Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn acetobacter

49 922 1
Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn acetobacter

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN  PHẠM VĂN HOẠT NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO MÀNG BC CỦA CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2011 Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung thầy cô phòng Vi Sinh khoa Sinh - KTNN tận tình giúp đỡ em thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Sinh – KTNN tạo điều kiện cho em thực đề tài Cảm ơn tất bạn sinh viên giúp đỡ để hoàn thành khóa luận cách tốt đẹp Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Sinh viên Phạm Văn Hoạt Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh ii ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới trình lên men tạo màng BC chủng vi khuẩn Acetobacter ” thực hiện, trùng lặp với tác giả khác Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Sinh viên Phạm Văn Hoạt Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh iii ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC MỤC LỤC Lời cảm ơn Bản cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt, bảng, hình vẽ TÓM TẮT CÔNG TRÌNH MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung đề tài Ý nghĩa đề tài NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu 1.2 Phân loại Acetobacter 1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter 1.2.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.3 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter 1.3.1 Đặc điểm hình thái 1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc 1.3.3 Đặc điểm màng vi khuẩn Acetobacter môi trường lỏng 1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn Acetobacte 1.3.5 Con đường chuyển hoá cacbon 1.4 Vị trí phân loại đặc điểm Acetobacter xylinum 10 1.4.1 Vị trí phân loại Acetobacter xylinum 10 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh iv ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 1.4.2 Đặc điểm Acetobacter xylinum 10 1.4.3 Màng BC vi khuẩn Acetobacter xylinum 11 1.4.4 Cơ chế tổng hợp màng BC vi khuẩn Acetobacter xylinum 12 1.5 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum 13 1.5.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới 13 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum Việt Nam 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thiết bị 16 2.1.1 Vi sinh vật 16 2.1.2 Hoá chất thiết bị 16 2.1.2.1 Hoá chất 16 2.1.2.2 Thiết bị …………… 16 2.1.3 Môi trường 17 2.1.3.1 Môi trường phân lập giống (MT1) 17 2.1.3.2 Môi trường nhân giống (MT2) 17 2.1.3.3 Môi trường nghiên cứu khả tạo màng 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp vi sinh 18 2.2.1.1 Phân lập chủng Acetobacter theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski Beijerinck 18 2.2.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái cách xếp tế bào tiêu nhuộm kép 19 2.2.1.3 Tuyển chọn chủng Acetobacter cho màng theo phương pháp Graxinop 19 2.2.1.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng 20 2.2.1.5 Phương pháp bảo quản chủng giống môi trường Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh v ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC thạch nghiêng 20 2.2.1.6 Phương pháp nuôi cấy môi trường lỏng 21 2.2.3 Các phương pháp hoá sinh 21 2.2.3.1 Phát hoạt tính catalase 21 2.2.3.2 Phát khả oxy hoá acid acetic 21 2.2.3.3 Phương pháp phát khả tổng hợp cellulose 21 2.2.3.4 Phương pháp xác định khả tổng hợp acid acetic chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm thị màu 22 2.2.4 Phương pháp thống kê xử lý kết 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Acetobacter 24 3.1.1 Hình thái tế bào học chủng vi khuẩn Acetobacter 24 3.1.2 Sinh trưởng môi trường thạch đĩa 25 3.1.3 Sinh trưởng môi trường lỏng 25 3.1.4 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Acetobacter 26 3.1.4.1 Hoạt tính catalase 26 3.1.4.2 Khả chuyển hóa glucose thành acid gluconic 26 3.1.4.3 Kiểm tra khả tổng hợp cellulose 27 3.2 Sự thay đổi màng BC qua thời gian nuôi cấy 28 3.3 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC 29 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 37 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh vi ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, BẢNG VÀ HÌNH VẼ Danh mục chữ viết tắt BC : Bacterial cellulose PC : Plant cellulose CFU : Colony Forming Unit CS : Cộng Nxb : Nhà xuất A.xylinum : Acetobacter xylinum MT : Môi trường CNSH : Công nghệ sinh học Danh mục bảng Bảng 1.1 Phân loại nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950) Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Danh mục hình Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Hình 1.2 Con đường chuyển hoá cacbon Acetobacter xylinum Hình 2.3 Acetobacter môi trường thạch nghiêng Hình 3.4 Kết nhuộm Gram Actobacter Hình 3.5 Acetobacter môi trường thạch đĩa Hình 3.6 Acetobacter môi trường lỏng Hình 3.7 Hoạt tính catalase chủng Acetobacter Hình 3.8 Khả oxy hóa acetat vi khuẩn Acetobacter Hình 3.9 Kết nhuộm màng BC Hình 3.10 Màng BC sau ngày nuôi cấy Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn thay đổi khối lượng màng BC qua thời gian nuôi cấy Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh vii ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Hình 3.12 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Hình 3.16a Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.16b Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.16c Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.17 Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước dừa) Hình 3.18a Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC môi trường nước máy Hình 3.18b Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC môi trường nước máy Hình 3.19 Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC môi trường nước dừa Hình 20 Màng BC chủng Acetobacter xylinum tạo pH =5 t0C = 300C Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh viii ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC TÓM TẮT CÔNG TRÌNH Vi khuẩn Acetobacter chủng có khả tạo màng BC môi trường dịch thể điều kiện nuôi cấy tĩnh Màng BC cấu tạo chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch thẳng, có cấu trúc hóa học đặc tính học giống với cellulose thực vật có thêm số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả thấm hút nước nhanh, khả polymer hóa lớn Vì màng BC ứng dụng rộng rãi giới nhiều lĩnh vực công nghệ Trong công nghệ thực phẩm sử dụng vi khuẩn Acetobacter tạo màng BC dày để sản xuất thạch dừa, màng để bảo quản thực phẩm Trong công nghiệp giấy, màng BC dùng để sản xuất giấy chất lượng cao, dùng để làm màng lọc nước công nghệ môi trường, làm chất mang đặc biệt cho pin tế bào lượng Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng BC dùng làm mặt nạ dưỡng da Trong lĩnh vực y học, màng BC bước đầu nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay da tạm thời, mạch máu nhân tạo Đặc biệt, nhu cầu màng trị bỏng cao phải nhập ngoại với giá thành lớn Công trình tập trung nghiên cứu: Ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, độ pH) đến khả tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum với mục đích tìm nhiệt độ, độ pH thích hợp cho tạo màng Nội dung gồm: Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng A.xylinum; nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, độ pH ban đầu tới tạo màng BC chủng A.xylinum Công trình cho phép lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum tạo màng BC có chất lượng tốt Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh ix ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Như biết kỷ XX kỷ ngành công nghệ thông tin kỷ XXI kỷ ngành công nghệ sinh học Ngày công nghệ sinh học dần trở thành ngành kĩ thuật chủ đạo chiếm giữ vị chí cao nhiều quốc gia giới Là phận ngành CNSH, công nghệ Vi sinh phát triển mạnh mẽ với thành tựu lớn có ý nghĩa đời sống, ngành: công nghiệp, nông nghiệp, y học Khó tìm lĩnh vực công nghệ sinh học mà lại không liên quan tới vi sinh vật Cho đến Acetobacter đánh giá loại vi khuẩn có khả sinh màng BC hiệu tự nhiên Vi khuẩn Acetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc họ Acetobacteriaceae Vi khuẩn Acetobacter tìm thấy giấm, dịch rượu, nước ép hoa Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường dịch lỏng, chúng hình thành bề mặt lớp màng BC, tập hợp tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose Màng BC cấu tạo chuỗi polymer-1,4 glucopyranose không phân nhánh tổng hợp từ số loài vi khuẩn nuôi cấy chúng môi trường dịch lỏng Màng BC Acetobacter tạo có cấu trúc hóa học đặc tính học giống với cellulose thực vật có thêm số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả thấm hút nước nhanh, khả polymer hóa lớn Vì màng BC ứng dụng rộng rãi giới nhiều lĩnh vực công nghệ Một ứng dụng quan tâm sản xuất màng BC điều trị bỏng tổn thương da [7] Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm màng tế bào Tiền chất tiết nhờ hệ thống lỗ nằm màng tế bào với enzym polymer hoá glucose thành cellulose môi trường dịch thể chúng phát triển thành lớp màng độ dày, mỏng khác tuỳ thuộc vào loài Màng tập hợp tế bào vi khuẩn liên kết với cellulose 3.1.4 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Acetobacter 3.1.4.1 Hoạt tính catalase Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có tượng sủi bọt khí (hình 3.7) Chứng tỏ oxy giải phóng ra, hay nói cách khác tác dụng enzym catalase phân giải H2O2 theo phương trình a ta lase H O  C   H 2O  O2 Hình 3.7 Hoạt tính catalase chủng Acetobacter Kết phù hợp với ý kiến đưa Walker cs (1942) chứng minh hoạt tính catalase vi khuẩn Acetobacter loài có hoạt tính catalase mạnh [17] 3.1.4.2 Khả chuyển hóa glucose thành acid gluconic Vòng sáng xuất xung quanh khuẩn lạc môi trường có chứa CaCO3 điều cho thấy acid gluconic tạo thành (Hình 3.8) Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trường từ màu trắng sang không màu H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 26 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Vòng phân giải CaCO3 Hình 3.8 Khả oxy hóa acetat vi khuẩn Acetobacter Kết phù hợp với nghiên cứu Hai-Peng Cheng cs (2002) xác định có mặt acid gluconic tổng hợp cellulose, sản phẩm oxy hoá glucose, tích luỹ pha lag chất quan trọng trình tổng hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter [13] 3.1.4.3 Kiểm tra khả tổng hợp cellulose Nhỏ dung dịch Lugol H2SO4 60% lên mặt lớp màng BC xuất màu lam Hình 3.9 Kết nhuộm màng BC Qua hình 3.9 chứng tỏ Acetobacter có khả hình thành màng cellulose Dựa theo khoá phân loại Bergey (1992) [11], tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic Frateur 1950, váo kết khảo sát đặc điểm sinh học loài Acetobacter mà nhận từ phòng thí nghiệm Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 27 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Vi sinh khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội loài Acetobacter xylinum có khả tạo màng sinh học BC sử dụng trị bỏng tổn thương da 3.2 Sự thay đổi màng BC qua thời gian nuôi cấy Khi nuôi cấy Acetobacter xylinum môi trường lỏng trùng 1210C vòng 20 phút, nhận thấy: Trong ngày đầu, vi khuẩn làm quen với môi trường, tích luỹ chất dinh dưỡng lượng cho giai đoạn sinh trưởng Lượng acid bắt đầu hình thành không nhiều làm cho pH môi trường giảm nhẹ Ngày thứ 2, màng BC bắt đầu hình thành bề mặt môi trường, tăng dần đạt khối lượng cực đại vào ngày thứ Sau màng chìm xuống dần khối lượng màng giảm dần bị phân hủy Ngày Hình 3.10 Màng BC sau ngày nuôi cấy Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 28 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp m(g) Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 m(g) 12 15 Ngày Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn thay đổi khối lượng màng BC qua thời gian nuôi cấy Qua thực nghiệm đến số nhận xét sau: Màng BC bắt đầu hình thành từ ngày thứ ổn định dần sau ngày nuôi cấy Môi trường giàu dinh dưỡng màng tiếp tục dày lên, môi trường nghèo dinh dưỡng chìm xuống bị phân huỷ dần Chình chọn sau ngày nuôi cấy thu màng (hình 3.11) 3.3 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Giá trị pH đo nồng độ ion H+ OH  có môi trường, độ pH ban đầu môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp đến tính chất sinh lý tế bào nên ảnh hưởng đến khả hình thành màng BC vi khuẩn Acetobacter xylinum Để xác định khoảng pH thích hợp cho tế bào sinh trưởng tạo màng BC, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn loại môi trường có giá trị pH khác 30oC ngày Qua nhiều lần thi nghiệm kết thu trình bày bảng 3.2 hình 3.12 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 29 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC STT pH Đặc điểm màng BC X m δ(%) Cv(%) Màng mỏng khoảng 1mm, 1,245 ± 0,01 0,02 1,61 3,218 ± 0,02 0,03 0,93 3,463± 0,02 0,03 0,87 3,203 ± 0,02 0,04 1,24 dai Màng mỏng – mm, dai, bề mặt nhẵn Màng mỏng – mm, dai, bề mặt nhẵn Màng mỏng – 4mm, dai, bề mặt nhẵn Màng không hình thành - - - Màng không hình thành - - - pH = Hình 3.12 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 30 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp m(g) Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 4.5 3.5 2.5 m(g) 1.5 0.5 pH Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Từ kết cho thấy: Vi khuẩn Actobacter xylinum sinh trưởng tốt pH = – đạt giá trị cao pH = Giá trị tương ứng với giá trị pH môi trường nước dừa Như để hạn chế tối đa thay đổi nồng độ ion môi trường nuôi cấy đồng thời tạo thành màng BC tốt chọn độ pH = để nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum Kết phù hợp với nghiên cứu Hestrin Schramm(1954) xác định giá trị pH tối ưu Chúng tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum với độ pH = 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Điều kiện thời tiết khí hậu Miền Bắc nước ta bốn mùa với thay đổi nhiệt độ rõ rệt Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng mà định đến khả hình thành màng BC chủng A.xylinum Trong trình nuôi cấy, nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng chậm, thời gian nuôi Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 31 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC cấy phải kéo dài làm giảm khả tổng hợp cellulose Nhiệt độ cao dẫn dến hô hấp mạnh ảnh hưởng đến trình tổng hợp cellulose Để xác định nhiệt độ tốt cho trình lên men đồng thời lợi dụng thuận lợi điều kiện khí hậu để sản xuất màng mang lại hiệu kinh tế cao tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum pH = tủ ấm với loại môi trường, mức nhiệt độ khác nhau, thu hồi xác định trọng lượng thô màng BC sau ngày nuôi cấy Kết thể bảng 3.2 hình 3.15 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC STT Nhiệt Đặc điểm độ màng BC X m δ (%) Cv (%) - - - 2,634 ± 0.02 0,05 1,90 3,474 ± 0,02 0,04 1,15 3,235 ± 0,02 0,04 1,23 (toC) 20 Không hình thành màng, có sợi cellulose nhỏ, lơ lửng môi trường 25 Màng mỏng(1 – 2mm), dai, bề mặt nhẵn 30 Màng mỏng – 3mm, dai, bề mặt nhẵn 35 Màng mỏng – 3mm, dai, bề mặt nhẵn 40 Không hình thành màng - - - 45 Không hình thành màng - - - 300C Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 32 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp m(g) Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 m(g) 20 25 30 35 40 T0C Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Từ kết cho thấy chủng Acetobacter xylinum sinh trưởng tổng hợp cellulose thích hợp khoảng nhiệt độ 25 – 35oC Khả hình thành màng cellulose tốt 30oC Nhiệt độ 35oC ức chế hoạt động tổng hợp cellulose Như nhiệt độ nuôi cấy để tạo màng tôt thời gian phù hợp 30oC Màng BC thu từ trình lên men acetic với tham gia vi khuẩn Acetobacter xylinum dùng theo mục đích chế tạo màng sinh học trị bỏng phải đảm bảo yêu cầu sau: đủ mỏng, phải có độ dai, chắc, bề mặt trơn nhẵn, màu sắc sáng trong… Quá trình nuôi cấy thu nhận màng BC phụ thuộc vào nhiều yếu tố tác động, việc nghiên cứu ảnh hưởng đến sinh tổng hợp màng BC cho thời gian tạo màng phù hợp để áp dụng rộng rãi quy mô công nghiệp đem lại lợi ích kinh tế cao Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 33 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum chủng cho màng BC đáp ứng yêu cầu màng sinh học sử dụng trị bỏng 1.2 Sự hình thành màng BC chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tốt điều kiện nuôi cấy có độ pH = 1.3 Nhiệt độ tốt cho tạo màng BC chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 300C Đề nghị Do thời gian có hạn nên nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ độ pH tới trình hình thành màng BC chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Để có màng BC có chất lượng tốt, mang lại hiệu kinh tế cao cần phải tiếp tục nghiên cứu: 2.1 Ảnh hưởng yếu tố môi trường : Pepton, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, … đến hình thành màng 2.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy như: tỷ lệ S/V,… 2.3 Các khâu trình xử lý màng BC 2.4 Cách xử lý bảo quản, đóng gói màng Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 34 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1.] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Đình Quyết, Phạm Văn Ty, (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Nxb khoa học kĩ thuật [2.] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, (1998) Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục [3.] Nguyễn Thành Đạt, (1999) Cơ sở sinh học vi sinh vật Nxb Giáo dục, [4.] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào, (1990) Thực hành vi sinh vật học Nxb Giáo dục [5.] Đặng Thị Hồng, (2007) Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học (BC) Luận án thạc sĩ Sinh học ĐHSP Hà Nội [6.] Nguyễn Thuý Hương, (2006) Chọn lọc dùng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn [7.] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh, (số 361/ 2006) Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí Dược học tr 18 – 20 [8.] Chu Văn Mẫn, (2003) Ứng dụng tin học sinh học Nxb ĐHQG Hà Nội [9.] Đinh Thị Kim Nhung, (1996) Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men acetic theo phương pháp chìm Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học [10] Nguyễn Thị Nguyệt, (2008) Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 35 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC [11.] Bergey H, John G Holt, (1992) Bergey’s manual of dererminativa bacteriology Wolters Kluwer health, p.71-84 [12.] Brown E, (2007) Bacterial cellulose Themoplastic polymer nanocomposites Master of sience in chemical engineering, Washington state university [13.] Hai-Peng Cheng, Pei-Ming Wang, Jech-Wei Chen, Wen-Teng Wu, (2002) Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reactor Vol 35, Biotechnol Appl Biochem, p 125-132 [14.] Jonas, R & Frarad L.F, (1998) Production and application of microbial cellulose Polymer Degradation and Stability 59, 101 – 106 [15.] Shah, J & Brown, R M Jr, (2005) Towards electionic paper displays made from microbial cellulose Applied Microbiology and Biotechnology, 66, 352 – 355 [16.] Wan, W.K & Millon, E, (2005) Poly (vinyl alcohol) – bacterial cellulose nanocomposite V S Pat Appl., Publ US 2005037082 A1, 16 [17.] Walker K T, Toidi.J, ( 1942) The ' Catalase test', with special reference to Acetobacter species Vol 37, The College of Technology, The University of Manchester, p 10-12 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 36 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC PHỤ LỤC Hình 3.16 a Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.16b Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 37 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp pH = pH = Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC pH = pH = pH = pH = Hình 3.16c Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.17 Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước dừa) Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 38 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Hình 3.18a Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC với môi trường nước máy 250C 200C 350C 300C 400C Hình 3.18b Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC với môi trường nước máy Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 39 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 300C Hình 3.19 Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC với môi trường nước dừa Hình 20 Màng BC chủng Acetobacter xylinum tạo thành pH =5 t0C = 300C Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 40 ĐHSP HÀ NỘI [...]... ngành : VI SINH VẬT HỌC Nhằm bổ sung hiểu biết về Acetobacter và màng BC tạo cơ sở cho sản xuất màng trị bỏng, chúng tôi quyết định chọn đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter ” 2 Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum 3 Nội dung của đề... tài 3.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A xylinum 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự tạo màng BC của chủng A.xylinum 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH ban đầu tới sự tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum 4 Ý nghĩa của đề tài Tìm ra một số đặc điểm của chủng vi khuẩn A.xylinum Từ đó chọn điều kiện môi trường (pH, nhiệt độ) nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum... sử dụng màng BC từ vi khuẩn A.xylinum ngày càng được quan tâm Có một số các nghiên cứu, công bố liên quan đến A.xylinum sự hình thành BC và ứng dụng màng BC Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng [7], sản xuất thạch dừa Gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn... cho vi khuẩn Acetobacter xylinum là 250C – 350C, pH tối ưu là 4,5 – 6,2 [11] Đặc điểm khuẩn lạc: Trên môi trường đặc, vi khuẩn Acetobacter xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hoặc gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên, dễ tách khỏi môi trường [5] 1.4.3 Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện. .. các chủng cho màng tốt nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo 2.2.1.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng Quá trình tuyển chọn các chủng Acetobacter được tuyển chọn thông qua các chỉ tiêu: quan sát quá trình hình thành màng (thời gian tạo màng, đặc điểm của dịch nuôi cấy…), kích thước và hình dạng tế bào khi nhuộm Gram, kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Acetobacter. .. Quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum diễn ra đồng thời với quá trình hình thành màng trên bề mặt môi trường dịch Lớp màng này chính là hàng rào ngăn cản oxy và chỉ những tế bào tiếp xúc trực tiếp với oxy mới có khả năng tổng hợp cellulose 1.5 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum 1.5.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới Vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng BC. .. trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường 3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường lỏng Vi khuẩn Acetobacter nuôi cấy trong môi trường lỏng hình thành một lờp màng có màu trắng sáng, bề mặt màng nhẵn, có độ dai cao trên bề mặt nuôi cấy (hình 3.6) Acetobacter Acetobacter Hình 3.6 Acetobacter trên môi trường lỏng Vi khuẩn Acetobacter là những loài hiếu khí, khi sống trong môi trường lỏng... ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 1.3.3 Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng Trên môi trường lỏng, vi khuẩn Acetobacter tạo thành các loại màng BC có độ dày mỏng, và đặc tính khác nhau Một số loài tạo thành màng dày như sứa, nhẵn, khi lắc chìm xuống đáy bình và hình thành lớp màng mới Một số loài tạo thành màng mỏng như tờ giấy cellofan, dai, nhẵn, khi... tên là “Vinegar”, bắt nguồn từ tiếng Pháp: “Vine” là rượu vang và “aigre” là chua Khi đó, người ta chưa biết vi khuẩn Acetobacter chính là tác nhân của quá trình lên men này Giấm mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỉ XIX Person là người đầu tiên nghiên cứu về giấm và vi khuẩn Acetobacter 1822, ông đã quan sát lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh sự có mặt của một... trợ giúp của kính hiển vi đã chứng minh nhận của Kiitzing và Pasteur là hoàn toàn đúng đắn Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia và rượu vang, ông kết luận: Màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi nó là Mycoderma aceti Từ đó đến nay, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu về Acetobacter Các nghiên cứu chủ yếu nhằm mục đích cải tiến và hoàn thiện hơn quá trình lên men giấm, ... ngành : VI SINH VẬT HỌC Nhằm bổ sung hiểu biết Acetobacter màng BC tạo sở cho sản xuất màng trị bỏng, định chọn đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới trình lên men tạo màng BC chủng. .. đặc tính sinh học chủng vi khuẩn A xylinum 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ tới tạo màng BC chủng A.xylinum 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng độ pH ban đầu tới tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum Ý nghĩa... chủng vi khuẩn Acetobacter ” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum Nội dung đề tài 3.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng

Ngày đăng: 30/11/2015, 07:38

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • 1.1. Lược sử nghiên cứu 3

  • 1.2. Phân loại Acetobacter 4

  • 1.2.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter 5

  • 1.3. Đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter 7

  • 1.3.1. Đặc điểm hình thái 7

  • 1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc 8

  • 1.3.3. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng 9

  • 1.3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacte 9

  • 1.3.5. Con đường chuyển hoá cacbon 9

  • 1.4. Vị trí phân loại và đặc điểm của Acetobacter xylinum 10

  • 1.4.1. Vị trí phân loại Acetobacter xylinum 10

  • 1.4.2. Đặc điểm của Acetobacter xylinum 10

  • 1.4.3. Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum 11

  • 1.4.4. Cơ chế tổng hợp màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum 12

  • 1.5. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum 13

  • 1.5.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới 13

  • 1.5.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam 14

  • CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 2.1. Vật liệu và thiết bị 16

  • 2.1.1. Vi sinh vật 16

  • 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 16

  • 2.1.2.1. Hoá chất 16

  • 2.1.3. Môi trường 17

  • 2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1) 17

  • 2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) 17

  • 2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng 17

  • 2.2. Phương pháp nghiên cứu 18

  • 2.2.1. Phương pháp vi sinh 18

  • 2.2.1.1. Phân lập chủng Acetobacter theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck 18

  • 2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp

  • tế bào trên tiêu bản nhuộm kép 19

  • 2.2.1.3. Tuyển chọn các chủng Acetobacter cho màng theo phương pháp

  • Graxinop 19

  • 2.2.1.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho

  • 2.2.1.5. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường

  • 2.2.3. Các phương pháp hoá sinh 21

  • 2.2.3.1. Phát hiện hoạt tính catalase 21

  • 2.2.3.3. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose 21

  • 2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid acetic bằng chuẩn

  • độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị màu 22

  • 2.2.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 22

  • Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950)

  • Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

  • Hình 2.3. Acetobacter trên môi trường thạch nghiêng

  • Hình 3.5. Acetobacter trên môi trường thạch đĩa

  • Hình 3.6. Acetobacter trên môi trường lỏng

  • Hình 3.7. Hoạt tính catalase của chủng Acetobacter

  • Hình 3.8. Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn Acetobacter

  • Hình 3.9. Kết quả nhuộm màng BC

  • Hình 3.10. Màng BC sau 4 ngày nuôi cấy

  • Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng màng BC qua thời

  • gian nuôi cấy

  • NỘI DUNG

  • CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

  • 1.1. Lược sử nghiên cứu

  • Giấm là sản phẩm rất quen thuộc đối với mỗi chúng ta, nó xuất hiện khoảng từ những năm 1000 trước công nguyên, người xưa dùng nó làm nước uống jessus, và được biết đến nhờ hiện tượng lên men hỏng của rượu vang. Chính vì vậy giấm có tên là “Vinegar”, bắt nguồn từ tiếng Pháp: “Vine” là rượu vang và “aigre” là chua. Khi đó, người ta chưa biết vi khuẩn Acetobacter chính là tác nhân của quá trình lên men này.

  • Giấm mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỉ XIX.

  • Person là người đầu tiên nghiên cứu về giấm và vi khuẩn Acetobacter. 1822, ông đã quan sát lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh sự có mặt của một loại vi sinh vật, ông gọi chúng là Mycoderma aceti.

  • Năm 1837, Kiitzing từ những thí nghiệm của mình đã đưa ra kết luận: quá trình lên men giấm được thực hiện khi có sự tham gia của vi khuẩn. Cùng năm đó, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen đã tách được từ màng giấm 2 loại vi khuẩn thuần khiết ông gọi đó là: Mycoderma aceti và Mycoderma pasteurianum.

  • Nhờ có sự xuất hiện của kính hiển vi, 1862 đến 1868, Pasteur nhờ sự trợ giúp của kính hiển vi đã chứng minh nhận của Kiitzing và Pasteur là hoàn toàn đúng đắn. Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia và rượu vang, ông kết luận: Màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi nó là Mycoderma aceti.

  • Từ đó đến nay, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu về Acetobacter. Các nghiên cứu chủ yếu nhằm mục đích cải tiến và hoàn thiện hơn quá trình lên men giấm, phân loại Acetobacter thành các nhóm, các loài dựa trên những đặc tính sinh lý, sinh hoá và các ứng dụng của chúng.

  • 1.2. Phân loại Acetobacter

  • 1.2.1. Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter

  • Để phân loại Acetobacter, các nhà nghiên cứu dựa vào một số tiêu chuẩn:

  • - Địa điểm phân lập: có liên quan đến điều kiện sống.

  • - Đặc điểm nuôi cấy: đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch (hình thái, tính chất, màu sắc…); khi nuôi cấy trên môi trường lỏng chú ý sự biến đổi của môi trường sau thời gian nuôi cấy (môi trường đục hay trong, mùi thơm dễ chịu hay không mùi, màu sắc môi trường…)

  • - Đặc điểm hình thái: hình dạng tế bào, cách sắp xếp tế bào, khả năng di động, có hay không có tiên mao, vỏ nhầy, màu sắc khi nhuộm Gram.

  • - Đặc điểm sinh lý: mối quan hệ với các yếu tố: nhiệt độ, độ pH của môi trường, khả năng hình thành sắc tố, mối quan hệ với oxy, khả năng lên men acetic, khả năng sử dụng chất vô cơ và hữu cơ,…

  • - Đặc điểm sinh hoá (theo Frateur, 1950):

  • + Khả năng tạo catalase.

  • + Khả năng tổng hợp các xeto từ các rượu bậc cao như : glixerol, manitol, sorbitol.

  • + Khả năng oxy hoá acetat thành CO2 và H2O.

  • + Khả năng oxy hoá glucose thành acid gluconic.

  • + Khả năng sử dụng muối amôn làm nguồn nitơ duy nhất, khả năng sử dụng rượu etylic làm nguồn cacbon.

  • + Khả năng sinh sắc tố nâu.

  • + Khả năng tổng hợp cellulose.

  • - Ngoài ra, ngày nay khi định loại Acetobacter, người ta còn sử dụng sinh học phân tử để giải trình tự rARN16S.

  • 1.2.2. Phân loại vi khuẩn Acetobacter

  • Việc tiến hành phân loại vi khuẩn Acetobacter được tiến hành ngay từ thế kỷ XIX. Trong đó có một số khoá phân loại đáng chú ý như sau: khoá phân loại của Beijerinck năm 1899, ông đã tiến hành phân lập vi khuẩn acetic thuần khiết và chia chúng thành 4 nhóm cơ bản. Năm 1916, Janke đã tiếp theo công trình nghiên cứu của Beijerinck. Ông đã phân loại dựa trên 2 dấu hiệu:

  • Một là: Sử dụng muối amoni làm nguồn cung cấp nitơ trong quá trình sinh

  • trưởng và phát triển.

  • Hai là: Không có hoặc có khả năng di động trong quá trình phát triển.

  • Năm 1926, Henneberg dựa vào nơi sống mà chia vi khuẩn acetic làm

  • 4 nhóm sau:

  • + Nhóm 1: Vi khuẩn không phát triển trên bia vì hoa hublon độc với chúng.

  • + Nhóm 2: Vi khuẩn có khả năng phát triển trên bia.

  • + Nhóm 3: Vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang, oxy hoá rượu thành giấm, thường dùng trong sản xuất giấm theo phương pháp chậm.

  • + Nhóm 4: Vi khuẩn dùng để sản xuất giấm theo phương pháp nhanh.

  • Năm 1934, các nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ dựa vào khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ, đã xếp vi khuẩn acetic vào họ Nitrobacteriaceae. Từ đó, vi khuẩn acetic có tên là Acetobacter.

  • Năm 1936, Kenyver, Wanneil và Staniel nghiên cứu khả năng di động của chúng thấy có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động nên xếp chúng vào họ Pseudomonadaceae.

  • Năm 1948, Vanghn đã nghiên cứu khả năng di động của một số loài Acetobacter: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianum, Acetobacter zancens, Acetobacter melanogenus, Acetobacter oxydans và thấy chúng đều có đơn mao ở cực và đã xác nhận vị trí của vi khuẩn acetic trong họ Pseudomonadaceae. Cùng năm 1948, Krassilnicov cùng một số tác giả người Mỹ đã thống nhất xếp vi khuẩn Acetobacter vào họ vi khuẩn Pseudomonadaceae.

  • Năm 1914, Bergey đã phân các loài trong giống Acetobacter thành 2 nhóm:

  • - Nhóm 1: Có khả năng oxy hoá acetic thành CO2 và H2O, gồm các nhóm:

  • + Sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất (sinh trưởng trên môi trường Hoyer) như: Acetobacter aceti.

  • + Không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất:

  • * Trên môi trường dịch thể tạo thành màng nhầy chứa cellulose như: Acetobacter xylinum.

  • * Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa cellulose như: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter kneizigianus.

  • - Nhóm 2: Không có khả năng oxy hoá acid acetic.

  • + Tạo thành sắc tố trên môi trường glucose.

  • * Sắc tố nâu tối tới đen nhạt như: Acetobacter melanogenus.

  • * Sắc tố hồng như: Acetobacter resens.

  • + Không tạo thành sắc tố:

  • * Nhiệt độ thích hợp nhất từ 300C đến 350C : Acetobacter suboxydans.

  • * Nhiệt độ thích hợp nhất từ 180C đến 210C : Acetobacter oxydans.

  • Năm 1950, Frateur chính thức đưa ra một khoá phân loại mới dựa trên các tiêu chuẩn cụ thể như:

  • - Khả năng tạo catalase.

  • - Khả năng tổng họp các chất xeto từ rượu bậc cao như: glycerol, manitol, sorbitol.

  • - Khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O

  • - Khả năng oxy hoá glucose thành gluconic.

  • - Khả năng sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ và rượu làm nguồn cacbon (Sinh trưởng trên môi trường Hoyer)

  • - Tạo sắc tố nâu.

  • - Tổng hợp cellulose.

  • Trên cơ sở đó, Frateur chia vi khuẩn acetic thành các nhóm theo bảng sau:

  • Bảng 1.1. Phân loại các nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950)

  • 1.3. Đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter

  • 1.3.1. Đặc điểm hình thái

  • Vi khuẩn Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men acid acetic.

  • Đối chiếu với các tiêu chuẩn phân loại học có thể xếp chúng vào 2 giống: vi khuẩn Acetobacter có chu mao hoặc không có chu mao và Gluconobacter đơn bào.

  • Theo Bergey, 1989 và Larpent et al, 1990, Acetobacter và Gluconobacter là hai giống vi khuẩn quan trọng nhất trong họ Acetobacteriaceae. Hai giống này gặp thấy nhiều trong tự nhiên, trên bề mặt lá cây, hoa quả và đều có khả năng tạo acid từ rượu. Nhưng Gluconobacter không có chu trình tricacboxylic (ATC) nên không có quá trình oxy hoá acetat thay vào đó có một số chu trình khác như: chu trình Glyoxylat, quá trình photphoril hoá, còn Acetobacter lại không xảy ra các quá trình trên.

  • Đem so sánh 2 vi khuẩn trên với những vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas thấy có nhiều nét tương đồng. Tuy nhiên chúng khác Pseudomonas ở những điểm sau: khả năng chịu độ acid cao hơn, khả năng chuyển hoá pepton yếu hơn, không sinh sắc tố, ít di động hơn. Một số loài vi khuẩn acetic khi sống trên môi trường nghèo chất dinh dưỡng hoặc thời gian nuôi cấy lâu thì tế bào dễ bị biến đổi hình thái( kéo dài hoặc phình to hay phân nhánh)

  • Tế bào vi khuẩn acetic có hình que hoặc hình elip, đứng độc lập hay xếp thành chuỗi, kích thước 0,6 – 0,8 µm, có thể có tiên mao và có khả năng di động, sống hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng hữu cơ, nhuộm màu Gram âm, không sinh bào tử.

  • Vi khuẩn Acetobacter thích hợp pH = 4,5 – 6,2 và nhiệt độ 25 – 35oC, có khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic và có quá trình oxy hoá hoàn toàn các chất hữu cơ tạo các hợp chất xeton hay acid hữu cơ tương ứng.

  • 1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc

  • Trên môi trường đặc (thạch đĩa), Acetobacter phát triển thành các khuẩn lạc tròn, đều, đường kính trung bình là 3mm. Thường có 3 dạng:

  • Một số loài như Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti có khuẩn lạc nhỏ (đường kính ≈ 1mm), bề mặt trơn bóng, ở giữa khuẩn lạc dày và đậm màu hơn các phần xung quanh.

  • Một số khác lớn hơn (đường kính khoảng 4 – 5 mm), bề mặt trơn nhẵn, không màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, có thể tách ra khỏi môi trường dễ dàng. Một loại khác ăn sâu vào môi trường, khó tách ra bằng que cấy.

  • 1.3.3. Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng

  • Trên môi trường lỏng, vi khuẩn Acetobacter tạo thành các loại màng BC có độ dày mỏng, và đặc tính khác nhau.

  • Một số loài tạo thành màng dày như sứa, nhẵn, khi lắc chìm xuống đáy bình và hình thành lớp màng mới.

  • Một số loài tạo thành màng mỏng như tờ giấy cellofan, dai, nhẵn, khi lắc cũng chìm xuống đáy bình, dịch nuôi cấy trong, có mùi thơm dễ chịu. Khi nghiên cứu màng này thấy có nhiều sợi cellulose đan kết với nhau tạo nên độ dẻo dai, đàn hồi và độ chắc khỏe, màng có chứa nhiều vi khuẩn Acetobacter.

  • Một số khác tạo thành những loại màng mỏng, dễ vỡ, nhăn nheo, bám theo thành bình, dịch nuôi cấy đục có màu vàng nâu, không trong, có mùi không dễ chịu.

  • 1.3.4. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter

  • Vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với nguồn cacbon, nguồn nitơ và các chất sinh trưởng hết sức đa dạng. Chúng có thể đồng hoá nhiều loại thức ăn cacbon khác nhau như: các loại đường (monosaccharide, disaccharide, polysaccharitde), rượu etylic, acid hữu cơ nhưng không sử dụng được tinh bột.

  • Trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi khuẩn acetic cần cung cấp một số acid amin như: valin, alanin, prolin, ioslysine. Một số chất kích thích sinh trưởng như: acid nicotic, acid folic, biotin.

  • Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp polysaccharide phân tử lớn như: cellulose, tinh bột, dextran,…Người ta ứng dụng đặc tính này trong sản xuất công nghiệp. Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose như bông: Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti, Acetobacter kiitzingianum.

  • 1.3.5. Con đường chuyển hoá cacbon

  • Qua sự nghiên cứu về khả năng chuyển hoá cacbon các tác giả đã đi đến kết luận: Vi khuẩn acetic có khả năng oxy hoá gluxit theo các hướng sau:

  • Hướng 1: Chuyển hoá gluxit theo con đường hexosemono phosphate (HMP) hoặc pentose nhờ sự oxy hoá các cơ chất đã được photphoril hoá.

  • Hướng 2: Theo con đường Entner – Doudoroff (ED) - chỉ gặp trong loài có khả năng tổng hợp cellulose.

  • Hướng 3: Theo chu trình Kreps (ATC) hoặc glyoxylat

  • Hướng 4: Sinh trưởng trên môi trường chứa glycerol.

  • Hướng 5: Không có sự photphoril hoá cơ chất do thiếu enzym phosphofructokinase do đó không tồn tại con đường glycolysis.

  • 1.4. Vị trí phân loại và đặc điểm của Acetobacter xylinum

  • 1.4.1. Vị trí phân loại Acetobacter xylinum

  • Theo hệ thống phân loại của Bergey,(1992) Acetobacter xylinum thuộc giống Acetobacter,họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales,

  • lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, một số tác giả coi Acetobacter xylinum như một loài phụ của Acetobacter acetic [11]

  • 1.4.2. Đặc điểm của Acetobacter xylinum

  • Vi khuẩn Acetobacter xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng di động. Các tế bào được bao bọc bởi màng nhầy có bản chất là cellulose. Chúng tích luỹ khoảng 4,5% acid trong môi trường, khi nồng độ acid acetic vượt quá giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn.

  • 

  • Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum

  • Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, không sinh bào tử. Thường sống trong giấm, rượu nhạt, nước ép hoa quả, bề mặt hoa quả, và có cả ở trong đất. Theo Bergey, 1992, nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Acetobacter xylinum là 250C – 350C, pH tối ưu là 4,5 – 6,2 [11].

  • Đặc điểm khuẩn lạc: Trên môi trường đặc, vi khuẩn Acetobacter xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hoặc gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên, dễ tách khỏi môi trường [5].

  • 1.4.3. Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum

  • Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn Acetobacter xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay màng BC.

  • * Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:

  • Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau.

  • 1.4.4. Cơ chế tổng hợp màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum

  • 1.5. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum

  • 1.5.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới

  • Vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng BC của chúng đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học dã dùng màng BC làm màng phân tách để xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng (Brown 1989) [12], Jonas và Farad (1998) [14] đã dùng màng như một chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học. Đặc biệt trong công nghiệp dệt, Brown (1989) đã sử dụng chúng để sản xuất vải đặc biệt có giá trị kình tế cao [12]. Trong công nghiệp giấy, màng BC được sử dụng để sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao. Trong công nghiệp thực phẩm, nó được ứng dụng để sản xuất thạch dừa, một món ăn được ưa chuộng ở Đông Nam Á.

  • Ứng dụng nổi bật nhất của màng BC là trong lĩnh vực y học. Nó được sử dụng để chế tạo vật liệu composite đắp lên vết thương hở, điều trị bỏng, thay thế da tạm thời, làm mặt nạ dưỡng da [10], làm mạch máu điều trị các bệnh tim mạch. Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong phẫu thuật và nha khoa implants. Năm 2005, Henrik Backdahl và cs đã ghép thành công sợi cellulose trên động mạch cảnh của lợn thấy chúng sinh sản và kéo dài khoảng 40m chỉ sau 2 tuần cấy ghép. Họ đã đi đến kết luận có sự tương đồng về cấu trúc giữa màng BC với collagen.

  • 1.5.2. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Việt Nam

  • CHƯƠNG 2

  • VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 2.1. Vật liệu và thiết bị

  • 2.1.1. Vi sinh vật

  • Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng hình thành màng BC của các chủng vi khuẩn acetic từ các nguồn sau: mẫu màng giấm từ kết quả nghiên cứu của thạc sỹ Đặng Thị Hồng 2007, giấm làm theo phương pháp thủ công, nước uống lên men (Kombucha) [5]

  • Đối tượng nghiên cứu: chủng vi khuẩn phân lập Acetobacter xylinum có khả năng hình thành màng BC.

  • 2.1.2. Hoá chất và thiết bị

  • 2.1.2.1. Hoá chất

  • Ngoài ra còn sử dụng : acid acetic, NaOH 0,1N, nước dừa (Việt Nam).

  • 2.1.2.2. Thiết bị

  • Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức).

  • Nồi hấp Tommy (Nhật).

  • Máy so màu UV – vis ( Nhật).

  • Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ).

  • Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).

  • Máy li tâm Sorvall (Mỹ).

  • Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20l – 1000µl.

  • Kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ)

  • Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ).

  • Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn,…

  • 2.1.3. Môi trường

  • 2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1)

  • Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g

  • KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g

  • CaCO3 : 10g Agar: 20g

  • Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).

  • Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).

  • Nước máy: 1000ml.

  • 2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)

  • Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g

  • KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g

  • Pepton: 4g

  • Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).

  • Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).

  • Nước máy: 1000ml.

  • 2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng

  • Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g

  • KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g

  • Cao nấm men: 3g Pepton: 4g

  • Acid acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).

  • Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).

  • Nước dừa (hoặc nước máy): 1000ml.

  • 2.2. Phương pháp nghiên cứu

  • 2.2.1. Phương pháp vi sinh

  • 2.2.1.1. Phân lập chủng Acetobacter theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck)

  • Nguồn vật liệu: các nguồn bia khác nhau, nước dừa, các loại dịch chiết quả, cho lên men tự nhiên từ 10 đến 12 ngày tạo thành một lớp màng trắng, mỏng trên bề mặt dịch nuôi cấy.

  • Từ các màng thu được, dùng đũa thuỷ tinh vô trùng vớt màng, lấy một lượng nhỏ màng, rửa qua bằng nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa nước cất thanh trùng, vontex đều, thu được ống nghiệm chứa mẫu màng gốc.

  • Sử dụng phương pháp pha loãng Pasteur: Chuẩn bị 10 ống nghiệm có đậy nút bông, sấy vô trùng, cho vào mỗi ống nghiệm 9ml nước cất, đậy nút bông, hấp thanh trùng trong nồi hấp giữ ở 1210C, 1atm trong thời gian 15 phút. Chuyển vào bốc cấy vô trùng, dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch từ ống nghiệm chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông, vontex trong 5 phút, thu được ống nghiệm chứa dịch pha loãng mức 10-1. Tiếp tục hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ hai, thu được dịch pha loãng ở mức 10-2. Tiếp tục pha loãng ở các độ pha loãng 10-3; 10-4…;10-7. Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có ở trong mẫu, chúng tôi chọn các mẫu ở độ pha loãng 10-4 - 10-7 để tiến hành các bước tiếp theo.

  • Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa: Chuẩn bị môi trường 1 đã hấp khử trùng, đổ môi trường thạch đĩa. Dùng pipet vô trùng hút 100l dịch màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10-4 - 10-7) nhỏ vào các hộp lồng đã chứa môi trường thạch, dùng que trang thủy tinh trang đều trên khắp bề mặt thạch. Đặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, để trong tủ ấm 300C, sau 3 – 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thước, màu sắc, độ trơn bóng, viền mép khuẩn lạc, vòng phân giải CaCO3).

  • Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), tách các khuẩn lạc riêng rẽ từ hộp lồng, cấy chuyển vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C. Sau 3 – 4 ngày, quan sát, làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram.

  • 2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép

  • Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram [1]:

  • 1. Tím gentian: 2 phút.

  • 2. Rửa nước.

  • 3. Dung dịch Lugol: 2 phút.

  • 4. Rửa nước.

  • 5. Cồn 950: 20 giây.

  • 6. Rửa nước.

  • 7. Dung dịch Fucshin: 2 phút.

  • 8. Rửa nước.

  • 9. Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn.

  • Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm màu hồng (Gram âm), đó chính là vi khuẩn Acetobacter.

  • 2.2.1.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng theo phương pháp Graxinop

  • Trước tiên, phải nhân giống các chủng vi khuẩn phân lập được bằng cách: Từ mỗi loại khuẩn lạc, dùng que vô trùng, gợt lấy khuẩn lạc vào các ống nghiệm đã chứa sẵn môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3, đã khử trùng và để nguội), nuôi trong tủ ấm 3 – 4 ngày để hoạt hóa giống, từ các ống giống đó, ta nuôi vi khuẩn trên môi trường nhân giống cơ bản (môi trường MT2) trong các ống nghiệm, có thể nuôi lắc để thu sinh khối tế bào vi khuẩn.

  • Tiếp tục nuôi cấy các chủng Acetobacter trong môi trường dịch thể (MT3), tuyển chọn các chủng cho màng tốt nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.

  • 2.2.1.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng

  • Quá trình tuyển chọn các chủng Acetobacter được tuyển chọn thông qua các chỉ tiêu: quan sát quá trình hình thành màng (thời gian tạo màng, đặc điểm của dịch nuôi cấy…), kích thước và hình dạng tế bào khi nhuộm Gram, kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập được, kiểm tra độ dày mỏng của màng, kiểm tra tính chịu lực của màng: độ dai chắc của màng bằng cảm quan.

  • 2.2.1.5. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng

  • Các chủng giống sau khi phân lập và sơ bộ xác định là Acetobacter được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 – 4 ngày ở 300C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo quản giống. Cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng một tháng một lần.

  • Hình 2.3. Acetobacter trên môi trường thạch nghiêng

  • 2.2.3. Các phương pháp hoá sinh

  • 2.2.3.1. Phát hiện hoạt tính catalase

  • Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (calatase+). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính calatase (calatase-).

  • Ngoài ra, có thể nhỏ trực tiếp H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 6000 vòng/10phút, quan sát hiện tượng như trên.

  • 2.2.3.3. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose

  • Nuôi vi khuẩn trong môi trường thử khả năng tạo màng (MT3), nuôi tĩnh ở nhiệt độ 28 – 300C trong 3 – 4 ngày. Quan sát sự hình thành màng, kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên màng dung dịch lugol và H2SO4 60%, nếu là cellulose thì màng sẽ chuyển sang màu xanh lam.

  • 2.2.3.4. Phương pháp xác định khă năng tổng hợp acid acetic bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị

  • Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men, thêm vào đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hống nhạt. Sau đó tính số gam acid acetic trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức:

  • 

  • Với : X : Số gam acid acetic trong 100 ml dung dịch lên men

  • V : Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men

  • K : Lượng acid acetic tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N (K = 0,006)

  • 10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ

  • 2.2.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả

  • Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp sau:

  • + Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình cộng các chỉ số acid

  • tạo thành trong các lần thí nghiệm:

  • 

  • + Trung bình bình phương các sai lệch:

  • 

  • + Sai số đại diện của trung bình cộng:

  • 

  • + Hệ số biến thiên trung bình cộng:

  • 

  • Trong đó :  là trung bình cộng các chỉ số acid tạo thành

  • n là số lần thí nghiệm

  • ±m là sai số đại diện của trung bình cộng lượng acid tạo thành

  • Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Acetobacter hình thành khuẩn lạc (hình 3.5)

  • Hình 3.5. Acetobacter trên môi trường thạch đĩa

  • Hình 3.6. Acetobacter trên môi trường lỏng

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan