ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ 1 PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ 1 PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 604270 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) .......................................................... 3 1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm ............ 3 1.1.2 Các hệ thống vector ................................................................................... 4 1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein ....................................... 9 1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) .................. 13 1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV) ...................................................................... 13 1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản ........................................... 14 1.2.3 Tiềm năng ứng dụng khác của hệ vector SFV .......................................... 17 1.2.4 Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV .................................... 19 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................... 23 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 27 2.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp................................................. 28 2.2.2 Phương pháp tách chiết plasmit. ........................................................ 29 2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và nhân dòng ........................................................................................................... 29 2.2.4 Thiết kế mồi. ..................................................................................... 30 2.2.5 Khuếch đại gen nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction) ....... 31 2.2.6 Cắt ADN sử dụng enzym giới hạn và chống tự nối/đóng vòng. ......... 31 2.2.7 Tạo các đoạn ADN sợi đôi và các linker từ các đoạn oligonucleotit... 32 2.2.8 Phản ứng nối các đoạn ADN ............................................................. 33 2.2.9 Sàng lọc khuẩn lạc............................................................................. 34 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp ................................................... 35 3.2 Cải tiến vector pSFV ............................................................................ 37 3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản........... 43 3.4 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến.......... 46 3.5. Sàng lọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1. ................................ 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận .......................................................................................................... 52 Kiến nghị ........................................................................................................ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 53 Tài liệu tiếng Anh .......................................................................................... 53 Tài liệu tiếng web............................................................................................ 57 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Bốn họ thụ thể chính .............................................................................. 3 Hình 2. Quy trình và thời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện khác nhau.............................................................................. 9 Hình 3. Hệ gen SFV tự nhiên............................................................................ 13 Hình 4. Cấu trúc vector pSFV cơ bản ............................................................... 15 Hình 5. Cấu trúc vector pHelper ....................................................................... 15 Hình 6. Mô hình hoạt động của hệ vector SFV ................................................. 16 Hình 7. Cấu trúc của vector pJET1.2 ................................................................ 23 Hình 8. Vị trí các mồi trên cADN mã cho thụ thể NK1..................................... 25 Hình 9. Trình tự vị trí nhân dòng đa điểm của đoạn O-M7 ............................... 25 Hình 10. Sơ đồ nghiên cứu tạo hệ vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8 ........... 27 Hình 11. Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cải tiến ......................................................................................... 27 Hình 12. Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cơ bản .......................................................................................... 28 Hình 13. Đường cong sinh trưởng của E.coli DH5α ......................................... 35 Hình 14. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã vỏ capsit của SFV .............. 38 Hình 15. Một phần kết quả giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV ....................................................................................... 39 Hình 16. Vị trí của đoạn chèn thứ 2 trong pHelper............................................ 39 Hình 17. Ảnh điện di đoạn chèn 2 trên gel agarrose 1%. ................................... 40 Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm colony PCR kiểm tra khuẩn lạc mang vùng cải biến ............................................................................................................. 41 Hình 19. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M7 ...................... 42 Hình 20. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M8 ...................... 43 Hình 21. Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA polymerase ....................................................................................................... 43 Hình 22. Ảnh điện di sản phẩm cắt pSFV đã mở vòng bằng SmaI .................... 45 Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm cắt thu cADN mã cho NK1 từ pJET1.2 ........... 46 Hình 24. Ảnh điện di cADN mã cho NK1 (XhoI/Klenow/ XbaI) sau khi tinh sạch .................................................................................................................. 47 Hình 25. Ảnh điện di mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8.................................... 48 Hình 26. Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1. ........................................................................................................ 50 Hình 27. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809 ................................... 51 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Một số promoter được bổ sung vào các vectơ biểu hiện ......................... 6 Bảng 2. Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực .................................................. 8 Bảng 3. Các vị trí cắt của một số protease phổ biến ............................................ 8 Bảng 4. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu.......................................... 24 Bảng 5. Trình tự các oligonucleotit sử dụng trong nghiên cứu .......................... 24 Bảng 6. Phản ứng cắt với enzym giới hạn ......................................................... 31 Bảng 7. Điều kiện của phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN ..................... ..32 Bảng 8. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng ...................... 33 Bảng 9. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính ....................... 33 Bảng 10. Điều kiện của phản ứng nối linker ..................................................... 34 Bảng 11. Tần số biến nạp của một số lô tế bào khả biến ................................... 36 Bảng 12. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV ....................................................................................... 38 Bảng 13. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 2 ..................... 40 Bảng 14. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8 ................................................................. 41 Bảng 15. Quy trình cho phản ứng nhân dòng đoạn cADN mã hóa cho thụ thể NK1 ................................................................................................................. 44 Bảng 16. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV bằng SmaI ............. 44 Bảng 17. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV đã mở vòng bằng XhoI ................................................................................................................. 45 Bảng 18. Thành phần và điều kiện của phản ứng chống tự đóng vòng của pSFV ................................................................................................................ 46 Bảng 19. Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính ........ 47 Bảng 20. Quy trình mở vòng pSFV cải biến và kiểm tra hiệu suất mở vòng .... 48 Bảng 21. Quy trình tạo 1 đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến .................... 49 Bảng 22. Thành phần và điều kiện của phản ứng colony PCR để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp pSFV-NK1........................................................................ 50 BẢNG CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic bp Base pair (Cặp bazơ nitơ) dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) GPCR Thụ thể kết cặp G- protein kb kilobase (= 1000 bp) LB Lubertani Broth NK1 Neurokinin-1 Nu Nucleotit OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) ARN Axit ribonucleic SFV Semliki Forest Virut SOC Super Optimal broth with Catabolite repression TAE Đệm Tris/Axit acetic/EDTA BẢNG VIẾT TẮT CÁC AXIT AMIN Ala (A): alanin Leu (L): leucin Arg (R): arginin Lys (K): lysin Asn (N): asparagin Met (M): methionin Asp (D): axit aspartic Phe (F): phenylalanin Cys (C): cystein Pro (P): prolin Gln (Q): glutamin Ser (S): serin Glu (E): axit glutamic Thr (T): threonin Gly (G): glycin Try (W): trytophan His (H): histidin Tyr (Y): tyrosin Ile (I): isoleucin Val (V): valin Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học MỞ ĐẦU Mặc dù là một ngành mới ra đời nhưng những thành tựu mà công nghệ sinh học phân tử (molecular biotechnology) đã mang lại là rất lớn. Những bước phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học phân tử trong các lĩnh vực như điều chế dược liệu, tạo ra kháng thể đơn dòng, sản xuất vacxin, thành công trong giải trình tự hệ gen người... đã góp phần đắc lực giúp con người trong công cuộc đấu tranh chống bệnh tật và không ngừng cải thiện, nâng cao chất lượng cuộc sống. Ngày nay, biểu hiện protein tái tổ hợp là một phần quan trọng của công nghệ sinh học phân tử với nhiều ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược. Biểu hiện được protein quan tâm trên tế bào động vật và người có thể giúp thiết lập những mô hình điều trị bệnh bằng liệu pháp gen, bao gồm cả điều trị ung thư. Biểu hiện protein tái tổ hợp đặc biệt là các protein thụ thể kết cặp G-protein (Gprotein coupled receptor, viết tắt là GPCR) phục vụ hữu ích cho các nghiên cứu phát triển thuốc, tìm hiểu cấu trúc và chức năng sinh học của các thụ thể, qua đó làm sáng tỏ các con đường truyền tin nội bào. Các protein thụ thể kết cặp Gprotein liên quan trực tiếp đến sự phát sinh nhiều bệnh lý ở người, là “đích” có vai trò quan trọng bậc nhất trong các chương trình sàng lọc các dược chất mới . Các nhà khoa học luôn mong muốn xây dựng được các hệ thống biểu hiện GPCR chủ động ở mức độ cao để dùng cho các nghiên cứu dược lý học phân tử, các thí nghiệm sàng lọc để phát hiện các dược chất mới và phát triển dược phẩm. Trên thế giới, một số hệ thống biểu hiện GPCR tiềm năng đã được thiết lập và thử nghiệm, chẳng hạn như hệ thống dịch mã phi tế bào, các hệ thống biểu hiện ở tế bào nhân sơ (E.coli và Halobacterium salinarum) và nhân chuẩn (nấm men, côn trùng và động vật có vú). Một số GPCR đã được biểu hiện thành công trên các hệ thống này ở mức độ cao từ 1 đến 10 mg/l môi trường nuôi cấy [19]. Trong các hệ thống biểu hiện trên, hệ thống sử dụng hệ vector Semliki Forest Virut (SFV) được ghi nhận là một trong những hệ thống có nhiều đặc điểm ưu việt và giàu tiềm năng ứng dụng [34]. Tuy vậy, hiện nay SFV không 1 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học được thương mại hóa rộng rãi do sự độc quyền sử dụng tại một số phòng thí nghiệm của các hãng dược phẩm (như Roche, Novartis). Với tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực sinh – y – dược và hệ vector SFV cơ bản được tặng từ GS. Kenneth Lundstrom (hãng dược phẩm Roche, Thụy Sĩ) và nguồn cADN mã hóa cho thụ thể kết cặp G-protein neurokinin 1 (NK1) của người Việt Nam đã được phân lập và nhân dòng thành công từ đề tài ĐT-PTNTĐ.2011-G/04, chúng tôi đề xuất và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam” với mục tiêu lâu dài là xây đựng được hệ thống biểu hiện các protein GPCR có thể được dùng như một công cụ công nghệ sinh học hiệu quả trong các nghiên cứu về sinh học thụ thể ở người Việt Nam sau này, đồng thời phục vụ cho các nghiên cứu dược lý học, sàng lọc và phát triển dược phẩm ở cấp độ phân tử và tế bào. 2 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 1.1.1 Thụ thể kết cặp G-protein và vai trò trong nghiên cứu dược phẩm Thụ thể là một lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào, truyền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tin nội bào dẫn đến đáp ứng tế bào giúp cơ thể đáp ứng kịp thời với sự thay đổi của môi trường. Để thực hiện được chức năng đó, thụ thể có đặc tính liên kết đặc hiệu với một hoặc một số phân tử tín hiệu đặc thù được gọi là phối tử (ligand) và phức hệ “ligand – thụ thể” sẽ khởi đầu một quá trình truyền tin nội bào và gây nên đáp ứng tế bào [3]. Có 4 họ thụ thể chính (Hình 1), trong đó thụ thể kết cặp G-protein (viết tắt là GPCR) là họ protein lớn và đa dạng nhất ở người [33]. Thụ thể kết cặp Gprotein là nhóm thụ thể xuyên màng sinh chất và hoạt động nhờ sự kết cặp với một loại protein hoạt động bởi liên kết với GTP (tức là G-protein). GPCR dẫn truyền tín hiệu cho nhiều dạng phối tử, bao gồm các hóc môn, peptit thần kinh, các chemokine…Trong cơ thể, các GPCR được biểu hiện trên hầu hết các kiểu tế bào và ước tính có đến 1000 GPCR khác nhau ở người [52]. Hình 1. Bốn họ thụ thể chính (nguồn: Gunnar Schulte, 2008 [18]) Sự thay đổi về mật độ cũng như trạng thái hoạt hóa của các GPCR là nguyên nhân trực tiếp gây nên nhiều bệnh cấp tính và mãn tính như tiểu đường, các bệnh tim, trầm cảm, viêm nhiễm và ung thư [31]. Các GPCR là đích tác động chính của hơn 50% các loại dược phẩm đang được sử dụng trong điều trị. 3 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Riêng năm 2001, nhóm thuốc này đem đến doanh thu trên 30 tỷ USD và ước tính con số hiện nay còn cao hơn [25]. Mặc dù GPCR có ý nghĩa thực tiễn to lớn song có hai trở ngại lớn khi sử dụng các GPCR tự nhiên (native) trong các nghiên cứu dược lý học phân tử và sàng lọc thuốc. Thứ nhất là các GPCR tự nhiên thường chỉ được biểu hiện ở mức độ rất thấp (khoảng vài fmol/mg protein màng tế bào) nên thường không sẵn có để dùng cho các thí nghiệm sàng lọc. Thứ hai là trong các mô hình thử nghiệm ở các động vật thí nghiệm, các GPCR thường đồng thời tồn tại ở nhiều dạng phụ (subtype) khác nhau hoặc các dạng biến thể (variants/polymorphic alleles) khác nhau, dẫn đến có thể có những nhận định nhầm về khả năng tương tác của các “thuốc thử” (test compound) với các thụ thể đích nếu đối tượng thí nghiệm lấy mẫu ngẫu nhiên không đại diện cho nhóm phổ biến nhất (các alen kiểu dại). Có thể nhận thấy những khó khăn trên có thể được khắc phục bằng việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm biểu hiện các GPCR tái tổ hợp của người. Các GPCR tái tổ hợp được biểu hiện ở mức độ cao sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính bởi vậy, xây dựng các hệ thống biểu hiện GPCR nhanh và hiệu quả là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng và mang lại nhiều lợi ích thiết thực trong sàng lọc và nghiên cứu phát triển dược phẩm. 1.1.2 Các hệ thống vector Ý tưởng về vector mang gen ngoại lai bắt nguồn từ các plasmit vi khuẩn. Vector là phân tử ADN có khả năng tự tái bản, tồn tại độc lập trong tế bào chủ và mang các gen cần chuyển. Sau khi vector ngoại lai được đưa vào tế bào chủ, chúng sử dụng bộ máy sao chép của tế bào chủ để nhân bản đến số lượng cần thiết và biểu hiện các gen chúng mang [1]. Đến nay, đã có hơn 2600 vector được chia làm 3 nhóm chính là plasmit (nguồn gốc từ vi khuẩn), phagơ (nguồn gốc từ virut) và nhiễm sắc thể nhân tạo [46]. Chuyển gen vào các tế bào động vật có thể tiến hành bằng cách gây nhiễm các phagơ mang gen tái tổ hợp quan tâm hoặc chuyển gen trực tiếp thông qua plasmit. Có rất nhiều vector biểu hiện trên động vật có vú có nguồn gốc từ virut 4 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học được dùng trong sản xuất protein, liệu pháp gen và phát triển vacxin mới (Phụ lục-1). Hiệu quả biểu hiện gen đặc biệt là trong các tế bào động vật có vú không đơn thuần thể hiện ở tốc độ sản xuất protein mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như các nhân tố kiểm soát phiên mã và dịch mã, quá trình biên tập và sự ổn định của ARN, số lượng bản sao của gen ngoại lai, khả năng gây độc của các protein tái tổ hợp với tế bào cũng như các đặc tính di truyền của tế bào chủ. Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thuận tiện với mục đích sử dụng. Không có hệ vector nào toàn năng cho chuyển gen và biểu hiện mà cần có sự chọn lựa tùy theo mục đích và kích thước của đoạn gen được tạo dòng [66]. Các vector liên tục được cải tiến thuận lợi cho việc chuyển gen, sản xuất và thu hồi protein ngoại lại một cách hiệu quả. Dưới đây tóm lược một số xu hướng cải tiến vector phổ biến và ý nghĩa của chúng. 1.1.2.1 Tạo các vector ADN từ hệ gen virut có bản chất ARN Nhiều virut có hệ gen ARN có tiềm năng phát triển thành các vector biểu hiện mạnh. Các phiên bản vector ADN của virut ARN được thiết lập là một bước cải tiến lớn đem lại các hệ thống biểu hiện mạnh hơn (đặc biệt ở tế bào động vật có vú), dễ dàng thao tác với các enzym và thuận lợi cho quá trình chèn các đoạn ADN ngoại lai đồng thời hạn chế được các bước xử lý trong điều kiện chuyên biệt dành cho ARN và dịch mã ARN có mũ đầu 5’ trong ống nghiệm [6]. Nhiều nghiên cứu xây dựng vector ADN dựa trên hệ vector ARN gốc đã được tiến hành, chẳng hạn như các hệ vector ADN có nguồn gốc từ ARN hệ gen của virut Sindbis [54]. 1.1.2.2 Thêm hoặc cải tiến các vùng điều khiển Những hiểu biết ngày càng sâu sắc về các trình tự mã cho các tín hiệu điều khiển quá trình phiên mã, biên tập mARN và dịch mã có thể thêm vào vector giúp chúng ta chủ động điểu khiển hiệu suất biểu hiện theo ý muốn. Trình tự Kozak GCC(A/G) CCATGG ở động vật có xương sống hoặc trình tự tương đương CAAAACATG ở côn trùng bất cứ khi nào xuất hiện đều làm tăng hiệu suất dịch mã ARN [1]. Ngoài ra, đoạn trình tự này còn khuyến 5 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học khích loại bỏ các vùng có thể ức chế dịch mã nằm ngược dòng ATG hay vùng cấu trúc thứ cấp ở đầu 5’ không mã hóa [15]. Lựa chọn các trình tự tăng cường hay các promoter mạnh có hiệu suất phiên mã cao để thêm hoặc thay thế cho promoter gốc của vector sẽ giúp tắng cường mức độ biểu hiện protein. Bảng 1 trình bày một số promoter có thể thêm vào vector biểu hiện trên động vật có vú. Bảng 1. Một số promoter được bổ sung vào các vector biểu hiện (nguồn: Gerstein, 2001 [15]) Promoter Hệ vector gốc Độ mạnh* EF-1α Nhân tố kéo dài 1α ở người 40-160 CMV Cytomegalovirut 4 RSV Virut LTR rous sarcoma 2 SV40 muộn Gen muộn của virut simian 40 1.1 SV40 sớm Gen sớm của virut simian 40 1 * Promoter SV40 sớm được coi là có độ mạnh là 1để so sánh với các promoter khác. Nhiều tín hiệu kết thúc phiên mã của sinh vật nhân sơ đã được nghiên cứu và được sử dụng rộng rãi trong các vector biểu hiện . Ở sinh vật nhân chuẩn, trình tự ATCAAA(A/T)TAGGAAGA đã được xác định là vùng kết thúc phiên mã của chín gen được nghiên cứu [36]. Đuôi polyadenin – polyA (50-250 phân tử adenyl nối tiếp nhau) thêm sau mARN có vai trò quan trọng giúp ổn định và dịch chuyển ARN từ nhân ra tế bào chất để dịch mã. Mặc dù trình tự polyA cách xa điểm khởi đầu dịch mã nhưng nó có tác dụng tăng cường sự tái hoạt động của ribosom nên trực tiếp làm tăng cường hiệu suất dịch mã [1]. Có một số tín hiệu polyadenin hóa hiệu quả đã được sử dụng trong vector biểu hiện của động vật có vú có nguồn gốc từ gen mã cho hoóc môn tăng trưởng của bò, β- globin chuột, đơn vị phiên mã sớm của SV40 và gen mã cho thymidine kinase của Herpes simplex. Các mã kết thúc (TAG, TAA, TGA) cũng có thể xem xét để thêm vào sau vùng nhân dòng đa điểm nhằm tăng cường sự kết thúc dịch mã trong trường hợp các đoạn cài mã gen ngoại lai thiếu các mã này hoặc để tăng hiệu quả hoạt động của các yếu tố kết thúc dịch mã (RF) [1]. 6 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.1.2.3 Mở rộng và đa dạng hóa các vùng nhân dòng đa điểm Các phiên bản vector đầu tiên dựa trên trình tự nguyên gốc của plasmit hoặc phage có vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site-MCS) rất hạn chế. Các vị trí nhân dòng đa điểm là nơi mà các enzym giới hạn nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu tái bản để tránh bị cắt nhầm. Để thuận lợi cho quá trình nhân dòng gen ngoại lai, các vector gốc thường được bổ sung thêm các đoạn nối (linker) mang vị trí nhân dòng đa điểm mới. Các vị trí nhân dòng đa điểm mới phải đảm bảo không có trong trình tự gốc của vector, ưu tiên cho các enzym giới hạn tạo được đầu tương thích với nhiều enzym giới hạn khác [2]. 1.1.2.4 Thêm các vùng gen giúp sàng lọc thể tái tổ hợp Các gen kháng kháng sinh giúp chọn lọc các dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp thường được thêm vào hầu hết các vector. Các gen kháng kháng sinh hay được sử dụng là gen mã họ kháng sinh penicillin (bao gồm ampicillin) tác động ức chế hình thành thành tế bào vi khuẩn hoặc kanamycin, tetracyclin và chloramphenicol ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn thông qua ức chế sinh tổng hợp protein vi khuẩn. Các gen báo cáo (reporter genes) giúp xác định plasmit có chứa đoạn chèn gen ngoại lai mong muốn cũng có thể được cài vào vector. Gen lacZ là một gen báo cáo điển hình, mã hóa cho β-galactosidase có khả năng cắt galactose. Vị trí nhân dòng đa điểm nằm trong gen LacZ và nếu đoạn chèn được cài thành công vào vector sẽ làm bất hoạt β-galactosidase. Chính vì vậy, tế bào chứa vetor có đoạn chèn quan tâm có thể được xác định bằng phương pháp chọn khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trường chứa X-gal [2]. 1.1.2.5 Thêm các đoạn epitop và các vị trí cắt của protease Trong vài năm gần đây, một số epitop peptit và protein rất nhỏ còn được gọi là các đuôi ái lực (affinity-tag) được gắn vào protein tái tổ hợp để tăng cường sản xuất các protein này [22]. Các đuôi ái lực này có đặc điểm chung là: không gây đáp ứng miễn dịch; tinh sạch một bước bằng cột lọc có chất gắn thích hợp; có ảnh hưởng tối thiểu lên cấu trúc và hoạt động sinh học của protein tái tổ 7 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học hợp mà nó gắn vào; có thể loại bỏ dễ dàng và đặc hiệu để sản xuất các protein dạng nguyên gốc; phân tích protein tái tổ hợp đơn giản và chính xác trong quá trình tinh sạch; áp dụng được cho một số loại protein khác nhau. Mỗi loại đuôi ái lực được tinh sạch với một loại đệm đặc hiệu và trong một số trường hợp các đoạn peptit này có thể không cần loại bỏ khỏi protein đích. Các đoạn peptit nhỏ được sử dụng nhiều nhất hiện nay là poly-Arg-tag, FLAG-tag, poly-His-tag, cmyc-tag, S-tag và Strep II-tag. Trình tự của một số đuôi ái lực phổ biến được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Trình tự, kích thước một số đuôi ái lực Đuôi ái lực Poly-Arg Poly-His FLAG Strep II c-myc S HAT 3x FLAG Glutathione S-transferase Số axit amin 5–6 2–10 8 8 11 15 19 22 211 Trình tự RRRRR HHHHHH DYKDDDDK WSHPQFEK EQKLISEEDL KETAAAKFERQHMDS KDHLIHNVHKEFHAHAHNK DYKDHDGDYKDHDIDYKDDD DK Protein Kích thước (kDa) 0.80 0.84 1.01 1.06 1.20 1.75 2.31 2.73 26.00 Các trình tự mã hóa cho vị trí cắt của protease cũng thường được thêm vào sau trình tự của các đuôi ái lực để loại bỏ các đuôi ái lực này và thu hồi dạng protein tái tổ hợp nguyên bản. Các vị trí cắt của một số protease được trình bày trong Bảng 3. Các vị trí cắt của protease được lựa chọn sao cho không có vị trí tương tự trong protein tái tổ hợp được quan tâm. Bảng 3. Các vị trí cắt của một số protease phổ biến Protease Factor Xa Enterokinase Thrombin PreScission Trình tự nhận biết IEGR/ DDDDK/ VPR/GS LEVLFQ/GR 8 Tài liệu tham khảo [42] [40] [8] [9] Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.1.3 Các hệ thống biểu hiện thụ thể kết cặp G-protein Biểu hiện protein tái tổ hợp đã trở thành công cụ chủ chốt trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng trong vòng 20 năm trở lại đây. Mặc dù có nhiều hệ thống biểu hiện đã được phát triển khá tốt cho các protein hòa tan trong tế bào nhân sơ và nhân thật, thì đến nay biểu hiện hiệu suất cao và chủ động các protein xuyên màng tế bào vẫn là một thách thức lớn. Khả năng biểu hiện GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới cấu trúc và hình dạng của các loại protein này. Các GPCR với 7 vùng xuyên màng được tạo ra ở mức độ thấp do yêu cầu cuộn gập, vận chuyển và khả năng gây độc tính đối với tế bào. Hình 2. Quy trình và thời gian yêu cầu để sản xuất GPCR tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện khác nhau (nguồn: Nambi, 2003 [43]) Trong phần này, các tính chất cũng như những thành tựu của các hệ thống biểu hiện bao gồm hệ thống dịch mã phi tế bào, các vector nhân sơ và nhân chuẩn sử dụng cho việc biểu hiện mạnh các GPCR tái tổ hợp sẽ được trình bày tóm lược (xem thêm Hình 2). Đa phần trong số chúng đã được sử dụng cho việc 9 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học biểu hiện GPCR tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng: không có một hệ thống nào là toàn năng cho việc biểu hiện mức độ cao tất cả các loại GPCR. 1.1.3.1 Hệ thống dịch mã phi tế bào Hệ thống dịch mã phi tế bào được xây dựng từ dịch thủy phân E.coli hoặc dịch thủy phân tế bào mầm lúa mì. Hệ thống chứa các nhân tố tham gia phản ứng phiên mã và dịch mã đồng thời được cung cấp thêm liên tục các nucleotit, các axit amin và các hợp chất thiết yếu khác [37]. Hệ thống biểu hiện phi tế bào áp dụng để dịch mã nhanh các sản phẩm PCR mã cho các protein hòa tan đơn giản với lượng lớn cỡ hàng chục milligram một cách nhanh chóng (khoảng 4 ngày). Tuy nhiên, hệ thống dịch mã phi tế bào vẫn tồn tại nhiều hạn chế như chi phí cao, quy trình kỹ thuật phức tạp. Sự biểu hiện của các protein xuyên màng lớn, đặc biệt là các GPCR chưa từng thành công bằng sử dụng hệ thống này [26]. 1.1.3.2 Biểu hiện ở tế bào nhân sơ Ưu điểm của biểu hiện trên các tế bào nhân sơ là chi phí rẻ, đơn giản, nhanh (khoảng 11 ngày) và dễ mở rộng quy mô sản xuất các protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, hệ biểu hiện này có nhược điểm cơ bản là không có cơ chế biến đổi sau dịch mã nên các protein phức tạp và lớn, như GPCR, thường được biểu hiện ở dạng không có hoạt tính đầy đủ do không được cuộn gập chính xác hoặc được biến đổi sau dịch mã như dạng tự nhiên [43]. Tuy vậy, đến nay một số GPCR đơn giản đã được biểu hiện bởi hệ thống này nhằm nghiên cứu cấu trúc. E.coli, Halobacterium salinarum, Lactococcus lactis là những chủng vi khuẩn được dùng làm tế bào chủ biểu hiện phổ biến hơn cả. 11 GPCR gắn đuôi His ở đầu C đã được biểu hiện trên E.coli với hiệu suất biểu hiện khác nhau từ 0.1 đến 10% tổng số protein tế bào [24]. Thụ thể muscaricnic M1 và serotonin 5-HT2C đã được tiến hành biểu hiện trên H.salinarum [53]. L. lactis là một vi khuẩn Gram dương thường được sử dụng để biểu hiện các protein màng nhằm xác định dạng prokaryote nguyên gốc [28]. 10 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.1.3.3 Biểu hiện ở nấm men Ưu điểm của biểu hiện protein tái tổ hợp ở tế bào nấm men là dễ nuôi cấy, thu được sinh khối lớn và có hệ thống biến đổi sau dịch mã gần tương đồng với tế bào động vật. Thụ thể dopamine D1A ở người đã được biểu hiện thành công ở Saccharomyces cerevisiae và được thu hồi nhờ đuôi His6 [4]. Nấm Schizosaccharomyces pombe sở hữu hệ thống truyền tín hiệu giống động vật có vú và có thể glycosyl hóa, thụ thể dopamine D2 ở người đã được biểu hiện trên màng nấm S. pombe với lượng cao gấp ba lần so với biểu hiện trên S.cerevisiae [44]. Nấm Pichia pastoris được đánh giá là chủng nấm biểu hiện gen tốt nhất bởi khả năng biến đổi sau dịch mã bao gồm glycosyl hóa, tạo các liên kết disulfit và phân cắt protein [7]. Khoảng 100 GPCR trong chương trình nghiên cứu hệ gen cấu trúc của MePNet đã được biểu hiện thành công với hiệu suất 95% ở các tế bào P.pastoris. Mặc dù vậy, thành tế bào nấm dày thường được coi là một trong những trở ngại cho hiệu suất tinh sạch và thu hồi protein tái tổ hợp. Bên cạnh đó, quy trình sản xuất GPCR ở nấm men cũng thường tốn nhiều thời gian (khoảng 18 ngày). 1.1.3.4 Biểu hiện ở các tế bào côn trùng Ưu điểm lớn nhất của biểu hiện ở các tế bào côn trùng là tế bào côn trùng sở hữu một lượng lớn các quy trình cải biến giống với động vật có vú. Thêm nữa, các tế bào côn trùng được nuôi cấy trong môi trường bán tổng hợp nên dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất protein mặc dù chi phí cao hơn so với nuôi cấy nấm men và vi khuẩn. Hệ thống vector baculovirut lây nhiễm trên tế bào côn trùng được đánh giá là một trong những hệ thống biểu hiện GPCR hiệu quả nhất [35]. Virut thuộc nhóm này được sử dụng phổ biến hơn cả là virut Autograha californica nuclear polyhedrosis (AcMNPV). AcMNPV có thể lây nhiễm các dòng tế bào côn trùng như Sf9 và Sf21 và nhân lên trong chúng. Nhờ promoter của baculovirut hoạt động mạnh, các gen ngoại lai được biểu hiện mạnh và có thể được tích lũy với 11 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học lượng lớn trong giai đoạn muộn của pha đóng gói hạt virut mới (thường kéo dài khoảng 2 giờ). Thời gian của một quy trình sản xuất protein GPCR tái tổ hợp kể tử khi bắt đầu phân lập gen đích vào khoảng 21 ngày [23]. Hệ thống vector baculovirut đến nay đã được sử dụng thành công trong sản xuất nhiều thụ thể GPCR, như các thụ thể adrenegic, opioid, histamine, serotonine … nhưng chủ yếu phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các thụ thể. Các protein xuyên màng được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện baculovirut thường có hiệu suất thu protein vào khoảng 18 đến 71 pmol/mg protein, nghĩa là tăng hàng nghìn lần so với mức biểu hiện trong tự nhiên [38]. Tuy nhiên, sự khác biệt chính giữa tế bào động vật có vú và côn trùng luôn tồn tại, ví dụ như quá trình N-glycosyl hóa ở tế bào côn trùng đơn giản hơn và chứa nhiều manose hơn tế bào động vật có vú [21]. 