BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Hồng Dỗn Cảnh KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN BỆNH PHẨM TẠI VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH TỪ THÁNG 01- 06/2014 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC \ Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Hồng Dỗn Cảnh KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN BỆNH PHẨM TẠI VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH TỪ THÁNG 01- 06/2014 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS.BS CAO HỮU NGHĨA Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành với giúp đỡ tận tình q Thầy cơ, Anh Chị, bạn Xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến: TS.BS CAO HỮU NGHĨA – người trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực luận văn Ban Giám Hiệu trường ĐHSP q thầy trường ĐHSP Thành phố Hồ Chí Minh tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi cho việc học tập nghiên cứu Ban Giám đốc Viện Pasteur TP.HCM tạo điều kiện thuận lợi để thực khóa luận tốt nghiệp Chị Lê Vũ Ngọc Lan, Anh ng Nguyễn Đức Ninh, Cơ, Anh Chị phịng Vi sinh Bệnh Phẩm khoa LAM, viện Pasteur TP.Hồ Chí Minh tận tình dạy bảo tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Các bạn sinh viên thực tập bạn lớp giúp đỡ tôi, chia động viên suốt thời gian qua Gia đình ln điểm tựa vững chắc, nguồn động viên khích lệ to lớn cho tơi suốt thời gian học tập Tác giả MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài 10 Nhiệm vụ đề tài 10 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 11 Thời gian, địa điểm thực đề tài 11 Chương 1: TỔNG QUAN 12 1.1 Một số nét vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 12 1.1.1 Đặc tính phân loại 12 1.1.2 Độc lực khả gây bệnh 16 1.2 Nhiễm trùng bệnh viện 18 1.2.1 Khái niệm nhiễm trùng bệnh viện 18 1.2.2 Các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện 18 1.2.3 Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng bệnh viện 19 1.3 Kháng sinh 19 1.3.1 Khái niệm 19 1.3.2 Phân loại 19 1.3.3 Kháng sinh Carbapenem enzyme carbapenemase 22 1.3.4 Cơ chế tác động kháng sinh 26 1.3.5 Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 29 1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa giới nước 37 1.4.1 Trong nước 37 1.4.2 Trên giới 39 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 43 2.2 Đối tượng nghiên cứu 43 2.2.1 Đối tượng 43 2.2.2 Cỡ mẫu 43 2.3 Phương pháp nghiên cứu 43 2.3.1 Vật liệu 43 2.3.2 Phương pháp thực 47 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 66 3.1 Đặc tính bệnh nhân 66 3.1.1 Đặc tính bệnh nhân nhiễm Pseudomonas aeruginosa theo giới tính 66 3.1.2 Đặc tính bệnh nhân nhiễm Pseudomonas aeruginosa theo độ tuổi 67 3.2 Sự phân bố Pseudomonas aeruginosa bệnh phẩm 69 3.3 Khảo sát mức độ kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa 71 3.4 Các chủng sản