Khóa luận tốt nghiệp o n h h IC , ế P S TS T ịK ế N , , ThS GVC N K T , TS.GVC P P ế ,T S N , , , , N , 2013 S ị Khóa luận tốt nghiệp o n h I CA ĐOA T Kế T Nế h , ị N , Sinh viên T ịT 2013 Khóa luận tốt nghiệp o n h h ỤC ỤC L L D D ế Ở ĐẦU CHƯ G 1: TỔ G QUA TÀI IỆU 1.1 V trí v đặc điểm phân loại Gluconacetobacter sinh giới 1.1.1 V trí phân loại c a Gluconacetobacter sinh giới 1.1.2 ặc điểm phân loại c a sinh giới 1.2 Nhu cầu dinh dưỡng c a vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2.1 Ảnh hưởng c a nguồn cacbon 1.2.2 Nhu cầu nitơ c a vi sinh vật 1.2.3 H m lượng ethanol dung d ch lên men 10 1.3 ặc điểm v tính chất hình th nh m ng Bacterrial cellulose 10 1.3.1 ặc điểm cấu trúc c a m ng Bacterrial cellulose 10 1.3.2 Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose 12 1.3.3 ính chất c a m ng Bacteria cellulose 13 1.4 ình hình nghiên cứu m ng BC từ Acetobacter x linum 14 1.4.1 ình hình nghiên cứu Acetobacter x linum giới 14 1.4.2 ình hình nghiên cứu Acetobacter x linum Việt Nam 15 CHƯ 2.1 G 2: PHƯ G PHÁP GHIÊ CỨU 18 18 2.1.1 ối tượng nghiên cứu 18 2.1.2.Hoá chất 18 2.1.3 hiết b , dụng cụ 18 2.1.4 Môi trường nghiên cứu 19 Khóa luận tốt nghiệp o n h h 2.1.4.1.Môi trường phân lập giống (M 1) 19 2.1.4.2 Môi trường nhân giống (M 2) 19 2.1.4.3 Môi trường nghiên cứu khả tạo m ng 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 20 2.2.2 Phân biệt tế b o vi khuẩn phương pháp nhuộm Gram 20 2.2.3 Phương pháp bảo quản ch ng giống thạch nghiêng 21 2.2.4 Phương pháp hoạt hóa giống 21 2.2.5 Phương pháp lên men tạo m ng 21 2.2.6 Phương pháp thống kê v xử lý kết 21 2.2.7 Quá trình xử lí m ng BC từ Gluconacetobacter 22 2.2.8 Phương pháp nghiên cứu khả ngăn cản vi sinh vật c a m ng BC tạo từ ch ng Gluconacetobacter 24 2.2.8.1 Nghiên cứu khả ngăn cản vi khuẩn c a m ng 24 2.2.8.2 Nghiên cứu khả ngăn cản nấm men c a m ng 25 2.2.8.3 Nghiên cứu khả ngăn cản xạ khuẩn c a m ng BC 25 2.2.8.4 Nghiên cứu khả ngăn cản nấm mốc c a m ng 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 Kế Gluconacetobacter BHN2 27 3.2 Quá trình xử lí m ng 29 3 Kế 29 Kế 31 Kế 33 Kế 35 37 N KẾT LUẬN VÀ KIẾN N 37 Ị 39 Khóa luận tốt nghiệp o n h DA H 11 ỤC H ế h H Gluconacetobacter 12 Gluconacetobacter 13 K Gluconacetobacter 14 S 15 S Gluconacetobacter Hình 1.6 Con 17 M , ị 38 T ĩ 38 T ĩ Hình M 10 M 10 M 10 M 11 ị 11 ị 12 ị 12 13 ị ị ị ngày Hình 3.13 ngày 14 ị BC sau ngày 14 ị ngày Khóa luận tốt nghiệp DA H ỤC B o n h h G 21 11 ặ theo Frateur (1950) Gluconacetobacter Khóa luận tốt nghiệp o n h h CÁC TỪ VIẾT TẮT BC : Bacterial cellulose PMG : Phosphoglucomutase UGP : Glucose-1- phosphat uridylytransferase 1PFK : Fructose-1-phosphate kinase Fru-6-P : Fructose-6-phosphate Glc-1-p : Glucose-1-phosphate UDPGlc : Uridine diphosphoglucose GK : Glucokinase FPB : Fructose-1,6-biphosphate phosphatase G6PDH : Glucose-6-phosphatse dehydrogenase PGI : Phosphoglucoisomerase PTS : Fru-bi-P : Fructose-1,6-bi- Phosphate Glc-6-P : Glucose-6- phosphate PGA : Phosphogluconic acid FK : Fructokinase CS : Cellulose synthanse CFU : Colony Forming Unit UV : Ultra violet VSV :V : f Khóa luận tốt nghiệp o n h h Ở ĐẦU ý chọn đề tài M ( Bacterial cellulose; Biocellulose; ặ ) ( ế ế β-1,4 glucorit) cellulose v ỗ: : ế … hemicellulose, ẻ , , , ặ [14] T ế Bacterial cellulose ĩ : , ặ ế ế dùng , , ĩ ế ặ , ế ị , ỞV N , , ế ặ , ỉ ế ỉ T V N T Gluconacetobacter BHN2 có màng BC ị [10] , S , Gluconacetobacter BHN2 ị ị Khóa luận tốt nghiệp o n h N ặ ế ị ế h ặ D ẽ , ặ ẹ ế ế N , ế Staphylococcus, ế ế Pseudomonas, E.coli… ị ị V ế ị ế ế ch tìm màng BC ĩ : “Nghiên cứu khả ngăn cản vi sinh vật c a m ng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 ” ục tiêu nghiên cứu đề tài 2.1 Nghiên Gluconacetobacter BHN2 22 2.3 N Gluconacetobacter BHN2 Điểm đề tài 3.1 ị 32 ế Gluconacetobacter BHN2 ội dung nghiên cứu Gluconacetobacter 4.1 N BHN2 4.2 L P Khóa luận tốt nghiệp o n h h 4.3 N Gluconacetobacter BHN2 4.4 N Gluconacetobacter BHN2 4.5 N Gluconacetobacter BHN2 4.6 Nghiên Gluconacetobacter BHN2 Ý nghĩa 5.1 L ừ Gluconacetobacter BHN2 5.2 N Gluconacetobacter BHN2 Khóa luận tốt nghiệp 38 o n h M ĩ Q ĩ , vi Gluconacetobacter BHN2 lên me ẽ ị ( ẽ ( , , , ặ 38 ) S ( 38 ) S ), ẵ , Nế ế thu , , có màu , Kế BC Gluconacetobacter ế BHN2 N ặ , K h , T N Q T ị , N T ịT ặ V [10], [11], ị , Gluconacetobacter BHN2 , ế ị Gluconacetobacter BHN2 28 Khóa luận tốt nghiệp o n h h 3.2 Quá trình xử lí màng Mà ( ), , ặ ế : , Q 227 … ế Hình 3.9 Màng BC M :  L  L ế  ỉ ( màng : 7) 3.3 Kết xử lí màng M nghiê ế ị ặ M ỉ 29 , ẹ, Khóa luận tốt nghiệp o n h h Kế 10 , , : 10 M 10 10 S M , ( ặ M ( 10 ) 10 ) , : ế 30 Khóa luận tốt nghiệp o n h , , ẻ ẻ , , ế ị N , Q , ế ặ , V h T ịN T [12], N N T ịT V L ,N [10] , , ặ , ế ị ị ị S ặ , ế 3.4 Kết nghiên cứu khả n ng ng n cản vi khuẩn màng BC ế ng BC ị tr 2281 11 ế ị 31 11 , : Khóa luận tốt nghiệp Hình 11 o n h ị T h không ị MPA, 30 0C, ị Q ị ( 11 ) ặ n , ặ Từ ế , , ( ị ặ 11 ), ế ị ( 11 ) Kế ế T ịN N T ịT V [10] , L ,N ế 32 V T [12], Khóa luận tốt nghiệp S o n h h ế , ế 3.5 Kết nghiên cứu khả n ng ng n cản nấm men màng BC , S N ế M ị , 25 - 300 , 3-5 ế ế ế ị Kế 3.12 a, b: Hình 3.12 a ị 33 ị Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.12 Q o n h ị ặ ( h g BC ị , 12 ) , ị Q ( ị 12 ) ặ , ặ Từ ế , ị ặ trang , , ị ế ( Kế ặ 12 ) ế T ịN 34 L ,N V T [12], Khóa luận tốt nghiệp N T ịT V o n h [10] , , h , ế S ế , ế ế 3.6 Kết nghiên cứu khả n ng cản xạ khuẩn màng BC ế S – KTNN T V N ị ặ , , ế ị , 4-5 28 - 300 ế ị , ế 13 , b: Hình 3.13.a , ị 35 Khóa luận tốt nghiệp 13 Q 13 ), ( o n h ị h sau ngày ị ặ , Q ị ( , ặ 13 ) , ặ Kế ế T ịN N T ịT V [10], V T , ị S , L ,N ế ế ế 36 [12], Khóa luận tốt nghiệp o n h h 3.7 ghiên cứu khả n ng ng n cản nấm mốc màng BC ế ế ch ị ị 2-3 ế ị , 14 14 ế 14 , : ị sau ngày BC ị ngày 37 , Khóa luận tốt nghiệp o n h ị Quan sát ( 14 ) ặ Q ( h , ị 14 ) , ặ , ặ Từ ế , , ị ( N 14 ) , , , , , ị ị , , , ế qu T ị N D Kế L ,N V T [12], N , ị 38 T ịT V [10] Khóa luận tốt nghiệp o n h KẾT UẬ VÀ KIẾ h GHỊ Kết luận 1.1 Gluconacetobacter BHN2 , ị , 1.2 M ế , ế ẻ , ị 1.3 M : , , , ế Đề nghị T ế ị ế sau: +X +Tế ĩ 39 Khóa luận tốt nghiệp o n h TÀI IỆU THA h KH O TIẾ G VIỆT N L học, D (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 1- 2- 3, Nxb N L D ỹ , N Q sinh vật học N N , T N ế , P V T (1998) Vi 149-150 (1999) Cơ sở vi sinh vật học T 1, N SP N , tr 52-55, 62-102, 185-309 N T , N D T hực h nh vi sinh vật N 5.V T ị M , V T (1990) , tr 17-34, 63-74, 89-92 (2001) hực tập vi sinh vật N Q N , tr 1-50 N T (2006) Chọn lọc dùng Acetobac x linum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với qu mô lớn L ế Q N L , M (2000) Công nghệ Vi sinh vật, Q N ỹ TP T ị N 1- 2- 3, Nxb M (2008) Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter x linum cho m ng Bacterial cellulose l m mặt nạ dưỡng da, L T ỹ T ịK SP N N (1996) Nghiên cứu số đặc điểm c a vi khuẩn Acetobacter v ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm L T ị K 10 PTS N SP , T N (2009) N Q , N N T ị T V Acetobacter xylinum ị B 40 Báo cáo khoa học Khóa luận tốt nghiệp 11 N o n h T ịT V h (2009) Nghiên cứu đặc tính sinh học v khả tạo m ng Bacterial cellulose c a vi khuẩn Acetobacter x linum phân lập từ số nguồn ngu ên liệu Việt Nam, L T ỹ , T ị 12 L ,N SP V T N (2006) Nghiên cứu đặc tính m ng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter x linum sử dụng l m m ng tr bỏng 13 P T ịN ,N ị T ịD ,N Acetobacter xylinum, T ặ 14 361, T T (1999) hống kê v ứng dụng N , tr 214- 267 15 L T ế T (1997), Bỏng - kiến thức chu ên ng nh, Nxb y N , tr 21 -109, 206 -209, 297 - 310, 453 - 482 16 P T ( 2000), Di tru ền học, Nxb TIẾ G A H 17 Nguyen Van Thanh et al (2005), Study on preparation bacterial cellulose from Acetobacter xylinum for treating burns and wounds, Proceedings of the 4-th Indochina Conf on Pharmaceutical Sciences, Nov 10-13, Univ of Medicine and Pharmacy of HCM City, Vietnam 18.Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) Polysaccharides and polyamides in the food industry, www.wiley vch.pp 31-85 19 Hoyer, Alina Krystynowicz, Marianna Turkiewicz, Stanislaw Bielecki, Sokolnicki, Emilia Klemenska, Nodes, Aleksander Masny, Ebner, Heirich, Andrzej Plucienniczak (2005) Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in submerged culture ofAcetobacter xylinum, Acta biochimica polonica, Vol 52, pp 691698 41 Khóa luận tốt nghiệp o n h h 20.Breed R.S., Murray E.G.D, Smith N.R (1957) Berge ’s manual of determinative bacteriology The Williams and Wilkins company, Baltimore 21 Bergey H, John G Holt (1992), Berge ’s manual of dererminativa bacteriology Wolters kluwer health, p.71- 84 22 Hong - Jon Son, Moon - Su Heo, Yong- Gyun Kim, Sang- Joon Lee (2001) Optimization of fermetation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp A9 in shaking cultures Vol 33, Biotechnol Appl Biochem, p 1-5 23 Brown R.M (1999), Cellulose structure and biosynthesis, Pure Appl Chem 24 Stanislw Bielecki, Alina Krystynowicz, Marianna Turkyewicz (1981) Bactrerial cellulose, Institute of TechnicalvBiochemmistry, Technical University of Ldz 25 Wan, WK & Millon E (2005) Poly – bacterial cellulose nanocomposite V S Pat Appl Publ US 2005037082 Al, 16 26 Frateur J (1950) Essai sur la systesmatique des Acetobacter La cellule, Vol 53, pp 278-398 27 Jean-Luc Wertz,Olivier Bédué,Jean P Mercier (2010), Cellulose Science and Technology, EPFL Press 28 http://www.rcub.bg.ac.yu/~todorom/tutorials/rad15.html 42 [...]... pháp nghiên cứu khả năng ngăn cản vi sinh vật của màng BC tạo ra từ chủng Gluconacetobacter Kế ỗ T ịK (S M) ỗ ừ 18,9 – 104nm, N ế ế 2.2.8.1 Nghiên cứu khả năng ngăn cản vi khuẩn của màng ế ị V : ị heo T Gluconacetobacter S N 2 ế + 1: : 1 ị ặ mô ặ 30 + ặ , ồ tex 2: ở ế , ị ẽ tam giác vô trùng + 3: 0,1 ị N ở 300C, 5 24 Khóa luận tốt nghiệp o n h h 2.2.8.2 Nghiên cứu khả năng ngăn cản nấm men của màng. .. 2.2.8.3 Nghiên cứu khả năng ngăn cản xạ khuẩn của màng BC : + 1: 1 ị ặ ặ , 30 + 2: ặ ồ tex ị ở ế , ị ẽ bình tam giác vô trùng + 3: 0,1 ị am giác trang N ở 28 - 30 0C, 5 không 25 Khóa luận tốt nghiệp o n h h 2.2.8.4 Nghiên cứu khả năng ngăn cản nấm mốc của màng ế ị ị N 2 T S : ế 1: + 1 ặ , : ặ ồ 30 tex + 2: ở ặ + ế 3: , ị 0,1 ẽ ị N ở 370 , 3 26 Khóa luận tốt nghiệp o n h CHƯ KẾT QU h G3 GHIÊ CỨU VÀ TH... Kết quả quá trình lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 Gluconacetobacter BHN2 m Vi Sinh, Khoa sinh – KTNN, T N 2 S Gluconacetobacter BHN2 T ịK T N Q ,N T ịT V [10], [11] V , ế ị Gluconacetobacter BHN2 N T ịT , V [11] ĩ , ở phòng (28 – 30oC), sau 4 - 5 ở Hình 3.8 ế Kế 38 , , : T 38 ĩ 2 T ĩ 27 4 N , Khóa luận tốt nghiệp 38 o n h M ĩ 4 Q ĩ , vi Gluconacetobacter BHN2 lên me ẽ ị ( ẽ ( , ,... , [12] ặ ế 17 ế ị 17M ặ ế ị (Ảnh: Vi n Bỏng Quốc gia) ặ , , ặ ặ 16 ế Khóa luận tốt nghiệp o n h h ồ ị ỉởV K ị ế ị N ế ị ồ ế , ừ ẵ ặ ế 17 , … Khóa luận tốt nghiệp o n h CHƯ PHƯ h G2 G PHÁP GHIÊ CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Gluconacetobacter BHN2 ừ V S N , Khoa sinh – KTNN, T S 2 2.1.2 Hoá chất ế Trong quá , ế , ở Vi Sinh, Khoa sinh – KTNN, T S : Nguồ N 2 c T.W... 1) ế N poly ặ z ỗ f 1.3.3 Tính chất của màng Bacteria cellulose T ôn Vi sinh- T ịN D , T L ,N Y D M ừ 90% - 0% M 13 T V T ồ , Khóa luận tốt nghiệp o n h ị 2, 4, 6, 12 h S 90% ế 19,84 %, , ẽ ặ ế [12] ế ặ , K ế, ẽ th 12 ế ị ị , K 5 ASTMD 882 – 02 ỹ T ừ 25 ± 30 , 55 ± 5% ở 4 0C ị 24 tro 1.4 Tình hình nghiên cứu màng BC từ Acetobacter xylinum 1.4.