1.1.3.5 Biểu hiện trên tế bào động vật có vú Vật chủ tối ưu biểu hiện các gen mã cho GPCR của động vật có vú hiển nhiên chính là các tế bào động vật có vú với đầy đủ các cơ chế biến đổi, vận chuyển cũng như sự có mặt của G-protein. Các vector virut nhiễm trên tế bào động vật có vú có thể cải thiện mức độ biểu hiện một cách hiệu quả nhờ có khả năng di chuyển từ tế bào chủ này sang tế bào chủ khác và có các promoter rất mạnh, những promoter này được đánh giá là “đỉnh cao” của biểu hiện gen. Gần như phần lớn các protein màng được sản xuất một lượng lớn trong môi trường nuôi cấy huyền phù dựa trên hệ thống biểu hiện của Semiliki Forest virut (SFV). Đây là một loại alpha virut có hệ gen ARN mạch đơn. Hiệu quả biểu hiện các protein xuyên màng của người bởi hệ thống SFV trong một số trường hợp tỏ ra hiệu quả hơn so với hệ thống biểu hiện baculovirut, có lẽ nhờ khả năng biến đổi protein sau dịch mã ở các dòng tế bào động vật có vú, như CHO, HEK hay U20S. Các vector SFV đến nay đã được ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR và mức độ biểu hiện trong phần lớn trường hợp là rất cao khi đo bằng phối tử đánh dấu và Western blot [32]. Tuy vậy, so với hệ thống biểu hiện của baculovirut, hệ thống biểu hiện của SFV có giá thành cao hơn và vẫn luôn cần sự quan tâm đáng kể về khía cạnh an toàn sinh học khi thao tác. 12 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1.2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) 1.2.1 Virut Semliki Forest (SFV) SFV là virut có hệ gen ARN (+) thuộc họ Togaviridae, chi Alpha virut. Nó được phân lập lần đầu tiên từ muỗi ở Uganda năm 1944 [49]. Đây là một virut có cấu trúc tương đối đơn giản. Hệ gen SFV dài 11442 nucleotit (không tính mũ 5’ và đuôi poly A) với 2 khung đọc mở mã cho 2 chuỗi polyprotein (xem Hình 3). SFV có 4 protein phi cấu trúc (non-structural proteins, viết tắt là nsPs) từ nsP1 đến nsP4 cấu thành nên enzym ARN replicase, còn lại là các protein cấu trúc vỏ capsit (protein C) và vỏ ngoài (protein E1, E2, E3). Một protein nhỏ 6 kD được mã hóa trong vùng gen cấu trúc không được dùng để cấu thành virut mới. Các protein cấu trúc được mã hóa bởi đoạn ARN được ký hiệu là 26S, trong khi các protein phi cấu trúc được dịch mã từ ARN 42S của hệ gen. Cả protein cấu trúc và phi cấu trúc được tạo thành từ sự phân tách 2 chuỗi polyprotein nhờ cơ chể cắt sau dịch mã [50]. Hình 3. Hệ gen SFV tự nhiên (nguồn: Lundstrom K., 2003 [32]) Trong chi Alpha virut, SFV được coi là hệ thống biểu hiện gen tốt bởi vòng đời virut ngắn, phổ vật chủ rộng, có khả năng tự nhân hệ gen của bản thân và chỉ cần bộ máy dịch mã của vật chủ để tái tạo [14]. Trong chu trình nhân lên (tái bản) thông thường, SFV lây nhiễm vào tế bào chủ và khởi đầu quá trình nhân lên bằng cách dịch mã ở 2/3 đầu 5’ của đoạn ARN(+). Đoạn polyprotein được dịch mã sẽ phân cắt thành 4 protein phi cấu trúc hình thành nên enzym ARN replicase. Phức hệ ARN replicase có đích là trình tự đầu 3’ của ARN (+), chúng tổng hợp lên sợi ARN (-) có chiều dài đầy đủ từ sợi ARN (+). Protein cấu trúc cần cho lắp ráp virut trưởng thành được mã 13 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học hóa bởi 1/3 đoạn gen còn lại của hệ gen virut, vùng này được sao chép bằng enzym SFV replicase và dịch mã cho ra protein vỏ. Protein vỏ capsit nhận tín hiệu đóng gói nằm ở vùng mã hóa cho nsP2 và cùng với sợi ARN có chiều dài đầy đủ tạo nên nucleocapsit [13]. Cấu trúc này dung hợp và mọc chồi từ màng tế bào để tạo thành dạng virut trưởng thành có khả năng lây nhiễm. SFV không gây bệnh truyền nhiễm ở người, mặc dù có một báo cáo về một đợt bùng phát sốt nhẹ trong binh lính Pháp ở Cộng hòa Trung Phi được giả thiết là do SFV [39]. Nhìn chung, SFV được coi là ít nguy hiểm cho nhân viên phòng thí nghiệm hơn các togavirut khác. Vì những lí do này, SFV được phân loại là virut an toàn sinh học độ 3 ở Mỹ, nhưng có một số khuyến cáo rằng mọi hoạt động vẫn nên được tiến hành ở độ 2 (U. S. HHS Publication no. (CDC) 938395, 1993). Ở Liên Minh Châu Âu, SFV được xếp là virut an toàn sinh học độ 2 (E. C. Council Directive 93/88/EEC, 1993). Các vector biểu hiện SFV không mang các gen cấu trúc được xếp vào an toàn sinh học độ 2 ở cả Mỹ và Châu Âu [11]. 1.2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản Hệ vector SFV cơ bản chúng tôi được tặng bởi GS. Kenneth H. Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) gồm vector nhân dòng các gen quan tâm pSFV dài 11489 bp và vector biểu hiện các protein cấu trúc pHelper dài 8650 bp. Hai vector này có bản chất là ADN, cấu trúc cụ thể của chúng được nêu ở dưới đây. 1.2.2.1 Cấu trúc của pSFV cơ bản pSFV chứa trình tự mã hóa cho phức hệ replicase gồm 4 protein phi cấu trúc (kí hiệu từ nsP1đến nsP4) dài 7381 Nu (nsP1: 86-1096 (737 axit amin), nsP2: 1697-4090 (798 axit amin), nsP3: 4091-5536 (482 axit amin), nsP4: 55377378 (614 axit amin). Theo sau là vùng nhân dòng đa điểm và đoạn gen mã hóa cho protein cấu trúc đã bị xóa đi phần lớn (∆sP). Vùng nhân dòng đa điểm của pSFV rất hạn chế nhưng có thể cải tiến thêm các vị trí nhận biết cho các enzym mới bằng cách thêm những đoạn oligonucleotit thích hợp. Ngoài ra, pSFV được cải tiến với promoter mạnh CMV, 3 mã kết thúc nằm liên tiếp nhau sau vị trí nhân dòng đa điểm, đuôi polyadenyl và tín hiệu kết thúc phiên mã của virut SV40. 14 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Hình 4. Cấu trúc vector pSFV cơ bản 1.2.2.2 Cấu trúc của pHelper Vùng gen mã hóa cho protein phi cấu trúc của vector pHelper bị xóa bỏ phần lớn, chỉ giữ lại nguyên vẹn vùng gen mã hóa cho các protein cấu trúc (sPs) tham gia vào việc đóng gói virut. pHelper có các promoter CMV/T7, promoter subgenomic, đuôi polyadenyl đảm bảo cho quá trình phiên mã các gen cấu trúc invivo có thể diễn ra. Hình 5. Cấu trúc vector pHelper 15 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Sự đồng biến nạp các ARN từ vector pSFV và vector helper theo tỉ lệ mol 1:1 vào cùng một dòng tế bào tạo ra sự đóng gói invivo của ARN tái tổ hợp hình thành nên các hạt virut SFV (Hình 6). Hình 6. Mô hình hoạt động của hệ vector SFV Nhìn chung, hệ SFV cơ bản được thiết kế có những ưu điểm sau: - 2 plasmit riêng biệt của virut đều biến nạp nhanh và đơn giản, thu hoạch virut trưởng thành sau 1-2 ngày, không yêu cầu tái tổ hợp. - Dải vật chủ lây nhiễm rộng, cho phép chọn được các dạng biến đổi sau dịch mã phù hợp. 16 Luận văn tốt nghiệp-2012 - Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Sản lượng protein cao, có thể tạo ra 25% tổng số protein của tế bào và có thể tạo ra lượng protein đủ cho cả một gia đình sống trong vài năm. Có tính an toàn cao nhờ các yếu tố: + Các vector cADN được sử dụng đều có nguồn gốc từ một dòng đã được làm suy yếu khả năng gây bệnh. + Các gen cấu trúc và các gen tái bản của SFV được tách và tái cấu trúc thành 2 vector riêng biệt (replicon và helper) nên virut này mất khả năng tái sản xuất qua mỗi chu kì tế bào. Chính vì lí do này, hệ vector SFV còn được gọi là hệ vector virut “tự tự tử”. + Phức protein p62 (gồm E3và E2) không được phân tách thành 2 tiểu phần do có 3 thay đổi về axit amin. Để tránh hoạt hóa virut, p62 phải được cắt nhờ chymotrysin, nên virut chỉ nhiễm sau khi hoạt hóa bằng chymotrypsin. 1.2.3 Tiềm năng ứng dụng khác của hệ vector SFV Hệ vector SFV không chỉ là một trong những hệ vector biểu hiện GPCR hiệu quả nhất, phục vụ đắc lực cho các nghiên cứu sàng lọc dược phẩm mà còn có rất nhiều tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác. Dưới đây là một số ứng dụng nổi bật của hệ vector SFV. 1.2.3.1 Ứng dụng trong liệu pháp gen Mục đích ban đầu khi nghiên cứu về SFV là tìm hiểu hoạt tính sinh bệnh của nó, tuy nhiên có một số đặc điểm của SFV cho thấy nó có thể được cải biến để chữa bệnh hơn là những tác hại mà nó gây ra. Nghiên cứu các dòng tế bào nhiễm SFV cho thấy: vùng gen mã hóa cho protein phi cấu trúc của SFV cần cho sự cảm ứng chết theo chương trình (apoptosis). Sự mất phần gen nsP2 hủy bỏ đồng thời sự cảm ứng apoptosis và sự tổng hợp ARN virut [17]. Cảm ứng chết theo chương trình bởi SFV không phụ thuộc p53, do đó không gây thương tổn cho ADN tế bào. Một cơ chế khả thi giải thích cho sự cảm ứng chết theo chương trình do SFV là sự hoạt hóa protein kinase phụ thuộc ARN mạch đôi [30]. Vì các tế bào H358a chết theo chương trình không phụ thuộc p53 do SFV hoặc vector SFV là các tế bào ung thư phổi 17 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học của người mang đột biến mất p53, điều này gợi ý về tính khả thi của việc dùng SFV và vector SFV để cảm ứng apoptosis ở tế bào ung thư. Vector SFV có mức độ biểu hiện cao và có khả năng gây dừng quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ cũng như kích hoạt chết theo chương trình của tế bào chủ nên được nhắm đến sử dụng trong liệu pháp gen để điều trị ung thư. Bằng cách đếm tế bào theo dòng, số lượng tế bào chết theo chương trình tăng mạnh khi biến nạp virut SFV-LacZ vào dòng tế bào u tuyến tiền liệt và sinh thiết thu từ người bệnh [56]. Tiêm ARN SFV-LacZ cũng kéo dài sự sống của chuột BALB/c bị ung thư [55]. Chuyển gen interleukin-12 (IL12) chuột nhờ vector SFV cho thấy có thể gây suy thoái và ức chế khối u B16 thông qua việc ức chế hình thành mạch máu quanh khối u [5]. Các nghiên cứu cho thấy không có dấu hiệu bị đầu độc ở chuột đã xử lý SFV-IL12 và hiệu quả chống khối u có thể được tăng cường bằng việc cách tiêm nhắc lại hạt SFV tái tổ hợp. 1.2.3.2 Ứng dụng trong sản xuất vacxin Các vector SFV được coi là một công cụ vector dẫn truyền gen lý tưởng làm vacxin cho người và động vật. Đầu tiên, sự sao chép ARN của SFV diễn ra ở tế bào chất, không có nguy cơ dung hợp gen của virut vào nhiễm sắc thể tế bào chủ. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy, nhiều người và động vật không có miễn dịch tiền nhiễm chống lại vector SFV. Khả năng gây chết theo chương trình do nhiễm virut giúp hệ gen của virut không tồn tại dai dẳng trong các mô và giải phóng các protein kháng nguyên mã hóa từ gen ngoại lai. Một lợi thế nữa là SFV có phạm vi vật chủ rộng, xâm nhiễm nhiều loại tế bào. Vector SFV có thể dùng để nghiên cứu để biểu hiện protein kháng nguyên từ nguồn gen của vi sinh vật độc hại ngoại lai, loại trừ được khả năng có mặt của đối tượng. Trong cơ thể, vacxin virut tái tổ hợp kích thích tốt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với các loại kháng nguyên ngoại lai. Tiêm tĩnh mạch hạt SFV tái tổ hợp biểu hiện gen cúm NP dẫn đến đáp ứng dịch thể với mật độ kháng thể cao trong chuột BALB/c [56]. Tối thiểu 100 hạt SFV-NP xâm nhiễm sẽ gây đáp ứng độc mạnh cho tế bào T và sau một lần tiêm tăng cường miễn dịch nhớ của tế bào T kéo dài hơn 40 ngày sẽ được thiết lập [57]. Khỉ Pigtail được tiêm chủng với hạt SFV tái tổ hợp biểu hiện gp160 của virut suy giảm 18 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học miễn dịch ở khỉ (SIV) được bảo vệ khỏi căn bệnh gây chết người này [41]. Gần đây, hạt SFV biểu hiện kháng nguyên kháng khối u P815 đã tạo ra phản ứng mạnh của tế bào T và bảo vệ cơ thể chống lại sự phát triển của khối u P815. Ngoài ra, kỹ thuật tiêm trực tiếp axit nucleic đã được sử dụng cho vector SFV. Tiêm vector SFV ARN đã chèn gen cúm NP vào cơ chuột đã thu được đáp ứng dịch thể cao [56]. Lợi ích của việc sử dụng ARN trần gây miễn dịch là độ an toàn cao hơn do ARN trần kém bền và không có sự sát nhập vào hệ gen của tế bào chủ. Gần đây, vector ARN trần biểu hiện glycoprotein gp41 HIV-1 được tiêm vào bắp chuột để hình thành kháng thể đơn dòng [16]. Vector ADN SFV mới được xây dựng gây đáp ứng miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch cao hơn các plasmit ADN thông thường. Trong các nghiên cứu khác, vector SFV (dạng ARN hoặc ADN) và hạt SFV tái tổ hợp được ứng dụng để tạo ra các kháng nguyên đơn dòng chống lại các protein prion [27]. 1.2.4 Các yếu tố cần được cải tiến trong hệ vector SFV Mặc dù có nhiều ứng dụng khác nhau và có khả năng biểu hiện gen hiệu quả, vector SFV vẫn cần được cải tiến thêm. Sau đây là các yếu tố có thể cải tiến trong hệ vector SFV. 1.2.4.1 Vùng nhân dòng đa điểm Vùng nhân dòng đa điểm của pSFV rất hạn chế (chỉ có vị trí nhận biết của 3 enzym), chúng ta có thể cải tiến bằng cách bổ sung thêm các vị trí nhận biết enzym giới hạn mới giúp việc nhân dòng các gen sẽ trở nên linh hoạt và thuận lợi nhờ có thể lựa chọn thêm nhiều tổ hợp các enzym giới hạn phục vụ cho nhân dòng và biểu hiện các gen GPCR mong muốn. 1.2.4.2 Yếu tố tăng cường dịch mã Frolov và Schlesinger (1994) đã tìm thấy đoạn trình tự tăng cường dịch mã nằm ở gen mã hóa vỏ capsit xuất hiện ở Sindbis virut, một virut có cấu trúc khá tương đồng và cùng nhóm phân loại với SFV[12]. Nhiều nghiên cứu sau này đã cho thấy, khi thêm vùng tăng cường trên vào các vector biểu hiện, không những không làm giảm tốc độ phiên mã mARN mà còn tăng cường khả năng 19 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học dịch mã lên 10 đến 100 lần [10]. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy trên SFV có 102 nucleotit đầu tiên mã hóa cho protein vỏ capsid cũng có khả năng tăng cường dịch mã cho những gen xuôi chiều và cùng nằm trong khung đọc mở với đoạn trình tự này [48]. Thêm đoạn trình tự mã hóa cho vỏ capsit SFV vào trước vị trí nhân dòng có thể biểu hiện GPCR hàm lượng cao như một protein liên hợp với protein vỏ capsit. 1.2.4.3 Gắn FLAG-tag FLAG-tag hay FLAG octapeptit có bản chất là đuôi polypeptit gồm 8 axit amin ưa nước có thể gắn vào protein quan tâm (Bảng 1). Cấu trúc của FLAG-tag đã được tối ưu để tương thích với protein mà nó gắn vào. Đây là đoạn polypeptit ưa nước hơn so với hầu hết các epitop thông thường khác và do vậy ít có khả năng gây biến tính hoặc bất hoạt các protein mà nó gắn vào. FLAG peptit liên kết với kháng thể M1. Protein tái tổ hợp có gắn đuôi FLAG-tag có thể được phân lập bằng sắc kí ái lực và được xác định bằng kháng thể tương tác với đoạn FLAG-tag. Protein tái tổ hợp được gắn FLAG-tag đã được biểu hiện trong nhiều loại tế bào, từ vi khuẩn tới nấm men và tế bào động vật có vú [29]. FLAG-tag có thể được gắn vào đầu N hoặc đầu C của phân tử protein tái tổ hợp, tuy nhiên có nhiều kháng thể chỉ có thể nhận biết các epitop khi chúng ở đầu tận cùng N của protein. FLAG-tag có thể được sử dụng liên hợp với các tag có ái lực khác như His-tag hay myc-tag. Ngoài ra, FLAG-tag ở đầu tận cùng N có thể được loại bỏ dễ dàng từ các protein sau khi chúng đã được phân lập bằng cách xử lý với protease như enterokinase [51]. 1.2.4.4 Đuôi polyhistidin (His-tag) và vị trí thrombin Tinh sạch protein với đuôi polyhistidin (His-tag) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất và đã áp dụng thành công trong các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở nhân sơ, nấm, các tế bào động vật có vú và tế bào côn trùng nhiễm virut baculo [47]. Histidin là axit amin tương tác mạnh nhất với các ion kim loại nhờ dễ dàng hình thành liên kết giữa nhóm cho điện tử trên vòng imidazole của nó với kim loại. Polyhistidin (His-tag) là một đoạn axit amin chứa 20 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học ít nhất 5 histidin, thường được gắn vào đầu tận cùng C hoặc N của protein tái tổ  hợp và có thể được loại bỏ bởi các endopeptidase như Qiagen TAGZyme . His-tag thường được sử dụng để tinh sạch protein tái tổ hợp qua sắc kí ái lực của đuôi His-tag với các ion kim loại chuyển tiếp như Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2 + được cố định trên chất nền và các chuỗi axit amin đặc hiệu [20]. His-tag cũng được sử dụng để phát hiện protein trong các phản ứng tương tác sử dụng kháng thể Anti-HisG, phản ứng ELISA, Western blot cũng như các phản ứng phân tích miễn dịch khác. Đuôi His–tag có thể được loại bỏ nhờ có vị trí cắt thrombin có trình tự SGLVPR (liên kết peptit sẽ cắt giữa V và P). Vị trí thrombin được gắn vào nhiều hệ vector cho phép loại bỏ vùng ngược chiều, chủ yếu là các đuôi ái lực. Hệ vector SFV là một hệ thống tiềm năng với nhiều ưu điểm, có thể được nghiên cứu cải tiến thêm nhằm phục vụ cho biểu hiện protein màng nói chung và các GPCR nói riêng ở mức độ cao. Mặc dù vậy chưa có nhiều nghiên cứu nhằm cải tiến hệ vector này. Ở Việt Nam, sử dụng hệ SFV để biểu hiện các GPCR là hướng nghiên cứu mới song có nhiều tiềm năng phục vụ cho các nghiên cứu dược lý phân tử và sàng lọc dược chất từ các nguồn dược liệu tự nhiên của Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể Neurokinin-1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam”với mục tiêu nghiên cứu chính là: phát triển hệ vector SFV dựa trên vector SFV cơ bản cho phép biểu hiện các GPCR tái tổ hợp mà bước đầu là gen mã thụ thể Neurokinin 1 với đủ hoạt tính với hiệu suất cao. Để thực hiện mục tiêu nghiên cứu trên, chúng tôi đã tiến hành một số nội dung nghiên cứu sau: 1) Hoàn thiện quy trình chuẩn bị các lô tế bào khả biến DH5α có hiệu suất biến nạp đủ cao cho phép nhân dòng tất cả các plasmit của hệ vector SFV cơ bản một cách thuận tiện, dễ dàng. 2) Chuyển hệ vector SFV cơ bản và được cải biến vào các tế bào khả biến DH5α để lưu giữ, nhân dòng. 21 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 3) Cải biến hệ vector SFV cơ bản. 4) Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản và hệ vector SFV cải biến. 5) Sàng lọc chủng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp SFV mang gen mã hóa NK1. 