xuất carbapenemase sàng lọc nhanh theo phương pháp Hodge test 75 3.5 Một số gene mã hóa enzyme carbapenemase phát Pseudomonas aeruginosa 77 3.5.1 Gene blaVIM2 79 3.5.2 Gene blaSIM1 81 3.5.3 Gene blaNDN1 83 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85 Kết luận 85 1.1 Đặc tính mẫu 85 1.2 Mức độ kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa 85 1.3 Khả sản xuất enzyem carbapenemase Pseudomonas aeruginosa 86 1.4 Phát gene mã hóa cho khả sản xuất enzyme carbapenemase Pseudomonas aeruginosa 86 Kiến nghị 86 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC 97 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADH Arginine dehydrolase AM Ampicillin (10µg) AN Amikacin (30µg) ATM Aztreonam (30µg) ATP Adenosin triphosphat BCP Môi trường Bromocresol Purple BHI Môi trường Brain Heart Infusion CA Mơi trường Chocolate agar CAZ Ceftazidime (30µg) CDC The centers Disease Control and Prevention - Trung tâm kiểm sốt ngăn ngừa dịch bệnh CFP Cefoperazone (30µg) CFU Colony-forming unit - đơn vị tạo khuẩn lạc CFS Cefsulodin (30µg) CIP Ciprofloxacin (5µg) CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute - Viện tiêu chuẩn thí nghiệm lâm sang CO Môi trường Columbia agar + 5% máu cừu CS Colistin (10µg) ETA Exotoxin A FEP Cefepime (30µg) FOS Fosfomycin (50µg) DNT Dịch não tủy GM Gentamicin HAIs Healh care-associated infections – Nhiễm trùng bệnh viện I Intermediate –Trung gian IMP Imipenem (10µg) LDC Lysine decarboxylase LPS Lipopolysaccharide MBL Metallo-beta-lactamase MH Môi trường Mueller Hinton agar NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện NT Nước tiểu NST Nhiễm sắc thể ODC Ornithine decarboxylase PABA Acid para-amino-bezoic PBPs Penicillin-binding protein PCR Polymerase chain reaction-phản ứng khuếch đại chuỗi PIP Piperacillin (10µg) R Resistant – kháng S Susceptible – nhạy cảm SSS Sulfamides (200µg) TBE Tris-acetic base EDTA TCC Ticarcillin/clavulanic acid (75/10µg) TE Tetracycline (30µg) TE Tris-HCl-EDTA TM Tobramycin(10µg) TSA Mơi trường Trypticase soy agar DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số thử nghiệm sinh hóa định danh P aeruginosa .6 Bảng1.2 Lớp, phụ lớp kháng sinh thuộc nhóm β-lactams 12 Bảng 1.3 Lớp, phụ lớp kháng sinh thuộc nhóm Non β-lactams 13 Bảng 2.1 Các kháng sinh sử dụng thử nghiệm kháng sinh đồ 38 Bảng 2.2 Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm .43 Bảng 2.3 Trình tự primer, gene mục tiêu chiều dài gene mục tiêu 55 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 56 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt cho cặp primer .56 Bảng 3.1 Tỉ lệ bệnh nhân nhiễm P aeruginosa theo độ tuổi 59 Bảng 3.2 Tỉ lệ P aeruginosa phân lập từ mẫu bệnh phẩm 61 Bảng 3.3 Kết kháng sinh đồ P aeruginosa theo phương pháp Kirby – Bauer 63 Bảng 3.4 Tỉ lệ kháng kháng sinh P aeruginosa theo nghiên cứu số tác giả 65 Bảng 