BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY CÓ MÚI CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS HUỲNH XUÂN PHONG NGUYỄN THỊ THUỲ DƢƠNG MSSV: 3113707 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY CÓ MÚI CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS HUỲNH XUÂN PHONG NGUYỄN THỊ THUỲ DƢƠNG MSSV: 3113707 LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37 Cần Thơ, Tháng 12/2014 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS Huỳnh Xuân Phong Nguyễn Thị Thuỳ Dương DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………….……………………… Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Quý Thầy Cô tận tình giảng dạy thời gian học tập vừa qua tạo điều kiện cho thực luận văn Trong trình thực luận văn, nhận nhiều giúp đỡ từ cán sinh viên Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tôi chân thành cảm ơn cô Ngô Thị Phương Dung, thầy Huỳnh Xuân Phong thầy Phạm Hồng Quang tận tình truyền đạt kiến thức với anh Nguyễn Ngọc Thạnh tận tình giúp đỡ hướng dẫn đóng góp ý kiến cho suốt trình thực thí nghiệm, anh chị cán phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học giúp đỡ để hoàn thành tốt luận văn Cám ơn gia đình, người thân bạn bè chỗ dựa vững cho tinh thần vật chất giúp an tâm học tập làm luận văn thời gian qua Nguyễn Thị Thùy Dương Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƢỢC Acid acetic ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, acid acetic acid hữu sử dụng phổ biến điều vị chế biến thực phẩm Vi khuẩn acid acetic có ý nghĩa quan trọng trình lên men, lên men giấm ứng dụng rộng rãi phổ biến Đề tài phân lập 25 dòng vi khuẩn acid acetic (Acid Acetic Bacteria, AAB) từ 11 mẫu trái có múi lấy từ tỉnh ĐBSCL (Vĩnh Long, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang, Bến Tre, Sóc Trăng, Cà Mau Định danh sơ thông qua khả oxy hóa acetate cho thấy có 22 chủng thuộc giống Acetobacter chủng thuộc giống Gluconobacter Kết thử nghiệm khả sinh acid môi trường 0,01% bromocresol green, khảo sát khả phát triển nhiệt độ (30oC,37oC, 39oC, 41oC, 43oC 45oC) nồng độ acid ban đầu (0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% 3%) sơ tuyển 10 chủng AAB (VB.VL1, VB.VL6, RB.BT1, RB.BT2, RC.BT, RC.KG1, VCh.VL1, VCh.VL3, VCh.CM2 VQ.BT) Kết thí nghiệm lên men nhiệt độ khác tuyển chọn hai chủng vi khuẩn chịu nhiệt có khả lên men acid mạnh VCh.VL1 VQ.BT, chủng VCh.VL1 vượt trội chủng lại nhiệt độ cao mật số khả sinh acid, đạt 0,6% w/v vào ngày lên men thứ Kết thử nghiệm khả phát triển môi trường có bổ sung acid acetic cho thấy hai chủng VCh.VL1 VQ.BT phát triển đến nồng độ 0,4% w/v 37oC 39oC VCh.VL1 có khả có khả sinh acid tốt chủng RB.ST2 môi trường có 4% w/v ethanol 37oC đạt đến 0,64% w/v Từ khoá: acid acetic, vi khuẩn acid acetic Chuyên ngành Vi Sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CÁC TỪ VIẾT TẮT vi CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu trình lên men từ vi sinh vật 2.1.1 Bản chất trình lên men 2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 2.2 Giới thiệu trình lên men acid acetic 2.3 Vi khuẩn acid acetic 2.3.1 Một số loài Vi khuẩn acid acetic có nhiều ý nghĩa thực tế 2.3.2 Một số ứng dụng quan trọng vi khuẩn Acetobacter CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 3.1.1 Nguyên liệu 3.1.2 Hoá chất 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phân lập dòng vi khuẩn acid acetic 3.2.2 Xác định đặc tính hình thái, sinh hoá dòng vi khuẩn acid acetic 10 3.2.3 Thử nghiệm khả sinh acid acetic 10 3.2.4 Khảo sát khả phát triển lên men nồng độ acid khác 11 Chuyên ngành Vi Sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.5 Khảo sát khả chịu nhiệt vi khuẩn acid acetic 11 3.2.6 Tuyển chọn dòng vi khuẩn acetic chịu nhiệt có khả sinh acid mạnh 11 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12 4.1 Phân lập dòng vi khuẩn acid acetic 12 4.2 Xác định đặc tính hình thái, sinh hóa dòng vi khuẩn acid acetic 14 4.3 Thử nghiệm khả sinh acid acetic 18 4.4 Khả phát triển nồng độ acid khác 20 4.5 Khả chịu nhiệt vi khuẩn acid acetic 22 4.6 Tuyển chọn vi khuẩn acetic chịu nhiệt có khả sinh acid mạnh 24 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 Chuyên ngành Vi Sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng Kết xác định hình thái, sinh lý, sinh hóa 14 Bảng Kết định danh sơ chủng AAB 17 Bảng Khả phát triển nồng độ acid khác chủng AAB 21 Bảng Kết thử nghiệm khả chịu nhiệt cao dòng AAB 23 Chuyên ngành Vi Sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình Vi khuẩn Acetobacter xylinum Hình Khuẩn lạc tạo vòng halo môi trƣờng (A), môi trƣờng đối chứng có CaCO3 (B) CaCO3 (C) 12 Hình Một số chủng AAB tạo vòng sáng halo môi trƣờng có CaCO 12 Hình Hình nhuộm Gram (độ phóng đại 100) số dòng AAB 13 Hình Sƣ biến đổi màu môi trƣờng thị sau 72 16 Hình Sự biến đổi màu thị số dòng AAB 24 18 Hình Khả phát triển nồng độ acid 0,5% số chủng AAB 20 Hình Thử khả chịu nhiệt số chủng AAB ở: 41oC (A) 43oC (B) 22 Hình Sự phát triển mƣời chủng vi khuẩn AAB 30oC 25 Hình 10 Sự biến đổi hàm lƣợng acid mƣời chủng vi khuẩn AAB 30oC 25 Hình 11 Sự phát triển mƣời chủng vi khuẩn AAB 37oC 26 Hình 12 Sự thay đổi hàm lƣợng acid sinh mƣời chủng AAB 37oC 26 Hình 13 Sự phát triển mƣời chủng vi khuẩn AAB 38oC 27 Hình 14 Sự thay đổi hàm lƣợng acid sinh mƣời chủng AAB 38oC 27 Hình 15 Sự phát triển mƣời chủng vi khuẩn AAB 39oC 28 Hình 16 Sự thay đổi hàm lƣợng acid sinh mƣời chủng AAB 39 oC 28 Chuyên ngành Vi Sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ CÁC TỪ VIẾT TẮT AAB Acetic Acid Bacteria ĐBSCL Đồng Sông Cửu Long MC Bacterial cellulose NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Chuyên ngành Vi Sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 12 Sự biến đổi hàm lƣợng acid sinh mƣời chủng AAB 38oC ( đơn vị % w/v) Chủng Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày VB.VL1 0.04 0.16 0.28 0.4 0.4 0.4 0.4 0.32 VB.VL6 0.04 0.12 0.28 0.36 0.4 0.44 0.44 0.32 RC.KG1 0.12 0.16 0.36 0.48 0.4 0.36 0.4 0.28 0.16 0.48 0.44 0.4 0.48 0.48 0.36 VCh.VL1 0.08 0.2 0.32 0.68 0.64 0.6 0.56 0.48 VCh.VL3 0.04 0.12 0.24 0.64 0.84 0.8 0.52 0.56 RB.ST1 0.08 0.24 0.32 0.52 0.6 0.8 0.72 0.44 RB.ST2 0.12 0.24 0.32 0.68 0.92 0.76 0.64 0.28 VQ.BT 0.04 0.2 0.36 0.48 0.52 0.36 0.36 0.24 0.12 0.28 0.68 0.64 0.44 0.32 0.4 RC.BT VCh.CM2 Bảng 13 Sự biến đổi hàm lƣợng acid sinh mƣời chủng AAB 39oC ( đơn vị % w/v) Chủng Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày VB.VL1 0.04 0.12 0.24 0.36 0.36 0.44 0.4 0.32 VB.VL6 0.2 0.24 0.24 0.2 0.24 0.36 0.2 RC.KG1 0.04 0.24 0.36 0.44 0.32 0.36 0.36 0.24 RC.BT 0.08 0.24 0.32 0.28 0.24 0.36 0.24 0.2 VCh.VL1 0.12 0.16 0.24 0.4 0.48 0.6 0.56 0.44 VCh.VL3 0.24 0.28 0.28 0.24 0.24 0.28 0.2 RB.ST1 0.04 0.2 0.32 0.28 0.32 0.28 0.4 0.2 RB.ST2 0.08 0.24 0.32 0.32 0.32 0.32 0.4 0.36 VQ.BT 0.04 0.32 0.36 0.36 0.48 0.4 0.35 0.24 0.24 0.4 0.4 0.4 0.4 0.44 0.24 VCh.CM2 Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ One-way ANOVA: Hàmlượng acid Ngày 7_39 versus Chủng VK Source Chủng VK Error Total DF 20 29 S = 0,05797 Level RB.ST1 RB.ST2 RC.BT RC.KG1 VB.VL1 VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT N 3 3 3 3 3 SS 0,35568 0,06720 0,42288 MS 0,03952 0,00336 R-Sq = 84,11% Mean 0,20000 0,36000 0,20000 0,24000 0,32000 0,20000 0,24000 0,44000 0,20000 0,52000 StDev 0,06928 0,00000 0,06928 0,00000 0,06928 0,06928 0,00000 0,06928 0,06928 0,06928 F 11,76 P 0,000 R-Sq(adj) = 76,96% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( -* ) ( -* -) ( -* ) ( -* -) ( -* ) ( -* ) ( -* -) ( -* ) ( -* ) ( * -) -+ -+ -+ -+ 0,24 0,36 0,48 0,60 Pooled StDev = 0,05797 Grouping Information Using Fisher Method ChủngVK VQ.BT VCh.VL1 RB.ST2 VB.VL1 VCh.CM2 RC.KG1 VCh.VL3 VB.VL6 RC.BT RB.ST1 N 3 3 3 3 3 Mean Grouping 0,52000 A 0,44000 A B 0,36000 B C 0,32000 C D 0,24000 D E 0,24000 D E 0,20000 E 0,20000 E 0,20000 E 0,20000 E Means that not share a letter are significantly different Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of Chủng VK Simultaneous confidence level = 44,42% Chủng VK = RB.ST1 subtracted from: Chủng VK RB.ST2 RC.BT RC.KG1 VB.VL1 VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT Lower 0,06127 -0,09873 -0,05873 0,02127 -0,09873 -0,05873 0,14127 -0,09873 0,22127 Center 0,16000 0,00000 0,04000 0,12000 0,00000 0,04000 0,24000 0,00000 0,32000 Upper 0,25873 0,09873 0,13873 0,21873 0,09873 0,13873 0,33873 0,09873 0,41873 -+ -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 Chủng VK = RB.ST2 subtracted from: Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Chủng VK RC.BT RC.KG1 VB.VL1 VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT ChủngVK RC.BT RC.KG1 VB.VL1 VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT Lower -0,25873 -0,21873 -0,13873 -0,25873 -0,21873 -0,01873 -0,25873 0,06127 Center -0,16000 -0,12000 -0,04000 -0,16000 -0,12000 0,08000 -0,16000 0,16000 Trường Đại học Cần Thơ Upper -0,06127 -0,02127 0,05873 -0,06127 -0,02127 0,17873 -0,06127 0,25873 -+ -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 Chủng VK = RC.BT subtracted from: Chủng VK RC.KG1 VB.VL1 VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT Lower -0,05873 0,02127 -0,09873 -0,05873 0,14127 -0,09873 0,22127 Center 0,04000 0,12000 0,00000 0,04000 0,24000 0,00000 0,32000 Upper 0,13873 0,21873 0,09873 0,13873 0,33873 0,09873 0,41873 -+ -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 Chủng VK = RC.KG1 subtracted from: Chủng VK VB.VL1 VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT Lower -0,01873 -0,13873 -0,09873 0,10127 -0,13873 0,18127 Center 0,08000 -0,04000 0,00000 0,20000 -0,04000 0,28000 Upper 0,17873 0,05873 0,09873 0,29873 0,05873 0,37873 -+ -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 Chủng VK = VB.VL1 subtracted from: Chủng VK VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT ChủngVK VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT Lower -0,21873 -0,17873 0,02127 -0,21873 0,10127 Center -0,12000 -0,08000 0,12000 -0,12000 0,20000 Upper -0,02127 0,01873 0,21873 -0,02127 0,29873 -+ -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 Chủng VK = VB.VL6 subtracted from: Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Chủng VK VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT Lower -0,05873 0,14127 -0,09873 0,22127 Center 0,04000 0,24000 0,00000 0,32000 Trường Đại học Cần Thơ Upper 0,13873 0,33873 0,09873 0,41873 -+ -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 Chủng VK = VCh.CM2 subtracted from: Chủng VK VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT Lower 0,10127 -0,13873 0,18127 Center 0,20000 -0,04000 0,28000 Upper 0,29873 0,05873 0,37873 -+ -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 Chủng VK = VCh.VL1 subtracted from: Chủng VK VCh.VL3 VQ.BT ChủngVK VCh.VL3 VQ.BT Lower -0,33873 -0,01873 Center -0,24000 0,08000 Upper -0,14127 0,17873 -+ -+ -+ -+-( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 Chủng VK = VCh.VL3 subtracted from: Chủng VK VQ.BT Lower 0,22127 Center 0,32000 Upper 0,41873 -+ -+ -+ -+-( -* -) -+ -+ -+ -+ 0,25 0,00 0,25 0,50 One-way ANOVA: Hàm lượng acid Ngày 7_39 versus Chủng VK Source Chủng VK Error Total DF 20 29 S = 0,05797 Level RB.ST1 RB.ST2 RC.BT RC.KG1 VB.VL1 VB.VL6 VCh.CM2 VCh.VL1 VCh.VL3 VQ.BT N 3 3 3 3 3 SS 0,35568 0,06720 0,42288 MS 0,03952 0,00336 R-Sq = 84,11% Mean 0,20000 0,36000 0,20000 0,24000 0,32000 0,20000 0,24000 0,44000 0,20000 0,52000 StDev 0,06928 0,00000 0,06928 0,00000 0,06928 0,06928 0,00000 0,06928 0,06928 0,06928 F 11,76 P 0,000 R-Sq(adj) = 76,96% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( -* ) ( -* -) ( -* ) ( -* -) ( -* ) ( -* ) ( -* -) ( -* ) ( -* ) ( * -) -+ -+ -+ -+ 0,24 0,36 0,48 0,60 Pooled StDev = 0,05797 Grouping Information Using Fisher Method Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Chủng VK VQ.BT VCh.VL1 RB.ST2 VB.VL1 VCh.CM2 RC.KG1 VCh.VL3 VB.VL6 RC.BT RB.ST1 N 3 3 3 3 3 Mean 0,52000 0,44000 0,36000 0,32000 0,24000 0,24000 0,20000 0,20000 0,20000 0,20000 Trường Đại học Cần Thơ Grouping A A B B C C D D E D E E E E E Means that not share a letter are significantly different General Linear Model: lượng acid ngày thứ Factor Type dòng vi khuẩn fixed Levels 10 Values RB.ST1., RB.ST2, RC.BT, RC.KG1, VB.VL1, VB.VL6, VCh.CM1., VCh.VL1, VCh.VL1., VQ.BT nhiệt độ fixed 30, 37, 38, 39 lặp lại random 1, 2, Analysis of Variance for lượng acid ngày thứ 5, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dòng vi khuẩn 1.53852 1.53852 0.17095 24.94 0.000 nhiệt độ 7.04772 7.04772 2.34924 342.69 0.000 lặp lại 0.00288 0.00288 0.00144 0.21 0.811 dòng vi khuẩn*nhiệt độ 27 3.28788 3.28788 0.12177 17.76 0.000 Error 78 0.53472 0.53472 0.00686 Total 119 12.41172 S = 0.0827973 R-Sq = 95.69% R-Sq(adj) = 93.43% Unusual Observations for lượng acid ngày thứ lượng acid ngày Obs thứ Fit SE Fit Residual 0.96000 1.15400 0.04898 -0.19400 -2.91 R 1.44000 1.19400 0.04898 0.24600 3.69 R 10 1.44000 1.27400 0.04898 0.16600 2.49 R 23 1.32000 1.16600 0.04898 0.15400 2.31 R Chuyên ngành Vi Sinh vật học St Resid Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ 38 0.96000 0.79400 0.04898 0.16600 2.49 R 39 0.48000 0.71400 0.04898 -0.23400 -3.51 R R denotes an observation with a large standardized residual * WARNING * No multiple comparisons were calculated for the following terms which contain or interact with random factors lặp lại Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence dòng vi khuẩn N Mean Grouping VCh.VL1 12 0.9200 VCh.VL1 12 0.7800 B RC.KG1 12 0.7700 B RB.ST1 12 0.7300 B VCh.CM1 12 0.7000 B C RB.ST2 12 0.6800 B C D RC.BT 12 0.6000 C D E VQ.BT 12 0.5900 C D E VB.VL6 12 0.5800 D E VB.VL1 12 0.5200 E A Means that not share a letter are significantly different Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence nhiệt độ N Mean 30 30 0.9880 37 30 0.8440 38 30 0.5440 39 30 0.3720 Grouping A B C D Means that not share a letter are significantly different Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence dòng vi nhiệt khuẩn độ N Mean VCh.VL1 30 1.3200 A VCh.VL1 37 1.3200 A Chuyên ngành Vi Sinh vật học Grouping Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ VCh.CM1 30 1.2800 A RB.ST1 30 1.2000 A RC.KG1 37 1.2000 A RC.KG1 30 1.1600 A VCh.VL1 37 1.1600 A RC.BT 30 0.8400 B VB.VL6 30 0.8400 B VB.VL1 30 0.8400 B RB.ST2 30 0.8400 B VQ.BT 30 0.8000 B VCh.VL1 38 0.8000 B VB.VL6 37 0.8000 B RB.ST2 37 0.8000 B RB.ST1 38 0.8000 B RB.ST2 38 0.7600 B VCh.VL1 30 0.7600 B VQ.BT 37 0.7200 B C RC.BT 37 0.7200 B C VCh.CM1 37 0.6800 B C D RB.ST1 37 0.6400 B C D E VCh.VL1 38 0.6000 B C D E F VCh.VL1 39 0.6000 B C D E F VQ.BT 39 0.4800 C D E F G RC.BT 38 0.4800 C D E F G VCh.CM1 38 0.4400 D E F G VB.VL6 38 0.4400 D E F G VB.VL1 39 0.4400 D E F G VB.VL1 38 0.4000 E F G VB.VL1 37 0.4000 E F G VCh.CM1 39 0.4000 E F G RC.BT 39 0.3600 F G VQ.BT 38 0.3600 F G RC.KG1 39 0.3600 F G RC.KG1 38 0.3600 F G RB.ST2 39 0.3200 G RB.ST1 39 0.2800 G VCh.VL1 39 0.2400 G VB.VL6 39 0.2400 G Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ General Linear Model: lượng acid ngày thứ Factor Type dòng vi khuẩn fixed Levels 10 Values RB.ST1., RB.ST2, RC.BT, RC.KG1, VB.VL1, VB.VL6, VCh.CM1., VCh.VL1, VCh.VL1., VQ.BT nhiệt độ fixed 30, 37, 38, 39 lặp lại random 1, 2, Analysis of Variance for lượng acid ngày thứ 6, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dòng vi khuẩn 2.63088 2.63088 0.29232 50.61 0.000 nhiệt độ 3.31104 3.31104 1.10368 191.10 0.000 lặp lại 0.00072 0.00072 0.00036 0.06 0.940 dòng vi khuẩn*nhiệt độ 27 5.11536 5.11536 0.18946 32.80 0.000 Error 78 0.45048 0.45048 0.00578 Total 119 11.50848 S = 0.0759960 R-Sq = 96.09% R-Sq(adj) = 94.03% Unusual Observations for lượng acid ngày thứ lượng acid ngày Obs thứ Fit SE Fit Residual St Resid 2.16000 1.92300 0.04496 0.23700 3.87 R 0.36000 0.52300 0.04496 -0.16300 -2.66 R 21 0.60000 0.47700 0.04496 0.12300 2.01 R 56 1.08000 0.91700 0.04496 0.16300 2.66 R 99 0.36000 0.48300 0.04496 -0.12300 -2.01 R 119 0.60000 0.47700 0.04496 0.12300 2.01 R R denotes an observation with a large standardized residual * WARNING * No multiple comparisons were calculated for the following terms which contain or interact with random factors lặp lại Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence dòng vi khuẩn N Mean Grouping RC.KG1 12 0.9100 VCh.VL1 12 0.7300 B VCh.VL1 12 0.6300 B C VB.VL6 12 0.5800 RB.ST1 12 0.5100 D E RC.BT 12 0.5100 D E VCh.CM1 12 0.4600 E F RB.ST2 12 0.4600 E F VQ.BT 12 0.4500 E F VB.VL1 12 0.4000 F A C D Means that not share a letter are significantly different Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence nhiệt độ N Mean 30 30 0.8360 37 30 0.5440 38 30 0.4840 39 30 0.3920 Grouping A B C D Means that not share a letter are significantly different Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence dòng vi nhiệt khuẩn độ N Mean RC.KG1 30 1.9200 RC.BT 30 1.0000 B RC.KG1 37 0.9600 B C VCh.VL1 30 0.9600 B C VCh.VL1 37 0.9200 B C VCh.VL1 37 0.8400 B C D VCh.CM1 30 0.8000 B C D E VB.VL6 30 0.8000 B C D E Chuyên ngành Vi Sinh vật học Grouping A Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ VCh.VL1 30 0.8000 B C D E VB.VL6 37 0.7200 C D E F RB.ST1 38 0.7200 C D E F RB.ST1 30 0.6400 D E F G RB.ST2 38 0.6400 D E F G VCh.VL1 38 0.5600 E F G H VCh.VL1 39 0.5600 E F G H VCh.VL1 38 0.5200 F G H I VQ.BT 30 0.5200 F G H I VB.VL1 30 0.4800 F G H I J VQ.BT 39 0.4800 F G H I J RC.BT 38 0.4800 F G H I J VB.VL6 38 0.4400 G H I J VQ.BT 37 0.4400 G H I J VCh.CM1 39 0.4400 G H I J RB.ST2 30 0.4400 G H I J RC.KG1 38 0.4000 G H I J RB.ST1 39 0.4000 G H I J VB.VL1 38 0.4000 G H I J RB.ST2 39 0.4000 G H I J VB.VL1 39 0.4000 G H I J RC.KG1 39 0.3600 H I J RB.ST2 37 0.3600 H I J VB.VL6 39 0.3600 H I J VQ.BT 38 0.3600 H I J VCh.CM1 38 0.3200 H I J VB.VL1 37 0.3200 H I J RC.BT 37 0.3200 H I J VCh.VL1 39 0.2800 I J VCh.CM1 37 0.2800 I J RB.ST1 37 0.2800 I J RC.BT 39 0.2400 J Means that not share a letter are significantly different General Linear Model: lượng acid ngày thứ Factor Type dòng vi khuẩn fixed Chuyên ngành Vi Sinh vật học Levels 10 Values RB.ST1., RB.ST2, RC.BT, RC.KG1, VB.VL1, VB.VL6, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ VCh.CM1., VCh.VL1, VCh.VL1., VQ.BT nhiệt độ fixed 30, 37, 38, 39 lặp lại random 1, 2, Analysis of Variance for lượng acid ngày thứ 7, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P dòng vi khuẩn 1.68252 1.68252 0.18695 42.31 0.000 nhiệt độ 3.19236 3.19236 1.06412 240.83 0.000 lặp lại 0.00096 0.00096 0.00048 0.11 0.897 dòng vi khuẩn*nhiệt độ 27 3.97524 3.97524 0.14723 33.32 0.000 Error 78 0.34464 0.34464 0.00442 Total 119 9.19572 S = 0.0664715 R-Sq = 96.25% R-Sq(adj) = 94.28% Unusual Observations for lượng acid ngày thứ lượng acid ngày Obs thứ Fit SE Fit Residual St Resid 0.36000 0.47600 0.03933 -0.11600 -2.16 R 29 0.60000 0.48200 0.03933 0.11800 2.20 R 32 0.72000 0.59600 0.03933 0.12400 2.31 R 41 0.36000 0.24200 0.03933 0.11800 2.20 R 51 0.12000 0.24200 0.03933 -0.12200 -2.28 R 52 0.48000 0.60200 0.03933 -0.12200 -2.28 R R denotes an observation with a large standardized residual * WARNING * No multiple comparisons were calculated for the following terms which contain or interact with random factors lặp lại Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence dòng vi khuẩn N Mean RC.KG1 12 0.7400 Chuyên ngành Vi Sinh vật học Grouping A Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ VCh.VL1 12 0.5800 B VCh.VL1 12 0.5200 B C VB.VL6 12 0.4700 RB.ST1 12 0.4300 D E VQ.BT 12 0.4300 D E RC.BT 12 0.4200 D E F VCh.CM1 12 0.3800 E F G RB.ST2 12 0.3400 F G VB.VL1 12 0.3200 G C D Means that not share a letter are significantly different Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence nhiệt độ N Mean 30 30 0.7240 37 30 0.4680 38 30 0.3680 39 30 0.2920 Grouping A B C D Means that not share a letter are significantly different Grouping Information Using Tukey Method and 95.0% Confidence dòng vi nhiệt khuẩn độ N Mean RC.KG1 30 1.6800 RC.BT 30 0.8400 B VCh.VL1 37 0.8000 B C RB.ST1 30 0.7600 B C D RC.KG1 37 0.7600 B C D VB.VL6 30 0.7600 B C D VCh.VL1 30 0.7600 B C D VCh.CM1 30 0.6400 B C D E VCh.VL1 37 0.6400 B C D E VB.VL6 37 0.6000 VCh.VL1 38 0.5600 VCh.VL1 30 0.5200 E F G H VQ.BT 39 0.5200 E F G H Chuyên ngành Vi Sinh vật học Grouping A C D E F D E F G Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ VCh.VL1 38 0.4800 E F G H I VQ.BT 37 0.4800 E F G H I VQ.BT 30 0.4800 E F G H I VCh.VL1 39 0.4400 E F G H I J RB.ST1 38 0.4400 E F G H I J VB.VL1 30 0.4000 F G H I J K RB.ST2 30 0.4000 F G H I J K VCh.CM1 38 0.4000 F G H I J K RB.ST2 39 0.3600 G H I J K RC.BT 38 0.3600 G H I J K VB.VL1 38 0.3200 H I J K VB.VL6 38 0.3200 H I J K RB.ST2 37 0.3200 H I J K RB.ST1 37 0.3200 H I J K VB.VL1 39 0.3200 H I J K RC.KG1 38 0.2800 I J K RB.ST2 38 0.2800 I J K RC.BT 37 0.2800 I J K VCh.CM1 37 0.2400 J K VCh.CM1 39 0.2400 J K VQ.BT 38 0.2400 J K RC.KG1 