BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG KHÓM CẦU ĐÚC - HẬU GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS HUỲNH XUÂN PHONG SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ NGỌC NGÂN MSSV: 3113734 LỚP: VSV K37 Cần Thơ, Tháng 11/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG KHÓM CẦU ĐÚC - HẬU GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS HUỲNH XUÂN PHONG SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ NGỌC NGÂN MSSV: 3113734 LỚP: VSV K37 Cần Thơ, Tháng 11/2014 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS Huỳnh Xuân Phong Lê Ngọc Ngân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Quý Thầy Cô tận tình giảng dạy em thời gian học tập vừa qua Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Huỳnh Xuân Phong – người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em thực đề tài nghiên cứu Xin gửi lời biết ơn chân thành đến thầy Phạm Hồng Quang cô Nguyễn Thị Liên cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học khóa 37 Sự hỗ trợ nhiệt tình thầy cô giúp cho chúng em hoàn thành tốt trình học tập Xin chân thành cảm ơn cô Ngô Thị Phương Dung, thầy Trần Vũ Phương, anh Nguyễn Ngọc Thạnh anh Bùi Hoàng Đăng Long – Cán phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, đóng góp ý kiến hỗ trợ điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu Xin ghi ơn gia đình, anh chị cán phòng thí nghiệm Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học tất bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Kính chúc Quý Thầy Cô nhiều sức khỏe, thành đạt nhiều lĩnh vực có cống hiến quý báu cho nghiệp giáo dục đào tạo Xin chân thành cảm ơn! Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Đề tài nhằm nghiên cứu quy trình lên men rượu vang khóm Cầu Đúc – Hậu Giang Nội dung thực gồm có: sản xuất bột men từ chủng nấm men Saccharomyces CKV1, nghiên cứu ảnh hưởng độ Brix pH đến khả lên men, xác định thời gian nhiệt độ thích hợp cho trình lên men rượu Kết nghiên cứu cho thấy với bột men từ chủng Saccharomyces CKV1 có khả lên men rượu tốt, hàm lượng ethanol thu 16,36% v/v Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men cho thấy điều kiện độ Brix 30 pH 4, bột men với mật số vi sinh vật 2,4x108CFU/g thích hợp cho lên men rượu vang khóm Thời gian lên men 13 ngày nhiệt độ phòng mát (22oC) cho kết độ rượu cao (16,36% v/v) Kết phân tích tiêu lý hóa vi sinh vật sản phẩm sau lên men cho thấy rượu vang khóm sản phẩm đạt yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm vi sinh vật theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7045:2002) lý hóa theo quy chuẩn Việt Nam (QCVN 6-3:2010/BYT) Từ khóa: bột men thuần, lên men rượu, rượu vang khóm, Saccharomyces Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT i LỜI CẢM TẠ ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii TỪ VIẾT TẮT viii CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược khóm 2.1.1 Nguồn gốc chủng loại 2.1.2 Thành phần hoá học giá trị dinh dưỡng 2.1.3 Các sản phẩm chế biến từ khóm 2.2 Sơ lược nấm men 2.2.1 Đặc điểm chung nấm men 2.2.2 Hình dạng kích thước 2.2.3 Cấu tạo tế bào nấm men 2.2.4 Sự sinh sản nấm men 2.2.5 Vai trò nấm men 2.2.6 Các chủng nấm men thường sử dụng sản xuất rượu vang 2.3 Giới thiệu rượu vang 2.3.1 Định nghĩa rượu vang 2.3.2 Thành phần hóa học rượu vang 2.3.3 Quá trình sản xuất rượu vang 2.3.4 Tình hình sản xuất rượu vang 13 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Phương tiện nghiên cứu 16 3.1.1 Thời gian địa điểm 16 Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ 3.1.2 Vật liệu 16 3.1.3 Dụng cụ thiết bị 16 3.1.4 Hóa chất 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Sơ đồ quy trình lên men rượu vang 17 3.2.2 Sản xuất bột nấm men 18 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường pH ban đầu 19 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian lên men 19 3.2.5 Sản xuất thử nghiệm mẻ lít lít 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Sản xuất bột men 22 4.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường pH ban đầu 22 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian lên men 25 4.4 Sản xuất thử nghiệm đánh giá chất lượng mẻ rượu lít lít 26 4.5 Quy trình sản xuất rượu vang khóm 31 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần hóa học 100g khóm Bảng 2: Thành phần hóa học rượu vang Bảng 3: Kết độ rượu, pH, Brix sau lên men 22 Bảng 4: Kết đánh giá cảm quan 24 Bảng 5: Kết độ rượu, pH, Brix sau lên men theo thời gian nhiệt độ 25 Bảng 6: Kết độ rượu sau lên men mẻ rượu lít lít 26 Bảng 7: Kết đánh giá cảm quan mẻ lít lít 27 Bảng 8: Kết đánh giá cảm quan rượu vang khóm 27 Bảng 9: Kết phân tích mẫu rượu vang khóm 30 Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Khóm Cầu Đúc - Hậu Giang Hình 2: Nấm men Saccharomyces Hình 3: Quy trình lên men rượu vang 17 Hình 4: Quy trình sản xuất bột men từ nấm men Saccharomyces 18 Hình 5: Biểu đồ trung bình đánh giá quan nồng độ rượu điều vị 28 Hình 6: Biểu đồ trung bình đánh giá cảm quan rượu vang khóm sản phẩm điều vị 29 Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ TỪ VIẾT TẮT CFU Colony forming units v/v Volume/Volume TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 28: Bảng kiểm định LSD ảnh hưởng nhiệt độ thời gian lên men đến độ rượu Multiple Range Tests for DO CON by MAU Method: 95.0 percent LSD MAU 7–P 9–P – PM – PM 11- P 11- PM 13 – P 13 – PM Count 3 3 3 3 Mean 10.3167 11.7867 11.8467 12.9133 13.16 14.37 15.1933 16.27 Homogeneous Groups X X X X X X X X Bảng 29: Bảng phân tích ANOVA ảnh hưởng nhiệt độ thời gian lên men đến độ rượu Analysis of Variance for Do Con - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Thoi Gian 71.6057 23.8686 200.96 0.0000 B:Nhiet Do 9.1637 9.1637 77.15 0.0000 AB 0.186679 0.0622264 0.52 0.6720 RESIDUAL 1.90033 16 0.118771 INTERACTIONS TOTAL (CORRECTED) 82.8564 Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 23 50 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 30: Bảng kiểm định LSD ảnh hưởng nhân tố nhiệt độ thời gian lên men đến độ rượu Multiple Range Tests for Do Con by Thoi Gian Method: 95.0 percent LSD Thoi Gian 11 13 Count 6 6 LS Mean 11.0817 12.35 13.765 15.7317 LS Sigma 0.140695 0.140695 0.140695 0.140695 Homogeneous Groups X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits 7–9 * -1.26833 0.421805 – 11 * -2.68333 0.421805 – 13 * -4.65 0.421805 – 11 * -1.415 0.421805 – 13 * -3.38167 0.421805 11 – 13 * -1.96667 0.421805 * denotes a statistically significant difference Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 51 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC ẢNH Nấm men CKV1 Khuẩn lạc nấm men CKV1 Lên men mẻ lít lít Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 52 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ Tủ cấy Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 53 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 4.1 Phương pháp nhân giống nấm men, đếm mật số nấm men Môi trường nuôi cấy: môi trường PGA lỏng Nhân giống nấm men: cho môi trường PGA lỏng vào bình tam giác đậy kín nút gòn, nắp giấy, đem khử trùng nhiệt ướt 121oC 15 phút, để nguội, chủng nấm men vào, đặt lên máy lắc 150 vòng/phút 24 nhiệt độ phòng Sau nhân giống, kiểm tra mật số nấm men phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Đếm mật số nấm men buồng đếm hồng cầu Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 54 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ - Lắc ống nghiệm chứa mẫu pha loãng, dùng ống