BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH - - Nguyễn Thiện Phú NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH - - Nguyễn Thiện Phú NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN THANH THỦY Thành Phố Hồ Chí Minh - 2013 LỜI CẢM ƠN  Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ động viên suốt trình tiến hành đề tài  Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh hết lòng dạy dỗ  Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Hữu Phúc, TS Võ Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới), cô Tâm, chị Trang, anh Nghĩa (Công ty Vipesco) hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành đề tài  Tôi xin cảm ơn chị Trần Thị Minh Định, chị Phùng Ngọc Thùy Linh, chị Hồ Thị Mỹ Linh, bạn Phạm Thị Lịch nhiệt tình giúp đỡ động viên  Tôi xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh, động viên ủng hộ Nguyễn Thiện Phú LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Tác giả luận văn Nguyễn Thiện Phú MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Mục tiêu Nhiệm vụ Đối tượng nghiên cứu Ý nghĩa đề tài Thời gian địa điểm nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược RNM Cần Giờ 1.2 Tổng quan Bt 12 1.2.1 Lịch sử phát Bt 12 1.2.2 Đặc điểm phân loại 13 1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa Bt 16 1.2.4 Độc tố chế gây độc 17 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng, hình thành bào tử, tinh thể độc 21 1.2.6 Đối tượng tác động Bt 22 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng Bt 24 1.3.1 Các nghiên cứu nước 24 1.3.2 Các nghiên cứu nước 26 1.3.3 Các hướng phát triển thuốc trừ sâu Bt 27 1.4 Phương pháp sản xuất chế phẩm Bt 28 1.4.1 Tuyển chọn chủng 28 1.4.2 Lên men chìm 29 1.4.3 Thu hồi sản phẩm 30 1.4.4 Tạo chế phẩm 30 1.4.5 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu 32 2.1.1 Đối tượng 32 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 32 2.1.4 Các môi trường nghiên cứu sử dụng 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt 33 2.2.2 Phương pháp bảo quản giống dầu khoáng 34 2.2.3 Định danh đến loài chủng Bacillus sinh học phân tử 34 2.2.4 Phương pháp nhân giống 35 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, BT, tinh thể Bt 36 2.2.6 Phương pháp xác định số lượng BT, tinh thể độc 37 2.2.7 Định lượng mật độ TB phương pháp đo mật độ quang 37 2.2.8 Phương pháp nuôi nhân giống sâu tơ 38 2.2.9 Phương pháp thử hoạt tính diệt sâu 39 2.2.10 Khảo sát ảnh hưởng Mg2+ Mn2+ đến khả sinh trưởng hình thành tinh thể độc 40 2.2.11 Phương pháp kiểm tra diện gen sinh nội độc tố Bt 41 2.2.12 Phương pháp tạo chế phẩm Bt 43 2.2.13 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 44 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng VK Bacillus từ đất RNM Cần Giờ 44 3.2 Khảo sát hoạt tính diệt sâu chủng VK có tinh thể độc 49 3.2.1 Kết xác định số lượng BT, tinh thể 50 3.2.2 Kết hoạt lực diệt sâu 51 3.3 Định danh sinh học phân tử chủng P14 54 3.4 Đặc điểm sinh học chủng tuyển chọn 54 3.5 Khảo sát ảnh hưởng Mg2+ Mn2+ đến khả sinh trưởng hình thành bào tử, tinh thể độc 56 3.5.1 Kết khảo sát ảnh hưởng Mg2+ đến khả sinh trưởng hình thành bào tử, tinh thể độc 56 3.5.2 Kết khảo sát ảnh hưởng Mn2+ đến khả sinh trưởng hình thành BT, tinh thể độc 58 3.6 Bước đầu khảo sát so sánh khả sinh trưởng sinh tinh thể độc chủng Btk14 phân lập từ RNM Cần Giờ từ chế phẩm trừ sâu Đài Loan 60 3.6.1 So sánh khả sinh trưởng, sinh tinh thể độc 60 3.6.2 So sánh hoạt tính diệt sâu 62 3.7 Kết kiểm tra diện gen sinh nội độc tố Btk14 64 3.8 Tạo chế phẩm thử nghiệm hoạt tính chế phẩm 66 3.9 Kiểm tra khả sống sót chủng Btk14 chế phẩm 68 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 Kết luận 70 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 78 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BT