BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NGUYỄN THỊ NGỌC GIAO MSSV: 3113710 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NGUYỄN THỊ NGỌC GIAO MSSV: 3113710 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS TS Ngô Thị Phương Dung Nguyễn Thị Ngọc Giao XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho thực đề tài Trong trình thực đề tài, nhận nhiều giúp đỡ từ cán sinh viên Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tôi chân thành cám ơn cô Ngô Thị Phương Dung, thầy Phạm Hồng Quang thầy Huỳnh Xuân Phong tận tình truyền đạt kiến thức với anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Bùi Hoàng Đăng Long tận tình giúp đỡ hướng dẫn đóng góp ý kiến cho suốt trình thực thí nghiệm để hoàn thành tốt đề tài luận văn Tôi xin chân thành cám ơn người bạn bên cạnh, động viên lúc khó khăn giúp đỡ xuyên suốt trình thực thí nghiệm hoàn thành luận văn Cám ơn anh chị cao học giúp đỡ dạy tận tình cho Nguyễn Thị Ngọc Giao Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Vi sinh vật chịu nhiệt bao gồm vi khuẩn lên men acid acetic nguồn giống chủng quan tâm nghiên cứu năm gần Acid acetic acid hữu sử dụng phổ biến điều vị chế biến thực phẩm Mục tiêu đề tài phân lập, tuyển chọn thử khả lên men chủng vi khuẩn acid acetic nhiệt độ khác Đề tài phân lập 30 chủng vi khuẩn acid acetic từ 15 loại trái Phân loại chủng AAB thông qua khả oxy hóa acetate cho thấy có 18 chủng Acetobacter 12 chủng thuộc giống Gluconobacter Thử nghiệm khả sinh acid môi trường có 0,01% bromocresol green sơ tuyển 15 chủng có khả sinh acid nhanh mạnh thông qua khả hình thành vùng phân giải sau 36-48 ủ 30oC với đường kính vùng phân giải >20 mm Tuyển chọn chủng có khả phát triển tốt đến 41oC, riêng chủng C2 có khả phát triển đến 43oC, khả chịu acid acetic lên đến 2,5% Thử nghiệm khả lên men acetic 30oC, 37oC, 38oC 39oC môi trường YPGD bổ sung 4% v/v ethanol điều kiện ủ lắc 150 vòng/phút ngày tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt lên men acid acetic C2 NH2 với nồng độ acid acetic đạt 3,56 3,44% (w/v) 38oC Từ khóa: acid acetic, chịu acid, chịu nhiệt, lên men acid acetic, vi khuẩn acid acetic Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT .i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG .v DANH SÁCH HÌNH .vi CÁC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài .2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu nước 2.1.1 Nghiên cứu nước 2.1.2 Nghiên cứu nước 2.2 Vi khuẩn acid acetic 2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn acid acetic .4 2.2.2 Phân loại 2.2.3 Vai trò quan trọng vi khuẩn acid acetic 2.3 Giới thiệu acid acetic 2.3.1 Giới thiệu chung acid acetic 2.3.2 Phương pháp sản xuất 2.3.3 Ứng dụng 10 2.4 Tổng quan trình lên men vi sinh vật 12 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ 2.4.1 Bản chất trình lên men .12 2.4.2 Quá trình lên men acid acetic .12 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 13 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Phương tiện nghiên cứu 15 3.1.1 Thời gian địa điểm 15 3.1.2 Nguyên liệu 15 3.1.3 Thiết bị - dụng cụ hóa chất 15 3.1.4 Phương pháp theo dõi tiêu 16 3.1.5 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn acid acetic 17 3.2.2 Đặc tính hình thái, sinh lý sinh hóa 17 3.2.3 Sơ tuyển chủng vi khuẩn có khả sinh acid acetic 18 3.2.4 Khảo sát khả chịu acid nồng độ acid khác 18 3.2.5 Khảo sát khả chịu nhiệt vi khuẩn acid acetic 18 3.2.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn AAB chịu nhiệt .19 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 20 4.1 Phân lập xác định đặc tính chủng vi khuẩn acid acetic 20 4.2 Đặc tính hình thái, sinh lý sinh hóa chủng AAB 22 4.3 Kết thử nghiệm khả sinh acid acetic 25 4.4 Khả chịu acid vi khuẩn acid acetic 27 4.5 Khả chịu nhiệt vi khuẩn acid acetic 28 4.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic 30 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iii Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỤ LỤC 3: BẢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THỐNG KÊ Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iv Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Kết phân lập chủng AAB 22 Bảng 2: Kết phân loại chủng AAB 24 Bảng 3: Tỷ lệ vi khuẩn Acetobacter Gluconobacter 25 Bảng 4: Hình dạng khuẩn lạc đặc điểm hình thái chủng AAB 26 Bảng 5: Kết thử nghiệm khả chịu acid cao 15 chủng AAB 28 Bảng 6: Kết thử nghiệm khả chịu nhiệt cao 15 chủng AAB 30 Bảng 7: Kết thí nghiệm khả sinh acid chọn 15 chủng tốt - Bảng 8: Bảng thống kê phát triển chủng AAB - Bảng 9: Số liệu hàm lượng acid chủng AAB - - Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học v Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Vi khuẩn Acetobacter aceti Hình 2: Cấu trúc hóa học acid acetic Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc AAB môi trường có chứa CaCO 20 Hình 4: Hình hình dạng vi khuẩn nhuộm Gram số chủng AAB .21 Hình : Sự biến đổi màu môi trường thị sau 72 23 Hình 6: Sự biến đổi màu thị số chủng AAB 25 Hình 7: Khả chịu acid chủng AAB 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%, 2,5% 27 Hình 8: Khuẩn lạc chủng AAB ở: 30oC, 37oC, 39oC, 41oC 43oC 29 Hình 9: Sự phát triển chủng vi khuẩn AAB 30oC 31 Hình 10: Hàm lượng acid chủng AAB 30oC 31 Hình 11: Sự phát triển chủng vi khuẩn AAB 37oC 32 Hình 12: Hàm lượng acid chủng AAB 37oC 32 Hình 13: Sự phát triển chủng vi khuẩn AAB 38oC 33 Hình 14: Hàm lượng acid chủng AAB 38oC 33 Hình 15: Sự phát triển chủng vi khuẩn AAB 39oC 34 Hình 16: Hàm lượng acid chủng AAB 39oC 34 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vi Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Martin R Adams and Maurice O Moss 2008 Food Microbiology University of Surrey, Guildford, UK Matsushita, K 2009 Thermotolerant acetic acid bacteria: Its physiological features and application for high temperature oxydative fermentation Proceeding of Satellite Seminar in Asian Core Program The National University of Laos, Laos Matsutani, M., H Hirakawa, M Nishikura, W Soemphol, I Ali Ibnaof Ali, T Yakushi, and K Matsushita 2011 Increased number of arginine-based salt brigdes contributes to the thermotolerance of thermotolerant acid acetic bacteria, pp 120-124 Moryadee, A and P Wasu 2008 Isolation of thermotolerant acid acetic bacteria from fruits for vinegar production Research Journal of Microbiology, vol 3, No 3, pp.209-212 Nanda, K., M Taniguchi, S Ujike, N Ishihara, H Mori, H Ono, Y Murooka 2001 Characterization of acid acetic bacteria in traditional acetic acid fermentions of rice vinegar (Komesu) and unpolished rice vinegar (Kurosu) produced in Japan Applied and Environmental Microbiology 67, pp.986-990 Ndoye, B., S Lebecque, R Dubois-Dauphin, L Tounkara, A T Guiro, C, Kere, B Diarawa, and P Thonart 2006 Thermoresistant properties of acetic acid bacteria isolatated from tropical products of Sub-Saharan Africa and destined to industrial vinegar Enzyme and Microbial Technology, Vol 39, pp.916-923 Ndoye, B., Weekers, F., Diawara, B., Guiro, A T & Thonart, P (2007) Survival and preservation after freeze-dying process of thermoresistant Ohmori, S., H Masai, K Arima and T Beppu 1980 Isolation and identification of acetic acid bacteria for submerged acetic acid fermentation at high temperature Agric, Biol Chem 44 (12), pp.2901-2906 Randazzo, C L., H Heiling, C Restuccia, P Giudici, and C Caggia 2005 Bacterial population in traditional sourdough evaluated by molecular methods Journal of Applied Microbiology 99, pp.251-258 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 40 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Sacki., G Theeragool, K Matsushita, H Toyama, N Lotong, and O Adachi, 1997 Development of thermotolerant acetic acid bacteria useful for vinegar fermentation at high temperatures Biosci Biotech Biochem 61 (1), pp.138-145 Schuller, G., C Hertel, and W P Hammes 2000 Gluconacetobacter entanii sp Nov., isolated from submerged high-acid industrial vinegar fermentations International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, pp.2013-2020 Sievers, M., A Lorenzo, S Gianotti, C Boesch, and M Teuber 1996 16-23S ribosomal RNA spacer regions of Acetobacter europaeus and A xylinum, tRNA genes and antitermination sequences FEMS Microbiology Letters 142, pp.43-48 Sievers, M., C Gaberthuel, C Boesch, W Ludwig, and M Teuber 1995 Phylogenetic position of Gluconobacter species as coherent cluster separated from all Acetobacter species on the basis of 16S ribosomal RNA sequences FEMS Microbiology Letter 126, pp 123-126 Sokollek, J S., Christian Hertel, Walter P Hammes 1998 Cultivation and preservation of vinegar bacteria Journal of Biotechnology 60, pp 195-206 Sudsakda, S., W Srichareon and W Pathom-Aree, 2007 Comparison of three enrichment broths for the isolation of thermotolerant acetic acid bacteria from flowers and fruits Res J Microbiol Treek, J 2005 Quick identification of acetic acid bacteria based on nucleotide sequences of the 16S-23S rDNA internal transcribed spacer region and of the PQQ-dependent alcohol dehydrogenase gene Systematic and Applied Microbiology 28, pp.735-745 Watchara Kanchanarach 209 Studies on Acetuc acid Fermentation and Acetic acid Resistance Abilities in Thermotolerant Acetobacter pasteurianus Strains Yukphan, P., Takahashi, M., Potacharoen, W., Tanasupawat, S., Nakagawa, Y., Tanticharoen, M & Yamada, Y 2005 Gluconobacter albidus (ex Kondo and Ameyama 1958) InValidation of the Publication of New Names and New Combinations Previously Effectively Published Outside the IJSEM, List no 93 Int J Syst Evol Microbiol 55, 983-985 Trang web Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 41 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-chon-giong-vi-khuan-va-khao-sat-mot-so-dieukien-len-men-acetic-de-lam-giam-trai-cay-42852/ (ngày 15/6/2014) http://en.wikipedia.org/wiki/Acetic_acid, (ngày 15/6/2014) http://www.vinachem.com.vn/Desktop.aspx/Xuat-ban-pham/4/11/, (ngày 16/6/2014) http://www.asm.org/index.php/asm-newsroom/press-releases/2-uncategorised/92867vinegar-kills-tuberculosis-and-other-mycobacteria (ngày 24/11/2014) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 42 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM Kính hiển vi Cân phân tích Tủ ủ Nồi khử trùng Máy OD Tủ ủ nhiệt Tủ cấy Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Buồng ủ cách thủy Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.1 Phương pháp nhuộm Gram − Nhỏ giọt nước khử trùng lên kính mang vật − Lấy sinh khối môi trường thạch MRS (hoặc ống trữ), cho vào giọt nước vô trùng miếng lam vô trùng, trãi cho thật mỏng theo hình xoắn ốc − Lướt mặt nước kính mang vật lửa cách khoảng 10cm độ lần để giết chết vi sinh vật dán chúng lên kính mang vật − Nhỏ giọt Crystal violet cho phủ nơi cố định, để 60 giây − Rửa nước từ – giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước − Nhỏ giọt Lugol 60 giây (gắn phẩm nhuộm violet vào tế bào G+) − Rửa cồn: thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, đến giọt cồn không màu tím nữa, nhỏ từ từ − Rửa nước vài giây, chậm nhẹ giấy thấm cho khô − Nhỏ – giọt Safranine để 60 giây − Rửa nước vài giây − Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ lửa cho khô nước − Quan sát kính hiển vi Kết quả: Tế bào vi sinh vật có màu tím xanh: vi khuẩn Gram dương Tế bào vi sinh vật có màu hồng đỏ: Vi khuẩn Gram âm Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp (2002) 2.2 Thử nghiệm catalase Nguyên tắc: vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý chứa chuỗi dẫn truyền điện có cytochrome có enzyme catalase ( trừ streptococcus spp) Enzyme thành viên hệ thống enzyme bảo vệ tế bào khỏi tổn thương dẫn xuất độc tính cao oxy phân tử tế bào hiếu khí kỵ khí tùy ý Các vi sinh có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp với oxy chất nhận điện tử cuối chuỗi dẫn truyền điện tử tạo H 2O2 Catalase thủy phân hydrogen peroxyde (H2O2) thành H2O O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ tính cao tế bào Tuy nhiên, catalase, nhiều enzyme oxydase khác hệ thống enzyme bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa có khả thủy phân hydrogen peroxyde Các enzyme diện tế bào, vi sinh vật hiếu khsi kỵ khí tùy ý có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí Sự thủy phân hydrogen peroxyde giải phóng O2 ghi nhận qua tượng sủi bọt khí Phương pháp tiến hành: - Hóa chất sử dụng dung dịch hydrogen peroxyde 30% giữ lạnh chai màu nâu, tránh ánh sáng; dung dịch đệm phosphate pH 7,0 - Có thể thực thử nghiệm catalase phương pháp sau: Thử nghiệm phiến kính (lame): dùng kim cấy lấy sinh khối từ khuẩn lạc đặt lên phiến kính Nhỏ giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật phiến kính Ghi nhận sủi bọt có - Đọc kết quả: thử nghiệm (+) có tượng sủi bọt khí O2 tạo ngược lại (-) tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2008) 2.3 Thử nghiệm Oxydase (Trần Linh Thước, 2003) Nguyên tắc: Thử nghiệm nhằm xác định diện hệ enzyme oxydase vi sinh vật Thành viên quan trọng hệ enzyme cytochrome oxydase chuỗi dẫn truyền điện tử hô hấp hiếu khí với O chất điện tử sau nên diện loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy ý Số chủng loài cytochrome oxydase phát nhờ thuốc thử p-phenylenediamine Trong điều kiện có diện cytochrome c khử tế bào, thuốc thử bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương Phương pháp thực hiện: Nhỏ giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào giọt nước cất vô trùng kính mang vật Dùng thuốc thử oxydase đặt lên giọt nước cất vô trùng chứa sinh khối vi khuẩn Kết quả: Thử nghiệm (+) xuất màu xanh dương đậm thử nghiệm (-) không xuất màu xanh dương đậm Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 3: BẢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM Bảng 7: Kết thí nghiệm khả sinh acid chọn 15 chủng tốt STT Loại mẫu Chuối Chủng phân lập Vùng màu vàng (mm) Chọn 24h 36h C1 12 23 * C2 22 46 * MC2 15 30 * K1 11 33 * K2 14 N1 4 N2 TL 17 37 KO1 KO2 V1 8 V2 DH1 DH2 29 * BB1 17 31 * 17 BB2 13 28 * 18 X1 11 26 * X2 11 24 * X3 12 25 * D1 D2 12 24 A1 5 A2 21 XO1 7 XO2 L1 L2 16 43 * NH1 12 31 * NH2 14 39 * 9 11 12 13 14 15 16 19 Mãng Cầu Khế Nhãn Thanh Long Khóm Vải Dưa Hấu Bòn Bon Xoay 20 21 22 23 Đào Sa pô 24 25 26 27 28 29 30 Xoài Lựu Nho Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học MC1 * * Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 8: Bảng thống kê phát triển chủng AAB Nhiệt độ 30oC Sự phát triển AAB theo ngày đo OD (550nm) Chủng NH2 0,057 0,335 0,357 0,401 0,434 0,475 0,521 0,578 MC2 0,042 0,286 0,312 0,367 0,418 0,451 0,501 0,525 DH2 0,042 0,312 0,367 0,421 0,462 0,496 0,536 0,592 L2 0,046 0,297 0,325 0,4 0,447 0,483 0,527 0,565 NH2 0,056 0,263 0,311 0,357 0,401 0,443 0,456 0,46 MC2 0,042 0,243 0,271 0,305 0,382 0,412 0,437 0,442 DH2 0,041 0,293 0,316 0,371 0,417 0,46 0,467 0,471 L2 0,047 0,213 0,246 0,291 0,368 0,433 0,444 0,448 NH2 0,058 0,235 0,246 0,276 0,306 0,326 0,365 0,386 MC2 0,041 0,212 0,222 0,251 0,278 0,285 0,302 0,345 DH2 0,043 0,241 0,261 0,282 0,312 0,321 0,358 0,391 L2 0,046 0,207 0,22 0,243 0,267 0,273 0,297 0,353 NH2 0,11 0,116 0,127 0,133 0,141 0,142 0,145 0,11 MC2 0,057 0,078 0,98 0,99 0,113 0,115 0,117 0,057 DH2 0,92 0,121 0,131 0,135 0,145 0,147 0,148 0,92 L2 0,089 0,114 0,123 0,128 0,131 0,132 0,133 0,089 o 37 C o 38 C 39oC Ghi chú: Giá trị bảng giá trị trung bình lần lặp lại (theo dõi ngày 30oC, 37oC, 38 oC 39oC đo OD bước sóng 550nm.) Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 9: Số liệu hàm lượng acid chủng AAB Nhiệt độ 30oC o Hàm lượng acid AAB theo dõi ngày (%w/v) Chủng MC2 0,76 1,68 1,88 2,36 2,88 3,04 2,88 NH2 0,96 2,08 2,76 3,24 3,36 3,32 3,12 C2 1,04 2,68 2,96 3,32 3,6 3,4 3,2 L2 0,8 1,8 2,28 2,68 2,88 2,76 MC2 0,6 1,88 2,16 2,92 3,16 2,88 2,76 NH2 0,96 2,28 3,04 3,48 3,56 3,28 3,24 C2 0,96 3,24 3,24 3,6 3,64 3,48 3,36 L2 0,8 2,88 2,88 3,32 3,4 3,16 3,12 MC2 0,6 1,88 2,68 3,12 2,76 2,68 NH2 0,96 2,16 3,04 3,44 3,2 3,12 3,08 C2 0,96 2,28 3,28 3,56 3,4 3,2 3,16 L2 0,8 2,04 2,88 3,28 3,12 2,96 2,76 MC2 0,2 0,6 0,6 0,76 0,72 0,72 0,6 NH2 0,84 0,96 0,96 0,96 0,92 0,92 0,88 C2 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 L2 0,6 0,84 0,84 0,84 0,76 0,72 0,76 37 C 38oC 39oC Ghi chú: Giá trị bảng giá trị trung bình lần lặp lại Sô liệu ngày 30oC, 37oC, 38 oC 39oC Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THỐNG KÊ 30°C General Linear Model: Nồngđộ versus Ngày, Chủng Factor Type Levels Values Ngày fixed 1, 2, 3, 4, 5, 6, Chủng fixed C2, L2, MC2, NH2 Analysis of Variance for Nồngđộ, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS AdjSS Adj MS Ngày6 49.4613 49.4613 8.2435 211.84 Chủng 6.3113 6.3113 2.1038 54.06 0.000 Ngày*Chủng 18 1.5463 1.5463 0.0859 2.21 0.013 Error 56 2.1792 2.1792 0.0389 Total 83 59.4981 S = 0.197267 R-Sq = 96.34% F P 0.000 R-Sq(adj) = 94.57% Unusual Observations for Nồngđộ ObsNồngđộ Fit SE Fit Residual St Resid 37 1.92000 2.36000 0.11389 -0.44000 -2.73 R 52 3.72000 3.36000 0.11389 0.36000 2.24 R 55 3.24000 3.60000 0.11389 -0.36000 -2.24 R R denotes an observation with a large standardized residual Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence NgàyChủng N Mean Grouping C2 3.6000 A C2 3.4000 A B NH2 3.3600 A B C NH2 3.3200 A B C C2 3.3200 A B C NH2 3.2400 A B C D C2 3.2000 A B C D NH2 3.1200 A B C D MC2 3.0400 A B C D L2 3.0000 A B C D C2 2.9600 B C D E MC2 2.8800 B C D E F MC2 2.8800 B C D E F Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ L2 2.8800 B C D E F L2 2.7600 C D E F NH2 2.7600 C D E F C2 2.6800 D E F G L2 2.6800 D E F G MC2 2.3600 L2 2.2800 F G H I NH2 2.0800 G H I MC2 1.8800 H I L2 1.8000 H I MC2 1.6800 I C2 1.0400 J NH2 0.9600 J L2 0.8000 J MC2 0.7600 J E F G H Means that not share a letter are significantly different 37°C General Linear Model: Nồngđộ versus Ngày, Chủng Factor Type Levels Values Ngày fixed 1, 2, 3, 4, 5, 6, Chủng fixed C2, L2, MC2, NH2 Analysis of Variance for Nồngđộ, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS AdjSS Adj MS Ngày6 58.5168 58.5168 9.7528 223.98 Chủng 5.9698 5.9698 1.9899 45.70 0.000 Ngày*Chủng 18 1.9646 1.9646 0.1091 2.51 0.005 Error 56 2.4384 2.4384 0.0435 Total 83 68.8896 S = 0.208669 R-Sq = 96.46% F P 0.000 R-Sq(adj) = 94.75% Unusual Observations for Nồngđộ ObsNồngđộ Fit SE Fit Residual St Resid 29 2.64000 3.04000 0.12048 -0.40000 -2.35 R 34 3.24000 2.88000 0.12048 0.36000 2.11 R 70 2.64000 3.16000 0.12048 -0.52000 -3.05 R 73 2.40000 2.76000 0.12048 -0.36000 -2.11 R Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 74 3.12000 2.76000 Trường Đại học Cần Thơ 0.12048 0.36000 2.11 R R denotes an observation with a large standardized residual Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence NgàyChủng N Mean Grouping C2 3.6400 A C2 3.6000 A NH2 3.5600 A B NH2 3.4800 A B C C2 3.4800 A B C L2 3.4000 A B C D C2 3.3600 A B C D L2 3.3200 A B C D NH2 3.2800 A B C D NH2 3.2400 A B C D C2 3.2400 A B C D C2 3.2400 A B C D MC2 3.1600 A B C D L2 3.1600 A B C D L2 3.1200 A B C D NH2 3.0400 A B C D MC2 2.9200 B C D E L2 2.8800 C D E L2 2.8800 C D E MC2 2.8800 C D E MC2 2.7600 NH2 2.2800 E F G MC2 2.1600 F G MC2 1.8800 G NH2 0.9600 H C2 0.9600 H L2 0.8000 H MC2 0.6000 H D E F Means that not share a letter are significantly different 38°C General Linear Model: Nồngđộ versus Ngày, Chủng Factor Type Levels Ngày fixed 1, 2, 3, 4, 5, 6, Chủng fixed C2, L2, MC2, NH2 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Values Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ Analysis of Variance for Nồngđộ, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS AdjSS Adj MS Ngày6 56.3530 56.3530 9.3922 332.05 Chủng 2.3827 2.3827 0.7942 28.08 0.000 Ngày*Chủng 18 0.1457 0.1457 0.0081 0.29 0.998 Error 56 1.5840 1.5840 0.0283 Total 83 60.4654 S = 0.168184 R-Sq = 97.38% F P 0.000 R-Sq(adj) = 96.12% Unusual Observations for Nồngđộ ObsNồngđộ Fit SE Fit Residual St Resid 88 2.40000 2.68000 0.09710 -0.28000 -2.04 R 97 2.52000 2.88000 0.09710 -0.36000 -2.62 R 105 3.72000 3.44000 0.09710 0.28000 2.04 R 121 2.76000 3.12000 0.09710 -0.36000 -2.62 R 134 3.24000 2.96000 0.09710 0.28000 2.04 R R denotes an observation with a large standardized residual Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence NgàyChủng N Mean Grouping C2 3.5600 A NH2 3.4400 A B C2 3.4000 A B C C2 3.2800 A B C D L2 3.2800 A B C D NH2 3.2000 A B C D E C2 3.2000 A B C D E C2 3.1600 A B C D E NH2 3.1200 A B C D E L2 3.1200 A B C D E MC2 3.1200 A B C D E NH2 3.0800 A B C D E NH2 3.0400 A B C D E MC2 3.0000 B C D E L2 2.9600 B C D E L2 2.8800 C D E L2 2.7600 D E F MC2 2.7600 D E F MC2 2.6800 E F G MC2 2.6800 E F G C2 2.2800 Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học F G H Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ NH2 2.1600 G H L2 2.0400 H MC2 1.8800 H NH2 0.9600 I C2 0.9600 I L2 0.8000 I MC2 0.6000 I Means that not share a letter are significantly different 39°C General Linear Model: Nồngđộ versus Ngày, Chủng Factor Type Levels Values Ngày fixed 1, 2, 3, 4, 5, 6, Chủng fixed C2, L2, MC2, NH2 Analysis of Variance for Nồngđộ, using Adjusted SS for Tests Source Ngày6 DF Seq SS Adj SS 0.40423 0.40423 0.06737 Chủng3 1.69371 1.69371 Adj MS 1.65 F 0.56457 0.150 13.84 Ngày*Chủng 18 0.41589 0.41589 0.02310 Error 56 2.28480 2.28480 0.04080 Total 83 4.79863 S = 0.201990 R-Sq = 52.39% P 0.000 0.57 0.909 R-Sq(adj) = 29.43% Unusual Observations for Nồngđộ ObsNồngđộ Fit SE Fit Residual St Resid 0.60000 0.96000 0.11662 -0.36000 -2.18 R 1.32000 0.96000 0.11662 0.36000 2.18 R 22 1.32000 0.84000 0.11662 0.48000 2.91 R 24 0.48000 0.84000 0.11662 -0.36000 -2.18 R 45 1.44000 0.96000 0.11662 0.48000 2.91 R 67 1.32000 0.96000 0.11662 0.36000 2.18 R R denotes an observation with a large standardized residual Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence NgàyChủng N Mean Grouping NH2 0.9600 A NH2 0.9600 A NH2 0.9600 A C2 0.9600 A C2 0.9600 A C2 0.9600 A C2 0.9600 A Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 C2 0.9600 A C2 0.9600 A C2 0.9600 A NH2 0.9200 A NH2 0.9200 A NH2 0.8800 A NH2 0.8400 A B L2 0.8400 A B L2 0.8400 A B L2 0.8400 A B L2 0.7600 A B L2 0.7600 A B MC2 0.7600 A B MC2 0.7200 A B L2 0.7200 A B MC2 0.7200 A B MC2 0.6000 A B MC2 0.6000 A B MC2 0.6000 A B L2 0.6000 A B MC2 0.2000 B Trường Đại học Cần Thơ Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học [...]... múi và dứa, chiếm hơn 73% tổng diện tích trồng cây ăn quả cả nước Từ những lý do trên với nguồn nguyên liệu trái cây dồi dào, sẵn có quanh năm Dựa vào đó mà đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây được thực hiện nhằm mục đích đa dạng hơn về nguồn nguyên liệu: mẫu và địa danh, mong muốn phân lập được nhiều chủng vi khuẩn acid acetic có khả năng chịu nhiệt cao và sinh... cao và sinh acid mạnh Từ đó có thể phân loại các chủng AAB có đặt tính tốt và tiến tới vi c sản xuất giống thuần chủng cung cấp cho các cơ sở sản xuất 1.2 Mục tiêu đề tài Đề tài nhằm phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây để lên men acetic Nội dung thực hiện: - Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic - Khảo sát các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của... Acetobacter và Gluconobacter được sử dụng lên men acid acetic phổ biến nhất vì chúng có khả năng oxy hóa rượu tốt tạo acid acetic với nồng độ cao và hiểu được cơ chế lên men chịu nhiệt của AAB Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây; Đề tài Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lên men acid acetic chịu nhiệt của Huỳnh Xuân Phong (2011) đã phân lập được 132 chủng từ 27... men tốt chưa được đa dạng Vì thế, đề tài “ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây nhằm mục đích đa dạng nguồn nguyên liệu cũng như đa dạng về loài của chủng vi khuẩn này 2.2 Vi khuẩn acid acetic 2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn acid acetic Hiện nay, người ta đã biết tới hơn 20 loài AAB, những vi khuẩn này dễ tìm thấy trong không khí, đất và nước Vì vậy, các dịch nước quả, bia, rượu... hoa và trái cây của một số loại cây ăn quả sơ tuyển được 13 chủng chịu nhiệt và sinh acid mạnh Gần đây, Võ Thị Ngọc Bích (2012), với đề tài “Ảnh hưởng của ethanol và acid acetic đến khả năng lên men của Acetobacter tropicalis” đã khảo sát và so sánh các đặc tính sinh lý,sinh hóa, nhưng nhìn chung, nguồn nguyên liệu trái cây để phân lập tìm ra vi khuẩn acid acetic Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 3 Vi n... 2008 đã phân lập được 43 giống Acetobacter, 13 giống Gluconobacter từ 13 loại trái cây như: táo, anh đào Jamaica, nhãn, xoài, dứa và chôm chôm,… 2.1.2 Nghiên cứu trong nước Ở Vi t Nam đã có một số nghiên cứu về vi khuẩn acid acetic điển hình như: Nghiên cứu điều kiện lên men của các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt (Đặng Thụy Thùy Vân 2010) đã phân lập được hơn 20 chủng từ 10 loại trái cây khác... vi sinh đã phân lập được một số chủng chịu nhiệt cao lên men tốt Ndoye (2006) đã dựa vào đặc tính chịu nhiệt của AAB, chọn lọc ra 2 chủng AAB chịu nhiệt: CWBI-B418 thuộc loài Acetobacter senegalensis và CWBI-B419 thuộc loài Acetobacter pasteurinus phân lập từ trái xoài ở Burkina Faso, có khả năng phát triển và lên men acid acetic tối ưu ở 35oC và có thể phát triển đến 42oC trong 17 chủng AAB phân lập. .. phân lập - Khảo sát khả năng chịu nhiệt và chịu acid acetic của các chủng phân lập - Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển và lên men acetic - Tuyển chọn các chủng AAB chịu nhiệt lên men tốt nhất Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Vi n NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu trong và. .. ra vi khuẩn Acetobacter còn được ứng dụng trong sản xuất nước giải khát, bánh mì đen,… (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2008) 2.3 Giới thiệu về acid acetic 2.3.1 Giới thiệu chung acid acetic Acid acetic (hay còn gọi là acid ethanoic) là một acid hữu cơ, công thức hóa học là CH3COOH, khối lượng phân tử của acid acetic là 60 g/mol Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid monoprotic Acid acetic. .. ngành Vi Sinh Vật Học 19 Vi n NC &PT Công Nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và xác định đặc tính của các chủng vi khuẩn acid acetic Với mục đích có thể thu nhập được các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ nhiều nguồn khác nhau, tổng cộng có 15 loại trái cây chín được thu từ các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long để phân