3.5 Kết PCR phát gene mã hóa cho enzyme carbapenemase… 69 Bảng 3.6 Đối chiếu kết Hodge test với kết PCR với chủng dương tính .70 đoán đặt trước chết, bác sĩ thiết lập điều trị kháng sinh thích hợp Và có dấu hiệu đây: - Dịch não tủy: bạch cầu tăng, tăng protein hay giảm đường huyết - Tìm thấy vi khuẩn phết nhuộm Gram dịch não tủy - Cấy máu dương tính - Test kháng nguyên dương tính dịch não tủy, máu nước tiểu - Tăng IgM tăng IgG 1.5 Nhiễm trùng da mô mềm a Nhiễm trùng da Phải thỏa mãn tiêu chuẩn sau: Tiêu chuẩn 1: Chảy mủ, mủ mụn bong mủ Tiêu chuẩn 2: Có hai số dấu hiệu triệu chứng mà không tìm ngun nhân khác: Đau, sưng, đỏ, nóng chỗ Và có dấu hiếu sau đây: - Phân lập tác nhân gây bệnh từ dịch hút dịch dẫn lưu từ nơi tổn thương; vi khuẩn thường trú da, phải đảm bảo không tạp nhiễm cấy - Cấy máu dương tính - Test kháng nguyên dương tính máu mơ tổn thương - Tìm thấy tế bào khổn lồ đa nhân qua soi kính hiển vi mô tổn thương - Tăng IgM lần IgG b Nhiễm trùng mô mềm (Viêm màng cân hoại tử, hoại tử nhiễm trùng, viêm mô tế bào hoại tử, viêm nhiễm trùng, viêm hạch bạch huyết, viêm ống bạch huyết) Phải đáp ứng tiêu chuẩn sau: 104 Tiêu chuẩn 1: Phân lập tác nhân gây bệnh từ mô dịch dẫn lưu vùng tổn thương Tiêu chuẩn 2: Chảy mủ từ vùng tổn thương Tiêu chuẩn 3: Hình ảnh abces chứng nhiễm khuẩn khác thấy qua phẫu thuật xét nghiệm mô học Tiêu chuẩn 4: Có số dấu hiệu triệu chứng mà khơng tìm ngun nhân: Sưng, nóng, đỏ, đau Và có điều kiện đây: - Cấy máu dương tính - Test kháng nguyên dương tính máu hay nước tiểu - Tăng IgM lần IgG 105 PHỤ LỤC Hướng dẫn đọc kết API 20E http://www2.fiu.edu/~makemson/MCB3020Lab/API20eInstructions.pdf Test Thành phần hoạt động Phản ứng/enzyme Kết Âm tính OPNG 2-Nitrophenyl- Β-galactosidase βDgalactopyranoside NitroPhenyl- (Ortho Khơng màu Dương tính Màu vàng (1) βDGalactopyranosidase ADH L-arginine Aginine DiHydrolase Vàng Đỏ/vàng cam (2) LDC L-Lysine Lysine Decarboxylase Vàng Đỏ/vàng cam(2) ODC L-ornithine Orthinine DeCarboxylase Vàng Đỏ/vàng cam(2) CIT Trisodium citrate CITrate utilization Xanh Xanh da nhạt/vàng trời-Xanh (3) H2S Sodium thiosulfate H2S production Không màu/ Đen xám nhạt lắng đọng đường mỏng URE Urea URease Vàng Đỏ/vàng cam (2) TDA L-Tryptophane Tryptophane DeAminase TDA/ngay Vàng IND L-Tryptophane INDole production 106 Nâu đỏ Thuốc thử Kovac’s/ nhay Không màu Hồng Xanh nhạt/Vàng VP GEI Sodium pyruvate Gelatin (bovine origin) Aetoin production (Voges VP1 + VP2/10 phút Proskauer) Không màu Hồng/đỏ (5) GELatinase Không Chất khuếch tán đen khuếch màu tán GLU D-glucose Lên men/ôxi (GLUcose)(4) hóa Xanh da Vàng/ xám trời- xanh vàng MAN D-mannitol Lên men/ơxi (MANnitol)(4) hóa Xanh da Vàng/ xám trời- xanh vàng INO inositol Lên men/ôxi (INOsitol)(4) hóa Xanh da Vàng trời- xanh SOR D-sorbitol Lên men/ơxi (SORbitol)(4) hóa Xanh da Vàng trời- xanh RHA L-rhamnose Lên men/ơxi (RHAmnose)(4) hóa Xanh da Vàng trời- xanh SAC D-sucrose Lên men/ôxi (SACcharose)(4) 107 hóa Xanh da Vàng trời- xanh MEL D-melibiose Lên men/ơxi (MELibiose)(4) hóa Xanh da Vàng trời- xanh AMY amygdalin Lên men/ơxi (AMYgdalin)(4) hóa Xanh da Vàng trời- xanh ARA L-arabinose Lên men/ơxi (ARAbinose)(4) hóa Xanh da Vàng trời- xanh (1) Màu vàng nhạt nên xem dương tính (2) Màu vàng cam sau 36-48h ủ phải xem âm (3) Đọc kết phần hiếu khí (4) Lên men bắt đầu phần tube, oxi hóa bắt đầu phần hiếu khí (5) Màu hồng nhẹ sau 10 phút nên xem âm tính 108 Hướng dẫn đọc kết API 20NE Test Thành phần hoạt động Phản ứng/enzyme Kết Âm tính NO3 Potassium nitrate Reduction of nitrates to Dương tính NIT + NIT / phút nitrites Không màu TRP L-Tryptophane Hồng-đỏ Reduction of nitrates to Zn / phút nitrites Hồng Indole production JAMES / immediate (TRyptoPhane) Không màu, Không màu Hồng xanh cây/vàng GLU D-Glucose Fermentation Xanh da trời- (GLUcose) xanh Vàng ADH L-Arginine Arginine DiHydrolase Vàng Cam/hồng/đỏ URE Urea UREase Vàng Cam/hồng/đỏ ESC Esculin Hydrolysis (β- Vàng Xám/nâu/ đen ferric citrate glucosidase) (ESCulin) Gelatin Hydrolysis (protease) Khơng có màu Màu đen (bovine origin) (GELatin) khuếch tán khuếch tán 4-Nitrophenyl-β-D - β-Galactosidase (Para- Khơng màu Vang Galactopyranoside NitroPhenyl-ß GEL PNPG DGalactopyranosidase) GLU D-Glucose Assimilation (GLUcose) Trong suốt Đục ARA L-Arabinose Assimilation Đục 109 Trong suốt (ARAbinose) Trong suốt Đục Trong suốt Đục N-Acetyl- Assimilation (N-Acetyl- Trong suốt Đục glucosamine Glucosamine) MAL D-Maltose D-maltose Trong suốt Đục GNT Potassium gluconate Assimilation (potassium Trong suốt Đục MNE D-Mannose Assimilation (ManNosE) MAN D-Mannitol Assimilation (MANnitol) NAG GlucoNate) CAP Capric acid Assimilation (CAPric Trong suốt Đục Trong suốt Đục acid) ADI Adipic acid Assimilation (ADIpic acid) MLT Malic acid Assimilation (MaLaTe) Trong suốt Đục CIT Trisodium citrate Trisodium citrate Trong suốt Đục PAC Phenylacetic acid Assimilation Trong suốt Đục (PhenylACetic acid) OX Cytochrome oxidase Quan sát kết oxidase bổ xung thêm 110 PHỤ LỤC Kết kháng sinh đồ STT MÃ SỐ 131 GIỚI TUỔI KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ BỆNH PHẨM NT - AN ATM CFP CFS CIP CS PEP FOS GM IPM PIP SSS TCC TM Nam 79 R S 14 Nam 13 ĐÀM S S S I S S S S S S S S S S 473 Nam 45 ĐÀM R R R R R S R R R R R R R R 426 Nam 38 ĐÀM S S S S S S S S S S S S S S 683 Nữ 80 MỦ S S I S S S S S S S S S S S 793 Nữ 68 MỦ R R R R R R R R R R R R R R 488 Nam 31 ĐÀM S R R R R S R S R R R R R R 359 Nam 58 MỦ S S S S S S S S S S S R S S 919 Nữ 87 MỦ R I R R R S R S R R R R R R ĐÀM R 111 S R 10 405 Nam 47 DNT S 11 287 Nữ 26 MỦ S 12 185 Nam 12 MỦ S I S 13 13 Nữ 65 NT S S 14 836 Nam 44 MỦ R 15 527 Nam MỦ 16 353 Nữ 32 17 904 Nam 18 58 19 R R R S S S R R S S S S S S S S I S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S