Bào tử Bt Bacillus thuringiensis Btk Bacillus thuringiensis var kurstaki CFU Colony forming unit (Số đơn vị khuẩn lạc) kDa kiloDalton KHV Kính hiển vi KL Khuẩn lạc NXB Nhà xuất OD Mật độ quang PBS Dung dịch đệm RNM Rừng ngập mặn TB Tế bào VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Sinh vật hại trồng nguyên nhân lớn làm giảm suất, gây thiệt hại nặng nề cho ngành nông nghiệp Trung bình năm lượng nông sản bị mát sinh vật hại khoảng 22% (Khan, 2008) Vì vậy, việc tiêu diệt chúng trở nên vô cấp thiết Trong giai đoạn đầu, thuốc hóa học bảo vệ thực vật sử dụng rộng rãi có nhiều ưu điểm trội Tuy nhiên, thuốc hóa học có nhiều nhược điểm gây tác dụng không nhỏ với môi trường sức khỏe người, gây cân sinh thái tạo nên tượng kháng thuốc sinh vật hại Vì vậy, việc tạo thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học (từ VSV), khắc phục nhược điểm thuốc hóa học, tạo nên bước tiến công tác bảo vệ thực vật Các sinh vật như: virus, VK, nấm, tuyến trùng… ứng dụng rộng rãi để hạn chế tác hại sinh vật hại trồng Trong số hàng loạt VK có khả tiêu diệt sâu hại, Bt tác nhân sinh học nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu vi sinh giới, đồng thời sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học tiếng RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú, độ đa dạng sinh học đánh giá cao khu vực Đông Nam Á Ngoài hệ động thực vật, rừng ngập mặn Cần Giờ chứa đựng tài nguyên sinh vật khác – thành phần khu hệ VSV nơi Các chủng VSV phân lập từ RNM ứng dụng nhiều lĩnh vực, đặc biệt nông nghiệp, nhờ khả sinh chất có hoạt tính sinh học cao Trong năm gần đây, nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu hệ sinh thái RNM phát đất nơi có Bt có khả diệt sâu Từ lí trên, định chọn đề tài: “Nghiên cứu chọn chủng Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu” Mục tiêu - Thu nhận chủng Bt có hoạt lực mạnh diệt sâu hại trồng làm sở khoa học việc tạo chế phẩm Nhiệm vụ Phân lập chủng Bacillus từ RNM Cần Giờ Tuyển chọn chủng VK có hoạt tính diệt sâu tơ hại bắp cải Phân loại chủng VK tuyển chọn đến loài sinh học phân tử Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng Bt tuyển chọn Khảo sát khả sinh trưởng, sinh tinh thể độc chủng Bt nghiên cứu so sánh với chủng phân lập từ chế phẩm nước Kiểm tra diện gen sinh độc tố chủng Bt nghiên cứu Bước đầu tạo chế phẩm diệt sâu thử nghiệm hoạt tính chế phẩm Đối tượng nghiên cứu - Các chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ - Chủng Bt phân lập từ chế phẩm trừ sâu Đài Loan - Sâu tơ hại bắp cải nhận từ Công ty thuốc sát trùng Việt Nam - Vipesco Ý nghĩa đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học Góp phần tìm hiểu khả diệt sâu tơ gây hại bắp cải Bt RNM Cần Giờ 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Dựa vào kết thu đề tài ứng dụng tạo chế phẩm để phòng trừ sâu tơ hại bắp cải Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013 - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh Kết tra cứu BLAST SEARCH Bacillus thuringiensis serovar kurstaki, complete genome Sequence ID: gb|CP004069.1|Length: 5646799Number of Matches: 12 Related Information Range 1: 82289 to 82811GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 961 bits(520) 0.0 523/524(99%) 1/524(0%) Plus/Plus Features: rRNA-16S ribosomal RNA Query TGGAGAGTTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTC 60 ||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82289 TGGAGAG-TTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTC 82347 Query 61 GAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82348 GAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT 82407 Query 121 GGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82408 GGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACA 82467 Query 181 TTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCC 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82468 TTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCC 82527 Query 241 GCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82528 GCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACC 81 82587 Query 301 TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82588 TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC 82647 Query 361 AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82648 AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA 82707 Query 421 GGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82708 GGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGG Query 481 CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC 82767 524 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 82768 CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC KẾT LUẬN 82811 Bacillus thuringiensis var kurstaki TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 03 năm 2013 TRƯỞNG PHÒNG 82 Phụ lục 3: Xử lý thống kê số liệu thí nghiệm Thí nghiệm 1: Xác định số lượng bào tử, tinh thể chủng P3, P14, P19, P28 • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 83 Thí nghiệm 2: Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu chủng P3, P14, P19, P28 Ở mốc thời gian 24 h • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 84 Ở mốc thời gian 48 h • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 85 Ở mốc thời gian 72 h • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 86 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng Mg2+ đến khả sinh trưởng chủng Btk14 • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 87 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng Mg2+ đến khả sinh bào tử, tinh thể độc chủng Btk14 • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 88 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng Mn2+ đến khả sinh trưởng chủng Btk14 • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 89 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng Mn2+ đến khả sinh bào tử, tinh thể độc chủng Btk14 • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 90 Thí nghiệm 7: So sánh khả sinh trưởng chủng Btk14 chủng phân lập từ chế phẩm Baolus • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 91 Thí nghiệm 8: So sánh khả sinh bào tử, tinh thể độc chủng Btk14 chủng phân lập từ chế phẩm Baolus • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 92 Thí nghiệm 9: So sánh hoạt lực diệt sâu chủng Btk14 chủng phân lập từ chế phẩm Baolus Ở mốc thời gian 24 h • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 93 Ở mốc thời gian 48 h • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 94 Ở mốc thời gian 72 h • Xử lý Excel • Xử lý phần mềm Stagraphic 3.0 95 [...]... Kết quả đã phân lập được 36 chủng Bt, trong đó có 11 chủng có tinh thể hình quả trám, 6 chủng có tinh thể hình vuông và hình chữ nhật, 10 chủng có khối lập phương, 4 chủng có tinh thể không đều đặn, 2 chủng có tinh thể hình cầu, 3 chủng có dạng thể vùi nhỏ Tất cả 10 chủng Btk đều mang gen cry1Ab Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu thì cả 10 chủng có hiệu quả diệt 100% đối với sâu ngài gạo.