BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH PHẠM MỸ NGỌC TÌM HIỂU VAI TRỊ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.) OHWI ET OHASHI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS BÙI TRANG VIỆT TS LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS TS Bùi Trang Việt, Trưởng Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Tp HCM, người giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm quý báu, tận tình hướng dẫn em suốt q trình học tập hồn chỉnh luận văn TS Lê Thị Trung truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn TS Trần Thanh Hương, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Th.S Phan Ngô Hoang, Th.S Trịnh Cẩm Tú tận tình giúp đỡ đóng góp ý kiến chân tình, kinh nghiệm bổ ích cho luận văn em Quý thầy cô hội đồng dành thời gian đọc đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn em Ban chủ nhiệm tồn thể q thầy khoa Sinh Học trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh Các bạn cao học khoá 19, CN Hồ Thị Mỹ Linh (Chun viên Phịng thí nghiệm khoa Sinh trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh) động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Em Như (Cao học khoá 18 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh) em Huyên, Phước, Quỳnh sinh viên năm thứ IV thực đề tài Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, hỗ trợ tơi việc tìm kiếm sách tài liệu tham khảo MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 7T T MỤC LỤC 7T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7T 7T MỞ ĐẦU 7T T CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7T T 1.1 Giới thiệu Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 7T T 1.1.1 Phân loại học T 7T 1.1.2 Mô tả đặc điểm hình thái Đậu T T 1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật 7T 7T 1.2.1 Khái niệm T 7T 1.2.2 Mô phân sinh chồi T 7T 1.2.2.1 Đặc điểm T 7T 1.2.2.2 Cấu trúc mô phân sinh chồi 10 T T 1.2.2.3 Sự phân bào mô phân sinh chồi 11 T T 1.2.3 Hoạt động mô phân sinh chồi 11 T T 1.2.3.1 Trong giai đoạn nảy mầm hạt tăng trưởng mầm 11 T T 1.2.3.2 Trong giai đoạn sinh sản trưởng thành 12 T T 1.2.4 Sự phát triển chồi 12 T 7T 1.2.4.1 Sự phát triển chồi nách 12 T 7T 1.2.4.2 Sự hình thành phát triển chồi bất định 13 T T 1.3 Vai trò auxin chất điều hồ tăng trưởng thực vật phát sinh hình 7T thái chồi 14 7T 1.3.1 Vai trò auxin 14 T 7T 1.3.2 Vai trò cytokinin 16 T 7T 1.3.3 Sự phối hợp auxin cytokinin phát sinh chồi 17 T T 1.3.3.1 Tăng sinh chồi bên 17 T 7T 1.3.3.3 Sự hình thành rễ 18 T 7T CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 7T T 2.1.Vật liệu 19 7T T 2.2.Phương pháp 19 7T 7T 2.2.1.Quan sát tăng trưởng Đậu đỏ Vigna angularis vườn 19 T T 2.2.2.Khử trùng hạt 19 T 7T 2.2.3 Ảnh hưởng AIA theo nồng độ lên tăng trưởng khúc cắt chồi T Đậu đỏ 19 T 2.2.4 Ảnh hưởng AIA mg/l theo thời gian lên tăng trưởng khúc cắt T chồi Đậu đỏ 20 7T 2.2.5 Ảnh hưởng auxin cytokinin lên phát sinh hình thái chồi 21 T T 2.2.5.1 Ảnh hưởng BA riêng rẽ lên phát triển khúc cắt chồi Đậu T đỏ in vitro ngày tuổi 21 7T 2.2.5.2 Ảnh hưởng kết hợp AIA mg/l BA theo thời gian lên tăng T sinh tăng trưởng chồi 21 7T 2.2.6 Quan sát hình thái giải phẫu 22 T T 2.2.7 Đo cường độ quang hợp cường độ hô hấp 23 T T 2.2.8 Đo hoạt tính chất điều hồ tăng trưởng thực vật 23 T T 2.2.9.Xử lý số liệu 23 T 7T CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 7T T 3.1 Kết 24 7T T 3.1.1 Quan sát tăng trưởng vườn 24 T T 3.1.2 Nuôi cấy hạt để tạo in vitro môi trường MS 26 T T 3.1.3 Sự phát triển chồi mầm 26 T 7T 3.1.3.1 Trong giai đoạn hạt nảy mầm 26 T T 3.1.3.2 Sự thay đổi trọng lượng tươi trọng lượng khô theo thời gian từ giai đoạn T hạt đến mầm ngày tuổi 27 7T 3.1.3.3 Ảnh hưởng chất điều hoà tăng trưởng thực vật lên phát triển chồi T mầm 28 T 3.1.4 Các biến đổi hình thái mơ phân sinh chồi trình phát sinh chồi T T 30 3.1.5 Sự phát triển chồi nách từ in vitro vườn 33 T T 3.1.5.1 Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp in vitro 33 T T 3.1.5.2 Sự phát triển chồi nách từ nách in vitro vườn 33 T T 3.1.6 Quan sát hình thái giải phẫu chồi nách 36 T T 3.1.7 Ảnh hưởng AIA theo nồng độ lên tăng trưởng khúc cắt chồi T Đậu đỏ 45 T 3.1.8 Ảnh hưởng AIA mg/l theo thời gian lên tăng trưởng khúc cắt T chồi Đậu đỏ 47 7T 3.1.8.1 Khảo sát tăng trưởng chồi mơi trường AIA mg/l sau chuyển T sang mơi trưịng MS theo thời gian 47 T 3.1.8.2 Khảo sát tăng trưởng chồi mơi trường MS sau chuyển sang mơi T trưòng AIA mg/l theo thời gian 51 T 3.1.9 Sự thay đổi cường độ quang hợp hô hấp chồi sau xử lý AIA T mg/l theo thời gian 54 7T 3.1.10 Hoạt tính chất điều hồ tăng trưởng thực vật nội sinh trình tăng T trưởng chồi 55 7T 3.1.11 Ảnh hưởng auxin cytokinin lên phát sinh hình thái chồi 57 T T 3.1.11.1 Ảnh hưởng BA riêng rẽ lên phát triển khúc cắt chồi T Đậu đỏ in vitro ngày tuổi 57 7T 3.1.11.2 Ảnh hưởng kết hợp AIA mg/l với BA theo thời gian lên T tăng sinh tăng trưởng chồi 62 7T 3.2 Thảo luận 7T 7T CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 12 7T T 4.1 Kết luận 12 7T T 4.2 Đề nghị 12 7T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 14 7T 7T PHỤ LỤC 18 7T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abcisic acid AIA : Acetic indol acid BA : Benzyl Adenin CĐHTTTV : Chất điều hoà tăng trưởng thực vật G1 : ( G : gap, khoảng gián đoạn) - Tế bào trạng thái trưởng thành R R GA R R : Giberelic acid IBA : Indol Butyric acid MS : Murashige Skoog TLT : Trọng lượng tươi TLK : Trọng lượng khô cs : cộng MỞ ĐẦU Phát sinh hình thái sở cho việc vi nhân giống thực vật mà quan tâm Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới phát sinh liên tục mô quan thực vật nhờ hoạt động nhóm tế bào gốc khơng phân hóa (undifferentiated stem cells) gọi mơ phân sinh Hơn nữa, kiểm sốt hoạt động mơ phân sinh chồi mức phân tử tác động chất điều hòa tăng trưởng thực vật, đặc biệt auxin cytokinin, gần nghiên cứu nhiều tác giả Do đó, đề tài tập trung nghiên cứu Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi, thông dụng Việt Nam, để hiểu hoạt động mô phân sinh chồi tác động auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin Việc khảo sát ảnh hưởng auxin lên phát sinh hình thái chồi Đậu thực khía cạnh hình thái học sinh lý học, qua bổ sung thêm kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng vi nhân giống giảng dạy CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1.1.1 Phân loại học Cây Đậu dùng đề tài Đậu đỏ, phân loại sau: Ngành : Lớp : Bộ : Họ : Chi : Loài : 5T Magnoliophyta 7T Magnoliopsida 7T Fabales 7T T T Fabaceae 7T T T Vigna 5T Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hồng 5T Hộ, 1999) 1.1.2 Mơ tả đặc điểm hình thái Đậu Cây Đậu đỏ (adzuki bean) loại cỏ niên, đứng hay leo Cây có chiều cao trung bình 50-80 cm, có cạnh lơng dài Cuống dài 10-12 cm, có lơng Lá thường có hình xoan, đầu trịn, có thùy, dài 6-8 cm có lơng Mỗi gồm 4-5 cặp gân phụ Hoa mọc thành chùm nách lá, dài 3-10 cm, có màu vàng nhạt Đài hoa có ngắn Trái dài 6-10 cm rộng 0,7 cm, có chót nhọn Hột dài 6-10 mm, có màu nâu Bộ nhiễm sắc thể Đậu đỏ 2n = 22 Cây Đậu đỏ trồng nhiều Nha Trang, Sài Gịn,… trồng để lấy hạt Cơng dụng Đậu đỏ : rễ dùng để đắp trị sưng; hột giúp lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ, 1999) 1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật Ảnh 1.1 Cây Đậu đỏ Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (http://www.botanyvn.com/cnt.a sp?param=news&newsid=934) 1.2.1 Khái niệm Sự phát sinh hình thái thực vật phát triển thể thực vật theo thời gian để hồn