Đang tải... (xem toàn văn)
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CẤY ĐẾN SỰ THỤ TINH VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI IN VITRO TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CẤY ĐẾN SỰ THỤ TINH VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI IN VITRO TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Mai Công Minh Tâm 2 Ngày nay, khi nhắc đến lónh vực “Thụ tinh trong ống nghiệm” chúng ta đều nghó đến những thành tựu to lớn mà nó đem lại. Ởû nước ta, việc ứng dụng “Thụ tinh trong ống nghiệm” trong Y học nhằm giải quyết vấn đề vô sinh đã có những thành công rực rỡ, việc bệnh viện phụ sản Từ Dũ đón chào đứa bé thụ tinh trong ống nghiệm thứ 1000. Như vậy, có thể thấy thụ tinh trong ống nghiệm là một ngành khoa học có nhiều tiềm năng, trong đó quan trọng hơn hết nó là một phương thức diệu kỳ nhằm khắc phục hiện tượng bất thụ của con người nói riêng cũng như động vật nói chung. Tuy nhiên để đạt được những thành công to lớn ấy, việc đầu tư nghiên cứu những quy trình mới cũng như việc tìm tòi sáng tạo cải tiến quy trình cũ nhằm đưa ra một quy trình hợp lý mang tính thực tiễn cao thích hợp với điều kiện nước ta là vô cùng cấp thiết. Ngày nay đối tượng được sử dụng rộng rãi nhất trong lónh vực này đó là chuột nhắt trắng bởi vấn đề đạo đức trong sinh học không cho phép chúng ta nghiên cứu trên con người. Trong bước đầu tiếp cận với quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở chuột nhắt trắng, chúng tôi đã gặp không ít khó nhăn do điều kiện của chúng ta còn nhiều hạn chế. Nhưng thông qua đó, chúng tôi dần hoàn thiện thao tác của mình nhằm phù hợp với điều kiện hiện có. Và thông qua đó, chúng tôi nhận thấy rằng: “Nếu như chúng ta gia tăng thời gian cấy trứng thì chúng ta sẽ giảm thiểu thời gian hợp tử tồn tại trong môi trường ngoài, hơn nữa các chi phí tốn kém về môi trường nuôi cấy, đóa petri nuôi cấy và các thành phần khác sẽ được giảm thiểu. Ngoài ra, việc xác đònh chính xác những phôi đã thụ tinh (phôi 2 tế bào) sẽ dễ dàng hơn.” Trong gần 3 tháng thực hiện luận văn tốt nghiệp tại Phòng thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ, chúng tôi đã thực hiện đề tài này và đã thiết lập những thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm theo 2 hướng : Các thí nghiệm có thời gian cấy theo quy trình chuẩn. Các thí nghiệm có thời gian cấy dài hơn, tiện lợi hơn cho thao tác. Mục đích chính của các thí nghiệm trên là nhằm khảo sát ảnh hưởng của thời gian cấy trứng lên quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi trong giai phân chia sớm. Tuy nhiên, những nghiên cứu như trên ở nước ta còn quá mới mẻ và điều kiện thực hiện còn hạn chế do đó với tầm vóc khiêm tốn của đề tài cùng với quỹ thời gian ít ỏi, chúng tôi mong rằng đề tài này sẽ đem lại một cách nhìn đúng đắn cho quy trình thụ tinh trong ống nghiệm ở điều kiện nước ta hiện nay. Mai Công Minh Tâm 3 Phần 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP I. Vật liệu : 1) Đối tượng nghiên cứu : Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng chuột nhắt trắng (Mus musculus var albino) có trọng lượng khoảng 20 – 30 g gồm chuột cái và chuột đực trưởng thành về mặt sinh dục (khoảng 2 – 3 tháng tuổi). Nguồn chuột do viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2) Dụng cụ hoá chất và thiết bò: 2.1) Dụng cụ : 2.1.1) Dụng cụ giải phẫu : Giấy lót. Kéo thẳng , kéo cong Pinch thẳng. 2.1.2) Dụng cụ tách và thu nhận tế bào : Ống tuýp 5ml Ống tuýp 14 ml Ống tiêm 1ml Kim tiêm 26G Đóa petri nhựa (đường kính 35 mm) Đóa petri nhựa (đường kính 60 mm) Pipette Pasteur vô trùng. Dụng cụ hút, rửa phôi 2.1.3) Dụng cụ đếm tế bào : Lame, lamelle Phòng đếm Neubauer 2.1.4) Những dụng cụ khác : Đèn cồn. Tip 10 – 100 µl Micropipette 10 – 100 µl . Mai Công Minh Tâm 4 Gói Medipack dùng để đóng gói dụng cụ phẫu thuật trước khi hấp vô trùng. 2.2) Hoá chất : 2.2.1) Hoá chất khử trùng: Cồn 70 0 . 2.2.2) Hormon kích thích trứng chín và rụng: PMSG : - Dạng đông khô. - Bảo quản : 25 0 C, tránh ánh sáng. - Công dụng : kích thích nang trứng phát triển. - Pha chế : stock 1000UI + 10 ml nước cất 2 lần - Tiêm 10 UI/ 1 con chuột. Pregnyl : - Dạng đông khô. - Bảo quản 2 – 15 o C , tránh ánh sáng. - Công dụng : kích thích trứng chín và rụng. - Pha chế : stock 1500UI + 15 ml nước cất 2 lần. - Tiêm 10 UI/ 1 con chuột. 2.2.3) Môi trường thu nhận ống dẫn trứng và mào tinh : Môi trường Gamete TM Vitrolife : - dạng dung dòch. - bảo quản 2 – 8 o C , - tránh ánh sáng Thành phần chính : ¾ Muối ¾ Lactate ¾ Pyruvate ¾ Human serum albumin_HSA ¾ Nước Mili Q 2.2.4) Môi trường thụ tinh và nuôi phôi : Môi trường IVF TM – 20 Vitrolife : dạng dung dòch bảo quản 2 – 8 0 C , tránh ánh sáng Mai Công Minh Tâm 5 Thành phần chính : ¾ Muối ¾ Lactate ¾ Pyruvate ¾ Human serum albumin _ HSA ¾ Nước Mili Q. 2.2.5) Dầu phủ môi trường : Dầu khoáng do phòng thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm Bệnh viện phụ sản Từ Dũ cung cấp. - tỷ trọng 0.83 – 0.86 ở 20 o C - khử trùng dầu bằng phương pháp lọc bằng milipore filter. II. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm: Các phương pháp được thực hiện như sau : 1) Ổn đònh điều kiện sống của chuột khoảng 2 – 3 ngày trước khi làm thí nghiệm. Chuột nhắt trắng được nuôi ổn đònh trong chuồng bằng thuỷ tinh có thể tích 25cm ° 25 cm ° 12 cm tại phòng nuôi chuột thí nghiệm – Khoa Hiếm muộn bệnh viện Phụ sản Từ Dũ. Chuột đực và chuột cái được nuôi riêng. Một chuồng có khoảng 3 con. Chuột được ổn đònh chu kỳ sáng tối chu kỳ sáng 7 giờ đến 19 giờ, chu kỳ tối từ 19 giờ đến 7 giờ sáng hôm sau. Thức ăn dùng để nuôi chuột là cám viên chuyên biệt cho chuột của viện Pasteur, cùng với giá, rau muống, thóc mầm. Cách cho chuột ăn như sau : Sáng : cho chuột ăn cám viên. Chiều : cho chuột ăn thóc mầm hoặc giá hay thỉnh thoảng cho chuột ăn rau muống. Nước uống được lấy từ nguồn nước lọc dân dụng. Chú ý : Thức ăn rau cần phải rửa sạch trước khi cho chuột ăn. Không nên cho chuột ăn quá nhiều cám viên trong một bữa, điều này sẽ làm cho chuột bò béo phì gây khó khăn cho thao tác sau này. Mai Công Minh Tâm 6 2) Gây động dục ở chuột cái : sau thời gian ổn đònh, ta tiêm chuột cái hormon gây động dục. Phác đồ tiêm thuốc cho chuột như sau : P h ư ơ n g pháp tiêm thuốc : • Bắt chuột. • Giữ chuột • Tiêm 10 UI bằng ống tiêm 1ml, kim tiêm 26G. Tuân thủ theo các nguyên tắc khi tiêm thuốc như sau : Không để chuột có thể quay đầu và cắn vào tay người chích. Tránh tiêm vào cơ hoành hay bàng quang. Thuốc sau khi tiêm không được chảy ra ngoài. Chỗ tiêm không bò chảy máu . Lớp da không bò phồng lên . 3) Quy trình thu nhận giao tử : 3.1 Chuẩn bò dụng cụ và môi trường thao tác trước ngày thao tác ( D -1 ): Toàn bộ dụng cụ giải phẩu chuột đều được đóng gói lại cẩn thận và đem hấp khử trùng bằng autoclave ở 121 o C khoảng 30 phút trước khi sử dụng. Chuẩn bò một đóa rửa (R) : dùng để rửa trứng sau khi thu và làm nơi để trứng chờ trước khi thụ tinh. Trong đó, 3 giọt đầu (1,2,3) chứa khoảng 80 µl môi trường Gamete và một giọt còn lại chứa 80 µl môi trường IVF. Sau đó, phủ ngập dầu khoáng đóa rửa này và ủ trong tủ ấm ở 37 0 C, 5% CO 2 . Chuẩn bò 4 ống tuýp loại 5ml trong đó : Ngày thực hiện Chuột dùng để thu phôi Ngày - 3 (D -3 ) Tiêm 10 IU PMSG cho chuột cái Ngày -1 (D -1 ) (46 – 48h sau khi tiêm PMSG) Tiêm 10 IU Pregnyl. Mai Công Minh Tâm 7 C h u a ån bò 2 ống tuýp loại 14 ml chứa khoảng 0,3 – 0,5 ml môi trường IVF dùng để xử lý tinh trùng bằng phương pháp Swim-up. Chú ý : các ống tuýp đều được ghi tên cẩn thận. Nút được đóng ở nấc 1 để môi trường trong tuýp được cân bằng với không khí và nhiệt độ trong tủ nuôi cấy. Chuẩn bò một đóa rửa tinh trùng (loại đường kính 60mm) : ta chia làm 4 phần bằng nhau, mỗi phần ta tạo được 3 giọt môi trường IVF (khoảng 80 µl một giọt) sau đó phủ dầu khoáng. 3.2 Thao tác tạo giọt môi trường: Dùng bút vẽ chia đều đóa petri làm 4 phần đều nhau . Đánh số từng khoảng (từ 1 đến 4) Ghi chú thật cụ thể trên đóa cùng với ngày tạo giọt . Gắn pipette Pasteur vào ống tiêm có đầu silicon, sau đó hút môi trường rồi nhỏ vào từng khoảng, mỗi khoảng một giọt (mỗi giọt khoảng 80 µl). Sau đó phủ dầu khoáng cho ngập các giọt môi trường . Tất cả môi trường được đặt vào trong tủ ấm 37 0 C , 5% CO 2 / 4-6h trước khi sử dụng. Riêng đóa rửa (R) được để qua đêm. Tên ống tuýp Môi trường Thể tích Mục đích sử dụng SP1 Gamete 2 ml Thu mào tinh và rửa sạch máu, mỡ. SP2 IVF 1 ml Thu tinh trùng OV1 Gamete 2 ml Thu ống dẫn trứng và rửa sạch máu, mỡ. OV2 Gamete 2 ml Thu trứng 1 2 3 4 80 µl IVF 80 µl Gamete 80 µl Gamete Hình 16 : Chuẩn bò đóa rửa trứng. Mai Công Minh Tâm 8 Hình 17 : Thao tác tạo giọt môi trường và chuyển phôi vào giọt môi trường. 3.3 Những chuẩn bò trước khi thao tác vào ngày D 0 : Gọi ngày D 0 là ngày trứng được thụ tinh. Trước tiên ta chuẩn bò một đóa nuôi phôi (D 1 ) : trình tự chuẩn bò như trên, môi trường là môi trường IVF. Đóa này được dùng để nuôi phôi vào khoảng 4giờ sau khi cấy. Chuẩn bò sẵn các dụng cụ cần thiết : o Ống tiêm có đầu silicon có gắn sẵn pipet Pasteur o 2 ống tiêm 1ml có gắn kim 26G o 2 đóa pertri vô trùng . o Một bộ dụng cụ phẩu thuật và giấy thấm lót cho chuột khi phẩu thuật. o Một bao rác để bỏ xác chuột. Chú ý : Khi thu tinh trùng ta chuẩn bò 1 bộ như trên và khi thu trứng cũng vậy. 3.4 Thu nhận tinh trùng : 3.4.1 Giải phẫu chuột đực và thu mào tinh : Mai Công Minh Tâm 9 - Giết chuột đột ngột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ. - Mổ ổ bụng của chuột đực. - Kéo tinh hoàn và mào tinh ra khỏi ổ bụng. Nếu như chuột đực quá mập, khi mổ ổ bụng ra ta sẽ thấy được 2 mô mỡ nối liền với tinh hoàn của chuột đực. Kéo hai mô mỡ này lên ta sẽ thấy được 2 tinh hoàn. Dùng pinch thẳng kéo tiếp tinh hoàn lên ta sẽ thấy được mào tinh. Như đã trình bày ở trên, mào tinh có hình dấu chấm hỏi. Dùng kéo thẳng thu lấy mào tinh. Thao tác này phải khéo và thật cẩn thận nếu không ta sẽ thu mào tinh cùng với những mô mỡ bao quanh. Điều này sẽ gây bất lợi cho thao tác sau này. - Chuyển mào tinh hoàn vào ống tuýp SP1. 3.4.2 Thu nhận tinh trùng và xác đònh mật độ tinh trùng : - Chuyển toàn bộ môi trường chứa mào tinh trong ống SP1 vào một đóa petri vô trùng đã chuẩn bò trước. - Dùng 2 ống tiêm đã chuẩn bò trước rửa sạch máu và loại bỏ mỡ bám trên mào tinh. - Chuyển toàn bộ môi trường trong ống tuýp SP2 vào đóa petri đã chuẩn bò trước. - Chuyển mào tinh này sang đóa trên. Dùng 2 ống tiêm đẩy tinh trùng ra khỏi mào tinh hoàn. Để thu được lượng tinh trùng triệt để trong mào tinh, ta có thể dùng đầu ống tiêm trên tạo một vài vết cắt trên mào tinh rồi ấn nhẹ vào mào tinh để tinh trùng thoát ra dễ dàng. Cứ thế ta sẽ thu được từng khối tinh trùng trào ra từ những vết cắt. - Dùng ống tiêm có đầu silicon đã gắn sẵn pipet pasteur thu tất cả môi trường chứa tinh trùng vào một ống tuýp mới. Tiếp theo ta trộn đều môi trường chứa tinh trùng bằng cách hút nhả nhiều lần môi trường này. Chú ý thao tác thật nhẹ nhàng nếu không lực cơ học khi hút đẩy sẽ làm chết tinh trùng chuột. Sau đó, trích một ít môi trường để xác đònh mật độ tinh trùng bằng phương pháp phòng đếm Neubauer. 3.4.3 Xử lý tinh trùng và xác đònh mật độ tinh trùng sau xử lý: Mai Công Minh Tâm 10 - Sau khi xác đònh mật độ tinh trùng lúc ban đầu. Ta xử lý tinh trùng bằng phương pháp Swim – up. - Nguyên tắc của phương pháp này được trình bày ở phần tổng quan tài liệu. Cách tiến hành : - Dùng ống tiêm đã dùng ở trên hút trộn môi trường chứa tinh một lần nữa. - Chia đôi môi trường này. - Chuyển từng phần môi trường chứa tinh trùng (khoảng 0,5 ml) đặt nhẹ nhàng bên dưới môi trường IVF trong ống tuýp 14 ml đã chuẩn bò sẵn. - Lúc này ta thấy rất rõ 2 phần môi trường : một phần trong phía trên và phần đục chứa tinh trùng ở dưới. - Dùng bút lông vạch nhẹ đánh dấu mặt phân cách của 2 môi trường. - Đặt nhẹ nhàng các ống tuýp vào một cốc nhựa sạch để tạo góc nghiêng tương đương một góc 45 0 . - Đặt cốc này nhẹ nhàng vào tủ ấm. Ủ ở 37 0 C, 5% CO 2 . - Thời gian Swim-up thường là từ 30 – 45 phút. - Sau thời gian này, thật nhẹ nhàng thu lớp môi trường ở trên. Chú ý : ta nên sử dụng một pipet pasteur mới và chỉ chạm đầu pipet vào thành ống tuýp rồi thu phần môi trường phía trên vạch đánh dấu một chút để tránh việc thu nhầm những tinh trùng chết ở phía dưới. Xác đònh mật dộ tinh trùng : Đếm mật độ tinh trùng bằng phòng đếm Neubauer. Ta cần xác đònh : Mật độ tinh trùng. Phần trăm tinh trùng di động. Ghi nhận về chất lượng tinh trùng. 3.4.4 Tạo giọt cấy và hoạt hoá tinh trùng : Tạo các giọt cấy tuỳ vào thể tích tinh trùng thu được. Sau đó, phủ một nửa dầu khoáng vào đóa cấy và ủ 37 0 C, 5% CO 2 . 3.5 Thu nhận trứng : 3.5.1 Giải phẫu chuột cái và thu ống dẫn trứng: Giết chuột đột ngột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ. [...]... thí nghiệm đầu khảo sát ảnh hưởng của việc để trứng chờ lâu (khoảng 1,5 giờ) đến hiệu quả thụ tinh và sự phát triển của phôi 7 thí nghiệm sau khảo sát ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng đến hiệu quả thụ tinh và sự phát triển của phôi Tuy nhiên, trong quá trình ghi nhận số liệu, chúng tôi nhận thấy 5 thí nghiệm ở trên cũng có chất lượng tinh trùng rất kém nên kết quả khảo sát chất lượng tinh trùng chúng... quy đònh một thời gian cấy thích hợp là rất quan trọng, thông thường ở chuột thời gian cấy thường là 4 - 6 giờ Thời gian này sẽ là tối ưu cho việc giảm thiểu các độc chất trong tinh trùng làm ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi Ngoài ra, kết quả thụ tinh cũng như tỷ lệ phát triển của phôi ở các lô a và b là không cao Điều này có thể giải thích như sau : Tỷ lệ thụ tinh không cao( tỷ lệ thụ tinh bình thường... cho quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi sau này Còn khi trứng quá già, màng trong suốt của trứng sẽ trở nên cứng chắc (hardened) do đó tinh trùng sẽ không thể thực hiện quá trình thụ tinh và trứng thường đi vào chu trình chết của tế bào (cell apoptosis) Trong 12 thí nghiệm đầu tiên, thí nghiệm thứ 1 đến thí nghiệm thứ 5 cho thấy tỷ lệ thụ tinh rất thấp (6%) và các phôi ở các giai đoạn sau phát. .. này, ta nhận thấy thời gian cấy đã không ảnh hưởng gì đến kết quả thụ tinh tuy nhiên nó lại có ảnh hưởng đến sự phát triển của các phôi sau này Nhìn vào đồ thò biểu diễn (trang 52) cho thấy tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn Morulae của lô a cao hơn nhiều so với lô b (15% so với 1%) và tỷ lệ phôi phát triển lên giai đoạn Blastocyst của lô a là 10% còn lô b thì không có một phôi nào phát triển tới giai... là 19% (83/433) Tỷ lệ phôi phát triển ở giai đoạn 4-8 tế bào 0% đến 82% trong đó có 3 trường hợp phôi không phát triển tiếp tục Tỷ lệ phôi phát triển tiếp tục ở giai đoạn này thấp 27% (22/83) Không có phôi nào phát triển tiếp tục đến giai đoạn Morula và Blastocyst Ảnh hưởng của việc để trứng chờ trong thời gian lâu đến hiệu quả thụ tinh và sự phát triển của phôi : Trong tiến trình 5 thí nghiệm đầu... tới giai đoạn Blastocyst Sự tác động của thời gian cấy lên sự phát triển của phôi in vitro là rất rõ rệt, có thể là khi ta kéo dài thời gian cấy quá lâu thì môi trường cấy là môi trường có mật độ tinh trùng dày đặc sẽ không là môi trường tối ưu cho phôi phát triển Do đó, phôi sẽ bò những tác động xấu từ môi trường này làm ảnh hưởng đến chất lượng phôi và làm giảm sức sống của phôi ở các giai đoạn tiếp... 1,5 triệu (với % tinh trùng di động cũng là 50%.) Thời gian xử lý đều là 45 phút, thời gian tối đa khi xử lý tinh trùng bằng phương pháp swim-up Hơn nữa, sau khi xử lý chúng tôi thấy tỷ lệ tinh trùng kém di động chiếm phần lớn có trong mẫu Kết quả thụ tinh và sự phát triển của phôi : Tỷ lệ thụ tinh không cao di động từ 0% đến 52%, có 3 trường hợp không cho kết quả thụ tinh Tỷ lệ thụ tinh trung bình là... tôi chia thành 2 lô để khảo sát mục tiêu đã đề ra Sau đây là kết quả chi tiết : 1 Các thí nghiệm nhận đònh ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng và chất lượng trứng đến quá trình thụ tinh : Có thể nói, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh Những yếu tố có thể kể đến như : chất lượng trứng, chất lượng tinh trùng, thời gian cấy, nhiệt độ,… Qua 12 thí nghiệm đầu, như đã trình bày ở phần vật... lệ thụ tinh : 6% (8/126) trong đó có 3 trường hợp không cho kết quả thụ tinh 17 Mai Công Minh Tâm Ngoài ra, có thể thấy 5 trường hợp trên còn bò tác động bởi chất lượng tinh trùng Và có thể thấy, tỷ lệ thụ tinh của 5 trường hợp này thấp hơn tỷ lệ thụ tinh trong trường hợp chất lượng tinh trùng kém (6% so với 19%) Tỷ lệ phát triển lên đên phôi 4-8 tế bào là 25% (2/8) và không có phôi nào phát triển đến. .. đến phôi Morulae 2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian cấy đến quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi trong điều kiện in vitro: Thí nghiệm này được thực hiện ở 8 thí nghiệm cuối trong tổng số 20 thí nghiệm chúng tôi thực hiện Cụ thể các thí nghiệm này được bố trí như sau : Lô đối chứng (lô a) : lô này được quy đònh thời gian cấy là 4 giờ Lô thử nghiệm (lô b) : lô này được quy đònh thời gian . KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CẤY ĐẾN SỰ THỤ TINH VÀ QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI IN VITRO TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Mai Công Minh Tâm. (2/8) và không có phôi nào phát triển đến phôi Morulae. 2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian cấy đến quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi
