Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp hoàn thành phòng Hoạt chất sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Tiến Đạt – Phòng Hoạt chất sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người trực tiếp hướng dẫn em suốt trình thực hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Bằng thầy giáo khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ cung cấp cho em kiến thức để em hoàn thành khóa luận Em xin cảm ơn anh, chị cán Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ bảo tận tình để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Khoá luận tốt nghiệp không tránh khỏi số thiếu sót em mong nhận góp ý, bảo thầy cô bạn sinh viên quan tâm Hà Nội, tháng năm 2013 Sinh viên ĐINH THỊ NHẠN K35C – Khoa Hóa học i Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT []D Độ quay cực Specific Optical Rotation 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy H-1H COSY 2D-NMR H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc ký cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mass Spectrometry FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Me Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography K35C – Khoa Hóa học ii Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm, tính vị công dụng Desmodium stryracifolium 1.1.1 Mô tả 1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Công dụng 1.2 Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có Kim tiền thảo 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Các nhóm flavonoit 1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 12 1.3.1 Đặc điểm chung 12 1.3.2 Cơ sở trình chiết 13 1.3.3 Quá trình chiết thực vật 13 1.4 Các phương pháp sắc ký phân lập hợp chất hữu 18 1.4.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc ký 18 1.4.2 Cơ sở phương pháp sắc ký 18 1.4.3 Phân loại phương pháp sắc ký 19 1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc hợp chất hữu 22 1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) 23 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 25 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Mẫu thực vật 28 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 28 2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 28 K35C – Khoa Hóa học iii Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn 2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 29 2.2.3 Sắc ký cột (CC) 29 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất 29 2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 29 2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 29 2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 29 2.3.4 Độ quay cực []D 29 2.4 Dụng cụ thiết bị 30 2.4.1 Dụng cụ thiết bị tách chiết 30 2.4.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 30 2.5 Hoá chất 30 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31 3.1 Chiết phân lập hợp chất 31 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất 31 3.2.1 Hợp chất 31 3.2.2 Hợp chất 32 CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 34 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 34 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 39 4.3 Kết đánh giá hoạt tính quét gốc tự DPPH 42 KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 K35C – Khoa Hóa học iv Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo Hình1.2: Flavan (2-phenyl chromen)……………………………………… Hình 1.3: Flavon (2-phenyl benzopyron, 2-phenyl cromon) Hình 1.4: Flavonol (3-hidroxi flavon) Hình 1.5: Flavanon Hình 1.6: Flavanon Chalcon Hình 1.7: Flavanonol-3 Hình 1.8: Chalcon Hình 1.9: Auron Hình 1.10: Antoxianidin Hình 1.11: Các dạng chuyển hoá antoxianidin 10 Hình 1.12: Leucoantoxianidin 10 Hình 1.13: (+) Catechin 11 Hình 1.14: (–) Catechin 11 Hình 1.15: 3-phenyl chromen 11 Hình 1.16: 3-phenylchromen-4-one 12 Hình 1.17: Rotenoit 12 Hình 2.1 Ảnh chụp tiêu mẫu Kim tiền thảo 28 Hình 4.1.1 Phổ ESI-MS hợp chất 34 Hình 4.1.2 Phổ 1H-NMR hợp chất 35 Hình 4.1.3 Phổ 13C-NMR hợp chất 36 Hình 4.1.4 Phổ DEPT hợp chất 36 Hình 4.1.5 Cấu trúc hóa học 37 Hình 4.2.1 Phổ ESI-MS hợp chất 39 Hình 4.2.2 Phổ 1H-NMR hợp chất 40 Hình 4.2.3 Phổ 13C-NMR hợp chất 40 Hình 4.2.4 Phổ DEPT hợp chất 41 Hình 4.2.5 Cấu trúc hóa học 41 Hình 4.3: Hoạt tính quét gốc tự DPPH 42 K35C – Khoa Hóa học v Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn MỞ ĐẦU Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao Với điều kiện tự nhiên thuận lợi nên hệ thực vật Việt Nam phát triển phong phú đa dạng Khoảng 12000 loài thực vật không kể đến loài tảo, rêu nấm, có tới 4000 loài nhân dân ta làm thảo dược với mục đích khác phục vụ sống người Điều thực có ý nghĩa quan trọng phát triển ngành ngành y học, ngành hóa học hợp chất thiên nhiên ngành khác Việc sử dụng cỏ làm thuốc gắn liền với lịch sử tồn phát triển xã hội loài người Từ xa xưa, cha ông ta biết dùng thực vật vừa để tự nuôi sống mình, vừa để chữa bệnh chăm sóc sức khoẻ cho thân Thiên nhiên đem lại cho nguồn nguyên liệu phong phú cung cấp hoạt chất quý để tạo biệt dược chất dẫn đường để tổng hợp nhiều loại thuốc Việc sử dụng hợp chất thiên nhiên sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên dược phẩm chữa bệnh ngày thu hút quan tâm nhà khoa học cộng đồng ưu điểm chúng độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển hoá thể có khả trị bệnh cao Nhiều công ty dược phẩm nước tập trung hướng nghiên cứu kinh doanh vào sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên Việc nghiên cứu tập trung thúc đẩy hướng nghiên cứu tìm kiếm dược liệu từ thiên nhiên, qua nghiên cứu nhà khoa học tìm nhiều loài thực vật có ứng dụng cao y dược hao hoa vàng Artemisia annua, nhân sâm - Panax ginseng, đan sâm - Salvia miltiorrhiza… Những kết nghiên cứu giúp cho việc cung cấp hoạt chất quý cho nghiên cứu tạo sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn Trong số loài thực vật Việt Nam, loài thực vật thuộc họ đậu (Fabaceae) thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Việt Nam Kim tiền thảo số loại thuộc họ đậu có tác dụng dược lý tốt, có tác dụng nhiệt, lợi thuỷ, tiêu sạn, giải độc, tiêu viêm; lợi thuỷ, thông lâm, tiêu tích tụ Chủ trị chứng nhiệt lâm, thạch lâm, sỏi mật, hoàng đản, ung nhọt nhiệt độ, trị gan mật kết sỏi, sỏi thận, tiểu buốt, hoàng đản Tuy nhiên chưa có nghiên cứu thức hóa thực vật Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kim tiền thảo (Desmodium stryracifolium)”” Nhiệm vụ đề tài là: Thu mẫu Kim tiền thảo (Desmodium stryracifolium), xử lý mẫu, tạo dịch chiết Phân lập hợp chất flavonoit Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lâp K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm, tính vị công dụng Desmodium stryracifolium 1.1.1 Mô tả [1,2] Tên khoa học: Desmodium styracifolium (Osb.)Merr Tên tiếng Việt: Cây kim tiền thảo gọi đồng tiền lông, kim tiền, mắt trâu, vẩy rồng Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo Phân lớp: Hoa hồng (Fabaceae) Họ: Đậu (Fabaceae) Phân họ: Đậu (Faboideae) Chi: Desmodium Kim tiền thảo cao khoảng 40-80 cm Thân cỏ mọc bò hình trụ màu xanh vàng có phủ đầy lông mịn màu vàng hoe Lá mọc so le đơn hay kép lông chim lẻ gồm 1-3 chét hình tròn có lông, chét to chét bên, mặt màu lục lơ nhẵn, mặt có lông trắng bạc mềm Cuống hình trụ phủ đầy lông trắng Cụm hoa chụm hay chùy nách hay có lông mềm màu hung Hoa tự hình chùm, tràng hoa hình bướm, màu tía xếp 2-3 Quả loại đậu dài khoảng 14-16 mm xụ xuống mang đài tồn góc dẹp nhiều lông trắng mịn, chứa 4-5 hạt K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn 1.1.2 Phân bố, sinh thái Phổ biến Sri Lanka, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Việt Nam, Campuchia Ở nước ta có từ Lào Cai, Phú Thọ, Hòa Bình, Hà Nội, Hải Hưng, Quảng Ninh, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa ThiênHuế vào Kontum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương, Tây Ninh, Cần Thơ Thường Gặp bãi cỏ ruộng bỏ hoang đất có cát nha, vùng thấp vùng trung du, số mọc vùng núi Mùa hoa tháng 6-9, mùa tháng 9-10 Tính vị tác dụng: Theo dược học cổ truyền, Kim tiền thảo vị ngọt, tính bình, có công dụng nhiệt, lợi thấp, lợi niệu thông lâm, tiêu thũng thạch, thường dùng để chữa chứng bệnh viêm đường tiết niệu, sỏi tiết niệu, sỏi mật, phù thũng viêm thận, hoàng đản (vàng da), tích tụ, ung thũng, 1.1.3 Thành phần hóa học [3, 4] Toàn có mùi mạnh coumarin Trong kim tiền thảo có chứa polysaccharid, saponin triterpenic flavonoid isovitexin, isoorientin, vicenin glycosid, chất khác desmodimin, desmodilacton, lupenon, lupcol, tritriacontan, acid stearic, 1.1.4 Công dụng Theo đông y, Kim tiền thảo có tác dụng dược lý tốt, thường dung để chữa sỏi liệu đạo, sỏi bang quang, sỏi túi mật, chữa nhiễm khuẩn đường niệu,viêm thận phù thũng, viêm gan vàng da [1,2] Thanh nhiệt, tán thấp, thông lâm Nước sắc kim tiền thảo có tác dụng làm tăng tuần hoàn mạch, hạ áp lực động mạch, làm chậm nhịp tim, giảm lượng oxi tim Tuần hoàn thận não tăng tim co lại, nghĩ đến việc kim tiền thảo có tác dụng chữa cao huyết áp Ngoài có tác dụng điều hào miễn K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn dịch, giãn trơn, nước sắc kim tiền thảo dùng để điều trị bệnh hen suyễn, sốt thương hàn, sốt rét, bệnh suy dinh dương trẻ em [3,4] Ngoài chứa hợp chất flavonoid, alkaloid, steroid, triterpenoid, sapomin… đồng thời mang nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm chống viêm, gây độc tế bào, kháng khuẩn, diệt vi - rút, chống oxi hóa [3,4,5,6,7] 1.2 Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có Kim tiền thảo 1.2.1 Giới thiệu chung [8, 9, 10, 11, 12] Flavonoid nhóm hợp chất phân bố rộng rãi tự nhiên Cho đến có 4000 Flavonoid tìm thấy từ thực vật Sự tiến hoá Flavonoid liên quan đến trình tiến hoá thực vật Từ loài có gỗ sơ khai đến loài bụi phát triển dẫn đến thay đổi quan trọng mặt cấu trúc Flavonoid: - Sự biến Proantoxianidin - Sự nhóm OH vòng benzen - Sự thay Flavonol (Quercetin) Flavon (Luteonin) Flavonoid đặc trưng cho loài sinh vật bậc cao song song với phân bố axit Xiamic Lignin Flavonoid có mặt hầu hết phận lá, hoa, quả, phấn, rễ… cư trú thành tế bào Nó tham gia vào tạo thành màu sắc đặc biệt hoa Flavonoid nhóm hợp chất poliphenol đa dạng cấu trúc hoá học tác dụng sinh học Chúng có mặt hầu hết phận cây, đặc biệt tế bào thực vật, hợp chất cấu tạo gồm hai vòng benzen A, B nối dị vòng C với khung bon C6-C3-C6 Tại vòng có đính hay nhiều nhóm hydroxy tự hay thay phần Vì chất chúng poliphenol có tính axit Các poliphenol phản ứng lẫn qua nhóm hydroxy để tạo thành K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Chiết phân lập hợp chất Mẫu Kim tiền thảo (10 kg tươi), rửa sạch, phơi khô bóng râm, sau sấy khô bằng tủ sấy nhiệt độ 50 oC, sau đem xay nhỏ thành bột thu kg bột khô Phần bột khô ngâm chiết với metanol (5 L x lần) bể siêu âm nhiệt độ 40-50oC, lần 60 phút Phần dịch chiết cất loại dung môi áp suất giảm thu dịch cao chiết metanol 160 g Cao chiết hoà với nước (1 lít) chiết phân đoạn với n-hexan (1L x 3) clofoc (1L x 