BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ THANH THÚY NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ KIM LOẠI VÀ VITAMIN B1, B6 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP THỤ NGUYÊN TỬ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG NẤM LINH CHI NUÔI TRỒNG Ở THỪA THIÊN HUẾ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC VINH-2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ THANH THÚY NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ KIM LOẠI VÀ VITAMIN B1, B6 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP THỤ NGUYÊN TỬ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG NẤM LINH CHI NUÔI TRỒNG Ở THỪA THIÊN HUẾ CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 60.44.29 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS: Nguyễn Khắc Nghĩa VINH-2013 LỜI CẢM ƠN Luận văn thực Sở Y tế Thừa Thiên Huế - Trung tâm kiểm định thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm; phòng thí nghiệm chuyên đề Hóa phân tích, Khoa Hóa trường Đại học Vinh Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện suốt trình làm luận văn Tôi chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình thầy, cô: - PGS.TS Ngô Anh giúp đỡ định danh mẫu vật - PGS.TS Trần Đình Thắng giúp đỡ việc tìm kiếm tài liệu - PGS.TS Nguyễn Hoa Du TS Đinh Thị Trường Giang đọc góp nhiều ý kiến quý báu cho luận văn Nhân dịp này, xin cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa Sau Đại học, ban chủ nhiệm khoa Hóa thầy cô giáo cán phòng thí nghiệm khoa Hóa học giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình làm luận văn Dù có nhiều cố gắng, song lực hạn chế nên luận văn chắn tránh khỏi thiếu sót Tôi mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô bạn để luận văn hoàn chỉnh Vinh, tháng 10 năm 2013 Phạm Thị Thanh Thúy DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Abs AAS F – AAS GF – AAS HCL HPLC LOD LOQ Ppm Ppb Tiếng Anh Absorbance Atomic Absorption Spectrometry Tiếng Việt Độ hấp thụ Phép đo quang phổ hấp thụ Flame -Atomic Absorption nguyên tử Phép đo quang phổ hấp thụ Spectrometry Graphit-Atomic Absorption nguyên tử lửa Phép đo quang phổ hấp thụ Spectrometry Hollow Cathode Lamp High performance liquid nguyên tử không lửa Đèn catốt rỗng chromatography Limit of detection Limit of quantity Part per million Part per billion Sắc ký lỏng hiệu cao Giới hạn phát Giới hạn định lượng Một phần triệu Một phần tỉ MỤC LỤC Contents Contents MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1.GIỚI THIỆU VỀ NẤM LINH CHI .3 1.1.1.Giới thiệu nấm Linh chi 1.1.2.Phân loại: Nấm Linh chi có vị trí phân loại rộng rãi [19] 1.1.3.Chu trình sống nấm Linh chi [19] 1.1.6.Tác dụng trị liệu nấm Linh chi .6 1.2.GIỚI THIỆU CÁC KIM LOẠI: Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn VÀ VAI TRÒ SINH HỌC CỦA CÁC KIM LOẠI .7 1.2.1.Giới thiệu kim loại Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn [16] 1.2.1.1.Nguyên tố đồng (Cu) [16] 1.2.1.2.Nguyên tố chì (Pb) [16] 1.2.1.3.Nguyên tố coban (Co) [16] 1.2.1.6.Nguyên tố kẽm (Zn) [17] .10 1.2.2.Vai trò sinh học Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn 10 1.2.2.3.Vai trò sinh học Co [29] 11 1.2.2.5.Vai trò sinh học Ca [27] 12 1.2.2.6.Vai