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới ,... S ( 38 ) S 3 8 ), ẵ , Nế ế thu ồ , , có màu 6 , Kế BC ừ Gluconacetobacter ế BHN2 trên N 4 ặ , K h , T N Q T ị , N T ịT ặ V [10], [11], ị , Gluconacetobacter BHN2 , ế ị Gluconacetobacter BHN2 28 Khóa luận tốt nghiệp o n h h 3.2 Quá trình xử lí màng ừ Mà ( ), , ặ ế ồ : , Q 227 … ế 2 Hình 3.9 Màng BC M :  L ừ  L ế  ỉ ( màng : 7) 3.3 Kết quả xử lí màng M nghiê ế ị ặ M ỉ 29 , ẹ, ... nghiên cứu 2.1.4.1 Môi trƣờng phân lập giống (MT1) Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g CaCO3 : 10g Agar: 20g Pepton: Pepton 4g A : 2% ( R N ) : 2% ( ) : 1000 2.1.4.2 Môi trƣờng nhân giống cơ bản (MT2) Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g Pepton: 4g A R N h : 2% ( ) : 2% ( ) : 1000 19 ồ , … Khóa luận tốt nghiệp o n h h 2.1.4.3 Môi trƣờng nghiên cứu khả năng tạo. .. năng tạo màng Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH2PO4: 2 g MgSO4.7H2O: 2 g Pepton: 4g A : 2% ( R ) : 2% ( N : 500 N : 500 ) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc L 1 ị 24 ồ ồ micropipet hút 0,1ml pha loãng ở 30 o ĩ N ( FU) 1 ĩ , , ừ 5 ị ế ế ị N  Ai T N:T FU 1000 1 Vi 10 n 1 Ai: S CaCO3 Vi : T 10-n ĩ ị ỗ ĩ -n 10 : L 2.2.2 Phân biệt tế bào vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhuộm Gram V ,... Gluconacetobacter trong sinh giới 1.1.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới R 1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Frateur 1950… T “Gluconacetobacter” Y Acetobacter K (1984) ế sinh acetic khác nhau Gluconacetobacter Pseudomonasdales, N Acetobacter, h Pseudomonasdaceae, Schizomycetes [21] , ồ Gluconacetobacte V , 1.1.2 Đặc điểm phân loại của trong sinh giới * Đặc... Gluconacetobacter theo Frateur (1950) TT Đặc điểm Hiện tượng Kết quả Oxy 1 hoá ethanol thành acid 1 + 0,04% ừ acetic 2 + 2 S3 3 4 ở Hoyer 4 dihydroxyaceton 5 5 T _ ế ị 6 K7 cellulose + sau lên men V O3 acid K6 7 S K + _ V + 8 Khóa luận tốt nghiệp o n h h 1.2 hu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2.1 Ảnh hƣởng của nguồn cacbon ở ồ , ồ ị ế : ồ , ặ ừ N ị ở ị T ị , ế ỉ 1100 30 ở 0,5 Từ ( T ) ồ , 0,5- ... Phương pháp nghiên cứu khả ngăn cản vi sinh vật c a m ng BC tạo từ ch ng Gluconacetobacter 24 2.2.8.1 Nghiên cứu khả ngăn cản vi khuẩn c a m ng 24 2.2.8.2 Nghiên cứu khả ngăn cản nấm men... 2.2.8 Phƣơng pháp nghiên cứu khả ngăn cản vi sinh vật màng BC tạo từ chủng Gluconacetobacter Kế ỗ T ịK (S M) ỗ 18,9 – 104nm, N ế ế 2.2.8.1 Nghiên cứu khả ngăn cản vi khuẩn màng ế ị V : ị heo... màng BC ĩ : Nghiên cứu khả ngăn cản vi sinh vật c a m ng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 ” ục tiêu nghiên cứu đề tài 2.1 Nghiên Gluconacetobacter BHN2 22 2.3 N Gluconacetobacter BHN2 Điểm