tất chu trình phát triển Phát triển thay đổi tế bào, mô hay quan từ lúc khởi đầu lúc trưởng thành Phát sinh hình thái thực vật bao gồm phát sinh mô (histogenesis), phát sinh quan (organogenesis) phát sinh phôi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000) Trong phát sinh quan in vitro, tạo quan theo đường phát sinh quan trực tiếp (các quan tạo trực tiếp từ mẫu cấy) hay gián tiếp (mẫu cấy tạo mơ sẹo, sau quan tạo từ mô sẹo này) (Bùi Trang Việt, 2000) Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai trình sau: - Sự điều hoà hướng kéo dài tế bào - Sự kiểm sốt vị trí hướng mặt phẳng phân chia tế bào Chính kiểu tăng trưởng tế bào riêng rẽ định hình thái quan thể thực vật (Bùi Trang Việt, 2000) Sự phát triển mức tế bào thể qua hai chuỗi thay đổi: tăng trưởng (phân chia kéo dài tế bào) phân hóa tế bào Ở thực vật, phân chia kéo dài tế bào tách biệt theo không gian thời gian (Bùi Trang Việt, 2000) Mơn phát sinh hình thái mơn học nhằm mơ tả biến đổi hình thái cấu trúc, phân tích yếu tố nội sinh ngoại sinh, nghiên cứu điều hịa hình thái thực vật Sự phát sinh hình thái liên quan cách tồn diện đến nguồn gốc phát triển hình thái thực vật Do đó, khơng có kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ chứng minh tất khía cạnh Những kỹ thuật nhiều lĩnh vực khác mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học di truyền học giúp tìm hiểu tượng phát sinh hình thái Trong số phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp dùng nhiều là: - Cắt bỏ vùng lân cận mô phân sinh theo dõi biến đổi phát triển sau - Nuôi cấy in vitro điều kiện vô trùng có kiểm sốt phần tách rời thể thực vật Trong thí nghiệm in vitro, nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành kích thước q nhỏ bé loại mơ cấy, nên áp dụng chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh cách hữu hiệu để tìm hiểu phát sinh hình thái thực vật (Bùi Trang Việt, 2000) Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới phát sinh liên tục mô quan thực vật nhờ hoạt động nhóm tế bào gốc khơng phân hóa (undifferentiated stem cells) gọi mô phân sinh (Vernoux cs, 2010) 1.2.2 Mô phân sinh chồi 1.2.2.1 Đặc điểm sau vài lần cấy chuyền để chồi phát triển tốt (Edwin,1996) Do chuyển cụm chồi 20 ngày tuổi nuôi cấy môi trường BA mg/l sang môi trường MS có gia tăng chiều dài cụm chồi Nếu tiếp tục nuôi cấy môi trường cũ (BA mg/l) tăng trưởng chồi chậm (Ảnh 3.47) - Ảnh hưởng kết hợp AIA mg/l với BA theo nồng độ theo thời gian lên tăng sinh tăng trưởng chồi khúc cắt chồi Các chất điều hoà tăng trưởng thực vật, đặc biệt auxin cytokinin có vai trị quan trọng q trình sinh trưởng phát triển thực vật Sự phối hợp CĐHTTTV khảo sát theo nồng độ theo thời gian phối hợp dẫn đến kết khác * Xử lý AIA mg/l kết hợp BA 14 ngày Cytokinin có hiệu việc tạo chồi trực tiếp hay gián tiếp Tác dụng cytokinin hiệu phối hợp với auxin tỉ lệ thích hợp Cytokinin hỗ trợ auxin tăng trưởng, đồng thời có đối kháng auxin (giúp tạo rễ) cytokinin (giúp tạo chồi); cân hai hormon yếu tố kiểm soát phát triển (Bùi Trang Việt, 2000) Khi bổ sung AIA mg/l vào mơi trường BA 0,5 mg/l khơng có xuất chồi nách Ngược lại, BA 0,5 mg/l (khơng bổ sung AIA mg/l) giúp chồì nách xuất (2,00 ± 0,19) Auxin ức chế tích luỹ cytokinin (Gaspar cs, 1996; Bùi Trang Việt, 2000) Như vậy, có mặt auxin ảnh hưởng đến tích lũy cytokinin mơi trường ni cấy, hoạt tính BA yếu hơn, nên số lượng chồi giảm theo không xuất chồi Mặt khác, xử lý trực tiếp lên chồi nách, auxin khơng kìm hãm tăng trưởng chồi nách (Brown cs, 1979) Auxin không trực tiếp cản tăng trưởng chồi mà phải di chuyển xuống thân kìm hãm phát triển chồi nách theo chế gián tiếp mà chắn có liên quan đến tín hiệu điều hòa khác cytokinin, nhiệt độ, ánh sáng, tình trạng sinh lý cây,… (Leyser, 