TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN  VŨ THỊ HẠT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ Ở SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.PHẠM BÍCH NGỌC Th.S LA VIỆT HỒNG HÀ NỘI, 2012 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Phạm Bích Ngọc - Viện Công nghệ sinh học ThS La Việt Hồng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng Hà Trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, TS Lê Văn Sơn, tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới CN Nguyễn Đình Trọng toàn thể cán Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu suốt trình em hoàn thành khóa luận Và hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người động viên bên em suốt trình thực đề tài Hà nội, ngày 10 tháng năm 2012 Sinh viên Vũ Thị Hạt LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận: “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” kết nghiên cứu riêng hướng dẫn TS Phạm Bích Ngọc- Viện Công nghệ sinh học ThS La Việt Hồng – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Hà nội, ngày 10 tháng năm 2012 Sinh viên Vũ Thị Hạt MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG - BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu 3 Yêu cầu đề tài Ý nghĩa đề tài NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái sâm Ngọc Linh 1.2 Tình hình nghiên cứu sinh khối tế bào thực vật 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 1.3 Cơ sở khoa học phương pháp chuyển gen vào tế bào thực vật 1.3.1 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 1.3.2 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp 11 1.3.2.1 Giới thiệu vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 12 1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu biến nạp gen thông qua Agrobacterium rhizogenes 14 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 16 2.1.1 vật liệu 16 k2.1.2 Hóa 16 chất 16 2.1.3 Máy móc thiết bị 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 17 2.2.2 Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacteriumrhizogenes 18 2.2.3 Phương pháp nhuộm X – gluc 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng kháng sinh diệt khuẩn lên sinh trưởng phát 19 triển mô sâm Ngọc Linh tự nhiên 3.2 Ảnh hưởng điều kiện biến nạp lên sinh trưởng phát triển 21 mô sâm Ngọc Linh 22 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ khuẩn đến hiệu biến nạp 23 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp 3.3 Kiểm tra hiệu chuyển gen thông qua Agrobacteriumrhizogenes 25 vào mô sâm Ngọc Linh bàng phương pháp nhuộm X – gluc 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 Kết luận 27 Kiến nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 Tiếng Việt 28 Tiếng Anh 29 Trang web tham khảo PHỤ LỤC 30 DANH MỤC BẢNG - BIỂU ĐỒ Danh mục bảng Bảng 1.1 Các nghiên cứu tạo hoạt chất từ sinh khối rễ tơ Bảng 2.1 Thành phần dung dịch nhuộm X-gluc Bảng 3.1 Ảnh hưởng cacbe cefo tới sinh trưởng mô sâm Ngọc Linh Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ khuẩn đến sống sót mô sâm Ngọc Linh Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả sống sót mô sâm Ngọc Linh Danh mục biểu đồ Biểu đồ 3.1 Số mô Sâm Ngọc Linh sống sót sau tuần môi trường chứa cefotaxim với nồng độ khác Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng nồng độ khuẩn đến số mô sâm Ngọc Linh sống sót sau ngày Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả sống sót mô sâm Ngọc Linh DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh sâm Ngọc Linh Hình 1.2 Sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Hình 1.3 Nuôi cấy rễ tơ G glabra Hình 1.4 Cấu trúc plasmid Ri Hình 3.1 Mô sâm Ngọc Linh úa vàng sau tuần để tủ tối Hình 3.2 Cơ chế nhuộm mô tế bào X-gluc Hình 3.3 Kết nhuộm gen gus X-gluc DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Gus : β-glucuronidase AS : Acetosyringone SH : Schenk & Hildebrandt Cefo : Cefotaxim Vanco : Vancomycin Cacbe : Carbecillin X – gluc : - bromo - - chloro - - indolyl - β - D - glucuronide MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) loại dược liệu quý hiếm, phân bố vùng núi cao sơn hệ Ngọc Linh thuộc số huyện Kon Tum Quảng Nam Vào năm 1973, Sâm Ngọc Linh DS Đào Kim Long nhà khoa học phát độ cao 1800 m vùng núi Ngọc Linh thuộc Kon Tum Tới năm 1988, TS Hà Thị Dụng GS Grushvisky xác định loài sâm giới đặt tên khoa học Panax vietnamensis Ha et Grushv, mà người thường gọi sâm Việt Nam [10], [12] Theo nghiên cứu khoa học, sâm Ngọc Linh có tác dụng chống trầm cảm, kích thích hệ miễm dịch, chống lão hóa, phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, sức đề kháng, nâng cao huyết áp người huyết áp thấp Hợp chất hóa học saponin chứa sâm Ngọc Linh thần dược với sức khỏe người khiến sâm Ngọc Linh bán thị trường với giá cao, vào năm 2005 năm 2008 1kg tươi sâm Ngọc Linh – Quảng Nam có giá 12-15 triệu đồng, lúc khan lên tới 25-30 triệu đồng; 1kg tươi sâm Triều Tiên có giá khoảng triệu đồng [15] Hiện 1kg sâm Ngọc Linh có giá lên tới 60 triệu đồng Do lợi ích lớn sâm Ngọc Linh trở thành đối tượng săn tìm người hậu dẫn tới năm 1993 sâm Ngọc Linh xếp đầu bảng sách đỏ thực vật Việt Nam có nguy tuyệt chủng Chính mà có nhiều đề tài khoa học thực với mục đích bảo tồn phát triển sâm Ngọc Linh như: i) nghiên cứu nhân giống sâm Ngọc Linh, nghiên cứu điều kiện trồng trọt Tuy nhiên việc nhân giống sâm Ngọc linh tự nhiên khó khăn hạt không đảm bảo tỉ lệ sống sót đặc tính di truyền ii) nghiên cứu nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh thông qua kĩ thuật phát sinh phôi vô tính Đây xem giải pháp tối ưu tạo nguồn cung cấp giống sâm quanh năm, bảo tồn sâm Ngọc Linh mà tiến tới sản xuất sâm Ngọc Linh thương phẩm với quy mô lớn Tuy nhiên thời gian nuôi trồng kéo dài xảy tình trạng sâm bị khai thác trộm trước thời gian phép thu hoạch Do chế phẩm từ sâm Ngọc Linh sản xuất ít, chí ngưng sản xuất thiếu nguồn nguyên liệu.Trước thực trạng giải pháp tối ưu đưa tạo nguồn dược phẩm ổn định công nghệ sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh [5] Công nghệ sinh khối tế bào thực vật đơn giản nuôi vô tính dòng tế bào để tạo khối lượng lớn sản phẩm sử dụng cho việc tách chiết hoạt chất Quá trình việc tạo mô sẹo từ tế bào, mô bị biệt hóa thực vật, sau chúng làm giảm tính biệt hóa hóa môi trường nuôi cấy cuối tăng khối lượng hệ thống bình nuôi cấy lớn (Bioreactor) Trong trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm tính biệt hóa mô tế bào nuôi cấy cần thiết phải bổ sung chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy Vấn đề trở ngại lớn làm nản lòng nhà nghiên cứu tồn dư chất điều tiết sinh trưởng sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm sức khỏe người sử dụng Tuy nhiên việc hoàn toàn khắc phục nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ Rễ tơ bệnh thực vật gây trình tương tác vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tế bào vật chủ Điều đặc biệt rễ tơ sinh trưởng, phát triển tốt môi trường không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng loại bỏ dư lượng chất sản 2.2.3 Phƣơng pháp nhuộm X-Gluc * Dung dịch nhuộm: Bảng 2.1 Thành phần dung dịch nhuộm X – gluc STT Thành phần dung dịch nhuộm X - gluc 890µl Tris – HCl 100µl X – gluc (nồng độ 10 mg / ml) 10µl Trypton 10% ∑ 1ml dung dịch nhuộm X - gluc * Tiến hành nhuộm: - Ngâm mô cần quan sát vào dung dịch nhuộm - Ủ mẫu tủ ấm 37oC, 12 -14 - Loại bỏ dung dịch nhuộm rửa vài lần cồn 70o hẳn chlorophyl quan sát 18 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng kháng sinh diệt khuẩn lên sinh trƣởng phát triển mô sâm Ngọc Linh tự nhiên Chất kháng sinh gây độc cho mẫu thực vật trình chuyển gen thực vật, để nghiên cứu ảnh hưởng chất kháng sinh đến hiệu chuyển gen vào sâm Ngọc Linh mà hiệu chuyển gen đạt mà kháng sinh có tác dụng vi khuẩn, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng số loại chất kháng sinh lên sinh trưởng phát triển mô sâm Ngọc Linh Thí nghiệm thực sau: - Chọn mẫu sâm Ngọc Linh non nuôi cấy in vitro, cắt nhỏ mẫu cuống với kích thước khoảng 0,5-0,7 cm - Đặt mô cuống sâm Ngọc Linh vào loại môi trường khác nhau: o MT1: Môi trường SH có bổ sung vanco 100 mg/ml o MT2: Môi trường SH có bổ sung carbe 200 mg/ml vanco 100 mg/ml o MT3: Môi trường SH có bổ sung cefo 250 mg/ml vanco 100 mg/ml o MT4: Môi trường SH có bổ sung cefo 300 mg/ml vanco 100 mg/ml o MT5: Môi trường SH có bổ sung cefo 500 mg/ml vanco 100 mg/ml Theo dõi phát triển mẫu cuống sâm Ngọc Linh môi trường khác nhau, kết thể bảng 3.1 19 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng carbe cefo tới sinh trƣởng mô sâm Ngọc Linh Nồng độ cefo + vanco 100 (mg/ml) 250 300 500 ĐC (carbe 200+vanco 100) a Tổng số môa 30 26 10 28 Số mô trung bình sống sót 10,0 8,67 3,33 0,67 9,33 tổng số mô sâm Ngọc Linh sống sót môi trường SH bổ sung nồng độ cefo khác nhau, đối chứng môi trường SH bổ sung (carbe 200+vanco 100), số lần nhắc lại cho công thức 3, kết đếm sau tuần Biểu đồ 3.1 Số mô sâm Ngọc Linh sống sót sau tuần môi trƣờng chứa cefotaxim nồng độ khác Kết phân tích bảng 3.1 biểu đồ 3.1 cho thấy, chất kháng sinh cefotaxim có ảnh hưởng tới khả sống mô sâm Ngọc Linh tự nhiên, mô nuôi cấy môi trường chứa vanco (môi trường không chứa cefotaxim) số mô sống sót cao (trung bình 10 mô/đĩa) hay 20 100% số mô sống sót Giá trị cao so với đối chứng môi trường SH bổ sung carbe 200mg/ml (trung bình 9,3 mô/đĩa) Điều cho thấy, mô sâm Ngọc Linh nhạy cảm với nồng độ carbenicillin 200mg/ml Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả trước đối tượng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [7] Khi nồng độ cefotaxim môi trường nuôi cấy tăng lên, đặc biệt nồng độ cefotaxim 300mg/ml 500mg/ml ức chế sinh trưởng mô sâm Ngọc Linh 3.2 Ảnh hƣởng điều kiện biến nạp lên sinh trƣởng phát triển mô sâm Ngọc Linh Chúng tiến hành chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes theo phương pháp nêu, với dịch vi khuẩn có OD600nm = 0,543, thời gian đồng nuôi cấy ngày, môi trường chọn lọc môi trường SH có bổ sung carbe 200 mg/ml vanco 100 mg/ml, kết hình 3.1 Hình 3.1 Mô sâm Ngọc Linh úa vàng sau tuần để tủ tối Tuy nhiên, kết sau tuần để tủ tối để cảm ứng tạo rễ tơ thấy mẫu mô sâm Ngọc Linh nuôi cấy úa vàng Điều chứng tỏ việc chuyển gen thông qua vi khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 để tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh chưa thành công trình chuyển gen không phụ thuộc vào nồng độ chất kháng sinh mà phụ thuộc vào điều kiện biến nạp như: nồng độ khuẩn, thời gian biến nạp, thời gian đồng nuôi cấy 21 3.2.1 Ảnh hƣởng nồng độ khuẩn đến hiệu biến nạp Trong thí nghiệm này, tìm hiểu ảnh hưởng nồng độ khuẩn tới hiệu chuyển gen vào mô sâm Ngọc Linh thông qua A.rhizogenes ATCC 15834 Sử dụng khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 với OD600nm khác tiến hành chuyển gen vào mô sâm Ngọc Linh theo phương pháp mô tả Sau ngày thứ quan sát thu bảng 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ khuẩn A.rhizogenes đến sống sót mô sâm Ngọc Linh OD600nm 0,2 0,4 0,6 0,8 a Tổng số mô sâm Ngọc Linha 18 18 18 18 Số mô sống sótb 14 16 15 13 Tỷ lệ số mô sống sót so với tổng số mô (%) 77,78 88,89 83,33 72,21 Giá trị thể tổng số mô sâm Ngọc Linh nuôi cấy môi trường SH bổ sung carbe 200 mg/ml vanco 100 mg/ml Mỗi công thức nhắc lại lần (trên đĩa petri) b Số mô sống sót tương ứng với công thức thí nghiệm Biểu đồ 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ khuẩn đến số mô sâm Ngọc Linh sống sót sau ngày 22 Kết phân tích bảng 3.2 biểu đồ 3.2 cho thấy, nồng độ khuẩn ảnh hưởng tới khả sống sót mô sâm Ngọc Linh, nồng độ khác ảnh hưởng không giống tới khả này, cụ thể OD600nm đạt giá trị thấp (OD600nm = 0,2) tỷ lệ mô sống sót 77,78%, OD600nm đạt giá trị 0,4 0,6 cho tỷ lệ mô sống sót cao nhất, 88,89% 83,33% Tuy nhiên mật độ khuẩn cao (OD600nm = 0,8) lại gây bất lợi cho sống mô sâm Ngọc Linh Như vậy, mật độ khuẩn A.rhizogenes thích hợp cho biến nạp OD600nm = 0,4 0,6 3.2.2 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp Quy trình đồng nuôi cấy tiến hành theo quy trình nêu chương Sau biến nạp, thời gian đồng nuôi cấy thay đổi đĩa khác từ 1, ngày Sau tiến hành rửa khuẩn xác định hiệu chuyển gen sau tuần Hiệu chuyển gen xác định số mô sâm Ngọc Linh sống sót môi trường chọn lọc Bảng 3.3 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả sống sót mô sâm Ngọc Linh Thời gian đồng nuôi cấy (ngày) a Tổng số môa Số mô sống sótb 12 14 14 Tỷ lệ mô sống sót (%) 14,28 85,71 Giá trị thể tổng số mô sâm Ngọc Linh nuôi cấy môi trường SH bổ sung carbe 200 mg/ml + vanco 100 mg/ml Mỗi công thức nhắc lại lần (trên đĩa petri) b Số mô sống sót tương ứng với công thức thí nghiệm 23 Biểu đồ 3.3 Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả sống sót mô sâm Ngọc Linh Đồng nuôi cấy mô sâm Ngọc Linh dung dịch khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 (có OD600nm = 0,4) 1, ngày, sau tuần quan sát kết bảng 3.3 biểu đồ 3.3 Phân tích cho thấy, thời gian đồng nuôi cấy mẫu sâm Ngọc Linh với khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 có ảnh hưởng đến kết biến nạp vi khuẩn này, cụ thể thời gian đồng nuôi cấy ngày số mô sống sót thấp (14,28%), thời gian đồng nuôi cấy tăng lên ngày tỷ lệ mô sống sót cao nhiều đạt 85,71% Kết giải thích thời gian đồng nuôi cấy tăng lên tăng độ bám dính vi khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 với vết thương mẫu thực vật Như vậy, thời gian đồng nuôi cấy thích hợp để tăng hiệu chuyển gen nhờ A.rhizogenes ngày Để kiểm tra hiệu chuyển gen nhờ A.rhizogenes ATCC 15834, tiến hành nhuộm mẫu sâm Ngọc Linh sống sót phương pháp nhuộm X-gluc 24 3.3 Kiểm tra hiệu chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes vào mô sâm Ngọc linh phƣơng pháp nhuộm X-gluc Gen thị gus thường sử dụng để đánh giá hiệu quy trình chuyển gen trước tiến hành chuyển gen đích mong muốn Đây gen mã hóa enzyme β-glucuronidase, hydrolase xúc tác cho trình phân giải chất - bromo - - chloro - - indolyl - β - D - glucuronic acid (X – gluc) không màu chuyển thành màu xanh chàm đặc trưng dễ nhận biết bền vững [1] Hình 3.2 Cơ chế nhuộm mô tế bào X – gluc Trong tự nhiên β-glucuronidase không tồn thực vật, sản phẩm phản ứng độc không độc với tế bào vật chủ, phương pháp phân tích sản phẩm đơn giản, thuận tiện, rẻ tiền, nhạy đặc thù, gen gus coi gen thị hữu hiệu kỹ thuật chuyển gen thực vật Nhưng nhược điểm phương pháp tái sử dụng mẫu sau thực thí nghiệm 25 Trong nghiên cứu này, sử dụng vector pTN289 mang gen gus để chuyển gen thị gus vào mô sâm Ngọc Linh nhằm đánh giá hiệu quy trình chuyển gen vào mô sâm Ngọc Linh, kết hợp với điều kiện môi trường nuôi cấy sâm Ngọc Linh, nồng độ chất kháng sinh, nồng độ dịch khuẩn OD600nm = 0,4, thời gian đồng nuôi cấy ngày Kết mẫu sâm Ngọc Linh sống sót sử dụng để phân tích hiệu chuyển gen phương pháp nhuộm X-gluc Tiến hành nhuộm mẫu sâm Ngọc Linh theo phương pháp nhuộm X-gluc nêu, sau tuần mẫu nhuộm quan sát kính hiển vi soi nổi, mô sâm Ngọc Linh chuyển gen có nhuộm màu xanh đặc trưng gus Hình 3.3 Kết nhuộm gen gus X-gluc Như vậy, với quy trình chuyển gen thu mô sâm Ngọc Linh chuyển gen 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: - Phương pháp nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) - Tối ưu điều kiện (dịch khuẩn có OD600nm = 0,4, thời gian đồng nuôi cấy ngày, môi trường chọn lọc có bổ sung carbe 200 mg/ml vanco 100 mg/ml) để tăng hiệu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobactrium rhizogenes ATCC15834 để tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh Kiến nghị: - Tiếp tục có nghiên cứu hiệu chuyển gen dựa quy trình tìm thí nghiệm 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn (2010), Tài liệu lớp đào tạo ngắn hạn công nghệ sinh học “cây ngô biến đổi gen”, Hà Nội Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Giáo trình công nghệ chuyển gen động vật thực vật, Nxb Huế Nguyễn Huy Hoàng (2010), “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt vius H5N1 bước đầu chuyển gen HA1 tạo dòng rễ tơ chuyên gen thuốc lá” Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Trần Công Luận (2010), Công nghệ sinh học thực vật với tài nguyên thuốc Kỷ yếu hội thảo quốc tế tháng 4/2010 Nguyễn Văn Minh cs (2010), Báo cáo tổng kết đề tài: “Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phục vụ sức khỏe cộng đồng”, Học Viện Quân Y Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội Tiếng Anh Lin J.J, Assad-Garcia N, Kuo J (1995) “Plant hormone effect of antibiotics on the transformation effciency of plant tissues by Agrobacterium tumefaciens cells”, Plant science, 109, pp: 171-177 Chilton, M D., D A Tepfer, et al (1982), "Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells.", Nature 295: 432-434 N M Duc, R Kasai, N T Nham, K Yamasaki and O Tanaka, "Saponin composition of Vietnamese ginseng 28 and its significance from pharmacognostical points of view", Proceedings of "The First Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences: Pharmacy in Harmony", May 20-23, 1997, Bangkok, Thailand 10 N.T Thanh et al (2007), “Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv", VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 269-274 11 Pham NB (2009), “Production and secretion of recombinant sweet-tasting thaumatin from suspension cells and hairy roots of Nicotiana tabacum”, University of Heidelberg PhD Thesis Trang web tham khảo 12 http://vi.wikipedia.org/wiki/Sâm_Ngọc_Linh 13 http://www.vncreatures.net 14 http://www.ejbiotechnology.info/content/vol11/issue2/full/6 15 http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Quang-Nam-sam-Ngoc-Linh 29 PHỤ LỤC Thành phần loại môi trƣờng Môi Thành phần trƣờng 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l YMP đặc mannitol + g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = YMP 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O lỏng 10 g/l mannitol + g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl, pH = + 3,25 g/l Schenk & Hildebrandt + vitamin (5 mg/l nicotinic + SH lỏng 0,5 mg/l pyridoxin HCl + mg/l thiamine HCl + g/l myo –Inositol) + 30 g/l đường, pH = 5,8 3,25 g/l Schenk & Hildebrandt + vitamin (5 mg/l nicotinic + SH đặc 0,5 mg/l pyridoxin HCl + mg/l thiamine HCl + g/l myo –Inositol) + 30 g/l đường + 1,5 g/l gellan, pH = 5,8 ½ SH Tương tự SH nồng độ chất giảm nửa 30 Phụ lục ảnh Hình Mô sâm Ngọc Linh xanh môi trường MT1 sau tuần Hình Mô sâm Ngọc Linh xanh môi trường MT2 sau tuần Hình Mô sâm Ngọc Linh xanh môi trường MT3 sau tuần Hình Mô sâm Ngọc Linh úa vàng môi trường MT2 sau tuần Hình Mô sâm Ngọc Linh úa vàng môi trường MT3 sau tuần Hình Mô sâm Ngọc Linh môi trường có OD dịch khuẩn =0,2 31 Hình Mô sâm Ngọc Linh môi trường có OD dịch khuẩn = 0,4 Hình Mô sâm Ngọc Linh môi trường có OD dịch khuẩn = 0,6 Hình Mô sâm Ngọc Linh môi trường có OD dịch khuẩn = 0,8 32 [...]... sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh thông qua chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 3 Yêu cầu của đề tài - Sử dụng chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 biến nạp vào cây sâm Ngọc Linh - Xác định ảnh hưởng của một số chất kháng sinh và một số điều kiện... tới hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh 4 Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Cung cấp một phương pháp mới trong nghiên cứu sản xuất sinh khối sâm Ngọc Linh quy mô phòng thí nghiệm - Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp tài liệu nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố (chất kháng sinh, nồng độ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, thời gian đồng nuôi cấy ) tới khả năng tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh thông. .. và mô mang gen chuyển nạp Đối với phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tần số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn, các yếu tố liên quan đến thực vật và một số yếu tố khác Các yếu tố liên quan đến vi khuẩn bao gồm chủng vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt tính của gen vir khả năng xâm nhập vào các cây chủ và loại vector Các yếu tố liên quan đến thực... trình chuyển gen ở thực vật, để nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh đến hiệu quả chuyển gen vào sâm Ngọc Linh mà tại đó hiệu quả chuyển gen vẫn đạt được mà kháng sinh vẫn có tác dụng đối với vi khuẩn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại chất kháng sinh lên sự sinh trưởng và phát triển của mô sâm Ngọc Linh Thí nghiệm được thực hiện như sau: - Chọn những mẫu lá sâm Ngọc Linh. .. quả được chỉ ra ở hình 3.1 Hình 3.1 Mô sâm Ngọc Linh úa vàng sau 3 tuần để trong tủ tối Tuy nhiên, kết quả sau 3 tuần để trong tủ tối để cảm ứng tạo rễ tơ thì chúng tôi thấy các mẫu mô sâm Ngọc Linh được nuôi cấy đều úa vàng Điều đó chứng tỏ vi c chuyển gen thông qua vi khuẩn A .rhizogenes ATCC 15834 để tạo rễ tơ ở sâm Ngọc Linh chưa thành công và quá trình chuyển gen không chỉ phụ thuộc vào nồng độ của... biến nạp như: nồng độ khuẩn, thời gian biến nạp, thời gian đồng nuôi cấy 21 3.2.1 Ảnh hƣởng của nồng độ khuẩn đến hiệu quả biến nạp Trong thí nghiệm này, chúng tôi tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào mô sâm Ngọc Linh thông qua A .rhizogenes ATCC 15834 Sử dụng khuẩn A .rhizogenes ATCC 15834 với OD600nm khác nhau và tiến hành chuyển gen vào mô sâm Ngọc Linh theo phương pháp... ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó khi bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ [3] 13 Hình 1.4 Cấu trúc plasmid Ri 1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium rhizogens Sự thành công trong vi c tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh hoàn chỉnh cây chuyển gen. .. thay đổi ở các đĩa khác nhau từ 1, 2 ngày Sau đó chúng tôi tiến hành rửa khuẩn và xác định hiệu quả chuyển gen sau 1 tuần Hiệu quả chuyển gen được xác định bởi số mô sâm Ngọc Linh sống sót trên môi trường chọn lọc Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng sống sót của mô sâm Ngọc Linh Thời gian đồng nuôi cấy (ngày) 1 2 a Tổng số môa Số mô sống sótb 2 12 14 14 Tỷ lệ mô sống sót (% ) 14,28... Linh phải kể đến thành công của nhóm nghiên cứu của Học Vi n Quân Y trong nghiên cứu tạo sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh Nhóm nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh từ giai đoạn nuôi cấy tạo mô sẹo đến nuôi cấy trong Bioreator 15 lít Tại Vi t Nam, cũng đã có một số tác giả nghiên cứu thành công tạo rễ bất định từ mô sẹo và nhân sinh khối rễ đó để thu hoạch Nghiên cứu chỉ ra thời... máy đo pH, máy quang phổ… 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khử trùng mẫu sử dụng Javel, thuỷ ngân - Tối ưu môi trường nhân nhanh các đỉnh chồi 16 - Tối ưu loại môi trường nuôi cấy rễ tơ ở ở các đối tượng nghiên cứu - Tạo rễ tơ 2.2.2 Phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes * Nuôi khuẩn Agrobacterium rhizogenes - Cấy trải A .rhizogenes trên môi ... tài: Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Mục tiêu nghiên cứu Xác định ảnh hưởng số yếu tố. .. tài liệu nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố (chất kháng sinh, nồng độ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, thời gian đồng nuôi cấy ) tới khả tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh thông qua vi khuẩn A rhizogenes NỘI... chuyển gen tạo rễ tơ sâm Ngọc Linh thông qua chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 Yêu cầu đề tài - Sử dụng chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC15834 biến nạp vào sâm Ngọc Linh - Xác định ảnh hưởng