơn giản b- Dị dưỡng: Vi khuẩn đòi hỏi phần toàn nguồn dinh dưỡng phải chất hữu có sẵn: hydrate carbon (đường, tinh bột, cellulose , ) Còn nguồn N acid amine, yếu tố phát triển sinh trưởng vitamine, chất chuyển hóa -Dị dưỡng quang năng: Nguồn C chất hữu cơ, nguồn lượng ánh sáng Ví dụ: vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía -Dị dưỡng hoá năng: Nguồn C chất hữu cơ, nguồn lượng từ chuyển hoá trao đổi chất chất nguyên sinh thể khác -Dị dưỡng hoại sinh: Nguồn C chất hữu cơ, nguồn lượng từ trao đổi chất chất nguyên sinh xác hữu -Dị dưỡng kí sinh: Nguồn C chất hữu cơ, nguồn lượng lấy từ tổ chức dịch thể thể sống Ví dụ vi sinh vật gây bệnh cho người, thực vật, động vật Loại phát triển thể sống Như tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon cung cấp chất hữu chất vô Giá trị dinh dưỡng khả hấp thu nguồn thức ăn carbon khác phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hoá học tính chất sinh lý nguồn thức ăn này, hai đặc điểm sinh lý loại vi sinh vật Trên trái đất hợp chất hữu mà không bị vi sinh vật hay vi sinh vật khác phân giải, hay nói cách khác hợp chất hữu bền vững tuyệt vi sinh vật Có loại vi sinh vật đồng hoá hợp chất bền cao su, chất dẻo, dầu mỏ, parafin, khí thiên nhiên Ngay focmon chất diệt khuẩn cực mạnh có nhóm nấm sợi sử dụng chúng làm thức ăn Nhiều chất hữu không tan nước có khối lượng phân tử lớn trước hấp thụ vi sinh vật phải tiết enzyme thủy phân (amylase, cellulose, proteinase, ) để chuyển chúng thành hợp chất dễ hấp thụ (đường, acid amine, acid béo, ) Người ta thường sử dụng đường để làm thức ăn carbon cho vi sinh vật dị dưỡng Chú ý đường đơn nhiệt độ cao chuyển hoá thành hợp chất có màu tối gọi đường cháy, khó hấp thụ Trong môi trường kiềm, sau khử trùng đường dễ bị acid hoá làm thay đổi pH môi trường Để tránh tượng hấp khử trùng môi trường đường người ta thường hấp áp lực 0,5atm (112,50C) trì 30 phút Với loại đường đơn, tốt nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn, dùng nến lọc hay màng lọc vi khuẩn Khi chế tạo môi trường chứa tinh bột, trước hết phải hồ hoá tinh bột 60-700C, sau đun sôi đưa hấp cao áp cellulose đưa vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải cellulose dạng giấy lọc, bột cellulo Khi sử dụng lipid, parafin, dầu mỏ, để làm nguồn carbon nuôi cấy số loại vi sinh vật, phải thông khí mạnh giọt nhỏ tiếp xúc với thành tế bào vi sinh vật Nồng độ đường để nuôi cấy loại vi sinh vật khác không giống nhau, với vi khuẩn, xạ khuẩn dùng 0,05-0,2 % đường với nấm men dùng 3-10% đường Hầu hết vi sinh vật đồng hoá đường dạng đồng phân D, phần lớn đồng phân đường đơn tự nhiên dạng D dạng L Các hợp chất hữu chứa C N sử dụng làm vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N cho vi sinh vật (pepton, nước thịt, nước chiết nấm men, nước chiết giá đậu, nước chiết ngô, ) Phạm vi đồng hoá nguồn thức ăn carbon loài vi sinh vật cụ thể khác Có thực nghiệm cho thấy vi khuẩn Pseudomonas cepacia đồng hoá 90% loại nguồn thức ăn carbon, loại vi khuẩn sinh mêtan đồng hoá CO2 vài hợp chất chứa hai carbon mà Với vi sinh vật dị dưỡng nguồn thức ăn carbon làm hai chức năng: nguồn dinh dưỡng nguồn lượng Một số vi khuẩn dị dưỡng, vi khuẩn gây bệnh, sống máu, tổ chức ruột người động vật muốn sinh trưởng được, cabon hữu cần phải cung cấp lượng nhỏ CO2 phát triển đựơc Trong công nghiệp lên men, nguồn rỉ đường nguồn carbon rẻ tiền thích hợp sử dụng nhiều loại vi sinh vật khác 2.2 Nguồn thức ăn nitơ vi khuẩn Nitơ có ý nghĩa quan trọng phát triển vi sinh vật, nguồn Nitơ dễ hấp thụ vi sinh vật NH3 NH+4, chúng xâm nhập vào tế bào dễ dàng tạo nên nhóm amine Trước có số quan điểm cho rằng, số vi khuẩn không sử dụng muối amon để đồng hoá Quan điểm không đúng, ngày người ta cho tất loại vi sinh vật có khả sử dụng muối amon Urea nguồn thức ăn nitơ trung tính mặt sinh lý, bị phân giải enzyme urease giải phóng thành NH3 CO2 NH3 vi sinh vật sử dụng mà không làm chua môi trường muối amon NH2-CO-NH2+ H2O (urease)→ NH3+ CO2 Nhiều để nuôi cấy vi sinh vật nguồn nitơ từ urê, người ta phải bổ sung thêm muối amon phải có thức ăn nitơ dễ hấp thụ cho vi sinh vật phát triển có men urease để thủy phân urea Nguồn nitơ có trữ lượng nhiều tự nhiên nguồn khí nitơ tự (N2) khí Chúng chiếm tỷ lệ cao không khí (75,5% khối lượng 78,16% theo thể tích) Số lượng nitơ khí đất 85000 tấn, trái đất có khoảng 4x1015 Trong phân tử khí nitơ hai nguyên tử N liên kết với ba liên kết bền vững khó tách để liên kết với chất khác nitơ có nhiều chung quanh ta mà người, động vật lẫn trồng thiếu thức ăn nitơ Đa số vi sinh vật khả đồng hoá N2 không khí, nhiên có vi sinh vật chuyển hoá N2 thành NH3 nhờ hoạt động xúc tác hệ thống enzyme có tên gọi nitrogenase Người ta gọi vi sinh vật vi sinh vật cố định nitơ trình đuợc gọi trình cố định nitơ (vi khuẩn cố định nốt sần họ đậu) Nguồn nitơ hữu thường sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật pepton loại chế phẩm thủy phân không triệt để loại protein Hiện người ta ứng dụng siêu âm để thu nhận chế phẩm vô bào để tách enzyme nội bào, phân lập số thành phần tế bào, riboxom, thành tế bào màng tế bào chất Sức căng bề mặt Khi sinh trưởng môi trường dịch thể, vi khuẩn chịu ảnh hưởng sức căng bề mặt môi trường Đa số môi trường dịch thể dùng phòng thí nghiệm có sức căng bề mặt khoảng 5,7-0,63 mN/cm Những thay đổi mạnh mẽ sức căng bề mặt làm ngừng sinh trưởng làm chết tế bào Khi sức căng bề mặt thấp, thành phần tế bào bị tách khỏi tế bào Điều chứng tỏ thành tế bào bị tổn thương Các chất nâng cao sức căng bề mặt, hầu hết muối vô cơ, chất làm giảm sức căng bề mặt hầu hết acid béo, anchol, chất gọi chất có hoạt tính bề mặt Tác dụng chúng thể việc làm thay đổi đặc tính bề mặt tế bào vi khuẩn, trước hết nâng cao tính thấm tế bào Trong thực tế người ta ứng dụng tượng nuôi cấy vi khuẩn kháng acid Khác với vi khuẩn khác, vi khuẩn kháng acid, có bề mặt kỵ nước giảm sức căng bề mặt môi trường kích thích sinh trưởng chúng Sức căng bề mặt ngăn cản vi khuẩn gắn vào bề mặt cứng, tránh cho chúng khỏi cạnh tranh sinh trưởng Tia xạ Ánh sáng gây biến đổi hóa học tổn thương sinh học, tế bào hấp thu Mức độ gây hại tùy thuộc vào mức lượng lượng tử ánh sáng hay tùy thuộc vào chiều dài bước sóng ánh sáng Các tia xạ gây nên biến đổi hóa học nguyên tử phân tử có chiều dài sóng khoảng 10000 A0 Thuộc loại sau: ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại, tia X, tia Gamma tia vũ trụ, tia sáng có lượng lớn Khi vật chất hấp phụ chúng làm bắn electron từ vật chất Vì tia gọi tia xạ ion hóa Những xạ với chiều dài bước sóng lớn có lượng nhỏ, không đủ gây nên biến đổi hóa học tác dụng biểu chủ yếu nhiệt tia hồng ngoại 6.1 Ánh sáng mặt trời Là nguồn tia sáng chiếu tự nhiên có tác dụng phá hủy tế bào vi khuẩn (ngoại lệ vi khuẩn quang hợp sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn lượng) Tác dụng bị yếu vi khuẩn chứa sắc tố hay vỏ nhầy Ánh sáng mặt trời gián tiếp tác động lên tế bào làm biến đổi môi trường Chẳng hạn, tụ cầu khuẩn Staphylococcus không sinh trưởng môi trường thạch bị chiếu tia sáng mặt trời vài Ảnh hưởng ánh sáng mặt trời lên tế bào vi khuẩn tăng cường xử lý tế bào số thuốc nhuộm (metylen, ) Người ta gọi tượng có tác dụng quang động học ánh sáng 6.2 Tia tử ngoại (tia cực tím -UV) [2] So với xạ ion tia tử ngoại có lượng nhỏ Khi bị vật chất hấp phụ, tia tử ngoại không gây nên tượng ion hóa kích thích phân tử, nghĩa chuyển điện tử đến mức cao Tác dụng mạnh tia tử ngoại là vùng có chiều dài bước sóng khoảng 254-260 nm nghĩa vùng hấp thụ cực đại acid nucleic nucleoprotein Dưới ảnh hưởng tia tử ngoại, vi khuẩn bị chết bị đột biến theo loại vi khuẩn liều lượng chiếu, bào tử mốc có sức đề kháng cao Điều đáng ý hư hại tia tử ngoại gây cho tế bào phần có tính đảo ngược Nếu sau chiếu tia tử ngoại, ta lại cho vi khuẩn chịu tác dụng ánh sáng ban ngày, nhiều vi khuẩn có khả sống sót tiếp tục phân chia Hiện tượng gọi tượng quang tái hoạt Trong trình quang tái hoạt số enzyme gọi enzyme sửa chữa tổng hợp hoạt hóa Enzyme xúc tác việc phá hủy liên kết dime-timin xuất thời gian chiếu tia tử ngoại Hiện tượng sửa chữa ADN bị tổn hại sau chiếu tia tử ngoại xảy bóng tối Trước hết endonuclease tách rời dime-timin nguyên vẹn ra, sau men ADN-polymerase tiến hành sửa chữa cách tổng hợp đoạn ADN bị thiếu, cuối enzyme polynucleotidase liên kết đoạn ADN tổng hợp lại Tia tử ngoại ảnh hưởng đến acid nucleic (đặc biệt với mARN) tế bào sinh vật Cistein hợp chất chứa nhóm SH gần với có khả hấp phụ tia tử ngoại, có tác dụng bảo vệ vi sinh vật khỏi tác hại tia Tia sáng mặt trời có chứa phần tia tử ngoại phần lớn tia bị khí (mây, ozon, ) giữ lại Vì ánh nắng có tác dụng diệt khuẩn nhỏ so với tia tử ngoại dùng phòng thí nghiệm Do lực xuyên sâu tia tử ngoại kém, xuyên qua lớp nước thủy tinh mỏng nên thường sử dụng khử trùng không khí, buồng cấy vi sinh vật, phòng mổ III ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ HÓA HỌC Trong yếu tố hóa học ảnh hưởng đến chức phận sống tế bào, trước hết phải kể đến, nồng độ ion hydro (pH), oxy hóa khử môi trường, chất sát trùng chất hóa trị liệu Ảnh hưởng pH môi trường pH môi trường có ý nghĩa định phát triển vi sinh vật Các ion H+ OH- hai ion hoạt động lớn tất ion, biến đổi dù nhỏ chúng ảnh hưởng mạnh mẽ Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu pH trì trình nuôi cấy việc làm quan trọng Giới hạn hoạt động vi sinh vật khoảng pH= 4-10 Đa số vi sinh vật sinh trưởng tốt môi trường có pH =7, nhiều vi khuẩn gây bệnh thể người động vật pH máu, huyết 7,4 Các vi khuẩn nitrat hóa, vi khuẩn nốt sần, vi khuẩn phân giải ure lại ưa môi trường kiềm, số khác lại ưa acid Acetobacter acidophilus, Thiobacillus thioxydans (oxy hóa lưu huỳnh thành SO4 sinh trưởng pH 30 lợi vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Vi sinh vật kỵ khí hay hiếu khí tùy tiện thích ứng rH2 = 0- 30 Ưng dụng: nuôi cấy vi sinh vật hay bảo quản, chế biến khống chế lượng oxy để tăng cường hay ức chế tăng trưởng vi sinh vật Trong điều kiện cần thiết điều chỉnh độ pH làm giảm pH môi trường Eh giảm (rH giảm) để nuôi cấy vi khuẩn yếm khí bắt buộc môi trường có oxy Oxy có vai trò qua trọng hoạt động sống vi sinh vật Trong không khí, O2 chiếm 20,95% thể tích 23,14% khối lượng Tùy thuộc vào nhu cầu oxy mà người ta chia vi sinh vật thành nhóm sau -Hiếu khí bắt buộc: thuộc nhóm vi sinh vật sinh trưởng có mặt oxy phân tử Chúng có chuỗi hô hấp hoàn chỉnh, dùng O2 làm thể nhận hydro cuối -Hiếu khí không bắt buộc: thuộc nhóm vi sinh vật sinh trưởng điều kiện có oxy lẫn điều kiện oxy, có oxy chúng sinh trưởng tốt Ví dụ: E coli, Proteus, -Vi hiếu khí: thuộc nhóm vi sinh vật sinh trưởng điều kiện áp lực oxy thấp, loại Vibrio cholerae, Zymononas, -Kỵ khí chịu dưỡng: vi khuẩn kỵ khí tồn có mặt oxy Chúng không sử dụng oxy, chuỗi hô hấp, có mặt oxy hại cho chúng Streptococcus lactic, S faecalis -Kỵ khí: với vi sinh vật thuộc nhóm có mặt oxy có hại với chúng, chúng sinh trưởng môi trường dịch thể sâu, nơi oxy Các chất diệt khuẩn (sát trùng) Các chất diệt khuẩn thường dùng phenol hợp chất phenol, ancohol, halogen, kim loại nặng, H2O2 thuốc nhuộm, xà phòng chất tẩy rửa tổng hợp muối amon bậc bốn 3.1 Phenol Được dùng dạng dung dịch để sát trùng dụng cụ bị nhiễm bẩn Tùy theo nồng độ phenol có tác dụng ức khuẩn hay diệt khuẩn Hoạt tính phenol bị giảm môi trường kiềm có mặt chất hữu cơ, trái lại tăng lên có mặt muối Bào tử vi sinh vật kháng lại tác dụng phenol Một dẫn xuất phenol crezol có hoạt tính mạnh phenol Phenol crezol tác dụng chủ yếu lên lớp màng tế bào, phá hoại tính bán thấm màng tế bào chất làm biến tính protein 3.2 Ethanol Dùng để sát trùng da, phenol ethanol tác dụng với bào tử Chẳng hạn, bào tử Bacillus subtillis sống ethanol năm, B anthracis 20 năm Alcohol tác dụng cách gây đông tụ protein dung giải cấu trúc màng phospholipid Nhưng alcohol có nồng độ cao khử nước mạnh, rút nước khỏi tế bào, cản trở xâm nhập ancohol vào tế bào có tác dụng ức khuẩn, cố định vi khuẩn (ethanol 70% có tác dụng sát trùng mạnh 90%) 3.3 Các halogen tác dụng độc với vi khuẩn nước Khí Cl2 dùng để sát trùng nước, hợp chất Cl dùng để khử trùng Một chất quan trọng nhóm halogen iot Iot dễ hòa tan ancol dung dịch nước iodua kali natri Iod có tác dụng sát trùng mạnh với tất loài vi khuẩn bào tử, thường dùng dể sát trùng da tẩy không khí (I+iodua kali, khử trùng không khí) 3.4 Kim loại nặng Đa số kim loại nặng dù dạng nguyên chất hay hợp chất có tác dụng đầu độc với vi khuẩn, đáng kể bạc, thủy ngân, đồng, asen, +Bạc thường sử dụng để làm nước uống điều chế hợp chất kháng khuẩn Tác dụng bạc ion kim loại nặng khác làm bất hoạt nhóm SH phân tử enzyme permease R - SH +X+  R - S -X + H (X+ kim loại nặng) +Thủy ngân chất có tác dụng mạnh nhóm kim loại nặng, người ta thường dùng HgCl để sát trùng nồng độ 1/1000 có khả sát khuẩn mạnh Tác dụng chủ yếu thủy ngân kìm hãm lên men acid amin có nhóm -SH gây kết tủa protein tế bào (có tác dụng tương thể bậc cao, nên dùng để sát trùng da) +Đồng muối đồng có tác dụng diệt khuẩn mạnh tác dụng mạnh nấm CuSO4 CuCl2 gây đông vón protein +Arsen độc với thể sinh vật bậc cao liều lượng nhỏ có tác dụng diệt khuẩn, chế phẩm arsen salyarsan, neosalvarsan dùng khử trùng, điều trị bệnh giang mai +Peroxit hydro (H2O2) permanganat kali (KMnO4) chất oxy hóa mạnh tác dụng kìm hãm nhóm -SH enzyme 2R - SH + X  R - S - S - R +XH2 Hiện việc dùng số hóa chất để sát trùng da, dụng cụ dược phẩm, thực phẩm, nước uống, Người ta dùng dung dịch brom 1%, HgCl 0,1%, cồn, AgNO3 để sát trùng bề mặt hạt giống +Xà phòng: chủ yếu loại bỏ cách học khỏi bề mặt da số vi khuẩn gây bệnh Xà phòng làm giảm sức căng bề mặt, hòa tan tẩy vết bẩn qua loại bỏ vi sinh vật +Các chất hóa trị liệu: chất có tác dụng độc vi khuẩn không gây hại cho thể bậc cao (khác với chất sát trùng) Cơ chế tác dụng chất hóa trị liệu dựa vào tương tự cấu trúc chất với hợp chất mà vi khuẩn cần để tạo thành coenzyme, protein acid nucleic Các chất hóa trị liệu cạnh tranh vị trí gắn với hợp chất phân tử enzyme kìm hãm nhiều phản ứng sinh hóa quan trọng Đa số chất hóa trị liệu dùng để điều trị bệnh khác Các chất hóa trị liệu quan trọng sulfonamit dẫn xuất từ acid p-aminosulfonic Đó chất đối kháng acid paminobenzoic (P ABA) cạnh tranh phân tử enzyme với PABA, sulfonamit kìm hãm việc tạo thành acid folic tiền chất coenzyme tham gia vào trình tổng hợp số acid amin purin (base nitơ haivòng Adenin Guanin) Các hợp chất sufonamit có phổ kháng khuẩn mạnh nên thường dùng điều trị bệnh nhiễm khuẩn IV ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ SINH HỌC HAY TƯƠNG TÁC GIỮA VI SINH VẬT VỚI VI SINH VẬT VÀ VỚI VI SINH VẬT KHÁC [4] 4.1 Kháng sinh 4.1.1 Khái niệm phân loại chất kháng sinh Năm 1928 A Fleming phát thấy ức chế nấm penicilium Staphylococcus aureus chúng mọc cạnh Ông nghiên cứu kỹ nấm chất tiết nó, phát kháng sinh penicilin vào 1940 Các nhà khoa học tách chiết penicillin dùng chữa bệnh vi trùng gây ra, ngày có nhiều kháng sinh chiết xuất để chữa bệnh Trước người ta có xu hướng định nghĩa thuốc kháng sinh chất thể sống sinh (hầu hết vi sinh vật) nói chung chất có tác dụng ngăn cản phá hoại phát triển vi khuẩn Các chất chiết xuất tinh chế, dùng để chữa bệnh Nhưng đến sản phẩm vi sinh vật tạo xác định thành phần hóa học Người ta sản xuất chất kháng sinh cách tổng hợp (Chloramphenicol) Mặt khác nhà hóa học thay đổi chất để tạo nhiều chất khác Những phân tử bán tổng hợp có nhiều tính chất tốt chọn lọc chất chiết xuất ban đầu penicillin, xerosporin, tetracyclin, Vì định nghĩa phải thay đổi phải mang tính khái quát hơn, phải bao gồm số sản phẩm hóa học, phần lớn tổng hợp, có tác dụng chống vi khuẩn Trước đề cập đến định nghĩa thuốc kháng sinh ta cần phân biệt chất sát khuẩn thường dùng với nhân tố hóa học dùng để chữa bệnh Thuốc sát khuẩn: chất hóa học khác nhau, có tác dụng mạnh vi khuẩn, làm phá hủy vi khuẩn Bằng trình lý, hóa học chúng có tác dụng cách toàn trực tiếp lên tế bào màng tế bào làm cho vi khuẩn bị li giải hay làm biến tính toàn bộ, phối hợp hai tượng mức độ khác Các thuốc sát khuẩn khác kháng sinh chỗ, tác động hóa học đặc hiệu (tất vách tế bào mà thuốc ngấm vào bị tác dụng, nhạy cảm), liều có hiệu với chúng gần với liều độc Tác dụng phổ biến chúng ức chế vi khuẩn, vi khuẩn phục hồi trở lại Trong ứng dụng thực tế, thuốc sát khuẩn nguy hại đến thể sống Định nghĩa thuốc kháng sinh hay nhân tố hóa học liệu pháp: Với đặc điểm khác ta định nghĩa (theo nghĩa rộng): Kháng sinh chất có tác động chống vi khuẩn, ngăn cản vi khuẩn nhân lên phá hủy vi khuẩn liều thấp (tầm phân tử) cách đặc hiệu, vào hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết cho sống vi khuẩn, tác động vào sống vi khuẩn, tác động vào cân hóa lý Kháng sinh tác động đặc hiệu có nghĩa loại kháng sinh tác động lên hay số nhóm vi khuẩn định Tính đặc hiệu kháng sinh cao hoạt phổ hẹp Hoạt phổ kháng sinh phạm vi loại vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh toàn giới vi khuẩn Người ta chia kháng sinh thành: kháng sinh hoạt phổ rộng kháng sinh hoạt phổ hẹp Theo nghĩa hẹp: Kháng sinh (antibiotic) chất đặc hiệu sinh vật sinh trình sống, nồng độ thấp có khả ức chế tiêu diệt vi sinh vật cách chọn lọc Phân loại kháng sinh Có nhiều cách phân loại kháng sinh khác nhau: vào nguồn gốc, tính chất hóa học, tính chất chữa bệnh, theo hiệu tác động lên vi khuẩn Xét phương diện vi sinh vật giới thiệu phân loại theo nguồn gốc cách phân loại khác giới thiệu phần dược lý -Căn vào nguồn gốc Có thể sản xuất cách, tổng hợp hóa học hoàn toàn, bán tổng hợp, nghĩa hóa tổng hợp từ nhân vi sinh vật sản xuất ra, nguyên liệu lấy hoàn toàn từ vi sinh vật (từ vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) + Kháng sinh từ vi khuẩn Kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn không nhiều, có vài loại sử dụng rộng rãi Vi khuẩn Kháng sinh Bacillus licheniformis Bacitdraxin Ba polymixa Polimycin Bac brevis Tirotricin Phổ tác dụng Gram + GramGram+ Tụ cầu, liên cầu +Kháng sinh từ xạ khuẩn Kháng sinh từ xạ khuẩn chiếm lượng lớn Xạ khuẩn Streptomyces griceus Actinomyces fradiae Act kanamyceticus Kháng sinh Strepstomycin (A, B, C) Phổ tác dụng Gram âm Neomycin Gram + Gram- Kanamycin Gram - + Kháng sinh từ nấm mốc Kháng sinh từ nấm mốc có số lượng lớn, có độ độc cao nên dùng thực tiễn Loại nấm Penixillium Chrysogenum Kháng sinh Penecilin, G, F, K, X,V, O Phổ kháng sinh Gram + + Kháng sinh từ thực vật Nhiều loại thực vật có chứa thân, lá, quả, chất có khả gây ức chế tiêu diệt vi sinh vật Những chất gọi kháng sinh thực vật Alicin (có tỏi), Lactuxin (bồ công anh), Ocubin (có mã đề), + Kháng sinh từ động vật Cơ thể động vật có khả tiết chất có tính kháng sinh Lyzozim: có nước bọt, nước mắt, niêm dịch, huyết thanh, lòng trắng trứng (phá vỡ thành vi khuẩn) Eritrin: từ hồng cầu động vật Kháng thể: có huyết động vật, sữa đầu động vật, có vai trò vô quan trọng miễn dịch học 4.1.2 Một số vấn đề kháng sinh Trên tìm hiểu nguồn gốc, đặc tính, tác dụng kháng sinh Qua thấy chất hóa học chất kháng sinh định đặc tính, tác dụng chúng Các chất có chất hóa học khác hoạt động chúng khác Và ngược lại chất có chất hóa học tương tự có hoạt động tương tự - Cơ chế tác động kháng sinh Thuốc kháng sinh tác động tầm phân tử, tác động vào tế bào vi khuẩn theo hai chế sau đây: +Cơ chế che phủ: Thuốc kháng sinh gắn lên phân tử định ngăn cản hoạt động enzyme phân tử +Cơ chế cạnh tranh: Do gần giống cấu trúc phân tử, chất kháng sinh chiếm chỗ chất khác Đặc biệt chiếm chỗ phần tử cần thiết cho chuyển hóa vi khuẩn Hai phân tử giống nhau, cạnh tranh với enzym, làm rối loạn hoạt động tế bào: sulfamid, β-Lactamin Acid paraminobenzoic chất cần thiết để tổng hợp nên acid folic Acid folic vitamin quan trọng cho tổng hợp nên bazơ purin pyrimidin, acid amin: methionin serin, Sulfamid cạnh tranh với P ABA làm cho tế bào tổng hợp acid folic sau purin pirimidin tương ứng Hai chế tác động vào hướng sau: -Làm ngừng tổng hợp vách tế bào, kháng sinh ngăn trở murein (thành phần có cấu tạo màng vi khuẩn) Ví dụ: penicilin -Tác động vào màng, làm cho màng tế bào chất thay đổi tính thấm, phá vỡ màng tế bào chất, làm ngưng trình trao đổi chất -Ức chế trình tổng hợp acid nucleic, tổng hợp ARN hay ADN tế bào Ví dụ: Actinomycin -Làm ngưng trình tổng hợp protein, xúc tiến tổng hợp protein quan hệ khăng khít với trình sống tế bào Ví dụ: Chloramphenicol, Streptomycin - Hiện tượng kháng thuốc vi sinh vật Sự xuất dạng vi khuẩn kháng thuốc có ý nghĩa đặc biệt hóa học trị liệu Một số vi khuẩn chịu tác động liều nhỏ kháng sinh, thường giảm tính mẫn cảm với kháng sinh loại Quá trình gọi trình phát triển đề kháng hay phát triển tính không mẫn cảm Hiện tượng kháng thuốc mối lo ngại lớn, gây khó khăn việc dùng kháng sinh điều trị bệnh nhiễm khuẩn Vấn đề kháng thuốc phát dùng kháng sinh điều trị cách rộng rãi penicillin, streptomycin, sulfonamit Khoảng 20 năm sau sử dụng rộng rãi kháng sinh, penicillin, streptomycin, người ta phát thấy ngày có nhiều vi khuẩn có khả ngăng chống lại tác dụng hóa trị liệu kháng sinh penicilin, streptomycin sau tetracyclin chlormphenicol, trực khuẩn mủ xanh kháng thuốc vi khuẩn E coli, Salmonella, Shigella, nấm mốc, nấm men, Trước năm 1955 streptomycin diệt tất vi khuẩn lao, nhờ mà bệnh lao kiềm chế Ngày có 40% vi khuẩn lao kháng lại kháng sinh này, làm hiệu kháng sinh Khi dùng tetracyclin hiệu điều trị cao sau vi khuẩn lao lại trơ với tetracilin, tiếp đến penicilin hiệu lực -Cơ chế hình thành tính kháng thuốc vi sinh vật Trước hết phải thấy trình hình thành tính kháng thuốc vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố: - Nồng độ chất kháng sinh -Thời gian tác động - Cơ chế tác dụng kháng sinh -Đặc tính vi sinh vật nhiều nhân tố khác Mặc dù có tác động khác loại kháng sinh lên vi sinh vật, chế hình thành tính kháng thuốc chủ yếu hai chế sau: *Kháng thuốc biến đổi máy di truyền vi sinh vật Cấu trúc ADN bị thay đổi tác động kháng sinh làm thay đổi thứ tự bazơ kiềm, làm xuất chức khác thường tế bào tạo nên kháng thuốc, -Làm cho kháng sinh bị giữ lại bề mặt tế bào, không xâm nhập vào bên Tế bào trạng thái mẫn cảm với kháng sinh -Làm tế bào tăng cường tổng hợp men cảm ứng có khả phân hủy chất kháng sinh trước chất gây tác hại -Làm cho trình trao đổi chất tế bào không mẫn cảm với chất kháng sinh, trình có liên quan đến biến đổi acid nucleic protein có giảm thấp trình sinh hóa học tế bào Kết chất kháng sinh không gây nên tổn thương sâu sắc đến trao đổi chất tế bào - Có thể cách khác nữa, vi sinh vật tạo cho khả kháng thuốc, nhiều trường hợp đặc tính kháng thuốc cố vững truyền lại cho hệ sau tế bào khác đường biến nạp tải nạp *Cơ chế kháng thuốc gây nên nhân tố kháng thuốc Tính kháng nhiều thuốc chủng vi khuẩn, chưa tiếp xúc trực tiếp với loại thuốc xác định Kitamoto (1956) Shigella Nhân tố kháng thuốc, plasmid-R phát 1960 với đặc điểm: - Cấu tạo ADN xoắn kép, khép vòng nên quan sát có hình tròn - Tồn tách biệt NST, gắn vào thành màng tế bào - Một vi khuẩn có từ đến nhiều plasmid, có khoảng 30 loại plasmid kháng kháng sinh Nhân tố R phức hợp gồm hai thành phần: 1- Gen chủ trì việc đối kháng kháng sinh, gồm gen đối kháng với nhiều loại kháng sinh, gen chịu trách nhiệm đề kháng với loại kháng sinh, có gen kháng hai loại 2- Gen đạo quy phạm hóa tái sinh nhân tố R Trong tế bào vi khuẩn kháng thuốc, hai thành phần kết hợp với tách rời nhau, phần dạng xoắn kép có khả nhân đôi độc lập Khi có tiếp xúc với kháng sinh đó, gen tương ứng gen R nhân tố R đọc mã cho tổng hợp lại gen chống lại kháng sinh men βlactamase chống ampicilin, men axetintraspherase chống lại Chloramphenicol, Hiện tượng kháng nhiều thuốc truyền qua lại đường tiếp hợp, không kèm theo truyền NST tế bào, đường truyền nhân, nhờ nhân tố di truyền tế bào chất Khi vi khuẩn không chưa có nhân tố di truyền R-plasmid vi khuẩn trần, bị kháng sinh tiêu diệt, vi khuẩn trần được vi khuẩn plasmid truyền cho vũ khí bí mật có khả chống đối lại kháng sinh -Biện pháp tính kháng thuốc Trước hết phải đề cập đến vấn đề việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng sinh có quan hệ đến tính kháng thuốc vi khuẩn Việc dùng thuốc kháng sinh rộng rãi để chữa bệnh, tất nhiên dẫn đến trạng tạo tế bào thích ứng, thích ứng nhanh hay chậm phụ thuộc vào nồng độ phương pháp sử dụng Các tế bào có tính thích ứng cách bền vững di truyền Qua nghiên cứu cho thấy vi khuẩn mang plasmid tồn khắp nơi, kể nơi không sử dụng đến chất kháng sinh, tách vi khuẩn từ phân động vật hoang dại, vi khuẩn có mẫu hóa thạch tách plasmid kháng kháng sinh, hiển nhiên việc dùng kháng sinh rộng rãi làm cho nhân tố kháng thuốc lan truyền rộng nhờ chọn lọc Để đối phó với tính kháng thuốc vi sinh vật người ta có biện pháp: -Hạn chế tối đa sử dụng kháng sinh điều trị phòng ngừa (bổ sung vào thức ăn cho gia súc) -Tìm kiếm loại kháng sinh nghiên cứu sử dụng phối hợp nhiều loại kháng sinh điều trị, kết hợp hiệu lực nghĩ đến chuyện tăng liều lượng tăng mà phải tìm loại kháng sinh Tránh dùng liều thấp kéo dài -Làm thay đổi chất plasmid ngăn ngừa tái sinh truyền plasmid tế bào Hiện kỹ thuật đại người ta tách mảnh plasmid ghép mảnh lại thành plasmid hoàn chỉnh Điều cho phép lai tạo plasmid tế bào khác nhau, ghép mảnh ADN lấy từ virus, tế bào động vật, tế bào ung thư, để ghép thành plasmid có chức định hướng theo ý muốn, việc làm có triển vọng điều trị bệnh ung thư chống lại tượng kháng thuốc 4.2 Tế bào diệt tự nhiên yếu tố hòa tan Tế bào diệt tự nhiên hay tế bào NK (Natural killer cell) tế bào bị nhiễm virus lại lần thứ hai Bạch cầu có khả nhận biết thay đổi bề mặt tế bào bị nhiễm virus Tế bào NK gắn vào tế bào đích diệt chúng Tế bào NK hoạt hóa interferon, interferon sản xuất tế bào nhiễm virus có tế bào lympho Ngoài tác động tế bào NK ra, interferon có khả tạo tình trạng đề kháng virus cho tế bào chưa bị nhiễm virus mô Interferon sản xuất chống lại nhiều loại virus khác Trong huyết thể bị nhiễm trùng, nồng độ nhiều loại protein gia tăng nhanh chóng Các protein gọi chung ''protein pha cấp tính '' (acute phase protein) Nồng độ protein pha cấp có tăng từ 2-100 lần so với mức bình thường chúng tiếp tục giữ mức độ cao suốt trình nhiễm trùng Bổ thể chuỗi khoảng 20 protein huyết tác dụng nối phản ứng chuỗi, đồng thời chúng tác dụng với thành phần khác hệ thống miễn dịch bẩm sinh thu Sau hoạt hóa số thành phần bổ thể có tác dụng opsonin hóa vi khuẩn giúp cho trình thực bào, số thành phần khác đóng vai trò thu hút tế bào thực bào đến trường nhiễm trùng Một nhóm thành phần bổ thể khác tạo ly giải trực tiếp màng tế bào vi khuẩn 4.3 Kháng thể Kháng thể phân tử sản xuất tế bào lympho B, loại tế bào hệ thống miễn dịch thu Kháng thể hoạt động với tư cách cầu nối vi sinh vật gây bệnh với tế bào thực bào Từ có định nghĩa kháng thể: Kháng thể globulin máu động vật, có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sinh Kháng thể chủ yếu tìm thấy huyết động vật, huyết chứa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên gọi kháng huyết Kháng thể tìm thấy dịch thể khác thể, sữa Những kháng thể có sẵn sữa hay huyết tương người, động vật từ trước có tiếp xúc với kháng nguyên gọi kháng thể tự nhiên hay kháng thể không đặc hiệu Kháng thể đặc hiệu kháng thể sinh kích thích kháng nguyên (vi sinh vật) kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên Khi kháng nguyên kháng thể tương ứng kết hợp với xẩy phản ứng ngưng kết 4.4 Tiêu độc khử trùng Công tác tiêu độc, khử trùng đặc biệt quan trọng nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học, chế biến, dự trữ thức ăn, phòng trị bệnh nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác 4.4.1 Tiêu độc phương pháp tiêu độc Tiêu độc tên chung để biện pháp sử dụng hóa chất để hủy hoại vi sinh vật, nhiên sử dụng biện pháp vật lý sinh học Khi có mặt chất tiêu độc, vi sinh vật ngừng sinh trưởng chết Quá trình tiêu độc phát sinh lúc mà diễn theo qui luật định Trong số đơn vị thời gian số lượng vi sinh vật chết lúc bắt đầu nhiều, tùy theo tăng dần thời gian mà giảm dần thể qua đường cong tử vong Như số lượng vi khuẩn môi trường lớn thời gian tiêu độc dài, điều có ý nghĩa thực tiễn tiêu độc để đạt hiệu cao Các nhân tố ảnh hưởng đến tiêu độc Tác dụng tiêu độc phụ thuộc vào nhiều yếu tố: +Trước hết phụ thuộc vào loại hình nhân tố tác động cường độ tác động chúng, nhân tố vật lý hay hóa học, hóa chất loại gì, +Đặc tính tế bào: loài giống trạng thái sinh lý tế bào, tuổi tế bào, có hình thành nha bào, giáp mô hay không, hàm lượng muối loại tế bào +Tính chất môi trường mà vi sinh vật tồn tại: trạng thái môi trường rắn, lỏng, thành phần môi trường, nồng độ ion, pH môi trường, tồn chất hữu nhiệt độ môi trường +Thời gian tác động nhân tố Những nhân tố có quan hệ tác động qua lại lẫn Phương pháp tiêu độc Những hóa chất vừa chất ức chế, chất phòng thối hay chất tiêu độc, khử trùng có thay đổi nồng độ có tác động khác Tùy theo mục đích yêu cầu công việc mà sử dụng hóa chất hợp lý đạt hiệu cao Để ngăn ngừa lên men thối chế phẩm, sản phẩm chế biến người gia súc ta phải sử dụng hóa chất với nồng độ không gây độc chế biến bảo quản Hóa chất gồm hai nhóm: Nhóm chất hữu cơ: acid hữu cơ: lactic, citric, acetic, beoic, salicilic, muối: benzoat, salixilat, tiophosphat metin, etilic, khói củi gia vị Nhóm chất vô cơ: acid boric, muối borat, acid sunfuaric, kiềm, muối kiềm, NaCl, nitrat, halogen, peoxit, khí 4.4.2 Khử trùng phương pháp khử trùng Khử trùng phương pháp loại trừ hoàn toàn vi sinh vật có môi trường cách tiêu diệt hay loại bỏ chúng * Ý nghĩa khử trùng: Tránh lây truyền, gây nhiễm vi sinh vật từ nơi sang nơi khác, vật sang vật khác, từ vật thể sang thể động vật Đảm bảo độ xác thí nghiệm, khiết công tác vệ sinh nuôi cấy, phân lập, giữ giống Đảm bảo bảo quản lâu dài môi trường dinh dưỡng, thuốc, thực phẩm dụng cụ tinh xảo khác Những nhân tố có quan hệ đến khử trùng có nhiều tương tự trình bày phần tiêu độc +Khử trùng hóa chất Có nhiều chất có tác dụng khử trùng tùy theo mục đích, đối tượng mà dùng chất hóa học cho có hiệu Acid phenic: 5% đun sôi để khử trùng đồ vật chế vaccin Bơm vào buồng cấy 1015 phút khử trùng Crezin: dùng dung dịch 5% khử trùng chuồng trại, nhà vệ sinh HgCl: 0,1% ngâm dụng cụ, 0,05-0,2% khử trùng chuồng trại Focmon: 40% pha với thuốc tím để sát trùng buồng cấy Khử trùng tia xạ Tia tử ngoại: dùng đèn tử ngoại để phát tia có chiều dài bước sống 23002700A0, thường dùng đèn thủy ngân thạch anh có độ dài bước sóng 2537A0, khử trùng phòng cấy cách trì thời gian chiếu 30 phút-1giờ Nhân tố ảnh hưởng đến chiếu tia tử ngoại khử trùng: thời gian chiếu, cường độ chiếu, tính chất môi trường (môi trường chứa muối khoáng làm giảm, khả khử trùng, môi trường mỡ, chất béo tăng khả khử trùng) Tia tử ngoại dùng phổ biến rộng rãi công nghiệp thực phẩm Nó có khả diệt hoàn toàn vi khuẩn nấm móc + Tia phóng xạ Hiện người ta sử dụng tia γ, X để khử trùng, tia phóng xạ máy phóng xạ phát Đặc điểm khử trùng phóng xạ: - Khử trùng hoàn thiện, diệt trừ vi sinh vật sâu bệnh khác -Bảo đảm xử lý sản phẩm đồng đều, cần xử lý lần, thời gian bảo quản kéo dài - Độ xuyên sâu tia cao, đảm bảo khử trùng độ dày 20-30cm cho phép xử lý sản phẩm bao bì - Có ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị sản phẩm +Khử trùng nhiệt độ Như đa biết vi sinh vật sinh trưởng giới hạn 0-900C Ngoài giới hạn hầu hết vi sinh vật không hoạt động, nhiệt độ cao làm biến tính protein phá hủy men, dẫn đến phá hủy tế bào Khử trùng nhiệt độ khô Đốt: sử dụng khử trùng que cấy, dao kéo vật liệu không cháy Hoặc đốt xác chết, băng, dùng đèn cồn hay đèn xì, xăng đốt Sấy khô: sử dụng lò hấp có nguồn nhiệt điện Khử trùng nhiệt ướt Khử trùng Pasteur: sử dụng nhiệt độ thấp 1000C để khử trùng; 630 65 C/30phút, dùng để khử trùng sữa, hoa quả, phương pháp không diệt vi khuẩn chịu nhiệt nha bào chất lượng không bị ảnh hưởng Đun sôi: dùng phương pháp đun sôi trực tiếp 30 phút-1 Hấp ngắt quảng: hấp nhiệt độ đun sôi 1000C tránh hỏng cho môi trường hấp nhiệt độ cao, môi trường huyết thanh, lòng trắng trứng, sinh tố, đường, Khử trùng nước cao áp: nha bào thường bị diệt nhịêt độ ẩm 1200C Muốn phải sử dụng nồi hấp cao áp Khử trùng lọc Một số dung dịch khử trùng nhiệt độ bị thay đổi đặc tính vật lý, hóa học, môi trường huyết ngưng kết, men dung dịch bị phá hủy, Như môi trường dịch dùng phương pháp lọc khử trùng tốt Hiện có nhiều loại ống lọc khác nhau, muốn lọc trước hết phải dùng ống có kích thước lớn để loại bỏ hạt có kích thước lớn Sau dùng ống lọc khử trùng Khi lọc phải sử dụng máy áp lực chân không, thường dùng để khử trùng huyết thanh, hồng cầu, khiết giống virus, lọc ADN -Câu hỏi ôn tập: Trình bày phương pháp khử trùng tác nhân vật lý? Trình bày phương pháp khử trùng tác nhân hóa học? Trình bày phương pháp khử trùng pháp sinh học? Cơ chế tác động điểm tác động chất kháng sinh? Phân loại kháng sinh vào nguồn gốc -Tài liệu tham khảo: Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000) Nhà xuất giáo dục Hà Nội Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội Hoàng Thủy Nguyên, Đặng Đức Trạch, Ninh Đức Dự, Nguyễn Hồng Điệt, Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Thị Oanh (1974) Vi sinh y học tập I Nhà xuất Y học Hà Nội Nguyễn Vĩnh Phước(1976) Vi sinh vật học Thú y tập III Nhã xuất đại học trung học chuyên nghiệp Hà Nội Phạm Hồng Sơn(2006), Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y Nhã xuất nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Khắc Tuấn(1999) Vi sinh vật học, nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Giải thích thuật ngữ: Natural killer cell: tế bào diệt tự nhiên, tế bào lympho có khả nhận diện tiêu diệt tế bào lạ tế bào chủ nhiễm virus theo cách không đặc hiệu Antigen: protein mà vào thể động vật kích thích hệ miễn dịch sinh đáp ứng miễn dịch Antibiotic : Chất kháng sinh, có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn [...]... của vi sinh vật, một phần tiếp tục phân giải để tạo ra NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác Qúa trình phân giải từ một protein đến các acid amine là một quá trình phức tạp có thể diễn ra như sau: R - CH(NH2) - COOH + 1 /2 O2→ R -CO- COOH + NH3 R - CH(NH2) - COOH + O2 → R - COOH + CO2 + NH3 R - CH(NH2) - COOH + H2O → R - CHOH + CO2+ NH3 R - CH(NH2) - COOH + H2O → R - CO - COOH + NH3 R - CH(NH2)... vi khuẩn tự tổng hợp được) hoặc nó có thể là có tác dụng kích thích sinh trưởng (nếu như vi sinh vật nào đó tự tổng hợp được nhưng nhanh chóng tiêu thụ hết) Như vậy những chất có thể coi là chất kích thích sinh trưởng của loại vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là chất sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác Hầu như không có chất nào là chất sinh trưởng chung cho tất cả các loại vi sinh. .. cấy vi sinh vật người ta không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng Những nguyên tố này có sẵn trong nước máy, trong hóa chất, dung môi làm môi trường Trong một số trường hợp cụ thể người ta phải bổ sung một số nguyên tố vi lượng như: bổ sung Zn khi nuôi cấy nấm mốc, bổ sung Co vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp vitamine B 12 2.4 Nhu cầu về chất sinh trưởng của vi sinh vật Vấn đề về chất sinh. .. COOH + H2O → R - CO - COOH + NH3 R - CH(NH2) - COOH + 2H→ R-CH2 - COOH + NH3 Khi phân giải các acid amine chứa lưu huỳnh (cistin, cistein, methionin) vi sinh vật giải phóng ra khí H2S HOOC - CH2NH - CH2 -SH + 2H2O → H2S +NH3+CH3COOH +HCOOH Khi phân giải triptophan một số vi sinh vật có thể sinh ra indol và scaton có mùi thối +Quá trình amon hóa urea Vi khuẩn amon hóa urea thường thuộc loại hiếu khí hay... phân giải urea thành NH3, CO2, và H2O CO(NH2 )2 + 2H2O urease→ (NH4)2CO3 (NH4)2CO3 → 2NH3 + CO2+H2O +Quá trình amon hóa uric Uric là một chất hữu cơ chứa trong nước tiểu Chúng phân giải thành urea và acid Sau đó ure được tiếp tục phân giải như trên 4.3 Tổng hợp các hợp chất hữu cơ 4.3.1 Tổng hợp các hợp chất hữu cơ có Nitơ +Sinh tổng hợp acid amine Nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp được nhiều... trong khi đó một số vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất dễ dàng và thường xuyên người ta gọi chúng là những vi sinh vật cố định N2 Các vi khuẩn có khả năng cố định N2 như: Azotobacter (tốn 1g đường thì vi khuẩn có khả năng cố định 518 g N) Clostridium sống trong đất ẩm có khả năng cố định N2 không khí, vi khuẩn lam sống cộng sinh cố định N2, vi khuẩn nốt sần cây họ đậu (Rhizobium) 4.3 .2. Tổng hợp các hợp... sau: CO2 + → [CH2O] +O2 (Hν, năng lượng mặt trời) Tảo lam quang hợp gần giống cây xanh, vi khuẩn lưu huỳnh màu lục hoặc vi khuẩn lưu huỳnh màu tía quá trình quang hợp khác với cây xanh Nếu ở cây xanh nguồn H là từ H2O thì ở vi khuẩn nguồn H là từ H2S có thể tóm tắt quá trình quang hợp của vi khuẩn như sau: CO2 + H2S hν [CH2O] +2S Bacterio chlorophile IV SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN 4.1 Sinh trưởng, sinh. .. chất sinh trưởng của vi sinh vật đã được L Pasteur phát hiện từ khoảng 1859-1864, khi ông nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường chứa carbon, muối amon và một số thức ăn khác, Ông nhận thấy vi sinh vật phát triển yếu Nhưng nếu bổ sung thêm một ít nước chiết các nguyên liệu thiên nhiên vào môi trường nói trên thì sự phát triển của vi sinh vật tăng lên rất nhiều Năm 19 12 K Funk, nhà sinh hoá học người Ba... sản và phát triển của vi khuẩn Sinh trưởng và phát triển là thuộc tính cơ bản của mọi sinh vật, cũng như động vật và thực vật, vi sinh vật cũng sinh trưởng và phát triển Sinh trưởng là sự tăng kích thước và khối lượng của tế bào, còn sự phát triển (hoặc sinh sản) là sự tăng sinh số lượng tế bào Tuy nhiên sự tăng số lượng tế bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với sự tăng sinh khối Chẳng hạn... vi khuẩn tuy còn phân chia 1 -2 lần nhưng cho 2- 4 tế bào nhỏ hơn tế bào bình thường, trong pha mở đầu sinh khối tế bào vi khuẩn tăng lên nhưng số lượng tế bào không thay đổi, ngược lại pha logarit kích thước tế bào giảm đi nhưng số tế bào lại tăng lên Ở vi sinh vật khi nói đến sinh trưởng là nói đến sự sinh trưởng của cả quần thể 4 .2 Phương pháp nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn 4 .2. 1 Nuôi cấy vi ... tố vi lượng như: bổ sung Zn nuôi cấy nấm mốc, bổ sung Co vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp vitamine B 12 2.4 Nhu cầu chất sinh trưởng vi sinh vật Vấn đề chất sinh trưởng vi sinh vật. .. Polyomavirus Orthopoxvirus, Parapoxvirus,Avipoxvirus, Capipoxvirus, Suispoxvirus, Thoi, vi n gạch Leporipoxvirus, 22 0 Moluscipoxvirus, Yatapoxvirus; 450 +Entomopoxvirinae: A, B, C, 140 Alphaherpesvirinae,... +OrthohepaADNvirus, +AvihepaADNvirus Cầu 40- 42 Retroviridae Retrovirus +Oncovirus, +Retrovirus +Retrovirus +Sspumavirus, +Lentivirus, Cầu 80-130 Orthomyxoviridae Influenza virus Influenza virus C