trò sinh học Zn [4] 12 1.3.PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU XÁC ĐỊNH KIM LOẠI [12] 13 1.3.1.Phương pháp xử lý mẫu ướt (bằng axit đặc oxi hóa mạnh) 13 1.3.2 Phương pháp xử lý mẫu khô (vô hóa khô) 14 1.3.3.Phương pháp xử lý mẫu khô ướt kết hợp 14 1.4.CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KIM LOẠI 15 1.4.2.1.Phương pháp điện hóa 21 1.4.2.2.Phương pháp quang phổ khác 22 1.5.GIỚI THIỆU VITAMIN B1, B6 [31] 24 1.5.1.1.Tính chất vật lý .25 1.5.1.2.Tính chất hóa học 25 1.5.2.Vitamin B6 25 1.5.2.1.Tính chất vật lý .26 1.5.2.2.Tính chất hóa học vitamin B6 27 1.5.3.Vai trò nhu cầu vitamin B1, B6 thể [26] 27 CHƯƠNG .37 KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 37 2.1 LẤY MẪU 37 2.2.PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU XÁC ĐỊNH KIM LOẠI VÀ VITAMIN 38 2.2.1.Trang thiết bị, hóa chất, xử lý mẫu nấm xác định kim loại 38 2.2.1.1.Trang thiết bị hóa chất .38 2.2.1.2.Xử lý mẫu nấm .39 2.2.2.Trang thiết bị, hóa chất, xử lý mẫu nấm xác định vitamin B1, B6 39 2.2.2.1.Trang thiết bị hóa chất .39 2.2.2.2.Điều kiện tiến hành chuẩn bị hóa chất chuẩn 40 2.2.2.4.Phương pháp định lượng 41 CHƯƠNG .42 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 42 3.1.LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN ĐO PHỔ 42 3.1.1.Vạch đo phổ 42 3.1.2.Khe đo .43 3.1.3.Cường độ đèn catot rỗng (HCL) .43 B Kết thực nghiệm thảo luận xác định vitamin B1, B6 phương pháp HPLC 71 KẾT LUẬN 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 MỞ ĐẦU Để khẳng định tác dụng định chống định đơn thuốc trị bệnh, thực phẩm chức bồi bổ sức khỏe người bệnh có nấm Linh chi thành phần chính, cần phải xác định cấu tạo thành phần hóa học nấm Trong sách, tạp chí, từ điển y học lưu hành mạng internet thông tin đề cập đến cấu tạo thành phần nấm Linh chi hạn chế Qua khảo sát sơ bộ, biết có hàng chục kim loại thành phần hóa học nhiều loại vitamin có nấm Linh chi Để góp thêm thông tin nấm Linh chi, luận văn nghiên cứu xác định thành phần số kim loại số vitamin nhóm B nấm Linh chi nuôi trồng Thừa Thiên Huế Kết phân phân tích so sánh với số liệu phân tích nấm Linh chi Hàn Quốc bán thị trường thành phố Huế Để xác định hàm lượng vết số kim loại vitamin thực vật phương pháp hấp thụ nguyên tử sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp tỏ có nhiều ưu việt Xuất phát từ tình hình thực tế góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng nấm dùng để làm dược liệu, chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định hàm lượng số kim loại vitamin B1, B6 phương pháp hấp thụ nguyên tử (AAS) sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) nấm Linh chi nuôi trồng Thừa thiên Huế” làm luận văn tốt nghiệp Thực đề tài giải nhiệm vụ sau:  Nghiên cứu xác định kim loại phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) - Khảo sát điều kiện để đo phổ AAS Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến phép đo xác định kim loại - Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn cho phép đo phổ - Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đánh giá sai số độ lặp phép đo - Xác định hàm lượng vết kim loại Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn nấm Linh chi phương pháp AAS  Nghiên cứu xác định vitamin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) - Xác định điều kiện tối ưu để đo sắc đồ HPLC B1, B6 - Xác định hàm lượng vitamin B1, B6 theo phương pháp ngoại chuẩn 67 Hình 3.14: Hàm lượng Pb mẫu nấm Linh chi Bảng 3.23: Kết xử lý số liệu hàm lượng Co Mẫu C1 (ppm) C2 (ppm) C3 (ppm) C tb (ppm) S %RSD HT 0,2783 0,2687 0,2592 0,2687 0,0096 3,5728 0,0238 PT 0,2775 0,2782 0,2798 0,2785 0,0118 4,2370 0,0293 PL 0,2738 0,2740 0,2745 0,2741 0,0036 1,3133 0,0089 HQ 0,3646 0,3262 0,3502 0,3454 0,0195 5,6456 0,0484 Nồng độ tính theo đường chuẩn (ppm) 0,2687 0,0238 0,2785 0,0293 0,2741 0,0089 0,3454 0,0484 68 Hình 15: Hàm lượng Co mẫu nấm Linh chi Bảng 3.24: Kết xử lý số liệu hàm lượng Cd Mẫu C1 (ppm) C2 (ppm) C3 (ppm) C tb (ppm) S %RSD HT 0,287 0,286 0,290 0,288 0,0021 0,7292 0,0052 PT 0,296 0,291 0,307 0,298 0,0082 2,7468 0,0204 PL 0,299 0,313 0,321 0,311 0,0111 3,5691 0,0275 HQ 0,558 0,582 0,564 0,568 0,0125 2,2007 0,0310 0,288 0,0052 0,298 0,0204 0,311 0,0275 0,568 0,0310 Nồng độ tính theo đường chuẩn (ppm) 69 Hình 3.16: Hàm lượng Cd mẫu nấm Linh chi Bảng 3.25: Kết xử lý số liệu hàm lượng Ca Mẫu C1 C2 C3 C tb S %RSD HT 8,2584 8,2650 8,2797 8,2677 0,0109 0,1318 0,0271 PT 9,0111 9,0129 9,0150 9,0130 0,0020 0,0222 0,0050 PL 8,9614 8,9621 8,9625 8,9620 0,0006 0,0067 0,0015 HQ 13,4288 13,4294 13,4303 13,4295 0,0008 0,0060 0,0020 8,2677 0,0271 9,0130 0,0050 8,9620 0,0015 13,4295 0,0020 Nồng độ tính theo đường chuẩn (ppm) 70 Hình 3.17: Hàm lượng Ca mẫu nấm Linh chi Bảng 3.26: Kết xử lý số liệu hàm lượng Zn Mẫu C1 (ppm) C2 (ppm) C3 (ppm) C tb (ppm) S %RSD HT 0,8449 0,8464 0,8452 0,8455 0,0008 0,0946 0,0020 PT 0,7647 0,7652 0,7651 0,7650 0,0003 0,0392 0,0008 PL 0,8208 0,8213 0,8209 0,8210 0,0003 0,0365 0,0008 HQ 0,4328 0,4324 0,4320 0,4324 0,0004 0,0093 0,0009 0,8455 0,002 0,7650 0,0008 0,821 0,0008 0,4324 0,0009 Nồng độ tính theo đường chuẩn (ppm) 71 Hình 3.18: Hàm lượng Zn mẫu nấm Linh chi Nhận xét: Qua trình kiểm tra lại phép đo, ta thấy phương pháp có độ lặp lại tốt, sai số bé, nên phương pháp đáng tin cậy để xác định kim loại với hàm lượng vết đối tượng phân tích B Kết thực nghiệm thảo luận xác định vitamin B1, B6 phương pháp HPLC 3.10 CÁC ĐIỀU KIỆN ĐO HPLC [19] 3.10.1 Lựa chọn cột tách [12,19] Cột tách (pha tĩnh) yếu tố quan trọng phân tích sắc ký nói chung sắc ký lỏng hiệu cao nói riêng Tùy thuộc vào chất hỗn hợp phân tích mà lựa chọn cột tách với pha tĩnh phù hợp Theo [21], để phân tích hỗn hợp vitamin sau chiết axit axetic 1% Trong điều kiện tiến hành thí nghiệm, chọn cột Lichrosorb RP18C với thông số sau: - Chiều dài cột: 250 mm - Đường kính trong: 4mm - Bề dày lớp phim: 5µm 3.10.2 Lựa chọn thể tích tiêm mẫu Trong sắc ký lỏng, thể tích bơm mẫu ảnh hưởng đến nhiều yếu tố cân đối pic sắc ký, sai số, độ nhạy phép phân tích, tuổi thọ cột… 72 Nếu thể tích bơm mẫu nhỏ, gây sai số lớn bơm làm giảm độ nhạy Còn thể tích bơm mẫu lớn gây doãng pic, giảm tuổi thọ cột, tắt cột Ở chọn thể tích bơm mẫu 10µl để có độ nhạy cao sai số phân tích thấp 3.10.3 Tổng kết điều kiện hệ thống HPLC xác định vitamin Từ kết nghiên cứu khảo sát, điều kiện phù hợp để đo vitamin bảng 3.27 Bảng 3.27: Tổng kết điều kiện hệ thống HPLC để đo vitamin B1, B6 STT Các thông số Cột tách Nhiệt độ cột Tốc độ dòng pha động Thể tích bơm mẫu Detectơ Bước sóng Thành phần pha động Các điều kiện chọn Lichrosorb RPC18 (250×4mm, 5µm) Nhiệt độ phòng 1,5ml/phút 10µl Diode Array λ=270 nm A: KCl + axit axetic băng + Natri 1heptansunfomat + nước cất B: axit axetic 1% 3.11 KHẢO SÁT THỜI GIAN LƯU VÀ DIỆN TÍCH PIC CỦA CHẤT CHUẨN CỦA VITAMIN B1, B6 Cân 0,0282 g chất chuẩn B1 nồng độ 0,966% 0,0327 g chất chuẩn B6 nồng độ 0,9898% chế hóa axit axetic 1% Tiến hành đo xác định thời gian lưu diện tích pic vitamin điều kiện đo mẫu đề cập mục 73 3.10.3 Mỗi mẫu đo lần lấy giá trị trung bình Kết thu trình bày bảng 3.28 hình 3.19 Bảng 28: Thời gian lưu diện tích pic chuẩn vitamin B1, B6 Vitamin Số lần đo TB S %RSD B1 15,509 15,371 15,253 15,147 15,093 15,061 15,239 0,1743 1,1438 B6 1558231 1560105 1560602 1568870 1565589 1564521 1562896 4009,885 0,2566 5,899 5,867 5,845 5,813 5,803 5,792 5,8365 0,0414 0,7093 871501 872453 872333 873498 872627 872652 872510,7 642,2856 0,0736 Hình 3.19: Sắc ký đồ phân tích đồng thời chuẩn B1, B6 Nhận xét: Thời gian lưu đo vitamin B1 B6 nằm khoảng lý thuyết 3.12 THỰC NGHIỆM ĐO MẪU VÀ TÍNH TOÁN KẾT QUẢ 3.12.1 Kết đo thời gian lưu diện tích pic B1, B6 mẫu nấm Nấm sau xay nhỏ, cân 10 gam loại cho vào bình nón, với 100 ml dung dịch axit axetic 1% Đem xử lý lò siêu âm khoảng Chiết qua giấy lọc lấy dung dịch Sau loại bỏ bọt khí máy hút 74 chân không lấy dung dịch thu đem đo mẫu Kết thu có thời gian lưu diện tích pic vitamin B1 mẫu nấm vitamin B6 mẫu Kết trình bày bảng 3.29 đến 3.32 hình 3.20 đến 3.23 Bảng 3.29: Thời gian lưu diện tích pic B1trong nấm Hương Thủy Số lần đo Thông số tHT 15,048 15,126 SHT 6379 6355 TB 15,171 15,115 6418 6384 %RSD 0,4117 0,4981 Hình 3.20: Sắc ký đồ phân tích B1 mẫu HT Bảng 3.30: Thời gian lưu diện tích pic B1 nấm Phú Thứ Số lần đo Thông số tPT SPT TB %RSD 15,198 6379 15,263 6355 15,352 6418 15,271 6372 0,0392 0,3063 Hình 3.21: Sắc ký đồ phân tích B1 mẫu PT 75 Bảng 3.31: Thời gian lưu diện tích pic B1 nấm Phú Lương Số lần đo Thông số tPL 15,098 15,116 SPL 6368 6390 TB %RSD 15,089 15,101 0,0914 6382 6380 0,1745 Hình 3.22: Sắc ký đồ phân tích B1 mẫu PL Bảng 3.32: Thời gian lưu diện tích pic B1 nấm Hàn Quốc Số lần đo Thông số tHQ 14,740 SHQ 35513 TB %RSD 14,695 35546 14,788 35498 14,741 35519 0,3155 0,0691 Hình 3.23: Sắc ký đồ phân tích B1 mẫu HQ Nhận xét:  Vitamin B1: - Thời gian lưu B1 nấm Linh chi nuôi trồng Huế nấm Hàn Quốc nằm khoảng thời gian lưu vitamin B1 chuẩn - Diện tích pic B1 nấm Linh chi Hàn Quốc lớn gấp nhiều lần so với nấm Linh chi nuôi trồng Huế 76 - Thời gian lưu diện tích pic mẫu nấm Linh chi nuôi trồng Huế xấp xỉ gần  Vitamin B6: Không thể xác định có mặt vitamin B6 mẫu nấm Linh chi nguyên nhân sau: - Vitamin B6 dễ phân hủy tiếp xúc với ánh sáng, nên với mẫu nấm khô hàm lượng vitamin B6 không - Cũng trình xử lý mẫu không tốt làm vitamin B6 - Hàm lượng B6 nấm - Hàm lượng B6 bé nên sử dụng phương pháp ngoại chuẩn không phát giới hạn định lượng giới hạn phát B6 có nấm 3.12.2 Hàm lượng vitamin B1 bốn mẫu nấm Dung dịch sau chuẩn bị phần trước, tiến hành đo để xác định hàm lượng vitamin B1, B6 mẫu nấm, kết xác định hàm lượng vitamin B1, hàm lượng B6 định lượng Kết thu ghi bảng 3.33 hình 3.24 Bảng 3.33: Hàm lượng vitamin B1 mẫu nấm STT Mẫu HT PT PL HQ Khối lượng Hàm lượng mẫu mẫu (g) 10,2200 10,2742 10,2121 10,4435 (mg/kg) 5,4458 5,4069 5,4466 29,6508 15,115 15,271 15,101 14,741 6384 6372 6380 35519 77 Hình 3.24: Đồ thị biểu diễn hàm lượng vitamin B1 mẫu nấm Nhận xét: - Hàm lượng vitamin B1 mẫu nấm lấy vị trí khác có khác nhau, địa bàn hẹp khác không nhiều (q [...]