2003) Tuy nhiên, có mơi trường AIA mg/l kết hợp BA mg/l giúp chồi nách xuất (1,80 ± 0,25) tỷ lệ cytokinin/ auxin nghiêng cytokinin, số lượng chồi nách giảm so với môi trường tăng sinh chồi bổ sung BA nồng độ (2,26 ± 0,18) (hình 3.35) Nồng độ cytokinin cao (0,5-10 mg/l) thường cản hay làm trì hỗn hình thành rễ, đồng thời cản tăng trưởng rễ, làm giảm hiệu kích thích tạo rễ auxin (Staden cs, 2008) BA kích thích phân chia tế bào Do mơi trường có BA xuất khối mô sẹo gốc khúc cắt chồi mà không thấy xuất rễ (Bảng 3.9) Khi BA phối hợp với AIA mg/l, BA cản trở vai trò AIA việc tạo rễ xử lý 14 ngày nuôi cấy liên tiếp Chỉ môi trường AIA mg/l BA 0,1 mg/l, rễ hình thành với số lượng ít, mơi trường BA riêng rẽ nồng độ (0,1 mg/l), rễ khơng hình thành mà khối mơ sẹo xuất gốc khúc cắt chồi (hình 3.36) 2,5 2,3 BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) Số lượng chồi 1,8 1,5 0,4 0,5 0,2 0 0 0 0 BA AIA+BA(14ngày) AIA+BA(1ngày chuyển) AIA+BA(4ngày chuyển) Môi trường nuôi cấy Hình 3.35 Số lượng chồi trung bình /khúc cắt chồi sau 14 ngày nuôi cấy môi trường AIA mg/l kết hợp với BA nồng độ khác xử lý theo thời gian (so với môi trường đối chứng MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng MS bổ sung AIA mg/l BA) 40 37,7 36 36,5 số lượng rễ/chiều dài rễ (mm) 32 27,2 28,3 28 26,8 24 20 19,3 16 12 9,5 2,3 0 0 0 BA Số lượng rễ Chiều dài rễ 2,7 2,5 2,5 1,8 1,5 AIA+BA(14ngày) AIA+BA(1ngày chuyển) BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) AIA+BA(4ngày chuyển) Mơi trường Hình 3.36 Số lượng rễ trung bình chiều dài rễ trung bình/ khúc cắt chồi sau 14 ngày nuôi cấy môi trường AIA mg/l kết hợp với BA nồng độ khác xử lý theo thời gian (so với môi trường đối chứng MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng MS bổ sung AIA mg/l BA) Như vậy, AIA không giúp phá bỏ ưu ảnh hưởng đến tích lũy BA, nên chồi nách khơng thể phát triển, cịn BA cản AIA hình thành phát triển rễ * Xử lý AIA mg/l kết hợp BA ngày chuyển sang môi trường MS 13 ngày Khi nuôi cấy khúc cắt chồi mơi trường MS có AIA mg/l phối hợp với BA nồng độ khác ngày sau chuyển sau mơi trường MS 13 ngày, chiều dài tăng, số lượng rễ tăng, số lượng chồi so với mơi trường MS phối hợp với BA nồng độ 14 ngày liên tiếp (hình 3.35) Điều khoảng thời gian ngắn (1 ngày) đủ để AIA mg/l cảm ứng phát triển phát thể thành Trong thời gian ngắn, lượng AIA BA tích lũy mẫu cấy khơng nhiều, nên chúng hỗ trợ tăng trưởng mẫu cấy Điều với nhận định auxin kiểm soát phân chia, kéo dài phân hóa tế bào, cịn cytokinin điều hịa q trình sinh tổng hợp protein liên quan tới phân chia tế bào (Bùi Trang Việt, 2000) Khi xử lý AIA mg/l BA ngày tạo cân chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh khúc cắt chồi, làm cho phân chia tế bào nhanh thu hút dinh dưỡng nhiều giúp rễ dài Từ chiều dài kéo dài so với mẫu cấy môi trường MS bổ sung AIA mg/l BA xử lý 14 ngày (hình 3.37) 40 BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) 35,7 Chiều dài thứ (mm) 35 29,3 30 26,5 25 26,4 22,4 19,9 19,3 20 18,3 15 10 8,7 8,1 6,1 5,7 BA AIA+BA(14ngày) AIA+BA(1ngày chuyển) AIA+BA(4ngày chuyển) Môi trường ni cấy Hình 3.37 Chiều dài trung bình khúc cắt chồi sau 14 ngày nuôi cấy môi trường AIA mg/l kết hợp BA nồng độ khác xử lý theo thời gian (so với môi trường đối chứng MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng MS bổ sung AIA mg/l BA) * Xử lý AIA mg/l kết hợp BA ngày chuyển sang môi trường MS 10 ngày Nếu tiếp tục nuôi cấy khúc cắt chồi môi trường MS có AIA mg/l phối hợp với BA nồng độ khác ngày sau chuyển sang mơi trường MS 10 ngày tiếp theo, chiều dài giảm, số lượng rễ giảm khơng có chồi nách xuất so với thí nghiệm xử lý ngày (Hình 3.35, 3.36, 3.37) Điều thời gian ngày, AIA mg/l đủ thời gian liều lượng để ức chế tăng trưởng chồi khúc cắt chồi nên chiều dài giảm cản tích lũy BA nên khơng hình thành chồi nách (Bảng 3.12) Đồng thời BA phần cản hình thành rễ kéo dài rễ AIA đảm nhiệm Chiều dài lá, số lượng rễ, chiều dài rễ tăng xử lý AIA mg/l BA kéo dài ngày so với mẫu cấy xử lý AIA mg/l BA nồng độ kéo dài 14 ngày, giảm so với mẫu cấy xử lý mơi trường ngày sau chuyển sang MS (Hình 3.36, 3.37) Kết cho thấy thời gian xử lý lâu (4 ngày, 14 ngày), liều lượng CĐHTTTV tích lũy nhiều hiệu ứng cản tác động CĐHTTTV với tăng * Xử lý AIA mg/l ngày chuyển sang mơi trường có BA 13 ngày Khi nuôi cấy khúc cắt chồi môi trường AIA mg/l ngày, sau chuyển sang mơi trường BA nồng độ khác (0,1 mg/l; 0,5 mg/l mg/l) 13 ngày ưu nghiêng tác động BA BA phá vỡ ưu với auxin kích thích chồi nách phát triển, nên số lượng chồi sinh cao so với mẫu cấy mơi trường tăng sinh chồi có bổ sung BA nồng độ 14 ngày tuổi (Hình 3.38) BA(0,1mg/l) 2,5 BA(0,5mg/l) 2,7 BA(1mg/l) 2,4 2,3 Số lượng chồi 2 1,8 1,6 1,5 0,5 0 0 0 BA AIA+BA(14ngày) AIA 1ngày chuyển sang BA AIA 4ngày chuyển sang BA Mơi trường ni cấy Hình 3.38 Số lượng chồi/ khúc cắt chồi 14 ngày tuổi môi trường AIA mg/l, sau chuyển sang mơi trường có BA nồng độ khác xử lý theo thời gian (so với môi trường đối chứng MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng MS bổ sung AIA mg/l BA) BA cản tăng trưởng Do có xử lý AIA mg/l thời gian ngày - ngưỡng thích hợp cho tăng trưởng chồi (Bảng 3.5) - trước chuyển sang môi trường MS bổ sung BA, nên chiều dài tăng so với mẫu cấy môi trường MS bổ sung BA nồng độ 14 ngày (Hình 3.39) 30 BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) 25,5 Chiều dài thứ (mm) 25 22,4 21,5 19,3 20 18,1 17,1 15 11,6 10 8,7 8,1 6,1 6,9 5,7 BA AIA+BA(14ngày) AIA 1ngày chuyển sang BA AIA 4ngày chuyển sang BA Môi trường ni cấy Hình 3.39 Chiều dài trung bình/ khúc cắt sau 14 ngày nuôi cấy môi trường AIA mg/l, sau chuyển sang mơi trường BA nồng độ khác xử lý theo thời gian khác (so với môi trường đối chứng MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng MS bổ sung AIA mg/l BA) Trong khoảng thời gian ngày, AIA nồng độ mg/l khơng tích lũy đủ liều lượng để kích thích hình thành phát triển rễ Cho nên, số lượng rễ khúc cắt chồi thí nghiệm tương đương với kết môi trường MS bổ sung AIA mg/l BA 0,1 mg/l; 0,5 mg/l; mg/l 14 ngày (Hình 3.40) Ở thí nghiệm này, số lượng chồi nhiều so với thí nghiệm cịn lại tương đương với mơi trường tăng sinh chồi bổ sung BA (Hình 3.38) Như vậy, việc xử lý CĐHTTTV theo thời gian (AIA mg/l ngày BA 13 ngày tiếp theo) mang lại hiệu so với xử lý kết hợp đồng thời CĐHTTTV 14 ngày Sự phát sinh hình thái nghiêng phát triển chồi (chiều dài tăng, số chồi tăng), cịn rễ khơng phát triển (Hình 3.40) 24 22,1 22 20 18,3 Số lượng rễ / Chiều dài rễ 18 16 14 13,9 12,5 12 10 9,5 6,8 6,5 4,9 2,3 2 0 0 0 0 BA Số lượng rễ Chiều dài rễ AIA+BA(14ngày) 0 AIA 1ngày chuyển sang BA BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) BA(0,1mg/l) BA(0,5mg/l) BA(1mg/l) AIA 4ngày chuyển sang BA Mơi trường Hình 3.40 Số lượng chiều dài trung bình rễ/ khúc cắt sau 14 ngày nuôi cấy môi trường AIA mg/l, sau chuyển sang mơi trường BA nồng độ khác xử lý theo thời gian khác (so với môi trường đối chứng MS bổ sung BA riêng rẽ; đối chứng MS bổ sung AIA mg/l BA) * Xử lý AIA mg/l ngày chuyển sang môi trường BA 10 ngày Nếu tiếp tục nuôi cấy khúc cắt môi trường AIA mg/l ngày, sau chuyển sang mơi trường BA nồng độ khác (0,1 mg/l; 0,5 mg/l; mg/l) 10 ngày AIA mg/l đủ thời gian để cảm ứng hình thành phát triển rễ BA 0,5 mg/l mg/l có đủ thời gian tích lũy đủ liều lượng để kích thích hình thành chồi nách Tuy nhiên tích lũy BA khúc cắt chồi bị cản AIA nên hình thành chồi có mơi trường BA mg/l (do tỷ lệ cytokinin/ auxin nghiêng cytokinin) Số lượng chồi sinh nghiệm thức tương đương với kết mẫu cấy nuôi môi trường MS bổ sung AIA mg/l BA nồng độ 14 ngày tuổi (Hình 3.38) Bên cạnh đó, số lượng rễ nhiều rễ phát triển mạnh, kéo theo chiều dài tăng Như vậy, việc xử lý CĐHTTTV theo thời gian (AIA mg/l ngày BA 10 ngày tiếp theo) mang lại hiệu so với xử lý kết hợp đồng thời CĐHTTTV 14 ngày Sự phát sinh hình thái nghiêng phát triển rễ, cịn tăng sinh chồi giảm (Hình 3.38, 3.40) - Sự phát triển chồi nách ưu Trong tự nhiên, chồi thực vật lúc nhiều vượt cao nhánh tượng gọi ưu (Cline, 1997) Nếu cắt bỏ khối mô phân sinh chồi khúc cắt chồi từ in vitro ngày tuổi cắt bỏ trụ thượng diệp Đậu đỏ in vitro ngày tuổi ưu ngọn, chồi nách hai cuống thứ khúc cắt chồi hai tử diệp xuất kéo dài Ưu kiểm sốt chất điều hịa tăng trưởng thực vật, mà auxin cytokinin đóng vai trị quan trọng (Sachs Thimann, 1967; Shimizu Mori, 2001) Cytokinin tổng hợp từ rễ chuyển lên chồi theo hướng để kích thích bộc phát chồi, thúc đẩy tăng trưởng (Cline Harrington, 2007), bị auxin kiềm hãm ưu Auxin di chuyển từ đỉnh xuống gốc ức chế tăng trưởng chồi nách (Ongaro Leyser, 2007) Do đó, cắt bỏ khối mơ phân sinh chồi khúc cắt chồi từ in vitro ngày tuổi cắt bỏ trụ thượng diệp Đậu đỏ in vitro ngày tuổi loại bỏ vai trò ức chế tăng trưởng chồi nách auxin CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Sử dụng dung dịch HgCl 0,1% phút tốt cho việc khử trùng hạt Đậu đỏ R R - Chồi nách chứa khối sinh mơ có tổ chức mơ phân sinh chồi, có nguồn gốc ngoại sinh Trong phát triển chồi nách (sau ưu tháo gỡ) Đậu đỏ, nhu mô vỏ tế bào tầng phát sinh libe-mộc phân chia mạnh mẽ để đẩy khối sinh mơ dần phía vỏ đồng thời tạo hệ thống mạch dẫn, kế nối mạch chồi hình thành với mạch thân - AIA kích thích kéo dài thân rễ khúc cắt chồi Đậu đỏ nồng độ thấp (0,01 mg/l, 0,1 mg/l, mg/l) AIA nồng độ từ mg/l trở lên cản tăng trưởng khúc cắt Nhưng xử lý AIA mg/l thời gian ngắn (1 ngày) kích thích tăng trưởng phát thể thành lá, kéo dài khúc cắt kéo dài - BA 0,5 mg/l mg/l thích hợp để kích thích bộc phát chồi nách, phá bỏ ưu tính - AIA mg/l phối hợp đồng thời với BA khoảng thời gian khác (1 ngày, ngày, 14 ngày) cho kết khác nhau: • Nếu xử lý ngày chúng hỗ trợ phát sinh hình thái chồi Đậu đỏ • Nếu xử lý 14 ngày chúng tăng hiệu ứng cản tác động AIA mg/l cản tích lũy BA, khơng phá bỏ ưu tính BA BA cản tạo rễ AIA đảm nhiệm • Nếu xử lý ngày chúng cho kết trung gian xử lý ngày xử lý 14 ngày - AIA mg/l phối hợp với BA theo thời gian cho kết khác nhau: • Nếu xử lý AIA mg/l ngày sau chuyển sang BA 13 ngày phát sinh hình thái nghiêng phát triển chồi (chiều dài tăng, số chồi tăng), cịn rễ khơng phát triển • Nếu xử lý AIA mg/l ngày sau chuyển sang BA 10 ngày phát sinh hình thái nghiêng phát triển rễ, cịn tăng sinh chồi giảm 4.2 Đề nghị Trong thời gian tới, có điều kiện, chúng tơi tiếp tục nghiên cứu: - Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên tái sinh chồi từ khối mô sẹo gốc khúc cắt chồi - Khoảng thời gian thích hợp xử lý auxin cytokinin để vừa kích thích phát triển rễ, vừa tăng sinh chồi tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, 1, NXB Trẻ Trần Thanh Hương (2011), Phân tích biến đổi hình thái học sinh lý học trình phát sinh quan phôi thể hệ số giống chuối (Musa sp.), Luận văn tiến sĩ khoa học ngành sinh học, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Như Khanh (2009), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), Thực vật cấp cao, Nhà xuất Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Trung (2003), Tìm hiểu áp dụng chất điều hịa sinh trưởng thực vật để kiểm sốt tượng rụng trái non Xoài (Magifera indica L.), Luận án Tiến sĩ khoa học ngành Sinh học, Đại học quốc gia TPHCM Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương Phần II- Phát triển, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Bùi Trang Việt, (2009), Nuôi cấy mô sinh phôi thể hệ thực vật bậc cao, Giáo trình cao học Sinh lý thực vật * Tài liệu tiếng nước Alconi R., Schwalm K., Langhans M and Ullrich C.I (2003), Gradual shifts in site of free – auxin production during leaf – primordium development and their role in vascular differentiation and leaf morphogenesis in Arabidopsis, Planta, 216, 841- 853 Benkova E., Michniewicz M., Sauer M., Teichmann T., Seifertova D., Jurgens G and Friml J (2003), Local efflux – dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation, Cell, 115, 591- 602 10 Braybrook S.A and Kuhlemeier C (2010), How a Plant Builds Leaves, Plant Cell, 22: 1006T T 1018 11 Brown B.T., Foster C., Phillips J.N and Rattigann B.M (1979), The indirect role of 2,4-D in the maintenance of apical dominance in decapitated sunflower seedlings (Helianthus annuus L.), Planta, 146:475–480 12 Calderon-Villalobos L.I., Tan X., Zheng N and Estelle M (2010), Auxin PerceptionStructural Insights, Cold Spring Harbor Laboratory Pressed 1T T 13 Cline M.G and Harrington C.A (2008), Apical dominance and apical control in multiple flushing of temperate woody species, Can J For Res 37:74-83 14 Cline M.G (1997), Concepts and terminology of apical dominance, American Journal of Botany 84:1064–1069 15 Edwin F.G (1996), Plant propagation by tissue culture Part 2: In practice, Exegetics Limited, 613 – 936 16 Esau K (1967), Plant anatomy, John Wiley and Sons 17 Evert R.F (2006), Esau’s Plant Anatomy, 3rd edition, John Wiley and Sons, Inc., Publication 18 Ferguson B and Beveridge C (2009), Roles for Auxin, Cytokinin, and Strigolactone in T T Regulating Shoot Branching, Plant Physiology American Society of Plant Biologists 149: T T 1929-1944 19 Fleming A (2006), The co-ordination of cell division, differentiation and morphogenesis in the shoot apical meristem: a perspective, Journal of Experimental Botany 57(1): 25-32 20 Gaspar T., Kevers C., Penel C., Greppin H., Reid D.M., and Thrope T.A (1996), Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture, In Vitro Cell Dev Biol.-Plant 32: 272- 289 21 Gautheret R.J (1966), Factors affecting differentiation of plant tissues grown in vitro”, cell differentiation and morphogenesis, North-Holland Publishing Company – Amsterdam, 55-95 22 Hamant O., Heisler M., Jönsson H., Krupinski P., Uyttewaal M., Bokov P., Corson F., Sahlin T P., Boudaoud A., Meyerowitz E., Couder Y and Traas J (2008), Developmental Patterning T by Mechanical Signals in Arabidopsis, Science 322(5908): 1650 – 1655 T T 23 Higuchi M., Pischke M.S., Mahonen A.P., Miyawaki K., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Shinozaki K., Kato T., Tabata S et al (2004), In planta functions of the Arabidopsis cytokinin receptor family, Proc Natl Acad Sci USA, 101, 8821- 8826 24 Kurakawa T., Ueda N., Maekawa M., Kobayashi K., Koijima M., Nagato Y., Sakakibara H and Kyozuka J (2007), Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme, Nature 445: 652-655 T 8T 9T 9T 25 Leibfried A., Jennifer P.C To, Busch W., Stehling S., Kehle A., Demar M., Kieber J and Lohmann J (2005), WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinininducible response regulators, Nature 438: 1172-1175 26 Leyser O (2003), Regulation of shoot branching by auxin, Trends in Plant Science 8:541– 545 27 Machakova I., Zazimalova E and George E.F (2008), Plant Growth Regulators I: introduction; Auxins, their Analogues and Inhibitors, Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition, Volume The Background, 185-197 28 Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M and Kakimoto T (2004), Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrat, Plant J, 37, 128- 138 29 Mok, D.W.S