ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn LÊ MAI NHẤT iii Lêi cảm ơn Đề tài đợc thực Viện Bảo vƯ thùc vËt vµ vïng trång cam Canh hun Tõ Liêm Hà Nội Để hoàn thành luận văn xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS Ngô Vĩnh Viễn thầy hớng dẫn khoa khọc, đà gợi ý đề tài hớng dẫn khoa học, cho lời khuyên, động viên chân tình kinh nghiệm quí báu nghiên cứu Phòng đào tạo Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam Ban đào tạo sau đại học Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam thầy cô giáo đà giảng dậy năm qua LÃnh đạo Viện Bảo vệ thực vật phòng ban đà tạo điều kiện sở vật chất tinh thần để tiếp sức cho hoàn thành tốt luận văn Các đồng nghiệp Bộ môn Bệnh Viện Bảo vệ thực vật đặc biệt bạn nhóm nghiên cứu bệnh hại ăn có múi dành cho thời gian quí báu sẵn sàng giúp đỡ để hoàn thành luận văn Giáo s Hong Ji Su - Đài Loan đà giúp kít chẩn đoán bệnh greening, tristeza nh phơng pháp chẩn đoán nhanh thực địa Xin ghi nhận nơi tình cảm yêu thơng vợ, cha mẹ anh chị đà hết lòng động viên tinh thần suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Lê Mai NhÊt iv MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4 Đối tượng phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu đề tài 1.2 Một số kết nghiên cứu nước liên quan đến đề tài 1.2.1Tình hình nghiên cứu nước ngồi 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 22 CHƯƠNG ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG 30 PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thời gian 30 2.2 Vật liệu nghiên cứu 30 2.3 Nội dung nghiên cứu vấn đề cần giải 32 v 2.4 Phương pháp nghiên cứu 32 2.4.1 Phương pháp điều tra thành phần bệnh hại vườn cam 32 Canh Từ Liêm – Hà Nội 2.4.2 Phương pháp vi ghép đỉnh trưởng làm bệnh vàng 33 greening, tristeza cam Canh 2.4.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng greening, tristeza 35 cam Canh kỹ thuật PCR, Iodine, ELISA khẳng định vi ghép bệnh 2.4.4 Phương pháp sản xuất giống cam Canh bệnh theo hệ 39 thống nhà lưới cấp 2.4.5 Phương pháp tính tốn xử lý số liệu thí nghiệm 41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Thành phần bệnh hại vườn cam Canh - Từ Liêm – Hà Nội 42 3.2 Ứng dụng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng làm bệnh 54 vàng greening, tristeza cam Canh 3.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR, Iodine, ELISA để chẩn đoán bệnh 68 vàng greening, tristeza cam Canh khẳng định giống bệnh 3.4 Hoàn thiện kỹ thuật sản xuất giống cam Canh bệnh 70 hệ thống nhà lưới cấp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 Kết luận 81 Kiến nghị 82 Tài liệu tham khảo 83 Phụ lục 92 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt CIRAD-FLHOR Nội dung Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le dévelopement –Département des productions fruitières et horticoles (Pháp) CTIFL Centre technique interprofessionel des fruits et légumes FFTC Food and Fertilizer Technology Center ( Đài Loan ) ACIAR Australian Centre for International Agricultural Research FAO Food and Agriculture Organization IPGRI International Plant Genetics Resource Institute INRA Institut national de Recherche agronomique ( Pháp) SPV Service de la Protection des végétaux BSA Bovine serum albumin dNTP Deoxy Nucleotide triphosphate EDTA Sodium ethylene diaminetetraacetate PBS-T Phosphate-buyer saline-Tween SDS Sodium dodecyl sulphate DIECA Diethyldithio carbamate DMSO Dimethyl sulphate IgG Immunoglobulin G NBT NitroBlue Tetrazolium P-NPP P-nitrophenyl phosphate SDS Sodium dodecyl sulphate TE Tris + EDTA + Distilled water TBE Tris + Boric acid + EDTA TNE Tris + NaCl + Distilled water BCIP Bromo-chloro-indolyl phosphate vii DMS Dimethyl sulphate TBS Tris buffered saline PVP Polyvinyl pyrrolidone MM Master mix bp base pairs cặp base DNA Deoxyribose nucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay STG Shoot Tip Grafting MS Murashige Skoog EG Electrofusion polyethylen glycol RT-PCR Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction EM Electron microscope RCC Rầy chổng cánh CTV Cộng tác viên CNSH Công nghệ sinh học viii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng Trang 1.1 Diện tích lồi trồng chủ yếu nước ta 23 3.1 Thành phần bệnh hại vườn cam Canh (Hà Nội,2007) 44 3.2 Kết điều tra trạng sử dụng giống cam Canh Hà 45 Nội, 2007 3.3 Kết giám định mẫu cam Canh đồng ruộng 48 phương pháp PCR ELISA (Viện BVTV, 2007) 3.4 Kết chẩn đoán nhanh bệnh vàng greening Iodine 49 vườn cam Canh (Hà Nội, 2007) 3.5 Kết giám định bệnh greening, tristeza số vườn cam 50 Canh tuổi (Viện BVTV, 2007) 3.6 Kết điều tra tuổi thọ cam Canh số xã 52 huyện Từ Liêm, 2007 3.7 Ảnh hưởng loại môi trường đến chất lượng cam ba 57 sử dụng làm gốc ghép lần (Viện BVTV, 2007)) 3.8 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến chất lượng gốc 58 ghép lần 1(Viện BVTV, 2007) 3.9 Ảnh hưởng tuổi gốc ghép lần đến tỷ lệ sống sót sau 59 vi ghép (Viện BVTV, 2007) 3.10 Ảnh hưởng thời gian xử lý rễ sau vi ghép thuốc 60 Bavistine 50FL đến tỷ lệ sống sau vi ghép lần 1(Viện BVTV, 2007) 3.11 Ảnh hưởng xử lý chồi đỉnh ghép đến tỷ lệ sống sau vi ghép 61 lần 1(Viện BVTV, 2007) 3.12 Hiệu tăng cường ánh sáng đến khả sống sót sau vi ghép giống cam Canh (Viện BVTV, 2007) 62 ix 3.13 Ảnh hưởng thời gian nuôi vi ghép lần ống 63 nghiệm đến kết ghép lần thành công (Viện BVTV, 2007) 3.14 Kết giám định cam Canh sau vi ghép đỉnh sinh trưởng 68 thành công (Viện BVTV, 2007) 3.15 Kết xử lý giá thể trước gieo hạt làm gốc ghép (Viện 73 BVTV, 2006) 3.16 Ảnh hưởng loại gốc ghép đến tỷ lệ sống sau 74 ghép(Viện BVTV, 2007) 3.17 Ảnh hưởng mắt ghép đến tỷ lệ sống sau ghép (Viện BVTV, 76 2007) 3.18 Ảnh hưởng thời vụ ghép đến tỷ lệ sống sau ghép 76 (Nhà lưới Viện BVTV, 2007) 3.19 Kết cải tiến giá thể sản xuất giống bệnh 77 (Viện BVTV, 2007) 3.20 So sánh hiệu phương pháp ghép mắt nhỏ có gỗ 79 (Viện BVTV, 2007) 3.21 Kết cung ứng giống cam Canh bệnh cho địa phương (Viện BVTV, 2007) 80 x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình 2.1 Qui trình phục tráng làm bênh greening bệnh Trang 34 virus khác hại cam quýt công nghệ vi ghép đỉnh sinh trưởng 2.2 Hệ thống nhà lưới ba cấp sản xuất cung cấp giống cam 40 Canh bệnh 3.1 Sản xuất giống trời 46 3.2 Sản xuất giống ruộng rau trồng đậu Hà Lan 46 3.3 Sản xuất giống ruộng thâm canh rau 47 3.4 Đảo tạo 47 3.5 Cây giống sau năm 47 3.6 Cây bị bệnh greening, tristeza 47 3.7 Kết PCR bệnh greening 48 3.8 Kết ELISA bệnh Tristeza 48 3.9 Mẫu kít chẩn đốn bệnh greening Iodine 50 3.10 Kết giám định Iodine 50 3.11 Các tuổi khác đơn vị diện tích 53 3.12 Dụng cụ cần thiết tiến hành vi ghép đỉnh sinh trưởng 55 3.13 Các loại môi trường sử dụng vi ghép đỉnh sinh trưởng 55 3.14 Cây cam ba làm gốc ghép lần 55 3.15 Cắt bỏ rễ, thân trước vi ghép đỉnh sinh trưởng 55 3.16 Kỹ thuật cắt hình chữ V 55 3.17 Vị trí đặt điểm sinh trưởng 55 3.18 Các loại môi trường khác gieo hạt cam 58 3.19 Cây vi ghép xử lý rễ thuốc Bavistine 50FL 64 3.20 Cây sau vi ghép lần nuôi ống nghiệm: 1, 2, tháng 64 xi 3.21 Dụng cụ chuẩn bị vi ghép lần 65 3.22 Cây vi ghép nuôi ống nghiệm tháng tuổi 65 3.23 Cây vi ghép nuôi ống nghiệm 45 ngày tuổi 65 3.24 Cây vi ghép lần 65 3.25 Cây vi ghép lần nảy chồi 66 3.26 Cây vi ghép lần trùm túi nilon trắng 66 3.27 Cây vi ghép lần tháo bỏ túi nilon 66 3.28 Cây vi ghép lần thành công 67 3.29 Hạt khoẻ hạt bị bệnh vàng greening 74 3.30 Chọn lựa mạ trước 74 88 46 Di Martino, E., A Sarden, and G Terranova (1972), Effects of critacortis on growth and productivity of Tarocco, In Proc th Conf IOCV Univ of Florida Press Gainesville, tr.176-177 47 Dodds, J.A and M Bar-Joseph (1983), Double stranded RNA from plants infected with closteroviruses Phythphathology tr 419-423 48 FAO/ IBPGR (1988), Technical Guidelines for the Safe Movement of citrus gerplasm E.A Frison and M.M teher (9ed) collabration with IOCV 49 Garnier, M and L.J Kloz (1948), Exocortis of trifoliata orange California Citrograph 50 Garnier, M and J.M.Bové (1984), The greening organism is a gram negative bacterium, In Proc 9th Conf IOCV.IOCV, Riverside, tr.115-124 51 Garnier, M., Daniel, N.and Bové, J.M (1984), An etiology of citrus greening diseases Ananals of Microbiology, tr 169-179 52 Gmitter F.G., Grosser J.W., Moore G.A (1992), Citrus, In Biotechnology of perennial of perennial fruit crops, Hammmershlag et Litz Eds CAB International, tr 335-369 53 Gmitter, F.Z Deng, GA Moore (1997), Utilization of DNA marker in citrus breeding program, In Abs 5th Congress of citrus Nurserymen, 3/99, Montpellier 54 Gmitter, F.G Xiao, S.Y., Huang,S., Hu, X.L.(1996), Garnsey and Deng Z., A localized linkage map of the citrus tristeza virus resistant gene region, Theor Appl Genet., tr 686-695 55 Hong L.T.T (1998), Some aspects of fruit production and genetic conservation in Vietnam, In: Proceedings Second MESFIN Meeting on Plat Genetic Resources and First MESFIN meeting in Fruit Production V Galan Sauco (Ed.) Madeira, Portugal, tr 287-299 89 56 Hugghees, W.A and C.A Lister (1946), Lime disease in the Gold Coast Nature, tr 164- 180 57 Kechung and Xu Chiang Fan (1990), Successful integradted management of Huanglongbin disease in several farms of Guangdong and Fujian by combining early eradication with targeted insecticide spraying, In Proc Of the 4th Intern Asia Pacific Conf On citrus rehabilitation FAO-UNDP, Chiangmai, Thailand, tr 145-148 58 Kitajima, E.W., Silva, D.M., Oliveria, A.R., Muller, G W and Costa A.S (1964), Threadplike particles associated with triteza disease of citrus, Nature, tr 1011-1012 59 La Rosa, R., M.Tessitori, G Albanese, A Catara, and M Davino (1993), Diagnosis of citrus exocortis and hop stunt-homologus citrus viroids by oligonucleotide probes, In Proc 12th Conf IOCV IOCV, Riverside, tr 435437 60 Lee A.T.C (1993), The South African citrus improvement program (CIP) 62-72, In Proceedings of the IV World Congress of the International Society of Citrus Nurserymen South Africa, tr 67-72 61 Lin, Kung, and Hsiang (1956), Etiological studies of yellow shoot of citrus Acta Phytopathological Sinica, tr 13-42 62 Murashige, T., W.P Bitters, E.M Naver, C.N Roistacher, ADN P.B.Holiday (1972), A technique of shoot tip grafting and its utilization towards recovering virus-free clones, Hort Science, tr 118-119 63 Musharam, A., and A.M Whittle (1991) Stem pitting strain of citrus tristeza virus in Indonesia, In Proc 4th Conf, IOCV Univ of Florida Press, Gainesville, tr 71-83 90 64 Navarro, L., C.N Roistacher and T Murashige (1975), Improvement of shoot tip grafting in vitro for virus free citrus, J Amer Soc Hort Sei, tr 471-479 65 Ollitraut.P (1990), Isozymes and DNA Restrition Fragment Length Polimorphisms (RFLP’s) as genetic marker in citrus selection, Proc Of the Asia-Pacific International Conference on Citriculture, tr 57-68 66 Philippe, C.V, Hong, L.T.T, Anh Thu, T.P and Chau, N.M (1997), The program of elite planting material for the citrus industry of the Mekong Delta river in South Vietnam, In Proc Of the 5th ISCN Interm Congress, tr 155161 67 Prasad, M.B.N.V., Rao, N.N.R (1983), Reaction of some citrus rootstock hybrids for tolerance to Phytophthora root, Rot India Phytopatholoy, tr 726728 68 Raccah, B.C., C.N Roistacher and S.Barbagallo (1989), Semipersistent transmisstion of viruses by vectors with special emphasis on citrus tristeza virus, tr 301- 340 69 Reddy, P.P.(1983), Reaction of selected citrus rootstocks to the citrus nematode, Proc Interm Citrus symp., tr 379-381 70 Reddy, P.P., Khan, R.M and Agarwal, P.K.(1987), Selection of citrus rootstocks and hybrids resistant to the citrus nematode Tylenchus semipenetrans, Pak.J.Nematol., tr 69-72 71 Reinking, O.A (1919), Diseases of economic plants in South china, Philippines, Agr, tr.109-135 72 Roistascher, C.N (1993), The psorosis virus complex, A review, In Proc 12th Conf IOCV IOCV, Reverside, tr 139-154 91 73 Su,H.J,;Chu,J.Y (1984), Modified technique of citrus shoot-tip grafting and rapid propagation method to obain citrus budwoods free of citrus viruses and likubin organism In: Proc.Int.Soc Citriculture Vol.2 1984.pp 332-334 74 Su,H.J., Chen, C.N (1991) Implementation of IPM on citrus virus and greening (Likubin) disease FFTC supplement No.1,1991 pp.3-11 75 Su,H.J; Hung,T.H.; and Wu,M.L.(1995), Preparation and application of diagnostic DNA probe on the fasidiuos bacteria causing citrus greening, Proc Symposium Research and Development of cirus in Taiwan, 167-176 76 Su, H.J., Ting – Hseng Hung and Mei Chen Tsai (1993), Detection of the fastidious bacteria causing The Asian citrus greeing by DNA probes, In Proc 12th Conf IOCV, Riverside (Abs), 466 77 Trung H.M.(1991), Surveys on citrus greening and its control by IPM in VietNam In: Proceedings of the 6th International Asia Pacific Worshop on Integrated Citrus Health Management, Kuala Lumpur, Malaysia, 6/1991, 124-130 78 Trung.H.M; Vien N.V; Phu V.D (1998), Management of citrus disease – free seedlings in the North of Vietnam, Paper presented in Regional workshop on disease management of banana and citrus: The use and management of disease-free planting materials Davao, Philippine, 14-16 October, 1998,6 79 Trung, H.M., J Bourdeaut, N.V Phu (1997), Upgrading citrus nurseries in Vietnam by controliong Huanglongbin and other diseases, In Abs 5th Interm Congress of citrus nurserymen, 3/99, Montpellier 80 Tsai, M.C and H.J.Su (1991), Development and characterization of monoclonal antibodies to citrus tristeza vius (CTV) strains in Taiwan, Proceedings of the 11th IOCV Conference tr 46-50 92 PHỤ LỤC PHIẾU ĐIỀU TRA ĐỒNG RUỘNG Cây trồng: Địa điểm: Ngày điều tra: Tuổi cây: Giống: Điều kiện thời tiết: Thời gian sinh trưởng cây: TT n Bệnh Mức độ phổ biến Bộ phận bị hại Ghi Thí nghiệm chiều cao cam BALANCED ANOVA FOR VARIATE 14 NGAY FILE CAM3LA1 14/ 6/** 13:41 PAGE VARIATE V003 14 NGAY LN SOURCE OF VARIATION PROB ER DF SUMS OF MEAN F RATIO SQUARES SQUARES LN ==================================================================== CT 837333 418667 1.14 0.352 * RESIDUAL 12 4.39200 366000 * TOTAL (CORRECTED) 14 5.22933 373524 BALANCED ANOVA FOR VARIATE 21 NGAY FILE CAM3LA1 14/ 6/** 13:41 PAGE VARIATE V004 21 NGAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ==================================================================== CT 724000 362000 1.70 0.223 * RESIDUAL 12 2.55600 213000 -* TOTAL (CORRECTED) 14 3.28000 234286 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CAM3LA1 14/ 6/** 13:41 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 14 NGAY 21 NGAY 5.52000 5.88000 5.56000 6.02000 6.04000 6.40000 SE(N= 5) 0.270555 0.206398 5%LSD 12DF 0.833672 0.635981 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CAM3LA1 14/ 6/** 13:41 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE 14 NGAY 21 NGAY GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 5.7067 15 6.1000 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.61117 0.60498 10.6 0.3521 0.48403 0.46152 7.6 0.2232 | | | | Thí nghiệm gốc ghép cam ba điều kiện sáng tối BALANCED ANOVA FOR VARIATE 14 N FILE GGHEPST 12/ 6/** 15:32 PAGE VARIATE V003 14 N LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN CT 1.02400 1.02400 10.34 0.012 * RESIDUAL 792000 990000E-01 * TOTAL (CORRECTED) 1.81600 201778 BALANCED ANOVA FOR VARIATE 21 N FILE GGHEPST 12/ 6/** 15:32 PAGE VARIATE V004 21 N LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN CT 9.80100 9.80100 60.31 0.000 * RESIDUAL 1.30000 162500 * TOTAL (CORRECTED) 11.1010 1.23344 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE GGHEPST 12/ 6/** 15:32 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 5 14 N 6.20000 5.56000 21 N 8.22000 6.24000 SE(N= 5) 0.140712 0.180278 5%LSD 8DF 0.458849 0.587867 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE GGHEPST 12/ 6/** 15:32 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE 14 N 21 N GRAND MEAN (N= 10) NO OBS 10 5.8800 10 7.2300 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.44920 0.31464 5.4 0.0121 1.1106 0.40311 5.6 0.0001 | | | | Một số hình ảnh hoạt động đề tài 2006 2007 (Ngun nh: Lê Mai Nhất) Cây cam Canh làm bệnh vi ghép đỉnh sinh trưởng Tạo cành cấp cho đầu dòng bệnh S0 Cây cam Canh đầu dòng bệnh (S0) lưu giữ nhà lưới Cây cam Canh đầu dòng bệnh (Ảnh chụp tháng năm 2008) Cam Canh trồng làm cảnh nở hoa rộ Cam Canh làm cảnh ngày tết cổ truyền TS Nguyễn Văn Bộ - Giám đốc Viện KHNN Việt Nam Lãnh đạo Viện BVTV tiếp chuyên gia Đài Loan,Nhật Bản Vườn cam đến ngày thu hoạch 10 ... sinh trưởng 2.2 Hệ thống nhà lưới ba cấp sản xuất cung cấp giống cam 40 Canh bệnh 3. 1 Sản xuất giống trời 46 3. 2 Sản xuất giống ruộng rau trồng đậu Hà Lan 46 3. 3 Sản xuất giống ruộng thâm canh rau... cho vi? ??c sản xuất giống bệnh Một cam Canh cung cấp 30 0 mắt ghép/ năm Nhà lưới lưu giữ cung cấp mắt ghép phải giám định bệnh vàng greening tristeza định kỳ Nhà lưới sản xuất giống bệnh nhà lưới. .. làm bệnh greening cam Canh Hà Nội hệ thống nhà lưới cấp sản xuất giống? ?? Mục tiêu yêu cầu đề tài 2.1 Mục tiêu đề tài Ứng dụng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng để phục tráng, trì làm bệnh vàng greening,