BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG TRÊN CÁ NƯỚC NGỌT DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN Giảng viên hướng dẫn : ThS. Vũ Đặng Hạ Quyên TS. Đặng Thúy Bình Sinh viên thực hiện : Đặng Nguyễn Anh Tuấn Mã số sinh viên : 53131923 Khánh Hòa: 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------------o0o--------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI KÝ SINH TRÙNG TRÊN CÁ NƯỚC NGỌT DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN Giảng viên hướng dẫn : ThS. Vũ Đặng Hạ Quyên TS. Đặng Thúy Bình Sinh viên thực hiện : Đặng Nguyễn Anh Tuấn Mã số sinh viên : 53131923 Khánh Hòa, tháng 06/2015 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Mục đích của đề tài nghiên cứu nhằm cung cấp thông tin về tình hình nhiễm ký sinh trùng trên các loài cá nước ngọt, gồm cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc đồng (Channa striata), cá mè vinh (Barbonymus gonionotus), cá rô đồng (Anabas testudineus) Các nội dung của đề tài bao gồm:  Thực hiện khảo sát thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá nước ngọt.  Xác định tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm.  Định danh các loài ký sinh trùng khảo sát được trên cá nước ngọt dựa vào các đặc điểm hình thái và kỹ thuật di truyền.  Xây dựng cây phát sinh loài. i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, trước tiên tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu và Phòng Đào tạo - Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt 4 năm đại học. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Đặng Thúy Bình và Th.S Vũ Đặng Hạ Quyên đã có những tư vấn, chỉ bảo hữu ích trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đồ án tốt nghiệp. Ngoài ra, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, các thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã giảng dạy, chỉ dẫn trong quá trình học tập và thực hiện đồ án tốt nghiệp. Cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, các anh chị 56CHSH, tập thể 53CNSH đã hỗ trợ và động viên tôi khi thực hiện đồ án. Trong khoảng thời gian hạn hẹp, bài báo cáo tốt nghiệp của tôi không thể tránh khỏi thiếu sót, rất mong các thầy cô giáo góp ý giúp luận văn được hoàn thiện hơn. Một lần nữa tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, lời chúc sức khỏe, hạnh phúc và thành công đến tất cả mọi người! Nha Trang, ngày 20 tháng 06 năm 2015 Sinh Viên Đặng Nguyễn Anh Tuấn ii TÓM TẮT Nghiên cứu thực hiện phân loại các loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc đồng (Channa striata), cá mè vinh (Barbonymus gonionotus), cá rô đồng (Anabas testudineus). Kết quả 13 loài ký sinh trùng được ghi nhận, trong đó có 7 loài ký sinh trùng được phân loại đến mức campylopterocirrus, độ loài (Bothriocephalus Thaparocleidus vietnamensis, acheilognathi, Thaparocleidus Thaparocleidus siamensis, Prosorhynchoides ozakii, Cucullanus chabaudi, Trianchoratus gussevi). Tỉ lệ nhiễm cao nhất là loài Pallisentic sp. (81,67%) trên cá lóc đồng, cường độ nhiễm cao nhất là loài Thaparocleidus campylopterocirrus (7 trùng/cá) trên cá mè vinh. Loài Ichthyophthyrius sp. có cùng tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm thấp nhất (2,9%, 1 trùng/cá) trên cá rô đồng. Nghiên cứu tập trung xây dựng cây phát sinh loài cho 3 loài monogenea (Thaparocleidus siamensis, T. campylopterocirrus và Trianchoratus gussevi) và 3 loài digenea (Bucephalus sp., Prosorhynchoides ozakii và Allocreadium sp.) nhằm khảo sát mối quan hệ phát sinh loài với các loài ký sinh trùng khác được ghi nhận trên cá nước ngọt. iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i TÓM TẮT............................................................................................................................ ii MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................... v DANH SÁCH BẢNG BIỂU .............................................................................................. vi DANH SÁCH HÌNH VẼ................................................................................................... vii I - TỔNG QUAN ................................................................................................................. 1 1.1. Đặc điểm sinh học của các loài cá khảo sát trong đề tài ............................................ 2 1.1.1. Cá rô đồng (Anabas testudineus) ........................................................................ 2 1.1.2. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ............................................................. 4 1.1.3. Cá lóc đồng (Channa striata) .............................................................................. 5 1.1.4. Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) ................................................................ 6 1.2. Tình hình nghiên cứu ký sinh trùng trên các loài cá nước ngọt ................................ 7 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................ 7 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................................ 8 1.3. Đặc điểm hệ gen ribosome DNA ............................................................................ 10 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 12 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 12 2.2. Sơ đồ khối nghiên cứu ............................................................................................. 13 2.3. Phương pháp thu mẫu .............................................................................................. 13 2.4. Phuơng pháp giải phẫu và kiểm tra ký sinh trùng .................................................... 14 2.5. Phương pháp bảo quản, cố định và nhuộm tiêu bản ................................................ 16 2.6. Phương pháp phân loại hình thái ký sinh trùng ....................................................... 17 2.7. Phương pháp nghiên cứu di truyền .......................................................................... 19 2.7.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ............................................................... 19 2.7.2. Phản ứng PCR ................................................................................................... 19 2.7.3. Phương pháp điện di.......................................................................................... 22 2.7.4. Phương pháp giải trình tự ................................................................................. 22 2.8. Xử lý số liệu ............................................................................................................. 23 iv III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................................................... 24 3.1. Thành phần ký sinh trùng, tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm ..................................... 24 3.2. Mô tả đặc điểm hình thái các loài ký sinh trùng trong nghiên cứu .......................... 26 3.2.1. Ngành Protozoa ................................................................................................. 26 3.2.1.1. Trichodina sp. .............................................................................................. 26 3.2.1.2. Ichthyophthyrius sp. .................................................................................... 27 3.2.2. Lớp Monogenea ................................................................................................. 29 3.2.2.1. Thaparocleidus siamensis ........................................................................... 29 3.2.2.2. Thaparocleidus campylopterocirrus ........................................................... 30 3.2.2.3. Thaparocleidus vietnamensis ...................................................................... 31 3.2.2.4. Trianchoratus gussevi ................................................................................. 32 3.2.3. Lớp Trematoda .................................................................................................. 33 3.2.3.1. Prosorhynchoides ozakii ............................................................................. 33 3.2.3.2. Allocreadium sp........................................................................................... 34 3.2.3.3. Bucephalus sp. ............................................................................................. 36 3.2.4. Lớp Cestoda - Nematoda – Acanthocephala ..................................................... 37 3.2.4.1. Camallanus sp. ............................................................................................ 37 3.2.4.2. Pallisentic sp. .............................................................................................. 38 3.2.4.3. Bothriocephalus acheilognathi ................................................................... 40 3.2.4.4. Cucullanus chabaudi .................................................................................. 41 3.3. Nghiên cứu di truyền các loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt ............................... 43 3.3.1. Khuếch đại đoạn gen 28S rDNA ........................................................................ 43 3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài của các loài monogenea và digenea .................... 43 3.3.2.1. Cây phát sinh loài đối với các loài monogenea dựa vào trình tự gen 28S rDNA ........................................................................................................................ 43 3.3.2.2. Cây phát sinh loài đối với các loài digenea dựa vào trình tự gen 28S rDNA .................................................................................................................................. 47 KẾT QUẢ VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .................................................................................. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 53 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 61 v DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu viết tắt Ý nghĩa WHO Tổ chức Y Tế Thế Giới Bộ NN&PTNT Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn QĐ Quyết định bp Base pairs µl Microlit µm Micromet mm Milimet cm Centimet g Gram/Gam rDNA Recombinant Deoxyribonucleic Acid ctv Cộng tác viên TLN Tỉ lệ nhiễm CĐN Cường độ nhiễm PCR Polymerase Chain Reaction n Số lượng mẫu kiểm tra Scale bar Thanh chia tỉ lệ GB Gen Bank BT Boostrap vi DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Số lượng và kích thước các loài cá trong nghiên cứu ....................................... 14 Bảng 2.2. Ý nghĩa các ký hiệu trong Hình 2.2. ................................................................. 18 Bảng 2.3. Tỉ lệ các thành phần trong Master mix của phản ứng PCR .............................. 20 Bảng 2.4. Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR của nghiên cứu ..... 21 Bảng 3.1. Thành phần ký sinh trùng trên các loài cá ........................................................ 24 Bảng 3.2. So sánh giữa Trichodina nigra và Trichodina sp. ............................................ 27 Bảng 3.3. So sánh giữa Ichthyophthyrius multifillis và Ichthyophthyrius sp. .................. 28 Bảng 3.4. So sánh giữa nghiên cứu Hà Ký và ctv (2007) với nghiên cứu hiện tại ........... 35 Bảng 3.5. So sánh giữa Camallanus anabantis và Camallanus sp. .................................. 38 Bảng 3.6. So sánh giữa Pallisentis ophiocephali, Pallisentis basiri và Pallisentis sp..... 39 Bảng 3.7. So sánh giữa nghiên cứu Choudhury và ctv (2013) với nghiên cứu hiện tại .... 41 Bảng 3.8. Thông tin các trình tự monogenea sử dụng trong nghiên cứu .......................... 44 Bảng 3.9. Trình tự tương đồng của các loài monogenea ................................................... 45 Bảng 3.10. Thông tin các trình tự digenea sử dụng trong nghiên cứu .............................. 47 Bảng 3.11. Trình tự tương đồng của các loài digenea ....................................................... 49 vii DANH SÁCH HÌNH VẼ Hình 1.1. Cá rô đồng (Anabas testudineus)......................................................................... 2 Hình 1.2. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ............................................................. 4 Hình 1.3. Cá lóc đồng (Channa striata) ............................................................................... 5 Hình 1.4. Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) ................................................................ 6 Hình 1.5. Vùng rDNA (5.8S, 18S và 28S) ........................................................................ 11 Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu ....................................................................................... 13 Hình 2.2. Các chỉ tiêu đo kích thước của bộ phận bám, cơ quan giao cấu của lớp sán lá đơn chủ Monogenea .......................................................................................................... 18 Hình 2.3. Các chỉ tiêu đo kích thước của lớp sán lá song chủ Trematoda ........................ 