3) thu cắn chiết n-hexan (60 g), cắn clofoc (10 g) cắn nước tương ứng Phần dịch nước lọc qua cột dianion rửa giải bằng nước, metanol:nước 50% 100% metanol thu phân đoạn A1-A3 Tiến hành sắc ký cột với silicagel phân đoạn A3 rửa giải bằng hệ dung môi gradient clofoc:metanol (100:1 v/v → 100% metanol) thu phân đoạn ký hiệu B1B5 Tinh chế phân đoạn B3 qua cột YMC-RP18 (metanol:nước 1:3 v/v) qua cột silica gel với dung môi rửa giải clofoc:metanol:nước 5:1:0.1 (v/v) thu hợp chất (10 mg) Tinh chế B2 qua cột YMC- RP18 với hệ dung môi rửa giải metanol:nước 1:3 v/v thu hai phân đoạn C11 C12 Tinh chế lại C12 cột silica gel sử dụng dung môi rửa giải n-hexan:clofoc:metanol 10.5:1:1 (v/v/v) thu hợp chất (15 mg) 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất 3.2.1 Hợp chất Các thông số vật lý hợp chất (1), số liệu sau: - Chất bột màu vàng - Điểm nóng chảy mp: 238-240oC K35C – Khoa Hóa học 31 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn - Phổ khối lượng ESI-MS (negative) m/z: 446,8 [M-H]- Tên khoa học: 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside (1) H-NMR (500 MHz, CD3OD)  (ppm): 7,37 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6′), 7.36 (1H, br s, H-2′), 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5′), 6.53 (1H, s, H-8), 6.47 (1H, s, H-3), 4.90 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.20 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′′), 3.91 (1H, dd, J = 1.5, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.76 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.50 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-3′′), 3.49 (1H, m, H-4′′), 3.45 (1H, m, H-5′′) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD)  (ppm): 166,2 (C-2), 103,8 (C-3), 183,9 (C-4), 162,0 (C-5), 109,1 (C-6), 165,1 (C-7), 95,2 (C-8), 158,7 (C-9), 105,1 (C-10), 123,5 (C-1′), 114,1 (C-2′),147,0 (C-3′), 151,0 (C-4′),116,7 (C5′), 120,3 (C-6′), 75,3 (C-1′′), 71,7 (C-2′′), 80,1 (C-3′′), 72,6 (C-4′′), 82,6 (C5′′) 62,8 (C-6′′) 3.2.2 Hợp chất Các thông số vật lý hợp chất (2), số liệu sau: - Chất bột màu vàng - Điểm nóng chảy mp: 240-242oC - Phổ khối lượng ESI-MS (positive) m/z: 454,9 [M+Na]+ - Tên khoa học: 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside (2) H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm:  7.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.44 (1H, s, H-3), 6.33 (1H, s, H-8), 4.90 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1′′), 4.33 (1H, t, J = 8.5 Hz, H-2′′), 3.87 (1H, dd, J = 1.5, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.80 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.57 (1H, m, H-4′′), 3.48 (1H, t, J = 9.0 Hz, H-3′′), 3.44 (1H, m, H-5′′) K35C – Khoa Hóa học 32 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 13 Đinh Thị Nhạn C-NMR (125 MHz, CD3OD) δppm: 165,42 (C-2), 103,02 (C-3), 183,1 (C-4), 161,9 (C-5), 110,2 (C-6), 165,4 (C-7), 96,9 (C-8), 159,2 (C-9), 103,8 (C-10), 122,8 (C-1′), 119,1 (C-2′),117,2 (C-3′), 163,5 (C-4′),117,1 (C5′), 129,1 (C-6′), 75,6 (C-1′′), 72,3 (C-2′′), 80,5 (C-3′′), 71,5 (C-4′′), 82,3 (C5′′) 62,5 (C-6′′) 3.3 Đánh giá tác dụng quét gốc tự DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) có khả tạo gốc tự bền dung dịch MeOH Các chất có khả làm trung hoà bao vây gốc tự làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng gốc tự DPPH Hoạt tính chống oxy hoá đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng dịch thí nghiệm so với đối chứng đo bước sóng 517nm [15] Theo đó, 10 µl mẫu pha DMSO (dimethyl sulfoxid) cho vào giếng phiến 96 giếng chứa 190 µl dung dịch 150 µM DPPH/MeOH Sau 30 phút ủ bóng tối nhiệt độ phòng, độ hấp thụ dung dịch phản ứng đo máy ELISA bước sóng 517nm Kết biểu thị bằng giá trị scavenging capactity (SC50) Hoạt chất catechin sử dụng làm đối chứng dương K35C – Khoa Hóa học 33 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất thu dạng chất bột màu vàng, phổ khối lượng phun mù điện tử có píc ion giả phân tử [M-H]- m/z 446,8 chứng tỏ có khối lượng phân tử 448 Trên phổ 1H-NMR (hình 4.1.2) 1, vùng trường thấp có tín hiệu olefin vòng thơm gồm có hai proton dạng singlet  6.47 (1H, s, H-3), 6.53 (1H, s, H-8), hệ vòng thơm kiểu ABX H 7.36 (1H, br s, H-2'), 7.37 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-6'), 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5') Ngoài vùng trường trung bình  3.44-4.90 có tín hiệu proton nhóm đường Hình 4.1.1 Phổ ESI-MS hợp chất K35C – Khoa Hóa học 34 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn Phổ 13C NMR (Hình 4.1.3) phổ DEPT (Hình 4.1.4) cho biết có mặt 21 vạch tín hiệu có 10 nguyên tử carbon bậc 4, 10 nhóm CH nhóm CH2 (Bảng 1) Trong số 21 píc này, tín hiệu C 75.3 (C1''), 71.7 (C-2''), 80.1 (C-3''), 72.6 (C-4''), 82.6 (C-5''), 62.8 (C-6'') đặc trưng cho đơn vị đường C-glucospyranosit [17] Còn lại 15 vạch tín hiệu phù hợp với cấu trúc flavonoit có vòng B 1,3,5 So sánh kiện phổ với tài liệu tham khảo cho thấy hợp chất 3',4',5,7tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside [16] Hình 4.1.2 Phổ 1H-NMR hợp chất K35C – Khoa Hóa học 35 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn Hình 4.1.3 Phổ 13C-NMR hợp chất Hình 4.1.4 Phổ DEPT hợp chất K35C – Khoa Hóa học 36 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn Hình 4.1.5 Cấu trúc hóa học K35C – Khoa Hóa học 37 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn Bảng Số liệu phổ 1H- 13C-NMR hợp chất 1, hợp chất phân lập từ Kim tiền thảo C H ppm (J, Hz) C ppm H ppm (J, Hz) C ppm - 166.2 - 165.42 6.47 s 103.8 6.44 s 103.02 - 183.9 - 183.1 - 162.0 - 161.9 - 109.1 - 110.2 - 165.1 - 165.4 6.53 s 95.2 6.33 s 96.9 - 158.7 - 159.2 10 - 105.1 - 103.8 1′ - 123.5 - 122.8 2′ 7.36 s 114.1 7.78 (d, J = 8.5) 129.1 3′ - 147.0 6.90 (d, J = 8.5) 117.2 4′ - 151.0 - 163.5 5′ 6.90 (d, 8.5) 116.7 6.90 (d, J = 8.5) 117.1 6′ 7.37 (d, 8.5) 120.3 7.78 (d, J = 8.5) 129.1 1′′ 4.90 (d, J = 7.5) 75.3 4.90 (d, J = 7.5) 75.6 2′′ 4.20 (t, J = 8.5) 71.7 4.33 (t, J = 8.5) 72.3 3′′ 3.50 (t, J = 8.5) 80.1 3.48 (t, J = 9.0) 80.5 4′′ 3.49 m 72.6 3.57 m 71.5 5′′ 3.45 m 82.6 3.44 m 82.3 62.8 3.80 (dd, J = 5.5, 12.0, H-6a′′) 62.5 6′′ 3.76 (dd, J = 5.5, 12.0, H-6a′′) 3.91 (dd, J = 1.5, 12.0, H-6b′′) K35C – Khoa Hóa học 3.86 (dd, J = 1.5, 12.0, H-6b′′) 38 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất thu dạng chất bột màu vàng, phổ khối lượng phun mù điện tử có vạch tín hiệu [M+Na]+ m/z 454.9 chứng tỏ có khối lượng phân tử 432 Hình 4.2.1 Phổ ESI-MS hợp chất Các phổ 1H 13C NMR hợp chất tương tự phổ tương ứng cho phép xác định hai hợp chất có cấu trúc tương tự (Bảng 1) Sự khác biệt dễ nhận thấy nằm tín hiệu vòng B với xuất tín hiệu hai cặp proton hệ A2B2, có tương tác vị trí ortho với δC 129.1 (C-2', 6')/δH 7.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6) δC 117.2 (C-3', 5')/δH 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3', 5') Số liệu cho phép xác định hợp chất 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside [17] K35C – Khoa Hóa học 39 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn Hình 4.2.2 Phổ 1H-NMR hợp chất Hình 4.2.3 Phổ 13C-NMR hợp chất K35C – Khoa Hóa học 40 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn Hình 4.2.4 Phổ DEPT hợp chất Hình 4.2.5 Cấu trúc hóa học K35C – Khoa Hóa học 41 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn 4.3 Kết đánh giá hoạt tính quét gốc tự DPPH Kết thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa hợp chất phân lập cho thấy hợp chất có khả quét gốc tự DPPH tương đối mạnh tác dụng Giá trị SC50 hợp chất 3,71 µg/ml thấp nhiều so với đối chứng dương catechin 15,13 µg/ml (Hình 4.3) Đáng ý hợp chất có số nhóm hydroxy vòng B nhiều so với thể hoạt tính mạnh Điều phù hợp với nghiên cứu trước chứng minh có mặt nhóm hydroxy vòng B có vai trò quan trọng khả chống oxy hóa [18] % scavenging activity 90 80 70 60 50 40 30 20 10 10 Hợp chất (ug/ml) 15 (+)-Catechin (ug/ml) Hình 4.3: Hoạt tính quét gốc tự DPPH K35C – Khoa Hóa học 42 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn KẾT LUẬN Thực khóa luận tốt nghiệp với Đề tài: “Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kim tiền thảo” bằng phương pháp chiết sắc ký hết hợp sắc ký cột nhồi silica gel pha thường, sắc ký cột nhồi silicagel pha đảo, sắc ký lớp mỏng điều chế, em phân lập hợp chất flavonoit sau: Hợp chất 1: 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside Hợp chất 2: 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside từ Kim tiền thảo Cấu trúc hợp chất xác định bằng phương pháp phổ đại bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều ( 1H-NMR, 13CNMR, DEPT 135, DEPT 90) phổ khối lượng Các kết nghiên cứu bước đầu đóng góp thêm vào việc làm sáng tỏ thành phần hoá học cây Kim tiền thảo K35C – Khoa Hóa học 43 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB y học, Hà Nội, trang 267-268(2000) Võ Văn Chi Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học, Hà Nội, trang 1322(1999) [3] M Xhao, J.A Duan, C.T Che Phytochem 68, 1471-1479 (2007) [4] X Ma, C Zheng, C Hu, K Rahman, L Qin J Ethnopharmacol 138, 314-332 (2011) [5] S Rastogi, M.M Pandey, A Kumar, S Rawat J Ethnopharmacol 136, 183-296 (2011) [6] A Rathi, C.V Rao, B Ravishankar, S De, S Mehrotra J Ethnopharmacol 95, 259-263 (2004) [7] S Dudonne, X Vitrac, P Coutiere, M Woillez, J.M Merillon J Agric Food Chem 57, 1768-1774 (2009) [8] Hayerman A.E., Butler I.G., Assay of condensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant, Meth, Enz, 234, pp 249 (1994) [9] Ternai B., Markham K.R., C13-NMR of flavonoids-1-Flavones and flavonols, Tetrehedron 32, pp 565 (1976) [10] Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., The syrematic indentification of flavonoids, springer Verlag-Berlin-Heidelberg-New york, (1970) [11] Harborn J.B., The flavonoids advance in research since 1986, Chaprman & Hall, (1994) [12] Agrawal P.K., Carbon-13 NMR of flavonoids, Elsevier Science Pub K35C – Khoa Hóa học 44 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn B.V., (1989) [13] Peter J Houghton and Lu Minh Lian, Triterpenes from Desfontainia spinosa, Phytochemistry, Vol.25(8), pp 1939-1944 (1986) [14] Liang Guang-Yi, Alexander I Gray and Peter G Waterman, Pentacylic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis, Journal of Natural Products, Vol.52, pp 162-167 (1989) [15] S Dudonne, X Vitrac, P Coutiere, M Woillez, J.M Merillon J Agric Food Chem 57, 1768-1774 (2009) [16] S Rayyan, T Fossen, S.H Nateland, O.M Andersen Phytochem Anal 16, 334-341 (2005) [17] N Ramarathnam, T Osawa, M Namiki, S Kawakishi J Agric Food Chem 37, 316-319 (1989) [18] J.C Luis, F Valdes, R Martin, A.J Carmona, J.G Diaz DPPH radical scavenging activity of two flavonol glycosides from Aconitum napellus sp lusitanicum Fitoterapia 77, 469-471 (2006) K35C – Khoa Hóa học 45 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội [...]... nghiệp Đinh Thị Nhạn CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Mẫu cây Kim tiền thảo thu hái ở Tam đảo, Vĩnh phúc vào tháng 6/2012 và được PGS.TS Trần Huy Thái, Viện Sinh Thái tài nguyên Sinh vật giám định tên khao học Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa sinh biển Hình 2.1 Ảnh chụp tiêu bản mẫu Kim tiền thảo 2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 2.2.1 Sắc... chiết Các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, được loại bỏ dễ dàng, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu) , không dễ bốc cháy, không độc Những... triển cây cỏ, chúng có thể có ở cây này nhưng không có ở cây kia Hiện nay, có rất nhiều giả thiết về vai trò của chúng trong thực vật Có ý kiến cho rằng chúng là những chất thải, góp phần giải độc cho cây (ancaloid, tinh dầu), góp phần tạo màu sắc, quyến rũ ong bướm giúp cho sự phát triển nòi giống (flavonoid, carotenoid…), hoặc góp phần bảo vệ chống các tác nhân làm hại cây (flavonoid, saponin, tinh... NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Chiết và phân lập các hợp chất Mẫu lá của cây Kim tiền thảo (10 kg tươi), được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50 oC, sau cùng đem xay nhỏ thành bột thu được 2 kg bột khô Phần bột khô được ngâm chiết với metanol (5 L x 3 lần) trong bể siêu âm ở nhiệt độ 40-50oC, mỗi lần 60 phút Phần dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu... này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược) 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của... secquiterpen, và các dẫn xuất phenyl propanoid Dầu béo và tinh dầu tồn tại trong các bộ phận riêng biệt của cây như ở hạt (dầu béo), vỏ thân (tinh dầu) , ở hạch tiết của lá Trong cây còn có chứa các loại enzyme, trong quá trình nghiên cứu, các glycozit có thể bị thủy phân một phần hoặc toàn phần làm thay đổi tính phân cực dẫn đến thay đổi độ hòa tan của hợp chất trong dung môi nếu không khống chế sự... cây Dựa vào chức năng sinh học, người ta chia các hợp chất trong cây thành hai nhóm lớn: - Chất chuyển hóa sơ cấp (primary metabolite) là chất tham gia vào quá trình sinh trưởng của cây như hydrat cacbon, lipit, axit amin Nói chung là chúng không thể thiếu trong cây cỏ - Chất chuyển hóa thứ cấp (secondary metabolite) là những chất mà vai trò chủ yếu của chúng không phải để nuôi sống và phát triển cây. .. cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết Thí dụ: trechlonolide A thu được từ Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước... bis-2-etylhexyl-phtalat] Nó là nguyên nhân làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chloroform, methanol và metylen clorit là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như lá, thân, rễ, củ, quả, hoa Chloroform có chứa những tạp chất như CH2Cl2, CH2ClBr... hoặc huyền phù ở pha này được chuyển vào pha kia Mục đích: Dùng để chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một lượng lớn thể tích dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm K35C – Khoa Hóa học 12 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn nâng cao nồng độ của chất nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ... nhiên chưa có nghiên cứu thức hóa thực vật Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kim tiền thảo (Desmodium stryracifolium) ””... trung hướng nghiên cứu kinh doanh vào sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên Việc nghiên cứu tập trung thúc đẩy hướng nghiên cứu tìm kiếm dược liệu từ thiên nhiên, qua nghiên cứu nhà khoa... điểm, tính vị công dụng Desmodium stryracifolium 1.1.1 Mô tả [1,2] Tên khoa học: Desmodium styracifolium (Osb.)Merr Tên tiếng Việt: Cây kim tiền thảo gọi đồng tiền lông, kim tiền, mắt trâu, vẩy rồng