S R R R S S R R R S I R R R I S R R R S S S R R R R R R MỦ S S S S S S S S S S S S S S 72 ĐÀM R R R R N S R S R R R R R R Nam 38 ĐÀM R R R R R S R R R R R R R R 342 Nữ 53 ĐÀM S I S S S S S S R 20 392 Nam 27 ĐÀM S S S I S S I R S S R R S S 21 182 Nữ 72 ĐÀM R I R R R S R S R R R R R R 22 738 Nữ 52 MỦ S I S R R R S R R S S R S R 23 521 Nữ 78 ĐÀM R I R R S R S R R S S R R R 112 R S 24 358 Nam 38 ĐÀM R 25 104 Nam 38 ĐÀM R 26 993 Nam 48 MỦ S I I 27 113 Nam 33 ĐÀM S R 28 649 Nữ 66 NT S 29 892 Nữ 67 Đàm 30 496 Nam 72 31 722 Nam 32 827 33 R R R R S R R S R S S I R R R S S S I S R R R R Đàm S I R 46 NT S R Nam 77 Đàm R 927 Nữ 34 Đàm 34 316 Nam 32 35 353 Nam 36 352 37 581 R R R R R R R S R S R R R R S R S R R R S R R S S S S S R S S S R S R S R R R R R R R R S R S R S R R R R R R R S R S R S R R R S I R R R S R S R R R R R R R R R R R S R S R R R R R R Đàm R I R R R S R S R S R 15 Đàm S I I R R S S R S S R R Nam 41 Đàm S S S S S S S S S S R S Nam 71 Đàm R I R R R S R S R R R R 113 38 384 Nam 77 NT S S S 39 438 Nam 32 NT R R 40 447 Nữ 32 Đàm R I R 41 535 Nữ 54 NT S R 42 577 Nam 59 Mủ S 43 579 Nữ 82 Đàm S S 44 684 Nam 51 Mủ R R 45 760 Nữ 45 Đàm S 46 779 Nam 82 Đàm 47 885 Nam 51 48 119 Nam 49 182 50 267 S S S S S S R S S S S R R R S R R S R S R R R R S R R I R R S S S S S R S R S S S S R S R S R R R S R S S R R I S S S S S S S S R S I I R R R S R R R R R Đàm R R I R R S R S S R R R 53 Mủ S I S S S S S S S R R Nam 87 Đàm S S S I R S S S R R R R Nữ 22 Mủ S I S S S S S S S R I S 114 S 51 293 Nam 46 Đàm R R R R R S R S S S R R 52 250 Nam 87 Đàm S I R R R S R S R R R R 53 477 Nữ 100 Đàm S S S I R S R S S 54 925 Nam 82 Máu S S I R S R R R S 55 150 Nam 75 Đàm S S S S S S S S S 56 255 Nam 51 Đàm R R R R R S R R 57 303 Nam Máu S R 58 92 Nữ 41 Mủ S S S S I S S 115 R R R S R S S S S S R R S R R S S I I S S PHỤ LỤC Một số hình ảnh trang thiết bị sử dụng Tủ ấm ủ vi sinh vật 370C Tủ cấy vi sinh vật Tủ CO2 ủ vi sinh vật Mơi trường CO CA 116 Kính hiển vi quang học Dụng cụ dập kháng sinh Thiết bị đo vịng vơ khuẩn Primer cho phản ứng PCR 117 Máy lắc ủ luân nhiệt Máy Real-time PCR Thiết bị điện di Máy chụp gel 118 ... PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Hồng Dỗn Cảnh KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN BỆNH PHẨM TẠI VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH TỪ THÁNG 01- 06 /2014 Chuyên ngành: Vi sinh. .. SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN BỆNH PHẨM TẠI VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH? ?? Mục tiêu đề tài Nuôi cấy, phân lập, định danh xác định tỉ lệ kháng kháng sinh P aeruginosa phân lập. .. mẫu bệnh phẩm Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Nhiệm vụ đề tài - Nuôi cấy, phân lập định danh chủng Pseudomonas aeruginosa từ bệnh phẩm - Khảo sát đặc tính bệnh nhân nhiễm Pseudomonas aeruginosa - Khảo