LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy, cô giáo tổ phương pháp giảng dạy, thầy cô khoa Sinh - KTNN, thầy cô giáo trường ĐHSP Hà Nội bạn sinh viên Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô Đinh Thị Kim Nhung tận tình giúp đỡ em trình hoàn thành khóa luận Do lần làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Hơn thời gian lực thân hạn chế, cố gắng chắn không tránh khỏi thiếu sót Em kính mong nhận đóng góp ý kiến thầy, cô giáo bạn sinh viên để khóa luận em hoàn thiện có nhiều ứng dụng thực tế Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Sinh viên Phạm Thị Ngọc Mai LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan viết luận văn thật Đây kết nghiên cứu riêng Tất số liệu thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, tài liệu chép hay bịa đặt, không trùng với kết công bố Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Sinh viên Phạm Thị Ngọc Mai MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài 3 Nội dung đề tài Ý nghĩa đề tài Điểm CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.2 Tổng quan vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon 1.4 Đặc điểm chế hình thành màng BC 10 1.4.1 Đặc điểm cấu trúc màng BC 10 1.4.2 Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose 11 1.5 Các đặc điểm trình lên men 12 1.5.1 Ảnh hưởng oxy 12 1.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 12 1.5.3 Ảnh hưởng hợp chất chứa cacbon, nitơ, photpho 13 1.5.4 Ảnh hưởng nồng acid acetic rượu etylic 13 1.6 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới Việt Nam 13 1.6.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới 13 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum Việt Nam 14 1.7 Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng BC điều trị bỏng 15 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu thiết bị hóa chất 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 16 2.1.4 Môi trường nghiên cứu 17 2.1.4.1 Môi trường giữ giống (môi trường bản) 17 2.1.4.2 Môi trường nhân giống 17 2.1.4.3 Môi trường lên men 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp vi sinh 18 2.2.1.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 18 2.2.1.2 Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum phương pháp nhuộm Gram 18 2.2.1.3 Phương pháp bảo quản chủng giống thạch nghiêng 19 2.2.1.4 Phương pháp hoạt hoá giống 19 2.2.1.5 Phương pháp lên men tạo màng 19 2.2.1.6 Phương pháp phát khả tổng hợp cellulose 19 2.2.2 Phương pháp toán học 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Khảo sát tạo màng chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 21 3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 22 3.2.1 Xác định hàm lượng acid acetic tạo thành chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 22 3.2.2 Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum kính hiển vi quang học 23 3.2.2.1 Hình thái tế bào học chủng vi khuẩn A.xylinum 23 3.2.2.2 Sinh trưởng môi trường thạch đĩa 24 3.2.2.3 Hoạt tính catalase 25 3.2.2.4 Khả sinh acid acetic vi khuẩn A.xylinum môi trường Blue bromphenol 25 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến trình sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 26 3.3.1 Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 26 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả tạo màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 29 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ vô tới khả tạo màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 32 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng pepton tới khả tạo màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 Kết luận 36 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A.xylinum : Acetobacter xylinum BC : Bacterial cellulose MT : Môi trường Cs : Cộng CS : Cellulose synthase PGM : Phosphoglucomutase PC : Plant cellulose GK : Glucokinase FK : Fructokinase DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn A.xylinum theo Frateur (1950) Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men Bảng 3.1 Khả tạo màng BC loại môi trường khác chủng vi khuẩn A.xylinum Bảng 3.2 Khảo sát khả tạo thành acid acetic chủng vi khuẩn A.xylinum Bảng 3.3 Xác định số lượng tế bào chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 Bảng 3.4 Sự biến thiên hàm lượng acid acetic chủng vi khuẩn A.xylinum qua thời gian nuôi cấy khác Bảng 3.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới độ dày màng BC Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới khối lượng tươi màng BC Bảng 3.7 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới khối lượng khô màng BC Bảng 3.8 Ảnh hưởng nitơ tới độ dày màng BC Bảng 3.9 Ảnh hưởng nitơ tới khối lượng màng BC Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn pepton nồng độ khác đến khối lượng màng BC chủng CH14 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nguồn pepton nồng độ khác đến khối lượng màng BC chủng BHN2 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sợi cellulose màng BC Hình 1.2 Sợi cellulose thực vật Hình 1.3 Sự hình thành dải ribbon màng BC A.xylinum Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp cellulose A.xylinum Hình 3.1 Chủng giống vi khuẩn A.xylinum Hình 3.2 Tế bào vi khuẩn A.xylinum Hình 3.3 Khuẩn lạc A.xylinum môi trường thạch đĩa Hình 3.4 Hoạt tính catalase chủng A.xylinum Hình 3.5 Chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic vi khuẩn A.xylinum Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn trình sinh trưởng chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tạo thành acid acetic dung dịch lên men chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ngày công nghệ sinh học dần trở thành ngành kĩ thuật chủ đạo nhiều quốc gia giới Gắn liền với công nghệ vi sinh với thành tựu lớn có ý nghĩa đời sống, ngành công nghiệp, y học Khó tìm lĩnh vực công nghệ sinh học mà lại không liên quan tới vi sinh vật Vi khuẩn Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae Vi khuẩn A.xylinum tìm thấy giấm, dịch rượu, nước ép hoa Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường dịch lỏng, chúng hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và được g ọi là màng sinh học Bacterial cellulose (BC), tập hợp tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose [26], [28] Cho đến , Acetobacter xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có khả sinh màng BC hiệu tự nhiên Loài vi khuẩn Gram âm sống hiếu khí bắt buộc , không sinh bào tử và là loài tiến bộ nhất vi khuẩn tí a Mỗi tế bào Acetobacter xylinum chuyển hóa tới 108 phân tử glucose vào phân tử cellulose giờ nên khả tổ ng hợp cellulose là rất lớn [6] Nét cấu trúc quan trọng chế kết tinh khác hẳn với cellulose (PC) thực vật chỗ ng không có sự kết hợp hemic ellulose, ligmin hay những thành phần phụ khác , mà cấu tạo từ sợi mic rofibril tạo nên những bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose với độ bền học cao , độ tinh khiết cao, khả thấm hút nước lớn , đường kí nh sợi nhỏ , khả polime hóa và trạng thái kết tinh lớn Ngoài , màng B C còn chứa nhiều dưỡng chất , acid hữu đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các chất ở tế bào và ngăn cản tác động tia UV…[18], [24] Nhờ những đặc tí nh độ c đáo mà màng BC được coi là nguồn polimer mới, giải pháp đường tìm nguồn nguyên liệu Nó thu hút ý nhiều nhà khoa học từ nửa sau của thế kỷ XIX và hiện đ ược ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: công nghiệp sản xuất giấy màng BC được dùng để sản xuất giấy điện tử chất lượng cao; công nghệ môi trường đã sử dụng màng BC làm màng phân tách để sử lý nước biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989; Jonas và Fonah, 1998) Ngoài ra, màng BC còn dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào lượng (Brown, 1989), làm sợi truyền quang, môi trường chất sin h học sử dụng cố đị nh protein thay cho sắc ký Trong công nghiệp thực phẩm sử dụng vi khuẩn A.xylinum nuôi môi trường nước dừa tạo màng BC để sản xuất th ạch dừa Trong lĩ nh vực mỹ phẩm và dược phẩm , lợi dụng những đặc tính quý báu màng BC thông thoáng , kháng khuẩn , tính tương đồng cấu trúc với sợi collagen da nên màng BC được coi là nguồn nguyên liệu quý giá dùng làm mặt lạ dưỡng da, da nhân tạo, dùng điều trị bỏng tổn thương da [9], [25] Ở Việt Nam nay, nhu cầu màng trị bỏng lớn, hầu hết phải nhập ngoại với giá thành cao Trong màng BC tự sản xuất nước từ nguồn nguyên liệu dễ kiếm rẻ tiền Nên chế tạo thành công màng BC từ vi khuẩn A.xylinum có ý nghĩa cao tình hình điều trị bỏng nước ta [27] Do đa dạng mặt ứng dụng với mong muốn tìm hiểu thêm vi khuẩn A.xylinum, trình tạo màng BC nhiều ứng dụng hữu ích nó, định chọn đề tài “Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả tạo màng BC” 10 3.2.2.3 Hoạt tính catalase Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc ta thấy có tượng sủi bọt khí Chứng tỏ oxy giải phóng ra, hay nói cách khác tác dụng enzyme catalase phân giải H2O2 theo phương trình: H2O2 catalase H2O + 1/2 O2 Hình 3.4 Hoạt tính catalase chủng A.xylinum 3.2.2.4 Khả sinh acid acetic vi khuẩn A.xylinum với chất chỉ thị màu Blue bromphenol Chất thị màu Blue bromphenol 0,04% vi khuẩn A.xylinum có khả chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic làm môi trường chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng Có thể giải thích sau: Blue bromphenol chất thị màu bản, thân phân tử có màu vàng, ion có màu lam Khi dung dịch có pH:4,23 tỷ số màu vàng màu lam 1, lúc nồng độ chúng nhau, dung dịch có màu lục Khi sử dụng môi trường nuôi cấy có pH> 4,6 số ion lam tăng, không nhìn thấy phân tử màu vàng, dung dịch có màu lam 33 Hình 3.5 Chuyển hóa rƣợu etylic thành acid acetic vi khuẩn A.xylinum 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến trình sinh trƣởng phát triển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 3.3.1 Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 Chúng xác định trình sinh trưởng chủng môi trường nhân giống số Môi trường khử trùng 0,5atm, thời gian để nguội 30 phút Sau khử trùng bổ sung thêm acid acetic rượu etylic Sau xác định số lượng tế bào thời điểm 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h Qua áp dụng phương pháp đếm tế bào buồng đếm hồng cầu thu kết bảng: 34 Bảng 3.3 Xác định số lƣợng tế bào chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 Mẫu A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 Mm δ Mm δ 8,00,03 0,02 100,20 0,04 24 17 0,53 0,05 23,00,15 0,03 48 51 1,50 1,32 53,00,33 0,57 72 83,0 1,70 2,15 78,50,00 0,00 96 97,04,0 1,56 90,03,07 1,15 120 103,05,00 6,30 95,02,50 4,70 144 90,04,70 3,30 80,03,42 5,70 168 703,30 5,12 72,03,34 6,50 Giờ Qua bảng dựa vào số liệu để xây dựng đồ thị biểu diễn trình sinh trưởng chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 120 100 80 A.xylinum BHN2 60 A.xylinum CH14 40 20 0 24 48 72 96 120 144 168 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn trình sinh trƣởng chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 35 Nhận xét: Nhìn vào đồ thị ta thấy rõ phát triển mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 theo đường cong có điểm cực đại 120h Tiếp tục nghiên cứu động thái phát triển mẫu tiến hành chuẩn độ dễ xác định hàm lượng acid acetic tạo thành qua thời điểm định Kết nghiên cứu xử lý trình bày bảng Bảng 3.4 Sự biến thiên hàm lƣợng acid acetic mẫu vi khuẩn Acetobacter xylinum qua thời gian nuôi cấy khác Lƣợng acid acetic tạo thành Ký hiệu 24 48 72 96 120 144 168 BHN2 0,2 0,3 0,7 1,3 1,7 1,9 1,5 1,0 CH14 0,3 0,5 0,9 1,4 1,8 2,0 1,7 1,1 Dựa vào bảng xây dựng đồ thị biểu diễn tạo thành lượng acid acetic mẫu qua thời gian nghiên cứu khác 2.5 1.5 A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 0.5 0 24 48 72 96 120 144 168 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn tạo thành acid acetic dịch lên men chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 36 Qua nghiên cứu theo dõi trình phát triển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 phân chia trình phát triển vi khuẩn Acetobacter xylinum thành thời kỳ phát triển gồm pha: pha tiềm phát, pha cấp số mũ, pha cân bằng, pha suy vong Từ 0-48h pha tiềm phát: Trong pha lượng acid acetic tăng chậm vi khuẩn Acetobacter xylinum phải làm quen với môi trường tăng sinh khối tế bào Từ 48-96h pha cấp số mũ: Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển mạnh Ở cuối pha lượng acid acetic tăng nhanh Từ 96-120h pha cân bằng: giai đoạn số lượng tế bào tăng chậm không tăng thiếu oxy hay bị nhiễm độc Ở cuối pha lượng acid acetic đạt giá trị cực đại Từ 125h trở pha suy vong : Số lượng tế bào giảm acid acetic ức chế ngược lại môi trường thiếu chất dinh dưỡng 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả tạo màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 Để kiểm tra ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả tạo màng chủng Acetobacter xylinum BHN2 CH14 sử dụng môi trường tiêu chuẩn có thay đổi nguồn cacbon (MT1, MT2, MT3, MT4, MT5) Nguồn Cacbon sử dụng: Fructose, Sorbitol, Sacarose, Glucose, Ethanol Sau 120h thu màng, kiểm tra độ ảnh hưởng cacbon tới độ dày màng Kết thí nghiệm dẫn bảng sau: 37 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới độ dày màng BC (mm) Nguồn A.xylinum BHN2 cacbon A.xylinum CH14 M δ ±m Cv M δ ±m Cv Fructose 1,40 0,015 0,087 1,07 1,20 0,05 0,003 0,4 Sorbitol 1,37 0,173 1,100 12,65 0,87 0,023 0,013 2,7 Sacarose 1,00 0,040 0,023 2,50 0,47 0,063 0,036 4,3 Glucose 2,50 0,010 0,006 2,00 2,47 0,023 0,013 4,9 Ethanol 1,53 2,735 1,580 77,50 1,43 0,363 0,209 8,2 (mm) Trong đó: M giá trị trung bình tổng thể ± m sai số đại diện trung bình cộng δ trung bình bình phương sai biệt Cv hệ số biến thiên trung bình (+) Số lần thí nghiệm: lần (n=3) Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khối lƣợng tƣơi màng (g/40ml) Nguồn A.xylinum BHN2 cacbon A.xylinum CH14 (g/40ml) n M δ ±m Cv n M δ ±m Cv Fructose 3,66 0,13 0,06 3,55 3,16 0,67 0,30 21,20 Sorbitol 3,45 0,87 0,39 24,58 2,96 0,58 0,26 19,59 Sacarose 3,55 0,19 0,09 5,35 2,34 0,30 0,13 10,56 Glucose 4,92 0,08 0,36 2,74 3,79 0,81 0,36 45,52 Ethanol 3,90 1,13 0,59 19,15 3,30 1,06 0,48 14,52 Trong đó: M giá trị trung bình tổng thể ± m sai số đại diện trung bình cộng δ trung bình bình phương sai biệt Cv hệ số biến thiên trung bình (+) n số lần thí nghiệm 38 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khối lƣợng khô màng (g/40ml) Nguồn A.xylinum BHN2 cacbon A.xylinum CH14 (g/40ml) n M δ ±m Cv n M δ ±m Cv Fructose 0,38 0,07 0,04 18,42 0,58 0,12 0,07 20,69 Sorbitol 0,56 0,13 0,08 23,21 0,46 0,42 0,24 91,30 Sacarose 0,18 0,02 0,01 11,11 0,28 0,09 0,05 32,14 Glucose 1,78 0,03 0,02 37,50 2,11 0,02 0,01 18,18 Ethanol 0,31 0,78 0,45 77,23 1,37 0,31 0,18 22,63 Trong đó: M giá trị trung bình tổng thể ± m sai số đại diện trung bình cộng δ trung bình bình phương sai biệt Cv hệ số biến thiên trung bình (+) Số lần thí nghiệm: lần (n=3) Kết nghiên cứu được trình bày bảng cho thấy chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2, CH14 có khả tạo màng tốt nguồn cacbon glucose saccarose Nguồn cacbon glucose cho màng tốt vì: glucose loại đường đơn giản (monosaccarit) nên vi khuẩn dễ hấp thụ liên kết với glucose để tạo thành lớp màng BC đồng Còn loại đường khác saccarose loại đường disaccarit nên chúng cần có thời gian chuyển hóa thành glucose, đồng thời saccarose thủy phân thành gốc α-glucozơ gốc β-fructozơ, loại đường đơn nên vi khuẩn dễ hấp thụ tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà chúng sử dụng loại đường phù hợp với Cùng với quan điểm trên, có số tác giả khác Đinh Thị Kim Nhung cộng cho glucose nguồn cacbon tốt 39 cellulose vi khuẩn hình thành trực tiếp từ đơn phân glucose Các loại đường khác phải trải qua giai đoạn chuyển hóa thành glucose bắt đầu giai đoạn hình thành cellulose [10], [11], [12] Vậy với nguồn cacbon glucose thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 lên men tạo màng 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ vô tới khả tạo màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 Để kiểm tra ảnh hưởng nitơ tới khả tạo màng BC chủng A.xylinum BHN2 CH14 sử dụng môi trường tiêu chuẩn có thay đổi nguồn nitơ Nguồn nitơ sử dụng là: + Nguồn nitơ hữu : pepton, cao nấm men + Nguồn nitơ vô : (NH4)2SO4 KNO3 Sau 168h thu màng, kiểm tra ảnh hưởng nguồn nitơ tới độ dày màng Kết thu sau: Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nitơ tới độ dày màng BC (mm) Nguồn Nitơ (mm) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 n1 n2 n3 nTB n1 n2 n3 nTB Pepton 2,0 1,7 2,0 1,9 2,0 1,8 1,9 1,9 (NH4)2SO4 1,0 1,0 0,9 0,97 0,7 1,0 0,9 0,87 KNO3 0,8 0,7 0,7 0,73 0,6 0,7 0,6 0,63 Cao nấm men 2,2 2,0 2,5 2,33 2,4 2,3 2,3 2,33 n1, n2, n3: Độ dày trung bình lần thí nghiệm 1,2,3 nTB: Độ dày trung bình màng lần thí nghiệm 40 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng nitơ tới khối lƣợng màng (g/40ml) Nguồn Nitơ (g/40ml) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 X1 X2 X3 XTB X1 X2 X3 XTB Pepton 3,20 2,22 2,86 2,36 2,64 2,14 3,34 2,38 (NH4)2SO4 1,74 1,60 1,35 1,56 1,52 1,80 1,92 1,75 KNO3 1,02 1,80 1,38 1,40 1,28 1,35 1,26 1,30 Cao nấm men 3,55 2,50 3,20 3,02 2,84 2,46 3,64 2,98 X1, X2, X3: Khối lượng màng lần thí nghiệm 1,2,3 XTB: Khối lượng màng lần thí nghiệm Nguồn nitơ ảnh hưởng gián tiếp tới khả tạo màng BC thông qua trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn A.xylinum Nitơ có mặt nhiều thành phần cấu tạo axit nucleic, photpholipit, có coenzyme quan trọng ATP, NADP, FDA, số vitamin tham gia vào trình tạo thành hemicelluloses Ở bảng ta thấy chủng sinh trưởng tốt môi trường nitơ hữu yếu môi trường nitơ vô 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng pepton tới khả tạo màng chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 CH14 Để kiểm tra ảnh hưởng nitơ tới khả tạo màng BC chủng A.xylinum BHN2 CH14 dùng môi trường tiêu chuẩn loại bỏ (NH4)2SO4 đồng thời có thay đổi nồng độ pepton từ 