BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -o0o - LƯU THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN VIRUS VÀNG LỤI LÚA (RICE YELLOW STUNT VIRUS) CHUYÊN NGÀNH : BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ : 60.62.01.12 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS HÀ VIẾT CƯỜNG HÀ NỘI - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan! Bản luận văn tốt nghiệp hoàn thành nhận thức xác thân Số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực, chưa sử dụng công bố công trình nghiên cứu khác Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Lưu Thị Thanh Thùy Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn tốt nghiệp này, nhận động viên giúp đỡ, hướng dẫn tận tình Thầy, Cô Tôi xin trân trọng cám ơn TS Hà Viết Cường, giáo viên Bộ môn Bệnh cây- Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ths Trần Thị Như Hoa - Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu bệnh nhiệt đới hướng dẫn tận tình, đóng góp nhiều ý kiến quan trọng tạo điều kiện giúp hoàn thành luận văn tốt nghiệp Trân trọng cám ơn giảng viên Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành chương trình học tập cao học thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cám ơn cán Trung tâm Nghiên cứu bệnh nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ mặt kỹ thuật, dụng cụ, trang thiết bị phục vụ cho trình điều tra, tiến hành thí nghiệm giúp đỡ hoàn thành luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Lưu Thị Thanh Thùy Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích yêu cầu 2.1 Mục đích 2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát bệnh 1.2 Triệu chứng bệnh 1.3 Lan truyền virus vàng lụi 1.4 Rầy xanh đuôi đen 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh nước 1.6 Tình hình nghiên cứu bệnh nước 1.7 Phân loại, hình thái đặc điểm gen virus RYSV 12 1.7.1 Phân loại 12 1.7.2 Hình thái phân tử virus (virion) tổ chức gen 13 1.8 Phương pháp chẩn đoán virus ELISA 16 1.8.1 Nguyên lý phương pháp huyết học ứng dụng 16 1.8.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ kháng thể 16 1.8.3 Các kỹ thuật ELISA 17 1.8.4 Chẩn đoán virus RYSV ELISA 19 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 20 Page iii 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.2.1 Tạo nguồn kháng nguyên (phân tử virus vàng lụi) từ rầy 22 2.2.2 Thử nghiệm tạo kháng thể thỏ đặc hiệu virus vàng lụi từ nguồn phân tử virus tinh 2.2.3 22 Ứng dụng kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus vàng lụi điều kiện thực tế 2.2.4 22 Điều tra bệnh Bắc Giang, Hà Nội ứng dụng chẩn đoán virus vàng lụi từ mẫu lúa, cỏ rầy xanh đuôi đen thu thập tự nhiên 22 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp điều tra bệnh đồng ruộng 22 2.3.2 Phương pháp thu thập xử lý mẫu 22 2.3.3 Phương pháp bảo quản mẫu 22 2.3.4 Phương pháp nuôi rầy 23 2.3.5 Phương pháp chiết RNA tổng số từ mô rầy 23 2.3.6 Phản ứng RT – PCR 24 2.3.7 Điện di agarose 24 2.3.8 Tinh chiết phân tử virus RYSV 25 2.3.9 Tạo kháng huyết virus thỏ 26 2.3.10 Phương pháp ELISA 26 2.3.11 Tinh chiết protein tổng số từ lúa (NH4)2SO4 28 2.3.12 Thẩm tích protein tổng số 29 2.3.13 Phương pháp loại bỏ kháng thể không đặc hiệu kháng huyết màng nitrocelluse 29 2.3.14 Phương pháp loại bỏ kháng thể không đặc hiệu kháng huyết ELISA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 30 Page iv 2.3.15 Phương pháp tinh kháng thể sắc ký cột Protein A 30 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Chuẩn bị nguồn vật liệu tạo kháng nguyên 31 3.1.1 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2013 Bắc Giang 31 3.1.2 Phát virus RYSV RT-PCR mẫu thu thập 35 3.1.3 Tinh chiết phân tử virus 36 3.2 Nghiên cứu tạo kháng thể thỏ đặc hiệu RYSV từ phân tử virus tinh chiết 40 3.2.1 Gây miễn dịch thỏ kiểm tra có mặt kháng thể virus 40 3.2.2 Loại bỏ kháng thể không đặc hiệu kháng huyết 44 3.2.3 Tinh kháng thể sắc ký cột protein A từ kháng huyết loại bỏ kháng thể không đặc hiệu 3.3 50 Đánh giá điều kiện phản ứng ELISA dùng kháng thể tinh 3.3.1 51 Đánh giá phản ứng ELISA với độ hòa loãng kháng thể mẫu bệnh khác 3.3.2 51 Đánh giá phản ứng ELISA phận khác mẫu bệnh 3.3.3 53 Đánh giá phản ứng ELISA mẫu bệnh bảo quản điều kiện khác 3.4 55 Ứng dụng ELISA phát RYSV mẫu lúa bệnh, cỏ rầy xanh đuôi đen thu thập đồng ruộng vụ mùa 2014 57 3.4.1 ELISA phát RYSV mẫu lúa bệnh 57 3.4.2 ELISA phát RYSV mẫu cỏ thu thập ruộng 3.4.3 lúa bị bệnh vàng lụi vụ mùa năm 2014 59 Phát RYSV rầy xanh đuôi đen ELISA RT-PCR 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 Kết luận 65 Đề nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AP Bp CTAB DAS-ELISA DEPC DNA dNTP EDTA ELISA ICTV IgG IgM Kb mL mM nm NPP OD PBS PBS-T PCR PTA-ELISA PVP RdRp RNA RNP RT-PCR RYSV RTSV TAE TB µg µl β- ME Alkaline phosphatase Basepair Cetryl Ammonium Bromide Double antibody sandwich- Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Diethylpyrocarbonate Axit deoxyribonucleic Deoxynucleotide triphotphate Ethylene Diamine Tetra-acetic- Acid Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay International Committee on Taxonomy of Viruses Immunoglobulin G Immunoglobulin M Kilobase Millilit MilliMolarity Nanomet Nitrophenyl photphat Optical density Phosphate-buffered saline Phosphate Buffered Saline with Tween Polymerase chain reaction Plate Trapped Antibody-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Polyvinylpyrrolidone RNA-dependent RNA-polymerase Ribonucleic acid ribonucleoprotein Reverse transcription polymerase chain reaction Rice yellow stunt virus Rice transitory yellowing virus Tris-acetate-EDTA Trung bình Microgram Microlit Beta- Mercaptoethanol Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2013 Hiệp Hòa - Bắc Giang 3.2 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2014 xã Hòa Sơn - Hiệp Hòa - 32 Bắc Giang 3.3 Điều tra bệnh vàng lụi vụ mùa 2014 xã Ngọc Tảo - Phúc Thọ - Hà Nội 3.4 33 34 RT-PCR phát virus RYSV lúa vụ xuân 2013 Bắc Lý- Bắc Giang 35 3.5 Tinh chiết RYSV từ mô lúa bị bệnh vàng lụi 37 3.6 Kiểm tra có mặt kháng thể virus RYSV kháng huyết lấy sau tuần tuần 3.7 Kiểm tra có mặt kháng thể virus RYSV kháng huyết lấy sau tuần tuần 3.8 43 Kết ELISA đánh giá nguồn kháng huyết sau loại bỏ kháng thể không đặc hiệu qua màng nitrocellulose 3.9 42 46 Kết ELISA đánh giá khả loại bỏ kháng thể không đặc hiệu kháng huyết RYSV màng nitrocenllulose kết hợp ELISA 3.10 Kết ELISA đánh giá chất lượng kháng thể RYSV tinh sắc ký cột Proten A 3.11 52 Phản ứng ELISA phát RYSV phận khác bệnh 3.13 50 Kết ELISA với độ hòa loãng kháng thể độ hòa loãng mẫu bệnh khác 3.12 48 54 Phản ứng ELISA phát RYSV lúa bệnh bảo quản điều kiện khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 56 Page vii 3.14 Kiểm tra ELISA phát RYSV mẫu lúa vụ mùa 2014 3.15 Kiểm tra ELISA phát RYSV mẫu cỏ hòa thảo thu 3.16 58 thập ruộng lúa bị bệnh vàng lụi nặng vụ mùa 2014 60 Phát RYSV rầy xanh đuôi đen ELISA RT-PCR 61 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC HÌNH STT 1.1 Tên hình Trang Phân bố dịch bệnh “vàng lụi” Việt Nam, bệnh “vàng lùn” phía Nam Trung Quốc “vàng tạm thời” Đài Loan (các hình tam giác đỏ) năm 60, 70 1.2 Hình thái loài rầy xanh truyền RYSV 1.3 Cấu trúc phân tử rhabdovirus (Viralzone, 2009) 1.4 Phân tử virus RYSV (hình trái, Shikata Chen, 1969) vị trí 14 hình thành phân tử virus RYSV phần ngoại vi nhân tế bào lúa (hình phải, Ou, 1985) 15 1.5 Sơ đồ tổ chức gen RYSV 16 1.6 Các kỹ thuật ELISA khác (Hull, 2000) 18 3.1 Bệnh vàng lụi lúa vụ mùa 2013 Hiệp Hòa - Bắc Giang 32 3.2 Bệnh vàng lụi lúa vụ mùa 2014 Hòa Sơn- Hiệp Hòa -Bắc Giang 3.3 34 Thu thập mẫu bệnh kiểm tra RT-PCR phát virus RYSV mẫu lúa vụ mùa năm 2013 Bắc Lý- Bắc Giang M thang DNA kb (Fermentas) với băng tham khảo 0.5 kb hình 3.4 36 Mẫu lúa bị bệnh vàng lụi thu từ Hiệp Hòa - Bắc Giang Phúc Thọ - Hà Nội trồng Trung tâm Bệnh nhiệt đới 36 3.5 Một số bước trình tinh chiết virus RYSV từ mô 39 3.6 Phân đoạn virus gradient tỷ trọng đường sucrose kiểm 3.7 tra RT- PCR phân đoạn virus sau trình tinh chiết 40 Lấy máu thỏ sau tiêm lần 41 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix Bảng 3.12 Phản ứng ELISA phát RYSV phận khác bệnh Giá trị OD mẫu nghiền sau Bộ phận bệnh Mẫu lúa Mẫu lúa Mẫu lúa bệnh bệnh bệnh Giá trị OD mẫu không nghiền sau Mẫu TB TB mẫu lúa mẫu khỏe bệnh bệnh (SD) Rễ 0.831 0.208 0.219 0.184 0.361 Lóng thân 0.395 1.825 1.614 2.390 1.556 Bẹ 0.941 0.181 0.375 1.020 0.629 Lá 0.254 0.416 0.989 1.316 0.744 0.213 (0.078) 0.43 (0.021) 0.155 (0.028) 0.182 (0.012) Mẫu lúa Mẫu lúa Mẫu lúa bệnh bệnh bệnh Mẫu lúa bệnh TB mẫu bệnh 0.527 0.817 0.393 0.181 0.480 0.255 1.134 1.002 0.397 0.697 0.721 0.300 0.444 0.906 0.593 1.792 0.719 0.453 1.280 1.061 TB mẫu khỏe (SD) 0.443 (0.227) 0.615 (0.026) 0.457 (0.044) 0.294 (0.041) Ghi chú: Độ hòa loãng kháng thể 1/200, độ hòa loãng mẫu bị bệnh 1/10, độ hòa loãng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất mg/10 mL Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 Từ kết cho thấy: (1) Virus RYSV nhiễm hệ thống lúa, song phận có hàm lượng virus giống mà có khác phận Kết kiểm tra ELISA (Bảng 3.12) cho thấy, phận lóng thân có hàm lượng virus cao hơn, đặc biệt phần lóng thân sát gốc Kết đọc ELISA sau để 1giờ cho thấy giá trị OD phận tất mẫu bệnh cao đáng kể so với đối chứng mẫu khỏe tương ứng chứng tỏ virus có mặt vị trí Từ kết cho thấy lấy phận lúa để kiểm tra virus RYSV Trong đó, mẫu bệnh có giá trị OD cao (trung bình 0.744), cao gấp lần mẫu khỏe (trung bình 0.182) Điều chứng tỏ rằng, lấy mẫu bệnh làm thử nghiệm tốt để phát virus RYSV (2) Kết kiểm tra ELISA cho thấy, mẫu bệnh không nghiền mẫu bệnh có phận có hàm lượng virus cao phận khác Giá trị OD sau 1giờ mẫu bệnh cao (trung bình 1.061) so với đối chứng mẫu khỏe có giá trị OD sau 1giờ (trung bình 0.294) Điều chứng tỏ mẫu bệnh không cần nghiền phát virus RYSV 3.3.3 Đánh giá phản ứng ELISA mẫu bệnh bảo quản điều kiện khác Để đánh giá xem điều kiện bảo quản mẫu có ảnh hưởng đến phản ứng ELISA hay không, tiến hành thử nghiệm mẫu bệnh sau thu thập đồng ruộng bảo quản điều kiện khác tuần Kết trình bày Bảng 3.13, Hình 3.17 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 Bảng 3.13 Phản ứng ELISA phát RYSV lúa bệnh bảo quản điều kiện khác Điều kiện bảo quản Bộ phận bệnh Rễ - 20 oC oC 10 oC 25 oC Mẫu lúa bệnh 0.128 Giá trị OD sau 1giờ Mẫu lúa Mẫu lúa TB mẫu TB mẫu lúa bệnh bệnh lúa bệnh khỏe (SD) 0.169 0.153 0.150 0.169 (0.035) Bẹ 0.157 0.181 0.437 0.258 0.267 (0.036) Lá 0.242 0.207 0.352 0.267 0.171(0.005) Rễ 0.227 0.108 0.212 0.182 0.170 (0.010) Bẹ 0.668 0.280 0.670 0.539 0.255 (0.026) Lá 0.355 0.377 0.402 0.378 0.178 (0.000) Rễ 0.122 0.140 0.125 0.129 0.117(0.008) Bẹ 0.677 0.381 0.781 0.613 0.129(0.019) Lá 0.296 0.274 0.290 0.287 0.146(0.006) Rễ 0.117 0.113 0.121 0.117 0.134 (0.016) Bẹ 0.657 0.788 1.132 0.859 0.485 (0.045) Lá 0.228 0.187 0.194 0.203 0.207 (0.007) Ghi chú: Độ hòa loãng kháng thể 1/200, độ hòa loãng mẫu bị bệnh 1/10, độ hòa loãng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất mg/10 mL Hình 3.17 Phản ứng ELISA phát RYSV lúa bảo quản điều kiện khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 Từ kết cho thấy: (1) Kết kiểm tra ELISA cho thấy, bảo quản điều kiện 10 oC có giá trị OD sau mẫu bệnh có chênh lệch cao so với đối chứng mẫu khỏe Ba điều kiện bảo quản lại (- 20 oC, oC, 25 oC) có giá trị OD sau mẫu bệnh chênh lệch so với đối chứng mẫu khỏe Điều cho kết luận, mẫu lúa bệnh bảo quản điều kiện 10 oC tốt (2) Ở điều kiện bảo quản 10 oC, kiểm tra phận khác bệnh Kết kiểm tra ELISA cho thấy, phận bẹ có hàm lượng virus cao phận rễ bệnh Trong đó, phận bẹ có giá trị OD sau mẫu bệnh cao (trung bình 0.613), cao gấp lần so với đối chứng mẫu khỏe (trung bình 0.129) Từ kết luận, bảo quản mẫu bệnh nên để điều kiện 10 oC lấy mẫu bệnh để kiểm tra nồng độ virus nên lấy mẫu bẹ 3.4 Ứng dụng ELISA phát RYSV mẫu lúa bệnh, cỏ rầy xanh đuôi đen thu thập đồng ruộng vụ mùa 2014 3.4.1 ELISA phát RYSV mẫu lúa bệnh Chúng ứng dụng phản ứng ELISA dùng kháng thể tinh phát RYSV số mẫu lúa biểu bệnh vàng lụi thu thập tỉnh miền Bắc vụ mùa năm 2014 Kết trình bày Bảng 3.14, Hình 3.18 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 Bảng 3.14 Kiểm tra ELISA phát RYSV mẫu lúa vụ mùa 2014 Địa điểm Mẫu Giá trị OD sau Kết luận Khang Dân 0.607 + Hòa Sơn – Hiệp Hòa - Khang Dân 0.664 + Bắc Giang Khang Dân 0.699 + Bắc Thơm 0.511 + Ngọc Tảo - Phúc Thọ - Bắc Thơm 0.443 + Hà Nội Bắc Thơm 0.488 + Q5 0.355 + Thiệu Lý -Thiệu Hóa - Q5 0.352 + Thanh Hóa Q5 0.409 + Khang Dân 0.590 + Khang Dân 0.629 + Khang Dân 0.653 + Ngưỡng 0.176 Hương Canh – Bình Xuyên - Vĩnh Phúc Ghi chú: Độ hòa loãng kháng thể 1/200, độ hòa loãng mẫu bị bệnh 1/10, độ hòa loãng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất mg/10 mL Lúa giai đoạn đẻ nhánh Ngưỡng xác định theo công thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng khỏe 12 mẫu) (+): Bị bệnh (-): Không bị bệnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 Hình 3.18 Kiểm tra ELISA phát RYSV mẫu lúa vụ mùa 2014 Kết kiểm tra ELISA cho thấy tất 12/12 mẫu (100 %) lúa kiểm tra cho kết dương tính với RYSV Điều cho thấy, mẫu lúa thu thập ruộng lúa bị bệnh tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa, Vĩnh Phúc, Hà Nội bị nhiễm bệnh virus vàng lụi 3.4.2 ELISA phát RYSV mẫu cỏ thu thập ruộng lúa bị bệnh vàng lụi vụ mùa năm 2014 Hiện nay, ký chủ phụ virus vàng lụi chưa công bố giới Việt Nam Điều tra đồng ruộng cho thấy miền Bắc, bệnh xuất vào vụ mùa thường khu vực Điều dự đoán virus vàng lụi phải ký chủ phụ Nhằm xác định ký chủ phụ virus vàng lụi, tiến hành thu thập kiểm tra ELISA mẫu cỏ hòa thảo ruộng lúa bị bệnh vàng lụi nặng tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa, Hà Nội Kết trình bày Bảng 3.15 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 Bảng 3.15 Kiểm tra ELISA phát RYSV mẫu cỏ hòa thảo thu thập ruộng lúa bị bệnh vàng lụi nặng vụ mùa 2014 Địa điểm Hòa Sơn – Hiệp Hòa -Bắc Giang Thiệu Lý -Thiệu Hóa - Thanh Hóa Ngọc Tảo - Phúc Thọ - Hà Nội Mẫu Cỏ gấu Cỏ gấu Cỏ gấu Thài lài Thài lài Giá trị OD sau 0.044 0.042 0.044 0.275 0.259 Kết luận - Thài lài 0.251 - Cỏ gấu Cỏ gấu Cỏ gấu Thài lài Thài lài Thài lài 0.255 0.232 0.232 0.061 0.043 0.119 - Cỏ lồng vực Cỏ lồng vực Cỏ lồng vực Cỏ đuôi phụng 0.273 0.127 0.135 0.270 - Cỏ đuôi phụng Cỏ đuôi phụng 0.272 0.271 - Ngưỡng 0.402 Ghi chú: Độ hòa loãng kháng thể 1/200, độ hòa loãng mẫu bị bệnh 1/10, độ hòa loãng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Cơ chất mg/10 mL Ngưỡng xác định theo công thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng khỏe 18 mẫu) (+): Bị bệnh (-): Không bị bệnh Kết kiểm tra ELISA cho thấy tất 18 mẫu cỏ thuộc loài (cỏ gấu, thài lài, đuôi phụng, lồng vực) cho kết âm tính với RYSV Điều cho thấy, mẫu cỏ thu thập ruộng lúa bị bệnh tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa Hà Nội, không bị nhiễm bệnh virus vàng lụi Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 3.4.3 Phát RYSV rầy xanh đuôi đen ELISA RT-PCR Phản ứng ELISA sử dụng kháng thể RYSV tinh phát tốt virus mẫu lúa trình bày Tuy nhiên, ứng dụng quan trọng ELISA khả phát virus vector Để đánh giá khả này, tiếp tục kiểm tra ELISA virus mẫu rầy xanh đuôi đen Rầy sử dụng thí nghiệm nuôi lúa bệnh Trung tâm nghiên cứu Bệnh nhiệt đới Kết trình bày Bảng 3.16, Hình 3.19 Hình 3.20 Bảng 3.16 Phát RYSV rầy xanh đuôi đen ELISA RT-PCR Mẫu Giá trị OD sau RT – PCR Kết luận Đối chứng (Lúa bệnh 1) Đối chứng (Lúa bệnh 2) Rầy * 0.453 + + 0.517 + + 0.561 + + Rầy * Rầy * Rầy * Rầy * Rầy Rầy Rầy Rầy Rầy 10 Rầy 11 Rầy 12 Rầy 13 Rầy 14 Rầy 15 Ngưỡng 0.706 0.673 0.352 0.551 0.538 0.428 0.711 0.807 0.664 0.710 0.543 0.711 0.638 1.070 0.300 + + + (Băng mờ) + Không thử Không thử Không thử Không thử Không thử Không thử Không thử Không thử Không thử Không thử + + + + + + + + + + + + + + Ghi chú: Độ hòa loãng kháng thể 1/200, độ hòa loãng mẫu rầy bị bệnh 1/10, độ hòa loãng kháng thể chuột liên kết AP 1/5000 Ngưỡng xác định theo công thức: Ngưỡng = X +2*SD (trong X trung bình, SD độ lệch chuẩn mẫu đối chứng rầy khỏe; thí nghiệm số mẫu đối chứng rầy khỏe mẫu) * (Nghiền rầy bệnh tube với 40 µL đệm carbonate Dịch nghiền chia đôi, phần hòa loãng tiếp với 80 µL đệm carbonate cho phản ứng ELISA, phần sử dụng để chiết RNA cho phản ứng RT-PCR ) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 Hình 3.19 Kết ELISA kiểm tra nồng độ virus rầy xanh đuôi đen Hình 3.20 Kiểm tra RT-PCR phát virus vàng lụi lúa (RYSV) lúa bệnh rầy xanh đuôi đen M thang DNA kb (Fermentas) với băng tham khảo 0.5 kb hình Kết kiểm tra ELISA cho thấy tất 15/15 mẫu rầy xanh đuôi đen thí nghiệm có phản ứng dương tính với RYSV Trong số 15 mẫu thử có mẫu có giá trị OD sau 0.352, cao đáng kể so với ngưỡng 0.300 Các mẫu lại có giá trị OD cao nhiều, từ 0.428 đến 1.070 Do phản ứng ELISA sử dụng để phát RYSV rầy nên để có kết luận xác, thực song song phản ứng ELISA RT-PCR đối mẫu rầy (Bảng 3.15) Thí nghiệm thực cách sau: Nghiền rầy bệnh tube với 40 µL đệm carbonate Dịch nghiền chia đôi, phần hòa loãng tiếp với 80 µL đệm carbonate cho phản ứng ELISA, phần sử dụng để chiết RNA cho Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 phản ứng RT-PCR (Hình 3.21) Như kết trình bày Bảng 3.15, mẫu rầy có phản ứng dương tính (+) với ELISA RT-PCR Đặc biệt, mẫu