39 0.2400 J K VB.VL1 37 0.2400 J K VCh.VL1 39 0.2000 K RB.ST1 39 0.2000 K RC.BT 39 0.2000 K VB.VL6 39 0.2000 K Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.1 Phƣơng pháp nhuộm Gram Nhỏ giọt nước khử trùng lên kính mang vật Lấy sinh khối môi trường thạch MRS (hoặc ống trữ), cho vào giọt nước vô trùng miếng lam vô trùng, trãi cho thật mỏng theo hình xoắn ốc Lướt mặt kính mang vật lửa cách khoảng 10cm độ lần để giết chết vi sinh vật dán chúng kính mang vật Nhỏ giọt Crystal violet cho phu nơi cố định, để 60 giây Rửa nước từ 2-3 giây; chậm nhẹ cho khô bớt nước Nhỏ dung dịch Iod 60 giây (gắn phẩm nhuộm violet vào tế bào G+) Rửa cồn + aceton: thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, đến giợt cồn + aceton không màu tím nữa, nhỏ từ từ Rửa nước vài giây, chậm nhẹ giấy thấm cho khô Nhỏ 1-2 giọt Fuchsin để 60 giây Rửa nước vài giây Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ lửa cho khô nước Quan sát kính hiển vi Kết quả: - Tế bào vi sinh vật có màu tím xanh: Vi khuẩn Gram dương - Tế bào vi sinh vật có màu hồng đỏ: Vi khuẩn Gram âm Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp (2002) 3.2 Thử nghiệm Catalase Nguyên tắc: vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tuỳ ý chứa chuỗi dẫn truyền điện tử có cytochrome có enzyme catase (trừ streptococcus spp) Enzyme thành viên hệ thống enzyme bảo vệ tế bào khỏi tổn thương dẫn xuất độc tính cao oxy phân tử tế bào hiếu khí kỵ khí tuỳ ý Các vi sinh vật có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp với oxy chất nhận điện tử cuối chuỗi dẫn truyền điện tử tạo H2O2 Catalase Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ thuỷ phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao tế bào Tuy nhiên, catalase, nhiều enzyme oxydase khác hệ thống enzyme bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hoá có khả thuỷ phân hydrogen peroxide Các enzyme diện tế bào, vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tuỳ ý có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí Sự thuỷ phân hydrogen peroxide giải phóng O2 ghi nhận qua tượng sủi bọt khí Phương pháp tiến hành: Hoá chất sử dụng Hydrogen peroxide 30% giữ lạnh tỏng chai màu nâu, tránh ánh sang; dung dịch đệm phosphate pH 7,0 Có thể thử nghiệm catalase phương pháp sau: - Thử phiến kính (lame): dùng kim cấy lấy sinh khối từ khuẩn lạc đặt lên phiến kính Nhỏ giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật phiến kính Ghi nhận sủi bọt có Đọc kết quả: thử nghiệm (+) có tượng sủi bọt khí có O2 tạo ngược lại (-) tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2008) Chuyên ngành Vi Sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... triển Từ đó đề tài phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây có múi được thực hiện Chuyên ngành Vi Sinh vật học 1 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37 – 2014 Trường Đại học Cần Thơ 1.2 Mục tiêu đề tài Mục tiêu của đề tài là phân lập và tuyển chọn chủng AAB chịu nhiệt từ trái cây có múi có khả năng lên men acid tốt Chuyên ngành Vi Sinh vật học 2 Vi n... giấm có chứa các chất như acid amin, glucerin có tác dụng làm giảm gàu, giảm cân, tốt cho những người bị vi m khớp, tốt cho dạ dày, giảm đau do vi m xoang, đặc biệt là các sản phẩm lên men acid acetic giàu chất dinh dưỡng và an toàn cho sức khoẻ Các sản phẩm lên men này nhớ một nhóm vi khuẩn gọi chung là vi khuẩn acid acetic (AAB, Acetic Acid Bacteria) Vi c phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn chịu nhiệt. .. sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic  Cấy các chủng AAB vừa tuyển chọn vào môi trường YPGD chứa 4% ethanol  Ủ ở các nhiệt độ khác nhau: 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC  Theo dõi sự phát triển của AAB sau 2 và 3 ngày 3.2.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt có khả năng sinh acid mạnh  Ủ tăng sinh các chủng AAB trong ống nghiệm chứa 5 mL môi trường YPGD có bổ sung 10%... chủng vi khuẩn acid acetic Trong 25 chủng đã phân lập được, các chủng vi khuẩn này có một số đặc điểm, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng vi khuẩn khác nhau như: - Catalase: âm tính, dương tính - Hình dạng khuẩn lạc: phần lớn các khuẩn lạc đều có hình tròn, một số khuẩn lạc không đều Hầu hết các khuẩn lạc đều có dạng bìa nguyên - Màu sắc khuẩn lạc: đa số các khuẩn lạc có màu trắng đục trừ mộ vài dòng có màu... nghiệp có khí hậu nhiệt đới nên các nguyên liệu này rất dồi dào, đặc biệt là trái cây chín nói chung và trái cây có múi nói riêng Trong dịch trái cây có múi (cam, chanh, bưởi, quýt, ) chứa nhiều chất bổ dưỡng như nước, glucid, protid, cellulose, acid citric, caroten và nhiều khoáng như: Ca, Mg, Fe, và vitamin như: C, B, B2, là môi trường dinh dưỡng thuận lợi cho vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn acid acetic. .. 2.3 Vi khuẩn acid acetic Hiện nay người ta đã biết tới hơn 20 loài vi khuẩn có khả năng lên men acetic, chúng được gọi chung là vi khuẩn acetic Những vi khuẩn này dễ tìm thấy trong không khí, đất, nước Cho nên khi để các dịch nước quả, bia, rượu thấp, dịch đường tiếp xúc với không khí dễ bị vẫn đục nhẹ, phía trên mặt tạo một lớp màng mỏng, mịn màu trắng xám hoặc vàng xám Đó là do các vi khuẩn acetic. .. mL từ dịch lỏng vừa ủ vào 100 mL môi trường YPGD lỏng có bổ sung 4% ethanol  Ủ ở 30oC, 37oC, 39oC, 41oC, 43oC và 45oC và lắc ở 150 vòng/phút  Mỗi ngày tiến hành do mật số vi khuẩn bằng máy đo OD và theo dõi nồng độ acid trong 7 ngày bằng phương pháp chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,8N  So sánh và tuyển chọn được các chủng AAB có khả năng lên men acid acetic tốt nhất Chuyên ngành Vi Sinh vật học 11 Vi n... màu vàng Giống này có thể phát triển ở nồng độ rượu 11% và tích tụ trong môi trường tới 6% acid acetic Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 34oC Acetobacter suboxydans: Vi khuẩn này được dùng nhiều trong công nghiệp vitamin để sản xuất acid ascorbic (vitamin C) Trong lên men nhờ các chủng vi khuẩn suboxydans acid acetic được tích tụ và giữ lại trong môi trường mà không bị oxy hoá tiếp Các loài có khả... độ acid ban đầu khác nhau đã chọn ra được mười chủng trội nhất để tiếp tục tiến hành thử nghiệm cả khả năng phát triển và lên men trên môi trường YPGD lỏng có bổ sung 4% ethanol để tuyển chọn các chủng vi khuẩn vừa có khả năng chịu nhiệt vừa lên men acid mạnh Mười chủng vi khuẩn AAB được tăng sinh khối trong môi trường PM trong 24 giờ sau đó cho phát triển và sinh acid trong môi trường YPGD lỏng có. .. g/L, D-glucose 5 g/L ) bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol (Amornrut và Wasu, 2008)  Lựa chọn các khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường là AAB Khuẩn lạc vi khuẩn acetic sẽ tạo vòng sang xung quanh do vi khuẩn này tạo ra acid acetic hoà tan CaCO3 làm mất màu trắng đục của CaCO3  Tiếp tục cấy phân lập nhiều lần để thu được dòng thuần Chuyên ngành Vi Sinh vật học 9 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn