Trường ĐHSP HN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Các loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) tạo nên họ thực vật độc đáo tiếng vùng nhiệt đới Hiện nay, gỗ loài họ Dầu chiếm phần lớn thị trường gỗ giới nên rõ ràng chúng đóng vai trò quan trọng nhiều nước, nước châu Á đặc biệt nước Đông Nam Á Ngoài việc cung cấp gỗ, loài họ Dầu đem lại nhiều loại sản phẩm có giá trị khác phục vụ đời sống người tinh dầu thơm, nhựa mủ, mỡ bơ, camphor, tannin … Các chi lớn họ Dầu Shorea (khoảng 250 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) Vatical (65 loài) [11] Ở Việt Nam, họ Dầu có chi (Anisoptera, Hopea, Parashorea, Vatica, Dipterocarpus, Shorea), hầu hết loài địa đặc hữu Do giá trị thương mại nhu cầu người dân địa phương, loài họ Dầu bị khai thác mức [4] Ở Việt Nam, loài họ Dầu gặp khu bảo tồn quy hoạch năm qua, chiến tranh tàn phá, khai thác mức mà diện tích rừng nói chung rừng hỗn giao họ Dầu nói riêng bị suy giảm nghiêm trọng Theo viện Điều tra quy hoạch rừng (1995), thời điểm năm 1959, diện tích loài rừng có họ Dầu Đông Nam Bộ chiếm 49% diện tích toàn vùng, đến năm 1968 giảm xuống 36%, năm 1982 giảm 18% năm 1992 8% [10] Xét quy mô quốc gia, tài nguyên họ Dầu nói chung tài nguyên di truyền cuả loài họ Dầu nói riêng bị suy kiệt mạnh Hiện tại, số 40 loài thuộc họ Dầu có Việt Nam 33 loài bị đe doạ mức độ toàn cầu Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) loài phân bố hẹp, có Việt Nam Trung Quốc, gỗ bền, có nhiều giá trị sử dụng nên Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 2 gỗ Sao mặt quỷ bị khai thác mức, đứng trước nguy bị đe doạ tuyệt chủng cao, theo sách đỏ Việt Nam 2007, Táu Mặt Quỷ xếp cấp độ nguy cấp Vu A1c, d [2] Để bổ sung thông tin di truyền cho cở sở liệu loài thực vật quý Việt Nam góp phần nâng cao chất lượng công tác bảo tồn loài, tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái giải mã trình tự gen trnH-psbA loài Sao Mặt Quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) thu Khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang Mụ đ đề : Nghiên cứu thông tin phân bố, sinh thái, trạng, trình tự gen trnH-psbA giá trị tài nguyên loài Sao mặt quỷ Việt Nam, nhằm cung cấp sở liệu cho công tác phân loại, bảo tồn nghiên cứu có liên quan 3.1 n ọ n n ọ ết đề tài góp phần bổ sung vào tài liệu phân loại thực vật Việt Nam, cung cấp thông tin đặc điểm sinh học trình tự gen trnHpsbA loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) Việt Nam, phân biệt với Sao gai (Hopea chinensis Hand- azz) c ng công tác nghiên cứu loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) Việt Nam 3.2 n ti n: Ứng dụng vào sản xuất lâm nghiệp, sinh thái tài nguyên sinh vật Đ ểm c đề tài: Đây công trình nghiên cứu trình tự gen trnH-psbA loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) Việt Nam c ng giới Đã ôn bố báo khoa học tại: “Hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học trường ĐHSP toàn quốc lần thứ VI” Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN Bố cục c a khóa luận gồm: 29 trang, 15 ảnh, bảng chia thành phần sau: đầu (3 trang), chương (Tổng quan tài liệu: trang), chương (Đối tượng, phạm vi, thời gian phương pháp nghiên cứu: trang), chương ( ết nghiên cứu: 14 trang), kết luận kiến nghị (1 trang), tài liệu tham khảo (21 tài liệu), phụ lục Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu en (Vùn đệm) trnH-psbA Vùng đệm trnH-psbA nằm hệ gen lục lạp Vùng có kích thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân thành công cao (100% với loài nghiên cứu) ức độ khác biệt trình tự nucleotide loài 1,24% khác biệt bên loài thấp từ 0.00% - 0.08% [14] Trình tự trnH-psbA c ng công bố ngân hàng gen với nhiều loài khác thuộc thực vật Hạt trần, dương xỉ, rêu rêu tản (liverwort) Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen lục lạp vị trí gen trnH-psbA hệ gen lục lạp [21] Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 1.2 Lƣợc sử nghiên cứu 1.2.1 Trên giới Loài Sao mặt quỷ tác giả người Trung Quốc Wu Cheng Yi công bố (dựa vào mẫu vật thu P.Y ao thu ngày tháng năm 1954, núi Pingbian độ cao 800m, thuộc tỉnh Vân Nam, Trung Quốc) năm 1957 [20] với tên khoa học Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957 xếp họ Dầu (Dipterocarpaceae) Sau này, có số công trình nghiên cứu đề cập đến đặc điểm sinh học họ Dầu nói chung chi Hopea, như: Ashton (1982) [12]; Li Hsiwen-editor (1990) [15] cung cấp thông tin đặc điểm hình thái, phân bố, sinh học sinh thái loài Hopea mollissima C Y Wu, 1957 Trung Quốc (sau Xi-wen Li, Jie Li & Peter S Ashton (2007) [19] c ng đề cập đến công trình Thực vật chí Trung Quốc dịch tiếng Anh); Ashton, P (1998) [13] c ng đề cập đến loài Hopea mollissima C Y Wu, 1957 danh lục đỏ giới,… 1.2.2 Ở Việt Nam Ở Việt Nam, công trình đề cập đến chi Hopea loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) chủ yếu công trình phân loại hay giá trị tài nguyên, như: Nguyễn Tiến Bân (1997) [1] giới thiệu họ Dầu (Dipterocarpaceae) chi Hopea; Phạm Hoàng Hộ (1999) [8] cung cấp thông tin để nhận biết loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) Việt Nam; Nguyễn im Đào (2003) [6] chỉnh lý danh pháp, cung cấp thông tin phân bố, sinh thái giá trị tài nguyên loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) Việt Nam; Nguyễn Tiến Bân & nnk (2007) [2] cung cấp thông tin hình thái, phân loại đánh giá trạng bảo tồn loài Sách đỏ Việt Nam,… Như thấy rằng, công trình “Nghiên cứu số đặ đ ểm sinh học n Khóa luận tốt nghiệp en nH-psbA c a loài ặ ỷ (Hopea Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN mollissima C.Y.Wu, 1957) Việt Nam” công trình Việt Nam nghiên cứu trình tự gen trnH-psbA loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) Việt Nam c ng giới Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, THỜI GIAN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đố ƣợng nghiên cứu Mẫu vỏ loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) thu khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt Nam Hình 2.1 Sơ đồ vị trí thu mẫu 2.2 Đị đ ểm nghiên cứu Khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt Nam; Phòng tiêu thực vật phòng Hệ thống học phân tử Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 2.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng năm 2011 đến tháng 12 năm 2012 2.4 P ƣơn p áp n ên ứu 2.4.1 P ƣơn p áp phân loại hình thái học Chúng sử dụng mẫu tiêu thu khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang kết hợp với mẫu tiêu lưu giữ phòng tiêu thực vật - Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật (HN) Các mẫu tiêu sử dụng nghiên cứu gồm mẫu có số hiệu: 1171,3179, 5454 - phòng tiêu thực vật, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Các mẫu lá, cành, cuống, hoa quan sát soi kính hiển vi điện tử (với độ phóng đại 40X10, 4X10) phòng thực hành thực vật Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.4.2 P ƣơn p áp đọc trình t gen Để xác định trình tự gen trnH-psbA, sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR theo nguyên lý Sanger et al, 1977 [16], thực máy đọc trình tự ABI 3100 Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 2.4.2.1 Sơ đồ nghiên cứu Mẫu vỏ Sao mặt quỷ [17] [21] Tách chiết Thiết kế mồi ADN tổng số Cặp mồi PCR Vùng gen trnHpsbA Cặp mồi Giải trình tự Đọc kết trình tự gen Phân tích số liệu, so sánh với loài thuôc chi Sao, họ Dầu Hình 2.2 Sơ đồ bước thí nghiệm 2.4.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số ADN đại phân tử có kích thước lớn, nằm nhân tế bào muốn thu ADN ta phải dùng tác nhân học tác nhân hóa học Phương pháp tách gồm ba bước: Phá huỷ màng tế bào màng nhân; Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 10 loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, chủ yếu prôtêin; thu ADN tủa cồn Tách chiết ADN tổng số ADN tổng số tách chiết theo CTAB Xavier, 2000 [18] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam Quy trình tách thực theo bước sau: - Nghiền 00mg mẫu nitơ lỏng cối chày sứ thành bột mịn, chuyển vào ống epp ml - Bổ sung 00l đệm rửa (Tris-HCL 100mM, EDTA 5mM, Sodium metabisulfit 0,5, pH: 8.0, H2O…) vào ống epp ml, trộn tạo thành dịch đồng Li tâm 000 v/p phút, loại bỏ dịch - Bổ sung 600l đệm tách chiết (NaCl 1,5M , Tris-HCl 100mM, EDTA 20mM, CTAB 3, PVP 2%), đảo nhẹ tạo thành hỗn hợp đồng ủ 60 phút 65oC (đảo sau 10 phút) - Sau để nguội khoảng phút, để loại bỏ thành phần khác không mong muốn poly-saccarit ta bổ sung thêm 00l chloroform: isoamylacohol (:), đảo tạo thành dịch Ly tâm 000 v/p 0 phút o C, hút phần dịch cho vào ống epp ,5ml (bước thực lần) - ADN tủa cách cho Isopropanol lạnh vào mẫu theo tỷ lệ (Vmẫu: Visopropanol = :) đảo nhẹ để tủ -0oC  - ADN kết tủa rửa 00l cồn 0 Ly tâm 000 v/p 5 phút oC, loại cồn - Làm khô ADN Hoà tan ADN 00l nước khử ion - Loại bỏ ARN 2µl Rnase (10mg/ml), ủ 370C - Mẫu ADN bảo quản - 200C Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 20 3.1.2 Đặ đ ểm sinh học - sinh thái a đất ẩm, có tầng đất thịt dầy thoát nước; mọc rừng nhiệt đới, kín ẩm, thường xanh độ cao 100-1100 m, tập trung 400-800 m, tạo thành quần thể rừng ưu gần loại; thường mọc với Táu muối (Vatica diospyroides Simingt), Chắp trơn (Beilschmiedia laevis Allen), Lim (Erythrophleum fordii Oliv.), Vàng tâm [Manglietia dandyi (Gagnep) Dandy] ùa hoa tháng 6-9, mùa tháng 3-4 (năm sau) Tái sinh tán mẹ tốt, thiếu sáng lâu mạ bị chết hàng loạt [2,5,3] 3.1.3 P ân bố, ện trạng giá trị tài nguyên a Phân bố Ở Việt Nam, trước tìm thấy Lào Cai, Yên Bái, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà T nh [2,3] Hiện nay, khu vực tìm thấy khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt Nam Trên giới, tìm thấy Trung Quốc (Hải Nam) [2,6,9,5] b Hiện trạn ị n ên Gỗ bền nặng, màu xám