BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  Bộ Môn: Phân tích vi sinh thực phẩm BÀI BÁO CÁO Đề tài: MỤC LỤC Tổng quan vi sinh vật hiếu khí 1.1 Định nghĩa PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Vi sinh vật hiếu khí vi khuẩn tang trưởng hình thành khuẩn lạc điều kiện có diện oxy (O2) phân tử Là vi sinh vật thị Do đó, tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh độ an toàn thực phẩm Tổng số vi sinh vật hiếu khí diện mẫu thị mức độ vệ sinh thực phẩm, đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật, nguy hư hỏng, thời hạn bảo quản sản phẩm, mức độ vệ sinh trình chế biến bảo quản thực phẩm Chỉ số xác định phương pháp đếm khuẩn lạc mọc môi trường thạch dinh dưỡng, từ lượng mẫu xác định sở xem khuẩn lạc phát triển từ tế bào diện mẫu biểu diễn dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) đơn vị khối lượng hay thể tích thực phẩm có số tên gọi khác như: - Số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count_APC) - Tổng số đếm đĩa (Total Plate Count_TPC) - Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count_TVC) - Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count_SPC) Một số phương pháp xác định tổng vi sinh vật hiếu khí thực phẩm 4.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc TCVN 4884- 2005 PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Nguyên tắc: ủ vi sinh vật mẫu thực phẩm cần phân tích điều kiện hiếu khí nhiệt độ 300C 72 Sau tính số lượng vi sinh vật 1g 1ml mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu đĩa chọn 4.2 Phương pháo màng lọc Phương pháp sử dụng lọc màng ô vuông kị nước (TCVN 7923:2008) Nguyên tắc: Bộ lọc màng kẻ ô vuông kỵ nước có màng lọc khuôn mẫu kẻ ô vuông đóng vật liệu kỵ nước Các đường kẻ ngăn chặn không cho khuẩn lạc mọc lan, phân chia bề mặt lọc màng thành ngăn tách biệt có kích thước xác định Đếm số lượng ô vuông có chứa khuẩn lạc quy đổi sang số có xác suất lớn (MPN) vi sinh vật, sử dụng công thức cho 4.3 Kỹ thuật màng petrifilm TCVN 9977:2013 Nguyên tắc: môi trường dinh dưỡng dạng đông khô cố định vào màng mỏng gọi Petrifilm Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên nâng lên nhỏ ml dịch mẫu đậy lại Một đĩa pertri nhựa đặt màng bảo vệ để tạo khuôn tròn Môi trường dinh dưỡng hỗ trợ vi sinh vật phát triển thời gian ủ Sau đem ủ đếm khuẩn lạc Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí phương pháp đếm khuẩn lạc 5.1 Nguyên tắc Cấy lên môi trường cấy quy định, sử dụng hai đĩa, dung lượng mẫu thử qui định sản phẩm dạng lỏng với lượng huyền phù ban đầu quy định sản phẩm dạng khác PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Trong điều kiện, cấy dung dịch pha loãng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu vào hai đĩa cho dung dịch pha loãng Các đĩa ủ điều kiện hiếu khí nhiệt độ 300C 72 ± Tính số lượng vi sinh vật 1g 1ml mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu đĩa chọn 5.2 Dụng cụ, thiết bị hoá chất 5.2.1 Thiết bị • Cân phân tích: cân lượng mẫu phân tích trường hợp phân tích mẫu rắn hay huyền phù Hình 1: Cân phân tích • Máy dập mẫu (Stomacher): dùng để dập mẫu đồng mẫu trường hớp mẫu rắn PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Hình 2: Máy dập mẫu • Máy rung: dùng để trộn mẫu ống nghiệm cho đồng Hình 3: Máy rung • Nồi hấp, tủ sấy: dùng để khử trùng khô bình tam giác, ống nghiệm… ( tủ sấy) khử trùng ướt (nồi hấp) PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Hình 4: Nồi hấp Hình 5: Tủ sấy • Tủ ấm: để ủ vi sinh vật Có khả hoạt động 30oC Hình 6: Tủ sấy • pH kế: PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Hình 7: pH kế 5.2.2 Dụng cụ Hình 8: Bình tam giác pipetman Hình 9: Ống nghiệm đĩa petri 5.2.3 Hoá chất môi trường Môi trường - hóa chất Mục đích Saline Pepton Water (SPW) Pha loãng mẫu Plate count agar (PCA) Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí HCl 10% Chỉnh pH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM NaOH 10% Thành phần môi trường PCA Pepton từ casein 5g Cao nấm men 2.5 g Glucoza, dạng khan 1g Thạch Agar – 18 g Nước 1000 ml Thành phần dịch pha loãng SPW NaCl 8.5 g Pepton 1g Nước 1000 ml 5.3 Quy trình phân tích PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM 10g/25g mẫu rắn 10ml/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water Đồng mẫu Stomacher 60 giây Dịch mẫu 