rầy 4* có giá trị OD thấp (0.352) phản ứng ELISA tạo băng mờ phản ứng RT-PCR Kết ELISA RT-PCR cho thấy kháng thể tinh phát tốt RYSV ELISA dùng kháng thể có độ nhạy sánh với RT-PCR Hình 3.21 Rầy xanh đuôi đen nghiền tube 1.5 mL Nhận xét chung: Qua nghiên cứu cho thấy kháng thể đặc hiệu virus RYSV có số ưu điểm, hạn chế sau: Ưu điểm Kháng thể đặc hiệu virus RYSV có độ nhạy cao, phát dễ dàng virus RYSV mẫu lúa rầy xanh đuôi đen Phản ứng ELISA dùng kháng thể có độ nhạy tương đương phản ứng RT-PCR Hạn chế Đây kháng thể thô cần đưa chuyển kháng thể thành kỹ thuật DAS – ELISA Cần tiến hành thêm thí nghiệm khác, để đánh giá độ nhạy kháng thể đặc hiệu virus RYSV thực nghiệm, trước đưa sử dụng đại trà Qua nghiên cứu sản xuất kháng huyết chẩn đoán virus vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) đưa quy trình tạo kháng huyết đặc hiệu phân tử virus Rice yellow stunt virus Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 QUI TRÌNH TẠO KHÁNG HUYẾT THANH ĐẶC HIỆU PHÂN TỬ RYSV Vật liệu khởi đầu Mẫu lúa nhiễm bệnh RYSV kiểm tra RT-PCR Nghiền mẫu lúa bệnh (lá, thân) đệm citrate Acid hóa dịch nghiền - ủ lạnh OC Tinh chiết phân tử virus (virion) Làm ly tâm tốc độ 17400 g lấy dịch Sa lắng virus siêu ly tâm Tốc độ ly tâm 28000 rpm Tách virus ly tâm gradient tỷ trọng Cách tạo gradient đường sucrose: truyền thống với nồng độ 10, 20, 30, 40 50%; tốc độ siêu ly tâm 30000 rpm Thu thập vùng chứa virus Dịch virus tinh chiết trộn với adjuvant (complete) Tạo kháng huyết Tiêm dịch virus tinh chiết vào bắp đùi sau thỏ (4 lần, lần cách tuần) Huyết thỏ thu thập hàng tuần (trừ tuần tiêm đầu tiên) để đánh giá có mặt kháng thể Kiểm tra chất lượng kháng huyết Ứng dụng chẩn đoán Kháng huyết thu thập kiểm tra chất lượng tiêu - Tính đặc hiệu - Hiệu giá Ứng dụng chẩn đoán phát có mặt phân tử virus RYSV mẫu rầy Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Vụ mùa năm 2013 xã Bắc Lý, Hùng Sơn, Quang Minh - Bắc Giang cho thấy tỷ lệ bị bệnh từ 39.20 – 100 % (các giống khác nhau) Trong xã Bắc Lý giống Khang Dân tỷ lệ bị bệnh cao 100% Vụ mùa 2014 Phúc Thọ - Hà Nội Hòa Sơn - Bắc Giang, tỷ lệ bị bệnh 19 - 90% (các giống khác nhau) Trong Hòa Sơn - Bắc Giang giống TH 3-3 tỷ lệ bị bệnh cao 90% Bắc Thơm tỷ lệ bị bệnh cao 63.10% Đã sản xuất thành công kháng huyết đặc hiệu virus vàng lụi RYSV từ nguồn kháng nguyên virus tinh chiết từ lúa bệnh Kháng huyết tạo nhạy, phân biệt dễ dàng mẫu bệnh khỏe Đã thử nghiệm khả loại bỏ kháng thể không đặc hiệu kháng huyết virus RYSV màng nitrocellulose ELISA Kết cho thấy màng nitrocellulose loại bỏ đáng kể kháng thể không đặc hiệu virus kháng huyết Kháng thể tinh sắc ký cột protein A từ kháng huyết loại bỏ kháng thể không đặc hiệu đặc hiệu độ nhạy tốt, phát dễ dàng virus RYSV mẫu lúa rầy xanh đuôi đen Phản ứng ELISA dùng kháng thể có độ nhạy tương đương phản ứng RT-PCR Thử nghiệm điều kiện phản ứng ELISA cho thấy: • Độ hòa loãng dịch (kháng nguyên) tốt 1/5 • Độ hòa loãng kháng thể tốt 1/200 • Trên bệnh, nên lấy mẫu bệnh làm thử nghiệm tốt để phát virus RYSV • Bảo quản mẫu bệnh điều kiện 10 oC để kiểm tra virus tốt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu để sản xuất khối lượng lớn kháng huyết virus RYSV, phục vụ cho nghiên cứu chẩn đoán ứng dụng để phát sớm bệnh vàng lụi lúa đồng ruộng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Báo Nông nghiệp Việt Nam (2010) Bệnh lạ công lúa mùa sớm Bắc Giang Chi cục Bảo vệ thực vật Bắc Giang (26/08/2010) Xung quanh “bệnh lạ” lúa Hiệp Hoà, Bắc Giang: Diệt rầy để ngăn bệnh Hà Viết Cường (2010), Công nghệ sinh học bệnh Hà Viết Cường (2010), Virus NXB Đại học Nông nghiệp Hà Viết Cường, Lê Văn Hải, Nguyễn Viết Hải, Vũ Triệu Mân (2010) Xác định nguyên nhân gây bệnh vàng lùn lúa tỉnh Bắc Giang vụ mùa –2010 Vũ Triệu Mẫn, Lê Lương Tề (1998) Giáo trình bệnh nông nghiệp, Hà Nội Tài liệu nước Andrew O Jackson, Ralf G Dietzgen,Michael M Goodin, Jennifer N Bragg, and Min Deng Biology of plant Rhabdoviruses Chang, S., Puryear, J & Cairney, J (1993) A Simple and Efficient Method for Isolating RNA from Pine Trees Plant Molecular Biology Reporter 11:113-116 Chiu, R.J., Hsu, Y.H., Chen, C.C., Lee, R.C.R., Lin, M.C., Lin, S.M., and Kuo, T.T.1990 Purification and partial characterization of rice transitory yellowing virus Fang, R X., Wang, Q., Xu, B Y., Pang, Z., Zhu, H T., Mang, K Q.,Gao, D M., Qin, W S & Chua, N H (1994) Structure of the nucleocapsid protein gene of rice yellow stunt rhabdovirus Virology 204, 367–375 Hibino, H (1996) Biology and epidemiology of rice viruses Annual Review of Phytopathology 34, 249-274 Hiraguri, A., Hibino, H., Hayashi, Shimizu, T.T., Uehara-Ichiki, T., Omura, T & Sasaya, T (2009) Complete sequence analysis of rice transitory yellowing virus and its comparison to rice yellow stunt virus Archives of Virology 155:243–245 http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm http://www.mcb.uct.ac.za/Manual/lunchbox_immunoab.htm http://www.unr.edu/inbre/Proteomics/Acetone_Precipitation_Protocol.html 10 Inoue, H (1978) Transmission efficiency of rice transitory yellowing virus by the green plant hoppers, Nephotettix spp (Hemiptera: Cicadellidae) Applied Entomology and Zoology 14:123-126 11 Ou, S.H (1985) Rice Diseases Second Edition, p 23-25 & 48-49 Commonwealth Mycological Institute Publication Kew, Surrey, UK 12 K.L Heong, K.H Tan, C.P.F Garcia, L.T Fabellar, and Z Lu Research Methods in Toxicology and Insecticide Resistance Monitoring of Rice Planthoppers Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 13 Kyushu National Agricultural Experiment Station, Chikugo, Fukuoka 833, Japan (1978) Transmission Efficiency of Rice Transitory Yellowing Virus by the Green Rice Leaf hoppers, Nephotetix spp 14 Richard J Simpson , 2006 Bulk Precipitation of Proteins by Ammonium Sulfate 15 Shikata, E & Chen, M.J (1969) Electron microscopy of rice transitory yellowing virus Journal of Virology 3:261–264 16 Shikata, E (1972) Rice transitory yellowing virus Description of Plant 17 www.agrifoodtest.nl/…dia/PTA%20elisa%20protocol.pdf 18 Wang, Q., Chen, X Y., Luo, Z L & Fang, R X (1999) Sequence analysis of leader and trailer regions of rice yellow stunt rhabdovirus and characterization of their in vivo transcripts Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 [...]... “ Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán virus vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus) ’’ 2 Mục đích và yêu cầu 2.1 Mục đích Chẩn đoán sớm và chính xác virus vàng lụi trên cây lúa và rầy xanh đuôi đen bằng kỹ thuật ELISA 2.2 Yêu cầu • Tạo kháng nguyên là phân tử virus vàng lụi tinh chiết từ cây lúa bệnh và rầy xanh đuôi đen mang virus • Tạo kháng huyết thanh thỏ đặc hiệu từ nguồn phân tử virus. .. nghiệp Page 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Tạo nguồn kháng nguyên (phân tử virus vàng lụi) từ cây và rầy 2.2.2 Thử nghiệm tạo kháng thể thỏ đặc hiệu virus vàng lụi từ nguồn phân tử virus tinh sạch 2.2.3 Ứng dụng kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus vàng lụi trong điều kiện thực tế 2.2.4 Điều tra bệnh tại Bắc Giang, Hà Nội và ứng dụng chẩn đoán virus vàng lụi từ các mẫu cây lúa, cỏ và rầy xanh đuôi đen... (bệnh vàng lá di động) do Rice yellow stunt virus (RYSV) 2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ ngày 1/7/2013 đến ngày 1/8/2014 - Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới - Học viện nông nghiệp Việt Nam 2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 2.1.3.1 Vật liệu thử nghiệm tạo kháng huyết thanh và chẩn đoán ELISA - Động vật dùng để sản xuất kháng huyết thanh là thỏ đã trưởng thành, có sức khỏe... hình nghiên cứu bệnh ngoài nước Bệnh vàng lùn lúa (Rice yellow stunt disease) được phát hiện đầu tiên ở tỉnh Quảng Tây (Trung Quốc) năm 1957 và được công bố chính thức năm 1965 (Fang et al 1994) Cũng trong năm này, một bệnh trên lúa là bệnh vàng tạm thời (Rice transitory yellowing disease) đã gây thành dịch ở Đài Loan (Chiu et al., 1965) và virus gây bệnh được gọi là RTSV (Rice transitory yellowing virus) ... trường khác nhau (Hibino, 1996) Sản xuất lúa hiện đang phải đương đầu với nhiều nguy cơ, đặc biệt là sự tấn công của dịch hại, trong đó có bệnh virus Cho tới nay có hơn 15 virus gây bệnh cho lúa đã được xác định, trong đó có 12 virus ở Châu Á, 2 virus ở Châu Phi, 1 virus ở Châu Âu và 1 virus ở Châu Mỹ (Hibino, 1996) Ở Việt Nam, bệnh vàng lụi (còn gọi là bệnh vàng lá) xuất hiện ở Việt Nam từ những năm... trưởng thành, có rầy tuổi 3 - 4) với mật độ 7 15 con/m2 Kết quả giám định mẫu lúa bằng RT-PCR cho kết quả dương tính với virus vàng lá di động (Rice transitory yellowing virus) - Lần 2 (ngày 12/7/2013) cũng tại xã Hoà Sơn: bệnh vàng lá di động (Rice transitory yellowing virus) đã xuất hiện với tỷ lệ cao hơn hẳn (1 – 3%) Tần xuất bắt gặp trên các ruộng đều tăng lên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận... dịch virus và kháng thể liên kết AP Các tác giả đã chứng minh rằng bước kết hợp này không ảnh hưởng đến độ nhạy và tính đặc hiệu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19 Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Bệnh vàng lụi lúa (bệnh vàng lá di động) do Rice yellow stunt. ..3.8 PTA- ELISA kiểm tra sự có mặt kháng thể virus RYSV trong kháng huyết thanh 3.9 42 Kiểm tra sự có mặt kháng thể virus RYSV trong kháng huyết thanh lấy sau 4 tuần và 6 tuần 3.10 44 Bước khóa màng bằng sữa tách béo 5% trong ống effpendorf thí nghiệm đánh giá khả năng loại bỏ kháng thể không đặc hiệu bằng màng nitrocellulose 3.11 45 Kiểm tra ELISA dùng kháng huyết thanh RYSV thu được sau khi tinh sạch... vàng lùn lúa (Rice yellow stunt disease) được phát hiện đầu tiên ở tỉnh Quảng Tây (Trung Quốc) năm 1957 và được công bố chính thức năm 1965 (Fang et al 1994) Cũng trong năm này, có một bệnh trên lúa gọi là bệnh vàng tạm thời (Rice transitory yellowing disease) đã gây thành dịch ở Đài Loan (Chiu et al., 1965) và virus gây bệnh được gọi là RTSV (Rice transitory yellowing virus) Tại Việt Nam, bệnh vàng tạm... virus vàng lụi tinh chiết từ cây lúa bệnh • Tối ưu hóa điều kiện phản ứng bằng kỹ thuật PTA-ELISA dùng kháng huyết thanh thỏ • Điều tra bệnh tại Bắc Giang, Hà Nội và ứng dụng chẩn đoán virus vàng lụi từ các mẫu cây lúa, cỏ và rầy xanh đuôi đen thu thập ngoài tự nhiên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát hiện bệnh Bệnh vàng