[13], [14], [15]... RNM Cần Giờ (TP.HCM), các nhà khoa học đã phát hiện những chủng Bt sinh nhiều tinh thể có khả năng diệt trừ đặc hiệu một số loài côn trùng gây hại cho người và động, thực vật như các loài sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi… Nhiều nghiên cứu đã chứng minh độc lực của chủng Bt phân lập từ RNM Cần Giờ là rất cao với ấu trùng sâu và muỗi [59] Như vậy, việc nghiên cứu các chủng VSV trong đó có VK từ. .. pháp lên men chìm [24], [30] 1.4.1 Tuyển chọn chủng Tùy thuộc vào đối tượng sâu hại phòng trừ mà nhà sản xuất sử dụng các chủng khác nhau để lên men Có 2 cách để tuyển chọn chủng:  Nhà sản xuất có thể chọn chủng tự nhiên có độc lực cao phân lập từ đất bởi vì trong tự nhiên Bt phân bố rất rộng rãi Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng nên... sinh học của sâu tơ Sâu có 4 tuổi, phát triển từ 7 - 15 ngày tùy điều kiện thức ăn và thời tiết Mình sâu nở to chính giữa, hai đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng, mỗi đốt có nhiều lông mọc thẳng đứng Sâu có ba cặp chân giả từ đốt bụng thứ năm, mình sâu dài từ 8 - 11 mm Chi tiết ở từng giai đoạn tuổi như sau: • Tuổi 1: thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2 - 1,5... tháng 4, nước mặn chiếm ưu thế hơn trong mối tương tác sông – biển, nước mặn xâm nhập sâu hơn vào trong vùng đất liền [56] RNM Cần Giờ có hệ sinh thái đa dạng phong phú Tuy nhiên, những nghiên cứu về RNM Cần Giờ chủ yếu tập trung vào hệ động, thực vật VSV là đối tượng phân bố rộng rãi và được xem là “kho báu” của hệ sinh thái RNM Cần Giờ nhưng chỉ mới được quan tâm gần đây Những nghiên cứu về vi sinh... 1956, Hannay, Fitz - James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ra tác nhân chính quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân tử protein, được sản sinh trong cơ thể Bt Những kết quả nghiên cứu trên đã mở ra cho các nhà khoa học hướng nghiên cứu mới về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của Bt Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu được sử dụng rộng rãi... Nam, RNM Cần Giờ có độ đa dạng sinh học được đánh giá cao ở khu vực Đông Nam Á RNM Cần Giờ được phát triển dựa trên sự lắng đọng và bồi tụ 9 phù sa từ sông Sài Gòn, hạ lưu là sông Lòng Tàu, Ngã Bảy, sông Đồng Tranh và Soài Rạp, nằm ở cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh RNM Cần Giờ có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha với đặc điểm tự nhiên như sau: • Khí hậu: có hai mùa, mùa mưa từ tháng... dài từ 1,2 - 1,5 mm Tuổi 1 phát triển từ 2 - 4 ngày • Tuổi 2: mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục Sâu dài từ 1,5 3,5 mm Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1 - 3 ngày • Tuổi 3: mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5 - 5,5 mm và phát triển từ 1 - 3 ngày • Tuổi 4: sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5 - 9 mm, phát triển từ 1 4 ngày Ấu trùng tuổi 4 sau khi... nhất và nâng cao hiệu quả diệt sâu của chế phẩm Bt.[47] Chủng Bt 234 được chứng minh là tiêu diệt ấu trùng sâu đục thân mía Eldana saccharina Walker hiệu quả hơn chủng Btk có trong chế phẩm Thuricide Black và cộng sự (1991) đã tiến hành lên men trong 6 loại môi trường khác nhau nhằm xác định môi trường thích hợp nhất cho việc thu sinh khối và đánh giá hoạt tính diệt sâu của chủng này Kết quả cho thấy... đề tài Nghiên cứu và tìm hiểu đặc điểm của chủng Bt phân lập từ đất ở Syria và thử nghiệm hoạt tính trên một số côn trùng gây hại” P Kannan, R Xavier và cộng sự (2012) đã tìm hiểu về sự xuất hiện của Bt trên vùng trồng lúa thâm canh tại Malaysia [49] 25 1.3.2 Các nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam Bt đã được nghiên cứu từ những năm 70, chủ yếu là ở lĩnh vực tạo chế phẩm sinh học Nghiên cứu đầu tiên được ... tâm Nghiên cứu hệ sinh thái RNM phát đất nơi có Bt có khả diệt sâu Từ lí trên, định chọn đề tài: Nghiên cứu chọn chủng Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu ... HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH - - Nguyễn Thiện Phú NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ HOẠT TÍNH DIỆT SÂU Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 01 07 LUẬN... tiêu - Thu nhận chủng Bt có hoạt lực mạnh diệt sâu hại trồng làm sở khoa học việc tạo chế phẩm Nhiệm vụ Phân lập chủng Bacillus từ RNM Cần Giờ Tuyển chọn chủng VK có hoạt tính diệt sâu tơ hại bắp