hút hút giọt vào mặt kính, đậy kính lên lưới đếm Chú ý không để tạo thành bọt khí lưới đếm tràn dịch mẫu xuống rãnh - Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi, sau tiến hành đếm tế bào ô lớn góc Trong ô lớn, đếm từ ô thứ đến ô thứ 16 Chỉ đếm tế bào nằm bên ô tế bào nằm cạnh liên tiếp chiều Ghi số lượng tế bào đếm ô lớn Đếm buồng đếm sau lấy giá trị trung bình Sau dùng xong buồng đếm kính phài đem rửa lau khô - Số lượng tế bào 1mL mẫu dịch tính công thức: Số tế bào/mL = (a*4000*103*c)/b Trong : a – số tế bào ô lớn b – số ô ô lớn 103 – chuyển mm3 mL (1000 mm3 = mL) c – độ pha loãng (100 lần) (Nguyễn Xuân Thành, 2005) 4.2 Định lượng Coliforms Chuẩn bị pha loãng mẫu nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Tuần tự cấy 1mL dịch mẫu pha loãng nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 vào ống nghiệm có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc TLS, độ pha loãng làm ống lặp lại Để ống cấy tủ ấm nhiệt độ 370C 48 Quan sát ghi nhận ống có sinh khí đục (có kết dương tính) Lấy 1mL mẫu từ ống nghiệm dương tính chuyển sang ống chứa môi trường BGBL Để ống cấy tủ ấm nhiệt độ 37 oC 48 Với độ pha loãng, tính tổng số ống có sinh khí đục (có kết dương tính) Kết quả: dựa vào số ống có kết dương tính độ pha loãng, xác định số đặc trưng sau số MPN từ tính số Coliform có 1mL mẫu phân tích 4.3 Định lượng E coli Chuẩn bị pha loãng mẫu nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 55 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ Tuần tự cấy 1mL dịch mẫu pha loãng nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 vào ống nghiệm có chứa môi trường tăng sinh chọn lọc TLS, độ pha loãng làm ống lặp lại Để ống cấy tủ ấm nhiệt độ 44 oC 24 - 48 Quan sát ghi nhận ống có sinh khí đục (có kết dương tính) Lấy 1mL mẫu từ ống nghiệm dương tính chuyển sang ống chứa môi trường EC Để ống cấy tủ ấm nhiệt độ 44oC 24 - 48 Với độ pha loãng, tính tổng số ống có sinh khí đục (có kết dương tính) Phép thử khẳng định: lấy mL mẫu từ ống nghiệm chưa môi trường EC dương tính sang ống nghiệm chứa trypton Để ống cấy tủ ấm nhiệt độ 44 oC 48 Thêm 0,5 mL thuốc thử indol vào ống nghiệm chứa dung dịch trypton nuôi cấy,lắc sau phút quan sát ghi nhận số lượng ống có màu đỏ chứng tỏ có indol (có kết dương tính) cho độ pha loãng Kết quả: với độ pha loãng, đếm số lượng ống có màu đỏ, xác định số MPN từ tính số E coli có mL mẫu 4.4 Tổng số vi sinh vật hiếu khí Rửa khử trùng dụng cụ , dịch pha loãng Pha loãng thập phân mẫu phân tích tới nồng độ thích hợp để đẽ dàng cho việc quan sát đếm khuẩn lạc Thời gian thao tác không 30 phút Lấy 1mL mẫu pha loãng cho vào hộp petri (lặp lại lần) Rót môi trường thạch nóng chảy có nhiệt độ 45 – 50oC vào đĩa petri có mẫu Xếp đĩa mặt phẳng ngang, để yên thạch nguội đông hoàn toàn Nếu dự kiến sản phẩm bị mọc lan nên khắc phục cách: sau môi trường dinh dưỡng đông hoàn toàn, rót lên bề mặt đĩa khoảng – 5mL thạch màng đông lại hoàn toàn Lật ngược đĩa, đặt vào tủ ấm nhiệt độ 30oC thời gian 48 – 72 Kết quả: tính theo công thức: Trong đó: (CFU) ∑C: số khuẩn lạc đém đĩa petri Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 56 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 37 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ d: nồng độ pha loãng mẫu, mà đĩa petri chọn để đếm có số khuẩn lạc thỏa điều kiện 30< x [...]... các vùng miền khác Khóm Cầu Đúc có vị ngọt thanh, ăn ít rát lưỡi, ăn giòn và ngọt, giàu chất khoáng và vitamin rất có lợi cho sức khỏe Do đó khóm Cầu Đúc - Hậu Giang phù hợp làm nguyên liệu sản xuất rượu vang Vì vậy, đề tài Nghiên cứu quy trình lên men rượu vang khóm Cầu Đúc - Hậu Giang được nghiên cứu 1.2 Mục tiêu của đề tài Thiết lập quy trình sản xuất rượu vang khóm Cầu Đúc - Hậu Giang đạt hiệu quả... Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Sơ đồ quy trình lên men rượu vang Rượu vang khóm sẽ được lên men theo quy trình sau: Khóm trái ↓ Dịch khóm ↓ Lọc bã ↓ Đo độ Brix và pH ban đầu ↓ Điều chỉnh độ Brix và pH ↓ Thanh trùng bằng NaHSO3 (140 mg/L trong 2 giờ) ↓ Nấm men → Chủng giống ↓ Lên men ↓ Lắng lọc, làm trong ↓ Thành phẩm rượu vang Hình 3: Quy trình lên men rượu vang (Hứa Hữu Danh, 2011) Giải thích quy trình: ... hình thức lên men chính: lên men yếm khí và lên men hiếu khí - Lên men hiếu khí: là sự thủy phân đường với sự có mặt của O2 như quá trình lên men acid acetic, acid citric, - Lên men yếm khí: là sự thủy phân đường không có sự hiện diện của O 2 như quá trình lên men lactic, lên men rượu ethylic, butylic, Quá trình lên men rượu, bia hay còn gọi là quá trình rượu, cồn hóa đều là quá trình lên men yếm khí... (NH4)2SO4 Thời gian lên men: quá trình lên men bao gồm lên men chính và lên men phụ, thời gian lên men được tính từ lúc cấy men giống vào môi trường lên men và kết thúc khi không còn bọt khí thoát ra Thời gian lên men thích hợp sẽ tạo ra rượu có độ cồn cao và ổn định Ở cùng nhiệt độ như nhau, pH khác nhau thì thời gian lên men khác nhau Nếu nhiệt độ là 25-30oC và pH thích hợp thì thời gian lên men kéo dài... chế biến từ khóm Khóm được lưu thông rộng rãi trên thế giới dưới dạng khóm hộp và nước khóm Khóm hộp gồm có khóm khoanh, khóm miếng, khóm nghiền, Nước khóm gồm nước khóm cô đặc và nước khóm thường Theo PGS.TS Nguyễn Minh Thủy – Trường Đại học Cần Thơ (2013), ở Việt Nam khóm còn tạo ra các sản phẩm như: rượu vang, nước ép khóm, khóm sấy, bánh khóm, khóm tươi, khóm đóng hộp, mứt đông khóm, … Khóm còn có... độ rượu mạnh và giống như Chardonnay có màu vàng kim, đem lại vị thanh cao và hương thơm Rượu vang Mỹ Rượu vang thương phẩm (Branded Wine) Rượu vang thông dụng (Generic Wine) như: Vang California Burgundy Rượu vang pha trộn (Blended Wine), trên nhãn ghi America Wine Rượu vang Đức Rượu vang bàn (Deutcher Tafewein) Rượu vang vùng (Landwein) Rượu vang Qualitatswein bestimmer Anbuagebiete (QbA) Rượu vang. .. khóm Quá trình lên men được tiến hành trong bình tam giác 250 mL với 100 mL dịch lên men từ 10-12 ngày Đậy bình bằng water-lock Sau đó sẽ tiến hành lọc, làm trong sản phẩm, để sản phẩm ổn định Cuối cùng ta được thành phẩm rượu vang khóm 3.2.2 Sản xuất bột nấm men Mục đích thí nghiệm: cung cấp chủng nấm men tốt nhất cho quá trình lên men rượu vang khóm Có thể dự trữ nấm men trong thời gian dài Quy trình. .. chất của quá trình lên men nên ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men, nấm men có thể lên men đường thành rượu trong khoảng 22-25°Brix Hàm lượng đường tối đa 30%, khả năng lên men bắt đầu giảm Nguyên nhân là tế bào nấm men bị chết do hiện tượng co nguyên sinh Nồng độ rượu ethylic: sản phẩm chủ yếu trong quá trình lên men kỵ khí là rượu ethylic Rượu ethylic sẽ ức chế hoạt động của tế bào nấm men, tuy nhiên... vang khóm Vì chủng nấm men CKV1 lên men chậm nên không phù hợp khi lên men trong thời gian ngắn Do đó thời gian lên men 13 ngày là phù hợp cho quá trình lên men rượu vang khóm Sau khi lên men 13 ngày thì độ rượu ở mức nhiệt độ phòng (15,2% v/v) thấp hơn 1,07% v/v so với độ rượu ở mức nhiệt độ phòng mát (16,27% v/v) Vậy với các nhân tố nhiệt độ phòng mát là 22oC và thời gian là 13 ngày thì cho độ rượu. .. sắc: - Vang trắng: vang lên men từ các quả nho khi chín vỏ không màu hoặc màu lục nhạt, hoặc lên men từ các dịch quả khác mà không có xác quả - Vang đỏ: vang lên men từ các quả nho khi chín có màu đỏ - tím ở những mức độ khác nhau, hoặc lên men từ quả lấy cả dịch quả và xác quả * Phân loại theo hàm lượng đường: - Vang khô (khi lên men gần hết đường): chứa hàm lượng rượu ethylic tích tụ do lên men có