BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Bùi Thị Nhung NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Bùi Thị Nhung NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU PHÚC Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu trình bầy phần kết luận văn thực chưa công bố công trình Tác giả luận văn Bùi Thị Nhung LỜI CẢM ƠN Sau hai năm học tập nghiên cứu, hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Sinh học Để đạt thành ngày hôm Tôi xin chân thành cảm ơn:  Toàn thể quý Thầy, Cô khoa sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp HCM truyền đạt kiến thức quý báu cho thời gian theo học trường  TS Nguyễn Hữu Phúc – giáo viên hướng dẫn tôi, người thầy gần gũi tận tâm học trò Người hết lòng hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ động viên lúc khó khăn Thầy truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu giúp hoàn thành tốt luận văn  Sở Giáo Dục - Đào Tạo tỉnh Bình Dương, Trường THPT An Mỹ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học  Ths Dương Nhật Linh Ths Nguyễn Văn Minh (Đại Học Mở) nhiệt tình giúp đỡ hỗ trợ làm thí nghiệm suốt thời gian thực đề tài  Em Trang, Quỳnh, Phi (sinh viên Đại Học Mở) toàn thể bạn học viên cao học khóa 22 giúp đỡ, quan tâm hỗ trợ trình thực đề tài  Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân yêu gia đình bên cạnh, ủng hộ tôi, nguồn động viên lớn lao hy sinh nhiều để có ngày hôm Xin chân thành cảm ơn Bùi Thị Nhung MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Thời gian địa điểm nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Khái quát chung protease 10 1.1.1 Khái niệm phân loại 10 1.1.2 Cơ chế phản ứng ứng dụng protease 13 1.1.3 Enzyme protease kiềm 19 1.1.4 Enzyme Nattokinase 26 1.2 Phương pháp nuôi cấy thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn 30 1.2.1 Những vấn đề lên men bán rắn 30 1.2.2 Những ưu điểm lên men bán rắn tạo enzyme 30 1.2.3 Các giai đoạn trình lên men bán rắn 31 1.3 Đại cương Bacillus subtilis 31 1.3.1 Lịch sử phát triển 31 1.3.2 Vị trí phân loại 32 1.3.3 Đặc điểm phân bố 32 1.3.4 Đặc điểm hình thái sinh hóa 32 1.4 Giới thiệu bệnh huyết khối 34 1.4.1 Khái niệm huyết khối 34 1.4.2 Nguyên nhân hình thành huyết khối 34 1.4.3 Biến chứng bệnh huyết khối 35 1.4.4 Tình hình bệnh huyết khối giới Việt Nam 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37 2.1 Vật liệu 37 2.1.1 Nguyên vật liệu 37 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 37 2.1.3 Hóa chất 37 2.2 Môi trường nghiên cứu 37 2.3 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí thí ngiệm tổng quát) 39 2.3.1 Phương pháp phân lập VK Bacillus Natto 40 2.3.2 Phương pháp cấy truyền VSV 41 2.3.3 Phương pháp giữ giống lớp dầu khoáng 41 2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc 42 2.3.5 Phương pháp nhuộm Gram 42 2.3.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A Peskop 43 2.3.7 Phương pháp xác định khả sinh catalase 43 2.3.8 Phương pháp xử lí tế bào bào tử để chụp KHV điện tử quét SEM 44 2.3.9 Chụp ảnh tế bào, bào tử kính hiển vi điện tử quét 44 2.3.10 Định danh VK phương pháp sinh học phân tử 44 2.3.11 Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc 45 2.3.12 Xác định hoạt tính protease cách đo đường kính vòng thủy phân 46 2.3.13 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến 47 2.3.14 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 49 2.3.15 Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase 50 2.3.16 Khảo sát ảnh hưởng số điều kiện MT nuôi cấy lên khả tổng hợp protease chủng B subtilis N18 51 2.3.17 Phương pháp làm natto 54 2.3.18 Phương pháp xác định độ ẩm sản phẩm sau lên men 55 2.3.19 Phương pháp tách chiết enzyme 56 2.3.20 Phương pháp thu nhận enzyme 56 2.3.21 Khảo sát số đặc tính chế phẩm enzyme protease thu nhận ethanol58 2.3.22 Phương pháp xử lí số liệu 58 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60 3.1 Phân lập tuyển chọn mẫu VK có hoạt tính protease cao 60 3.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto Nhật Bản 60 3.1.2 Tuyển chọn mẫu VK có hoạt tính protease cao 61 3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học hai mẫu N18 N441, định danh đến chi 66 3.2.1 Đặc điểm hình thái 66 3.2.2 Định danh đến chi theo hình thái 68 3.3 Định danh hai mẫu N18 N441 đến loài sinh học phân tử 68 3.4 Khảo sát ảnh hưởng số điều kiện MT nuôi cấy lên tổng hợp protease chủng B subtilis N18 69 3.4.1 Ảnh hưởng tỉ lệ cám mì bột đậu nành 69 3.4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường 71 3.4.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men 72 3.4.4 Ảnh hưởng pH ban đầu 73 3.4.5 Ảnh hưởng tỉ lệ giống 75 3.4.6 Ảnh hưởng Zn2+ K+ 76 3.4.7 Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối hoạt tính protease 77 3.4.8 Tối ưu hóa nồng độ tween 80 glucose phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm 78 3.5 Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase 82 3.5.1 Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto Nhật Bản 82 3.5.2 Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase MT lên men bán rắn 86 3.5.3 Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase sinh khối Bacillus subtilis 91 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC 103 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACE Angiotensin BT Bào tử CPE Chế phẩm enzyme ĐN & GL Đậu nành gạo lức ĐN Đậu nành G(-) Gram âm G(+) Gram dương GL Gạo lức KHV Kính hiển vi KL Khuẩn lạc MT Môi trường NXB Nhà xuất OD Mật độ quang PP Phương pháp STT Số thứ tự TB Tế bào TCA Axit tricloacetic TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Protease hay peptide hydrolase enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptid (-O-NH-) phân tử protein polypeptide Sản phẩm trình thủy phân acid amin, polypeptide chuỗi ngắn, nhiều enzyme protease xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid phản ứng chuyển vị gốc acid amin Protease enzyme công nghiệp quan trọng hàng đầu, chiếm phần hai tổng sản lượng thị trường enzyme toàn giới (Rao et al.,1998) Các enzyme protease chiếm vị trí quan trọng ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp khác nhau: Chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, gia cầm, ngành công nghiệp dược phẩm, công nghiệp thuộc da, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp dệt thu hồi bạc từ phim ảnh… Vi sinh vật nguồn quan trọng sản xuất enzyme Trừ số protease sản xuất từ động vật, thực vật trypsin, chymotrypsin, papain, bromelain, ficin, lại hầu hết đựợc sản xuất từ vi sinh vật [2], vi khuẩn nguồn đóng góp chủ yếu, thứ đến nấm mốc Theo tổ chức y tế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết bệnh tim mạch (nhồi máu tim đột quy), mà nguyên nhân hậu chứng huyết khối Theo ước tính thị trường toàn cầu thuốc làm tan huyết khối gần 14 tỷ USD (Cong et al., 2009) [26] Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người chẩn đoán đột quỵ có liên quan đến huyết khối Huyết khối xuất sợi protein có tên Fibrin tích lũy lòng mạch Huyết khối nguyên nhân gây tắc nghẽn dòng mạch máu tới nuôi mô tim Nếu dòng mạch máu bị chẹn, oxy cung cấp cho bị giảm không Điều dẫn đến chứng đau thắt ngực đau tim Huyết khối tâm thất tim di chuyển lên não gây tắc nghẽn mạch máu não gây biến chứng tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ Các chất làm tiêu sợi fibrin đường tĩnh mạch streptokinase, urokinase hoạt hóa plasminogen mô ( t-PA ) sử dụng điều trị làm tan huyết khối từ năm 1960, 1970, 1980 Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học chất tồn không lâu nên có trường hợp huyết khối lại xuất trở lại nguy biến chứng gây xuất huyết (Kumar A.,(2010) [40] Năm 1980 có phát minh vô lý thú enzyme Nattokinase (NK) NK enzyme hoạt huyết mạnh có nguồn gốc từ ăn truyền thống Nhật Bản có tên Natto Nó loại gia vị dân gian phương thuốc cổ truyền chữa bệnh tim mạch Natto sản xuất lên men đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis – loại vi khuẩn có ích, ủ ấm với hạt đậu nành sản sinh enzyme NK Bác sỹ Hyroyuki Sumi tác giả phát Natto làm tan huyết khối năm 1980 Dựa nguồn gốc thực phẩm hoạt tính làm tan huyết khối tương đối mạnh, NK có lợi y tế thương mại hóa nhờ tác dụng phòng ngừa hiệu kéo dài, uống thuận tiện ổn định đường tiêu hóa (Sumi et al., 1990) NK tăng cường hoạt hóa plasminogen bất hoạt plasminogen activator inhibitor (Sumi et al, 1987, Urano et al 2001)[52] Các sản phẩm NK ngày bán rộng rãi giới sử dụng thực phẩm chức năng, phản ứng phụ Nguyên liệu để sản xuất NK chủ yếu đậu nành, sử dụng sản phẩm phụ công nghiệp chế biến thực phẩm cám mì, cám gạo, trấu, loại vỏ đậu (đậu xanh, đậu đỏ ), vỏ tôm Công đoạn lên men thực lên men bán rắn lên men chìm, nhiệt độ lên men từ 30-40oC Ngoài chủng Bacillus subtilis phân lập từ Natto, tìm kiếm Việt nam nhiều chủng Bacillus sp khác từ sản phẩm lên men truyền thống đất, nước Việt nam Tất điều kiện đáp ứng Việt nam Với lý thực đề tài : “Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có Natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng” Mục tiêu nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ Natto Nhật Bản xác định số điều kiện tạo chế phẩm protease giàu nattokinase Nội dung nghiên cứu 1) Phân lập mẫu B.subtilis từ Natto Nhật Bản 2) Chọn lọc khả sản xuất protease số mẫu phân lập 3) Xác định số đặc điểm sinh lý, sinh hoá mẫu chọn lọc 4) Phân loại đến loài hai mẫuh Bacillus chọn 5) Xác định số điều kiện lên men sản xuất protease chủng chọn lọc 6) Nghiên cứu số đặc tính protease tinh sơ 55 Ting wei Ku, Ruei –Lan Tsai and Tzu-Ming Pan (2009) “A simple and Cost – Saving Approach ro optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis Natto” J Agric Food Chem 57, pp: 292-296 56 Xiaoyan zu, Zhenya Zhang, et al (2010), “Thrombolytic Activities of Nattokinase Extracted from Bacillus subtilis Fermented Soybean Curd Residues”, International Journal of Biology, 2(2), pp: 120-125 57 Xiaoyan Zu, Zhenya Zhang, Yingnan Yang, Haittao Che, Guihua zhang Ji Li (2010) “Thrombolytic activities of nattokinase extracyed from Bacillus subtilis fermented soybean curd residues” International Journal of Biology 2(2), pp: 120-125 58 Xie Quiling Gao Yong (1999) “The optimization of fermentation condiction of nattokinase” Journal of south China University of Technology (National Science).5 59 Xue Jian, Xue- Li Z, Quuang C Guang W Jun Peng Gao (2005) “Optimization of liquid fermentation condiction of nattokinase” Journal of Jilin Agricultural University 60 Xu X., Skands A.R.H., Hoy C.-E., Mub H., Balchena S and Adler- Nissenna J., 1998 “Prodution of Specific – structured Lipids by Enymatic Interesterification: Elucidation of Acyl Migration by Response Surface Design” Journal of the American Oil Chemists’ Society, vol 75 (9), pp: 1179 – 1186 61 Yeon Kyoung Kim, Sang Mi Kim, Ji Yeon Kim, and Oran Kwon (2011) “The culture filtrates from Bacillus subtilis natto lowers blood pressure via rennin –angiotensin system in spontaneously hypertensive rats fed with a high cholesterol diet” J.Korean Soc appl Biol Chem 54(6), pp: 959-965  Internet 62 http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gif 63 http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecacys.gif 64 http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaasp.gif 65 http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecamet.gif 101 102 103 104 105 106 107 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn Tyrosin Tyrosine (µg) ∆OD (660nm) 10 20 30 40 50 60 70 0,000 0,086 0,181 0,281 0,371 0,465 0,560 0,645 0,780 0.90 y = 0.0094x R² = 0.9980 0.80 0.70 ∆OD 0.60 0.50 Tyrosine 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 80 20 40 60 80 Đường chuẩn Tyrosine (µg) Đồ thị đường chuẩn Tyrosin 108 100 Phụ lục 2: Đường chuẩn Albumin Albumin 50 100 150 200 250 0,000 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 (µg/ml) ∆OD (750nm) 0.18 y = 0.0006x R² = 0.999 0.16 0.14 0.12 ΔOD 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 50 100 150 200 Nồng độ Albumin (μg/ml) Đồ thị đường chuẩn Albumin 109 250 300 Phụ lục 3: Hoạt tính protease 10 mẫu VK tuyển chọn Thời gian 24 40 48 72 Kí hiệu g N 24 N 17 BC N 21 N 32 8.1 N 23 N 18 N441 N36 N 24 N 17 BC N 21 N 32 8.1 N 23 N 18 N441 N36 N 24 N 17 BC N 21 N 32 8.1 N 23 N 18 N441 N36 N 24 N 17 BC N 21 N 32 8,1 N 23 N 18 N441 N36 ΔOD Hoạt độ protease (U/g) Lần Lần Lần Lần Lần Lần T,B Sai số 0,04 0,07 0,11 0,03 0,03 0,10 0,03 0,08 0,08 0,04 0,07 0,07 0,12 0,03 0,03 0,12 0,05 0,15 0,08 0,06 0,07 0,10 0,15 0,06 0,06 0,15 0,07 0,17 0,09 0,08 0,06 0,07 0,12 0,04 0,04 0,08 0,03 0,09 0,08 0,04 0,04 0,07 0,11 0,02 0,03 0,10 0,03 0,09 0,07 0,04 0,07 0,07 0,13 0,03 0,03 0,12 0,05 0,15 0,08 0,06 0,07 0,10 0,15 0,06 0,06 0,15 0,06 0,17 0,09 0,08 0,07 0,07 0,11 0,04 0,04 0,08 0,03 0,09 0,08 0,04 0,04 0,06 0,11 0,03 0,03 0,11 0,03 0,09 0,08 0,04 0,07 0,07 0,12 0,03 0,03 0,12 0,05 0,15 0,08 0,06 0,07 0,10 0,15 0,06 0,05 0,15 0,07 0,18 0,09 0,07 0,06 0,07 0,12 0,04 0,04 0,09 0,03 0,09 0,08 0,05 27,10 41,93 70,96 17,42 18,06 67,09 18,71 52,90 50,97 27,10 42,58 45,16 78,71 18,71 21,93 76,13 32,90 94,83 50,97 37,42 44,51 63,87 97,42 39,35 35,48 98,06 42,58 109,67 59,35 49,03 41,29 42,58 74,19 23,23 24,52 54,19 17,42 58,71 53,55 28,39 25,81 42,58 71,61 14,19 16,13 67,09 20,64 55,48 47,74 27,10 41,93 43,87 80,64 19,35 20,00 76,13 34,19 93,54 50,32 38,06 44,51 63,87 98,06 38,71 37,42 98,71 41,29 109,03 60,00 50,32 41,93 43,87 71,61 23,23 23,87 51,61 16,77 58,71 51,61 28,39 27,10 41,29 72,26 18,71 19,35 67,74 17,42 55,48 52,26 27,10 43,22 45,80 78,71 18,06 21,93 75,48 32,26 95,48 51,61 35,48 45,16 63,87 96,77 40,00 34,19 96,77 43,22 112,90 58,06 47,10 39,35 41,93 74,84 23,23 23,23 55,48 18,71 59,35 54,19 29,03 26,67 41,93 71,61 16,77 17,85 67,31 18,92 54,62 50,32 27,10 42,58 44,94 79,35 18,71 21,29 75,91 33,12 94,62 50,97 36,99 44,73 63,87 97,42 39,35 35,70 97,85 42,36 110,53 59,14 48,82 40,86 42,79 73,55 23,23 23,87 53,76 17,63 58,92 53,12 28,60 0,43 0,37 0,37 1,34 0,94 0,22 0,94 0,86 1,34 0,00 0,37 0,57 0,65 0,37 0,65 0,22 0,57 0,57 0,37 0,78 0,22 0,00 0,37 0,37 0,94 0,57 0,57 1,20 0,57 0,94 0,78 0,57 0,99 0,00 0,37 1,14 0,57 0,22 0,78 0,22 Phụ lục 4: Ảnh hưởng tỉ lệ cám mì bột đậu nành đến khả tổng hợp protease chủng B.subtilis N18 110 Tỉ lệ Δ OD Hoạt độ protease (U/g) cám mì/đậu Lần Lần Lần Lần Lần Lần nành 3 0/10 0,05 0,05 0,05 33,55 32,90 3/7 0,08 0,08 0,08 52,90 4/6 0,10 0,01 0,10 5/5 0,12 0,12 6/4 0,15 7/3 10/0 TB Sai số 34,19 33,55 0,37 52,90 51,61 52,47 0,43 63,87 63,45 61,93 62,69 0,76 0,12 77,42 76,77 80,00 78,06 0,99 0,15 0,15 94,83 95,48 93,54 94,62 0,57 0,23 0,23 0,23 149,67 148,38 150,96 149,67 0,75 0,07 0,07 0,07 46,45 45,80 45,80 46,02 0,22 Phụ lục 5: Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường đến khả tổng hợp protease chủng B.subtilis N18 Δ OD Độ ẩm Hoạt độ protease (U/g) Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 40 0,23 0,23 0,23 149,03 150,96 50 0,27 0,28 0,27 175,48 60 0,28 0,28 0,28 70 0,18 0,18 80 0,09 0,09 (%) TB Sai số 147,74 149,24 0,94 179,35 174,19 176,34 1,55 178,06 177,41 178,70 178,06 0,37 0,18 112,90 112,90 112,90 112,90 0,00 0,09 56,77 55,48 57,42 56,56 0,57 Phụ lục 6: Ảnh hưởng nồng độ nấm men đến khả tổng hợp protease chủng B subtilis N18 Nồng Δ OD Hoạt độ protease (U/g) độ 111 Nấm Lần Lần Lần Lần Lần Lần Men 3 0,29 0,29 0,29 189,67 189,02 0,1 0,30 0,30 0,30 194,19 0,2 0,30 0,30 0,30 0,3 0,19 0,19 0,19 Đối chứng TB Sai số 188,38 189,02 0,37 194,19 194,19 194,19 0,00 195,48 194,19 196,12 195,26 0,57 122,58 123,22 121,29 122,36 0,57 Phụ lục 7: Ảnh hưởng pH đến khả tổng hợp protease chủng B.subtilis N18 Δ OD Hoạt độ protease (U/g) pH Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số 3 0,21 0,21 0,21 137,41 138,06 137,41 137,63 0,22 0,30 0,29 0,30 190,31 189,67 190,96 190,31 0,37 0,34 0,35 0,34 220,64 222,57 219,35 220,85 0,94 0,36 0,36 0,36 230,31 229,02 231,60 230,31 0,75 10 0,30 0,30 0,30 190,31 192,89 192,89 192,03 0,86 11 0,11 0,11 0,11 72,90 72,26 72,90 72,69 0,22 12 0,05 0,05 0,05 33,55 33,55 34,19 33,76 0,22 Phụ lục 8: Ảnh hưởng tỉ lệ giống đến khả tổng hợp protease chủng B.subtilis N18 Δ OD Tỉ lệ MT Hoạt độ protease (U/g) cấy giống Lần Lần Lần (ml) Lần Lần Lần 112 TB Sai số Đối 107 0,32 0,31 0,32 203,22 202,57 203,22 203,00 0,22 108 0,32 0,32 0,32 206,44 207,73 205,15 206,44 0,75 NaCl, 107 0,19 0,19 0,19 122,58 123,22 123,22 123,01 0,22 0,5% 108 0,30 0,30 0,30 194,19 194,19 194,19 194,19 0,00 NaCl 107 0,37 0,37 0,37 239,34 239,34 240,63 239,77 0,43 108 0,38 0,38 0,38 245,15 247,73 243,86 245,58 1,14 chứng 0,5%, 0,2% (YE) Phụ lục 9: Ảnh hưởng Zn2+ k+ đến khả tổng hợp protease chủng B.subtilis N18 Δ OD Vi khoáng Hoạt độ protease (U/g) Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 0,35 0,35 0,35 227,73 225,80 228,38 227,30 0,78 ZnCl2 0,39 0,34 0,39 250,96 249,35 250,31 250,20 0,47 KCl 0,36 0,36 0,36 231,60 232,89 230,31 231,60 0,75 Đối chứng TB Sai số Phụ lục 10 : Hoạt tính protease sản phẩm natto từ hai chủng B.subtilis N18 B.subtilis N441 Δ OD Natto Hoạt độ protease (U/g) Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 N18 ĐN 0,54 0,53 0,54 N18 ĐN - GL 0,47 0,47 N441 ĐN 0,46 N441 ĐN - 0,39 TB Sai số 57,99 57,77 58,10 57,95 0,10 0,47 50,94 51,05 50,94 50,98 0,04 0,46 0,46 49,53 49,64 49,43 49,53 0,06 0,39 0,40 42,60 42,27 42,81 42,56 0,16 113 GL N18 & N441 ĐN N18 & N441 ĐN -GL Natto Nhật Bản 0,51 0,51 0,51 55,60 55,50 55,71 55,60 0,06 0,46 0,46 0,46 49,32 49,32 49,32 49,32 0,00 0,54 0,54 0,53 58,21 58,42 57,88 58,17 0,16 Phụ lục 11: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease CPE Δ OD Hoạt độ CPE (U/g) pH Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 0,11 0,11 0,11 1224,80 1224,80 1213,96 1221,18 3,61 0,26 0,26 0,26 2774,76 2785,60 2774,76 2778,37 3,61 0,38 0,38 0,38 4064,59 4075,43 4075,43 4071,81 3,61 0,32 0,32 0,32 3511,80 3490,13 3490,13 3497,35 7,23 10 0,30 0,30 0,29 3208,31 3197,48 3186,64 3197,48 6,26 11 0,18 0,17 0,18 1875,13 1885,97 1875,13 1878,74 3,61 TB Sai số Phụ lục 12, Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính protease CPE Δ OD Nhiệt độ Hoạt độ protease (U/g) Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 25 0,30 0,30 0,29 3208,31 3197,48 30 0,30 0,30 0,31 3284,19 35 0,34 0,34 0,34 40 0,38 0,38 45 0,37 50 TB Sai số 3186,64 3197,48 6,26 3295,03 3305,87 3295,03 6,26 3652,71 3652,71 3663,55 3656,32 3,61 0,38 4064,59 4086,27 4086,27 4079,04 7,23 0,37 0,37 3999,55 3999,55 3967,04 3988,72 10,84 0,35 0,35 0,36 3836,97 3836,97 3858,65 3844,20 7,23 55 0,30 0,30 0,30 3208,31 3229,99 3240,83 3226,38 9,56 60 0,28 0,28 0,28 2991,54 3002,38 3002,38 2998,76 3,61 (0C) 114 Phụ lục 13: Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính protease CPE Δ OD Nồng Hoạt độ protease (U/g) độ chất Lần Lần Lần Lần Lần Lần (%) 3 0,5 0,13 0,13 0,13 1430,74 1419,90 1452,41 1434,35 9,56 1,0 0,32 0,32 0,32 3468,45 3479,29 3500,97 3482,90 9,56 1,5 0,40 0,40 0,40 4346,40 4335,56 4324,72 4335,56 2,0 0,39 0,39 0,39 4238,01 4248,85 4259,69 4248,85 6,26 2,5 0,39 0,39 0,39 4205,49 4216,33 4216,33 4212,72 3,61 3,0 0,39 0,39 0,39 4194,65 4205,49 4216,33 4205,49 6,26 115 TB Sai số 6,26 [...]... hạt đậu lên men (Bacillus subtilis Natto) cũng như vi khuẩn tạo chất nhờn rất dẻo dai (Bacillus mesentericus) tạo vị ngọt Trong những năm 1920, các nhà nghiên cứu đã tìm ra cách sản xuất Natto từ môi trường có chứa B subtilis Natto thay vì lên men đậu nành 27 Sumi et al.,(1987)[52] TS Hiroyuki Sumi đã nghiên cứu các enzyme thủy phân huyết khối, tìm kiếm các loại thực phẩm tự nhiên có khả nằng hòa tan... phomat Trong sản xuất phomat người ta cố gắng tìm những chủng VSV tạo ra được protease có tính chất giống rennin hoặc thay thế một phần rennin (25 – 50%) bằng protease của VSV Ở Nhật, từ canh trường bề mặt Mucor, người ta có thể thu được chế phẩm protease dùng trong sản xuất phomat Ở một số nước khác, người ta cũng thu được chế phẩm tương tự nấm mốc Asp.candidus 11 hoặc từ Bacillus mesentericus * Trong. .. động sẽ có 4 cơ chế xúc tác khác nhau như sau: 13 Hình 1.2 Cơ chế xúc tác của Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của Serine - protease [62] Cystein – protease[ 63] 14 Hình 1.4 Cơ chế xúc tác của Hình 1.5 Cơ chế xúc tác của Aspartic – protease[ 64] Metallo – protease[ 65] * Cơ chế phản ứng của nhóm serine protease Serine protease có chung nhóm phân loại (EC 3.4.21), là một trong số các enzyme được nghiên cứu khá... tính Nattokinase đạt được 78.71 đơn vị/ml Ruei - Lin Hsu et