Đang tải... (xem toàn văn)
Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC&THỰC PHẨM HÓA SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: CHIẾT, TINH CHẾ VÀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Trang 1/98 GVHD: LỚP: NHÓM : 1 SVTH: LÊ THANH NGUYÊN 09248781 VŨ THỊ NINH 09248861 ĐOÀN THỊ PHƯỢNG 09247521 NGUYỄN THỊ THỦY 09246191 TẠ PHI VŨ 09258231 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME 1.1Khái niệm về enzyme Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác. Chất xúc tác hóa học có hai đặc điểm quan trọng: 1- Làm tăng phản ứng hóa học. 2- Bản than chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng. Sau này các nhà khoa học thấy rằng các chất xúc tác hóa học chỉ làm tăng tốc độ phản ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay năng lượng sử dụng trong phản ứng. Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra trong cơ thể sinh vật) cũng có chất làm tăng các phản ứng, chất đó gọi là enzyme. Chữ “enzyme” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là chất trong nấu men. Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong cơ thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất vô cơ. Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein. Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể. Điểm rất đặc biệt của enzyme là chúng hoạt động trong diều kiện ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa của cơ thể sinh vật. Trong khi đó, các chất hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Nhiệt độ càng cao, tốc độ xúc tác phản ứng hóa học càng cao. Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thể tóm tắt như sau: 1- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất. 2- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao. Trang 2/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme 3- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo. 4- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít. 5- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme. 6- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại. 1.2 Cấu tạo của enzyme Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20000 đến 1000000 dalton. Các enzyme được cấu tạo từ L – axit amin. Các axi tamin này liên kết với nhau bởi liên kết peptit. Khi thủy phân protein enzyme, ta sẽ thu nhận được các axitamin. Trong một số trường hợp, ngoài axit amin ra người ta còn thu được những thành phần khác. - Nếu một enzyme, khi bị thủy phân, ta chỉ thu được các axit amin thì enzyme này được gọi là enzyme đơn cấu tử hay còn gọi là enzyme đơn giản. - Nếu một enzyme, khi bị thủy phân, ta thu được ngoài axit amin còn các thành phần khác thì enzyme này được gọi là enzyme đa cấu tử hay còn gọi là enzyme phức tạp. Các enzyme phức tạp, ngoài protein ra còn có các thành phần khác như ion kim loại, vitamin, glutation dạng khử, … đa số enzyme có trong cơ thể thuộc enzyme đa cấu tử. Trong thành phần enzyme đa cấu tử người ta phân biệt rõ các phần như sau: - Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme. - Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”. Nhóm ngoại, khi được tách ra khỏi enzyme, có thể tồn tại độc lập.Trong khi tham gia xúc tác, không phải toàn bộ tất cả các phần trong cấu trúc của enzyme tham gia mà chỉ có một phần giới hạn của phân tử enzyme tham gia phản ứng. Phần giới hạn tham gia phản ứng này được gọi là trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt đông của enzyme do một số axit amin đảm trách. Như vậy, trong trường hợp cơ thể bị đột biến thì không phải bất kỳ đột Trang 3/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme biến nào cũng dẫn tới hiện tượng làm sai lệch các phản ứng sinh hóa của tế bào, chỉ có những đột biến làm thay đổi axit amin hoặc làm thay đổi thứ tự sắp xếp của các axit amin thì mới có ý nghĩa. Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp các nhóm định chức của axit amin không tham gia vào trục chính của sợi polypeptit. Các nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptit nhưng chúng lại gần nhau trong không gian. Khoảng cách này được xác định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác. Cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động thường giống cấu trúc không gian của cơ chất mà chúng tham gia xúc tác. Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử là nhóm ngoại và nhóm định chức của axitamin nằm ở apoenzyme. Khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm định chức của trung tâm hoạt động sẽ thay đổi cấu trúc không gian sao cho tương ứng với cấu trúc không gian của cơ chất. Ở tế bào động vật tồn tại một loại enzyme không có khả năng tham gia phản ứng ngay, muốn có khả năng hoạt động chúng phải được hoạt hóa. Trung tâm hoạt động của loại enzyme này tồn tại ở dạng chưa được hoạt hóa và được gọi là zymogen hay proenzym, ví dụ như enzyme pepxinogen, tripxinogen, kimotripxinogen hay protrombin. Các enzyme này có thể tự hoạt hóa hoặc nhờ tác dụng của một enzyme nào đó hoặc một yếu tố nào đó. Khi đó một số liên kết peptit trong phân tử zymogen bị mất, enzyme sẽ được hoạt hóa. Trong một số trường hợp khác có sự sắp xếp lại các nhóm chức trong phân tử enzyme. Khi đó trung tâm hoạt động của enzyme ở trạng thái hoạt hóa. Ở những enzyme dị lập thể hay enzyme điều hòa còn có trung tâm dị lập thể (enzyme điều hòa). Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác. Các cơ chất tương tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa. Khi trung tâm điều hòa này tương tác với chất điều hòa, chúng sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động, khi đó tốc độ phản ứng enzyme sẽ bị thay đổi. Trong trường hợp phản ứng enzyme được tăng lên khi Trang 4/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất điều hòa này được gọi là chất điều hòa dương. Ngược lại nếu phản ứng enzyme giảm đi khi chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất diều hòa này được gọi là chất điều hòa âm. Các chất điều hòa hoàn toàn không biến đổi khi chúng tương tác với enzyme. Các nhóm chức năng của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm: - Nhóm sulfridril của xistein. - Nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm ε – amin của lizin. - Nhóm cacboxyl của axit aspartic và axit glutamiz. - Nhóm hydroxyl của serin, treonin, và trirozin. Trung tâm hoạt động của các enzyme một thành phần bao gồm từ 3 – 7 nhóm chức năng trên. Các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động được định hướng xác định sau đó để đảm bảo cho chúng có khả năng tương tác với nhau trong khi phản ứng. Trung tâm hoạt động của enzyme hai thành phần bao gồm một số nhóm chức năng của axit amin trong thành phần apoenzyme và trong nhiều trường hợp còn cần cả ion kim loại. Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là nhũng ion kim loại hóa trị 2 như Fe, Co, Mn, Zn, Cu …chúng có mặt ở cả trung tâm hoạt động của enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần. Các kim loại này có thể tham gia trực tiếp trong các phản ứng xúc tác, chúng liên kết bền với phân tử enzyme. Trong nhiều trường hợp enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính khi bị loại bỏ kim loại ra khỏi thành phần của enzyme. Trong trường hợp này enzyme này được gọi là metaloenzyme. Hoạt động của enzyme này sẽ được phục hồi khi cho kim loại vào. 1.3Cách gọi tên và phân loại enzyme Trước kia thường gọi tên enzyme một cách tùy tiện, tùy theo tác giả. Các tên đã quen dùng như tripxin, pepxin, kimotripxin, …hiện nay vẫn được dùng gọi là tên thông dụng. Tên gọi đầy đủ, chính xác theo quy ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme được gọi Trang 5/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme theo tên cơ chất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác, cộng thêm đuôi “aza”. Tên gọi hệ thống thường gồm hai phần: - Phần thứ nhất là tên gọi cơ chất (nếu phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách nhau bằng hai chấm); - Chỉ một cách khái quát bản chất của phản ứng xúc tác. Ví dụ: + Tên thông dụng: ureaza + Tên gọi hệ thống: cacbamit – amidohydrolaza Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hổ thì người ta còn thêm vào sau phần thứ hai của tên gọi một phần tương ứng trong dấu ngoặc. Ví dụ, enzyme xúc tác oxy hóa axit amin trong phản ứng: L – axit amin Có tên gọi: L – axit amin: oxydoreductaza (deamin) Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số từ 1- 6. Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp: 1- Oxydoreductaza 2- Transpheraza 3- Hydolaza 4- Liaza 5- Izomeraza 6- Ligaza Trang 6/98 COOH COOH H 2 N CH + O 2 C = O + NH 3 + H 2 R R Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme Mỗi lớp lại chia thành nhiều tổ. Mỗi tổ lại chia thành nhiều nhóm. Do đó trong bảng phân loại, đứng trước tên enzyme thường có 4 con số: số thứ nhất chỉ lớp, số thứ hai chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme. Ví dụ, 2.6.1.1. L – aspartat: α – xetoglutarat aminotranspheraza xúc tác cho phản ứng chuyển vị (lớp 2) nhóm chứa nitơ (tổ 6), nhóm chứa nitow ấy là nhóm amin (nhóm 1); phản ứng do enzyme này xúc tác: L – aspartat + α – xetoglutarat = oxaloaxetat + glutamate (Nhóm amin được chuyển từ L – aspactat đến α – xetoglutarct) 1.3.1 Oxydoreductaza Có tác động đến phản ứng oxy hóa khử. Có khả năng chuyển e - , H + … Phản ứng tổng quát: A - + B A + B - Các dạng thông dụng: - Dehydrogenase: tách H +. Ví dụ: alcol dehydrogenase (1.1.1.1.), glutamate dehydrogenase (1.4.3) - Reductase: tác động khử - Oxygenase: tác động oxy hóa - Peroxydase: tác động khi có H 2 O 2 , có tác dụng loại khả năng gây độc của H 2 O 2 trong cơ thể. 1.3.2 Transferase Có tác động lên phản ứng chuyển nhóm chức. Phương trình phản ứng tổng quát: A – B + C A + B – C Các dạng thông dụng: - Acyltransferase: có nhóm acyl (coenzyme A) - Glucosyltransferase: chuyển nhóm glucose. Enzyme chuyển hóa tinh bột. - Amino transferase: chuyển nhóm amin. - Photpho transferase: ATP ADP Trang 7/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme ATP + AMP ADP + ADP 1.3.3 Hydrolase Có tác động lên phản ứng thủy phân. Phương trình phản ứng tổng quát: A – B + H 2 O A – H + B – OH Các dạng thông dụng: - Amylase: + α – amylase: có trong nước bọt, mầm hạt ngũ cốc, nấm, vi khuẩn. Có khả năng phân giải 1- 4-glucozit tại vị trí giữa mạch. + ß – amylase: có trong thực vật (hạt củ). Phân giải 1-4 glucozit tại vị trí đầu mạch. Bền hơn α – amylase (bền tính acid). - Peptit hydroláe: có khả năng thủy phân liên kết peptit - Lipase có khả năng thủy phân lipit. Ví dụ triacylglycerol lipase (3.1.1.3) 1.3.4 Lyase Có tác động đến phản ứng nhờ bổ sung nhóm chức vào nối đôi hoặc tạo nối đôi nhờ lấy đi nhóm chức. Phương trình phản ứng tổng quát: AX – BY A = B + X – Y Ví dụ: Pyruvat decarboxylase: loại CO 2 ra khỏi acid pyruvic tạo thành acetaldehyde 1.3.5 Isomerase Có khả năng chuyển các nhóm chứctrong phân tử tạo thành các đồng phân. Phương trình phản ứng tổng quát: AX – BY AY - BX Ví dụ chuyển đổi galactose thành glucose 1.3.6 Ligase Có khả năng tổng hợp liên kết C – C, C – S, C – O, C – N nhờ vào phản ứng trùng ngưng liên hợp với sự thủy phân ATP và tác dụng của enzyme. Ví dụ: dưới tác dụng của pyruvat carboxylase (6.4.1.1), từ acid pyruvit tạo thành oxaloacetic. Trang 8/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme CHƯƠNG II: TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME 1 Các phương pháp phá vỡ tế bào 1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được hoạt tính enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào động vật, Trang 9/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme thực vật và VSV. Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ quan (hay mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ. Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay. Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định. - Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả. - Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi trường lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng. Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào). Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ học được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều. * Phương pháp đồng hóa áp lực cao: Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin). Tế bào bị phá vỡ bởi lực cắt và sức nén. Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có khác nhau. Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau. Ví dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar. Phương pháp đồng hóa áp lực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tế bào động vật và tế bào thực vật ít khi phải dùng phương pháp này. * Phương pháp nghiền ẩm: Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi thủy tinh có kích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường Trang 10/98 [...]... sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải cho một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tế bào và là của tế bào đó Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, Trang 11/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme. .. dung dịch Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muốn thu nhân enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào Trang 12/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan Như vậy khi... dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích 2.4 Phương pháp tinh sạch enzyme 2.4.1 Phương pháp kết tinh Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch phải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến 2.4.2 Phương pháp điện di Trang 18/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme Phương... nhiệt độ 400C Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 0– 40C 2.6 Chiết và tinh chế enzyme từ vi sinh vật Tùy theo yêu cầu của ứng dụng enzym mà ta cần enzym sạch và enzym không sạch (chế phẩm thô, chế phẩm tinh) Chế phẩm enzym thô thường chứa nhiều loại enzym khác nhau, chứa thành phần môi trường chưa được đồng hóa và vi sinh khối tế bào vi sinh vật Chế phẩm enzym tinh là sản phẩm... – 20% để kết tủa enzyme * Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện của protein -enzyme: Protein là chất lưỡng cực, chúng có cả nhóm acid và nhóm base Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ Trang 17/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng acid, vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid Kết tủa enzyme ở điểm đẳng... rất cao Mặt khác Trang 14/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao Chính vì thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau: - Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme - Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này - Tăng khả năng bảo quản enzyme - Giảm chi phí vận chuyển, bảo... tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và Trang 16/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80% * Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưỡng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của. .. dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền không hòa tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký 2.5 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật Trang 19/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme 2.5.1 Thu nhận enzyme amylase Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase (hay glucose) thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide... ngừng quá trình thu dịch enzyme Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô Quá trình lọc enzyme qua sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả năng giảm thiểu sự biến tính của enzyme Quá trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra trong khoảng thời gian 1 giờ Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký Trang 24/98 Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme Bromelin thân được... cơ và dung dịch enzyme Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ Người ta thường kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 100C Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme
