BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Trần Thị Minh Định NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG ASPERGILLUS SP PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH _ Trần Thị Minh Định NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG ASPERGILLUS SP PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN THANH THỦY Thành Phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN  Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ động viên suốt trình tiến hành đề tài  Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh hết lòng dạy dỗ  Tôi xin cảm ơn Thầy Phạm Văn Thông, TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết, TS Nguyễn Tiến Công hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành đề tài  Tôi xin cảm ơn em Nguyễn Vũ Mai Trang, bạn Salihah bạn Văn Đức Thịnh nhiệt tình giúp đỡ động viên  Tôi xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh, ủng hộ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Tác giả luận văn Trần Thị Minh Định MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược CKS 1.1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS 1.1.3 Cơ chế tác động CKS 1.1.4 Phân loại CKS 1.1.5 Ứng dụng CKS 13 1.3 Nấm sợi RNM khả sinh CKS 19 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng lên khả sinh trưởng sinh KS NS 21 1.5 Tách chiết tinh CKS 25 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu 27 2.1.1 VSV kiểm định 27 2.1.2 Hóa chất 27 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 27 2.1.4 Các MT nghiên cứu sử dụng 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính KS 29 2.2.1.1 Phương pháp khối thạch 29 2.2.1.2 Phương pháp đục lỗ 29 2.2.1.3 Phương pháp khoanh giấy lọc 30 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào 30 2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái định danh nấm sợi 30 2.2.3.1 Quan sát đại thể 30 2.2.3.2 Quan sát vi thể 31 2.2.3.3 Định danh sinh học phân tử 31 2.2.4 Phương pháp xác định sinh khối NS theo Egorov 32 2.2.5 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng khả sinh KS 32 2.2.5.1 Lựa chọn MT nuôi cấy thích hợp 32 2.2.5.2 Ảnh hưởng độ mặn 32 2.2.5.3 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng carbon 33 2.2.5.4 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ 33 2.2.5.5 Ảnh hưởng nhiệt độ 33 2.2.5.6 Ảnh hưởng pH ban đầu 33 2.2.5.7 Xác định động học trình lên men 33 2.2.6 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng lên độ bền CKS 34 2.2.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 34 2.2.6.2 Ảnh hưởng pH 34 2.2.6.3 Ảnh hưởng thời gian 34 2.2.7 Khảo sát khả làm giảm sinh khối nấm gây bệnh trồng dịch lên men 34 2.2.8 Xác định dung môi để thu nhận CKS thô 34 2.2.9 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 35 2.2.10 Tách chiết tinh CKS 35 2.2.10.1 Sắc ký mỏng 35 2.2.10.2 Sắc ký cột 36 2.2.11 Phương pháp xử lí số liệu 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 3.1 Tuyển chọn chủng NS có hoạt tính đối kháng mạnh 37 3.2 Đặc điểm sinh học phân loại 38 3.3 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện MT lên khả sinh trưởng hoạt tính đối kháng chủng Asp terreus Đ1 41 3.3.1 Ảnh hưởng MT nuôi cấy 41 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ muối 43 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng carbon 46 3.3.4 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ 48 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ 50 3.3.6 Ảnh hưởng pH ban đầu 51 3.3.7 Động học trình lên men 53 3.4 Khảo sát enzyme ngoại bào 55 3.5 Khảo sát khả kháng khuẩn 56 3.6 Khảo sát khả kháng nấm 57 3.7 Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ bền CKS chủng Asp terreus Đ1 59 3.7.1 Độ bền nhiệt 59 3.7.2 Độ bền pH 60 3.7.3 Độ bền thời gian 62 3.8 Bước đầu tìm hiểu khả ứng dụng dịch lên men chủng Asp terreus Đ1 làm giảm sinh khối nấm P palmivora 63 3.9 Xác định dung môi để thu CKS thô từ chủng Asp terreus Đ1 66 3.10 So sánh CKS thô chủng Asp terreus Đ1 với CKS khác 69 3.11 Xác định MIC CKS từ chủng Asp terreus Đ1 70 3.12 Tinh CKS 71 3.12.1 Sắc ký mỏng 71 3.12.2 Sắc ký cột 72 3.12.2.1 Sắc ký cột cao hexan 72 3.12.2.2 Sắc ký cột cao ethyl acetate 73 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 4.1 Kết luận 77 4.2 Kiến nghị 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CKS Chất kháng sinh IC50 The half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%) KL Khuẩn lạc KS Kháng sinh MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MRSA Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus kháng methicillin) MT Môi trường NMR Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) NS Nấm sợi NIC Non- Inhibitory Concentration (Nồng độ không ức chế) RNM Rừng ngập mặn VK Vi khuẩn VKG(+) Vi khuẩn Gram dương VKG(-) Vi khuẩn Gram âm VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Hoạt tính đối kháng chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ 37 Bảng 3.2 Đặc điểm phân loại chủng nấm sợi Đ1 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng MT nuôi cấy lên sinh trưởng hoạt tính đối kháng chủng Asp terreus Đ1 .41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối lên khả sinh trưởng hoạt tính đối kháng chủng Asp terreus Đ1 .44 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng carbon lên khả sinh trưởng hoạt tính đối kháng chủng Asp terreus Đ1 46 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ lên hoạt tính đối kháng chủng Asp terreus Đ1 .48 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh trưởng hoạt tính đối kháng chủng Asp terreus Đ1 50 Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH ban đầu MT nuôi cấy lên khả sinh trưởng hoạt tính đối kháng chủng Asp terreus Đ1 .52 Bảng 3.9 Động học trình lên men chủng Asp terreus Đ1 .53 Bảng 3.10 Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng Asp terreus Đ1 55 Bảng 3.11 Khả đối kháng với số VK chủng Asp terreus Đ1 .56 Bảng 3.12 Khả đối kháng với số nấm gây bệnh trồng chủng Asp terreus Đ1 57 Bảng 3.13 Độ bền nhiệt CKS chủng Asp terreus Đ1 59 Bảng 3.14 Độ bền pH CKS chủng Asp terreus Đ1 .60 Bảng 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên hoạt tính đối kháng dịch lên men chủng Asp terreus Đ1 .62 Bảng 3.16 Khả làm giảm sinh khối P palmivora dịch lên men chủng Asp terreus Đ1 64 Bảng 3.17 Hoạt tính CKS thô chủng Asp terreus Đ1 thu nhận dung môi khác 66 Bảng 3.18 Hoạt tính CKS thô chủng Asp terreus Đ1 thu nhận n-hexan ethyl acetate 68 Bảng 3.20 Rf CKS từ chủng Asp terreus Đ1 triển khai sắc ký hệ dung môi khác 71 Bảng 3.21 Sắc ký cột cao n-hexan 72 Bảng 3.22 Sắc ký mỏng để kiểm tra độ tinh khiết phân đoạn H2 72 Bảng 3.24 Sắc ký mỏng phân đoạn E5 74 3.12.2 Sắc ký cột 3.12.2.1 Sắc ký cột cao hexan Chúng triển khai sắc ký cột với 265mg cao thu hexan hệ dung môi chloroform: methanol = 100: 1, sau tăng dần độ phân cực dung môi theo tỉ lệ chloroform : methanol = 100: 2, 100: 3,… Hứng lọ thủy tinh 20 ml Theo dõi sắc ký cột sắc ký mỏng hệ dung môi chloroform:methanol tỉ lệ 10: Các lọ thủy tinh có mỏng sắc ký tương đương gom chung lại thành phân đoạn Kết sắc ký cột trình bày bảng 3.21 Bảng 3.21 Sắc ký cột cao n-hexan STT Phân đoạn H1 H2 H3 Đặc điểm theo dõi sắc ký mỏng Nhiều vết Một vết Nhiều vết Hoạt tính kháng khuẩn + - Ghi Không khảo sát Khảo sát Không khảo sát Chúng thu phân đoạn H2 13,8 mg có hoạt tính kháng khuẩn, chứng tỏ phân đoạn có chứa CKS Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết phân đoạn này, sắc ký mỏng hệ dung môi khác Kết trình bày bảng 3.22 Bảng 3.22 Sắc ký mỏng để kiểm tra độ tinh khiết phân đoạn H2 STT Hệ dung môi Chloroform:methanol Butanol:acid acetic: nước cất Ethyl acetate Acetonitril Tỉ lệ 10:1 5:1:2 100% 100% Số vết 1 Rf 0,50 0,87 0,41 0,44; 0,73;0,86 Khi kiểm tra hệ dung môi 100% acetonitril, phân đoạn H2 thu tách thành vết, chứng tỏ CKS thu phân đoạn H2 chưa tinh khiết, cần tinh chế thêm Nhưng khối lượng phân đoạn H2 ít, có 13,80 mg nên tiếp tục tinh chế Hình 3.40 Hiện hình sinh học mỏng sắc ký phân đoạn H2 100% acetonitril 3.12.2.2 Sắc ký cột cao ethyl acetate Chúng triển khai sắc ký cột với 2854,20 mg cao thu ethyl acetate hệ dung môi 100 chloroform: methanol Sau tăng dần độ phân cực dung môi theo tỉ lệ chloroform : methanol = 100: 2, 100: 3,… Hứng lọ thủy tinh 20 ml Theo dõi sắc ký cột sắc ký mỏng hệ dung môi chloroform: acetonitril tỉ lệ 10: Các lọ thủy tinh có mỏng sắc ký tương đương gom chung lại thành phân đoạn Kết sắc ký cột trình bày bảng 3.23 Bảng 3.23 Sắc ký cột cao ethyl acetate STT 10 11 Phân đoạn E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 Đặc điểm theo dõi sắc ký mỏng Có nhiều vết, có vết dơ Một vết Nhiều vết, có vết dơ Nhiều vết vết Nhiều vết Nhiều vết Nhiều vết Nhiều vết Nhiều vết Nhiều vết Hoạt tính kháng khuẩn + + + + + + - Ghi Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Không khảo sát Qua trình sắc ký cột cao ethyl acetate, thu nhiều phân đoạn có hoạt tính đối kháng với B subtilis, phân đoạn E5 kiểm tra sắc ký mỏng hệ dung môi chloroform: methanol có vết, vết so với phân đoạn khác, nên chọn phân đoạn E5 để tiếp tục khảo sát Hình 3.41 Bản mỏng theo dõi sắc ký cột cao ethyl acetate Chúng tiếp tục sử dụng sắc ký mỏng phân đoạn E5 hệ dung môi khác nhau, để tìm hệ dung môi thích hợp tách rõ ràng chất phân đoạn E5 Bảng 3.24 Sắc ký mỏng phân đoạn E5 STT Hệ dung môi Tỉ lệ Số lần nhúng Rf chất mục tiêu Ghi Các chất không tách Benzen:acid acetic: methanol 10:1:1 0,36 Chloroform: acid acetic 100:1 0,41 Chloroform: acid acetic 100:3 0,45 Chloroform:acid acetic 100:3 0,59 Chloroform: acid acetic 100:4 0,68 Chloroform: acid acetic 100:5 0,46 Chloroform: acid acetic 100:5 0,75 Chloroform: acid acetic 100:6 0,54 Chloroform: acid acetic 100:10 0,82 10 Chloroform: acetonitril 20:1 0,74 11 Chloroform: acetonitril 100:6 0,62 12 Chloroform: acetonitril 9:1 0,65 13 Chloroform: acetonitril 4:1 0,88 20:0,5:0,5 0,55 10:0,5:0,5 0,76 10:1:0,5 0,56 100:1 0,4 10:1:0,5 0,94 14 15 16 Chloroform: methanol: acetonittril Chloroform: methanol: acetonittril Chloroform:methanol: acetonittril 17 Chloroform:pyridine 18 Chloroform:acid acetic: methanol Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách ra; chất mục tiêu tách xa chất khác, vết tròn, màu đồng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất không tách Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất tách không rõ ràng Các chất không tách Trong hệ dung môi chloroform acid acetic tỉ lệ 100: 3, chất phân đoạn V tách rõ rệt, chất mục tiêu (màu xanh xám), thể vết tròn, màu sắc đồng (hình 3.42) Do đó, chọn hệ dung môi để chạy sắc ký mỏng chế hóa Hình 3.42 Hiện hình hóa học mỏng sắc ký phân đoạn E5 hệ dung môi 100 chloroform: acid acetic Khi tiến hành triển khai sắc ký mỏng chế hóa phân đoạn E5, nhận thấy vạch tách rõ hình (3.43.) Nhưng hình H SO đậm đặc, nhận thấy chất mục tiêu màu xanh xám xuất vết màu cam Điều chứng tỏ, vạch chứa chất mục tiêu có chứa chất khác Do hạn chế thời gian kinh phí, tạm dừng việc tinh chế CKS lại Hình 3.43 Hiện UV mỏng chế hóa phân đoạn E5 Như vậy, tiến hành tinh chế CKS theo bước sau, thu phân đoạn H2 E5 có chứa CKS Nuôi chủng Asp terreus Đ1 MT glucose 30g, bột đậu tương 0,5 g, cao nấm men 2,5 g, KH2PO4 g, MgSO4.7H2O g, NaCl 1,5 g, CaCl2.2H2O 0,5 g, FeCl3.2H2O 2mg, ZnSO4.7H2O 2mg, nước cất lít; pH 5,5; nhiệt độ nuôi cấy 25oC; 108 Lọc, tách sinh khối Dịch lên men Lắc với n-hexan, tách dung môi Dịch lên men sau lắc với n-hexan n-hexan có CKS Cô chân không 35oC Lắc với ethyl acetate, tách dung môi Cao n-hexan Sắc ký cột, hệ 100 chloroform: methanol Dịch lên men sau lắc với ethyl acetate Ethyl acetate có CKS Cô chân không 35oC H1 H2 H3 Cao ethyl acetate Sắc ký cột, hệ 100 chloroform: 1methanol E1-E4 E5 Hình 3.44 Qui trình tinh chế CKS E6-E11 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ 58 chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ sưu tập giống PTN Sinh hóa – Vi sinh Trường ĐH Sư Phạm TP HCM, tuyển chọn chủng Đ1 có hoạt tính đối kháng mạnh với B subtilis (D-d=2,74 cm) đối kháng yếu với E coli (D-d=1,10 cm) - Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại đến loài chủng Đ1, kết luận chủng thuộc loài Aspergillus terreus - Đã khảo sát tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng Asp terreus Đ1 sinh kháng sinh mạnh sau: glucose 30 g, bột đậu tương 0,5 g, cao nấm men 2,5 g, KH PO g, MgSO 7H O g, NaCl 1,5 g, CaCl 2H O 0,5 g, FeCl 2H O mg, ZnSO 7H O 2mg, nước cất lít; pH 5,5; nhiệt độ nuôi cấy 25oC; 108 - Đã khảo sát phổ tác động CKS từ chủng Asp terreus Đ1: kháng mạnh VKG(+) Staphylococcus aureus, S aureus kháng methicillin, Streptococcus pyogenes; kháng yếu không kháng VKG(-) nấm men; không kháng loài nấm Colletotrichum sp., Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani có khả kháng mạnh Phytophthora palmivora - Đã xác định số đặc điểm CKS dịch lên men chủng Asp terreus Đ1: bền nhiệt (đến 100oC 40 phút hoạt tính không thay đổi), bền pH (thể hoạt tính mạnh khoảng pH - 7,5), bền thời gian (khi bảo quản 4oC, sau 16 tuần hoạt tính không thay đổi) - Bước đầu tìm hiểu khả ứng dụng dịch lên men chủng Asp terreus Đ1 việc làm giảm sinh khối P palmivora: cho thấy MT có 10% dịch lên men làm giảm 70,16% sinh khối P palmivora, MT có 20% làm giảm 79,57% sinh khối P palmivora sau ngày nuôi cấy - Bước đầu khảo sát để tách chiết CKS, thu kết sau: + Dung môi thích hợp để thu CKS n-hexan ethyl acetate + CKS thô thu từ n-hexan có MIC 25 µg/ml CKS thô chủng Asp terreus Đ1 thu từ dung môi n-hexan có hoạt tính đối kháng với B subtilis mạnh streptomycin, neomycin, kanamycin, erythromycin, clindamycin; yếu ampicillin, tetracyclin + Đã bước đầu tiến hành tinh chế CKS cách sắc ký cột silica gel, thu phân đoạn H2 E5 có hoạt tính đối kháng 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục tinh xác định chất CKS từ chủng Asp terreus Đ1 để làm sở cho việc ứng dụng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP HCM, tr.62-63 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.96-108 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, tr.90-108 Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học Vi sinh vật tập 1, Nhà xuất Đại học Sư phạm, tr.124-130 Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thủy (2007), “Khảo sát đặc điểm số chủng nấm sợi có kháng sinh chống sinh vật gây hại”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Sư phạm TP HCM, 12 (46), tr.138-150 Bùi Xuân Đồng (2004), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.154-160 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.3-31 Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tr.3-30 Nguyễn Thị Lan Hương (2009), Tuyển chọn khảo sát khả sinh amylase số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ - TP HCM, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP HCM, tr.40-64 10 Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh (2009), Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng, Nhà xuất Giáo Dục, tr.221-269 11 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học – tập Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP HCM, tr.34 12 Phan Thanh Phương (2007), Khảo sát khả sinh kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP HCM, tr 22-32 13 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP HCM, tr.151-252 14 Phạm Thị Thanh Thúy (2007), Nghiên cứu khả phân giải cacbuahydro số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP HCM, tr.67-77 15 Trần Thị Nhã Uyên (2010), Nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ chủng nấm sợi rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP HCM, tr.56-76 16 Võ Thị Bích Vân (2010), Nghiên cứu khả sinh enzyme protease số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP HCM, tr.47-63 17 Võ Thị Bích Viên (2009), Khảo sát đặc điểm sinh học số nhóm nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP HCM, tr.70-75 Tiếng Anh 18 A A Brakhage, T Scheper (2004), Molecular Biotechnology of Fungal β-Lactam Antibiotics and Related Peptide Synthetases - Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Volume 88, Springer Berlin Heidelberg New York, pp.47-49 19 Benjaphorn Prapagdee, Chutima Kuekulvong, Skorn Mongkolsuk (2008), “Antifungal Potential of Extracellular Metabolites Produced by Streptomyces hygroscopicus against Phytopathogenic Fungi”, International Journal of Biological Sciences, 4, pp.330-337 20 Carsten Christophersen, Oscar Crescente, Jens C Frisvad, Lone Gram, Joan Nielsen, Per Halfdan Nielsen, Lisa Rahbæk (1999), “Antibacterial activity of marinederived fungi”, Mycopathologia, 143(3), pp.135-138 21 E B Gareth Jones (2011), “Fifty years of marine mycology”, Fungal Diversity, 50, pp.73-112 22 Emanuel Goldman, Lorrence H Green (2008), Practical handbook of microbiology, CRC Press, pp.131-143 23 Guangshun Wang (2010), Antimicrobial Peptides discovery Design and Novel Therapeutic Strategies, CAB International, pp.9-10 24 I Edward Alcamo (1991), Fundamentals of Microbiology, The Benjamin/ Cummings, pp.470-485 25 Iqbal Ahmad, Farah Ahmad, John Pichtel (2011), Microbes and Microbial Technology Agricultural and Environmental Applications, Springer, pp.447-453 26 J Heritage, E G V Evans, R A Killington (2003), Microbiology in action, Cambridge University Press, pp.249-260 27 J Webster, R W S Weber (2007), Introduction to fungi, Cambridge University Press, pp.293-304 28 K Sambamurthy, Ashutosh Kar (2010), Pharmaceutical biotechnology, New Age International Publishers, p.173 29 Kevin D Hyde, E B Gareth Jones, Eduardo Leanä O, Stephen B Pointing, Asha D Poonyth, Lilian L P Vrijmoed (1998), “Role of fungi in marine ecosystems”, Biodiversity and Conservation, 7, pp.1147-1161 30 Kim Lewis, Abigail A Salyers, Harry W Taber, Richard G War (2002), Bacterial Resistance to Antimicrobials, Marcel Dekker Inc, pp.331 31 Kongkiat Trisuwan, Vatcharin Rukachaisirikul, Yaowapa Sukpondma, Sita Preedanon, Souwalak Phongpaichit, Nattawut Rungjindamai, Jariya Sakayaroj (2008), “Epoxydons and a Pyrone from the Marine-Derived Fungus Nigrospora sp PSUF”, Journal of Natural products, 71(8), pp.1323-1326 32 Kyoko Adachi, Kaneo Kanoh, Puntip Wisespongp, Miyuki Nishijima, Yoshikazu Shizuri (2005), “Clonostachysins A and B, New Anti-dinoflagellate Cyclic Peptides from a Marine-derived Fungus”, The Journal of Antibiotics, 58, pp.145150 33 Marie B Coyle et al (2005), Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing, American Society for Microbiology, pp.3-14 34 Masahira Nakagawa, Arika Hirota, Heiichi Sakai (1982), “Terrecyclic acid A, A new antibiotic from Aspergillus terreus”, The Journal of Antibiotics, 35(7), pp.778782 35 Micheal J Carlite, Sarah C Watkingson, Graham W Gooday (2001), The fungi, Academic Press, pp.145-515 36 N S Egorov (1985), Antibiotics - A scientific approach, MIR, pp.76-340 37 P C Trivedi (2009), Microbes applications and effects, Aavishkar Publishers Distributors, pp.65-77 38 Petur W Dalsgaard, Thomas O Larsen, Carsten Christophersen (2005), “Bioactive Cyclic Peptides from the Psychrotolerant Fungus Penicillium algidum”, The Journal of Antibiotics, 58(2), pp.141-144 39 Quek Rop Fun (2007), A Study on Higher Marine Fungal Interaction, A Thesis Submitted For the Degree of Master of Science, National University of Singapore, pp.4-18 40 R Gayatri Nambiar, K Raveendran (2009), “Manglicolous Marine Fungi of Kerala (South India)”, Botany Research International, 2(3), pp.206-210 41 R J Howard, N.A.R Gow (2007), Biology of the Fungal Cell, 2nd Edition, SpringerVerlag Berlin Heidelberg, pp.219-230 42 Robert A Samson, Ellen S Hoekstra, Jens C Frisvad (2004), Intruduction to food and airborne fungi, Centraalbureau voor Schimmelculture_Utrecht, pp.52-76 43 S Arunmozhi Balajee (2009), “Aspergillus terreus complex”, Medical Mycology, 47, pp.42-46 44 Shu-Wei Yang, Tze-Ming Chan, Joseph Terracciano, David Loebenberg, Mahesh Patel, Min Chu (2005), “Structure Elucidation of Sch 725674 from Aspergillus sp.”, The Journal of Antibiotics, 58(8), pp.535-538 45 Simone Rochfort, Joanne Ford, Simon Ovenden, Soo San Wan, Samantha George, Howard Wildman, R Murray Tait, Barbara Meurer-Grimes, Susan Cox, Jonathan Coates, David Rhodes (2005), “A Novel Aspochalasin with HIV-1 Integrase Inhibitory Activity from Aspergillus flavipes”, The Journal of Antibiotics, 58(4), pp.279-283 46 Soo-Jin Choo, Hae-Ryong Park, In-Ja Ryoo, Jong-Pyung Kim, Bong-Sik Yun, ChangJin Kim, Kazuo Shin-ya, Ick-Dong Yoo (2005), “Deoxyverrucosidin, a Novel GRP78/BiP Down-regulator, Produced by Penicillium sp.”, The Journal of Antibiotics, 58(3), pp.210-213 47 Stuart Hogg (2005), Essential Microbiology, John Wiley & Sons Ltd, pp.59-63, 197209, 353-364 48 Takashi Fukuda, Hiroshi Tomoda, Satoshi Ōmura (2005), “Citridones, New Potentiators of Antifungal Miconazole Activity Produced by Penicillium sp FKI-1938”, The Journal of Antibiotics, 58(5), pp.315-321 49 Timothy G Schimmel, Allen D Coffman, Sarah J Parsons (1998), “Effect of Butyrolactone I on the Producing Fungus, Aspergillus terreus”, Applied And Environmental Microbiology 64(10), pp.3707-3712 50 V Venkateswara Sarma, K D Hyde, B P R Vittal (2001), “Frequency of occurrence of mangrove fungi from the east coast of India”, Hydrobiologia, 455, pp.41-53 51 W Scott Champney (2008), New antibiotic targets, Humana Press, pp.11-12 52 Weizhong Liu, Qianqun Gu, Weiming Zhu, Chengbin Cui, Guotao Fan (2005), “Dihydrotrichodimerol and Tetrahydrotrichodimerol, Two New Bisorbicillinoids, from a Marine-derived Penicillium terrestre”, The Journal of Antibiotics, 58(10), pp.621-624 Địa website 53 http://www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky-thuat/146/Ky-thuatkhang-sinh-do-MIC.vhtm 54 http://www.life.umd.edu/classroom/bsci424/Images/PathogenImages/BetaLactam.gif 55 http://www.ganfyd.org/images/2/2c/Streptomycin.png 56 http://cbassandchuck.pbworks.com/f/1197909289/800px-Tetracycline_structure.svg.png 57 http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/images/antibiotics/erythromycin gif 58 http://classes.midlandstech.com/carterp/Courses/bio225/chap20/20-14_Polyenes_1.jpg 59 http://xe0.xanga.com/c37c877b45733219651823/t172158251.gif 60 http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/images/antibiotics/cephalosporin _nuc.gif 61 http://cenblog.org/_img/fumagillin.jpg 62 http://home.caregroup.org/clinical/altmed/interactions/Images/Drugs/griseofu.gif 63 http://www.vnppa.org.vn/?m=news&a=page_newsdetail&newsid=1198&leveltwo=164 &lang=vi 64 http://forum.caycanhvietnam.com/diendan/archive/index.php/t-743.html PHỤ LỤC [...]... bỏ ngỏ Từ những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng Aspergillus sp phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ  Mục tiêu: Góp phần nghiên cứu về NS sinh KS ở RNM Cần Giờ  Nhiệm vụ - Tuyển chọn chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có hoạt tính KS mạnh - Phân loại đến loài chủng NS nghiên cứu - Nghiên cứu các điều kiện môi trường (MT) thích hợp cho sinh trưởng... và sinh KS của chủng tuyển chọn - Khảo sát phổ tác động của CKS từ chủng NS nghiên cứu - Khảo sát các tính chất lí hóa của CKS từ chủng NS nghiên cứu - Bước đầu thử nghiệm khả năng ức chế nấm gây bệnh cây trồng của dịch lên men từ chủng NS nghiên cứu - Tìm hiểu khả năng tách chiết để thu nhận CKS thô  Đối tượng nghiên cứu: Các chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ trong bộ sưu tập giống của PTN Vi sinh. .. Hoạt tính đối kháng của chủng Asp terreus Đ1 ở thời gian nuôi cấy khác nhau 55 Hình 3.16 Hoạt tính enzyme của chủng Asp terreus Đ1 56 Hình 3.17 Khả năng đối kháng với S aureus của chủng Asp terreus Đ1 57 Hình 3.18 Khả năng đối kháng với MRSA của chủng Asp terreus Đ1 57 Hình 3.19 Khả năng đối kháng với P palmivora của chủng Asp terreus Đ1 58 Hình 3.20 Khả năng đối kháng với Colletotrichum... nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của NS phân lập từ một số RNM ở hai tỉnh Nam Định và Thái Bình” của Mai Thị Hằng (2002) [12] - “Khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng của các chủng NS phân lập từ một số khu RNM Nam Định và Thái Bình” của Mai Thị Hằng, Lê Thanh Huyền (2002) [12] - “Khảo sát khả năng ký sinh gây bệnh côn trùng và tiềm năng kiểm soát sinh học của nấm RNM Nam Định” của. .. tác dụng diệt tằm và diệt sâu tơ của các chủng NS nói trên [12] - Bùi Thị Nha (2008), Phạm Thị Thùy Trinh (2008), Phạm Gia Cần (2009), Phùng Văn Phúc (2009), Khổng Thị Thu Hà (2010), Trương Mai Thanh Thanh (2010) nghiên cứu về khả năng sinh KS của một số chủng NS sinh KS từ RNM Cần Giờ Nhìn chung các nghiên cứu về NS sinh KS ở RNM Cần Giờ cho thấy nấm sợi RNM có khả năng sinh nhiều loại enzyme khác nhau,... Ảnh hưởng của MT nuôi cấy lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp terreus Đ1 42 Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của chủng Asp terreus Đ1 44 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp terreus Đ1 47 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hoạt tính đối kháng của chủng Asp terreus... kiếm CKS từ NS rừng ngập mặn (RNM) Bởi theo các nhà khoa học, chúng là nguồn sinh các chất có hoạt tính sinh học dồi dào, trong đó có CKS Và thực tế, họ đã phát hiện nhiều hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư,… từ NS rừng ngập mặn với hoạt tính mạnh hơn rất nhiều so với NS từ đất liền Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nấm sợi RNM sinh KS còn ít Đặc biệt, nấm sợi ở RNM Cần Giờ sinh KS... hơn từ đất liền Newman và cộng sự (1998) nghiên cứu về CKS của các nấm biển sinh trưởng chậm, cho thấy hoạt tính KS phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy Carsten Christophersen và cộng sự (1999) nghiên cứu trên 227 chủng NS phân lập từ biển (trong RNM và các đầm phá), kết quả có 7 chủng có khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus, 55 chủng kháng S aureus [20] Cho đến nay, các nghiên cứu về CKS của nấm... đối kháng của 30 µg CKS thô chủng Asp terreus Đ1 70 Hình 3.33 Hoạt tính đối kháng của 2 µg CKS thô chủng Asp terreus Đ1 70 Hình 3.34 Hoạt tính đối kháng của 10 µg CKS thô chủng Asp terreus Đ1 70 Hình 3.35 Hoạt tính đối kháng của 10 µg ampicillin 70 Hình 3.36 Hoạt tính đối kháng của 15 µg erythromycin 70 Hình 3.37 Hoạt tính đối kháng của 2 µg clindamycin 70 Hình 3.38 Hiện hình sinh. .. Colletotrichum sp của chủng Asp terreus Đ1 .58 Hình 3.21 Hoạt tính đối kháng của chủng Asp terreus Đ1 khi xử lí ở các nhiệt độ khác nhau 60 Hình 3.22 Hoạt tính đối kháng của chủng Asp terreus Đ1 khi xử lí ở các điều kiện pH khác nhau 62 Hình 3.23 Hoạt tính đối kháng của chủng Asp terreus Đ1 sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau .63 Hình 3.24 Khả năng ức chế sinh ... Trần Thị Minh Định NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG ASPERGILLUS SP PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG... Aspergillus sp phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ  Mục tiêu: Góp phần nghiên cứu NS sinh KS RNM Cần Giờ  Nhiệm vụ - Tuyển chọn chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ có hoạt tính KS mạnh - Phân loại... với NS từ đất liền Ở Việt Nam, nghiên cứu nấm sợi RNM sinh KS Đặc biệt, nấm sợi RNM Cần Giờ sinh KS nhiều vấn đề bỏ ngỏ Từ lí trên, định chọn đề tài: Nghiên cứu khả sinh kháng sinh chủng Aspergillus