al., (2009) [48] đã nghiên cứu protein có dạng amyloid in vivo có liên quan đến nhiều bệnh như bệnh Alzhemer, bệnh bò điên (prion) Tác giả thấy rằng Nattokinase có khả năng phân giải amyloid Các serine protease như Subtilisin có khả năng phân giải amyloid, khả năng này cũng thấy có ở Protease K, Subtilisin Carlsberg nhưng không thấy có ở Trypsin... * Trong công nghiệp y dược Trong công nghiệp y dược, các chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các MT dinh dưỡng hỗn hợp có proten dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các VSV khác Ngoài ra người ta còn thường dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc tố để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch) Chế phẩm protease thuần khiết được sử dụng trong y học để loại bỏ các tổ chức. .. Xie et al., (1999) [58] đã trích ly Nattokinase từ Natto - loại thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản và thấy có hoạt tính thủy phân mạnh fibrin Họ cũng đã phân lập chủng vi khuẩn từ Natto và xác định điều kiện sinh Nattokinase trong môi trường dịch thể có pH 7, nguồn carbon là xylose 2%, nguồn nitơ là protein đậu nành 3%, giống 2% trong 24 giờ, lên men trong bình tam giác 100ml chứa 10 ml môi... USD 16 Trong đó các enzyme thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất, chiếm 59% lượng enzyme được ứng dụng Đặc biệt là enzyme protease kiềm được ứng dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn so với các loại enzyme khác Ngoài ra protease còn được ứng dụng trong các lĩnh vực: * Trong công nghiệp thịt Có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm mềm thịt Ngoài papain có thể dùng chế phẩm protease. .. bảo vệ hệ thần kinh trung ương của Nattokinase thì còn chưa rõ, vì vậy cần nghiên cứu tiếp cơ chế bảo vệ hệ thần kinh của Nattokinase Lê thị Bích Phượng vctv., (2012) đã chọn lọc được hai chủng Bacillus 7.2 và Bacillus NP3 có khả năng sinh tổng hợp mạnh enyme (nattokinase) làm tan huyết khối [12] 29 Qua các công trình nghiên cứu có thể chứng minh rằng, NK có tiềm năng làm tan huyết khối mạnh mẽ 1.2... aprotinin, chymostatin - Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực nhất là nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng của nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác 1.1.2 Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease 1.1.2.1 Cơ chế phản ứng của protease Việc thủy phân protease là một tiến... giết mổ Thịt sau khi làm mềm có thể biến thành các thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao * Trong công nghiệp sữa Protease không những có khả năng phân giải protein mà còn có khả năng làm đông tụ sữa Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng đó Tuy nhiên, tất cả các protease của VSV đều khác với rennin động vật ở chỗ chúng không những làm đông tụ được sữa mà còn có thể thủy phân sâu casein, ... Với lý thực đề tài : Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có Natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng Mục tiêu nghiên cứu Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ Natto Nhật Bản xác... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Bùi Thị Nhung NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành... 3.5.1 Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto Nhật Bản 82 3.5.2 Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase MT lên men bán rắn 86 3.5.3 Tạo chế phẩm protease