22 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Các chủng vi khuẩn - Chủng vi khuẩn E.coli DH5α đã đột biến, có những thiếu hụt thuận lợi cho biến nạp và nhân nhanh plasmit hoặc cosmit tái tổ hợp mua của hãng Invitrogen (Mỹ). - Chủng vi khuẩn chứa plasmit pJET1.2 mang gen tái tổ hợp mã hóa cho thụ thể NK1 (pJET1.2-NK1) được cung cấp bởi PGS.TS Võ Thương Lan, trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội. Hình 7. Cấu trúc của vector pJET1.2 Trình tự đoạn cADN mã hóa cho thụ thể NK1 được đưa vào vetor pJET1.2: GATATGGATAACGTCCTCCCGGTGGACTCAGACCTCTCCCCAAACATCTCCACTAACACCACGGTCATTG Mã mở đầu TGGTGACCTCTGTGGTGGGCAACGTGGTAGTGATGTGGATCATCTTAGCCCACAAAGGAATGAGGACAGT GACGAACTATTTTCTGGTGAACCTGGCCTTCGCGGAGGCCTCCATGGCTGCATTCAATACAGTGGTGAAC TTCACCTATGCTGTCCACAACGAATGGTACTACGGCCTGTTCTACTGCAAGTTCCACAACTTCTTTCCCA TCGCCGCTGTCTTCGCCAGTATCTACTCCATGGCGGCTGTGGCCTTTGATAGGTACATGGCCATCATACA TCCCCTCCAGCCCCGGCTGTCAGCCACAGCCACCAAAGTGGTCATCTGTGTCATCTGGGTCCTGGCTCTC 23 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học CTGCTGGCCTTCCCCCAGGGCTACTACTCAACCACAGAGACCATGCCCAGCAGAGTCGTGTGCATGATCG AATGGCCAGAGCATCCGAACAAGATTTATGAGAAAGTGTACCACATCTGTGTGACTGTGCTGATCTACTT CCTCCCCCTGCTGGTGATTGGCTGTGCATACACCGTAGTGGGAATCACACTATGGGCCAGTGAGATCCCC GGGGACTCCTCTGACCGCTACCACGAGCAAGTCTCTGCCAAGCGCAAGGTGGTCAAAATGATGATTGTCG TGGTGTGCACCTTCGCCATCTGCTGGCTGCCCTTCCACATCTTCTTCCTCCTGCCCTACATCAACCCAGA TCTCTACCTGAAGAAGTTTATCCAGCAGGTCTACCTGGCCATCATGTGGCTGGCCATGAGCTCCACCATG TACAACCCCATCATCTACTGCTGCCTCAATGACAGGTTCCGTCTGGGCTTCAAGCATGCCTTCCGGTGCT GCCCCTTCATCAGCGCCGGCGACTATGGGGGGCTGGAAATGAAATCCACCCGGTATCTCCAGACCCAGGG CAGTGTGTACAAAGTCAGCCGCCTGGAGACCACCATCTCCACAGTGGTGGGGGCCCACGAGGAGGAGCCA GAGGACGGCCCCAAGGCCACACCCTCGTCCCTGGACCTGACCTCCAACTGCTCTTCACGAAGTGACTCCA AGACCATGACAGAGAGCTTCAGCTTCTCCTCCAATGTGCTCTCCTAGGCCACAGGGCCTTTGGCAGGTGC Mã kết thúc AGCCCCCACTGCCTTTGACCTGCCTCCCTTCATGCATGGAAATTCCCTTCATCTGGAACCATCAGAAACA CCCTCACACTGGGACTTG 2.1.2 Hệ vector SFV Hệ vector SFV cơ bản gồm vector pSFV và vector pHelper là quà tặng từ TS. Kenneth H. Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) tặng có cấu trúc như trình bày ở phần tổng quan (xem mục 1.2.2, các hình 4 – 6). 2.1.3 Các cặp mồi PCR và các đoạn oligonucleotit dùng để cải biến vector Các cặp mồi PCR dùng để nhân các phân đoạn ADN đặc hiệu của vector SFV hoặc của gen NK1 được thiết kế bằng các phần mềm (Primer Premier 5 và PerPrimer, Ver 1.1.14) có vị trí được minh họa trên hình 8 và có trình tự được trình bày trên bảng 4. Các đoạn oligonucleotit được dùng để cải biến vector, đoạn trình tự đa nhân dòng O-M7 và đoạn nối (linker) M3 – M4 lần lượt được trình bày trên bảng 5, hình 9. Tất cả các mồi PCR và các đoạn oligonucleotit được đặt mua từ hãng IDP (Mỹ) qua Công ty TNHH vật tư KHKT Đông Dương (Hà Nội, Việt Nam). Bảng 4. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu Tên mồi F-N R-N 807 809 808 NK1 F NK1 R NK1 R1 Trình tự (5’-3’) Mục đích TGACCTGTTATACACCTCTACG AGGCCCGGGATGACCACTCTTC GCCCATCTATGACAACAAG GTGCGATACCCGACATG ACCTCCAACTGCTCTTCAC CGAAATGGATAACGTCCTCCC CAAGTCCCAGTGTGAGGGTG GCCAGCAGATGGCGAAGG Nhân các trình tự của SFV 24 Nhân các trình tự của gen NK1 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Hình 8. Vị trí các mồi trên cADN mã cho thụ thể NK1 Tên mồi O-M1 M1M6 O-M2 M2M7 O-M3 O-M4 Bảng 5. Trình tự các oligonucleotit sử dụng trong nghiên cứu Trình tự (5’-3’) Mục đích AGCGAGATCTTGACTACAAGGACGACGAT BglII GACAAGCACCACCATCATCACCACCATCA CCATCACAGCAGCGGCCTGGTTCCGCGTG GG TCTGGATCCTA BamHI ATCAGGATCCAGACCCA Tạo linker chứa trình tự của Flag-tag, Histag, vị trí Thrombin ATTGGGATCCGCTAAGCGCGCTTCGAA BamHI TCGATGCATCCTAGGGCCCGGGCGC XmaI GCGCCCGGGCCCTAGGATGCATCGA Tạo ra linker chứa vùng nhân dòng đa GATCGGATCCGC (gọi là đoạn O-M6) điểm cải tiến O-M7 Tạo linker M3-M4 TTAGCGGATCC (Màu xám: đoạn chứa trình tự của Flag-tag, màu vàng: đoạn chứa trình tự của His10-tag, màu hồng: đoạn chứa trình tự của Thrombin) Hình 9. Trình tự vị trí nhân dòng đa điểm của đoạn O-M7 25 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 2.1.4 Các nhóm hóa chất chính được sử dụng - Nhóm hóa chất cải biến vector SFV gồm có: các hóa chất sử dụng trong phản ứng nhân bản gen cần phân tích (PCR) như đệm, dNTP, MgCl2, các polymerase, mồi đặc hiệu, các enzym giới hạn và đệm tương ứng với các enzym. - Nhóm hóa chất chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp plasmit vào tế bào DH5α gồm dung dịch CaCl2 0.1M, dung dịch MgCl2 2M, dung dịch MgCl2CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2), dung dịch Glucosse 1M, dung dịch KCl 250 mM, môi trường LB lỏng để tăng trưởng chủng ban đầu, kháng sinh thích hợp (ampicillin), môi trường SOC. - Nhóm các hóa chất tách plasmit gồm Sol I ( glucose 50 mM; đệm TrisHCl, 25 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM); Sol II (NaOH 0,2N, 1% SDS); Sol III (CH3COOK 5M: 60 ml, CH3COOH băng: 11,5 ml, H2O: 28,5 ml, Rnase 10 mg/ml không chứa DNase). Phenol: chloroform: isoamylalcohol được trộn theo tỷ lệ 25:24:1 về thể tích, trong đó phenol có pH 8.0; ethanol; đệm TE (10 mM Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 có chứa EDTA 1mM); isopropanol; dung dịch axetate kali 5M. - Nhóm hóa chất cho phản ứng cắt – nối ADN được cung cấp bởi Fermentas gồm các enzyme giới hạn FastDigest, T4 DNA ligase, FastAPThermosensitive Alkaline Phosphatase (FTAP), đoạn Klenow. - Nhóm các hóa chất điện di gồm agarose, đệm TAE, ethidium bromide, thang chuẩn ADN. - Kit tinh sạch sản phẩm PCR gồm AccuPrep PCR Purification Kit (K3034-1 của Bioneer), Kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas). Các hoá chất đều đảm bảo độ tinh sạch và được cung cấp bởi các hãng uy tín trên thế giới: Bioneer (Hàn Quốc), Thermo Scientific (Mỹ), Merck (Đức), IDP (Mỹ), Promega (Mỹ), Sigma (Mỹ),… 2.1.5 Trang thiết bị nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện bằng các trang thiết bị, máy móc phục vụ nghiên cứu sinh học phân tử - tế bào tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein và Phòng thí nghiệm Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 26 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chúng tôi tiến hành xây dựng 2 vector cải biến là pSFV-M7 và pSFV-M8 từ vector cơ bản là pSFV. Hai vector cải biến sẽ có thêm đoạn tăng cường dịch mã (gen mã hóa vỏ capsit của SFV), FLAG-tag, HIS10-tag, vị trí Thrombin, vùng nhân dòng đa điểm được thiết kế thêm các vị trí enzym cắt mới theo sơ đồ thí nghiệm hình 10. cADN mã gen NK1 được cài vào các vector pSFV theo các bước trong hình 11, 12. Hình 10. Sơ đồ nghiên cứu tạo vector cải tiến pSFV-M7 và pSFV-M8 Hình 11. Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cải tiến 27 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Hình 12. Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cơ bản Các nội dung nghiên cứu được tiến hành dựa vào các phương pháp được nêu bên dưới. 2.2.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp Chúng tôi nhận được hệ vector SFV cơ bản (pSFV, pHelper) với một lượng rất nhỏ (~5µl), lượng ADN này chỉ đủ cho 1-2 lần biến nạp nên một trong những nội dung nghiên cứu chúng tôi được yêu cầu là xây dựng quy trình chuẩn bị tế bào DH5α khả biến và biến nạp với hiệu suất cao nhât. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu dựa trên các quy trình được trình bày trong cuốn Molecular Cloning- A Laboratory manual[45], gồm: - Quy trình chuẩn bị và biến nạp các tế bào khả biến E.coli sử dụng Calcium Chloride. - Phương pháp Inoue để chuẩn bị và biến nạp các tế bào khả biến E.coli: tế bào “siêu-khả biến”. - Chuẩn bị tế bảo khả biến E.coli và biến nạp theo phương pháp của Hanahan. Số liệu được tính toán và xử lý để đánh giá kết quả thí nghiệm: - Chỉ số OD 600 giúp xác định sự tăng trưởng của dịch nuôi cấy. - Hiệu quả biến nạp được tính là tổng số khuẩn lạc biến nạp ứng với mỗi µg plasmit ADN siêu xoắn. Hiệu suất biến nạp mong muốn 5x106 đến 2x 107 khuẩn lạc biến nạp/ µg plasmit ADN siêu xoắn. Từ các kết quả thu được, tìm ra quy trình chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp tối ưu. 28 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 2.2.2 Phương pháp tách chiết plasmit ADN plasmit được tách chiết theo quy trình của Sambrook và cs [45] gồm các bước sau: Chiều /tối ngày thứ nhất: Chuyển 1 khuẩn lạc đơn lẻ trên đĩa thạch vào bình tam giác chứa 10ml LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Ủ bình nuôi cấy ở 37oC và lắc qua đêm. Ngày thứ hai: 1. Ly tâm 30 giây thu cặn tế bào. 2. Thêm 200 µl Sol I, hoà kết tủa và giữ hỗn hợp 5 phút ở nhiệt độ phòng. 3. Thêm 400 µl Sol II, ủ trên đá 3 phút. 4. Thêm 300 µl Sol III, ủ hỗn hợp trên đá 5 phút. 5. Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 10 phút. Chuyển 700 µl dịch nổi sang ống mới. 6. Thêm 13 µl RNase (1mg/ml) vào dịch nổi để đạt đến nồng độ cuối cùng 20 µg/ml, ủ ở 37˚C trong 20 phút. 7. Thêm thể tích tương đương hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (tỷ lệ 25:24:1 về thể tích), trộn đều, sau đó ly tâm ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 5 phút để thu pha trên. 8. Bổ sung 600 µl isopropanol, trộn nhiều lần, giữ ở nhiệt độ phòng 20 phút. Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 10 phút để thu tủa. 9. Bổ sung 1 ml ethanol 70% để lạnh, ly tâm ở 4oC, 14000 vòng/phút, trong 5 phút. Làm khô mẫu và hoà tan tủa trong 50 µl đệm TE. Mẫu ADN thu được có thể bảo quản ở 4oC trong thời gian vài ngày hoặc bảo quản lâu dài ở 20oC cho đến khi được dùng cho những nghiên cứu tiếp theo. 2.2.3 Duy trì, bảo quản mẫu sinh phẩm trong quá trình phân lập và nhân dòng Trong quá trình phân lập và nhân dòng, các vector được đưa vào chủng vi khuẩn E.coli DH5α để lưu giữ và nhân dòng. Chúng tôi bảo quản các dòng vi khuẩn theo 2 cách: giữ trong các đĩa LB đặc (môi trường thạch có agar) ở 4oC và trong các ống LB lỏng (không có agar) được bổ sung thêm glycerol ở -250C. 29 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Phương pháp bảo quản mẫu giống trong môi trường thạch: Vi khuẩn được cấy theo kiểu zic zắc trên môi trường thạch LB và ủ qua đêm ở 37oC, rồi được lưu giữ ở 4oC. Cứ sau 14 ngày, quy trình cấy chuyển được lặp lại để giữ giống. Phương pháp bảo quản mẫu trong môi trường lỏng gồm các bước sau: 1. Chuyển 500µl dịch vi khuẩn vào ống eppendorf, thêm 250 µl glycerol 60% (đã khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 1atm trong 20 phút). 2. Lắc vortex dung dịch để glycerol khuếch tán đều. 3. Đông lạnh nhanh dung dịch bằng nitơ lỏng. Có thể bảo quản mẫu giống đông lạnh trong thời giàn dài ở -70oC hoặc trong vài tháng ở 25oC. 4. Để thu vi khuẩn, cào nhẹ lớp bề mặt môi trường đông lạnh với que cấy đầu tròn đã khử trùng rồi cấy sang môi trường LB thích hợp. 2.2.4 Thiết kế mồi Hai phần mềm thiết kế mồi Primer Premier 5 và PerPrimer 1.1.14 được sử dụng để thiết kế và lựa chọn cặp mồi PCR tối ưu trên cơ sở đánh giá các chỉ số về tính đặc hiệu, độ bền, nhiệt năng và tính tương thích (khả năng tránh tự bắt cặp). Cặp mồi F-N/R-N dùng để nhân dòng gen mã protein vỏ capsit từ pHelper. Riêng mồi F-N có vị trí trên pSFV cơ bản, nằm trước trình tự Flag-tag ~50 bp được dùng làm mồi xuôi cho vector pSFV trong sàng lọc khuẩn lạc. Mồi 807 nằm trước trình tự Flag-tag 126bp trong cả hai vector pSFV-M7 và pSFV-M8. Chính vì vậy, mồi 807cũng được dùng như mồi xuôi cho hai vector pSFV cải tiến trên trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc. Mồi 809 có trình tự trên tất cả các phiên bản pSFV, cách vị trí nhân dòng đa điểm 408bp. Chính vì vậy, mồi 809 được dùng làm mồi ngược cho tất cả các phiên bản pSFV trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc. Các mồi được thiết kế sao cho có nhiệt độ gắn mồi gần nhau để có thể kết hợp các mồi linh hoạt tùy theo mục đích thí nghiệm. 30 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 2.2.5 Khuếch đại ADN nhờ phản ứng PCR (polymerase chain reaction) Phương pháp PCR nhìn chung là đơn giản và dễ thực hiện, song để thu được kết quả tốt, cần phải có sự tối ưu các thành phần tham gia phản ứng, chu trình nhiệt và sự ổn định của các điều kiện thí nghiệm cũng như trang thiết bị chuyên dụng. Các thành phần tham gia phần ứng PCR được thiết lập dựa trên mối liên hệ của chúng với nhau trong một phản ứng tổng hợp và các thí nghiệm điều chỉnh thử nghiệm. Đối với kỹ thuật PCR, thiết lập được một chu trình nhiệt là một yếu tố quan trọng, đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử ADN cũng như việc gắn mồi và kéo dài chuỗi trong mỗi chu kỳ. Sự thay đổi yếu tố nào đó trong chu trình nhiệt có thể sẽ thu được sản phẩm PCR không như mong muốn. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã tiến hành 2 loại phản ứng PCR là PCR thông thường (standard PCR) và colony PCR. Phản ứng PCR thông thường được tiến hành trực tiếp trên khuôn là ADN. Colony PCR là phản ứng PCR nhằm sàng lọc nhanh khuẩn lạc có mang đoạn gen quan tâm. Khuẩn lạc được thu từ đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh phù hợp được hòa vào 10µl LB lỏng, 1 µl hỗn hợp này được dùng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng colony PCR. Chính từ sự khác biệt này, colony PCR cần có thời gian biến tính bước đầu ở 950C dài hơn so với PCR thông thường. 2.2.6 Cắt giới hạn ADN và chống ADN tự đóng vòng Để tạo được các đoạn chèn và các linker, mở vòng vector, tạo đầu bằng, đầu dính mong muốn, các ADN vector và mang gen mã NK1 đã được cắt bằng các enzym giới hạn phù hợp. Bảng 6 mô tả thành phần điều kiện của của một phản ứng cắt cơ bản trong thể tích 20µl. Để đảm bảo phản ứng cắt xảy ra hoàn toàn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm tối ưu thời gian ủ, hàm lượng ADN và nồng độ enzym. Bảng 6. Phản ứng cắt với enzym giới hạn Thành phần Thể tích/ lượng Điều kiện Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ và thời ADN 100 ng-1 µg 10X Buffer 2 µl Mỗi enzym giới hạn 1 µl (1-10u) H 20 Thêm đến thể tích cuối là 20µl 31 gian thích hợp với từng loại enzym Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Các đầu dính và đầu bằng của đoạn ADN sau khi cắt giới hạn có khả năng tự nối hoặc tự đóng vòng (đối với vector) khi có ADN ligase. Phản ứng tự nối của ADN được ngăn cản bằng cách loại bỏ nhóm phosphat đầu 5’ của ADN nhờ sử dụng enzym Alkaline Phosphatase (Thermo Scientific FastAP Thermosensitive, Thermo Scientific) với thành phần phản ứng và điều kiện nêu ở bảng 7. Bảng 7. Điều kiện của phản ứng dephosphoryl hóa đầu 5’ADN Thành phần ADN dạng thẳng 10X FastAP Bufer FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase H2O Thể tích phản ứng 1µg 2 µl 1 µl (1u) Đến 20 µl Điều kiện Ủ 20 phút ở 37°C. Bất hoạt 75°C trong 5 phút 2.2.7 Tạo các đoạn ADN sợi đôi và các linker từ các đoạn oligonucleotit Đoạn Klenow là đoạn lớn của ADN polymerase I, E.coli. Nó có hoạt tính 5’-3’ ADN polymerase và 3’-5’ exonuclease nhưng thiếu mất hoạt tính 5’-3’ exonuclease của ADN polymerase I. Chính vì vậy, đoạn Klenow được dùng để lấp đầy đầu khuyết 3’ của ADN sợi đôi. Để tạo ra đoạn ADN sợi đôi có các trình tự mong muốn, tôi thiết kế 1 đoạn oligonucleotit dài chứa tất cả các trình tự cần thiết và một đoạn oligonucleotit ngắn (14-20 Nu) bắt cặp bổ sung với với đầu 3’ của đoạn oligonucleotit dài. Hai đoạn oligonucleotit dài/ngắn sẽ là cơ chất của đoạn Klenow để tạo ra đoạn ADN sợi đôi mong muốn thông qua các phản ứng sau: a. Phản ứng giúp gắn hai đoạn oligonucleotit dài/ngắn: • Đoạn oligonucleotit dài [50 µM]: 1 µl • Đoạn oligonucleotit ngắn [50 µM]: 1.5 µl • 10X buffer của enzyme giới hạn: 1 µl • H20: 6.5 µl Hai sợi oligobucleotit có trình tự bổ sung sẽ liên kết với nhau bằng liên kết hidro sau khi xử lý với chu trình nhiệt: 95°C trong 5 phút, hạ xuống (Tm của mồi-5°C) trong 5 phút, cuối cùng để mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. b. Phản ứng tạo sợi ADN đôi nhờ đoạn Klenow Thêm vào 10 µl hỗn hợp phản ứng (a) các thành phần như sau: 32 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học • 10X Klenow buffer: 2 µl • dNTP 2mM: 2.5 µl • Đoạn Klenow 2u/ µl: 2.5 • H20: 3 µl Ủ hỗn hợp trên 1 giờ ở 37°C và bất hoạt ở 75°C trong 20 phút. c. Tạo linker với các đầu dính mong muốn bằng cách dùng 2 enzym giới hạn thích hợp cắt ADN sợi đôi vừa thu được. d. Tinh sạch sản phẩm cuối cùng bằng PCR AccuPrep PCR Purification Kit® (K-3034-1 của Bioneer). 2.2.8. Phản ứng nối các đoạn ADN Việc nối các đoạn ADN được thực hiện nhờ enzym nối T4 DNA ligase ở 16°C qua đêm trong điều kiện và các thành phẩn phản ứng được trình bày ở bảng 7. Trước khi tiến hành phản ứng, các đoạn ADN được đo OD260/280 để ước tính hàm lượng. Để có phản ứng nối tối ưu giữa đoạn chèn ADN với vector, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm với dải tỷ lệ đoạn chèn/vector từ 1:1 đến 10:1. Thành phần và điều kiện của các phản ứng nối giữa đoạn cài ADN và vector đầu dính được nêu ở bảng 8 và nối các linker được nêu ở bảng 9. Bảng 8. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu bằng Thành phần Vector dạng thẳng Đoạn chèn ADN 10X T4 DNA Ligase Bufer 50% PEG 4000 Solution T4 DNA Ligase 5 u/µl H2O Thể tích phản ứng ~20ng Lượng gấp 1 đến 10 lần vector 1 µl 1 µl 1 µl Đến 10 µl Bảng 9. Thành phần của phản ứng nối ADN và vector đầu dính Thành phần Vector dạng thẳng Đoạn chèn ADN 10X T4 DNA Ligase Bufer T4 DNA Ligase 1 u/µl H2O Thể tích phản ứng ~20ng Lượng gấp 1 đến 10 lần vector 1 µl 1 µl Đến 10 µl 33 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Bảng 10. Điều kiện của phản ứng nối linker Thành phần ADN dạng thẳng Linker đã phosphoryl hóa 10X T4 DNA Ligase Bufer 50% PEG 4000 Solution T4 DNA Ligase 1 u/µl H2O Thể tích phản ứng 50-200 ng ~1µg 1 µl 1 µl 2 µl Đến 10 µl Điều kiện Ủ 1 giờ ở 22°C. Bất hoạt 65°C trong 10 phút 2.2.9 Sàng lọc khuẩn lạc Hỗn hợp nối các đoạn linker vào vector sẽ được biến nạp và tế bào E.coli DH5α khả biến, cấy trải trên đĩa LB chứa ampicillin rồi ủ ở 37°C qua đêm. Mỗi khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB bổ sung kháng sinh được sàng lọc nhanh bằng phản ứng clonyPCR. Khuẩn lạc có băng kích thước phù hợp sẽ được sàng lọc tiếp bằng cách nuôi bão hòa qua đêm trong môi trường LB bổ sung kháng sinh (100µg/ml), lắc ở 37°C qua đêm, tách plasmit. Các phân đoạn cải biến được nhân lên từ plasmit bằng phản ứng PCR và giải trình tự ở Công ty Cổ phần Dịch vụ Phân tích Di truyền (Hà Nội, Việt Nam). 34 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp Vì lượng plasmit của hệ vector SFV cơ bản chúng tôi nhận được với một lượng rất nhỏ (~5µl), để đảm bảo biến nạp plasmit với hiệu suất cao nhất và tránh bị mất vector nên chúng tôi đã thực hiện xác định quy trình chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp với hiệu suất cao nhất trong điều kiện thí nghiệm và trang thiết bị hiện tại. Sau khi thử nghiệm các quy trình chuẩn bị tế bào khả biến khác nhau, tôi nhận thấy quy trình chuẩn bị tế bào khả biến bằng CaCl2 có thao tác và hóa chất đơn giản, nhanh gọn hơn phương pháp của Hanahan. Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn khi chuẩn bị tế bào khả biến bằng CaCl2 là lắc ở 37°C, dễ áp dụng tromg điều kiện phòng thí nghiệm hơn phương pháp Inoue (nuôi cấy ở 18°C kết hợp lắc). Chính vì vậy, chúng tôi quyết định chuẩn bị tế bào khả biến sử dụng CaCl2. Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, dựa vào chỉ số O.D600 chúng tôi đã xây dựng được đường cong sinh trưởng thực tế của E.coli trong điều kiện nuôi cấy của phòng thí nghiệm chúng tôi (xem Hình 13). Chúng tôi cũng nhận thấy khi O.D600 = 0.35 bắt đầu thu khuẩn, tế bào sẽ có tần số biến nạp rất cao và thời gian để dung dịch nuôi cấy đạt mức O.D này càng ngắn thì tần số biến nạp càng tăng. Bảng 11 cho thấy kết quả biến nạp của 3 lô tế bào khả biến có thời gian nuôi cấy đạt O.D600 = 0.35 khác nhau. Hiệu suất biến nạp được đánh giá dựa trên số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin/ lượng plasmit dùng để biến nạp (µg). Hình 13. Đường cong sinh trưởng của E.coli DH5α 35 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Bảng 11. Tần số biến nạp của một số lô tế bào khả biến Kết quả đo OD600 Sau 60 phút Sau 80 phút Sau 90 phút Sao 95phút Sau 115 phút Sau 125 phút Số khuẩn lạc mọc Hiệu suất biến nạp (số khuẩn lạc/µg plasmit) Lô 1 0,103 0, 175 Lô 2 0,156 0,271 0,209 0,271 0,345 25 4175 0,331 0,356 Lô 3 0.162 0.278 0.357 2320 3504 ~387400 ~585000 Áp dụng quy trình chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp được trình bày dưới đây, chúng tôi đã chuyển thành công tất cả các plasmit vào trong tế bào E.coli DH5α để nhân dòng và lưu giữ. a. Quy trình chuẩn bị tế bào khả biến Chiều/tối ngày thứ nhất: 1. Chuyển 1 khuẩn lạc từ môi trường thạch LB vào 10ml môi trường lỏng LB. 2. Lắc dịch nuôi vi khuẩn ở 37oC qua đêm (180 vòng/phút). Ngày thứ hai: 3. Chuyển 1 ml dịch nuôi từ bước 2 vào 50ml môi trường LB lỏng. 4. Nuôi lắc ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,3 – 0,4 (khoảng 90 - 120 phút). 5. Chuyển dịch nuôi vào 2 ống ly tâm, mỗi ống chứa 25ml. Ủ trên đá 10 phút, ly tâm ở 4oC, tốc độ 3500 vòng/phút, trong 10 phút để thu cặn. 6. Nhẹ nhàng khuếch tán cặn tế bào (cặn ly tâm) trong mỗi ống ly tâm bằng cách bổ sung 7,5ml dung dịch MgCl2-CaCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2). Ủ trên đá 30 phút, ly tâm ở 4oC, 3500 vòng/phút, trong 10 phút để thu cặn. 7. Khuếch tán cặn tế bào trong ống ly tâm bằng bổ sung 1ml CaCl2 0,1M. 8. Chia lượng dịch vi khuẩn vào các ống eppendorf mỗi ống chứa 125 µl TE và bảo quản ở -20oC. b) Quy trình biến nạp vào tế bào DH5α 1. Lấy tế bào khả biến và plasmit lưu trong tủ -20OC, cho tan từ từ bằng cách để trong đá ~ 15 phút. 2. Lấy 125 µl tế bào khả biến, bổ sung thêm 2.5µl plasmit siêu xoắn (nồng độ ~30 ng/µl), trộn đều hỗn hợp. Ủ trên đá 20 phút. 3. Chuyển ống vào bể ổn nhiệt 42oC trong 90 giây. 36 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 4. Nhanh chóng chuyển các ống nghiệm vào đá trong 2 phút. 5. Thêm 500µl môi trường LB (đã ủ ở 37°C ít nhất 1 giờ) cho mỗi ống, lắc đều hỗn hợp. Ủ hỗn hợp ở 37°C trong 25 phút. Ủ hỗn hợp ở 37°C kết hợp lắc nhẹ (50 vòng/phút hoặc thấp hơn) trong 25 phút. 6. Cấy 50 µl hỗn hợp biến nạp lên đĩa LB đã bổ sung ampicilin (nồng độ cuối là 100µg/ml). Khuẩn lạc biến nạp có thể xuất hiện sau 12-16 giờ. 3.2 Cải tiến vector pSFV 3.2.1. Khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV (đoạn chèn 1) Đoạn gen mã vỏ capsit của SFV (gồm 267 axit amin; vị trí 1-267) dài 896 bp được khuếch đại với khuôn pHelper và cặp mồi F-N/R-N có chứa trình tự nhận biết của XmaI. Trình tự sản phẩm lý thuyết dự kiến như sau: GACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTAATACACAGAATTCTGATTATAGCGCAC EcoRI TATTATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGG Mã mở đầu CCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCA GCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAA CCAAAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGC AGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGCAT GAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGAAAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTG GGCGACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAAGGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGCTAGCTT TCAAGAAATCGAGCAAGTATGACCTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGAGGTCGGATGCCTCAAA GTACACGCATGAGAAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACGGGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGG TTCACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAGACAGTGGCCGGCCCATCTTTG°ACAACAAGGGGAGG GTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGGCCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCGGTGGTCACCTGGAACA AAGATATGGTGACTAGAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGGTCCTCCCGGGCCT Mã axit amin 267 XmaI Trong nghiên cứu này, các thành phần phản ứng PCR được thiết lập dựa trên mối tương tác của chúng với nhau trong một phản ứng tổng hợp và các điều kiện thí nghiệm được thử nghiệm. Ở nhiệt độ gắn mồi (Tm =) 54oC, thành phần và điều kiện của phản ứng PCR như trình bày trong bảng 12, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose cho một băng đặc hiệu, rõ và sáng có kích thước xấp xỉ 900 bp (hình 14), phù hợp với kích thước lý thuyết là 896bp. Như vậy, tôi đã nhân lên thành công đoạn gen mã hóa cho vỏ capsit của SFV với đủ chất lượng để phục vụ cho các phản ứng tiếp theo. 37 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học M (-) C (a) (b) Hình 14. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mã vỏ capsit của SFV (a) Ảnh điện di: M-thang chuẩn 1kb, (-)-đối chứng âm, C- sản phẩm PCR (b) Kích thước thang chuẩn 1kb (M, Fermentas) Bảng 12. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV Thành phần Thể tích (µl) Chu trình nhiệt H2O 19.2 Thời gian biến tính đầu tiên: 940C, 5 phút 10X Taq pol Buffer 3.0 Lặp lại 45 chu kì: MgCl2 25 mM 0.8 + Biến tính: 940C, 30 giây dNTP 2mM 2.0 + Gắn mồi: 540C, 30 giây F-N/ R-N 2 µM 1.0 + Tổng hợp: 720C, 90 giây Taq pol 1 u/µl 1.0 Thời gian tổng hợp sau cùng: ADN 2.0 720C, 10 phút Tổng 30.0 Để đảm bảo đoạn gen được nhân lên có đoạn trình tự có khả năng tăng cường dịch mã (102 Nu đầu tiên trong khung đọc mở mã hóa cho vỏ capsit), trước khi xử lý enzym để thu đoạn chèn 1, sản phẩm PCR được tinh sạch và đem đi giải trình tự. Kết quả giải trình tự (Hình 15) cho thấy đoạn gen nhân lên có một sai khác so với trình tự khuôn pHelper: thay T bằng C ở vị trí 132 tương ứng với sự thay đổi bộ ba mã hóa CCT thành CCC. Tuy nhiên, hai bộ ba mã hòa này đều mã hóa cho Prolin nên thay đổi nucleotit trên không làm ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của của protein mà nó mã hóa. 38 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Hình 15. Một phần kết quả giải trình tự phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mã vỏ capsit của SFV 3.2.2 Thu đoạn chèn số 2 Không thể gắn trực tiếp đoạn chèn 1 có đầu dính EcoRI/ XmaI vào pSFV vì pSFV có 4 vị trí cắt của EcoRI. Chính vì vậy, chúng tôi thiết kế một đoạn chèn thứ 2 có 2 đầu dính BglII/EcoRI gắn trước đoạn chèn 1, làm đoạn trung gian giúp nối đoạn chèn 1 vào vector pSFV cơ bản mở vòng bằng BglII/XmaI. Đoạn chèn số 2 được thu từ pHelper bằng phản ứng cắt phối hợp nhiều enzym có vị trí trên vector như minh họa trên hình 16. Hình 16. Vị trí của đoạn chèn thứ 2 (đoạn màu xanh) trong pHelper 39 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Sau nhiều phản ứng tối ưu nồng độ enzym cắt và ADN, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% như ở Hình 17a cho thấy phản ứng cắt liên hợp đã xảy ra hoàn toàn cho ra 4 băng sáng, nét có kích thước phù hợp với lý thuyết là 1355 bp, 5993 bp, 676 bp và 313 bp. Băng ADN có kích thước xấp xỉ 700bp được cắt và thu hồi bằng kit thôi gel GeneJET Gel Extraction Kit ®(Fermentas). Ảnh điện di trong Hình 17c cho thấy tôi đã thu hồi được thành công đoạn chèn số 2 có chất lượng đảm bào để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt pHelper bằng BglII, EcoRI và AccI được trình bày trong Bảng 13. 1 1 2 (a) (b) 2 (c) (d) Hình 17. Ảnh điện di đoạn chèn 2 trên gel agarrose 1%. (a) Làn 1: sản phẩm cắt pHelper bằng BglII/EcoRI/ AccI, làn 2: thang chuẩn 1kb. (b): thang chuẩn 1kb (Fermentas). (c) Làn 1: đoạn chèn 2 sau khi thôi gel, làn 2: thang chuẩn 100bp. (d): thang chuẩn 100bp (Fermentas) Bảng 13. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt thu đoạn chèn 2 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện hoạt động 10X Buffer Tango ADN BglII AccI H2O Thêm: 2 5 1 1 11 20 µl hỗn hợp ủ 370C qua đêm FastDigest EcoRI 10X FastDigest Buffer H2O 1 0.5 3.5 25 µl hỗn hợp ủ 370C - 10 phút. Bất hoạt ở 800C -20 phút 40 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 3.2.3. Sàng lọc khuẩn lạc mang vector cải biến pSFV-M7, pSFV-M8 Hỗn hợp sau phản ứng nối được biến nạp trực tiếp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả trên môi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml, chúng tôi thu được hàng trăm khuẩn lạc. Từ tập hợp này, chúng tôi thu ngẫu nhiên 74 khuẩn lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn ADN vector cải tiến pSFV-M7 và 65 khuẩn lạc lạc để kiểm tra sự có mặt của đoạn vector cải tiến pSFV-M8 bằng phản ứng colony PCR dùng cặp mồi 807/809. Đây là 2 cặp mồi nhân lên đoạn ADN chứa vùng cải tiến gồm có FLAG-tag, His-tag, vị trí Thrombin và vùng nhân dòng đa điểm của 2 vector cải tiến, có kích thước 634 bp. Thành phần và điều kiện của phản ứng colony PCR được trình bày trên bảng 14. Bảng 14. Thành phần và điều kiện phản ứng colony PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa vector cải tiến pSFV-M7, pSFV-M8 Thành phần H2O 10X Taq pol Buffer MgCl2 25 mM dNTP 2mM 807/ 809 2 µM Taq pol 1 u/µl Khuôn Tổng Thể tích (µl) 9.7 1.5 0.3 1.0 0.5 0.5 1.0 15.0 Chu trình nhiệt Thời gian biến tính đầu tiên: 940C, 15 phút Lặp lại 30 chu kì: + Biến tính: 940C, 30 giây + Gắn mồi: 600C, 30 giây + Tổng hợp: 720C, 60 giây Thời gian tổng hợp sau cùng: 720C, 6 phút 634bp (a) (b) Hình 18. Ảnh điện di sản phẩm colony PCR sàng lọc khuẩn lạc mang vùng pSFV cải biến. (a) Làn 1-6: sàng lọc khuẩn lạc mang vector pSFV-M7; làn M: thang chuẩn 100bp; làn 7-12: sàng lọc khuẩn lạc mang vector pSFV-M8. (b) Làn M7.2 và M8.1: sản phẩm PCR dùng mồi 807/809 trên khuôn plasmit của khuẩn lạc có kí hiệu tương ứng sau khi tinh sạch; làn M: thang chuẩn 100bp 41 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy tôi đã thu được 6/74 khuẩn lạc mang đoạn chèn cải biến cho vector pSFV-M7 (kí hiệu M7.1 đến M7.6) và 4/65 khuẩn lạc mang đoạn chèn cải biến cho vector pSFV-M8 (kí hiệu M8.1 đến M8.4). Trong Hình 18b, sản phẩm PCR sau khi tinh sạch của mẫu M7.2 và M8.1 cho các băng rõ nét nên được chọn để giải trình tự kiểm tra trình tự vùng cải biến. Kết quả giải trình tự các dòng M7.2 và M8.1 (hình 19 và 20) cho thấy các đoạn cải biến đã được chèn thành công vào đúng vị trí trên pSFV cơ bản như thiết kế. Hình 19. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M7 42 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Hình 20. Kết quả giải trình đoạn cải tiến trong vector pSFV-M8 3.3 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản 3.3.1. Nhân dòng đoạn cADN mã hóa cho thu thể NK1 có đầu bằng bằng phản ứng PCR dùng Pfu DNA polymerase Chúng tôi nhân dòng thành công cADN mã cho thụ thể NK1 từ khuôn là vector nhân dòng pJET1.2-NK1 theo điều kiện phản ứng PCR được nêu ở bảng 15. 1.3kb Hình 21. Ảnh điện di sản phẩm PCR cADN mã gen NK1 dùng Pfu DNA polymerase. Làn 1: sản phẩm PCR, làn 2: thang chuẩn 1kb (Fermentas) Hình 21 cho thấy, kích thước sản phẩm điện di thu được phù hợp với kích thước lý thuyết (~1.3kb). Băng điện di thu được đặc hiệu, rõ, sáng cho thấy phân 43 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học đoạn cADN NK1 được nhân dòng đảm bảo chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo. Sản phẩn PCR được tinh sạch bằng AccuPrep PCR Purification Kit (K3034-1 của Bioneer). Kết quả đo quang phổ cho thấy chỉ số OD260/280=2.1, hàm lượng ADN thu được sau khi tinh sạch là 92,49ng/µl. Như vậy, đoạn gen mã cho NK1 có nồng độ và độ tinh sạch đảm bảo để thực hiện cho các thí nghiệm kế tiếp. Bảng 15. Quy trình cho phản ứng nhân dòng đoạn cADN mã cho thụ thể NK1 Thành phần ADN dNTP 2mM 10X Buffer với MgSO4 NK1 F/R 2µM Pfu DNA polymerase 2.5u/ µl H 20 Thể tích (µl) 0.5 5 5 5 1 28.5 Chu trình nhiệt 95˚C, 3 phút Lặp lại 35 chu kỳ: (95˚C-30 giây, 60˚C-30 giây, 72˚C-90 giây) 72˚C – 10 phút 3.3.2 Mở vòng pSFV bằng SmaI Đầu tiên, chúng tôi cắt pSFV bằng SmaI theo quy trình đã tối ưu trong Bảng 16 tạo ra vector dạng thẳng có 2 đầu bằng. Bảng 16. Thành phần và điều kiện của phản ứng cắt pSFV bằng SmaI Thành phần Thể tích Điều kiện hoạt động (µl) ADN (4500ng/ µl) 5 Ủ: 30°C-qua đêm. Bất hoạt: 65°C-5 phút SmaI 4 10X Tango Buffer 5 H2O 36 Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng cách chuyển 7µl sản phẩm cắt sang ống nghiệm mới rồi cắt bằng enzym thứ 2 là FastDigest XhoI (có vị trí cắt cách SmaI ~2kb) theo điều kiện phản ứng mô tả trên bảng 17. Kết quả điện di trên hình 22a cho thấy chúng tôi đã thu được 2 băng ADN có kích thước tương đương 2kb và 9kb, phù hợp với kích thước các sản phẩm dự kiến theo lý thuyết là 2101bp và 9387bp, không còn băng ADN có kích thước >10kb (kích 44 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học thước gốc của pSFV). Như vậy, pSFV đã được mở vòng triệt để (100%) nhờ SmaI trong điều kiện phản ứng cắt này. 1 (a) 2 1 2 (b) (c) Hình 22. Ảnh điện di sản phẩm cắt pSFV đã mở vòng bằng SmaI (a) Làn1: thang chuẩn 1kb, làn 2: pSFV đã mở vòng cắt kiểm tra bằng XhoI thang chuẩn sử dụng; (b) Làn1: thang chuẩn 1kb, làn 2: pSFV mở vòng bằng SmaI đã tinh sạch; (c) thang chuẩn 1kb (Fermentas) Bảng 17. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt pSFV đã mở vòng bằng XhoI Thành phần ADN FastDigest XhoI 10X FastDigest Buffer H2O Thể tích (µl) 7 0.5 0.3 2.2 Điều kiện hoạt động Ủ: 37°C-5 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút Để phản ứng nối đoạn chèn NK1 vào vector mở vòng đạt hiệu suất cao nhất, pSFV đã mở vòng được ngăn tự đóng vòng bằng enzym Alkaline Phosphatase (FastAP) theo các điều kiện được mô tả ở Bảng 18. Sản phẩm ADN sau khi tinh sạch có chỉ số OD260/280= 2,0 và có hàm lượng ADN xấp xỉ 60 ng/ µl. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch (hình 22b) cho thấy chúng tôi đã thu hồi được pSFV mở vòng với lượng đủ lớn để thực hiện cho phản ứng nối với cADN mã NK1. 45 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Bảng 18. Thành phần và điều kiện của phản ứng chống tự đóng vòng của pSFV Thành phần pSFV đã mở vòng 10X FastAP Buffer FastAP 1u/ µl H2O Điều kiện hoạt động Ủ ở 37°C trong 15 phút. Bất hoạt ở 75°C trong 5 phút. Thể tích (µl) 38 1,2 5 5,8 3.3.3. Nối cADN mã NK1 vào pSFV cơ bản Sau một số thí nghiệm tái tổ hợp, chúng tôi thu được điều kiện nối cADN mã NK1 vào pSFV tối ưu là: hàm lượng pSFV và cADN NK1 tham gia 20 µl hỗn hợp phản ứng là 30 ng, tỷ lệ về hàm lượng ADN giữa vector và đoạn chèn là 1:1 với 5u T4 DNA ligase. Thông thường số khuẩn lạc tái tổ hợp thu được trên đĩa thạch LB dao động từ 300 đến 400 khuẩn lạc mỗi đĩa. 3.4 Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến (pSFVM7, pSFV- M8) 3.4.1 Thu cADN mã hóa NK1 từ vector pJET1.2-NK1 Ảnh điện di Hình 23 cho thấy chúng tôi đã thu được cADN mã cho NK1 từ pJET1.2 với 1 đầu bằng (XhoI/đoạn Klenow) và 1 đầu dính (XbaI). 1 2 1 3 ~4kb 2 3 ~3kb ~1.3kb (a) (b) Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm cắt thu cADN mã cho NK1 từ pJET1.2. (a) Làn 1: thang chuẩn 1kb (Fermentas), làn 2: pJET1.2-NK1 chưa cắt, làn 3: pJET1.2-NK1mở vòng bằng XhoI; (b) Làn 1: thang chuẩn 1kb, làn 2+3: pJET1.2NK1 cắt bằng XhoI và XbaI. 46 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Sản phẩm điện di ADN trên hình 23b cho thấy băng điện di khá mờ. Có lẽ do sau bước tinh sạch, lượng ADN thu hồi hiệu suất thấp. Để khắc phục khó khăn này, chúng tôi đã tiến hành phản ứng cắt với thể tích lớn, rồi tiến hành điện di và thu hồi ADN từ bản gel agarose bằng kit của Thermo Scientific. Hình 24 đã cho thấy, chúng tôi đã thu được cADN NK1 với hàm lượng đủ lớn để thực hiện phản ứng ligase tiếp theo. 1 2 ~1.3kb Hình 24. Ảnh điện di cADN mã cho NK1 (XhoI/Klenow/ XbaI) sau khi tinh sạch. Làn 1: thang chuẩn 1kb, làn 2: cADN mã cho NK1 sau khi thôi gel Quy trình đã tối ưu về nồng độ enzym và cơ chất, thời gian ủ mẫu cho phản ứng thu đoạn chèn NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính được trình bày trong Bảng 19. Bảng 19. Quy trình thu đoạn chèn cADN NK1 có 1 đầu bằng/ 1 đầu dính Thành phần ADN FastDigest XhoI. 10X FastDigest Buffer H2O Thêm: 10X Klenow Buffer dNTP 2mM Đoạn Klenow H2O Thêm: FastDigest XbaI 10X FastDigest Buffer H2O Thể tích (µl) 12 6 4 18 Điều kiện hoạt động Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút. 1 0.8 2 6.2 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 75°C-10 phút. 6 0.4 3.6 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút. 47 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 3.4.2 Mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8 1 2 1 2 3 3 ( a) (b) (c) Hình 25. Ảnh điện di mở vòng pSFV-M7 và pSFV-M8. (a) pSFV cải tiến cắt đã mở vòng cắt bằng XhoI: làn 1: pSFV-M7, làn 2: thang chuẩn1kb, làn 3:pSFV-M8; (b): thang chuẩn1kb (Fermentas); (c) pSFV cải tiến được tạo một đầu bằng (BamHI. đoạn Klenow) và 1 đầu dính (AvrII): làn 1: pSFV-M7, làn 2: pSFV-M8, làn 3: thang chuẩn1kb Đầu tiên, pSFV-M7 và pSFV-M8 được cắt mở vòng bằng BamHI và kiểm tra sản phẩm phản ứng bằng enzym XhoI (cách vị trí giới hạn BamHI 3kb) theo điều kiện được nêu trên bảng 20. Ảnh điện di hình 25a cho thấy phản ứng cắt lần lượt bằng 2 enzym thu được 2 băng có kích thước khoảng 9kb và 3kb, không có băng kích thước trên 12kb (kích thước gốc của 2 vector cải tiến). Kết quả này cho thấy phản ứng cắt mở vòng bằng BamHI đã diễn ra hoàn toàn. Bảng 20. Quy trình mở vòng pSFV cải biến và kiểm tra hiệu suất mở vòng Thành phần ADN FastDigest BamHI 10X FastDigest Buffer H2O Lấy 5 µl hỗn hợp trên và thêm: 10X FastDigest Buffer FastDigest XhoI H2O Thể tích (µl) 9 3 3 15 0.5 0.5 4 48 Điều kiện hoạt động Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 80°C-5 phút. Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 75°C-10 phút. Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Ở bước tiếp theo, vector sau khi mở vòng được tạo đầu bằng bằng cách xử lý với đoạn Klenow và tạo đầu dính thứ 2 bằng AvrII rồi ngăn tự đóng vòng bằng FastAP theo các điều kiện được nêu ở bảng 21. Bảng 21. Quy trình tạo 1 đầu bằng-1 đầu dính cho pSFV cải biến Thành phần ADN đã mở vòng bằng BamHI 10X Klenow Buffer dNTP 2mM Klenow H2O Thêm: FastDigest AvrlI 10X FastDigest Buffer H2O Thêm: 10X FastAP Buffer FastAP 1u/µl H2O Điều kiện hoạt động Thể tích (µl) 15 1 0.5 1.5 7 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt: 75°C-10 phút. 1.5 0.5 3 Ủ: 37°C-10 phút. Bất hoạt bằng phenol:chloroform 1 3 6 Ủ: 37°C-15 phút. Bất hoạt: 75°C-5 phút. Hình 25c cho thấy sau quá trình xử lý bằng các enzym tạo đầu bằng và đầu dính đã cho sản phẩm cuối cùng có kích thước phù hợp với lý thuyết (trên 10kb). Băng điện di rõ nét cho thấy các vector cải biến được mở vòng đủ chất lượng để tiến hành cho phản ứng nối tiếp theo. 3.4.3 Nối cADN mã NK1 vào pSFV cơ bản Sau một số lô thí nghiệm ligase, chúng tôi nhận thấy điều kiện ligase tối ưu khi hàm lượng pSFV cải biến được sử dụng ở nồng độ 40 ng/10µl, tỷ lệ về hàm lượng ADN giữa vector và đoạn chèn là 1:9 với 0,5u T4 DNA ligase /10µl hỗn hợp ligase. Chúng tôi đã tiến hành 3 lô biến nạp với pSFV-M7 và 1 lô biến nạp với pSFV-M8. Số khuẩn lạc thu được thường dao động quang khoảng 200 khuẩn lạc mỗi đĩa thạch chứa 20 ml môi trường LB. 49 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 3.5 Sàng lọc chủng vi khuẩn mang gen mã hóa NK1 3.5.1 Colony PCR dùng mồi NK1 F/ R1 để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp Chỉ những đĩa LB có đĩa đối chứng âm (hỗn hợp nối chỉ có vector, không có đoạn chèn) không mọc khuẩn lạc trên môi trường LB có bổ sung ampicillin tương ứng không có hiện tượng tự đóng vòng mới được dùng để sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn. Chúng tôi sử dụng phản ứng colony PCR nhân dòng đầu 5’ cADN mã cho NK1 (cặp mồi NK1 F/NK1 R1) để xác định các khuẩn lạc mang vector pSFV cơ bản được cài đoạn NK1. Đoạn khuếch đại có chiều dài 788 bp được nhân lên theo điều kiện được mô tả ở bảng 22. Bảng 22. Thành phần và điều kiện của phản ứng colony PCR để xác định khuẩn lạc tái tổ hợp pSFV-NK1 Thành phần Thể tích ( µl) H2O 9.7 Đệm 10X 1.5 MgCl2 25 mM 0.3 dNTP 2mM 1.0 NK1F / NK1 R1 2 µM 0.5 Taq Polymerase 1 u/µl 0.5 Khuôn 1.0 Tổng 15.0 Chu trình nhiệt Thời gian biến tính đầu tiên: 940C, 5 phút Lặp lại 45 chu kì: + Biến tính: 940C, 30 giây + Gắn mồi: 600C, 30 giây + Tổng hợp: 720C, 90 giây Thời gian tổng hợp sau cùng: 720C, 10 phút 788 bp Hình 26. Ảnh điện di sản phẩm clonyPCR kiểm tra khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1. Làn đánh số 1-13: các mẫu khuẩn lạc, làn M: tháng chuẩn 100bp Kết quả điện di sản phẩm PCR trên hình 26 cho thấy chúng tôi đã thu được 8/250 khuẩn lạc có khả năng mang đoạn chèn cADN-NK1. Các khuẩn lạc 50 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học mang đoạn chèn có thể có đoạn chèn được chèn ngược chiều hoặc xuôi chiều. Các khuẩn lạc trên được lưu lại và làm khuôn để tìm khuẩn lạc chứa đoạn chèn NK1 đúng chiều bằng phương pháp colony PCR dùng cặp mồi 808/809. 3.5.2 Tối ưu phản ứng colony PCR để sàng lọc khuẩn lạc mang gen mã cho NK1 đúng chiều Cặp mồi 808/809 được dùng để xác định đoạn chèn cADN NK1 có cài đúng chiều vào vector pSFV hay không. Do đây là mồi tự thiết kế chưa xác định được nhiệt độ gắn mồi (Tm) tối ưu bằng thực nghiệm, ngoài ra vì chưa sẵn có đối chứng dương (khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 đúng chiều), vì những lý do trên, các mẫu khuẩn lạc được xác định mang đoạn chèn NK1 (thông qua colony PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1 nêu ở mục 3.5.1) đã được dùng để chạy colony PCR trong dải nhiệt độ từ 48 đến 56oC. Khuẩn lạc số 97 trong lô biến nạp các tế bào mang vector pSFV cơ bản chèn NK1 là mẫu xuất hiện băng ~650bp, phù hợp với kích thước băng ADN được nhân bởi cặp mồi 808/809. Chủng 97 sau đó được dùng làm đối chứng dương để thực hiện tối ưu nhiệt độ gắn mồi với cặp mồi 808/809. 650 bp Hình 27. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho cặp mồi 808/809 Hình 27 cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cặp mồi 808/809 là 520C. Với nhiệt độ gắn mồi tối ưu, hiện tượng âm tính giả trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc bằng clonyPCR sẽ được giảm thiểu đáng kể, tăng hiệu quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn NK1 trong các phiên bản pSFV. 51 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Với kết quả bước đầu thu được từ các nghiên cứu phát triển hệ vector SFV nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể NK1, tôi rút ra một số kết luận chính như sau: 1) Đã tối ưu điều kiện chuẩn bị tế bào khả biến DH5α và biến nạp cho phép nhân dòng các vector một cách dễ dàng. 2) Đã chuyển thành công các vector SFV vào tế bào khả biến DH5α và xác lập các điều kiện tối ưu để nhân dòng và lưu giữ ổn định. 3) Đã tiến hành cải biến được hệ vector SFV cơ bản hướng tới việc biểu hiện gen mã NK1 ở tế bào động vật có vú. Hệ vector cải biến được cài thêm vùng tăng cường dịch mã, các đuôi tag hỗ trợ quá trình tinh sạch thu hồi protein tái tổ hợp, vị trí nhân dòng đa điểm được mở rộng thuận tiện cho việc chèn gen ngoại lai. 4) Đã thiết lập được quy trình kỹ thuật và điều kiện phản ứng cài cADN mã NK1 vào vector SFV cơ bản. 5) Đã thiết lập được quy trình colony PCR nhằm sàng lọc được các chủng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector SFV chèn gen mã hóa NK1 đúng chiều. Kiến nghị Trên cơ sở kết quả của nghiên cứu này, chúng tôi có một số kiến nghị như sau: 1) Tiến hành cài ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cải tiến và chọn lọc các chủng tái tổ hợp ổn định. 2) Tiến hành các nghiên cứu biểu hiện gen NK1 bởi hệ vector pSFV cơ bản và cải biến trong các dòng tế bào chủ khác nhau, và thử nghiệm sử dụng các thụ thể NK1 tái tổ hợp trong các nghiên cứu dược phẩm. 52 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. 2. 3. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở Di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. Nguyễn Xuân Thắng (2003), Hóa sinh dược lý phân tử, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Andersen B. and Stevens R.C. (1998), “The human D1A dopamine receptor: heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and purification of the functional receptor”, Protein Expr Purif, 13, pp. 111–119. Asselin-Paturel C., Lassau N., Guinebretiere J. M., Zhang J., Gay F., Bex F., Hallez S., Leclere J., Peronneau P., Mami-Chouaib F., and Chouaib S. (1999), “Transfer of the murine interleukin-12 gene in vivo by a Semliki Forest virus vector induces B16 tumor regression through inhibition of tumor blood vessel formation monitored by Doppler ultrasonography”, Gene Ther., 6, pp. 606-615. Boorsma .M, Saudan .P, Pfruender .H, Bailey .Je, Schlesinger .S, Renner .Wa, and Bachmann .Mf (2003), “Alphavirus cDNA-based expression vectors: effects of RNA transcription and nuclear export”, Biotechnol Bioeng, 81, pp. 553-562. Cereghino Jl and Cregg Jm (2000), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol Rev,(24), pp. 45-66. Chang .J.Y (1985), “Thrombin specificity:Requirement for apolar amino acids adja-cent to the thrombin cleavage site of polypeptide substrate”, Eur. J. Biochem, 151, pp. 217-224. Cordingley.M.G., Callahan.P.L., Sardana.V.V., Garsky.V.M., and Colonno.R.J (1990), “Substrate requirements of human rhinovirus 3C protease for peptidecleavage in vitro”, J. Biol. Chem., 265, pp. 9062-9065. E. Mathilda Sjoberg and Henrik Garoff (1996), “The translation-enhancing region of the Semliki Forest virus subgenome is only functional in the virusinfected cell”, Journal of General Virology, 77, pp. 1323--1327. Federal Register 58 No. 19, Addition of Appendix DL-X to the NIH guidelines regarding Semliki Forest virus. Human Gene Therapy. 1993. p. 5. Frolov. I and Schlesinger .S (1994), “Translation of Sindbis virus mRNA: effects of sequences downstream of the initiation codon”, Journal of Virology, 68, pp. 8111-8117. Frolova E., Frolov I., and Schlesinger S (1997), J. Virol, 71, pp. 248-258. Frolow I. and Schlesinger S (1994), J. Virol, 68, pp. 8111-8117. 53 Luận văn tốt nghiệp-2012 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Gerstein A.S. (2001), Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide, Wiley-Liss, Inc. Giraud A., Ataman-Onal Y., Battail N., Piga N., Brand D., Mandrand B, and Verrier B. (1999), “Generation of monoclonal antibodies to native human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein by immunization of mice with naked RNA”, J. Virol. Meth., 79, pp. 75-84. Glasgow G. M., Mcgee M. M., Tarbatt C. J., Mooney D. A., Sheahan B. J., and Atkins G. J. (1998), “The Semliki Forest virus vector induces p53independent apoptosis”, Journal of General Virology, 79, pp. 2405-2410. Gunnar Schulte, Basic Receptor Pharmacology. 2008. Hassaine G., Wagner R., Kempf J., Cherouati N., Hassaine N., Prual C., Andre N., Reinhart C., Pattus F., and Lundstrom K. (2006), “Semliki Forest virus vector for overexpression of 101 G protein-coupled receptors in mammalian host cell”, Protein Expr Purif, 45(2), pp. 343-351. Hengen P. (1995), “Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli”, Trends in Biochemical Sciences, 20(7), pp. 285-286. Jarvis Dl and Finn Ee (1995), “Biochemical analysis of the N-glycosylation pathway in baculovirus-infected lepidopteran insect cells”, Virology,(212), pp. 500–511. K. Terpe ((2003) ), “Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems”, Appl Microbiol Biotechnol 60, pp. 523-533. Kenneth H. Lundstrom and M.L. Chiu (2006), G Protein - Coupled receptors in Drug Discovery, Taylor & Francis Group. Kiefer H., Vogel R., and Maier K. (2000), “Bacterial expression of Gprotein-coupled receptors: prediction of expression levels from sequence”, Receptors Channels, 7, pp. 109-119. Klabunde T. and Hessler G. (2002), “Drug design strategies for targeting Gproteincoupled receptors”, Chembiochem, 3(10), pp. 929-944. Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., and Bernhard F. (2004), “High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins”, Eur J. Biochem, 271, pp. 568–580. Krasemann S., Jurgens T., and Bodemer W. (1999), “Generation of monoclonal antibodies against prion proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy”, J. Biotechnol, 73, pp. 119-129. Kunji Er, Slotboom Dj, and Poolman B (2003), “Lactococcus lactis as host for overproduction of functional membrane proteins”, Biochim Biophys Acta,(1610), pp. 97-108. Kunz .D, Gerad .Np, and Gerad .C (1992), “The human leukocyte plateletactivating factor receptor”, J Biol Chem, 267, pp. 9101-9106. Lee S. B. and Esteban M. (1994), “The interferon-induced doublestranded RNA-activated protein kinase induces apoptosis”, Virology, 199, pp. 491496. 54 Luận văn tốt nghiệp-2012 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Loll P. J. (2003), “Membrane protein structural biology: the high throughput challenge”, J Struct Biol, 142(1), pp. 144-153. Lundstrom K. (2003), “Semliki Forest virus vectors for rapid and high-level expression of integral membrane proteins”, Biochim Biophys Acta., 1610, pp. 90-96. Lundstrom K. (2009), “An overview on GPCRs and drug discovery: structure-based drug design and structural biology on GPCRs ”, Methods Mol Biol., 552, pp. 66-51. Lundstrom K., Wagner R., Reinhart C., Desmyter A., Cherouati N., et al. (2006), “Structural genomics on membrane proteins: comparison of more than 100 GPCRs in 3 expression sytems”, Struct Funct Genomics, 7(2), pp. 77 - 91. Luque T. and O’reilly D.R. (1999), “Generation of baculovirus expression vectors”, Mol Biotechnol, 13, pp. 153-163. Maa M.C., Chinsky J. M., Ramamurthy V., Martin B. D., and Kellems R. E (199), “Identification of transcription stop sites at the 59 and 39 ends of the murine adenosine deaminase gene”, J. Biol. Chem., 265, pp. 12513-12519. Madin K., Sawasaki T., Ogasawara T., and Endo Y. (2000), “A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes”, Proc Natl Acad Sci USA, 97, pp. 559–564. Massotte D. (2003), “G protein-coupled receptor overexpression with the baculovirus–insect cell system: a tool for structural and functional studies”, Biochim Biophys Acta, 1610, pp. 77-89. Mathiot C. C., Grimaud G., Garry P., Bouquety J. C., A. Mada, Daguisy A. M., and Georges A. J. (1990), “An outbreak of human Semliki Forest virus infection in Central African Republic”, American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 42, pp. 386-393. Matsushima.M., Ichinose.M., Yahagi.N., Kakei.N., Tsukada.S., et al. (1994), “Structural characterization of porcineenteropeptidase”, J. Biol. Chem., 269, pp. 19976-19982. Mossman S.P., Bex F., Berglund P., Arthos J., O’neil S.P., et al. (1996), “Protection against lethal simian immunodefieciency virus SIVsmmPBj14 disease by a recombinant Semliki Forest virus gp160 vaccine and by gp120 subunit vaccine”, J. Virol., 70, pp. 1953-1960. Nagai .K. and Thogersen .H.C (1984), “Generation of beta-globin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli”, Nature, 309, pp. 810-812. Nambi P., A.N. (2003), “G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery”, Assay and Drug Develop Tech., 1(2), pp. 305-310. Patzelt H., Goto N., Iwai H., Lundstrom K., and Fernholz E. (2003), “Modern methods for the expression of proteins in isotopically enriched form”, Drug Research, pp. 1-38. Sambrook J. and Russel D.W. (2001), Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 55 Luận văn tốt nghiệp-2012 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Savvas C.M (1999), “Components of Vectors for Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells”, Protein Expression and Purification, 17, pp. 183-202. Schmidt .M, Tuominen .N, Johansson .T, Weiss .Sa, Keinamen .K, and Oker-Blom .C (1998), “Baculovirus-mediated large-scale expression and purification of a polyhistidine-tagged Rubrella virus capsid protein”, Protein Expr Purif 12, pp. 323-330. Sjoberg. M., Suomalainen. M, and Garoff. H (1994)), “A significantly improved Semliki Forest virus expression system based on translation enhancer segments from the viral capsid gene”, Biotechnology, 12, pp. 11271131. Smithburn K. C. and Haddow A. J. (1944), “Semliki Forest virus. I. Isolation and pathogenic properties”, Journal of Immunology, 49, pp. 141-157. Strauss J. H. and Strauss E. G. (1994), “The alphaviruses : gene expression, replication and evolution”, Microbiological Reviews, 58, pp. 491-562. Thomas P. Hopp, Kathryn S. Prickett, Virginia L. Price, Randell T. Libby, Carl J. March, Douglas Pat Cerretti, David L. Urdal, and Paul J. Conlon (1988), “A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification”, Nature Biotechnology, 6, pp. 1204 1210. Vassilatis D. K., Hohmann J. G., Zeng H., Li F. S., Ranchalis J. E., Mortrud M. T., Brown A., Rodriguez S. S., Weller J. R., Wright A. C., Bergmann J. E., and Gaitanaris G. A. (2003), “The G protein-coupled receptor repertoires of human and mouse”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(8), pp. 4903-4908. Winter-Vann Am, Martinez L, Bartus C, Levay A, and Turner Gj (2001), “G protein-coupled expression in Halobacterium salinarum.”, In: Kuehne SR, de Groot H, Eds. Perspectives on Solid State NMR in Biology, Dordrecht: Kluwer, pp. 141-159. Yamanaka .R and Xanthopoulos .Kg (2004), “Development of improved Sindbis virus-based DNA expression vector”, DNA Cell Biol., 23(2), pp. 7580. Ying H., Zaks T.Z., Wang R.-F., Irvine K.R., Kammula U.S., Marincola F.M., Lettner W.W, and Restifo N.P (1999), “Cancer therapy using selfreplicating RNA vaccine”, Nat. Medicine, 5, pp. 823-827. Zhou X., Berglund P., Rhodes G., Parker S.E., Jondal M., and Liljeström P (1994), “Self-replicating Semliki Forest virus RNA as a recombinant vaccine”, Vaccine, 12, pp. 1510-1513. Zhou X., Berglund P., Zhao H., Liljeström P., and Jonda M. (1995), “Generation of cytotoxic and humoral immune responses by nonreplicative recombinant Semliki Forest virus”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, pp. 30093013. 56 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Tài liệu web 1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 2. 3. 4. http://www.sciencedirect.com http://vectordb.atcg.com http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/mapper 57 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học PHỤ LỤC 1. Các vector virut được dùng trong chuyển và biểu hiện gen ở động vật có vú Vector virut có hệ gen là ADN Virut Cytomegalo Virut Herpes simplex Virut Epstein-Barr Virut Simian Virut Papilloma Adenovirut Virut liên hợp với Adenovirut Virut Vaccinia Baculovirut Vector virut có hệ gen là ARN Virut Semliki Forest Virut Sindbis Poliovirut Virut dại Virut cúm SV5 Virut hô hấp hợp bào Virut viêm não ngựa Venezuela Virut Kunjin Virut Sendai Virut gây mụn nước viêm miệng Retrovirut Vector virut dạng lai Virut Adenovirut-Sindbis Adenovirut-virut liên hợp với Adenovirut 2. Trình tự của vector pSFV cơ bản 1 61 121 181 241 301 ... ATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCG CTACGCGAGAGATTAACCACCCACGATGGCCGCCAAAGTGCATGTTGATATTGAGGCTGA CAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCA GGTCACACCAAATGACCATGCAAATGCCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGAT CGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATCGGCAGTGCGCCTTCCAGGAG AATGATGTCTACGCACAAATACCACTGCGTATGCCCTATGCGCAGCGCAGAAGACCCCGA Luận văn tốt nghiệp-2012 ... 7321 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTA Vị trí bắt cặp của mồi F-N SFV replicase- dependent subgenomic promoter 7381 ATACACAGAATTCTGATTGGATCCCGGGTAATTAATTGAATTACATCCCTACGCAAACGT Vị trí nhân dòng đa điểm 3 mã kết thúc liên tiếp 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 TTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTC CGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCG TAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGA AGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGC AGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAG AAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGTATGCGGCTAGCCACAGTAAC GTAGTGTTTCCAGACATGTCGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGT Vị trí bắt cặp của mồi 809 CTGGGGGCCTTCGCAATCGGCGCTATCCTGGTGCTGGTTGTGGTCACTTGCATTGGGCTC CGCAGATAAGTTAGGGTAGGCAATGGCATTGATATAGCAAGAAAATTGAAAACAGAAAAA GTTAGGGTAAGCAATGGCATATAACCATAACTGTATAACTTGTAACAAAGCGCAACAAGA CCTGCGCAATTGGCCCCGTGGTCCGCCTCACGGAAACTCGGGGCAACTCATATTGACACA TTAATTGGCAATAATTGGAAGCTTACATAAGCTTAATTCGACGAATAATTGGATTTTTAT TTTATTTTGCAATTGGTTTTTAATATTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAGTGATCATAATCAGCCA TACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCT GAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA CAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAG TTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTAGTCTGCATTAAT GAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGC TCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGG CGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAG GCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCC GCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAG GACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGA CCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTC AATGCTCGCGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGT CCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCA GAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA CTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAG TTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCA AGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGG GGCATTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTAT CAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAA GTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT CAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTA CGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCT CACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTG GTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAA GTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGT CACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTA CATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA GAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTA CTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCT GAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCG CGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAAC TCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACT GATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAA 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 8821 8881 8941 9001 9061 9121 9181 9241 9301 9361 9421 9481 9541 9601 9661 9721 9781 9841 9901 9961 10021 10081 10141 10201 10261 Luận văn tốt nghiệp-2012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 10321 ATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTT 10381 TTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAAT 10441 GTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTG 10501 ACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGC 10561 CCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGG 10621 AGACGGTCACAGCTTCTGTCTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGT 10681 CAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTAC 10741 TGAGAGTGCACCATATCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAG 10801 TACTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCGTAATCAATTA 10861 CGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATG 10921 GCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTC 10981 CCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAA 11041 CTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCA 11101 ATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTA 11161 CTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGT 11221 ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTG 11281 ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACA 11341 ACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA 11401 GAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACT 11461 CACTATAGGGAGACCGGAAGCTTGAATTC Ghi chú cho các vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein phi cấu trúc (nsP1-4) Vùng gen cấu trúc đã bị cắt đi phần lớn Đầu 3’ không mã hóa của SFV Đuôi polyA69 Tín hiệu kết thúc SV40 Đoạn trình tự pBR322-origin Đoạn trình tự mã gen kháng ampicillin Promoter CMV 3. Trình tự của vector pHelper 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 ATGGCGGATGTGTGACATACACGACGCCAAAAGATTTTGTTCCAGCTCCTGCCACCTCCG CTACGCGAGAGATTAACCACCCACGATGGCCGCCAAAGTGCATGTTGATATTGAGGCTGA CAGCCCATTCATCAAGTCTTTGCAGAAGGCATTTCCGTCGTTCGAGGTGGAGTCATTGCA GGTCACACCAAATGACCATGCAAATGCCAGAGCATTTTCGCACCTGGCTACCAAATTGAT CGAGCAGGAGACTGACAAAGACACACTCATCTTGGATATCGGCAGTGCGCCTTCCAGGAG AATGATGTCTACATGAAACGAGATGTCAAAGTCACTCCAGGGACGAAACACACAGAGGAA AGACCCAAAGTCCAGGTAATTCAAGCAGCGGAGCCATTGGCGACCGCTTACCTGTGCGGC ATCCACAGGGAATTAGTAAGGAGACTAAATGCTGTGTTACGCCCTAACGTGCACACATTG TTTGATATGTCGGCCGAAGACTTTGACGCGATCATCGCCTCTCACTTCCACCCAGGAGAC CCGGTTCTAGAGACGGACATTGCATCATTCGACAAAAGCCAGGACGACTCCTTGGCTCTT ACAGGTTTAATGATCCTCGAAGATCTAGGGGTGGATCAGTACCTGCTGGACTTGATCGAG GCAGCCTTTGGGGAAATATCCAGCTGTCACCTACCAACTGGCACGCGCTTCAAGTTCGGA GCTATGATGAAATCGGGCATGTTTCTGACTTTGTTTATTAACACTGTTTTGAACATCACC ATAGCAAGCAGGGTACTGGAGCAGAGACTCACTGACTCCGCCTGTGCGGCCTTCATCGGC GACGACAACATCGTTCACGGAGTGATCTCCGACAAGCTGATGGCGGAGAGGTGCGCGTCG TGGGTCAACATGGAGGTGAAGATCATTGACGCTGTCATGGGCGAAAAACCCCCATATTTT TGTGGGGGATTCATAGTTTTTGACAGCGTCACACAGACCGCCTGCCGTGTTTCAGACCCA CTTAAGCGCCTGTTCAAGTTGGGTAAGCCGCTAACAGCTGAAGACAAGCAGGACGAAGAC AGGCGACGAGCACTGAGTGACGAGGTTAGCAAGTGGTTCCGGACAGGCTTGGGGGCCGAA CTGGAGGTGGCACTAACATCTAGGTATGAGGTAGAGGGCTGCAAAAGTATCCTCATAGCC Luận văn tốt nghiệp-2012 1201 1261 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học ATGGCCACCTTGGCGAGGGACATTAAGGCGTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACAC Vị trí bắt cặp của mồi F-N CTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTAATACACAGAATTCTGATTATAGCGCACTATT SFV replicase- dependent subgenomic promoter 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 EcoRI ATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCC CGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCC AGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACG CAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGA AAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAG CCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATG ACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGAAAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTGGGCG ACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAAGGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGC TAGCTTTCAAGAAATCGAGCAAGTATGACCTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGA GGTCGGATGCCTCAAAGTACACGCATGAGAAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACG GGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGGTTCACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAG ACAGTGGCCGGCCCATCTTTGACAACAAGGGGAGGGTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGG CCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCGGTGGTCACCTGGAACAAAGATATGGTGACTA GAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGGTCCGCCCCGCTGATTACTGCCATGTGTGTCC Vị trí bắt cặp của mồi R-N TTGCCAATGCTACCTTCCCGTGCTTCCAGCCCCCGTGTGTACCTTGCTGCTATGAAAACA ACGCAGAGGCCACACTACGGATGCTCGAGGATAACGTGGATAGGCCAGGGTACTACGACC TCCTTCAGGCAGCCTTGACGTGCCGAAACGGAACATCCCACCAATTGAGCGTGTCGCAAC ACTTCAACGTGTATAAGGCTACACGCCCTTACATCGCGTACTGCGCCGACTGCGGAGCAG GGCACTCGTGTCATAGCCCCGTAGCAATTGAAGCGGTCAGGTCCGAAGCTACCGACGGGA TGCTGAAGATTCAGTTCTCGGCACAAATTGGCATAGATAAGAGTGACAATCATGACTACA CGAAGATAAGGTACGCAGACGGGCACGCCATTGAGAATGCCGTCCGGTCATCTTTGAAGG TAGCCACCTCCGGAGACTGTTTCGTCCATGGCACAATGGGACATTTCATACTGGCAAAGT GCCCACCGGGTGAATTCCTGCAGGTCTCGATCCAGGACACCAGAAACGCGGTCCGTGCCT GCAGAATACAATATCATCATGACCCTCAACCGGTGGGTAGAGAAAAATTTACAATTAGAC CACACTATGGAAAAGAGATCCCTTGCACCACTTATCAACAGACCACAGCGAAGACCGTGG AGGAAATCGACATGCATATGCCGCCAGATACGCCGGACAGGACGTTGCTATCACAGCAAT CTGGCAATGTAAAGATCACAGTCGGAGGAAAGAAGGTGAAATACAACTGCACCTGTGGAA CCGGAAACGTTGGCACTACTAATTCGGACATGACGATCAACACGTGTCTAATAGAGCAGT GCCACGTCTCAGTGACGGACCATAAGAAATGGCAGTTCAACTCACCTTTCGTCCCGAGAG CCGACGAACCGGCTAGAAAAGGCAAAGTCCATATCCCATTCCCGTTGGACAACATCACAT GCAGAGTTCCAATGGCGCGCGAACCAACCGTCATCCACGGCAAAAGAGAAGTGACACTGC ACCTTCACCCAGATCATCCCACGCTCTTTTCCTACCGCACACTGGGTGAGGACCCGCAGT ATCACGAGGAATGGGTGACAGCGGCGGTGGAACGGACCATACCCGTACCAGTGGACGGGA TGGAGTACCACTGGGGAAACAACGACCCAGTGAGGCTTTGGTCTCAACTCACCACTGAAG GGAAACCGCACGGCTGGCCGCATCAGATCGTACAGTACTACTATGGGCTTTACCCGGCCG CTACAGTATCCGCGGTCGTCGGGATGAGCTTACTGGCGTTGATATCGATCTTCGCGTCGT GCTACATGCTGGTTGCGGCCCGCAGTAAGTGCTTGACCCCTTATGCTTTAACACCAGGAG CTGCAGTTCCGTGGACGCTGGGGATACTCTGCTGCGCCCCGCGGGCGCACGCAGCTAGTG TGGCAGAGACTATGGCCTACTTGTGGGACCAAAACCAAGCGTTGTTCTGGTTGGAGTTTG CGGCCCCTGTTGCCTGCATCCTCATCATCACGTATTGCCTCAGAAACGTGCTGTGTTGCT GTAAGAGCCTTTCTTTTTTAGTGCTACTGAGCCTCGGGGCAACCGCCAGAGCTTACGAAC ATTCGACAGTAATGCCGAACGTGGTGGGGTTCCCGTATAAGGCTCACATTGAAAGGCCAG GATATAGCCCCCTCACTTTGCAGATGCAGGTTGTTGAAACCAGCCTCGAACCAACCCTTA ATTTGGAATACATAACCTGTGAGTACAAGACGGTCGTCCCGTCGCCGTACGTGAAGTGCT GCGGCGCCTCAGAGTGCTCCACTAAAGAGAAGCCTGACTACCAATGCAAGGTTTACACAG GCGTGTACCCGTTCATGTGGGGAGGGGCATATTGCTTCTGCGACTCAGAAAACACGCAAC TCAGCGAGGCGTACGTCGATCGATCGGACGTATGCAGGCATGATCACGCATCTGCTTACA AAGCCCATACAGCATCGCTGAAGGCCAAAGTGAGGGTTATGTACGGCAACGTAAACCAGA CTGTGGATGTTTACGTGAACGGAGACCATGCCGTCACGATAGGGGGTACTCAGTTCATAT TCGGGCCGCTGTCATCGGCCTGGACCCCGTTCGACAACAAGATAGTCGTGTACAAAGACG Luận văn tốt nghiệp-2012 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181 6241 6301 6361 6421 6481 6541 6601 6661 6721 6781 6841 6901 6961 7021 7081 7141 7201 7261 7321 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học AAGTGTTCAATCAGGACTTCCCGCCGTACGGATCTGGGCAACCAGGGCGCTTCGGCGACA TCCAAAGCAGAACAGTGGAGAGTAACGACCTGTACGCGAACACGGCACTGAAGCTGGCAC GCCCTTCACCCGGCATGGTCCATGTACCGTACACACAGACACCTTCAGGGTTCAAATATT GGCTAAAGGAAAAAGGGACAGCCCTAAATACGAAGGCTCCTTTTGGCTGCCAAATCAAAA CGAACCCTGTCAGGGCCATGAACTGCGCCGTGGGAAACATCCCTGTCTCCATGAATTTGC CTGACAGCGCCTTTACCCGCATTGTCGAGGCGCCGACCATCATTGACCTGACTTGCACAG TGGCTACCTGTACGCACTCCTCGGATTTCGGCGGCGTCTTGACACTGACGTACAAGACCA ACAAGAACGGGGACTGCTCTGTACACTCGCACTCTAACGTAGCTACTCTACAGGAGGCCA CAGCAAAAGTGAAGACAGCAGGTAAGGTGACCTTACACTTCTCCACGGCAAGCGCATCAC CTTCTTTTGTGGTGTCGCTATGCAGTGCTAGGGCCACCTGTTCAGCGTCGTGTGAGCCCC CGAAAGACCACATAGTCCCATATGCGGCTAGCCACAGTAACGTAGTGTTTCCAGACATGT CGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGTCTGGGGGCCTTCGCAATCG GCGCTATCCTGGTGCTGGTTGTGGTCACTTGCATTGGGCTCCGCAGATAAGTTAGGGTAG GCAATGGCATTGATATAGCAAGAAAATTGAAAACAGAAAAAGTTAGGGTAAGCAATGGCA TATAACCATAACTGTATAACTTGTAACAAAGCGCAACAAGACCTGCGCAATTGGCCCCGT GGTCCGCCTCACGGAAACTCGGGGCAACTCATATTGACACATTAATTGGCAATAATTGGA AGCTTACATAAGCTTAATTCGACGAATAATTGGATTTTTATTTTATTTTGCAATTGGTTT TTAATATTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTAGTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTT TTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCA ATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATC ACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTC ATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTAGTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGG GAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTC GGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCAC AGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAA CCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCA CAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGC GTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATA CCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCGCGCTGTAGGTA TCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCA GCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGA CTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGG TGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGG TATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGG CAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAG AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGCATTCTGACGCTCAGTG GAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTA GATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCG TTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACC ATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATC AGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGC CTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAG TTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTAT GGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTG CAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGT GTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAG ATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCG ACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTT AAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCT GTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTAC TTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAAT AAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCAT TTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACA AATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTAT TATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTT CGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTCTGT Luận văn tốt nghiệp-2012 7801 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học CTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTG TCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATCGA CGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTACTAGGTTGAGGCCGTTG AGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAG CCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCC CAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACA TCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGC CTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATA GCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTT TTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCA AATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAG AGAACCCACTGCTTAACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGAA GCTTGAATTC Ghi chú cho các vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein vỏ capsit Đoạn trình tự mã cho protein E3 Đoạn trình tự mã cho protein E2 Đoạn trình tự mã cho protein 6K Đoạn trình tự mã cho protein E1 Đuôi polyA Tín hiệu kết thúc SV40 Đoạn trình tự pBR322-origin A/T/G/C Đoạn trình tự mã gen kháng ampicillin Promoter CMV 4. Vùng trình tự cải biến của pSFV-M7 7321 GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTA 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 7861 7921 7981 8041 ATACACAGAATTCTGATTATAGCGCACTATTATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAA ACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCCTGGCCGTTGCAGGCC ACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGC GCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCA AAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAA ACGCAGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAA AGAGAAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGA AAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTGGGCGACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAA GGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGCTAGCTTTCAAGAAATCGAGCAAGTATGAC CTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGAGGTCGGATGCCTCAAAGTACACGCATGAG AAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACGGGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGGTTC ACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAGACAGTGGCCGGCCCATCTTTGACAACAAG Vị trí bắt cặp của mồi 807 GGTAGGGTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGGCCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCG GTGGTCACCTGGAACAAAGATATGGTGACTAGAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGG GATCTTGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACCACCATCATCACCACCATCACCATCAC FLAG-tag HIS –tag SFV replicase- dependent subgenomic promoter 8101 8161 8221 8281 AGCAGCGGCCTGGTTCCGCGTGGGTCTGGATCCGCTAAGCGCGCTTCGAATCGATGCATC Luận văn tốt nghiệp-2012 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Vị trí Thrombin Vị trí nhân dòng đa điểm CTAGGGCCCGGGTAATTAATTGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGCCGGTG 3 bộ ba kết thúc liền kề GCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCCGTCGT CCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTGACAAT GAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGAAGAAGAAGACAACCAA ACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGCAGCAAAAGAAGAA AGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGCATGAA GATTGAAAATGACTGTATCTTCGTATGCGGCTAGCCACAGTAACGTAGTGTTTCCAGACA TGTCGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGTCTGGGGGCCTTCGCAA Vị trí bắt cặp của mồi 809 Ghi chú cho các vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein vỏ capsit 5. Vùng trình tự cải biến của pSFV-M8 7321 GTTTAAGAAATTGAGAGGACCTGTTATACACCTCTACGGCGGTCCTAGATTGGTGCGTTA SFV replicase- dependent subgenomic promoter 7381 7441 7501 7561 7621 7681 7741 7801 7861 7921 7981 8041 8101 8161 8221 8281 8341 8401 8461 8521 8581 8641 8701 8761 ATACACAGAATTCTGATTATAGCGCACTATTATAGCACCATGAATTACATCCCTACGCAA ACGTTTTACGGCCGCCGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCCTGGCCGTTGCAGGCC ACTCCGGTGGCTCCCGTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGC GCCGTAAATGCGCTGACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCA AAGAAGAAGAAGACAACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAA ACGCAGCAGCAAAAGAAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAA AGAGAAAGAATGTGCATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGAAGTCAAACACGAAGGA AAGGTCACTGGGTACGCCTGCCTGGTGGGCGACAAAGTCATGAAACCTGCCCACGTGAAA GGAGTCATCGACAACGCGGACCTGGCAAAGCTAGCTTTCAAGAAATCGAGCAAGTATGAC CTTGAGTGTGCCCAGATACCAGTTCACATGAGGTCGGATGCCTCAAAGTACACGCATGAG AAGCCCGAGGGACACTATAACTGGCACCACGGGGCTGTTCAGTACAGCGGAGGTAGGTTC ACTATACCGACAGGAGCGGGCAAACCGGGAGACAGTGGCCGGCCCATCTTTGACAACAAG Vị trí bắt cặp của mồi 807 GGTAGGGTAGTCGCTATCGTCCTGGGCGGGGCCAACGAGGGCTCACGCACAGCACTGTCG GTGGTCACCTGGAACAAAGATATGGTGACTAGAGTGACCCCCGAGGGGTCCGAAGAGTGG GATCTTGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACCACCATCATCACCACCATCACCATCAC FLAG-tag HIS –tag AGCAGCGGCCTGGTTCCGCGTGGGTCTGGATCGGATCCGCTAAGCGCGCTTCGAATCGAT Vị trí Thrombin Vị trí nhân dòng đa điểm GCATCCTAGGGCCCGGGTAATTAATTGAATTACATCCCTACGCAAACGTTTTACGGCCGC 3 bộ ba kết thúc liền kề CGGTGGCGCCCGCGCCCGGCGGCCCGTCCTTGGCCGTTGCAGGCCACTCCGGTGGCTCCC GTCGTCCCCGACTTCCAGGCCCAGCAGATGCAGCAACTCATCAGCGCCGTAAATGCGCTG ACAATGAGACAGAACGCAATTGCTCCTGCTAGGCCTCCCAAACCAAAGAAGAAGAAGACA ACCAAACCAAAGCCGAAAACGCAGCCCAAGAAGATCAACGGAAAAACGCAGCAGCAAAAG AAGAAAGACAAGCAAGCCGACAAGAAGAAGAAGAAACCCGGAAAAAGAGAAAGAATGTGC ATGAAGATTGAAAATGACTGTATCTTCGTATGCGGCTAGCCACAGTAACGTAGTGTTTCC AGACATGTCGGGCACCGCACTATCATGGGTGCAGAAAATCTCGGGTGGTCTGGGGGCCTT Vị trí bắt cặp của mồi 809 Ghi chú cho các vùng màu: Đoạn trình tự mã cho protein vỏ capsit Đoạn Nu thêm đẩy khung đọc mở lệch 2 Nu [...]... tử và sàng lọc dược chất từ các nguồn dược liệu tự nhiên của Việt Nam Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể Neurokinin- 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam với mục tiêu nghiên cứu chính là: phát triển hệ vector SFV dựa trên vector SFV cơ bản cho phép biểu. .. 1 (NK1) của người Việt Nam đã được phân lập và nhân dòng thành công từ đề tài ĐT-PTNTĐ.2 011 -G/04, chúng tôi đề xuất và thực hiện đề tài: Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa thụ thể Neurokinin- 1 phục vụ các nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc ở Việt Nam với mục tiêu lâu dài là xây đựng được hệ thống biểu hiện các protein GPCR có thể được... cụ công nghệ sinh học hiệu quả trong các nghiên cứu về sinh học thụ thể ở người Việt Nam sau này, đồng thời phục vụ cho các nghiên cứu dược lý học, sàng lọc và phát triển dược phẩm ở cấp độ phân tử và tế bào 2 Luận văn tốt nghiệp-2 012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1 CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BIỂU HIỆN THỤ THỂ KẾT CẶP G-PROTEIN (GPCR) 1. 1 .1 Thụ thể kết cặp... yếu là các đuôi ái lực Hệ vector SFV là một hệ thống tiềm năng với nhiều ưu điểm, có thể được nghiên cứu cải tiến thêm nhằm phục vụ cho biểu hiện protein màng nói chung và các GPCR nói riêng ở mức độ cao Mặc dù vậy chưa có nhiều nghiên cứu nhằm cải tiến hệ vector này Ở Việt Nam, sử dụng hệ SFV để biểu hiện các GPCR là hướng nghiên cứu mới song có nhiều tiềm năng phục vụ cho các nghiên cứu dược lý phân... xếp vào an toàn sinh học độ 2 ở cả Mỹ và Châu Âu [11 ] 1. 2.2 Hệ vector SFV (Semliki Forest virut) cơ bản Hệ vector SFV cơ bản chúng tôi được tặng bởi GS Kenneth H Lundstrom, Roche AG (Basel, Thụy Sĩ) gồm vector nhân dòng các gen quan tâm pSFV dài 11 489 bp và vector biểu hiện các protein cấu trúc pHelper dài 8650 bp Hai vector này có bản chất là ADN, cấu trúc cụ thể của chúng được nêu ở dưới đây 1. 2.2 .1. .. SFV cơ bản và được cải biến vào các tế bào khả biến DH5α để lưu giữ, nhân dòng 21 Luận văn tốt nghiệp-2 012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 3) Cải biến hệ vector SFV cơ bản 4) Tạo ADN tái tổ hợp chứa gen NK1 trong hệ vector SFV cơ bản và hệ vector SFV cải biến 5) Sàng lọc chủng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp SFV mang gen mã hóa NK1 22 Luận văn tốt nghiệp-2 012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền... vỏ capsit của SFV) , FLAG-tag, HIS10-tag, vị trí Thrombin, vùng nhân dòng đa điểm được thiết kế thêm các vị trí enzym cắt mới theo sơ đồ thí nghiệm hình 10 cADN mã gen NK1 được cài vào các vector pSFV theo các bước trong hình 11 , 12 Hình 10 Sơ đồ nghiên cứu tạo vector cải tiến pSFV-M7 và pSFV-M8 Hình 11 Sơ đồ nghiên cứu thu khuẩn lạc có cADN mã NK1 chèn trong vector pSFV cải tiến 27 ... lập gen đích vào khoảng 21 ngày [23] Hệ thống vector baculovirut đến nay đã được sử dụng thành công trong sản xuất nhiều thụ thể GPCR, như các thụ thể adrenegic, opioid, histamine, serotonine … nhưng chủ yếu phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các thụ thể Các protein xuyên màng được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện baculovirut thường có hiệu suất thu protein vào khoảng 18 đến 71 pmol/mg... tiến bằng cách bổ sung thêm các vị trí nhận biết enzym giới hạn mới giúp việc nhân dòng các gen sẽ trở nên linh hoạt và thuận lợi nhờ có thể lựa chọn thêm nhiều tổ hợp các enzym giới hạn phục vụ cho nhân dòng và biểu hiện các gen GPCR mong muốn 1. 2.4.2 Yếu tố tăng cường dịch mã Frolov và Schlesinger (19 94) đã tìm thấy đoạn trình tự tăng cường dịch mã nằm ở gen mã hóa vỏ capsit xuất hiện ở Sindbis virut,... bằng phối tử đánh dấu và Western blot [32] Tuy vậy, so với hệ thống biểu hiện của baculovirut, hệ thống biểu hiện của SFV có giá thành cao hơn và vẫn luôn cần sự quan tâm đáng kể về khía cạnh an toàn sinh học khi thao tác 12 Luận văn tốt nghiệp-2 012 Phạm Thị Hồng Nhung–K19 Di truyền học 1. 2 HỆ THỐNG VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) 1. 2 .1 Virut Semliki Forest (SFV) SFV là virut có hệ gen ARN (+) thuộc ... Hồng Nhung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ VECTOR SFV (SEMLIKI FOREST VIRUT) NHẰM NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ THỤ THỂ NEUROKININ PHỤC VỤ CÁC NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ VÀ PHÁT TRIỂN THUỐC Ở VIỆT NAM Chuyên... ĐT-PTNTĐ.2 011 -G/04, đề xuất thực đề tài: Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng biểu gen mã hóa thụ thể Neurokinin- 1 phục vụ nghiên cứu dược lý phát triển thuốc Việt. .. nhiên Việt Nam Chính vậy, tiến hành thực đề tài Nghiên cứu phát triển hệ vector SFV (Semliki Forest Virut) nhằm nhân dòng biểu gen mã hóa thụ thể Neurokinin- 1 phục vụ nghiên cứu dược lý phát triển