Đang tải... (xem toàn văn)
Kỹ thuật sắc ký bản mỏng trong phân tích định lượng kháng sinh
Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. Bài 1: Kỹ thuật sắc ký bản mỏng trong phân tích định lượng kháng sinh. I.Tiến hành thí nghiệm. Mẫu phân tích: Kháng sinh chuẩn : 10 µl Mẫu HT28: 50 µl 2 mẫu : 10µ/ 1 mẫu II. Kết quả thí nghiệm. Sau thực hiện các bước thí nghiệm ta thu được các kết quả như sau; - Quãng đường di chuyển của dung môi: 13cm - Quãng đường di chuyển của mẫu; Mẫu 1: 10 cm Mẫu 2: 8 cm Mẫu 3: 11,5 cm III. Tính toán kết quả. Hệ số di chuyển Rf = a/b Trong đó: a là quẫng đường di chuyển của mẫu. b là quãng đường di chuyển của dung môi. Ta có: Hệ số di chuyển của mẫu 1: Rf = 10/13 = 0,77 Hệ số di chuyển của mẫu 2 : Rf = 8/13 = 0,62 Hệ số di chuyển của mẫu 3: Rf = 11,5/13 = 0,88 IV. Nhận xét: Kết quả thí nghiệm có 1 bản sắc ký với kết quả không tốt vì: * Lượng mẫu ít. * Hệ dung môi chưa phải là hệ dung môi thích hợp. * Mẫu hiện vết không rõ ràng do mẫu kháng sinh lẫn tá dược. V. Định lượng đánh giá kháng sinh. SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 1 Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. Kỹ thuật sắc ký bản mỏng trong phân tích định lượng kháng sinh là kỹ thuật chỉ thực hiện trong nghiên cứu, không áp dụng nhiều trong công nghiệp. Bản sắc ký sau khi kết thúc thí nghiệm ta sẽ tiếp tục sử dụng để: + Khoang vùng và cạo lấy phần kháng sinh ta quan tâm. + Thử hoạt tính kháng khuẩn. + Kết tinh, tinh sạch thu sản phẩm. + Xác đinh cấu trúc và 1 số hệ số lý hóa. SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 2 Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. Bài 2: Tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel. I. Nguyên tắc. Dựa vào mức độ dịch chuyển khác nhau của các phân tử có kích thước khác nhau trong hệ thống phân tử gel sắc ký hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau đi qua cột gel dưới tác dụng của lực kéo pha động. Các phân tử có kích thước lớn sẽ chui ra trước, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui ra sau. Thu sản phẩm theo phương pháp phân đoạn. Khi chuẩn bị cột sắc ký cần cân bằng cột để cho cấu trúc hạt gel ổn định, kích thước lỗ đồng đều. II. Kết quả thí nghiệm & nhận xét. Thu được 18 phân đoạn. Sau khi kết thúc thí nghiệm ta thu được 18 phân đoạn chứa trong các ống nhỏ có bịt giấy bóng kín miệng và bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 3 Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. Bài 3: Xác định hoạt độ Enzyme Amilase theo phương pháp phân tích lượng đường khử tạo thành. I. Nguyên tắc. Xác đinh hoạt độ thông qua phân tích sản phẩm đường khử tạo thành bằng phương pháp xác định hoạt độ amilase nhờ DNS. Đơn vị của hoạt độ là lượng enzyme làm thủy phân tinh bột thành sản phẩm tương đương 1µmol glucose ở điều kiện thí nghiệm trong 1 phút. II. Kết quả. Sau khi đo độ hấp phụ ở bước sóng 575nm trên máy quang phổ ta thu được kết quả ở bảng sau. STT ống kiểm tra (giá trị OD) Hàm lượng đường ống kiểm tra(b) Ống thí nghiệm (OD) Hàm lượng đường ống thí nghiệm(a) Đơn vị hoạt dộ Hoạt độ riêng 1 - 0.179 - 1.677601 0.193 1.80881 0.464854 2 - 0.172 - 1.611996 0.184 1.724461 0.444860 3 0.083 0.796626 0.180 1.686973 0.118712 4 0.188 0.761949 0.209 1.958876 0.159575 5 0.158 1.480787 0.253 2.371134 0.118712 6 0.286 2.680412 7 0.256 2.39925 8 0.252 2.361762 9 0.205 1.921275 10 0.004 0.037488 0.197 1.846298 0.241174 11 0.048 3.823805 0.135 1.26523 -0.341143 12 - 0.016 - 0.14995 0.224 2.099344 0.299905 13 0.074 0.693533 0.285 2.67104 0.263667 14 0.067 0.627929 0.478 4.47985 0.313589 15 - 0.021 - 0.19681 0.188 1.761949 0.261167 SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 4 Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. 16 0.175 1.640112 0.240 2.249297 0.081224 17 0.188 1.761949 0.161 1.508903 -0.033739 18 0.074 0.693533 0.201 1.883786 0.158700 4 19 0.083 0.777882 0.448 4.198688 0.456107 Phương trình đồ thị chuẩn y = 0.1067x (1) Với y là giá trị của OD x là hàm lượng đường µmol/ml Từ (1) suy ra x = y/ 0.1067 (2) Ta có công thức đơn vị hoạt độ ((a-b).c)/ (0.25.t) (3) Trong đó: a số µmol đường trong ống thí nghiệm b số µmol đường ở ống kiểm tra c độ pha loãng dung dịch (1) t thời gian phản ứng (30 phút). Dựa vào phương trình (2) ta tính được hàm lượng đường ở ống kiểm tra (a,b) dựa vào phương trình (3) ta tính được hoạt độ của từng phân đoạn. Vậy qua bảng kết quả ta tính được đơn vị hoạt độ của phân đoạn 14 là cao nhất . Ở phân đoạn 14 có đơn vị hoạt độ là cao nhất có nghĩa là lượng enzyme làm thủy phân tinh bột thành sản phẩm tương đương 1 µmol glucose điều kiện thí nghiệm là 1 phút là cao nhất so với các phân đoạn khác. Bài 4. Định lượng protein tan theo phương pháp lowry. I. Nguyên lý. SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 5 Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden-photphovonphramat. Để xác định hàm lượng của protein phức chất màu xanh da trời có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 750nm. II. Kết quả thí nghiệm & nhận xét. a, Phương trình đồ thị chuẩn: y = 0.001x (1) Trong đó y là giá trị OD x là hàm lượng protein (mg/ml) b, Thí nghiệm: Sau khi cho thuốc thử Foling, các ống nghiệm xuất hiện màu xanh da trời đậm nhạt khác nhau. Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng – protein khử hỗn hợp photphomolipden-photphovonphramat để xác định hàm lượng protein. Hỗn hợp có màu xanh là do: + Phức chất màu xanh là phức chất của đồng-protein thuốc thử Foling. + Thuốc thử Foling tác dụng với gốc Tỷ, Try trong phân tử protein tạo phức chất màu xanh. Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trường có chứa muối amon, phenol, các ion kim loại…sau khi đo OD ở bước sóng 750nm ta thu được kết quả: STT OD STT OD 1 0.018 10 0.399 2 -0.005 11 0.418 3 0.045 12 0.473 4 0.096 13 0.523 5 0.190 14 0.548 6 0.173 15 0.541 7 0.170 16 0.506 8 0.245 17 0.420 9 0.260 18 0.239 Và ống kiểm tra (dịch enzyme thô) 0.571 có giá trị cao nhất vì là dịch có hoạt tính enzyme cao hơn các mẫu khác. SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 6 Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. Từ phương trình (1) ta có x = y/ 0.001(mg/ml) hàm lượng protein. STT 10 399 1 18 11 418 2 -5 12 473 3 46 13 523 4 96 14 548 5 190 15 541 6 173 16 506 7 170 17 420 8 254 18 239 9 260 19 571 Như vậy ta thấy ống thu ở phân đoạn thứu 14 cho hàm lượng protein cao nhất so với các mẫu ở các phân đoạn khác. Ống 19 là dịch enzyme thô cho hàm lượng protein cao nhất. STT OD (750nm) Hàm lượng protein Hoạt độ riêng 1 0.018 18 25.825>1 loại 2 -0.005 -5 -88.972<0 loại 3 0.045 45 2.638>1 loại 4 0.096 96 1.662>1 loại 5 0.190 190 0.6248 6 0.173 173 7 0.170 170 8 0.245 245 9 0.260 260 10 0.399 399 0.604 11 0.418 418 -0.816<0 loại 12 0.473 473 0.634 13 0.523 523 0.504 14 0.548 548 0.937 15 0.541 541 0.482 16 0.506 506 0.1605 17 0.420 420 -0.080<0 loại 18 0.239 239 0.66 19 571 20 Kết luận: Đánh giá độ sạch thu được ở các phân đoạn bằng cách: SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 7 Báo cáo thực hành công nghệ hóa sinh. GVHD: ThS. Trịnh Đình Khá. - Đánh giá qua hoạt độ riêng - Kiểm tra đánh giá bằng phương pháp điện di tren gel Hoạt độ riêng = ( số đơn vị hoạt độ enzyme)/ ( đơn vị khối lượng protein) SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 8