vàng, bị mối mọt, dễ bị nứt; dùng xây dựng, đóng tầu, làm tà vẹt, Theo nghiên cứu, ước lượng tính toán số lượng quần thể loài Sao mặt quỷ bị suy giảm 20% 10 năm tới, mặt khác với mức độ khai thác ngày nhiều nơi cư trú ngày bị thu hẹp Sao mặt quỷ đưa vào Sách đỏ Việt Nam (2007) phân hạng nguy cấp VU A1c, d Hiện nay, Sao mặt quỷ bảo vệ Vườn quốc gia Pù Mát (Nghệ An), V Quang (Hà T nh) Bến En (Thanh Hóa) [2] Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 21 3.2 Trình t gen trnH-psbA c a loài Sao mặt quỷ Sau trình tiến hành tách chiết ADN, chạy PCR, đọc trình tự gen phân tích trình tự gen trnH-psbA loài Sao mặt quỷ thu khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang thu kết sau: 3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số ADN tổng số mẫu vỏ Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) thu khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang, Việt Nam tách chiết theo phương pháp CTAB (Xavier, 2000) hiệu chỉnh cho phù hợp với điều kiện mẫu khí hậu Việt Nam Kết tách chiết ADN tổng số sau kiểm tra điện di gel agarose 1% (được trình bày hình 3.7) Hình 3.7 Hình ảnh ADN tổng số Sao mặt quỷ (giếng 1-2: Sao mặt quỷ thu khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang.) Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 22 Kết điện di cho thấy xuất vạch ADN rõ ràng, sắc nét, tượng vạch bị phân tán thành dải dài, điều chứng tỏ mẫu ADN tổng số thu mẫu đạt chất lượng tốt, bị đứt gãy 3.2.2 Kết nhân gen trnH-psbA PCR Mẫu ADN tổng số sau thu được dùng làm khuôn để nhân đoạn gen trnH-psbA, sử dụng mồi xuôi - trnH ( 5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC) mồi ngược psbA (5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C) Phản ứng PCR chạy tổng thể tích 50µl, 30 chu kỳ Kết PCR sau đươc di kiểm tra gel Agarose 1% (Hình 3.8) Gen trnH-psbA vùng gen lục lạp chứng minh marker phân tử phù hợp cho nghiên cứu barcoding Trong nghiên cứu này, với cặp mồi trnH (5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC), psbA (5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C), đoạn gen trnH-psbA dài 300bp khuyếch đại Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% cho thấy xuất đoạn ADN có kích thước dự kiến, vạch rõ ràng, sắc nét, chứng tỏ sản phẩm PCR đặc hiệu Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 23 Hình 3.8 Kết thực phản ứng PCR khuếch đại gen trnH-psbA (M: marker; giếng 1-2: Sao mặt quỷ thu khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh Bắc Giang.) 3.2.3 Kết giải trình t gen trnH-psbA Để kiểm tra sản phẩm PCR có khuếch đại gen trnH-psbA hay không, sản phẩm PCR sau tinh kít tinh DNA extraction kit (QIAgen) gửi đọc trình tự máy ABI 3100 Kết giải trình tự gen trnH-psbA cho hình ảnh (các peaks) tương đối rõ ràng (hình 3.9), không bị nhiễu nền, chứng tỏ mẫu tinh tốt Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 24 Hình 3.9 Sơ đồ peaks trình tự gen trnH-psbA loài Sao mặt quỷ So sánh trình tự gen trnH-psbA Blast-NCBI chứng tỏ đoạn gen thu gen trnH-psbA loài Sao mặt quỷ 3.2.4 So sánh trình t nucleotide mẫu nghiên cứu với số loài khác thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) Hopea mollissima loài có phân bố hẹp, tìm thấy Việt Nam tỉnh Hải Nam Trung Quốc Những nghiên cứu cấp độ phân tử cho loài họ Dầu Việt Nam gần chưa có, không tìm trình tự gen trnH-psbA cho loài họ Dầu Việt Nam ngân hàng gen để so sánh Với mục tiêu bước đầu nghiên cứu làm quen với phương pháp phân tích mối quan hệ di truyền loài gần g i sở so sánh trình tự gen phần mềm chuyên dụng ega 5.01, lựa chọn loài họ Dầu có nguồn gốc từ Ấn Độ bao gồm (Hopea parviflora, Hopea racophloea, Shorea robusta loài nhóm Pteleopsis anisoptera (thuộc họ Combretaceae)) (dữ liệu lấy từ ngân hàng gen) (bảng 2.1) Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 25 ết so sánh trình tự nucleotide gen trnH-psbA loài lấy từ ngân hàng gen loài Hopea mollissima Việt Nam trình bày hình 3.10 Hình 3.10 So sánh trình tự vùng trnH-psbA Sao mặt qủy với số loài chi Sao số loài họ Dầu Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 26 3.2.5 Khoảng cách di truyền mẫu nghiên cứu Trong nghiên cứu này, khoảng cách di truyền mẫu so sánh tính toán theo liệu tổng hợp vùng nucleotide trnH-psbA dài 300 bp Trình tự ADN đoạn gen trnH-psbA loài lựa chọn (bảng 2.1) Sau so sánh, cắt bỏ phần không trùng khớp hai đầu lại đoạn ADN dài 262 nucleotit, phần trăm ba-zơ tương ứng thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Thành phần base (%) c a loài nghiên cứu T C A G Total H racoploea 38.0 15.1 32.2 14.7 245 H parviflora 38.4 14.3 33.1 14.3 245 H mollissima pA ab1 33.7 14.2 33.2 19.9 246 Pteleopsis 40.2 12.1 32.4 15.3 281 Shorea robusta 32.4 14.2 39.3 14.1 262 Các tính toán khoảng cách di truyền thực phần mềm MEGA 5.01 theo thông số mặc định mô hình hiệu chỉnh Kimura, khoảng cách di truyền tính theo đột biến hoán đổi (transition) nucleotide A - T G - C hoán vị (tranversion) nucleotide A - C A - G T - C T - G Dữ liệu ADN coi trình tự tương đồng (homologous) có ngh a loài tiến hóa từ tổ tiên Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN Bản 3.3 Hệ số s 27 ữ ặ ỷ l s sán 1.H racoploea 2.H parviflora 0,013 3.H mollissima pA ab1 0,074 0,079 4.Pteleopsis 0,273 0,261 0,369 5.Shorea robusta 0,670 0,653 0,749 0,718 ết phân tích khoảng cách di truyền cho thấy dự đoán, loài chi Sao (Hopea) có khoảng cách di truyền thấp hẳn cho với loài lại (dao động từ 0,013 đến 0,079), đặc biệt loài H racoploea H parviflora loài đặc hữu có nguồn gộc từ Ấn Độ nên khoảng cách di truyền chúng thấp hẳn (0,013), so với loài Hopea mollissima Việt Nam 0,074 với H racoploea 0,079 với H parviflora 3.2.6 Xây d ng phát sinh ch ng loại Từ kết sai khác trình tự nucleotide vùng trnH-psbA Sao mặt quỷ với loài dùng so sánh, sơ đồ mối quan hệ di truyền loài thiết lập (hình 3.11) Sơ đồ thể mối quan hệ loài chi Hopea gần g i hơn, thể nhóm chung nhóm Hai loài lại Pteleopsis anisoptera Shorea robusta loài khác hẳn chi nên thể nhánh riêng biệt Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 28 Hình 3.11 Mối quan hệ di truyền Sao mặt quỷ với số loài khác sở phân tích trình tự vùng trnH - psbA phương pháp Maximum Parismony Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình tiến hành nghiên cứu, thu kết sau: 1.1 Đã xây dựng mô tả loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu, 1957) Việt Nam, kèm theo số thông tin phân bố, sinh thái giá trị tài nguyên, phân biệt với Sao gai 1.2 Nhân thành công vùng gen trnH – psbA loài Sao mặt quỷ Việt Nam 1.3 Đã giải mã phân tích trình tự gen trnH – psbA loài Sao mặt quỷ Việt Nam 1.4 Xây dựng mối quan hệ di truyền loài Sao mặt quỷ với số loài khác thuộc chi Sao, họ Dầu K ến n ị Hiện nay, loài họ Dầu (Dipterocarpaceae) nói chung Sao mặt quỷ nói riêng đứng trước nguy bị đe dọa tuyệt chủng nghiêm trọng Cho nên, cần có nghiên cứu sâu đặc tính sinh học c ng dẫn liệu di truyền cấp độ quần thể loài, phục vụ công tác bảo tồn phục hồi hiệu quả, góp phần bảo vệ đa dạng sinh học phát triển kinh tế Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Tiến Bân & nnk (2007), Sách đỏ Việt Nam, Phần II (Thực vật), tr 174-175, Nxb KHTN & CN, Hà Nội Bộ khoa học Công nghệ Việt Nam (2007), Danh lục đỏ Việt Nam, Nxb KHTN & CN, Hà Nội Lê Mộng Chân, Lê Thị Huyên (2000), Thực vật rừng, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Võ Văn Chi – Trần Hợp, Cây cỏ có ích Việt Nam, tập 2, Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn im Đào (2003), Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập 2, tr.333, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2008), Sinh học phân tử, tr 136, Nxb Giáo dục, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập 1, tr.439, NXB Trẻ, Tp Hồ Chí Minh Viện điều tra quy hoạch rừng (1978), Cây gỗ rừng Việt Nam, tập 4, tr.130, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội 10 Viện điều tra quy hoạch rừng, Bộ Lâm nghiệp (1995), Công trình Khoa học kỹ thuật điều tra quy hoạch rừng (1991-1995), Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 31 Tài liệu tiếng Anh 11 Ashton, P.S (2004) Dipterocarpaceae In Tree Flora of Sabah and Sarawak, Volum Soepadmo, E Saw, L G and Chung, R C K eds Government of Malaysia, Kuala Lumpur, Malaysia ISBN 983-2181-59-3 12 Ashton, PS Dipterocarpaceae Flora Malesiana 1982 Series I, 92: 237-552 13 Ashton, P (1998) Hopea mollissima In: IUCN 2011 IUCN Red List of Threatened Species Version 2011.2 14 Lecomte, H (Resdacteur) (1923), Flore Generale de I’ Indo-Chin, Vol 2, pp 479-496 15 Li Hsiwen – editor (1990), “Dipterocarpaceae”, Flora Reipublicae Popularis Sinicae, pp 114-131, Published by Science Press (Beijing) 16 Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R., 1977: DNA sequencing with chain - terminating inhibitors, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74 (12): 5463 - 5468 17 S Indrioko, O Gailing, R Finkeldey (2006) "Molecular phylogeny of Dipterocarpaceae in Indonesia based on chloroplast DNA" Plant Systematics and Evolution 261 (1-4): 99–115 18 Xavier J L., (2000): A rapit method for plant genomic instability using Unanchored - Microsatellite primer Plant Molecular Biology Reporter 18: 283a - 283g 19 Xi-wen Li, Jie Li & Peter S Ashton (2007), "Dipterocarpaceae" in Flora of China Vol 13 Page 48 Published by Science Press (Beijing) and Missouri Botanical Garden Press Tài liệu internet 20 http://tropicos.org/ 21 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/7/61/figure/f1?highres=y Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN MỤC LỤC MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài ục đích đề tài ngh a khoa học thực tiễn Điểm đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu en (Vùn đệm) trnH-psbA 1.2 Lƣợc sử nghiên cứu 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Ở Việt Nam CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, THỜI GIAN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đố ƣợng nghiên cứu 2.2 Đị đ ểm nghiên cứu 2.3 Thời gian nghiên cứu 2.4 P ƣơn p áp n ên ứu 2.4.1 Phương pháp phân loại hình thái học 2.4.2 Phương pháp đọc trình tự gen 2.4.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.4.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 2.4.2.3 Phương pháp điện di ADN gel agarose 11 2.4.2.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 2.4.2.5 Phương pháp đọc trình tự nucleotide 13 2.4.3 Phương pháp phân tích số liệu 14 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 3.1 Đặ đ ểm loài Sao mặt quỷ Việt Nam 15 3.1.1 Đặc điểm hình thái 15 3.1.2 Đặc điểm sinh học - sinh thái 20 3.1.3 Phân bố, trạng giá trị tài nguyên 20 3.2 Trình t gen trnH-psbA c a loài Sao mặt quỷ 21 3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số 21 3.2.2 Kết nhân gen trnH-psbA PCR 22 3.2.3 Kết giải trình tự gen trnH-psbA 23 3.2.4 So sánh trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu với số loài khác thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) 24 3.2 Khoảng cách di truyền mẫu nghiên cứu 26 Xây dựng phát sinh chủng loại 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN PHỤ LỤC Các công trình nghiên l ên n đến khóa luận Báo cáo tại: “Hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học trường ĐHSP toàn quốc lần thứ VI” Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung [...]... c c peaks c a trình tự gen trnH- psbA c a loài Sao mặt quỷ So sánh trình tự gen trnH- psbA trên Blast-NCBI đã chứng tỏ đoạn gen thu đư c chính là gen trnH- psbA c a loài Sao mặt quỷ 3.2.4 So sánh trình t nucleotide mẫu nghiên c u với một số loài kh c thu c họ Dầu (Dipterocarpaceae) Hopea mollissima là loài c phân bố hẹp, hiện mới chỉ tìm th y ở Việt Nam và tỉnh Hải Nam Trung Qu c Những nghiên c u ở c p... sinh thái và giá trị tài nguyên, phân biệt với Sao hòn gai 1.2 Nhân bản thành c ng vùng gen trnH – psbA c a loài Sao mặt quỷ ở Việt Nam 1.3 Đã giải mã và phân tích đư c trình tự gen trnH – psbA c a loài Sao mặt quỷ ở Việt Nam 1.4 X y dựng đư c mối quan hệ di truyền c a loài Sao mặt quỷ với một số loài kh c thu c chi Sao, họ Dầu 2 K ến n ị Hiện nay, c c loài c y họ Dầu (Dipterocarpaceae) nói chung và. .. tiến hành tách chiết ADN, ch y PCR, đ c trình tự gen và phân tích trình tự gen trnH- psbA c a loài Sao mặt quỷ thu đư c tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh B c Giang chúng tôi đã thu đư c c c kết quả sau: 3.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số ADN tổng số c a 2 mẫu vỏ c y Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C. Y. Wu, 1957) thu tại khu bảo tồn thiên nhiên Khe Rỗ, tỉnh B c Giang, Việt Nam đư c tách chiết theo... c nh quả phát triển c hình m c ngư c, c 9-10 x 2,5-3,5 cm, c 10-14 đôi gân rõ Tuy nhiên trong th c tế, vi c nhận dạng ra loài c y n y c ng gặp nhiều khó khăn bởi Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C. Y. Wu, 1957) và Sao hòn gai (Hopea chinensis Hand - Mazz) là hai loài c rất nhiều đ c điểm giống nhau Qua quá trình tiến hành nghiên c u, chúng tôi đã tìm ra đư c một số đ c điểm riêng biệt c a Sao mặt quỷ. .. tử cho c c loài họ Dầu ở Việt Nam gần như là chưa c , do v y chúng tôi đã không tìm đư c trình tự gen trnH- psbA cho loài họ Dầu nào ở Việt Nam trên ngân hàng gen để so sánh Với m c tiêu bư c đầu nghiên c u và làm quen với phương pháp phân tích mối quan hệ di truyền c a c c loài gần g i trên c sở so sánh trình tự gen bằng phần mềm chuyên dụng ega 5.01, chúng tôi đã lựa chọn 3 loài họ Dầu c nguồn g c. .. ATG CAT GAA CGT AAT GCT C) Phản ứng PCR đư c ch y trong tổng thể tích 50µl, 30 chu kỳ Kết quả PCR sau đó đư c đư c di kiểm tra trên gel Agarose 1% (Hình 3.8) Gen trnH- psbA là vùng gen l c lạp đã đư c chứng minh là marker phân tử phù hợp cho c c nghiên c u barcoding Trong nghiên c u n y, với c p mồi trnH (5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC), psbA (5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C) , 1 đoạn gen trnH- psbA. .. tự vùng trnH- psbA c a Sao mặt q y với một số loài trong chi Sao và một số loài trong họ Dầu Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 2 26 3.2.5 Khoảng c ch di truyền giữa c c mẫu nghiên c u Trong nghiên c u n y, khoảng c ch di truyền giữa 5 mẫu so sánh đã đư c tính toán theo bộ dữ liệu tổng hợp c a vùng nucleotide trnH- psbA dài 300 bp Trình tự ADN đoạn gen trnH- psbA c a 5 loài lựa chọn (bảng... 3.2 Trình t gen trnH- psbA c a loài Sao mặt quỷ 21 3.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 21 3.2.2 Kết quả nhân bản gen trnH- psbA bằng PCR 22 3.2.3 Kết quả giải trình tự gen trnH- psbA 23 3.2.4 So sánh trình tự nucleotide mẫu nghiên c u với một số loài kh c thu c họ Dầu (Dipterocarpaceae) 24 3.2 5 Khoảng c ch di truyền giữa c c mẫu nghiên c u 26 3 2 6 X y dựng c y phát... truyền c a Sao mặt quỷ với 1 số loài kh c trên c sở phân tích trình tự vùng trnH - psbA bằng phương pháp Maximum Parismony Khóa luận tốt nghiệp Tạ Thị Nhung Trường ĐHSP HN 2 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận Qua quá trình tiến hành nghiên c u, chúng tôi đã thu đư c c c kết quả chính như sau: 1.1 Đã x y dựng đư c bản mô tả loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C. Y. Wu, 1957) ở Việt Nam, kèm theo một số. .. ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) do ary ullis phát minh ra năm 1985 Phương pháp PCR dựa vào đ c tính c a enzym ADN polymerase c khả năng x c t c tổng hợp mạch ADN mới trên mạch khuôn, với sự c mặt c a mồi (mồi xuôi và mồi ngư c) - C ch tiến hành: Nhân bản vùng gen trnH- psbA bằng kỹ thuật PCR với c p mồi trnHpsbA + Mồi xuôi trn-H: 5’- CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC +Mồi ngư c psbA: ... trình tự gen trnH-psbA loài Sao mặt quỷ So sánh trình tự gen trnH-psbA Blast-NCBI chứng tỏ đoạn gen thu gen trnH-psbA loài Sao mặt quỷ 3.2.4 So sánh trình t nucleotide mẫu nghiên cứu với số loài. .. công vùng gen trnH – psbA loài Sao mặt quỷ Việt Nam 1.3 Đã giải mã phân tích trình tự gen trnH – psbA loài Sao mặt quỷ Việt Nam 1.4 Xây dựng mối quan hệ di truyền loài Sao mặt quỷ với số loài khác... liệu loài thực vật quý Việt Nam góp phần nâng cao chất lượng công tác bảo tồn loài, tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái giải mã trình tự gen trnH-psbA loài Sao Mặt Quỷ (Hopea mollissima