and Mok M.C (1994), Cytokinin metabolism and action, Plant Mol Biol., 52,89-118 30 Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato T., Tabata S and Ueguchi C (2004), Histidine kinase homologs that act as cytokinin receptors possess overlapping functions in the regulation of shoot and root growth in Arabidopsis, Plant Cell, 16, 1365- 1377 31 Ongaro V and Leyser O (2007), Hormonal control of shoot branching, Journal of Experimental Botany, doi: 10 1093/ jxb/erm 134 32 Reinhardt D., Mandel T and Kuhlemeier C (2000), Auxin regulates the initiation and radial position of plant lateral organs, Plant Cell, 12, 507-518 33 Reinhardt D., Pesce E.R., Stieger P., Mandel T., Baltensperger K., Bennett M., Traas J., Friml J and Kuhlemeier C (2003), Regulation of phyllotaxis by polar auxin transport, Nature, 426, 255-260 34 Riefler M., Novak O., Strnad M., Schmulling T (2006), Arabidopsis cytokinin receptor mutants reveal functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development, and cytokinin metabolism, Plant Cell, 18, 40- 54 35 Rudall P.G (2007), Anatomy of Flowering Plants, Cambridge University Press 36 Sachs T and Thimann K (1967), The role of auxins and cytokinins in the release of buds from dominance, American Journal of Botany 54:136–144 37 Shimizu-Sato S and Mori H (2001), Control of outgrowth and dormancy in axillary T 21T buds, Plant Physiol 127: 1405–1413 T 13T 14T 14T 21T 38 Soh W.Y and Bhojwani S.S (1999), Morphogenesis in Plant Tissue Cultures, Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 520p 39 Staden J., Zazimalova E and George E.F (2008), Plant Growth Regulators II: Cytokinin, their Analogues and Antagonists, Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition, Volume The Background, 213-220 40 Taiz L and Zeiger E (2002), Plant Physiology 3th edition, Sinauer Associates 41 Thimann K.V (1937), On the Nature of Inhibitions Caused by Auxin, American Journal of Botany, Vol 24, No (Jul., 1937), 407- 412 42 Vernoux T., Besnard F and Traas J (2010), Auxin at the Shoot Apical Meristem, Cold Spring T Harbor Laboratory Press 1T 43 Vieitez A.M and San-Jose M.C (1985), In vitro plantlet regeration from Juvenile and matura Quercua robus L., J.Hortic Sci, 60, 99-106 44 Zhao Z., Andersen S., Ljung K., Dolezal K., Miotk A., Schultheiss S and Lohmann J (2005), Hormonal control of the shoot stem-cell niche, Nature 438: 1172-1175 * Tài liệu internet 45 http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=news&newsid=934 PHỤ LỤC PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG MURASHIGE & SKOOG (1962) Khống đa lượng NH NO KNO CaCl 2H O MgSO 7H O KH PO NaH PO Khoáng vi lượng H BO MnSO 2H O ZnSO 4H O KI Na MoO 2H O CuSO 5H O CoCl 6H O Dung dịch Fe-EDTA FeSO 7H O Na EDTA Vitamin Morel Wetmore (1951) Panthotenat decalcium Meso - inositol Acid nicotinique Pyridoxine - HCl Thiamine Biotin Đường Agar pH R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R Nồng độ (mg/l) 1650 1900 440 370 170 170 Nồng độ (mg/l) 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 Nồng độ (mg/l) 27,8 37,3 Nồng độ (mg/l) 100 1 0,001 30 6,5 5,7 ± 0,1 ... phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dưỡng thành mô phân sinh tiền hoa Quá trình hoa biểu thị qua thay đổi hình thái sinh lý mơ phân sinh chồi (Bùi Trang Việt, 2000) Như vậy, mô phân sinh chồi. .. hoạt tính sinh lý cao chúng (Bùi Trang Việt, 2000) Mơ phân sinh sở hình thành mơ vĩnh viễn Nhờ hoạt động mô phân sinh mà sinh trưởng phát triển Trong trình sinh phôi, mô phân sinh chồi phát triển... chồi nách Chồi nách diện nách lá, tạo mô phân sinh phát thể xếp chồng lên Sự phát triển chồi nách (sự phát sinh chồi) bao gồm tổ chức mô phân sinh chồi (có cấu trúc giống với mơ phân sinh thân