... Nhưng trong điều kiện luận văn này chúng tôi chỉ đi sâu nghiên cứu xác định 6 kim loại trên bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử AAS 1.4.1 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) [13, 17] Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố được gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) 1.4.1.1.Cơ sở lý thuyết của phương pháp 16 Nguyên tắc: Đo sự hấp thụ năng lượng. .. tích khối lượng, phương pháp phân tích thể tích, phương pháp oxi hóa-khử, phương pháp complexon [12, 22] Phương pháp phân tích công cụ: gồm điện hóa, phổ phân tử UV-VIS, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phổ phát xạ nguyên tử, phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (F-AAS) và không ngọn lửa (GF-AAS)…đây là các phương pháp để xác định các kim loại ở hàm lượng vết, có độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác cao, cho... hiệu ứng phụ nào cho cơ thể [19] • Một số chế phẩm từ nấm Linh chi Trà Linh chi hộp Viên Linh chi giấy nguyên chất Hình 1.2: Các chế phẩm từ nấm linh chi Cao Linh chi đỏ 1.2 GIỚI THIỆU CÁC KIM LOẠI: Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn VÀ VAI TRÒ SINH HỌC CỦA CÁC KIM LOẠI 1.2.1 Giới thiệu về kim loại Cu, Pb, Co, Cd, Ca, Zn [16] 1.2.1.1 .Nguyên tố đồng (Cu) [16] Đồng là nguyên tố hóa học có kí hiệu Cu và số hiệu nguyên. .. xác định hàm lượng hỗn hợp vitamin như: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, xác định hỗn hợp vitamin bằng phương pháp phổ đạo hàm bậc [31], phương pháp trắc quang … Tuy nhiên, để chọn phương pháp vừa đảm bảo độ chính xác, tính kinh tế và tính khả thi phù hợp với nhiều phòng thí nghiệm, thì trong luận văn này chúng tôi xin chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao vì nó có nhiều ưu điểm như: phân tích... chính là tín hiệu hấp thụ Trong một giới hạn nồng độ xác định, tín hiệu này phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của nguyên tố cần xác định trong mẫu theo phương trình: Aλ=K.Cb Trong đó: Aλ: cường độ hấp thụ K: hằng số thực nghiệm C: nồng độ nguyên tố trong mẫu b: hằng số bản chất, phụ thuộc vào nồng độ (0 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ THANH THÚY NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ KIM LOẠI VÀ VITAMIN B1, B6 BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP THỤ NGUYÊN TỬ VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG NẤM LINH. .. tài: Nghiên cứu xác định hàm lượng số kim loại vitamin B1, B6 phương pháp hấp thụ nguyên tử (AAS) sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) nấm Linh chi nuôi trồng Thừa thiên Huế làm luận văn tốt nghiệp Thực... chục kim loại thành phần hóa học nhiều loại vitamin có nấm Linh chi Để góp thêm thông tin nấm Linh chi, luận văn nghiên cứu xác định thành phần số kim loại số vitamin nhóm B nấm Linh chi nuôi trồng