Đang tải... (xem toàn văn)
THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG PHỨC HỆ ENZYM PECTINASE VÀ CELLULASE
GIỚI THIỆU ĐỀ TÀI Enzym là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghóa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà còn được ứng dụng rỗng rãi trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường. Cụ thể, trong bài tiểu luận này chúng em sẽ đề cập đến THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG PHỨC HỆ ENZYM PECTINASE VÀ CELLULASE nhằm cung cấp thêm một số hiểu biết về vấn đề này. Trong quá trình làm tiểu luận, chúng em đã rất cố gắn trình bày những kiến thức mới và có hệ thống. Tuy nhiên, chắc chắn không thể trành khỏi sai sót. Chúng em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của cô để rút kinh nghiệm cho những lần sau. MỤC LỤC A. PECTINASE I. PECTIN II. HỆ ENZYM PECTINASE II.1 Pectinesterase (pectase-3.1.1.11) II.2 Polygalacturonase (pectinase-3.2.1.15) II.3 Protopectinase II.4 Transeliminase III. THU NHẬN ENZYM PECTINASE III.1 Nguồn thu nhận III.2 Thu nhận A. Thu nhận từ canh trường bề mặt B. Thu nhận từ canh trường bề sâu IV. ỨNG DỤNG B. ENZYM CELLULASE I. CELLULOSE II. HỆ ENZYM CELLULASE III. THU NHẬN CELLULASE TỪ VI SINH VẬT III.1 VSV tổng hợp Cellulase III.2 Phương pháp thu nhận IV. ỨNG DỤNG 1 A – PECTINASE Pectinase là hệ enzym có tác dụng lên pectin dạng hoà tan, làm giải phóng nhóm metoxy (CH 3 O-) và phần polysaccarit còn lại được gọi là axit pectic (hay polygalacturonic). I. PECTIN: (thuộc nhóm chất xơ hòa tan) - Pectin là polysaccarit có nhiều trong quả, củ hoặc thân cây Một đoạn phân tử pectin - Ở thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan và dạng pectin hoà tan. • Protoprectin không tan: chủ yếu ở thành tế bào, kết hợp với polysaccharide araban. • Pectin hoà tan: chủ yếu ở dòch bào. Pectin hoà tan là polysaccharide cấu tạo bởi các gốc acid galaturonic, trong đó một số gốc acid có chứa nhóm thế methoxy • Dạng không tan có thể chuyển hoá thành pectin hoà tan trong môi trường acid, ở nhiệt độ sôi, hay khi có mặt enzim protopectinase. - Tên gọi pectin dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic metyl hoá 100% - Axit pectinic dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic metyl hoáthấp hơn 100% - Axit pectic dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic hoàn toàn không chứa nhóm metyl - Tuy nhiên trong thực tiễn thì pectin được dùng chỉ cả pectin va axit pectinic. II. HỆ ENZYM PECTINASE: 2 Pectinase có trong cả thực vật và vi sinh vật. Ở đây ta chỉ xét việc thu nhận và ứng dụng của pectinase từ vi sinh vật. Theo quan điểm hiện đại, trong phức hệ enzym pectinase có các enzym: pectinesterase, polygalacturonase, protopectinase. transeliminase. II.1 - Pectinesterase: (pectase-3.1.1.11) - Enzym này thu đïc từ canh trường nấm mốc A.Niger ở trạng thái đồng thể, N-axit amin cuối trong phân tử là phenylalanin. - Pectinesterase thuỷ phân liên kết este trong pectin cũng như trong các axít pectic để tạo thành metanol và axít pectinic. pectin + nH 2 O CH 3 OH + axit pectinic - Pectinesterase của nấm mốc thì tham gia thuỷ phân sâu sắc hơn so với pectinesterase thực vật. - Pectinesterase có nguồn gốc khác nhau thì có pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu khác nhau. - Các ion Ca 2+ ,Na + , các clorua của Na, Ca, K sẽ hoạt hoá pectinesterase, còn cation hoá trò 3 và 4 thì kìm hãm tác dụng của nó. II.2 - Polygalacturonase:(pectinase-3.2.1.15) (tên hệ thống là : Polygalacturonitglucanhdrolase) Dựa vào cơ chế tác dụng có thể chia ra thành: - Endopolygalacturonase (còn gọi là polygalacturonase dòch hóa): phân cắt liên kết α-1,4 ở phía trong phân tử pectin cũng như phía trong phân tử axit polygalacturonic. - Exopolygalacturonase (còn gọi là polygalacturonase đường hoá): phân cắt dần dần từng phân tử acid galacturonic một, bắt đầu từ đầu không khử của mạch. pH tối ưu phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất, đa số polygalacturonase bền vững ở pH từ 4,0 đến 6,0, nhiệt độ tối ưu khoảng 40-50 o C và bò vô hoạt ở 55-65 o C. 3 Polygalacturonase cũng được hoạt hoá bởi cation kim loai kiềm và NH 4 + II.3 - Protopectinase: tách araban và galactan ra khỏi protopectin để tạo thành dẫn xuất metyl của axit polygalacturonic (tức là pectin hoà tan). II.4 - Transeliminase: phân huỷ pectin bằng con đường phi thuỷ phân tạo ra đơn phân là galacturonic có chứa nối đôi (4-deoxy-5-xetogalacturonic). Transeliminase có tính đặc hiệu cao nên người ta chia nó thành : • endopectintranseliminase • exopectintranseliminase • endopectinc-transeliminase • exopectinic-transeliminase Transeliminase có nguồn gốc khác nhau thì có cơ chế tác dụng và thuộctính khác nhau. 4 III. THU NHẬN ENZYM PECTINASE: III.1 - Ngu ồ n thu nh ậ n: - Vi sinh vật tổng hợp pectinase - Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn • Nấm mốc: penicillium glaucum, P.ehrlichii, P.chrysogenum, P.expanam, P.cilrimin, Aspergillus awamori, A.foetidus, A.niger, A.terrus, A.saitoi, Fusarium moniliforme, … • Nấm nem: Saccharomyces fragilis. • Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pentinovorum, Klebsiella aerogenes. - Các loài vi sinh vật này có mặt trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật. Khi quả bò hư hỏng hay thực vật chết chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá hủy rất nhanh quả và các bộ phận khác của thực vật . - Bên cạnh Pectinesterase(PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzyme PE như: cà chua, đậu nành, thòt quả chuối, quả cam, táo. - Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gay bệnh . Ví dụ: Saccharomyces fragilis , aspergillus niger, … PG còn được tìm thấy ở cà chua . III.2 - Thu nhận: - Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Có hai phương pháp sản xuất: A. Thu nhận từ canh trường bề mặt: - Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV thường là cám gạo, cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm, nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphoric… độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60 0 C, nấm mốc A.awamori 5 thường được nuôi cấy ở 30 0 C trong thời gian 40 giờ, sau đó giảm xuống 24 0 C và nuôi trong 48-52 giờ. Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thành phế phẩm enzym thô và đem tinh chế. - Để thu pectinase tinh khiết thì enzym thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ( etanol 72,5-75% hoặc iso-propanol 55- 57%) hay muối amoni sunfat có độ bão hòa 0,79%. Nếu dùng etanol độ tinh khiết của chế phẩm enzyme khoảng 90%, nếu dùng muối thì khoảng 75%. Nhiệt độ tối ưu của rượu là 2-5 0 C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ít càng tốt, sau đó ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dòch, sấy kết tủa trong thiết bò sấy chân không hay sấy thăng hoa nghiền nhỏ và đem đi bảo quản. B. Thu nhận từ canh trường bề sâu: a. Phương pháp hiếu khí : - Sự tích tụ enzym trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh vật gần đạt đến pha ổn đònh, khi môi trường bò acid hóa mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn. pH thích hợp từ 6-7,2, pH kiềm kìm hãm, pH=4 ức chế hoàn toàn. - Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24,32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10%. Trong quá trình nuôi cấy hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6 xuống 1,5 – 1,8. Để thu chế phẩm khô cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bò sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180 0 C và đi ra đạt 60-70 0 C. Thời gian lưu của chế phẩm enzym trong thiết bò sấy không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40 0 C. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. - Có thể thu bằng cách kết tủa enzym trong dòch lọc cach trường etanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và iso propanol theo tỉ lệ 3:1, hoặc với muối 6 amoniumsunfate( 50-80%). Nếu kết tủa bằng etanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dòch canh trường ban đầu, nếu kết tủa bằng muối ammonium silfale, cần tách muối ra khỏi enzym bằng phương pháp thẩm tích, sau đó sấy khô. b. Phương pháp yếm khí: - Môi trường: bã củ cải 2%, (NH 4 ) 2 HPO 4 0,75%, KH 2 PO 4 0,1%, CaCO 3 0,3%, nước chiết ngô 0,5%. - Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối, sự tích lũy enzym tối đa tương ứng với pha ổn đònh của sự sinh trưởng qua 5-60h. pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bò ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35 0 C. - Cl.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu được pectinase thành phần môi trường có: lactose 2%, pectin củ cải 1%, (NH 4 )HPO 4 0,4%, K 2 HPO 4 0,7%, KH 2 PO 4 0,3%, NaCl 0,1%, MgSO 4 0,025%, FeSO 4 dạng vết, CaCO 4 0,5%, dòch nấm mem tự phân 0,05%, ascorbic acid 0,5%. - Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dòch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzym với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sunfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dòch đã xử lý là 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzym trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu. - Phương pháp hiện đại trong chuẩn bò chế phẩm enzyme pectinase thường theo các bước cơ bản sau: • Khử muối bằng phương pháp lọc gel • Tách protein bằng phương pháp trao đổi ion. • Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang. 7 • Tinh sạch bằng FPLC. IV. ỨNG DỤNG ENZYM PECTINASE: - Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinase dưới dạng tinh khiết. Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm sau: • Sản xuất rượu vang • Sản xuất nước quả và nước uống không rượu • Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt … • Sản xuất nước giải khát • Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan - Trong sản xuất rượu vang, nước quả và các nước uống không rượu đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả. - Có pectinase các quá trình ép làm trong và lọc dòch quả rất dễ dàng làm tăng hiệu xuất của sản phẩm. Ví dụ: đưa pectinase vào khâu nghiền quả sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép 15 – 25%. Khi có pectin thì khối nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dòch quả không thoát ra được. - Nhờ pectinase phân giải các chất pectin đi mà dòch quả trong suốt không bò vẩn đục và lọc rất dễ dàng. - Pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan, làm tăng thêm chất lượng của sản phẩm. - Trong sản suất các mặt hàng từ quả nhờ pectinase có thể thu được dòch quả có nồng độ đậm đặc. 8 Ví dụ: dòch táo cô đặc đến 72 độ Brix, nếu không tách các pectin tự nhiên thì sản phẩm sẽ bò keo tụ một cách mạnh mẽ và không thể cô đặc thêm được nữa. - Trong sản suất cà phê, người ta dùng pectinase để tách lớp keo ở trên bề mặt hạt cà phê. 9 B – CELLULASE Cellulase là phức hệ enzym có tác dụng rất quan trong trong việc thuỷ phân cellulose. Đây là enzym thuộc nhóm enzym hydrolase thường chỉ thấy ở vi sinh vật. I. CELLULOSE: - Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật, trong bông chiếm khoảng 90%, còn trong gỗ chiếm hơn 50%. Hằng năm cellulose do thực vật tổng hợp khoảng 10 11 tấn. Sự tạo cellulase chủ yếu do thực vật còn phân hủy nó thì chủ yếu do vi sinh vật. • Cellulose có nhiều hơn tất cả các hợp chất hữu cơ khác của cơ thể sống vì nó là nguyên liệu chính của thành tế bào thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. • Cellulose là chất được trùng hợp từ các đơn phân tử glucose, mạch thẳng được tạo bởi β – D – glucose bằng liên kết β – 1,4 glucoside. • Cellulose là chất rắn, trắng, không mùi vò, không tan trong nước ngay cả khi đem đun nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ thông thường (rượu, ether, benzen). • Trong tế bào thành cây xanh, các vi sợi cellulose sắp xếp dưới dạng các lớp xen phủ, như thể tạo nên một cấu trúc rất dai và chắc. Đôi khi thành tế bào còn được củng cố bằng một nguyên liệu gọi là lignin, chất này chèn vào khoảng không giữa các vi sợi cellulose. • Được ứng dụng trong chất tẩy rửa, chủ yếu để làm mềm vải. 10 [...]... hưởng của phức hệ enzym xitaza (chủ yếu gồm 4 enzym cellulase, hemicellulase, enzym thủy phân chất gôm và enzym cellobiase …) thành tế bào của hạt đại mạch bỉ phá hủy khiến cho các enzym protease và amilase tác dụng dễ dàng với protein và tinh bột chứa trong hạt đại mạch Khi đó, lượng đường dextrin và các chất hòa tan khác tăng lên, tạo điều kiện để khi sau này hình thành nên các phẩm vật có màu và có... tác dụng của cellulase : Mô hình cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose - Phức hệ cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ một số loại nấm Ví dụ: nấm Morythesium verrucaia tạo cellulase sáu cấu tử, Polyporus versicolor tạo cellulase 4 cấu tử; … - Tính đặc hiệu của cellulase trên các liên kết glucoside rất rộng rãi: chúng có thể thu phân được xilan (β -1,4), glucomanan(β -1,4), lichenin (β -1,3 và. .. II -CELLULASE: Cellulase là phức hệ hydrolase bao gồm từ C1 đến Cx và β-glucozidase, có vai trò là thu phân cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose Chế phẩm cellulase Mô hình phân tử cellulase - Cơ chế tác dụng của cellulase như sau: • Ở giai đoạn đầu dưới ảnh hưởng của enzym C1, những mảnh polyanhydroglucose có kích thước lớn được tách ra khỏi cellulose không hoà tan ban đầu, sau đó dưói tác dụng. .. 15 sợi mất từ 36-48h và cho enzym có hoạt tính cao Tuy nhiên xạ khuẩn chòu nhiệt tốt hơn nấm sợi, enzym của xạ khuẩn hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzym nấm sợi - Sau khi nuôi cấy ở điều kiện tối ưu, người ta thu được cellulase thô Chế phẩm này chứa nước, sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và enzym - Bằng phương pháp hóa lý tách nước, sinh khối vi sinh vật sẽ thu được enzym bán tinh khiết... Trichoderma koningi… - Enzym cellulase có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa các vật chất hữu cơ trong tự nhiên, có ý nghóa lớn trong công nghiệp thực phẩm và bảo vệ môi trường III.2 - Phương pháp thu nhận : - Vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase thu c 3 nhóm: nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn - Trong công nghiệp sản xuất enzym cellulase chủ yếu người ta nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn Chúng... nước, sinh khối vi sinh vật sẽ thu được enzym bán tinh khiết Chúng chứa nước, protein không hoạt động và enzym Dùng phương pháp hóa lý ta sẽ loại được nước, protein không hoạt động và thu enzym tinh khiết IV ỨNG DỤNG: Các chế phẩm cellulase thường được dùng để: - Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc: • Chúng ta đều biết, cellulose là hợp phần quan trọng của vỏ tế bào thực vật, các... khí và sản phẩm cuối cùng là glucose Tuy nhiên, trong tự nhiên không có vi sinh vật nào tổng hợp cùng lúc tất cả enzym trong phức hệ enzym cellulose, mỗi loài tổng hợp mạnh một loại enzyme khác nhau Vì vậy, trong tự nhiên cellulose bò phân hủy rất chậm hoặc không triệt để - Số lượng loài vi sinh vật trong tự nhiên tham gia tổng hợp enzyme cellulase rất phong phú như: nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn và còn... và phế liệu gỗ: • Các phế liệu này rẻ tiền và có thể dùng chế phẩm cellulase để thủy phân thành đường đơn giản có thể chế biến làm thức ăn gia súc Enzym cellulase phổ biến rộng rãi trong các nấm hiển vi và vi khuẩn Trong đa số trường hợp, người ta thu chế phẩm cellulase từ canh trường bề mặt của nấm mốc A.Oryzae và A.Awamori - Được ứng dụng trong chất tẩy rửa, chủ yếu để làm mềm vải 17 ... trưng của malt và bia 16 • Rong biển nếu được gia công từ chế phẩm cellulase thì hiệu suất sẽ được tăng lên • Người ta cũng thấy do ảnh hưởng của enzym hemicellulase mà các chất mật, gôm … vốn không bò tác dụng của cellulase cũng bò phân hủy một cách mạnh mẽ, nên kết quả là ngăn cản được sự gelatin hóa khi chế biến các loại cafe cô đặc - Thủy phân gỗ và phế liệu gỗ: • Các phế liệu này rẻ tiền và có thể... hoà tan ban đầu, sau đó dưói tác dụng của enzym Cx mảnh vừa được tạo thành sẽ bò phân ly thành oligosaccarit cho đến cellobiose Như vậy, cellulase C1 tác dụng trên cellulose nguyên thủy, cellulase C2 tác dụng trên cellulose đã biến hình nhưng vẫn không hòa 13 tan, cellulase Cx tác dụng trên cellodextrin hoà tan hoặc các dẫn xuất hoà tan, còn cellobiase thì tác dụng trên các disaccaritcellobiose để tạo