19 Hình 2.4. Chu trình nhiệt dành cho phản ứng PCR sử dụng mồi 28S rDNA (LSU-5, 1500R) ............................................................................................................................... 21 Hình 2.5. Chu trình nhiệt dành cho phản ứng PCR sử dụng mồi 28S rDNA (C1, D2) .... 21 Hình 3.1. Trichodina sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. ............................................................... 26 Hình 3.2. Ichthyophthyrius sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. ...................................................... 28 Hình 3.3. Thaparocleidus siamensis ................................................................................. 30 Hình 3.4. Thaparocleidus campylopterocirrus – Tiêu bản và mẫu vẽ .............................. 31 Hình 3.5. Thaparocleidus vietnamensis............................................................................. 32 Hình 3.6. Trianchoratus gussevi – Tiêu bản và mẫu vẽ .................................................... 33 Hình 3.7. Prosorhynchoides ozakii – Tiêu bản và mẫu vẽ. ............................................... 34 Hình 3.8. Allocreadium sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. ........................................................... 35 Hình 3.9. Bucephalus sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. .............................................................. 36 Hình 3.10. Camallanus sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ............................................................. 37 Hình 3.11. Pallisentic sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. .............................................................. 39 Hình 3.12. Bothriocephalus acheilognathi – Tiêu bản và mẫu vẽ. ................................... 40 Hình 3.13. Cucullanus chabaudi. ....................................................................................... 42 Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 28S rDNA. ..................................... 43 Hình 3.15. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài monogenea . .......................................................................................................................................... 46 Hình 3.16. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài digenea. ...... 50 1 I - TỔNG QUAN Việt Nam có vị trí địa lý thuận lợi, kiểu khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm với lượng mưa trung bình hằng năm từ 1500 đến 2000 mm. Đồng thời nước ta có lợi thế về diện tích mặt nước với 653 nghìn hecta sông ngòi, 394 nghìn hecta hồ chứa, 85 nghìn hecta đầm phá ven biển và 580 nghìn hecta ruộng lúa nước. Các điều kiện tự nhiên thuận lợi tạo cho Việt Nam có một hệ sinh vật đa dạng có giá trị khai thác cao (Phạm Đình Văn, 2010). Công nghiệp chế biến thủy sản đã và đang là một trong các mũi nhọn kinh tế, đem về cho quốc gia nguồn lợi lớn. Năm 2001, ngành chế biến nông, thủy sản và thực phẩm giữ vị trí hàng đầu, chiếm khoảng 23%, năm 2010 chiếm khoảng 20% gái trị sản xuất công nghiệp và vị thế này không có sự thay đổi lớn trong 10 năm. Chính phủ định hướng đầu tư phát triển đưa Việt Nam trở thành quốc gia cung cấp tin cậy và các sản phẩm nông, thủy sản và thực phẩm an toàn với chất lượng cao (QĐ, 2014). Đồng thời với việc đánh bắt từ tự nhiên, việc phát triển ngành nuôi trồng thủy sản là một nhu cầu bức thiết nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu đầu vào ổn định – an toàn cho công nghiệp chế biến. Vấn đề quan trọng nhất và mang tính quyết định tới sự phát triển của ngành công nghiệp chế biến là việc nâng cao tính an toàn vệ sinh thực phẩm (QĐ, 2014). Tuy nhiên, sự phát triển mạnh của ngành nuôi trồng thủy sản hiện nay có nguy cơ làm tăng các vật chủ trung gian như ốc và cá, dẫn đến nguồn nước bị ô nhiễm, kết quả là tăng các loài ký sinh trùng. (WHO, 2004) Các loài ký sinh trùng làm giảm giá trị thương phẩm và quan trọng hơn là ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Tại nước ta đã xác định bệnh ung thư đường mật do Clonorchis sinensis chủ yếu ở miền Bắc với ít nhất 15 tỉnh, tỷ lệ nhiễm trung bình 19%. Trong đó, tỉnh có tỉ lệ nhiễm cao là Ninh Bình, Nam Định có một số điểm có tỉ lệ nhiễm lên tới 35% - 37%. Bệnh có liên quan đến tập quán ăn gỏi cá, tại Nam Định tỉ lệ người dân ăn gỏi cá tại một số địa phương đến 80,4%, Ninh Bình 70%, Thanh Hoá 67,9% (Nguyen, 2004). Nghiên cứu trên đối tượng sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini, các số liệu điều tra trong toàn quốc cho thấy sán lá gan nhỏ có tỉ lệ nhiễm 32,7% tại Kỳ Sơn, Hòa Bình, 27,7% tại Ba Vì, Hà Nội, 17,7% tại Nga Sơn, Thanh Hóa, 34,85%-50,55% tại Nam Định, 9,36% tại Gia Viễn, Ninh Bình, 11,1% tại Yên Bình, Yên Bái và tại Tuy Hòa, Phú Yên là 0,4% (Nguyễn Văn Đề và ctv, 2008; Nguyen, 2004). Việc nghiên cứu thành phần loài ký 2 sinh trùng là một nhu cầu cấp bách để góp phần đảm bảo sản lượng – chất lượng nguyên liệu đầu vào và sức khỏe người tiêu dùng. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, được sự cho phép của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại Học Nha Trang. Tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền”. 1.1. Đặc điểm sinh học của các loài cá khảo sát trong đề tài 1.1.1. Cá rô đồng (Anabas testudineus) Bộ Perciformes Họ Anabantidae Giống Anabas Loài Anabas testudineus Bloch, 1792 Hình 1.1. Cá rô đồng (Anabas testudineus) (Nguồn: http://tepbac.com/species/full/37/Ca-ro-dong.htm ) Đặc điểm phân bố Cá rô đồng là loài cá nước ngọt, phân bố khá rộng từ Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia đến Thái Lan, Mianma, Ấn Độ, Philippin và các quần đảo giữa Ấn Độ và châu Úc. Ở Việt Nam, cá rô đồng hiện diện khắp các địa phương, với các loại hình mặt nước như ao, hồ, kênh mương, ruộng lúa, đầm lầy, ruộng trũng, “đặc biệt ở những nơi có dòng nước chảy chậm” (Taki, 1978). Cá được tìm thấy ở những nơi có thảm thực vật dày (Rainboth, 1996). Nhiệt độ thích hợp cho cá phát triển tốt nhất từ 26-30oC, pH khoảng 6,5-7 và có khả năng sống trong nước phèn (pH≤4). (Bộ NN & PTNT, 2009) Đặc điểm hình thái Cá rô đồng có thân thon dài hình bầu dục, phía sau dẹp ngang, đầu rộng, mõm ngắn và hơi tròn. Thân cá màu xanh nâu pha hơi vàng nhạt. Mắt to, đỉnh đầu, mặt bên và toàn thân đều phủ vẩy lược, rìa và nắp mang có răng cưa. Gai vây rất cứng và chắc. Gốc vây lưng 3 rất dài, phần gai bằng bốn lần phần tia mềm. Gốc vây đuôi có đốm đên tròn. Vây lưng, vây đuôi và hậu môn màu xanh đen, các vây khác màu nâu nhạt. (Bộ NN & PTNT, 2009) Cá rô có cơ quan hô hấp phụ nằm rên cung mang thứ nhất (gọi là mê lộ hay hoa khế). Cơ quan hô hấp phụ giúp cho cá sống được trong môi trường nước thiếu oxy. Rô đồng có khả năng sống rất lâu trong điều kiện thiếu nước và chúng có thể di chuyển trên cạn rất xa bằng các vây cứng. (Bộ NN & PTNT, 2009) “Khi bị tách ra khỏi nước có thể tồn tại được vài ngày đến vài tuần nếu như cơ quan hô hấp phụ giữ được hơi ẩm. Có khả năng tồn tại qua mùa khô bằng cách tự chôn mình trong bùn”. (Rahman, 1989) Dinh dưỡng - Sinh sản Cá rô là loài ăn tạp, có tính ăn thiên về động vật. Miệng có nhiều răng, có thể nghiền những thức ăn là hạt có vỏ cứng. Cá rô thích ăn các loài động vật không xương sống trong nước hoặc bay trong không khí, sâu bọ, mùn bã hữu cơ, động vật chết và cả các loại rong, cỏ, hạt. (Bộ NN & PTNT, 2009) Cá rô đồng có kích thước nhỏ (nặng 50-100g, dài 10-15 cm), tốc độ tăng trưởng chậm hơn so với nhiều loài cá khác. Tuy vậy, cá dễ thành thục; tại Đồng bằng sông Cửu Long cá có thể thành thục lần đầu khi đạt trọng lượng thân trung bình 50-60g trở lên. Mùa vụ sinh sản trong tự nhiên tập trung nhiều nhất là các tháng 6-7. Cá rô đồng có sức sinh sản khá cao, có thể đạt 1.000.000 trứng/kg cá cái. Trứng cá rô đồng là trứng nổi nên dễ trở thành cá bột trong điều kiện tự nhiên. (Bộ NN & PTNT, 2009) 4 1.1.2. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Bộ Siluriformes Họ Pangasiidae Bleeker, 1858 Giống Pangasianodon Loài Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878 Hình 1.2. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Đặc điểm phân bố Cá tra có vùng phân bố tự nhiên ở lưu vực sông MeKong (Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam), có trường hợp được tìm thấy ở Trung Quốc (Poulsen và ctv, 2005). Tại Việt Nam, cá tra tự nhiên xuất hiện tại vùng hạ lưu sông MeKong. Cá tra phân bố chủ yếu ở các sông, các phụ lưu, đầm ao của sông Tiền, sông Hậu; ngoài ra còn phân bố ở các sông Đồng Nai, Vàm Cỏ, La Ngà (Bình Thuận), các hồ ở Đăk Nông, Đăk Lăk, Pleiku, hệ thống sông Hồng và các sông ở miền Trung Việt Nam. (Nguyễn Chung, 2000) Cá tra sống chủ yếu ở nước ngọt, hoặc nước lợ 7 ÷ 10% muối. Cá có thể chịu được nước phèn có pH>5, ngưỡng chịu nhiệt từ 15 – 39oC. (Phạm Văn Khánh, 2000) Đặc điểm hình thái Cá tra là loài cá da trơn, có thân dài gấp 4 lần chiều rộng. Lưng cá có màu xám đen, bụng hơi bạc. Miệng cá rộng, có 2 đôi râu, vây lưng ngắn, gai vây ngực cứng có chứa răng cưa ở mặt sau. (Phạm Văn Khánh, 2000) Cá tra có cơ quan hô hấp phụ, cá có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên có thể chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan. Cá tra có thể sống trên 20 năm trong tự nhiên. Trong điều kiện nuôi ao, cá bố mẹ có thể đạt tới 25kg đối với cá 10 năm tuổi. (Nguyễn Văn Thường, 2008) 5 Dinh dưỡng – Sinh sản Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh. Từ khoảng 2.5 kg trở lên, mức tăng trọng lượng nhanh hơn nhiều so với sự tăng chiều dài cơ thể cá. Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi, cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2.5 – 3 kg. Cá không có cấu tạo cơ quan sinh dục phụ nên khó phân biệt đực/cái dựa vào cảm quan bên ngoài. (Nguyễn Văn Thường, 2008) 1.1.3. Cá lóc đồng (Channa striata) Bộ Perciformes Họ Channidae Giống Channa Loài Channa striata Bloch, 1793 Hình 1.3. Cá lóc đồng (Channa striata) (Nguồn: http://fl.biology.usgs.gov/Snakehead_circ_1251/html/channa_striata.html ) Đặc điểm phân bố Cá lóc - thuộc giống Channa - là một nhóm quan trọng nhất của cá nước ngọt làm thực phẩm ở khu vực nhiệt đới châu Á (Benziger và ctv, 2011). Cá có nguồn gốc ở Ấn Độ và cũng được tìm thấy ở Myanmar, Bangladesh, Lào, Việt Nam, Campuchia, Malaysia và một phần của Indonesia. Cá lóc phân bố trải dài từ Madagaskar tới Phillipines (Gam và ctv, 2005; Hossain, 2008; Mohsin và ctv, 1983) và được xem là một trong những nguyên liệu thực phẩm phổ biến ở Thailand, Campuchia, Việt Nam và các nước khác ở Đông Nam Á (Sinh và Pomeroy, 2010). Channa Striata là loài ăn thịt và là loài cá nước ngọt cá săn mồi (Pudjirahaju, 1992). Đặc điểm hình thái Cá lóc có 42-45 tia vây lưng mềm, 25-29 tia vây hậu môn mềm, vẩy đường bên 55-65, miệng rộng, hàm thấp, hàm dưới có 4-7 răng nanh. Vây lưng và vây hậu môn có màu tối hơn màu cơ thể (Vishwananth, 2009). 6 Dinh dưỡng – Sinh sản Các chất chiết xuất từ Channa striata được coi là một thực phẩm chức năng bởi chúng có tác dụng trong điều trị vết thương, giảm đau và giảm nguy cơ nhiễm trùng bên trong, bên cạnh đó là khả năng bổ sung năng lượng cho người cao tuổi trong lúc ốm cũng như sự hồi phục của phụ nữ sau sinh (Barakbah, 2007; Mat Jais, 1998). Channa Striata còn chứa một số acid béo như chất oxi hóa chất béo (Dahlan-Daud, 2010; Gam, 2005). Cá lóc bắt đầu đẻ trứng khi được 1-2 tuổi. Một năm có thể đẻ 5 đợt cách nhau khoảng 15 ngày, đẻ rộ vào tháng 4-7. Channa strita đẻ nơi yên tĩnh lúc sáng sớm, có nhiều khu thực vật thủy sinh. Trước khi đẻ, cá thể cái sẽ thu nhặt rong để làm tổ và bảo vệ tổ cho đến khi trứng nở. Thời gian trứng nở khoảng 72h sau khi được thụ tinh, ở nhiệt độ 20-35oC (Sinh, 2010). 1.1.4. Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) Bộ Cypriniformes Họ Cyprinidae Giống Barbonymus Loài Barbonymus gonionotus Hình 1.4. Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) (Nguồn: http://ffish.asia/index.php?p=none&o=sspm&id=26187 ) Đặc điểm phân bố Cá mè vinh phân bố ở các nước Indonesia, Lào, Campuchia, Thái Lan, ở Việt Nam gặp nhiều ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long (Bộ Thủy sản, 2007). Cá phân bố ở vùng nước trung bình và vùng đáy ở các con sông, suối, cửa sông, khu vực hồ chứa nước ngọt. Cá mè vinh sống chủ yếu ở các khu vực nước tĩnh hơn ở các khu vực có dòng nước chảy 7 mạnh. Trong mùa nước nổi, cá sống ở các khu vực rừng ngập nước (Rainboth, 1996). Cá mè vinh là loài cá di cư nhưng chỉ trong phạm vi hẹp. Di cư vào các con suối, kênh rạch nhỏ và các vùng đất ngập nước trong suốt các tháng mùa mưa. Sau đó quay trở lại vào mùa nước cạn (Sokheng, 1999). Đặc điểm hình thái Thân dẹp bên, có dạng hình thoi. Đầu nhỏ dạng hình nón. Phần trán giữa hai mắt rộng và cong lồi. Mõm tù, ngắn, mõm trước, hẹp bên. Góc miệng chạm với đường thẳng đứng kẻ từ bờ trước của mắt, rạch miệng xiên. Cá mè vinh có 2 đôi râu: râu mõm và râu mép, râu kém phát triển, dài tương đương nhau và tương đương với ½ đường kính mắt. Mắt to, lệch về nửa trên của đầu và gần chót mõm hơn gần điểm cuối của nắp mang. Vảy lớn, phủ khắp thân, đầu không có vảy. Mặt lưng của đầu và thân có màu xanh rêu, lợt dần xuống hai bên hông, mặt bụng và thân của đầu có màu trắng bạc. Vây lưng màu xám, phần ngọn đậm hơn phần gốc. Vây bụng, vây hậu môn màu vàng, ria vây đuôi ửng lên màu vàng cam, vây ngực màu vàng lợt. (Bộ Thủy sản, 2007) Dinh dưỡng – Sinh sản Cá lớn thành thục khi được một năm tuổi, nhưng có thể sớm hơn ( 8 – 10 tháng) khi cơ thể đạt trọng lượng 9 – 20g, kích thước 8 – 8,5 cm. Con cái đẻ từ 200.000 đến 800.000 trứng/kg. Trứng nở sau 12h ở 25oC. (Mekong River Commission, 2013) 1.2. Tình nghiên cứu ký sinh trùng trên các loài cá nước ngọt 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Bùi Quang Tề và ctv (1976) đã tiến hành nghiên cứu ký sinh trùng hơn 41 loài cá nước ngọt tại đồng bằng sông Cửu Long và đưa ra biện pháp phòng trị bệnh. Bùi Quang Tề (2001) đã nghiên cứu ký sinh trùng trên 3210 cá thể thuộc 41 loài cá nước ngọt có giá trị kinh tế ở đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu xác định 157 loài ký sinh trùng, 70 giông, 46 họ, 27 bộ thuộc 12 lớp, 8 ngành. Trong 157 loài ký sinh trùng được ghi nhận có 121 loài lần đầu tiên phát hiện được ở Việt Nam. Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) tiến hành khảo sát trong giai đoạn cá giống, các loài ngoại ký sinh (trùng bánh xe, sán lá đơn chủ,…) có nguy cơ gây dịch bệnh cao, làm thiệt hại cho nghề nuôi. Trong giai đoạn cá nuôi thương phẩm, các bệnh do ký sinh trùng phức 8 tạp hơn, ví dụ: bệnh do trùng bánh xe (Trichodina, Trichodinellosis, Tripartiellosis), bệnh trùng mỏ neo (Lernaeosis), bệnh trùng quả dưa (Ichthyophthyriosis). Nguyễn Thị Thu Hằng và ctv (2008) khảo sát ký sinh trùng trên cá tra nuôi thâm canh ở tỉnh An Giang, nghiên cứu ghi nhận các loài ngoại ký sinh như Acineta sp., Balantidium polyvacuolum, Ichthyonyctus pangasia, Trichodina sp., … và nội ký sinh như Dactlogyrus sp., Bucephalosis gracilescens, Cucullanellus minutus. Phan Thi Van và ctv (2010) tiến hành khảo sát sán lá song chủ (trematodes) trên cá nước ngọt nuôi và tự nhiên ở Nam Định. Kết quả cho thấy loài Haplorchis pumilo được tìm thấy với tỷ lệ hơn 50% trong tổng số cá được thu. Nguyễn Văn Đức và ctv (2011) tiến hành nghiên cứu tình hình ký sinh trùng trên cá sông Lam, huyện Đô Lương, tỉnh Nghệ An. Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm sán lá đơn chủ là cao nhất, sau đó là sán lá, các lớp ký sinh trùng khác có tỉ lệ nhiễm thấp. Trần Nam Hà và Trương Thị Hoa (2011) tiến hành nghiên cứu một số bệnh phổ biến do ký sinh trùng gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer nuôi tại Thừa Thiên Huế. Kết quả công bố 3 giống (Vorticalle, Pseudorhabdosynochus, Carassotrema) và 5 loài ký sinh trùng (Trichodia jadranica, Dactylogyrus minutus, Oceanobdella sexoculata, Caligus orientalis, Alitropus typus) trên cá chẽm. Hai bệnh phổ biến do ký sinh trùng gây ra đó là bệnh trùng bánh xe Trichodina và bệnh do sán lá đơn chủ Pseudorhabdosynochus. Phạm Minh Đức và ctv (2012) đã tiến hành khảo sát mầm bệnh trên cá lóc (Channa striata) nuôi ao thâm canh ở An Giang và Đông Tháp. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã xác định được 23 giống ký sinh trùng; trong đó có 6 giống Henneguya, Chilodonella, Epistylis, Tripartiella, Gnathostoma và Capillaria mới được ghi nhận ký sinh trên cá lóc nuôi ao đất thâm canh. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Ở Thái Lan, Yutisri và Thuhanruksa (1985) thực hiện điều tra khu hệ ký sinh trùng trên một số loài cá tự nhiên ở một số vùng của Thái Lan. Nghiên cứu đã phát hiện 16 loài ký sinh trùng, trong đó tác giả đã xác định được 3 loài ngoại ký sinh và 13 loài nội ký sinh trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus). Ahmed và Ezaz (1997) đã nghiên cứu ký sinh trùng của 17 loài cá da trơn ở Banglades. Nghiên cứu xác định được 69 loài ký sinh trùng bao gồm 1 loài 9 monogenea, 24 loài Digenea, 10 loài Cestoda, 28 loài Nematoda và 6 loài Acanthocephala. Cá trê trắng trong nghiên cứu có số lượng giun sán ký sinh nhiều nhất với 24 loài: 1 loài Monogenea, 5 loài Digenea, 9 loài Cestoda, 2 loài Acanthocephala, 7 loài Nematoda. Luangphai và ctv (2004) nghiên cứu trên cá rô đồng tại quận San Sai, tỉnh Chiang Mai (Thái Lan) cho thấy 7 loài ký sinh trùng, trong đó 1 loài Monogenea (Trianchoratus sp.), 1 loài Acanthocephala (Pallisentis sp.), 1 loài Nematoda (Camallanus sp.), 1 loài Trematoda (Allocreadium sp.) và 3 loài ở thời kỳ ấu trùng Stellantchasmus falcatus, Acanthostomum sp., Centrocestus caninus. Chaiyapo và ctv (2007) nghiên cứu trên cá thuộc giống Channa, trên loài Channa striata ghi nhận Pallisentis nagpurensis và bộ Proteocephala. Thuy và Buchmann (2008) ghi nhận trên cá tra nuôi 2 loài Thaparocleidus siamensis và Thaparocleidus caecus. Trong đó, T. siamensis có tỷ lệ nhiễm 57%, cường độ nhiễm 148; T. caecus có tỷ lệ và cường độ nhiễm thấp hơn. Rahman và Bakri (2008) nghiên cứu trên cá nước ngọt ở Malaysia, Camallanus yehi và Pallisentis spp. được ghi nhận trên đối tượng cá lóc đồng (Channa striata). Dinh Thi Thuy và ctv (2010) đã tiến hành khảo sát tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ metacercariae trên cá tra Việt Nam. Nghiên cứu sử dụng trình tự gen ITS2 để tiến hành phân loại di truyền. Kết quả cho thấy 17/69 loài metacercariae bắt cặp được với trình tự gen ITS2. Binky và ctv (2011) thực hiện khảo sát các loài nematoda ở vùng Karbhala tại Silchar Assam, Ấn Độ. Nghiên cứu ghi nhận 13 loài nematoda. Tỉ lệ nhiễm cao nhất (20%) thuộc về 2 loài cá Monopterus cuchia và Channa orientalis. Trong nghiên cứu này, các loài Camallanus sp., Zeylanema anabantis, Paraquimperia manipurensis được ghi nhận trên loài Anabas testudineus. Verma và ctv (2012) tiến hành nghiên cứu ký sinh trùng trên cá leo tại Ấn Độ. Nghiên cứu thực hiện phản ứng PCR, sử dụng primer 28S rDNA trên đối tượng Thaparocleidus wallagonius. Kêt quả cho thấy loài nghiên cứu có sự tương đồng 91-98% với giống Thaparocleidus. Chaudhary và Singh (2012) sử dụng gen 28s để xác định sự gần gũi về mặt di truyền của các loài monogenea thu thập được trên các loài cá nước ngọt (Anabas 10 testudineus, Mystus vittatus, Puntius sophore,…). Kết quả cho thấy Thaparocleidus parvulus, Cornudiscoides proximus và Bifurcohaptor indicus có sự gần gũi về mặt di truyền; loài Trianchoratus agrawalae trên cá rô đồng có mối qaun hệ di truyền gần với Heteronchocleidus và Mastacembelocleidus indicus. Bhuiyan và ctv (2014), tiến hành nghiên cứu trên cá rô đồng Anabas testudineus. Kết quả khảo sát cho thấy thành phần ký sinh trùng bao gồm 5 loài nội ký sinh metazoan, 1 loài trematoda (Neopecoelina saharanpuriensis) và 4 loài nematoda (Ascaridida sp., Contracaecum sp., Camallanus anabantis và C. pearsei) Das và Goswami (2014) tiến hành khảo sát tình trạng nhiễm ký sinh trùng trên cá rô Anabas testudineus ở ba vùng đất ngập nước thuộc Goalpara, Assam. Ba loài thuộc treamatoda (Asymphylodora kedarai, Brahamputratrema sp., Neopodocotyl sp.) và 6 loài thuộc nematoda (Camallanus anabantis, C.trichuris, C.intestinalus, Onchocamallanus sp., Parascarophis sp., và Cosmoxynemoid nandusi) đã được ghi nhận. Chaudhary và ctv (2014) khảo sát ký sinh trùng trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus ở Ấn Độ. Khảo sát đã phát hiện loài Thaparocleidus caecus trên các sợi tơ mang. Các tác giả sử dụng các đặc điểm hình thái và đoạn gen 28s rDNA để phân loại loài ký sinh trùng và xây dựng cây di truyền với các đoạn gen có liên quan trên GenBank. 1.3. Đặc điểm hệ gen ribosome DNA Gen ribosome DNA (hay rDNA) là nhóm gen mã hóa của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh loài. rDNA có đặc điểm là một gen có nhiều bản sao và không mã hóa protein. Việc ra đời phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR tạo thuận lợi lớn cho các nghiên cứu liên quan. (White và ctv, 1989) Theo White và ctv (1989), rDNA có thể chia làm 2 nhóm là rDNA nhân và rDNA ty thể. rDNA nhân gồm:  Nu – SSU – rDNA (17-18S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị nhỏ.  Nu – SSU – rDNA (26-28S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị lớn. Trong các nghiên cứu phân loại học thường sử dụng DNA nhân vì các DNA này có tính alen cao, tần số đột biến thấp, việc truyền tính trạng tuân theo các định luật chặt chẽ. Ngược lại, DNA ty thể không có được các ưu điểm trên. Đồng thời, việc di truyền theo 11 dòng mẹ khiến các vật chất di truyền không được phân chia đều (Ballard và Whitlock, 2004; Song và ctv, 1998) Ribosome đước cấu tạo từ rRNA và protein. Các rRNA được đặc trưng bởi hằng số lắng S. Ở Eukaryote, ribosome có hệ số lắng là 80S, bao gồm 2 đơn vị: lớn (60S) và nhỏ (40S).  Đơn vị lớn (60S): 28S; 5,8S; 5S.  Đơn vị nhỏ (40S):18S. Hình 1.5. Vùng rDNA (5.8S, 18S và 28S) (Nguồn: http://www.genomebiology.com/2009/10/5/R49/figure/F1?highres=y ) Các loại rDNA 5,8S, 18S, 28S thực hiện phiên mã thành các rRNA riêng lẻ và nằm xen kẽ trong các vùng phiên mã trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Trong 3 loại rDNA nêu trên, 28S có vai trò quan trọng trong phân loại học; cạnh đó, vùng ITS thường được sử dụng trong các nghiên cứu về tiến hóa ở vi sinh vật nhằm xác định mức độ biệt hóa (Guarro Josep và ctv, 1999) 12 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá nước ngọt ở tỉnh Khánh Hòa và Đồng Bằng sông Cửu Long. Địa điểm thu mẫu: ký sinh trùng được thu trên mẫu cá thu tại Nha Trang, Cần Thơ, Đồng Tháp. Thời gian thực hiện: từ 02/02/2015 đến 07/06/2015. Tiến hành thí nghiệm tại Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử - Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trường Đại học Nha Trang. 13 2.2. Sơ đồ khối nghiên cứu Hình 2.1. Sơ đồ khối nghiên cứu 2.3. Phương pháp thu mẫu Các loài cá rô đồng (Anabas testudineus), cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) và cá lóc đồng (Channa striata) thu tại khu vực chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Cá được thu trong tình trạng còn sống hoặc bảo quản tươi tại chợ vận chuyển về phòng thí nghiệm. Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thu tại các tỉnh Đồng Tháp và thành phố Cần Thơ, được bảo quản tươi và vận chuyển về địa điểm thí nghiệm. Số lượng và kích thước các loài cá nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.1. 14 Bảng 2.1. Số lượng và kích thước các loài cá trong nghiên cứu STT Loài cá Số lượng (n) Chiều dài (cm) Khối lượng (g) 1 Cá rô đồng 70 9.34 ± 3.01 15.50 ± 8.79 10 24.85 ± 3.55 259.6 ± 37.15 60 15.05 ± 5.2 31.01 ± 35.44 150 29.4 ± 19.2 244.39 ± 358.42 (Anabas testudineus) 2 Cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) 3 Cá lóc đồng (Channa striata) 4 Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Giá trị trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn 2.4. Phuơng pháp giải phẫu và kiểm tra ký sinh trùng  Phương pháp giải phẫu Đối với nội tạng cá, thực hiện theo quy trình: Bước 1: Bắt đầu mổ cá từ lỗ hậu môn. Bước 2: Cắt lên hướng vây lưng. Bước 3: Tiếp tục cắt theo chiều hướng lên phía mang. Bước 4: Khi áp sát mang, cắt theo chiều hướng xuống Bước 5: Dùng kẹp kéo nhẹ nhàng mảng thịt ở khoang bụng ra để lộ phần nội tạng của cá. Đối với mang cá, thực hiện theo quy trình: Bước 1: Dùng kéo cắt vào cơ nắp mang ở dưới miệng cá. Bước 2: Đẩy nắp mang lên, dùng kéo cắt 2 phần gốc của các lá mang. Bước 3: Dùng kẹp lôi nhẹ nhàng mang cá và cho vào đĩa.  Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng Trong nghiên cứu, việc kiểm tra ký sinh trùng theo phương pháp của Dogiel (1929) có sửa chữa, bổ sung thêm của một số tác giả Đỗ Thị Hòa và ctv (2004), Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007). 15 Dụng cụ: Kính hiển vi, kính soi nổi, lam kính, lamel, bộ giải phẫu (kéo, banh kẹp, đèn cồn, cốc thủy tinh, cân, thước, hộp lồng, khay đựng mẫu) Hóa chất: Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất, cồn tuyệt đối, các mức thang cồn, carmin, acid lactic, lactophenol, vaselin để kết dính lamel vào lam kính và một số hóa chất khác. Theo Dogiel, có 2 phương pháp kiểm tra và nghiên cứu ký sinh trùng ở cá: kiểm tra toàn diện (toàn bộ các cơ quan bên trong và ngoài cơ thể cá) và kiểm tra từng phần (kiểm tra những cơ quan có nguy cơ là đích của các loài ký sinh trùng như: mang, ruột, vùng mắt, khoang bụng. Đối với các cơ quan bên ngoài (da, mang) Bước 1: Trước hết cần quan sát màu sắc da, tình trạng vây và vẩy cá, … Bước 2: Tiến hành cạo nhớt trên thân, gốc vây, bụng cá cho lên 2-4 lam kính và nhỏ thêm muối sinh lý, đậy lamel và quan sát ở vật kính 4x sau đó lên 40x để quan sát rõ hình dạng, cấu trúc ký sinh trùng. Bước 3: Cân đo chiều dài, cân nặng. Bước cân đo được thực hiện sau khi lấy nhớt để đảm bảo không có ảnh hưởng tới lượng nhớt trên cá ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Bước 4: Cắt bỏ nắp mang và quan sát màu sắc, hình dạng của mang, cũng như lượng nhớt mang cá tiết ra. Bước 5: Để dễ quan sát kĩ càng hơn, có thể cắt rời từng cung mang (cắt cẩn thận tránh chảy máu làm hạn chế sự quan sát) và quan sát bằng mắt thường, kính lúp tay. Bước 6: Lấy nhớt mang lên 2-4 lam kính, đậy lame và quan sát trên kính hiển vi. Trong trường hợp phát hiện nhiều sán lá đơn chủ (giống Dactylogyrus) ta cần tiến hành định lượng trên toàn bộ mang (cắt nhỏ từng tơ mang, soi dưới kính giải phẫu để đếm số lượng). Đối với các cơ quan bên trong của cá (nội tạng) Tiến hành mổ và tách riêng các bộ phận nội tạng cá ra như: tim, gan, ruột, dạ dày, thận,…  Tim cá được ngâm trong nước muối sinh lý và quan sát bằng mắt thường. Tiếp đó được tiến hành giải phẫu cắt nhỏ cho lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi. 16  Gan cá được quan sát màu sắc, hình dạng. Gan cá được cắt, nén ép trên lam kính và quan sát bằng kính giải phẫu.  Ruột cá được giải phẫu bỏ thức ăn còn sót lại, cắt làm ba đoạn ( ruột trước, ruột giữa, ruột sau) và quan sát dưới kính lúp tay hoặc kính soi nổi.  Dạ dày cần được kiểm tra riêng. Thực hiện mổ và quan sát bằng mắt thường hoặc kính soi nổi, vì có thể bắt gặp giun sán cỡ lớn. Cùng với đó là tiến hành quan sát dịch nhớt dạ dày.  Thận quan sát bằng mắt thường. Có thể lấy ít mẫu ép trên lam kính và quan sát.  Cơ cá cũng cần được kiểm tra bằng cách cắt thành từng miếng nhỏ (1cm2) ép trên lam kính và quan sát.  Mật: tách riêng túi mật khỏi gan. Cắt và vuốt dịch mật lên lam kính và quan sát dưới kính hiển vi. 2.5. Phương pháp bảo quản, cố định và nhuộm tiêu bản Ký sinh trùng sau khi được thu nhận có thể tiến hành nhuộm ngay hoặc bảo quản trong cồn tuyệt đối. Các bước cố định và nhuộm tiêu bản như sau:  Bước 1: Cho trùng vào lam có chứa 1 giọt nước muối sinh lý.  Bước 2: KST được bảo quản trong cồn tuyệt đối.  Bước 3: Lấy trùng ra cho vào lam kính làm tiêu bản.  Bước 4: Ngâm trùng qua các thang cồn có nồng độ giảm dần từ 900, 700, 500, 300, 100. Mỗi nồng độ cồn khác nhau ngâm 10-15 phút.  Bước 5: Nhỏ 1-3 giọt acid lactic, để 10 phút đến 20 phút tùy vào kích thước ký sinh trùng.  Bước 6: Nhỏ 3-5 giọt thuốc nhuộm carmin lên mẫu, để 30 – 40 phút. Sau đó, cho trùng qua cồn 500 trong 1 phút. Tiếp tục nhỏ 1-3 giọt cồn 100 lên tiêu bản.  Bước 7: Dùng vaselin gắn 4 góc tiêu bản. Đậy lamel, quan sát và bảo quản KST. Các lớp sán lá đơn chủ Monogenea, lớp sán lá song chủ Trematoda, ký sinh trùng thuộc ngành nguyên sinh động vật Protozoa, lớp giun tròn Nematoda, lớp sán dây Cestoda và lớp giun đầu móc Acanthocephala, tiến hành cố định, nhuộm và bảo quản giống với 17 các bước trên. Riêng đối với lớp giun tròn và lớp giun đầu móc, không cần nhuộm tiêu bản mà chỉ cần làm trong bằng acid lactic. 2.6. Phương pháp phân loại hình thái ký sinh trùng Ký sinh trùng được phân loại dựa vào các đặc điểm hình thái theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004), Hà Ký và ctv (2007), Tan và ctv (2009), Dian và ctv (2008), Tang và ctv (2013), Anido và ctv (2013). Phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau: Hình dạng ký sinh trùng, vị trí ký sinh trên vật chủ, cấu tạo, kích thước cơ thể (cơ quan bám, cơ quan sinh dục, điểm mắt, gai giao cấu,…), cơ quan sinh sản như tinh hoàn, buồng trứng Các đặc điểm cụ thể để phân loại như sau:  Trùng bánh xe (Trichodina): phân loại dựa vào hình dạng, cấu tạo, số lượng răng, số lượng răng bám, đương kính vòng móc bám, đường phóng xạ.  Sán dây (Cestoda): căn cứ vào phần đầu của sán và sự sắp xếp tinh trùng, buồng trứng để phân loại.  Sán lá song chủ (Trematoda): căn cứ hình dạng, cấu tạo cơ thể. Đặc điểm hình dạng, tỉ lệ - vị trí của của giác bụng – miệng, vị trí – kích thước buồng trứng, noãn hoàng.  Giun tròn (Nematoda): căn cứ hình dạng cơ thể, cấu tạo của đầu – đuôi, cấu tạo thực quản, dạ dày, gai giao cấu, tinh hoàn và buồng trứng.  Sán lá đơn chủ (Monogenea): căn cứ vào gai giao cấu, các giác bám lớn, thanh nối lưng, thanh nối bụng và số lượng móc rìa.  Giun đầu gai (Acanthocephala): căn cứ vào số gai phần đầu gai, gai phần thân và tỉ lệ sắp xếp gai trên cơ thể. 18 Hình 2.2. Các chỉ tiêu đo kích thước của bộ phận bám, cơ quan giao cấu của lớp sán lá đơn chủ Monogenea Bảng 2.2. Ý nghĩa các ký hiệu trong Hình 2.2. Ký hiệu Ý nghĩa 1 Móc giữa 2 Thanh nối lưng 3 Thanh nối bụng 4 Móc rìa 5 Cơ quan giao cấu al (lenghth of general) tổng chiều dài móc giữa, thanh nối lưng và thanh nối bụng ba (length of base) chiều dài cánh cung móc nhọn hl (hook- let) chiều dài phần móc rìa ko tổng chiều dài cơ quan giao phối m chiều dài ống giao phối ph (pivot hook) tổng chiều dài móc rìa pr (poin recurved) chiều dài phần móc giữa w (width) chiều rộng thanh nối lưng và thanh nối bụng Φ chiều dài bộ phận đỡ 19 Hình 2.3. Các chỉ tiêu đo kích thước của lớp sán lá song chủ Trematoda A1. Chiều dài cơ thể D1. Chiều dài giác bụng C. Chiều dài hầu A2. Chiều rộng cơ thể D2. Chiều rộng giác bụng F1. Chiều dài tinh hoàn B1. Chiều dài giác miệng E1. Chiều dài buồng trứng F2. Chiều rộng tinh hoàn B2. Chiều rộng giác miệng E2. Chiều rộng buồng trứng 2.7. Phương pháp nghiên cứu di truyền 2.7.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Trong nghiên cứu, quá trình tách chiết DNA được thực hiện theo bộ kit Dneasy® Blood & Tissue (Qiagen) với các bước cụ thể được trình bày trong Phụ lục 1. 2.7.2. Phản ứng PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật dựa trên các DNA mạch khuôn được coi như 1 trình tự đích DNA ban đầu, enzyme Taq polymerase được sử dụng trong quá trình PCR để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200-3.000 bp. Đoạn 20 DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 18-20 nucleotide. Kỹ thuật PCR có 3 giai đoạn:  Giai đoạn biến tính: nhiệt độ 91 – 970C, có tác dụng làm biến tính mẫu DNA kép thành các chuỗi đơn.  Giai đoạn bắt cặp: nhiệt độ 55 – 650C, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi DNA đơn.  Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ 68-730C, enzyme Taq polymerase được sử dụng để kéo dài các dNTP đến đầu 3’ của đoạn mồi đang thực hiện bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích và tiến hành tổng hợp nên mạch bổ sung. Trong nghiên cứu sử dụng 2 primer: cặp mồi 28S rDNA (C1, D2) dành cho Monogenea và 28S rDNA (LSU-5, 1500R) dành cho Digenea. Thành phần phản ứng, chu trình nhiệt PCR và trình tự của 2 primer được trình bày trong Bảng 2.3, Bảng 2.4, Hình 2.5, Hình 2.6. Bảng 2.3. Tỉ lệ các thành phần trong Master mix của phản ứng PCR 28s rDNA (C1,D2) 28s rDNA (LSU-5,1500R) Tổng thể tích 50 50 Buffer 5 5 dNTP 1 1 Mồi xuôi 2 1 Mồi ngược 2 1 Mẫu 9 5 Taq 0,25 0,25 H2O 30,75 36,75 21 Bảng 2.4. Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR của nghiên cứu Gen Mồi xuôi Mồi ngược Nguồn 28S rDNA C1: D2: Hassouna và 5’_TCA GTA ATC GGA 5’_CAA AAC CAC AGT ctv (1994) GGA AAA GAA_3’ TCT CAC AGC_3’ LSU-5: 1500R: Olson và ctv 5’_TAG GTC GAC CCG 5’_ GCT ATC CTG AGG (2003) CTG AAT TTA AGC A_3’ GAA ACT TCG_3’ 28S rDNA Hình 2.4. Chu trình nhiệt dành cho phản ứng PCR sử dụng mồi 28S rDNA (LSU-5, 1500R) Hình 2.5. Chu trình nhiệt dành cho phản ứng PCR sử dụng mồi 28S rDNA (C1, D2) 22 2.7.3. Phương pháp điện di Điện di nhằm mục đích đọc các sản phẩm của quá trình khuếch đại PCR. Phương pháp điện di được thực hiện theo nguyên tắc: đặt các phân tử DNA tích điện (-) vào điện trường. Dưới tác động của điện trường, các phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực (-) sang cực (+) của điện trường. Nghiên cứu thực hiện diện di trên gel agarose (1,5%) nhuộm Ethidium bromide. Các phân tử DNA nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn về phía cực dương và ngược lại. Các bước của quá trình điện di:  Chuẩn bị gel agarose: Cho 40ml đệm TBE 1X và 0,6g agarose vào bình tam giác 250ml. Đun hỗn hợp cho tới khi agarose tan hết. Để nguội đến 60-70oC rồi cho vào bình tam giác 250nl khác. Bổ sung 2 µl Ethidium bromide và lắc đều, tránh tạo bọt. Đổ gel vào khuôn đã lắp sẵn lược. Khi gel đông lại và ổn định tiến hành tháo lược.  Tiến hành điện di: thực hiện điện di với đệm TBE 1X được đổ ngập bản gel. Hút 3µl mẫu và 1µl loading dye trộn đều và bơm vào các giếng điện di. Hút 2µl DNA ladder vào 1 giếng. Chạy điện di ở 90V, 400mA trong 20 phút.  Đọc kết quả điện di: để bản gel lên bàn UV Transilluminator và quan sát. 2.7.4. Phương pháp giải trình tự Sản phẩm PCR được giải trình tự tại công ty TNHH Nam Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh. 23 2.8. Xử lý số liệu  Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ nhiễm được tính toán dựa vào số cá bị nhiễm ký sinh trùng. Tỷ lệ nhiễm (%) = 𝑆ố 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐á 𝑛ℎ𝑖ễ𝑚 𝑘ý sinh 𝑡𝑟ù𝑛𝑔 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑐á 𝑘𝑖ể𝑚 𝑡𝑟𝑎 * 100%  Cường độ nhiễm Cường độ nhiễm được tính toán dựa vào số lượng ký sinh trùng. Cường độ nhiễm = 𝑆ố 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑘ý sinh 𝑡𝑟ù𝑛𝑔 𝑆ố 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐á 𝑛ℎ𝑖ễ𝑚 𝑘ý sinh 𝑡𝑟ù𝑛𝑔  Xử lý số liệu đo kích thước ký sinh trùng Đối với ký sinh trùng có kích thước lớn như giun tròn, giun đầu móc… có thể sử dụng thước chia vạch để đo trực tiếp. Đối với ký sinh trùng có kích thước nhỏ, ta sử dụng kính hiển vi để xác định kích thước :  Cho trắc thị kính vào ống kính hiển vi, đặt trùng với thị trường kính và quan sát chiều dài trùng bằng cách đếm số vạch của trắc kính.  Bỏ trùng ra, thay vào thị trường kính trắc vật kính (giữ nguyên vật kính và thị kính). Quan sát xem 1 vạch của trắc thị kính tương ứng với mấy vạch của trắc vật kính. Biết rằng 1 vạch/trắc vật kính 10X = 0,01mm; 1 vạch/trắc vật kính 4X=0,1mm. Từ đó suy ra số đo của 1 vạch trên trắc thị kính và ký sinh trùng. 24 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần ký sinh trùng, tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm Nghiên cứu tiến hành thu 60 cá thể cá lóc đồng (Channa striata), 10 cá thể cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) và 70 cá thể cá rô đồng (Anabas testudineus) ở khu vực chợ Vĩnh Hải, Nha Trang. Thu 150 cá thể cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tại tỉnh Đồng Tháp và thành phố Cần Thơ. Dựa vào các thông số hình thái và các đặc điểm phân loại, nghiên cứu tiến hành phân tích thành phần ký sinh trùng, tính tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm của các loài ký sinh trùng phát hiện được. Thông tin về thành phần ký sinh trên từng vật chủ, tỉ lệ nhiễm, cường độ nhiễm được trình bày trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần ký sinh trùng trên các loài cá Loài cá Vị trí ký Ký sinh trùng thu Tỉ lệ Cường sinh được nhiễm độ nhiễm Cá mè vinh Ruột (Barbonymus gonionotus) Bothriocephalus 30% 1,3 70% 7 26,67% 2,2 78% 4,9 10% 1,53 64,7% 1,57 31,3% 4,02 acheilognathi Mang Thaparocleidus campylopterocirrus Cá tra Mang (Pangasianodon hypophthalmus) Thaparocleidus siamensis Mang Thaparocleidus campylopterocirrus Mang Thaparocleidus vietnamensis Ruột Prosorhynchoides ozakii Ruột Bucephalus sp. 25 Ruột Cucullanus 21,3% 1,3 chabaudi Cá rô đồng Ruột Allocreadium sp. 44,3% 2,7 (Anabas testudineus) Ruột Camallanus sp. 32,9% 3,87 Mang Ichthyophthyrius sp. 2,9% 1 Mang Trichodina sp. 4,3% 2,3 Mang Trianchoratus 47,3% 1,64 81,67% 4 gussevi Cá lóc đồng Ruột Pallisentic sp. (Channa striata) Tỉ lệ nhiễm (TLN) và cường độ nhiễm (CĐN) có sự dao động giữa các loài và trên các vật chủ khác nhau. Tỉ lệ nhiễm cao nhất là loài Pallisentic sp. (81,67%) trên cá lóc đồng, cường độ nhiễm cao nhất là loài Thaparocleidus campylopterocirrus (7) trên cá mè vinh. Loài Ichthyophthyrius sp. trên cá rô đồng có cùng cường độ nhiễm và tỉ lệ nhiễm thấp nhất (2,9% và 1). Tỉ lệ nhiễm Pallisentic sp. trên cá lóc đồng trong nghiên cứu hiện tại tương tự với nghiên cứu của Phạm Minh Đức và ctv (2012) trên đối tượng Channa striata và Channa micropelte. Tỉ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá rô đồng (Anabas testudineus) ở mức < 50%, kết quả cho thấy sự tương tự với nghiên cứu của Luangphai và ctv (2003). Trong các loài ký sinh trên đối tượng cá tra, T. campylopterocirrus có tỉ lệ nhiễm cao nhất (78%) và cường độ nhiễm cao nhất trong tất cả các loài ký sinh trong nghiên cứu. Theo nghiên cứu của Dinh và Buchman (2008) trên đối tượng sán lá đơn chủ trên cá tra ở Vĩnh Long và Cần Thơ, T. siamensis chiếm ưu thế với TLN 53% và CĐN 148. Trong nghiên cứu hiện tại, loài T. siamensis được ghi nhận với TLN 26,67% và CĐN 2,2. 26 3.2. Mô tả đặc điểm hình thái các loài ký sinh trùng trong nghiên cứu 3.2.1. Ngành Protozoa 3.2.1.1. Trichodina sp. (Hình 3.1) Ngành: Ciliophora Doflein, 1901 Lớp: Oligohymenophorea de Puytorac et al., 1974 Bộ: Mobilina Kahl, 1933 Họ: Trichodinidae Clau, 1874 Giống: Trichodina Ehrenberg, 1830 Loài: Trichodina sp.  Vật chủ ký sinh: Cá rô đồng (Anabas testudineus)  Cơ quan ký sinh: Mang  Đặc điểm hình thái (n=1): Đường kính thân 58,1 µm, vòng đĩa bám 42,2 µm, vòng móc bám ngoài 29,0 µm, vòng móc bám trong 25,4 µm. Số lượng móc trong vòng móc bám 27. Số lượng sọc giữa hai nhánh ngoài của móc là 27. Chiều dài nhánh ngoài của móc 5,1 µm, nhánh trong 4,9 µm. A B Hình 3.1. Trichodina sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. A – Sọc giữa hai nhánh ngoài của móc, B – Móc trong vòng móc bám. Scale bar = 14,52 µm 27  So sánh các chỉ tiêu phân loại với loài Trichodina nigra trong nghiên cứu của Hà Ký vs ctv (2007) (Bảng 3.2) Bảng 3.2. So sánh giữa Trichodina nigra và Trichodina sp. Trichodina nigra Trichodina sp. Đường kính thân 57,6-98,0 µm 58,1 µm Vòng đĩa bám 41,6-54,4 µm 42,2 µm Vòng móc bám ngoài 28,8-49,9 µm 29,0 µm Vòng móc bám trong 25,6-46,4 µm 25,4 µm Số móc trong vòng bám 17-33 27 8-16 27 4,8-8 µm 5,1 µm 4,8-9,6 µm 4,9 µm Số sọc giữa hai nhánh ngoài của móc Chiều dài nhánh ngoài của móc Chiều dài nhánh trong của móc 3.2.1.2. Ichthyophthyrius sp. (Hình 3.2) Ngành: Ciliophora Doflein, 1901 Lớp: Oligohymenophorea de Puytorac et al., 1974 Bộ: Hymetostomatida Delage et Hérouard, 1896 Họ: Ophryoglenidae Kent, 1881 Giống: Ichthyophthyrius Fouquet, 1876 Loài: Ichthyophthyrius sp.  Vật chủ ký sinh: Cá rô đồng (Anabas testudineus)  Cơ quan ký sinh: Mang 28  Đặc điểm hình thái (n=1): Thân hình tròn. Kích thước 0,27 mm. Hạch lớn hình móng ngựa ( 0,12 x 0,1 mm), dày, ngắn, nằm gần giữa thân. Lỗ miệng bé, hầu ngắn. Bao bọc bởi lông mảnh. A B Hình 3.2. Ichthyophthyrius sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. A – Hạch hình móng ngựa, B – Lỗ miệng. Scale bar = 0,054 mm  So sánh các chỉ tiêu phân loại với loài Ichthyophthyrius multifillis trong nghiên cứu của Hà Ký và ctv (2007). (Bảng 3.3) Bảng 3.3. So sánh giữa Ichthyophthyrius multifillis và Ichthyophthyrius sp. Ichthyophthyrius multifillis Ichthyophthyrius sp. Hình dạng thân Thân hình tròn hoặc hình trứng Thân hình tròn Kích thước 0,2-0,41 mm 0,27 mm Hình móng ngựa, dày, ngắn, Hình móng ngựa, dày , ngắn, nằm gần giữa thân. nằm gần giữa thân Lỗ miệng và hầu Lỗ miệng bé, hầu ngắn Lỗ miệng bé, hầu ngắn Toàn thân Có lông mảnh bao bọc Có lông mảnh bao bọc Hạch lớn 29 3.2.2. Lớp Monogenea 3.2.2.1. Thaparocleidus siamensis (Hình 3.3) Ngành: Plathelminthes Schneider, 1873 Lớp: Monogenea Bychowsky, 1937 Bộ: Dactylogyridea Bychowsky, 1937 Họ: Ancyrocephalidae Bychowsky, 1937 Giống: Thaparocleidus Jain, 1952 Loài: Thaparocleidus siamensis Lim, 1990  Vật chủ ký sinh: cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)  Cơ quan ký sinh: Mang  Mô tả hình thái (n=3): T. siamensis có dạng hình trụ, cơ thể khá trong suốt, chiều dài cơ thể 325 ± 32 μm; chiều rộng 74 ± 12 μm. Bộ phận bám của sán có đôi móc giữa khá lớn và chắc chắn, ngoài ra có một đôi móc lưng và một đôi móc bụng. T. siamensis có một màng nối lưng và một màng nối bụng. Móc giữa phía lưng có tấm phụ hình tam giác hơi cong về phía ở đầu nhánh trong. Móc rìa nhỏ và khó quan sát, chiều dài móc rìa 12 ± 1 μm. Tổng chiều dài của móc giữa phía lưng là 60 ± 4 μm, phần chính dài 49 ± 2 μm, mấu nhọn uốn cong dài 31 ± 2μm. Tổng chiều dài móc bụng 22 ± 2μm, chiều dài mấu nhọn uốn cong 12 ± 1μm. T. siamensis có màng lưng thẳng, hai đầu hơi nhỏ lại, chiều dài 9 ± 2μm. Màng nối bụng hình chữ “V”, kích thước 20 ± 2μm. T. siamensis có cơ quan giao phối đơn giản, tổng chiều dài cơ quan giao phối 73 ± 2μm, ống giao phối uốn lượn, xoắn một vòng ở phần đầu, phần sau lượn sóng. 30 B A C Hình 3.3. Thaparocleidus siamensis A – Gai giao cấu, B – Móc lưng và thanh nối lưng, C – Móc bụng và thanh nối bụng. Scale bar = 54,2 µm 3.2.2.2. Thaparocleidus campylopterocirrus (Hình 3.4) Ngành: Plathelminthes Schneider, 1873 Lớp: Monogenea Bychowsky, 1937 Bộ: Dactylogyridae Bychowsky, 1937 Họ: Ancyrocephalidae Bychowsky, 1937 Giống: Thaparocleidus Jain, 1952 Loài: Thaparocleidus campylopterocirrus  Vật chủ ký sinh: cá mè vinh (Barbonymus gonionotus), cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)  Cơ quan ký sinh: Mang  Đặc điểm hình thái (n=3): Chiều dài 557±20µm. Chiều rộng 108±9µm. Chiều dài màng lưng 41±3µm. Màng nối bụng 19±2µm. Chiều dài móc giữa phía lưng 71±13 µm. Chiều dài móc nhọn uốn cong của móc giữa 35±7µm. Móc rìa 14±2µm 31 Hình 3.4. Thaparocleidus campylopterocirrus – Tiêu bản và mẫu vẽ A – Tiêu bản, B – Mẫu vẽ, C – Gai giao cấu, D – Móc rìa, E - Thanh và móc bụng, F – Móc chính và thanh nối lưng. Scale bar = 111,4 µm. 3.2.2.3. Thaparocleidus vietnamensis (Hình 3.5) Ngành: Plathelminthes Schneider, 1873 Lớp: Monogenea Bychowsky, 1937 Bộ: Dactylogyridae Bychowsky, 1937 Họ: Ancyrocephalidae Bychowsky, 1937 Giống: Thaparocleidus Jain, 1952 Loài: Thaparocleidus vietnamensis  Vật chủ ký sinh: cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)  Cơ quan ký sinh: Mang.  Đặc điểm hình thái (n=3): Chiều dài toàn thân 678 ± 125, chiều rộng 126 ± 21. Tổng độ dài ống giao cấu 87 ± 2,4. Màng nối lưng 25 ± 0,8 x 5 ± 0,4. Móc giữa phía lưng dài 28 ± 3,5. Màng nối bụng rộng 2,7 ± 0,3. Móc giữa phía bụng 14 ± 2,5. 32 Hình 3.5. Thaparocleidus vietnamensis A – Móc chính, B – Thanh nối lưng, C – Thanh nối bụng, D – Móc bụng, E – Móc rìa, F – Gai giao cấu. Scale bar = 30 µm 3.2.2.4. Trianchoratus gussevi (Hình 3.6) Ngành: Plathelminthes Schneider, 1873 Lớp: Monogenea Bychowsky, 1937 Bộ: Dactylogyridae Bychowsky, 1937 Họ: Ancyrocephalidae Bychowsky, 1973 Giống: Trianchoratus Price et Berry, 1966 Loài: Trianchoratus gussevi  Vật chủ ký sinh: Cá rô đồng (Anabas testudineus)  Cơ quan ký sinh: Mang  Đặc điểm hình thái (n=4): Sán nhỏ, kích thước 0,15-0,2 x 0,043-0,08 mm. Bộ phận bám có 3 móc giữa, một móc phía lưng, hai móc phía bụng, không có màng nối. Móc giữa mảnh hơn, hai nhánh trong và ngoài phát triển khá dài, mấu nhọn thu hẹp nhỏ lại. Tổng chiều dài móc giữa phía lưng 0,027-0,029 mm; chiều dài phần chính 0,019-0,023 mm, nhánh trong dài 0,014 mm, nhánh ngoài 0,006 mm, mấu nhọn 0,021-0,023 mm.Tổng 33 chiều dài móc giữa phía bụng 0,031-0,043 mm, chiều dài phần chính 0,021-0,027 mm, nhánh trong 0,019-0,021 mm, nhánh ngoài 0,008 mm. Chiều dài ống giao phối 0,0600,073 mm. A Hình 3.6. Trianchoratus gussevi – Tiêu bản và mẫu vẽ. A – Tiêu bản, B – Mẫu vẽ, C – Gai giao cấu, D – Móc. Scale bar = 0,03 mm 3.2.3. Lớp Trematoda 3.2.3.1. Prosorhynchoides ozakii (Hình 3.7) Ngành Platyhelminthes Lớp Trematoda Bộ Plagiorchiida Họ Bucephalidae Giống Prosorhynchoides Dollfus, 1929 Loài Prosorhynchoides ozakii  Vật chủ ký sinh: cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)  Cơ quan ký sinh: Ruột  Đặc điểm hình thái (n=3): thân hình hình bầu dục. Cơ thể dài 0,3 – 1,35 mm, rộng 0,3 – 0,9 mm. Trên vỏ bao có gai xếp thành hàng. Giác bám miệng đơn giản, dài 0,12 – 0,30 mm, rộng 0,14 – 0,20 mm. Miệng ở phần trước cơ thể. Ruột nhỏ, có vị trí ở dưới hầu. Tinh hoàn dài 0,2 – 0,3 mm, rộng 0,1 – 0,2 mm. Buồng trứng ở phía 34 trước tinh hoàn, có chiều dài 0,1 – 0,25 mm. Trứng có chiều dài 0,017 – 0,028 mm, rộng 0,011 – 0,017 mm. Hình 3.7. Prosorhynchoides ozakii – Tiêu bản và mẫu vẽ. A – Giác bám miệng, B – Giác bám bụng, C – Buồng trứng, D – Tinh hoàn, E – Ruột, F – Cực nang. Scale bar = 0,225 mm 3.2.3.2. Allocreadium sp. (Hình 3.8) Ngành: Plathelminthes Schneider, 1873 Lớp: Trematoda Ruldophi, 1808 Bộ: Strigeata, 1937 Họ: Allocreadiidae Stossich, 1903 Giống: Allocreadium Looss, 1900 Loài: Allocreadium sp.  Vật chủ ký sinh: cá rô đồng (Anabas testudineus)  Cơ quan ký sinh: Ruột  Đặc điểm hình thái (n=4): Kích thước cơ thể 1,2-1,8 x 0,4-0,7 mm. Kích thước giác miệng 0,11-0,28 x 0,18-0,26 mm, giác bụng 0,15-0,23 x 0,17-0,24 mm. Kích thước hầu 0,06-0,07 x 0,11-0,12 mm.Kích thước tinh hoàn 0,11-0,17 x 0,18-0,24 mm và 0,160,21 x 0,15-0,23 mm. 35 G Hình 3.8. Allocreadium sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. A – Giác bám miệng, B – Hầu, C – Ruột, D – Giác bụng, E – Buồng trứng, F – Tinh hoàn, G – Cực nang. Scale bar = 0,267 mm  So sánh với loài Allocreadium markewitschi trong nghiên cứu của Hà Ký và ctv (2007). (Bảng 3.4) Bảng 3.4. So sánh giữa nghiên cứu hiện tại và nghiên cứu của Hà Ký và ctv (2007) Allocreadium markewitschi Allocreadium sp. 1,2-2,1 x 0,4-0,7 mm 1,2-1,8 x 0,4-0,7 mm 0,19-0,30 x 0,23-0,32 mm 0,1-0,28 x0,18-0,26 mm Kích thước giác bụng 0,28-0,29 x 0,22-0,34 mm 0,15-0,23 x 0,17-0,24 mm Kích thước hầu 0,06 x 0,07-0,11 mm 0,06-0,07 x 0,11-0,12 mm 0,11-0,19 x 0,15-0,26 mm và 0,11-0,17 x 0,18-0,24 và 0,16- 0,13-0,19 x 0,15-0,24 mm 0,21 x 0,15-0,23 mm Kích thước cơ thể Kích thước giác miệng Kích thước tinh hoàn 36 3.2.3.3. Bucephalus sp. (Hình 3.9) Ngành: Plathelminthes Schneider, 1873 Lớp: Trematoda Ruldophi, 1808 Bộ: Gasterostomata Odhner, 1995 Họ: Bucephalidae Poche, 1907 Giống: Bucephalus Diesing, 1855 Loài: Bucephalus sp.  Vật chủ ký sinh: cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)  Cơ quan ký sinh: Ruột.  Đặc điểm hình thái: Cơ thể có dạng chiếc lá, đối xứng hai bên, dài 0.8 ± 0.1 mm, rộng 0.42 ± 0.16 mm. Giác bám miệng và giác bám bụng hình tròn, nằm ở 2/3 phía trước cơ thể. Giác bám miệng có đường kính 17 μm, đường kính giác bám bụng 5,5 μm, khoảng cách giữa hai giác bám là 41 μm. Buồng trứng khá lớn nằm ở trước hai tinh hoàn, đường kính buồng trứng 12 x 25 μm. Hai tinh hoàn khá lớn, đường kính mỗi tinh hoàn lần lượt là: 14 x 16 μm, 14 x 18 μm. Hình 3.9. Bucephalus sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. A – Giác bám miệng, B – Cực nang, C – Giác bám bụng, D – Tinh hoàn, E – Buồng trứng Scale bar = 0,16 mm 37 3.2.4. Lớp Cestoda - Nematoda – Acanthocephala 3.2.4.1. Camallanus sp. (Hình 3.10) Ngành: Nematheminthes Schneider, 1866 Lớp: Nematoda Ruldophi, 1808 Bộ: Spirudida Chitwood, 1933 Họ: Camallanidae Railiet et Henry, 1915 Giống: Camallanus Baylis et Daubney, 1922 Loài: Camallanus sp.  Vật chủ ký sinh: cá rô đồng (Anabas testudineus)  Cơ quan ký sinh: Ruột  Đặc điểm hình thái (n=3): Kích thước trung bình, biểu bì nhẵn, Có nếp nhăn ngang mịn. Bao miệng là thể đinh ba màu vàng. Từ chỗ bao miệng ở mặt bụng và mặt lưng đi ra 3 nhánh hình tam giác hướng về phía sau (con đực thấy rõ, con cái kém phát triển). Thực quản có phần cơ phía trước ngắn, phần tuyến dài hơn. Mẫu có chiều dài 14,5-19 mm, rộng 0,29-0,32 mm. Túi kitin có 8 hàng “xương sườn” xếp theo chiều dọc. Thực quản phần trước dài 0,330-0,342 mm, phần sau 0,584-0,672 mm. Hình 3.10. Camallanus sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. A – Túi kitin, B – Phần trước thực quản, C – Phần sau thực quản. Scale bar = 2,24 mm 38  So sánh với loài Camallanus anabantis trong nghiên cứu của Hà Ký và ctv (2007). (Bảng 3.5) Bảng 3.5. So sánh giữa Camallanus anabantis và Camallanus sp. Camallanus anabantis Camallanus sp. Kích thước, hình Dài trung bình, biểu bì nhẵn, có Dài trung bình, biểu bì nhẵn, có dáng bên ngoài nếp nhăn ngang mịn nếp nhăn ngang mịn Hình dáng bao Thể đinh ba màu vàng nâu Thể đinh ba màu vàng nâu Có phần cơ phía trước ngắn, Có phần cơ phía trước ngắn, phần phần tuyến dài hơn tuyến dài hơn Chiều dài 13-20 mm 14,5-19 mm Chiều rộng 0,23-0,35 mm 0,29-0,32 mm miệng Thực quản Có 9 hàng “xương sườn” Túi kitin xếp dọc Chiều dài thực quản Phần trước 0,312-0,347 mm Phần sau 0,663-0,757 mm Có 8 hàng “xương sườn” xếp dọc Phần trước 0,330-0,342 mm Phần sau 0,584-0,672 mm 3.2.4.2. Pallisentic sp. (Hình 3.11) Ngành: Acanthocephales Ruldophi, 1808 Lớp: Acanthocephala Ruldophi, 1808 Bộ: Acanthogyrida Thapar, 1927 Họ: Quadrigyridae Van Cleave, 1920 Giống: Pallisentis Van Cleave, 1925 Loài: Pallisentis sp.  Vật chủ ký sinh: cá lóc đồng (Channa striata)  Cơ quan ký sinh: Ruột  Đặc điểm hình thái (n=1): Vòi có 4 vòng móc, mỗi vòng 10 móc. Vòi dài 0,276 mm, rộng 0,271 mm. Vòng gai trên thân sắp xếp gần nhau ở phía trước thân gồm 14 vòng, tiếp đó các vòng xếp thưa hơn, gồm 46 vòng. Tổng chiều dài 7 mm, rộng 0,23 mm. Dài tuyến cổ 2,46 mm. 39 Hình 3.11. Pallisentic sp. – Tiêu bản và mẫu vẽ. Scale bar = 0,2 mm  So sánh với loài Pallisentis ophiocephali và Pallisentis basiri trong nghiên cứu của Hà Ký và ctv (2007), Hisam và ctv (1958) (Bảng 3.6) Bảng 3.6. So sánh giữa Pallisentis ophiocephali, Pallisentis basiri và Pallisentis sp. Pallisentis sp. Pallisentis Pallisentis basiri n. sp. ophiocephali Màu sắc Màu vàng nâu Màu vàng nâu Màu vàng nâu Đặc điểm vòi Có 4 vòng móc, Có 4 vòng móc, mỗi Có 4 vòng móc, mỗi mỗi vòng có 10 vòng có 10 móc vòng có 10 vòng móc móc Đặc điểm vòng gai 14 vòng đầu xếp 8 vòng đầu xếp gần 12 vòng đầu xếp gần phần đầu phía gần nhau, 38 nhau, 30 – 35 vòng nhau, 38 vòng tiếp theo trước vòng tiếp theo tiếp theo xếp thưa xếp thưa hơn xếp thưa hơn 0,242 x 0,221 0,195x0,195 mm 1,95x0,14 mm Kích thước vòi mm Dài tuyến cổ 1,24 mm 1,624 mm 0,27 mm Kích thước cơ thể 7,8x0,23 mm 5-6 x 0,28-0,35 mm 8,28 x 0,24 mm 40 3.2.4.3. Bothriocephalus acheilognathi (Hình 3.12) Ngành: Plathelminthes Schneider, 1873 Lớp: Cestoda Rudolphi, 1808 Bộ: Pseudophyllidae Carus, 1863 Họ: Bothriocephalidae Giống: Bothriocephalus Loài: Bothriocephalus acheilognathi  Vật chủ ký sinh : cá mè vinh (Barbonymus gonionotus)  Cơ quan ký sinh: Ruột  Đặc điểm hình thái (n=3): Đầu hình quả mận, dài 0,12 mm, rộng 0,8 mm. Chiều dài trước 2 mm. Cơ thể có tổng cộng 321 đốt, trong đó 161 đốt tính từ đuôi đến giữa thân, mỗi đốt có 20-30 trứng.Tinh hoàn rải rác khắp hai bên cơ thể. Hình 3.12. Bothriocephalus acheilognathi – Tiêu bản và mẫu vẽ. Scale bar = 0,12 mm 41  So sánh với loài Bothriocephalu acheilognathi trong nghiên cứu của Choudhury và ctv (2013) (Bảng 3.7) Bảng 3.7. So sánh giữa nghiên cứu Choudhury và ctv (2013) với nghiên cứu hiện tại Bothriocephalu acheilognathi Choudhury và ctv (2013) Nghiên cứu hiện tại Chiều dài đầu 0,1 mm 0,12 – 0,15 mm Chiều rộng đầu 0,7 mm 0,8 – 0,9 mm Chiều dài trước 2 mm 1,7 – 1,9 mm 3.2.4.4. Cucullanus chabaudi (Hình 3.13) Ngành: Nematheminthes Schneider, 1886 Lớp: Nematode Ruldophi, 1808 Bộ: Spirudia Chitwood, 1933 Họ: Cucullanidae Cobbold, 1864 Giống: Cucullanus Muller, 1777 Loài: Cucullanus chabaudi Hoa, 1967 Vật chủ ký sinh: Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Cơ quan ký sinh: Ruột Đặc điểm hình thái (n=3): Kích thước tương đối lớn, có thể thấy bằng mắt thường. Cơ thể thon dài; hơi uốn cong. Xoang miệng cứng, có hai phiến bằng kitin, vách của khoang miệng có một dây cơ thể xếp song song với cơ thể. Sau khoang miệng là thực quản, ruột giữa, ruột sau, thực quản có thành cơ từng đối khỏe và phình to thành bầu thực quản. Mặt lưng và mặt bụng của túi miệng có 3 nhánh răng bằng chất kitin. Chiều dài thân: 12,4 ± 2,4 mm, chiều rộng thân 0,36 ± 0,31 mm, chiều dài thực quản 1,32 ± 0,1 mm, chiều dài đuôi 0,34 mm. 42 A B Hình 3.13. Cucullanus chabaudi. A – Thực quản, B – Bầu thực quản. Scale bar = 1,58 mm 43 3.3. Nghiên cứu di truyền các loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt 3.3.1. Khuếch đại đoạn gen 28S rDNA Các loài ký sinh trùng được tách DNA và dùng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại gen 28S rDNA. Theo lý thuyết , khi sử dụng cặp mồi C1, D2 và cặp mồi LSU-5, 1500R của gen 28S rDNA, sản phẩm PCR thu được là đoạn DNA có kích thước ~ 900 bp. Kết quả khuếch đại được hiển thị trên Hình 3.14. Sản phẩm điện di là một băng đậm nét có kích thước phù hợp với lý thuyết. 3000 bp 1500 bp 1000 bp Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 28S rDNA của các loài monogenea và digenea trong nghiên cứu 3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài của các loài Monogenea và Digenea 3.3.2.1. Cây phát sinh loài đối với các loài Monogenea dựa vào trình tự gen 28S rDNA Phân tích mối quan hệ phát sinh loài được tiến hành dựa trên trình tự gen 28S rDNA của 16 loài monogenea (trong đó 3 loài nghiên cứu hiện tại và 13 loài trên Genbank). Thông tin các trình tự được trình bày trong Bảng 3.8. 44 Bảng 3.8. Thông tin các trình tự monogenea sử dụng trong nghiên cứu Loài ký sinh trùng Tác giả Vị trí Mã số GenBank Thaparocleidus Nghiên cứu hiện tại Đồng Tháp Nghiên cứu hiện tại Đồng Tháp Nghiên cứu hiện tại Khánh Hòa Thaparocleidus Rajvanshi và Ấn Độ JX947852 siamensis GB Agrawal (2012) Thaparocleidus Wu và ctv (2006) Unknown EF100546 Thaparocleidus Rajvanshi và Ấn Độ JX960419 indicus GB Agrawal (2012) Thaparocleidus Rajvanshi và Ấn Độ KC962229 gomtius GB Agrawal (2013) Trianchoratus Ding và Liao (2003) Trung Quốc AY841875 Tan và ctv (2010) Malaysia HQ719215 Tan và ctv (2010) Malaysia HQ719218 Tan và ctv (2010) Malaysia HQ719220 Tan và ctv (2010) Malaysia HQ719219 Dash và ctv (2013) Ấn Độ KC687091 Simkova và ctv Cộng Hòa Séc AJ969946 siamensis Thaparocleidus campylopterocirrus Trianchoratus gussevi campylopterocirrus GB gussevi GB Trianchoratus ophicephali GB Trianchoratus malayensis GB Trianchoratus longianchoratus GB Trianchoratus pahangensis GB Dactylogyrus catlaius GB Dactylogyrus 45 hemiamphibothrium GB (2005) Dactylogyrus Simkova và ctv cryptomeres GB (2005) Dactylogyrus Simkova và ctv inexpectatus GB (2005) Gyrodactylus Zietara và Lumme sprostonae GB (2003) Cộng Hòa Séc AJ969947 Cộng Hòa Séc AJ969945 Ba Lan AY278044 Xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Likelihood (Phần mềm MEGA ver. 6) và trình tự tương đồng được thể hiện trong Bảng 3.9. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài ở Hình 3.15. Bảng 3.9. Trình tự tương đồng của các loài monogenea 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0,978 0,978 0,969 0,969 0,902 0,857 0,857 0,838 0,838 0,832 0,829 0,826 0,832 0,832 0,841 1.000 0,972 0,972 0,896 0,869 0,869 0,844 0,844 0,838 0,835 0,823 0,829 0,829 0,838 0,972 0,972 0,896 0.869 0,869 0,844 0,844 0,838 0,835 0,823 0,829 0,829 0,838 1.000 0,884 0,854 0,854 0,829 0,829 0,823 0,820 0,817 0,817 0,814 0,823 0,884 0,854 0,854 0,829 0,829 0,823 0,820 0,817 0,817 0,814 0,823 0,857 0,857 0,844 0,851 0,857 0,848 0,838 0,841 0,838 0,848 1.000 0,957 0,963 0,963 0,960 0,857 0,863 0,866 0,863 0,957 0,963 0,963 0,960 0,857 0,863 0,866 0,863 0,987 0,981 0,990 0,857 0,854 0,863 0,866 0,987 0,990 0,857 0,860 0,863 0,872 0,990 0,866 0,863 0,869 0,869 0,857 0,857 0,863 0,863 0,920 0,933 0,917 0,957 0,954 10 11 12 13 14 15 0,945 16 ***Chú thích: 1. Thaparocleidus indicus GB, 2. Thaparocleidus siamensis GB, 3. Thaparocleidus siamensis, 4. Thaparocleidus campylopterocirrus, 5. Thaparocleidus campylopterocirrus GB, 6. Thaparocleidus gomtius GB, 7. Trianchoratus gussevi GB, 8. Trianchoratus gussevi, 9. Trianchoratus longianchoratus GB, 10. Trianchoratus malayensis GB, 11. Trianchoratus ophicephali GB, 12. Trianchoratus pahangensis GB, 13. Dactylogyrus catlaius GB, 14. Dactylogyrus cryptomeres GB, 15. Dactylogyrus hemiamphibothrium GB, 16. Dactylogyrus inexpectatus GB. Các loài monogenea được sử dụng trình tự gen 28S rDNA có sự khác biệt dao dộng trong khoảng 1,3 – 18,6 % (Bảng 3.9) . Riêng với các loài trong nghiên cứu hiện tại 46 (Thaparocleidus siamensis, Thaparocleidus campylopterocirrus và Trianchoratus gussevi) có quan hệ gần gũi với nhau và trình tự tương đồng với các loài Thaparocleidus siamensis, Thaparocleidus campylopterocirrus và Trianchoratus gussevi trên Genbank là 100%. Hình 3.15. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài monogenea ***Chú thích: Sử dụng phần mềm MEGA 6.1 (bootstrap 1000) với thuật toán Maximum Likelihood. Loài có kí hiệu GB được lấy từ GenBank. Gyrodactylus sprostonae được sử dụng làm nhóm ngoại. Cây phát sinh loài trình tự gen 28S rDNA của các loài monogenea (Hình 3.15.) cho thấy các loài thuộc họ Ancyrocephalidae và Dactylogyridae cùng nằm trên một nhánh đồng dạng (monophyly). Cây phát sinh chia làm hai nhóm chính. Nhóm 1 bao gồm các loài thuộc họ Ancyrocephalidae. Nhóm 2 gồm các loài thuộc họ Dactylogyridae (giống Dactylogyrus). Nhóm 1 được chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm 1.1 gồm các loài thuộc giống Thaparocleidus, nhóm 1.2 gồm các loài thuộc giống Trianchoratus. Palmero và ctv (2015) đã nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của các loài monogenea từ các loài cá da trơn ở Cộng hòa Séc. Tác giả đã ghi nhận sự tương đồng trình tự gen 28S rDNA của các loài thuộc giống Dactylogyrus, Thaparocleidus và cho thấy các họ thuộc loài này có quan hệ gần gũi với nhau trên cây phát sinh loài thông qua họ Dactylogylidae 47 và Ancyrocephalidae. Kết quả hiện tại có điểm tương tự với nghiên cứu trên là các loài thuộc giống Dactylogyrus và Thaparocleidus có quan hệ gần gũi với nhau. Tan và ctv (2011) cũng đã ghi nhận kết quả tương tự của tác giả trên khi khảo sát mối quan hệ phát sinh loài của các loài monogenea thuộc giống Heteronchocleidus, Eutrianchoratus và Trianchoratus từ dữ liệu trình tự gen 28S rDNA. Mặt khác, khi xây dựng cây phát sinh loài của các loài thuộc giống trên, nhóm tác giả cũng cho thấy được mối quan hệ gần gũi của các loài thuộc giống Trianchoratus và Thaparocleidus hơn là đối với loài thuộc giống Dactylogyrus. Nghiên cứu hiện tại ghi nhận kết quả này tương tự với kết quả trên về sự sắp xếp hay mức độ gần gũi của các loài trong cây phát sinh loài. Các kết quả trên cũng được ghi nhận trong báo cáo của Andrea và ctv (2004); Laetitia và ctv (2004). 3.3.2.2. Cây phát sinh loài đối với các loài digenea dựa vào trình tự gen 28S rDNA Tương tự với monogenea, cây phát sinh loài dựa vào trình tự của 16 loài digenea với 3 loài trong nghiên cứu hiện tại và 13 loài trên Genbank. Thông tin các trình tự được trình bày trong Bảng 3.10. Bảng 3.10. Thông tin các trình tự digenea sử dụng trong nghiên cứu Loài ký sinh trùng Tác giả Vị trí Mã số GenBank Allocreadium sp. Nghiên cứu hiện tại Khánh Hòa Bucephalus sp. Nghiên cứu hiện tại Đồng Tháp Prosorhynchoides sp. Nghiên cứu hiện tại Cần Thơ Rhipidocotyle Petkeviciute và ctv Ukraina KF184356 campanula GB (2013) Rhipidocotyle Stunzenas và ctv Lithuania KM068119 fennica GB (2014) Bucephalus Petkeviciute và ctv Lithuana JQ346717 polymorphus GB (2012) Prosorhynchoides Baha và ctv (2011) Nhật Bản AB640885 ozakii GB 48 Allocreadium Petkeviciute và ctv Nga GU462126 isoporum GB (2010) Allocreadium Curran và ctv (2006) Hoa Kỳ EF032693 Lee và ctv (2007) Unknown EF654661 Centrocestus Thaenkham và ctv Thái Lan HQ874609 formosanus GB (2011) Haplorchis Thaenkham và ctv Thái Lan HM004191 pumilo GB (2010) Haplorchis Thaenkham và ctv Thái Lan HM004192 yokogawai GB (2010) Haplorchis Thaenkham và ctv Thái Lan HM004187 taichui GB (2010) Metorchis Ai và ctv (2010) Trung Quốc HM347224 Procerovum Thaenkham và ctv Thái Lan HM004182 varium GB (2010) Procerovum Thaenkham và ctv Thái Lan HM004179 cheni GB (2010) markewitschi GB Clonorchis sinensis GB orientalis GB Xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Likelihood (Phần mềm MEGA ver. 6) và trình tự tương đồng được thể hiện trong Bảng 3.11. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài ở Hình 3.16. 49 Bảng 3.11. Trình tự tương đồng của các loài digenea 1 1 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0,970 0,967 0,898 0,897 0,871 0,872 0,820 0,838 0,818 0,819 0,818 0,815 0,816 0,828 0,828 0,997 0,902 0,903 0,869 0,872 0,814 0,833 0,816 0,813 0,812 0,808 0,809 0,829 0,832 0,904 0,906 0,871 0,875 0,813 0,833 0,816 0,813 0,812 0,808 0,809 0,832 0,834 0,998 0,946 0,945 0,827 0,825 0,820 0,820 0,818 0,815 0,816 0,886 0,888 0,945 0,944 0,828 0,826 0,822 0,822 0,819 0,816 0,817 0,885 0,887 0,994 0,834 0,835 0,822 0,825 0,819 0,819 0,820 0,928 0,925 0,833 0,832 0,822 0,825 0,819 0,819 0,820 0,922 0,920 0,943 0,920 0,927 0,925 0,933 0,934 0,835 0,834 0,922 0,929 0,932 0,935 0,937 0,835 0,830 0,954 0,964 0,961 0,960 0,822 0,824 0,961 0,982 0,981 0,828 0,830 0,970 0,971 0,829 0,829 0,998 0,829 0,832 0,830 0,833 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0,988 16 ***Chú thích: 1. Allocreadium isoporum GB, 2. Allocreadium markewitschi GB, 3. Allocreadium sp., 4. Prosorhynchoides ozakii GB, 5. Prosorhynchoides sp., 6. Rhipidocotyle campanula GB, 7. Rhipidocotyle fennica GB, 8. Centrocestus formosanus GB, 9. Clonorchis sinensis GB, 10. Haplorchis pumilio GB, 11. Haplorchis taichui GB, 12. Haplorchis yokogawai GB, 13. Procerovum cheni GB, 14. Procerovum varium GB, 15. Bucephalus sp., 16. Bucephalus polymorphus GB. Các loài digenea được sử dụng trình tự gen 28S rDNA có sự khác biệt dao dộng trong khoảng 0,2 – 19,2 % (Bảng 3.11) . Loài Allocreadium sp. trong nghiên cứu hiện tại có quan hệ gần gũi với với loài Allocreadium markewitschi trên Genbank (sự khác biệt trình tự là 0,3%) dù nằm trong cùng một nhánh nhưng chúng thể hiện là 2 loài khác nhau thuộc cùng một giống (BT 98%). Tương tự đối với loài Prosorhynchoides sp. và Bucephalus sp. (sự khác biệt trình tự là 0,2 % và 1,2%). 50 Hình 3.16. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài digenea ***Chú thích: Sử dụng phần mềm MEGA 6.1 (bootstrap 1000) với thuật toán Maximum Likelihood. Loài có kí hiệu GB được lấy từ GenBank. Metorchis orientails được sử dụng làm nhóm ngoại. Cây phát sinh loài trình tự gen 28S rDNA của các loài digenea (Hình 3.16.) được chia làm 2 nhóm chính. Nhóm 1 gồm 2 nhánh nhỏ: nhóm 1.1 gồm các loài thuộc họ Bucephalidae, nhóm 1.2 gồm các loài thuộc họ Allocreadiidae. Nhóm 2 bao gồm các loài thuộc họ Opisthorchiidae, Heterophyidae và được chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm 2.1 gồm các loài thuộc giống Haplorchis và Procerovum , nhóm 2.2 gồm các loài thuộc giống Centrocestus và Clonorchis. Nhiều báo cáo về sự đa dạng di truyền cũng như mối quan hệ phát sinh loài của các loài thuộc giống Allocreadium, Prosorhynchoides và Bucephalus riêng rẽ, nhưng đối với mối quan hệ phát sinh loài của 3 giống trên thể hiện chung trong cây phát sinh loài vẫn còn giới hạn. Olson và ctv (2003), tác giả đã xây dựng cây phát sinh loài của 163 loài digenea dựa vào gen 28S rDNA. Kết quả nghiên cứu cho thấy được mối quan hệ phát sinh loài cũng như mối quan hệ gần gũi của 77 họ digenea. Đồng thời thể hiện được các loài thuộc họ Bucephalidae không có quan hệ gần gũi với họ Allocrediidae. Hơn nữa, đối với giống Prosorhynchoides, tác giả cũng đã cho thấy được mối quan hệ gần gũi của giống này với giống Rhipidocotyle 51 hơn là giống Bucephalus. Kết quả này có điểm tương tự với kết quả trong nghiên cứu hiện tại, nhưng vẫn có sự khác biệt khi các loài thuộc giống Prosorhynchoides đều nằm cùng nhánh với các loài thuộc giống Rhipidocotyle và Bucephalus. Đồng thời khi xây dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen ITS rDNA và 28S rDNA, Curran và ctv (2006) cũng cho thấy mối quan hệ gần gũi của loài thuộc giống Allocredium với giống Prosthenhystera thuộc họ Callodistomidae hơn các họ khác khi phân tích mối quan hệ phát sinh loài. Besprozvannykh và ctv (2012) đã chỉ ra được mối quan hệ gần gũi của các loài thuộc họ Allocrediidae với họ Monochiidae và Lissorchiidae ở Nga. Loài Clonorchis sinensis và Centrocestus formosanus thuộc cùng 1 họ Opisthorchiidae nhưng lại không nằm trên cùng một nhánh mà tách riêng ra cho thấy sự không phù hợp giữa phân loại dựa trên hình thái và di truyền. Hơn nữa, ở mức độ giống Haplorchis và Procerovum cũng cho thấy sự thiếu phân tách dựa vào đặc điểm di truyền. Điều này chứng tỏ các loài này có quan hệ gần gũi với nhau. 52 KẾT QUẢ VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Dựa vào các đặc điểm hình thái và di truyền, nghiên cứu đã phân loại được 13 loài ký sinh trùng (6 loài ngoại ký sinh trên mang, 7 loài nội ký sinh ở ruột) trên các loài cá nước ngọt. Trong đó, 7 loài ký sinh trùng được phân loại đến mức độ loài gồm Bothriocephalus acheilognathi, Thaparocleidus campylopterocirrus, Thaparocleidus vietnamensis, Thaparocleidus siamensis, Prosorhynchoides ozakii, Cucullanus chabaudi, Trianchoratus gussevi. Tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm có sự dao động giữa các loài và trên các vật chủ khác nhau. Tỉ lệ nhiễm cao nhất là loài Pallisentic sp. (81,67%) trên cá lóc đồng, cường độ nhiễm cao nhất là loài Thaparocleidus campylopterocirrus (7) trên cá mè vinh. Loài Ichthyophthyrius sp. trên cá rô đồng có cùng cường độ nhiễm và tỉ lệ nhiễm thấp nhất (2,9% và 1). Sử dụng đoạn gen 28S rDNA, nghiên cứu tập trung thực hiện xây dựng cây phát sinh loài cho 3 loài monogenea (Thaparocleidus siamensis, T. campylopterocirrus và Trianchoratus gussevi) và 3 loài digenea (Bucephalus sp., Prosorhynchoides sp. và Allocreadium sp.) trong nghiên cứu. Mục tiêu của việc xây dựng cây phát sinh loài nhằm khảo sát mối quan hệ di truyền của các loài ký sinh trùng trong nghiên cứu với các loài ký sinh trùng đã được ghi nhận trên cá nước ngọt. Kết quả cho thấy sự tương đồng của phân loại hình thái và di truyền ở các loài ký sinh trùng ghi nhận trong nghiên cứu. Vị trí trong cây phát sinh loài của các loài có độ chính xác cao. Tuy nhiên, các loài ấu trùng sán lá song chủ (Clonorchis sinensis, Centrocestus formosanus, Haplorchis spp., Procerovum spp.) cho thấy sự thiếu phân tách dựa vào đặc điểm di truyền. Qua những kết quả của nghiên cứu hiện tại cần có các kế hoạch thu mẫu với số lượng mẫu nhiều hơn, tiến hành thu tại nhiều khu vực và vào những mùa khác nhau để đánh giá đầy đủ sự biến động tỉ lệ nhiễm, cường độ nhiễm và thành phần loài ký sinh trùng trên cá. Cần sử dụng thêm các chỉ thị phân tử khác để có thêm các căn cứ đánh giá chính xác hơn về mối quan hệ phát sinh loài. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1) Bộ Nông nghiệp & PTNT (2009). Kỹ thuật nuôi cá rô đồng (Anabas testudineus Bloch, 1792). Nhà Xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 2) Bộ Thủy sản (2007). Một số loài cá nước ngọt thường gặp ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 42. 3) Bùi Quang Tề (2001). Ký sinh trùng của một số loài cá nước ngọt đồng bằng sông Cửu Long và các giải pháp phòng trị chúng. Luận án tiến sĩ. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 4) Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 5) Hà Ký & Bùi Quang Tề (2007). Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 6) Hà Ký, Bùi Quang Tề (2007). Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 7) Nguyễn Chung (2000). Kỹ thuật sinh sản và nuôi cá tra. NXB Nông Nghiệp. 8) Nguyễn Thị Thu Hằng, Đặng Thụy Mai Thy, Nguyễn Thanh Phương và Đặng Thị Hoàng Oanh (2008). Khảo sát sự nhiễm ký sinh trùng trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở tỉnh An Giang. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 1, 204-212. 9) Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà & Jong-yil Chai (2008). “Sán lá ruột ký sinh trên người ở Việt Nam”. FIBOZOPA, tr. 4. 10) Nguyễn Văn Đức và cộng sự (2011). Tình hình nhiễm ký sinh trùng ở cá sông Lam, huyện Đô Lương, tỉnh Nghệ An. Tạp chí Sinh Học, 33(3), tr. 9-14. 11) Nguyễn Văn Thường (2008). Tổng quan dẫn liệu về định loại cá Tra Pangasianodon hypophthalmus phân bố ở vùng hạ lưu sông Mê Kông. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. 12) Phạm Đình Văn (2010). Điều tra thành phần loài và xây dựng bộ mẫu về các loài cá có giá trị kinh tế trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp. Luận văn thạc sỹ, Đại học Đồng Tháp. 54 bệnh trên cá lóc (Channa striata) nuôi ao thâm canh ở An Giang và Đồng Tháp. Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ, 21b, 124-132. 13) Phạm Văn Khánh (2000). Kỹ thuật nuôi cá tra và cá basa trong bè. NXB Nông Nghiệp. 14) Quyết định 1291/QĐ-TTg. Quyết định: Phê duyệt Kế hoạch hành động phát triển ngành công nghiệp chế biến nông, thủy sản thực hiện Chiến lược công nghiệp hóa của Việt Nam trong khuôn khổ hợp tác Việt Nam-Nhật Bản hướng đến năm 2020, tầm nhìn 2030. Hà Nội, 01/08/2014. 15) Trần Nam Hà và Trương Thị Hoa (2011). Nghiên cứu một số bệnh phổ biến do ký sinh trùng gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer nuôi tại Thừa Thiên Huế và biện pháp trị bệnh. Trường Đại học Nông Lâm Huế. 16) Vũ Đặng Hạ Quyên, Đặng Thúy Bình, Đào Thị Hàn Ly và Phạm Thị Diệu Anh (2014). Nghiên cứu thành phần ký sinh trùng trên cá Tra Pangasianodonn hypophthamus, 1978 bằng phương pháp hình thái và di truyền. Tạp chí Sinh Học, 36(1se), 138-144. Tài liệu Tiếng Anh 17) Ahmed và Ezaz (1997). Diversity of Helminth parasites in the freshwater catfish of Bangladesh. Department of Zoology, University of Dhaka, Dhaka- 1000, Bangladesh. 18) Andrea, I., Serge, M., Jobet, E., Gelnal, M., & Verneau, O. (2004). Molecular phylogeny of congeneric monogenean parasites (Dactylogyrus): a case of intrahost speciation, evolution, 58(5), 1001-1018. 19) Anindo, C., Shuai, Z., Gerardo, P. D. L., Andres, M. A., Chase, B. & Eric, G. (2013). The invasive Asian fish tapeworm, Bothriocephalus acheilognathi Yamaguti, 1934, in the Chagres River/Panama Canal drainage, Panama. BioInvasions Records, 2(2), 99-104. 20) Ballard & Whitlock (2004). The incomplete natural history of mitochodrya. Molecular Ecology. 13(4), 729 – 744. 21) Barakbah A. (2007). Encyclopedia of Midwife Melayu. Kuala Lumpur: Nona Roguy/Utusan Melayu Publications. 55 22) Benziger A, Philip S, Raghavan R, Anvar Ali PH, Sukumaran M, Tharian JC, Dahanukar N, Baby F, Peter R, Rema Devi K, Radhakrishnan KV, Haniffa MA, Britz R, Antunes A (2011). Unravelling a 146 years Old Taxonomic Puzzle: Validation of Malabar Snakehead, Speciesstatus and its relevance for Channid Systematics and Evolution. PloSONE, 6(6), e21272. 23) Besprozvannykh, V. V., Ermolenko, A. V., Atopkin, D. M. (2012). The life cycle of Asymphylodora perccotti sp. n. (Trematoda: Lissorchiidae) in the Russian Southern Far East, Parasitology International ,61, 235–241 24) Bhuiyan A. I., Bushra J. and Ghani O. (2014). Abundance and distribution of endoparasitic helminths in Anabas testudineus (Bloch, 1792) from a polluted beel of Bangladesh. Bangladesh J. Zool, 42(1), 1-10. 25) Binky K., M. Shomorendra and Devashish Kar (2011). Nematode Parasites of Karbhala Wetland in Silchar Assam. Biological Forum – An International Journal, 3(2), 18-21. 26) Chaiyapo M., Wongsawad C. and Wongsawad P. (2007). Diversity of helminths found in Channid fishes from Bung Boraphet. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 38, 191-193. 27) Chaudhary A. & Singh H. S. (2012). Phylogenetic study of nine species of freshwater monogeneans using secondary structure and motif prediction from India. Bioinformation, 8(18), 862-869. 28) Chaudhary A., Verma C., Varma M. and Hridaya S. Singh (2014). Identification of Thaparocleidus caecus (Mizelle & Kritsky, 1969) (Monogenea: Dactylogyridae) using morphological and molecular tools: a parasite invasion in Indian freshwater. BioInvasions Records, 4(3), 195-200. 29) Choudhury, A., Zheng, S., León, G. P. De, & Martínez-aquino, A. (2013). The invasive Asian fish tapeworm , Bothriocephalus acheilognathi Yamaguti , 1934 , in the Chagres River / Panama Canal drainage , Panama. BioInvasion Records, 2(2), 99– 104. 56 30) Curran, S. S., Tkach, V. V., Overstreet, R. M. A Review of Polylekithum Arnold 1934 and Its Familial Affinities Using Morphological and Molecular Data, with description of Polylekithum catahoulensis sp. nov., Acta Parasitologica, 51(4), 238–248. 31) Dahlan-Daud CK, Mat Jais AM, Ahmad Z, Md Akim A & Adam A. (2010). Amino and fatty acids composition in haruan traditional extract. Boletin Latino-americano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromaticas, 9(5), 414- 429. 32) Das D. and Goswami M. M. (2014). Helminth infection in Anabas testudineus of three wetlands of Goalpara, Assam. Journal of Applied and Natural Science, 6(2), 677-679. 33) Dian, G., Gui, T. W., Bing, W. X., Wei, J. Y. & Pin, N. (2008). A New Species of Allocreadium (Trematoda: Allocreadiidae) from Freshwater Fishes in the Danjiangkou Reservoir in China. Journal of Parasitology, 94(1), 176-180. 34) Dinh T.T., Kania P., Buchmann K. (2010). Infection of zoonotic trematode metacercariae in Sutchi catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in Vietnam: Associations with season, management and host age. Aquaculture, 302, 19–25. 35) Dinh T.T., Buchmann K., (2008). Infections with gill parasitic monogeneans Thaparocleidus siamensis and T. caecus in cultured Catfish Pangasius hypophthalmus in Southern Vietnam, Bull. Eur. Ass. Fish Pathol, 28(1), 10-15. 36) Gam LH, Leow CY, Baie S. (2005). Amino acid composition of Snakehead fish (Channa striatus) of various sizes obtained at different times of year. Malaysian Journal of Pharmaceutical Sciences, 3(2), 19-30 37) Guarro, J., GenéJ, & Stchigel, a M. (1999). Developments in fungal taxonomy. Clinical microbiology reviews, 12(3), 454–500. 38) Hassouna N., Michot B., Bachellerie J. P. (1994). The complete nucleotide sequence of mouse 28S rRNA gene. Implications for the process of size increase of the large subunit rRNA in higher eukaryotes. Nucleic Acids Res, 12, 3563–3583. 39) Hisam U. Farooqi (1958). A new species of the genus Pallisentics from a fresh – water fish. Z. f. Parasitenkunde, Bd. 18, S. 457 – 456. 40) Hossain MK, Latifa GA & Rahman MM (2008). Observations on induced breeding of snakehead murrel, Channa striatus (Bloch, 1793). Int J Sustain Crop Prod ,3: 65-68. 57 41) Laetitia, P., Timothy, D., Littlewood, J., Olson, S., & Morand, S. (2004). Molecular phylogeny of gill monogeneans (Platyhelminthes, Monogenea, Dactylogyridae) and colonization of Indo-West Pacific butterflyfish hosts (Perciformes, Chaetodontidae), Zoologica Scripta, 425-436. 42) Luangphai, P., Chalobol Wongsawad, Kanda Kumchoo and Pralongyrut Sripalwit (2004). Survey of helminths in climbing perch (Anabas testudineus) from San Sai District, Chiang Mai Province. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 35, 288290. 43) Luangphai, P., Chalobol, W., Kanda, K. & Pralongyut, S. (2003). Survey Of Helminths In Climbing Perch (Anabas Testudineus) From San Sai District, Chiang Mai Province. Department of Biology, Thailand, 288-290. 44) Mat Jais AM, Matori MF; Kittakoop P, Suwanborirux K. (1998). Fatty acid composition in mucus and roe of Haruan, Channa striatus, for wound healing. General Pharmacology: The Vascular System, 30(4), 561-563. 45) Mekong River Commission (2013). A guide to larve and juveniles of some common fish species from the Mekong River Basin. MRC Technical Paper, 38, p.40. 46) Mohsin AK, Ambak MA. (1983). Freshwater fishes of Peninsula Malaysia. University Putra Malaysia, Serdang, Malaysia,157–161. 47) Nguyen, V. D. (2004). "Fish-borne trematodes in Vietnam". The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 33, 299–301. 48) Olson, P.D., Cribb, T.H., Tkach, V.V., Bray, R.A., Littlewood, D.T.J. (2003). Phylogeny and classification of the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda), International Journal for Parasitology, 33, 733–755. 49) Olson, P. D., Cribb, T. H., Tkach, V. V., Braya, R. A., & Littlewood, D. T. J. (2013). Phylogeny and classification of the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda). International Journal for Parasitology, 33(7), 733-755 50) Omar, M. A., Richard, A. H., Nguyen, V. H. (2004). On The Immature Stages Of Pallisentis (Pallisentis) Celatus (Acanthocephala: Quadrigyridae) From Occasional Fish Hosts In Vietnam. The Raffles Bulletin Of Zoology, 52(2), 593 – 598. 58 51) Paiboon - Yutisri & Apirum – Thuhanruksa (1985). Parasites fauna of Oxyeleotris marmoratus (Bleeker) from some natural water resource at Amphoe Pra Nakhon Si Ayutthaya, Thailand”, 122-123. 52) Palmero, C., Costa, L., & Scholz, T. (2015). Molecular phylogeny of Neotropical monogeneans (Platyhelminthes: Monogenea) from catfishes (Siluriformes), Parasites & Vectors,1-11. 53) Pariselle A., Lim L.H.S. & Lambert A. (2002). Monogenea from Pangasiidae (Siluriformes) in Southeast Asia: III. Five new species of Thaparocleidus Jain, 1952 (Ancylodiscoididae) from Pangasius bocourti, P. djambal and P. hypophthalmus. Parasite, 9, 207-217. 54) Poulsen, Hortle, A.F., Hortle, K.G., Jorgensen, V. J., Chan, S., Chhuon, C. K. & Tran, Q. B. (2005). Distribution and Ecology of Some Important Riverine Fish Species of the Mekong River Basin. MRC Technical Paper No. 10, (10), P. 74–76. 55) Pudjirahaju, W. (1992). Fermentation technology of fishery products. PAU- BogorAgricultural Institute, Indonesian. 56) Rahman, A.K.A. (1989). Freshwater fishes of Bangladesh, Zoological Society of Bangladesh. Department of Zoology, University of Dhaka, p. 364. 57) Rainboth, W.J. (1996). Fishes of the Cambodian Mekong. FAO Species Identification Field Guide for Fishery Purposes. FAO, Rome, p. 265. 58) Sinh LX, Pomeroy RS (2010). Farming of Snakehead Fish (Channa micropeltes and Channa striatus) in Mekong Delta of Vietnam, World Aquaculture, San Diego. California Abstract, p. 953. 59) Sokheng C., Chhuon Kim Chhea, S. Viravong, K. Bouakhamvongsa, U. Suntornratana, N. Yoorong, Nguyen Thanh Tung, Tran Quoc Bao, A.F. Poulsen and J. Valbo Jørgensen. (1999). Fish migrations and spawning habits in the Mekong mainstream: a survey using local knowledge (basin-wide). Assessment of Mekong fisheries: Fish Migrations and Spawning and the Impact of Water Management Project (AMFC). AMFP Report 2/99, Vientiane, Lao, P.D.R. 59 60) Song C. B., Near T. J. and Page L. M. (1998). Phylogenetic Relations among Percid Fishes as Inferred from Mitochondrial Cytochromed DNA Sequence Data. Molecular Phylogenetics and Evolution, 10(3), 343 – 573. 61) Taki, Y. (1978). An analytical study of the fish fauna of the Mekong basin as a biological production system in nature. Research Institute of Evolutionary. Biology Special Publications, Tokyo, Japan, no. 1, p.77. 62) Tan, W.B. & Lim, L.H.S. (2009). Trianchoratus longianchoratus sp. n. (Monogenea: Ancyrocephalidae: Heteronchocleidinae) from Channa lucius (Osteichthyes: Channidae) in Peninsular Malaysia. Folia Parasitologica, 56(3), 180–184. 63) Tan, W. B., Fong, M. Y., Lim, L. H. S. (2011). Relationships Of The Heteronchocleidids (Heteronchocleidus, Eutrianchoratus And Trianchoratus) As Inferred From Ribosomal Dna Nucleotide Sequence Data, The Raffles Bulletin Of Zoology, 59(2), 127–138. 64) Tang, F.H., Zhao Y.J., Alan, W. (2013). Phylogenetic Analyses of Trichodinids (Ciliophora, Oligohymenophora) Inferred from 18S rRNA Gene Sequence Data. Curr Microbiol, 66, 06–313. 65) Thaenkham, U., Dekumyoy, P., Komalamisra, C., Sato, M., Dung, D. T., Waikagul, J. (2010). Systematics of the subfamily Haplorchiinae (Trematoda: Heterphyidae), based on nuclear ribosomal DNA genes and ITS2 region. Parasitology International, 59, 460–465 66) Van Thi Phan, Annette Kjær Ersbøll, Te Quang Bui, Hang Thi Nguyen, Darwin Murrell and Anders Dalsgaard (2010). Fish-Borne Zoonotic Trematodes in Cultured and Wild-Caught Freshwater Fish. VECTOR-BORNE AND ZOONOTIC DISEASES, 10(9). 67) Verma C., Chaudhary A. and Singh H. S. (2012). PCR – based molecular characterization, phylogenetic analysis and secondary structure of the 28S rDNA of Thaparocleidus wallagonius (Monogenea: Dactylogyridae) – the most primitive species of this genus from India. Bioinformation, 8(17), 816 – 819. 60 68) Vishwananth, W., Geetakumari Kh. (2009). Diagnosis and interrelationships of fishes of the genus Channa Scopoli (Teleostei: Channidae) of northeastern India. Journal of Threatened Taxa, 1(2), 97-105. 69) Wahab A Rahman and Mutaqin Barki (2008). Short communication on the endoparasitic fauna of some paddy-field fishes from Kedah, Peninsular Malaysia. Journal of Bioscience, 19(2), 107-112. 70) White, T. J., Burns, T., Lee, S., & Taylor, J. (1989). Apmlication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA gens for Phylogenetic. Genectic and Evollution (part three). P.315 – 320 71) World Health Organization (2004). Joint Who/FAO workshop on foodborne trematode infections in Asia. Ha Noi, Vietnam, 5-9. Tài liệu website http://www.genomebiology.com/2009/10/5/R49/figure/F1?highres=y http://tepbac.com/species/full/37/Ca-ro-dong.htm http://fl.biology.usgs.gov/Snakehead_circ_1251/html/channa_striata.html http://ffish.asia/index.php?p=none&o=sspm&id=26187 61 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Quy trình tách chiết DNA được thực hiện theo bộ kit Dneasy® Blood & Tissue (Qiagen) Bước 1: Mẫu ký sinh trùng được cho vào trong tube 1,5ml. Bước 2: Bổ sung 180μl đệm ATL. Bước 3: Bổ sung 20μl proteinase K, vortex. Bước 4: Ủ 560C cho đến khi mẫu tan hoàn toàn, vortex 15s. Bước 5: Bổ sung 200μl Buffer AL, vortex. Bước 6: Bổ sung 200μl ethanol (96 – 1000C), vortex. Bước 7: Dùng pipet hút toàn bộ dịch chuyển sang tube có cột lọc 2ml (có sẵn) Bước 8: Ly tâm tại 6000g (8000 vòng/phút) trong 1phút. Bước 9: Loại bỏ dịch và thu cột lọc ở trên. Bước 10: Đặt cột lọc sang tube 2ml mới (có sẵn). Bước 11: Bổ sung 500μl đệm AW1, ly tâm trong 1 phút tại 8000 vòng/phút. Bước 12: Loại bỏ dịch và thu cột lọc ở trên. Bước 13: Đặt cột lọc sang tube 2ml mới (có sẵn). Bước 14: Bổ sung 500μl buffer AW2, ly tâm 3 phút tại 14000 vòng/phút. Bước 15: Loại bỏ dịch và chuyển cột lọc ở trên sang tube 1,5ml mới (không có sẵn). Bước 16: Thêm 50μl đệm AE, ủ 3-5 phút tại nhiệt độ phòng, ly tâm 1 phút tại 8000 vòng/phút. Bước 17: Lặp lại bước trên 1 lần, thu được 100μl bảo quản DNA ở -200C. 62 Phụ lục 2. So sánh các chỉ tiêu phân loại của loài Thaparocleidus siamensis trong nghiên cứu hiện tại với nghiên cứu của Bùi Quang Tề (2001) Bảng PL 2. So sánh giữa nghiên cứu Bùi Quang Tề (2001) với nghiên cứu hiện tại Bùi Quang Tề Thaparocleidus siamensis (2001) Nghiên cứu hiện tại Chiều dài 280 325 ± 32 Chiều rộng 110 74 ± 12 Móc rìa 12 12 ± 1 Chiều dài màng lưng - 60 ±4 al 63 ± 1 49 ± 2 pr 35 31 ± 2 al 24 22 ±2 pr 13 12 ±1 Chiều dài màng nối bụng 26 20 ±1 Chiều dài cơ quan giao cấu 90 73 ± 2 Móc giữa Móc bụng Giá trị trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Phụ lục 3. So sánh các chỉ tiêu phân loại của loài T. vietnamensis với nghiêu cứu của Pariselle và ctv (2002) Bảng PL 3. So sánh với loài T. vietnamensis trong nghiên cứu Pariselle và ctv (2002) Pariselle và ctv (2002) Nghiên cứu hiện tại Chiều dài toàn thân 765 ± 176 678 ± 125 Chiều rộng thân 137 ± 24,7 126 ± 21 Tổng độ dài ống giao cấu 91 ± 3,8 87 ± 2,4 Kích thước màng nối lưng 29 ± 1,6 x 6 ± 0,7 25 ± 0,8 x 5 ± 0,4 Chiều dài móc giữa phía lưng 37 ± 1,8 28 ± 3,5 Kích thước màng nối bụng 3 ± 0,5 2,7 ± 0,3 Chiều dài móc giữa phía bụng 20 ± 0,7 14 ± 2,5 Giá trị trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn 63 Phụ lục 4. So sánh các chỉ tiêu phân loại của loài P. ozakii với nghiên cứu của Thuy và Buchmann (2008) Bảng PL 4. So sánh giữa nghiên cứu của Thuy và Buchmann (2008) với nghiên cứu hiện tại Prosorhynchoides ozakii Thuy và Buchmann (2008) Nghiên cứu hiện tại Hình dáng cơ thể Bầu dục Bầu dục Đặc điểm vỏ Gai xếp thành hàng Gai xếp thành hàng Kích thước cơ thể 0,4 – 1,4 x 0,3 – 1 0,3 – 1,35 x 0,3 – 0,9 Kích thước giác miệng 0,13 – 0,32 x 0,15 – 0,24 0,12 – 0,30 x 0,14 – 0,20 Kích thước tinh hoàn 0,2 – 0,3 x 0,1 – 0,2 0,2 – 0,3 x 0,1 – 0,2 Kích thước buồng trứng 0,1 – 0,3 0,1 – 0,25 x Kích thước trứng 0,16 – 0,026 x 0,010 – 0,015 0,17 – 0,028 x 0,011 – 0,017 Giá trị trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn 64 Phụ lục 5: So sánh các chỉ tiêu phân loại của loài Trianchoratus gussevi với nghiên cứu của Hà Ký và ctv (2007). Bảng PL 5. So sánh giữa nghiên cứu Hà Ký và ctv (2007) với nghiên cứu hiện tại Trianchoratus gussevi Hà Ký và ctv (2007) Nghiên cứu hiện tại Kích thước 0,14-0,16 x 0,036-0,071 mm 0,15-0,2 x 0,043-0,08 mm 3 móc giữa ( một móc phía 3 móc giữa ( một móc phía lưng, hai móc phía bụng, lưng, hai móc phía bụng, không màng nối) không màng nối) phía lưng (tổng chiều 0,026-0,030 x 0,024-0,026 x 0,027-0,029 x 0,019-0,023 x dài x phần chính x 0,017 x 0,007 x 0,022-0,024 0,014 x 0,006 x 0,021-0,023 nhánh trong x nhánh mm mm Kích thước móc giữa 00,27-0,030 x 0,027-0,029 x 0,031-0,043 x 0,021-0,027 x phía bụng 0,017 x 0,007 mm 0,019-0,021 x 0,008 mm Chiều dài ống giao phối 0,070-0,080 mm 0,060-0,073 Số lượng móc ở bộ phận bám Kích thước móc giữa ngoài x mấu nhọn) Giá trị trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Phụ lục 6. So sánh các chỉ tiêu phân loại loài Cucullanus chabaudi với nghiên cứu của Bùi Quang Tề (2001) Bảng PL 6. So sánh giữa nghiên cứu Bùi Quang Tề (2001) với nghiên cứu hiện tại Cucullanus chabaudi Bùi Quang Tề (2001) Nghiên cứu hiện tại Chiều dài thân 14,5 ± 1,50 12,4 ± 2,4 Chiều rộng thân 0,44 ± 0,02 0,36 ± 0,31 Chiều dài thực quản 1,33 ± 0,06 1,32 ± 0,1 Chiều dài đuôi 0,3 0,34 Giá trị trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn [...]... Dựa vào các thông số hình thái và các đặc điểm phân loại, nghiên cứu tiến hành phân tích thành phần ký sinh trùng, tính tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm của các loài ký sinh trùng phát hiện được Thông tin về thành phần ký sinh trên từng vật chủ, tỉ lệ nhiễm, cường độ nhiễm được trình bày trong Bảng 3.1 Bảng 3.1 Thành phần ký sinh trùng trên các loài cá Loài cá Vị trí ký Ký sinh trùng thu Tỉ lệ Cường sinh. .. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Ở Thái Lan, Yutisri và Thuhanruksa (1985) thực hiện điều tra khu hệ ký sinh trùng trên một số loài cá tự nhiên ở một số vùng của Thái Lan Nghiên cứu đã phát hiện 16 loài ký sinh trùng, trong đó tác giả đã xác định được 3 loài ngoại ký sinh và 13 loài nội ký sinh trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus) Ahmed và Ezaz (1997) đã nghiên cứu ký sinh trùng của 17 loài cá. .. thường được sử dụng trong các nghiên cứu về tiến hóa ở vi sinh vật nhằm xác định mức độ biệt hóa (Guarro Josep và ctv, 1999) 12 II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: thành phần loài ký sinh trùng trên một số loài cá nước ngọt ở tỉnh Khánh Hòa và Đồng Bằng sông Cửu Long Địa điểm thu mẫu: ký sinh trùng được thu trên mẫu cá thu tại Nha Trang, Cần... cá nước ngọt 1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Bùi Quang Tề và ctv (1976) đã tiến hành nghiên cứu ký sinh trùng hơn 41 loài cá nước ngọt tại đồng bằng sông Cửu Long và đưa ra biện pháp phòng trị bệnh Bùi Quang Tề (2001) đã nghiên cứu ký sinh trùng trên 3210 cá thể thuộc 41 loài cá nước ngọt có giá trị kinh tế ở đồng bằng sông Cửu Long, nghiên cứu xác định 157 loài ký sinh trùng, 70 giông, 46 họ,... da trơn ở Banglades Nghiên cứu xác định được 69 loài ký sinh trùng bao gồm 1 loài 9 monogenea, 24 loài Digenea, 10 loài Cestoda, 28 loài Nematoda và 6 loài Acanthocephala Cá trê trắng trong nghiên cứu có số lượng giun sán ký sinh nhiều nhất với 24 loài: 1 loài Monogenea, 5 loài Digenea, 9 loài Cestoda, 2 loài Acanthocephala, 7 loài Nematoda Luangphai và ctv (2004) nghiên cứu trên cá rô đồng tại quận... Đề và ctv, 2008; Nguyen, 2004) Việc nghiên cứu thành phần loài ký 2 sinh trùng là một nhu cầu cấp bách để góp phần đảm bảo sản lượng – chất lượng nguyên liệu đầu vào và sức khỏe người tiêu dùng Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, được sự cho phép của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại Học Nha Trang Tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu thành phần loài ký sinh trùng trên cá nước ngọt dựa trên. .. vạch trên trắc thị kính và ký sinh trùng 24 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thành phần ký sinh trùng, tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm Nghiên cứu tiến hành thu 60 cá thể cá lóc đồng (Channa striata), 10 cá thể cá mè vinh (Barbonymus gonionotus) và 70 cá thể cá rô đồng (Anabas testudineus) ở khu vực chợ Vĩnh Hải, Nha Trang Thu 150 cá thể cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tại tỉnh Đồng Tháp và thành. .. phát hiện loài Thaparocleidus caecus trên các sợi tơ mang Các tác giả sử dụng các đặc điểm hình thái và đoạn gen 28s rDNA để phân loại loài ký sinh trùng và xây dựng cây di truyền với các đoạn gen có liên quan trên GenBank 1.3 Đặc điểm hệ gen ribosome DNA Gen ribosome DNA (hay rDNA) là nhóm gen mã hóa của ribosome, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh loài rDNA có đặc điểm là một... với nghiên cứu của Luangphai và ctv (2003) Trong các loài ký sinh trên đối tượng cá tra, T campylopterocirrus có tỉ lệ nhiễm cao nhất (78%) và cường độ nhiễm cao nhất trong tất cả các loài ký sinh trong nghiên cứu Theo nghiên cứu của Dinh và Buchman (2008) trên đối tượng sán lá đơn chủ trên cá tra ở Vĩnh Long và Cần Thơ, T siamensis chiếm ưu thế với TLN 53% và CĐN 148 Trong nghiên cứu hiện tại, loài. .. trên cá nước ngọt dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền 1.1 Đặc điểm sinh học của các loài cá khảo sát trong đề tài 1.1.1 Cá rô đồng (Anabas testudineus) Bộ Perciformes Họ Anabantidae Giống Anabas Loài Anabas testudineus Bloch, 1792 Hình 1.1 Cá rô đồng (Anabas testudineus) (Nguồn: http://tepbac.com/species/full/37/Ca-ro-dong.htm ) Đặc điểm phân bố Cá rô đồng là loài cá nước ngọt, phân bố khá rộng từ ... b nhim ký sinh trựng T l nhim (%) = ỏ ý sinh ự ỏ * 100% Cng nhim Cng nhim c tớnh toỏn da vo s lng ký sinh trựng Cng nhim = ý sinh ự ỏ ý sinh ự X lý s liu o kớch thc ký sinh trựng... hin iu tra khu h ký sinh trựng trờn mt s loi cỏ t nhiờn mt s vựng ca Thỏi Lan Nghiờn cu ó phỏt hin 16 loi ký sinh trựng, ú tỏc gi ó xỏc nh c loi ngoi ký sinh v 13 loi ni ký sinh trờn cỏ bng... sỏt ký sinh trựng trờn cỏ tra nuụi thõm canh tnh An Giang, nghiờn cu ghi nhn cỏc loi ngoi ký sinh nh Acineta sp., Balantidium polyvacuolum, Ichthyonyctus pangasia, Trichodina sp., v ni ký sinh