0,05 - 0,55% Sau ngày thu màng kiểm tra ảnh hưởng pepton nồng độ khác Kết bảng sau: 41 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nguồn pepton nồng độ khác đến khối lƣợng màng BC chủng CH14 (g/40ml) Nồng độ pepton 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 Z1 1,94 2,28 2,64 2,116 2,60 2,62 2,44 3,12 2,60 257 240 Z2 2,13 2,53 2,31 2,67 2,52 3,12 2,88 2,51 2,35 2,79 1,70 Z3 2,35 2,37 2,13 2,62 2,66 2,52 2,52 3,30 3,20 2,19 2,55 Z4 2,19 2,31 2,49 2,45 2,60 2,35 2,84 2,72 2,79 2,50 2,30 ZTB 2,15 2,37 2,39 2,48 2,60 2,65 2,67 2,91 2,74 2,51 2,24 (‰) Z1,Z2,Z3,Z4: Khối lượng màng lần thí nghiệm 1,2,3,4 ZTB: Khối lượng trung bình lần thí nghiệm Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nguồn pepton nồng độ khác đến khối lƣợng màng BC chủng BHN2 (g/40ml) Nồng độ pepton 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 Z1 1,11 1,85 1,56 1,76 2,44 2,22 2,52 2,16 2,37 2,19 2,14 Z2 1,04 1,53 1,89 1,80 1,94 2,30 2,34 3,14 2,63 1,98 1,88 Z3 1,13 1,25 1,70 1,81 2,10 2,13 2,39 3,02 1,96 1,94 1,24 ZTB 1,09 1,54 1,72 1,79 2,16 2,22 2,41 2,86 2,32 2,00 1,75 (‰) Z1,Z2,Z3: Khối lượng màng lần thí nghiệm 1,2,3 ZTB: Khối lượng trung bình lần thí nghiệm Ở bảng cho thấy chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 nồng độ pepton 0,4‰ cho màng khối lượng lớn nồng độ 0,05‰ cho màng khối lượng nhỏ Nồng độ pepton 0,05‰ - 0,35‰ ít không đáp ứng đủ nhu cầu nitơ cho tế bào vi khuẩn, lượng sinh khối BC sinh pepton từ 4,5‰ - 5,5‰ cao so với nhu cầu vi khuẩn, pepton dư 42 môi trường làm ức chế trình sinh trưởng tổng hợp màng BC chủng A.xylinum BHN2 CH14 Như nồng độ pepton thích hợp cho khả tạo màng BC chủng vi khuẩn BHN2 CH14 0,4‰ 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Sự hình thành màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 tốt điều kiện môi trường dinh dưỡng: Glucose: 20g/l MgSO4.7H2O: 3g/l (NH4)2SO4: 3g/l Nước dừa 1000ml KH2PO4: 2g/l 1.2 Vi khuẩn A.xylinum BHN2 gồm tế bào đứng riêng rẽ xếp thành chuỗi, không di động, bắt màu hồng fuchsin, tế bào bao bọc lớp màng nhày tạo thành váng dày 1.3 Số lượng tế bào chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 đạt cực đại 120h Nồng độ pepton thích hợp cho tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 CH14 0,4‰ Đề nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện môi trường điều kiện nuôi cấy để tiếp tục thu màng nhiều lần từ dịch lên men 2.2 Nghiên cứu phát triển hướng ứng dụng khác màng BC vào phục vụ thực tiễn đời sống 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Lân Dũng (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1- 2- 3, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998) Vi sinh vật học Nxb giáo dục, tr.149-150 [3] Nguyễn Thành Đạt (1999) Cơ sở vi sinh vật học Tập 1, Nxb ĐHSP Hà Nội, tr 52309 [4] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990) Thực hành vi sinh vật Nxb giáo dục, tr 17-92 [5] Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập vi sinh vật Nxb ĐHQG Hà Nội, tr 1-50 [6] Nguyễn Thúy Hương (2006) Chọn lọc dùng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn Luận án tiến sỹ khoa học sinh học, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh [7] Nguyễn Đức Lượng (2000) Công nghệ Vi sinh vật, tập 1- 2- 3, Nxb Đại học Quốc Gia TP HCM, tr 84 – 90 [8] Nguyễn Thị Nguyệt (2008) Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội [9] Đinh Thị Kim Nhung (1996) Nghiên cứu số đặc điểm vi khuẩn Acetobacter ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm Luận án PTS khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội 45 [10] Đinh Thị Kim Nhung (1999) Phân lập tuyển chọn nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter từ nguồn nguyên liệu khác Tạp chí sinh học năm 1999 tập 21, số 4, trang 49-53 [11] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thành Đạt (1994) Ảnh hưởng số nhân tố vô sản xuất giấm suất cao, phương pháp lên men chìm Tạp chí nông nghiệp [12] Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) Nghiên cứu đặc tính sinh học khả tạo màng Bacterial cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội TIẾNG ANH [13] Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) Polysaccharides and polyamides in the food industry, www.wiley vch pp 31-85 [14] Alina Krystynowicz et al (2005) Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture of Acetobacter xylinum, Acta biochimica polonica, Vol 52, pp 691-698 [15] Breed R.S., Murray E.G.D, Smith N.R (1957) Bergey’s manual of determinative bacteriology The Williams and Wilkins company, Baltimore [16] Buchanan R.E., Gibbons N.E (1974) Bergey’s manual of determinative bacteriology The Williams and Wilkins company, Baltimore [17] David.R.Boone et al (1980) Bergey's manual of systematic bacteriology p 41-81 [18] Diete Klem et al (2001), “Bacterial synthesis cellulose artificial blood vessels for microsurgery”, In Prog Polym Sci, Vol 26, pp 1561 – 1603 46 [19] Ebner H (1989) Process for the production of vinegar with more than 12G MS/100 graMS/100 ml acetic acid vol 67 N0 5, pp 471-481 [20] Embuscado M., Marks I., and Miller J., (1994), “Factors affecting the production of Acetobacter xylinum”, Food Hydrocollois, Vol 8, No 5, pp 407 – 418 [21] Elvie Escoro Brown (2007) Bacterial cellulose thermoplastic polymer nanocomposites Master of science in chemical engneering, Washington state university, Department of chemical engineer, pp.1-6 [22] Forng E.R., Anderson S.M., Canon R.E (1989) Synthetic medium for Acetobacter xylinum that can be used for isolation of auxotrophic mutants and study cellulose Biosynthesis Applied and Enviromene microbiology pp 1317 – 1319 [23] Frateur J (1950) Essai sur la systématique des Acétobacter La cellule, Vol 53, pp 278-398 [24] Heirich E (1987) Process of producing vinegar P patent N0 2090717 [25] Holt J.G., Krieg N.R (1984) Bergey’s manual of systematic bacteriology The Williams and Wilkins company, Baltimore [26] Wan, WK & Millon E (2005) Poly (vinyl alcohol) - bacterial cellulose nanocomposite V S Pat Appl Publ US 2005037082 Al, 16 [27] http://www.benhhoc.com/index.php?do=viewarticle&artid=848 [28] http://www.wattpad.com/?p=2 47 [...]... tiêu của đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A .xylinum có khả năng tạo màng BC 3 Nội dung của đề tài 3.1 Khảo sát sự tạo màng của 2 chủng vi khuẩn vi khuẩn A .xylinum BHN2 và CH14 3.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn A .xylinum BHN2 và CH14 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của 2 chủng vi khuẩn A .xylinum. .. A .xylinum BHN2 và CH14 4 Ý nghĩa của đề tài 4.1 Lý luận Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A .xylinum BHN2 và CH14 để tạo màng BC có chất lượng tốt trong thời gian ngắn 4.2 Thực tiễn Nghiên cứu góp phần tạo ra màng BC có chất lượng tốt với chi phí thấp để ứng dụng tạo màng trị bỏng 5 Điểm mới Nồng độ pepton thích hợp cho khả năng tạo màng BC ở 2 chủng vi khuẩn A .xylinum BHN2 và CH14 là 0,4‰... fructose tạo điều kiện thích hợp cho quá trình tổng hợp màng BC Dựa vào mục đích nghiên cứu chúng tôi quyết định chọn MT6 là môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng, vitamin… cho màng BC đạt chỉ tiêu cho những nghiên cứu tiếp theo 3.