10-1 Pha loãng Dịch mẫu 10-2 15 ml 15 ml PCA 02 đĩa 02 đĩa (PCA đung chảy làm nguội đến 470C) Xoay nhẹ trộn mẫu, nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược đĩa ủ tủ ấm 300C 72 ± Đọc kết qủa chọn đĩa mọc lớn 15 nhỏ 300 khuẩn lạc độ pha loãng liên tiếp Tính biểu thị kết Hình 10: Quy trình phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí 5.4 Các bước tiến hành 5.4.1 Chuẩn bị môi trường • Chuẩn bị môi trường PCA: có phương pháp o Chuẩn bị từ môi trường hoàn chỉnh dạng thương phẩm khô PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM o Chuẩn bị từ thành phần khô • Khử trùng môi trường: Khử trùng 15 phút nồi hấp áp lực 121oC Làm nguội nồi cách thuỷ đến nhiệt độ 47oC Chỉnh pH sau khử trùng 5.4.2 Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Cân xác 10g mẫu rắn đong mẫu với thể tích 10ml mẫu lỏng phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW 90 ml vô trùng vào bao PE (hoặc bình tam giác) chứa mẫu Đồng mẫu máy dập mẫu phút lắc bình tam giác có mẫu dịch pha loãng SPW 2-3 phút Để vi sinh vật không bị tổn thương thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ dịch pha loãng suốt trình thao tác phải giữ xấp xỉ nhiệt độ phòng 5.4.3 Pha loãng mẫu Dịch mẫu tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân cách dùng pipetman có đầu típ vô trùng chuyển ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng Trộn mẫu ống nghiệm cho đồng máy rung vortex dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5-10 lần Dung dịch có độ pha loãng 10 -2 Sau sử dụng pipetman đầu tip hay thay đầu tip tiếp tục chuyển 1ml dịch ống nghiệm vừa pha loãng sang ống nghiệm khác chưa 9ml dịch pha loãng thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10 -3 Tiếp tục thực tương tự để có độ pha loãng thập phân độ pha loãng cần thiết Lưu ý: • Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu chất cấy tiếp xúc với môi trường không vượt 45 phút thời gian chuẩn bị huyền phù ban đầu đến PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM bắt đầu chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân không vượt 30 phút • Nếu đầu tip pipetman có nguy bị nhiễm trình thao tác chạm tay, chạm mặt ống nghiệm, mặt bình chứa… cần phải thay đầu tip vô trùng khác 5.4.4 Cấy ủ mẫu • Chọn hay độ pha loãng liên tiếp dự kiến chưa 15-300 tế bào vi sinh vật ml để cấy lên đĩa Petri o Nếu mẫu dạng lỏng: dung pipet vô trùng cho vào đĩa 1ml o Nếu mẫu dạng rắn: dung pipet vô trùng cho vào đĩa 1ml dịch huyền phù ban đầu • Tương ứng với độ pha loãng cấy 2-3 đĩa (thực 2-3 lần lặp lại) • Rót vào đĩa Petri khoảng 12-15ml môi trường PCA 440C đến 470C • Trộn dịch mẫu với môi trường cách xoay đĩa Petri xuôi ngược chiều kim đồng hồ, chiều 3- lần sau đổ môi trường đặt đĩa mặt phẳng nằm ngang hỗn hợp đông đặc • Lật ngược đĩa cấy đặt vào tủ ấm 300C 72 5.4.5 Đếm khuẩn lạc • Sau giai đoạn ủ qui định, đếm khuẩn lạc đĩa Sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (nếu cần) Kiểm tra đĩa ánh sang dịu, điều quan trọng khuẩn lạc phải đếm tránh đếm nhầm với hạt không hòa tan chất kết tủa PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM đĩa Kiểm tra cẩn thận khuẩn lạc nghi ngờ, cần nên dung kính lúp có độ khuyếch đại lớn để phân biệt khuẩn lạc với tạp chất lạ • Các khuẩn lạc mọc lan rộng coi khuẩn lạc đơn lẻ Nếu đĩa mọc dày lan rộng, đếm khuẩn lạc đĩa phần lại tính số tương ứng cho đĩa ¼ đĩa bị mọc dày lan rộng loại bỏ đĩa không đếm Hình 11: Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí môi trường PCA từ 15-300 khuẩn lạc PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Hình 12: Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí môi trường PCA lớn 300 khuẩn lạc Hình 13: Khuẩn lạc mọc loang môi trường PCA PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Hình 14: Mẫu bị nhiễm không đạt yêu cầu 5.4.6 Tính kết thu • Chọn đĩa có 15-300 khuẩn lạc đếm • Tính số lượng VSV hiếu khí 1g ml thực phẩm công thức: A(CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: A: số đơn vị hình thành khuẩn lạc vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy giữ lại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng • Nguyên tắc làm tròn kết quả: kết làm tròn đến hai chữ số có nghĩa Sau tính kết quả, chữ số thứ bé không thay đổi chữ số đứng trước nó, lớn tăng chữ số đứng trước lên đơn vị Ví dụ: PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM 11,300 CFU/g báo cáo 1,1 x 104 CFU/g 235,000 CFU/g báo cáo 2,4 x 105 CFU/g • Ví dụ cách tính kết tổng vi sinh vật hiếu khí: Độ pha loãng Số khuẩn lạc 10-3 10-4 168 19 173 15 Số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí đếm hai độ pha loãng liên tiếp là: Ở độ pha loãng d=10-3: đếm 168 khuẩn lạc 173 khuẩn lạc Ở độ pha loãng d=10-4: đếm 19 khuẩn lạc 15 khuẩn lạc, ta có A(CFU/g hay CFU/ml) = Làm tròn kết 1,7 x 105 CFU/g (hoặc CFU/ml) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Thúy Hương, giảng Phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM, 2012 PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM [2] Đinh Thị Hải Thuận (chủ biên), Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Kim Liên, Nguyễn Thị Kim Oanh, Liêu Mỹ Đông, giáo trình Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại Học Công Nghiêp Thực Phẩm TP.HCM, 2013 [3] Trần Linh Thước, phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, nhà xuất giáo dục Việt Nam, 2013 [...]... tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM, 2012 PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM [2] Đinh Thị Hải Thuận (chủ biên), Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Kim Liên, Nguyễn Thị Kim Oanh, Liêu Mỹ Đông, giáo trình Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại Học Công Nghiêp Thực Phẩm TP.HCM, 2013 [3] Trần Linh Thước, phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, ... lạc vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA từ 15-300 khuẩn lạc PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Hình 12: Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA lớn hơn 300 khuẩn lạc Hình 13: Khuẩn lạc mọc loang trên môi trường PCA PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM Hình 14: Mẫu bị nhiễm và không đạt yêu cầu 5.4.6 Tính kết quả thu được • Chọn các đĩa có 15-300 khuẩn lạc đếm • Tính số lượng VSV hiếu khí. .. lớn hơn hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước nó lên 1 đơn vị Ví dụ: PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM 11,300 CFU/g báo cáo là 1,1 x 104 CFU/g 235,000 CFU/g báo cáo là 2,4 x 105 CFU/g • Ví dụ cách tính kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí: Độ pha loãng Số khuẩn lạc 10-3 10-4 168 19 173 15 Số khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là: Ở độ pha loãng d=10-3: đếm được...PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá 30 phút • Nếu đầu tip của pipetman có nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác như chạm tay, chạm mặt ngoài ống nghiệm, mặt ngoài bình chứa… thì cần phải thay đầu tip vô trùng khác 5.4.4 Cấy và ủ mẫu • Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chưa 15-300 tế bào vi sinh vật trong. .. Chọn các đĩa có 15-300 khuẩn lạc đếm • Tính số lượng VSV hiếu khí trong 1g hoặc 1 ml thực phẩm bằng công thức: A(CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: A: số đơn vị hình thành khuẩn lạc vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy được giữ lại ở độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng • Nguyên tắc làm tròn... tủ ấm ở 300C trong 72 giờ 5.4.5 Đếm khuẩn lạc • Sau giai đoạn ủ qui định, đếm các khuẩn lạc trên các đĩa Sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (nếu cần) Kiểm tra các đĩa dưới ánh sang dịu, điều quan trọng là các khuẩn lạc chính phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạt không hòa tan hoặc các chất kết tủa trên PHÂN TÍCH VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM đĩa Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi ngờ, khi cần nên dung... thì cấy ít nhất 2-3 đĩa (thực hiện 2-3 lần lặp lại) • Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 12-15ml môi trường PCA ở 440C đến 470C • Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay đều đĩa Petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3- 5 lần ngay sau khi đổ môi trường và đặt các đĩa trên mặt phẳng nằm ngang để cho hỗn hợp đông đặc • Lật ngược các đĩa đã cấy và đặt vào tủ ấm ở 300C trong 72 giờ 5.4.5 Đếm... Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm, Trường Đại Học Công Nghiêp Thực Phẩm TP.HCM, 2013 [3] Trần Linh Thước, phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, nhà xuất bản giáo dục Vi t Nam, 2013