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 3.2.1 Xác định hàm lượng acid acetic tạo thành của các chủng vi khuẩn Acetobacter. .. Bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh Đại học Y Dược Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên men Màng có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời Năm 2010, nhóm nghiên cứu đề tài B.2010 - 18 - 69TĐ của Đinh Thị Kim Nhung cũng đang nghiên cứu thu nhận màng BC từ chủng vi khuẩn Acetobacter, ... Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trƣờng khác nhau của chủng vi khuẩn A .xylinum Đặc điểm MT3 MT4 MT5 MT6 Thời gian tạo màng 6 4 6 5 Tính chất của màng Khá dai Dai Dai Dai Màu sắc của màng Màu sáng Vàng ngà Vàng đậm Trắng trong 3,45 3,52 3,59 3,65 Khối lượng của màng Trong các môi trường có thành phần khác nhau, khả năng tạo màng của chủng A .xylinum cũng khác nhau: MT4 và MT5 là các môi trường có. .. luận có sự tương đồng về cấu trúc giữa màng BC với collagen [5], [8] 1.6.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum ở Vi t Nam Ở Vi t Nam, những nghiên cứu về A .xylinum và màng BC là khá mới mẻ Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính về cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng; sản xuất thạch dừa; những điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển và tạo màng. .. cấy có pH> 4,6 thì số ion lam tăng, không nhìn thấy các phân tử màu vàng, dung dịch có màu lam 33 Hình 3.5 Chuyển hóa rƣợu etylic thành acid acetic của vi khuẩn A .xylinum 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 3.3.1 Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum. .. Shiwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng môi trường nuôi cấy và sinh hóa của vi khuẩn Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất nằm trong giới hạn 30-350C Hai ông đã đi đến kết luận không thể có sự phân loại đồng nhất giữa các vi khuẩn Acetobacter [25], [26] 1.2 Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.2.1 Đặc điểm chung về vi khuẩn Acetobacter xylinum * Đặc điểm hình thái, tế bào học A .xylinum có dạng hình... thạch đĩa vi khuẩn A.xylium hình thành khuẩn lạc Hình 3.3 Khuẩn lạc A .xylinum trên môi trƣờng thạch đĩa Quan sát thấy khuẩn lạc có một số các đặc điểm sau: Một số khuẩn lạc có hình tròn, phẳng, có bề mặt mịn, trơn, nhẵn Một số có hình cầu, bóng như giọt mỡ với phần trung tâm dày, rắn, sẫm màu, phần xung quanh sáng hơn gần như không có màu Một số khác có kích thước lớn hơn, bề mặt xù xì, khô, mép khuẩn. .. phân loại của mình Năm 1934, theo nghiên cứu của hội nhà vi khuẩn học Hoa Kỳ các vi khuẩn acetic có khả năng sử dụng các hợp chất tương đối đơn giản của cacbon và nitơ nên đã được kết hợp vào họ Nitro Bacteriaceae Từ đó vi khuẩn giấm giữ tên Acetobacter [27] Năm 1936, Kenyver và Wanniel cùng với Staniel đã cho rằng dựa vào đặc tính của vi khuẩn acetic có hiện tượng ghép cực xoắn ở phần di động của chúng ... đề tài Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả tạo màng BC 10 Mục tiêu đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học chủng vi khuẩn A .xylinum có khả tạo màng BC Nội dung... Khảo sát tạo màng chủng vi khuẩn vi khuẩn A .xylinum BHN2 CH14 3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn A .xylinum BHN2 CH14 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến trình sinh. .. pháp toán học 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Khảo sát tạo màng chủng vi khuẩn A .xylinum BHN2 CH14 21 3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn A.xylinum