BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ NGỌC HẠNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT FLUNARIZINE TRONG THUỐC VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I HÀ NỘI 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ NGỌC HẠNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT FLUNARIZINE TRONG THUỐC VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I CHUYÊN NGÀNH: CNDP VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh Nơi thực hiện:Trường Đại Học Dược Hà Nội Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa Thời gian thực hiện: 15/01 – 19/5/2015 HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Trải qua thời gian tham gia học tập lớp dược sĩ chuyên khoa cấp I và quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, bản thân đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ những kiến thức quý báu từ các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội cũng với các anh chị đồng nghiệp của Trung tâm Kiểm nghiệm Thanh Hóa. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Đồng thời, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Trung tâm Kiểm Nghiệm Thanh Hóa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin phép được gửi những tình cảm sâu sắc và lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn chuyên khoa. Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2015 Học viên: Đỗ Ngọc Hạnh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcCN Acetonitril AFTA Khu vực mậu dịch tự do Asean BYT Bộ Y tế CP Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam EP Dược điển Châu Âu HD Hạn sử dụng HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH Methanol PVP K Poly Vinyl Pyrovidon Kali RS Độ phân giải RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKS Số kiểm soát TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TLC Sắc ký lớp mỏng tR Thời gian lưu TT Thông tư USP Dược điển Mỹ UV-VIS Quang phổ tử ngoại khả kiến WHO Tổ chức Y tế Thế giới WTO Tổ chức thương mại thế giới MỤC LỤC MỤC TRANG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về tiêu chuẩn kỹ thuật của thuốc. 3 1.2 Tổng quan về Flunarizin 4 1.2.1 Cấu trúc phân tử, tính chất lý hóa 4 1.2.2.Tính chất dược động học, tác dụng dược lý 5 1.2.3 Tổng quan về các tiêu chuẩn kỹ thuật thuốc viên nang Flunarizin 6 1.3.Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao 9 1.3.1. Khái niệm chung 9 1.3.2. Một số thông số đặc trưng của sắc ký 9 1.3.4.Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao trong kiểm nghiệm thuốc 13 1.4. Nội dung thẩm định phương pháp bằng HPLC 14 1.4.1 Tính phù hợp của hệ thống sắc ký 14 1.4.2. Độ đặc hiệu/chọn lọc 14 1.4.3. Độ tuyến tính 15 1.4.4. Độ đúng 15 1.4.5. Độ chính xác 16 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 17 2.1.1 Hóa chất, vật liệu 17 2.1.2 Chất chuẩn 17 2.1.3 Mẫu thử nghiên cứu 18 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 19 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN CỨU 20 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất Flunarizin trong chế phẩm thuốc 21 viên nang bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích định tính, định lượng đã xây dựng 2.3.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng kiểm nghiệm một số mẫu thuốc viên nang Flunarizin lưu hành trên thị trường 22 24 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 24 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT FLUNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM THUỐC 25 VIÊN NANG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG 27 3.2.1 Chuẩn bị mẫu 27 3.2.2. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống 27 3.2.3 Độ đặc hiệu của phương pháp 29 3.2.4. Khoảng nồng độ tuyến tính 30 3.2.5. Độ chính xác 32 3.2.6. Độ đúng 35 3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THUỐC THU THẬP TRÊN THỊ TRƯỜNG 3.3.1 So sánh phương pháp đã xây dựng với phương pháp đã đăng ký trong TCCS (phương pháp đo quang, kèm chất chuẩn) 3.3.2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng phân tích một số mẫu nghiên cứu 37 37 39 Chương 4. BÀN LUẬN 42 4.1 VỀ XÂY DỰNGPHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 41 4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43 4.3 VỀ SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC MỚI XÂY DỰNG VỚI PHƯƠNG PHÁP UV-VIS 44 MÀ NHIỀU TCCS ĐÃ XÂY DỰNG 4.3 VỀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH CÁC MẪU THUỐC VIÊN NANG FLUNARIZIN 5,0 mg SẢN XUẤT TRONG NƯỚC 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 KẾT LUẬN 45 ĐỀ XUẤT 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG TÊN BẢNG TRANG Bảng 1.1: Một số điều kiện định lượng hoạt chất Flunarizin 7 Bảng 2.1: Danh sách các mẫu phân tích 18 Bảng 2.2. Thành phần tá dược trong các chế phẩm thuốc viên nang Flunarizin sản xuất trong nước. 20 Bảng 2.3. Công thức bào chế mẫu Placebo 21 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các điều kiện sắc ký 26 Bảng 3.2. Kết quả thẩm định độ thích hợp của hệ thống sắc ký. 28 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính. 31 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 33 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp 34 Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 36 Bảng 3.7 Kết quả định lượng mẫu thử bằng phương pháp UVVIS 38 Bảng 3.8. Kết quả so sánh hai phương pháp thử 39 Bảng 3.9 Kết quả phân tích các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp HPLC đã xây dựng. 40 DANH MỤC CÁC HÌNH TÊN HÌNH TRANG Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Flunarizin 4 Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn Flunarizin. 29 Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử Flunarizin. 29 Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch mẫu Placebo. 30 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc flunarizin 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Flunarizin là thuốc đối kháng calci có chọn lọc. Thuốc hấp thu tốt qua đường ruột, đạt nồng độ đỉnh trong vòng 2-4 giờ và đạt trạng thái cân bằng hằng định ở tuần thứ 5 thứ 6. Thuốc gắn kết với protein 90%, chuyển hóa hoàn toàn qua gan. Thuốc và các chất chuyển hóa thải trừ qua đường mật ra phân, thời gian thải hoàn toàn khoảng 18 ngày. Thuốc ngăn chặn sự quá tải Calci tế bào, bằng cách giảm Calci tràn vào quá mức qua màng tế bào, không tác động đến sự co bóp và dẫn truyền cơ tim. Thuốc được dùng để phòng các cơn đau nửa đầu có triệu chứng báo trước và không có triệu chứng báo trước, điều trị chứng chóng mặt tiền đình do rối loạn tiền đình. Điều trị các chứng thiểu năng tuần hoàn não và suy giảm chức năng tuần hoàn não, suy giảm oxy tế bào não bao gồm: chóng mặt, nhức đầu nguyên nhân mạch máu, rối loạn kích thích, mất trí nhớ, kém tập trung và rối loạn giấc ngủ [5],[17]. Hiện nay theo thống kê của Cục Quản lý Dược Việt Nam có 53 chế phẩm thuốc viên nang Flunarizin được cấp số đăng ký trong vòng 5 năm gần đây; gồm 16 thuốc sản xuất trong nước và 37 thuốc nhập ngoại có nguồn gốc từ các nước trong khu vực như: Ấn Độ, Bangladet, Pakistan, Hàn Quốc, Trung Quốc, ... Tham khảo các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc được đăng ký cho thấy, mức chất lượng công bố và phương pháp thử khác nhau theo từng tiêu chuẩn cơ sở [6], [7], [8] [15], [16] gây khó khăn rất nhiều cho các đơn vị làm công tác kiểm tra chất lượng thuốc, vì không có một phương pháp chung để kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đặc biệt đối với thuốc ngoại nhập việc có được một bản tiêu chuẩn kỹ thuật gốc dùng để kiểm tra chất lượng sản phẩm là rất khó khăn và thường không kịp thời. DĐVN IV; Dược điển Anh (BP 2013); Dược điển Mỹ (USP 34); Dược điển Châu Âu (EP 2012); Dược điển của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO Pharmacopoeia 2012) chưa có chyên luận quy định về chất lượng của viên nang Flunarizin [13], [18]. 1 Dược điển Trung Quốc (CP 2005) có một chuyên luận quy định về chất lượng và phương pháp thử nghiệm cho thuốc viên nang Flunarizin với chỉ tiêu định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhưng các điều kiện sắc ký chưa được chỉ rõ ràng dẫn đến sự lúng túng khi tiến hành phân tích chất lượng mẫu thuốc (thiếu điều kiện về cột sử dụng và tốc độ pha động) [14]. Trong tiêu chuẩn chất lượng của một chế phẩm thuốc chỉ tiêu định tính và định lượng là những chỉ tiêu chất lượng quan trọng, luôn được quan tâm xây dựng đảm bảo tính hiện đại, tiên tiến phù hợp đáp ứng yêu cầu của sự phát triển khoa học công nghệ ngày nay. Hiện nay kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao đã trở thành một trong những kỹ thuật phổ biến, xuất phát từ những ưu việt của nó như: có độ nhạy cao, đặc hiệu với từng hoạt chất, khoảng tuyến tính rộng, độ đúng cao, độ lặp lại tốt đáp ứng yêu cầu của một kỹ thuật phân tích hiện đại. Phương pháp đã được các phòng kiểm tra chất lượng của các công ty sản xuất dược phẩm, các phòng thí nghiệm của Trung tâm kiểm nghiệm triển khai, áp dụng để kiểm tra chất lượng nguyên liệu, thành phẩm sản xuất thuốc và coi đây là phương pháp quy chiếu. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân tích hoạt chất Flunarizin trong thuốc viên nang bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu: 1. Xây dựng và hoàn chỉnh phương pháp định tính, định lượng hoạt chất cho thuốc viên nang Flunarizin và nghiên cứu thẩm định phương pháp bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng kiểm tra một số chế phẩm thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất tại Việt Nam, đánh giá so sánh kết quả với phương pháp đã đăng ký trong bản TCCS. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về tiêu chuẩn kỹ thuật của thuốc. Thuốc là một loại hàng hóa đặc biệt có ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe thậm chí là tính mạng của người sử dụng, chính vì vậy việc đảm bảo chất lượng thuốc luôn được quan tâm từ khâu sản xuất, kiểm tra chất lượng, phân phối lưu thông, tồn trữ, sử dụng nhằm đảm bảo hiệu lực điều trị và an toàn cho người sử dụng. Khái niệm chất lượng thuốc được hiểu theo hai nghĩa: - Theo nghĩa hẹp: chất lượng thuốc là sự phù hợp các chỉ tiêu chất lượng với tiêu chuẩn kỹ thuật đã đăng ký và công bố. - Theo nghĩa rộng: ngoài sự phù hợp trên còn phải đảm bảo hiệu lực, hiệu quả công tác điều trị và tính an toàn cho người sử dụng [10]. Theo luật chất lượng hàng hóa sản phẩm có hai loại tiêu chuẩn: + Thứ nhất: tiêu chuẩn cơ sở do nhà sản xuất đăng ký và công bố đây là bản cam kết các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm của nhà sản xuất đối với các cơ quan quản lý và kiểm tra chất lượng thuốc. + Thứ hai: quy chuẩn kỹ thuật do nhà nước ban hành và bắt buộc áp dụng đối với các sản phẩm hàng hóa cùng loại muốn lưu hành trên lãnh thổ của quốc gia (Việt Nam). Đây là các chỉ tiêu, tiêu chuẩn liên quan đến quyền lợi của người tiêu dùng, đến độ an toàn của người sử dụng, tất cả các mặt hàng cùng loại của nước ngoài muốn được lưu hành trên thị trường, lãnh thổ Việt Nam phải đáp ứng mức tiêu chuẩn này. Đối với các thuốc lưu hành trên thị trường Việt Nam hiện nay có hai cấp tiêu chuẩn kỹ thuật: + Tiêu chuẩn cơ sở: của nhà sản xuất xây dựng, đăng ký và công bố áp dụng cho chế phẩm thuốc của chính nhà sản xuất đó, đơn vị có thẩm quyền phê duyệt + Tiêu chuẩn DĐVN là tiêu chuẩn cấp nhà nước về thuốc khuyến khích các cơ sở sản xuất thuốc trong nước áp dụng các tiêu chuẩn kỹ thuật 3 của chuyên luận thuốc đã được ban hành trong DĐVN, khi các cơ sở sản xuất xây dựng tiêu chuẩn cơ sở thì mức tiêu chuẩn không được thấp hơn mức tiêu chuẩn đã quy định trong DĐVN. Đối với các thuốc nước ngoài khi đăng ký nhập khẩu vào Việt Nam thì tiêu chuẩn kỹ thuật của sản phẩm không được thấp hơn so mức tiêu chuẩn DĐVN nếu đã có chuyên luận của chế phẩm đó. Ngày nay cùng với sự hội nhập toàn cầu, Việt Nam tham gia WTO; AFTA... các loại hàng hóa trong đó có thuốc chữa bệnh ngày càng phong phú về chủng loại, dạng bào chế đã góp một phần quan trọng trong công tác chăm sóc, bảo vệ sức khỏe nhân dân, song nếu hàng rào kỹ thuật của chúng ta không tốt các sản phẩm thuốc nước ngoài có tiêu chuẩn chất lượng không phù hợp dễ dàng tràn vào Việt Nam, bán với giá rẻ, các doanh nghiệp sản xuất trong nước không đủ sức cạnh tranh ngay tại thị trường nội địa, và người chịu thiệt thòi nhất là người bệnh, người tiêu dùng. Chính vì vậy công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng phải luôn được quan tâm đúng mức. Trong những năm gần đây hàng loạt các văn bản pháp quy về dược được ban hành trong đó quan trọng các văn bản sau: Luật Dược; Thông tư 09/2010/TT-BYT về quản lý chất lượng thuốc; thông tư 04/2010/TT-BYT hướng dẫn lấy mẫu thuốc để kiểm tra chất lượng, thông tư 44/2014/TTBYT về đăng ký thuốc đã hoàn thiện dần hành lang pháp lý cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc dùng cho người. 1.2 Tổng quan về Flunarizin. 1.2.1 Cấu trúc phân tử, tính chất lý hóa. - Công thức phân tử: C26H26F2N2 . 2 HCl (Khối lượng phân tử: 477,42) - Công thức cấu tạo: 4 F N H N F H - - Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Flunarizin Tên khoa học: 1 [bis (4-flurophenyl)methyl)-4-[(2E)-3-phenylprop-2en-1-yl] piperazine Dạng thường dùng: Flunarizin dihydroclorid. Khả năng hòa tan: Flunarizin ít tan trong methanol và ethanol; rất ít tan trong nước; thực tế không tan trong benzen; tan tốt hơn trong các dung dịch acid. Nhiệt độ nóng chảy: Flunarizin HCl có nhiệt độ nóng chảy là 204 2100C [14]. Flunarizin hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS. Cực đại hấp thụ tại bước sóng 226 nm và 253 nm, có hai cực tiểu ở 221 nm và 234 nm [14]. 1.2.2.Tính chất dược động học, tác dụng dược lý Dược động học - Hấp thu: Flunarizin hấp thu tốt quan đường uống, đạt nồng độ đỉnh trong vòng 2-4 giờ, và đạt trạng thái hằng định ở tuần thứ 5-6. - Phân bố: phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô, gắn kết với protein 90%. - Chuyển hóa: Flunarizin bị chuyển hóa hoàn toàn qua gan - Thải trừ: thuốc và các chất chuyển hóa được bài tiết ra phân qua đường mật. Thời gian thải trừ hoàn toàn khoảng 18 ngày [5]. 5 Tác dụng dược lý - Flunarizin là thuốc có tác dụng ngăn chặn sự quá tải Calci tế bào, bằng cách giảm Calci tràn vào tế bào một cách quá mức qua màng tế bào. Thuốc không có tác dụng trên co bóp cơ tim và dẫn truyền co bóp cơ tim [5]. Chỉ định - Dự phòng đau nửa đầu dạng cổ điển (có triệu chứng báo trước) hoặc đau nửa đầu dạng thông thường (không có triệu chứng báo trước). - Điều trị chứng chóng mặt tiền đình do rối loạn chức năng hệ thống tiền đình. - Điều trị các triệu chứng do thiểu năng tuần hoàn não và suy giảm oxy tế bào não bao gồm: chóng mặt, nhức đầu nguyên nhân mạch máu, rối loạn kích thích, mất trí nhớ, kém tập trung và rối loạn giấc ngủ [5]. 1.2.3 Tổng quan về các tiêu chuẩn kỹ thuật thuốc viên nang Flunarizin DĐVN IV ban hành từ năm 2009 chưa có chuyên luận thuốc viên nang Flunarizin [10]. Dược điển của các nước tiên tiến phiên bản mới nhất như: BP 2015; USP38; EP 2010 cũng chưa ban hành chuyên luận thuốc viên nang Flunarizin [13] ; [18]. Dược điển Trung Quốc CP 2010 đã ban hành chuyên luận thuốc viên nang Flunarizin, và chuyên luận nguyên liệu Flunarizin dạng muối HCl trong đó phương pháp định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhưng các điều kiện sắc ký không được quy định cụ thể gây khó khăn cho người phân tích [14]. Các cơ sở sản xuất thuốc viên nang Flunarizin xây dựng và công bố tiêu chuẩn cơ sở của mình, trong TCCS quy định phương pháp định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), dựa vào phổ hấp thụ UV-VIS so sánh với phổ của dung dịch chuẩn, làm song song chỉ tiêu định lượng bằng phương quang phổ tử ngoại UV-VIS và so sánh với dung dịch chuẩn hoặc tính toán kết quả theo giá trị E (1% ; 1cm) [ 6], [7], [8]. 6 Một số kỹ thuật đã được áp dụng để phân tích định lượng hoạt chất Flunarizin hiện nay: Bảng 1.1: Một số điều kiện định lượng hoạt chất Flunarizin Kỹ thuật phân tích Mẫu phân tích Chuẩn Nguyên độ môi liệu trường Flunarizin khan UV-VIS UV-VIS UV-VIS Các điều kiện phân tích Nồng độ mẫu phân tích Cân chính xác 0,2g chế phẩm, hòa tan trong 15 ml anhydric acetic, 10 ml acid acetic băng, thêm 5 ml dung dịch thủy ngân acetat (tt), thêm 1 giọt tím tinh thể. Chuẩn độ bằng Acid percloric 0,1N đến khi xuất hiện màu xanh. Song song làm mẫu trắng. 1 ml acid percloric 0,1N tương đương với 23,87 mg Flunarizin. 2HCl C26H26F2N2. 2HCl. Viên nang Bước sóng λ=253 nm; cứng Mẫu trắng: HCl 0,05N; Siberizin E(1% ;1cm)=439 Tài liệu tham khảo [14] 0,01 mg/ml [8] Viên nang Bước sóng λ=254 nm; 0,01 mg/ml cứng Mẫu trắng: HCl 0,05N; Sibelium So sánh song song với mẫu chuẩn. [15] Viên nang Bước sóng λ=254 nm; 0,01 mg/ml cứng Mẫu trắng: HCl 0,1N: [6] 7 Kỹ thuật phân tích Nồng độ mẫu phân tích Tài liệu tham khảo Viên nang Bước sóng λ=252 nm; 0,01 mg/ml cứng Mẫu trắng: HCl 0,1N trong Serapid Isopropanol. So sánh song song với mẫu chuẩn. [16] Mẫu phân tích Các điều kiện phân tích Sibethephar Isopropanol (11 :89) m So sánh song song với mẫu chuẩn. UV-VIS HPLC HPLC HPLC Thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg Cột : C18 0,01 mg/ml Pha động: MeOH : dung dịch Đệm phosphat pH = 3,5 (75:25) Detector: UV 253 nm Thể tích tiêm mẫu 20 µl. [14] Thuốc viên nén hỗn hợp Flunarizin và propranolol + Cột: C8 + Pha động: MeOH : dung dịch đệm phosphat 10 mM pH=3,8 (70 : 30); + Detector : 242 nm; Nhệt độ cột 400C; + Thể tích tiêm mẫu : 20 µl; + Tốc độ dòng 0,8 ml/phút. [19] Thuốc viên nang Hagizine 5,0 mg + Cột: Rp 18 + Pha động: AcCN : MeOH : Dung dịch A gồm: (5,9 g Tetrabutylamonium hydrogensulfat + 1,8 g [9] 8 Kỹ thuật phân tích Mẫu phân tích Các điều kiện phân tích Nồng độ mẫu phân tích Tài liệu tham khảo amoni acetat + 1000ml nước) : (30:30:40); + Detector : 253 nm; Nhệt độ cột 400C; + Thể tích tiêm mẫu = 20 µl; + Tốc độ dòng 1,2 ml/phút. 1.3.Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.3.1. Khái niệm chung Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Lựa chọn thành phần pha động để chất phân tích ra khỏi cột được rửa giải với thời gian hợp lý [10], [13], [18]. 1.3.2. Một số thông số đặc trưng của sắc ký Thời gian lưu: Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi chất phân tích được phát hiện tại detector. Thời gian chết: thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động). Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR - tM Hệ số phân bố K: K= CS CM CS, CM: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động. 9 K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn. Hệ số dung lượng k’: k’ = C S .VS V t t  K. S = R M C M .VM VM tM VS, VM tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động. k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha và hệ số VS/VM Thông thường chọn k’ = 1-5. Hệ số chọn lọc α: Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B: α= K B k ' B t R B  t M   K A k ' A t R  A  t M KB, KA lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước). k’A, k’B tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B. (tR)A, (tR)B tương ứng là thời gian lưu của chất A, B. Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1. Trong phân tích sắc ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 - 2. Nếu α quá lớn, thời gian phân tích kéo dài. Số đĩa lý thuyết: Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký 2  t  L t  N   16 R   5,54 R  H W   W1 / 2  2 L: chiều dài của cột (đơn vị độ dài); H: chiều cao của đĩa lý thuyết (đơn vị độ dài); W: chiều rộng của pic sắc ký (phút); W1/2: chiều rộng pic ứng với một nửa chiều cao của pic. 10 Độ phân giải của cột Độ phân giải (RS) đánh giá khả năng tách hai pic liền kề trong sắc ký đồ: t R B  t R A 1,18.t R B  t R A   W1 / 2 , A  W1 / 2 , B .W A  WB  RS = 1 2 Ở đây: WA, WB tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B; W1/2,A, W1/2,B tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B ứng với một nửa chiều cao của pic. Cột sắc ký và pha tĩnh Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm. Cột thường nhồi hạt cỡ 5-10 µm. Ưu điểm của cột nhồi hạt cỡ nhỏ là chạy tốn ít dung môi, thời gian ngắn và số đĩa lý thuyết lớn. Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được lắp trước cột sắc ký để loại các tạp chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại. Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica). Nhóm OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan. Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm: - Pha tĩnh không phân cực có R’ là: 11  Gốc octadecyl (C18)  Gốc octyl (C8)  Gốc phenyl - Pha tĩnh phân cực có R’ là:  Cyano  Amino  Diol Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai loại sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo: Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như triethylen glycol, nước. Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như hexan. Sắc ký phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon (C18 hoặc C8) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như nước, acetonitril. Detector Có nhiều detector được sử dụng trong HPLC và thường sử dụng 6 loại sau: - Detector hấp thụ UV-VIS - Detector huỳnh quang - Detector chỉ số khúc xạ - Detector tán xạ ánh sáng bay hơi - Detector đo dòng - Detector đo độ dẫn Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng dụng rộng, chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong cấu hình tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại. Về bản chất, đây là một 12 detector UV-Vis cho phép đồng thời ghi nhận tín hiệu hấp thụ đồng thời trên toàn dải phổ UV gần và VIS. Dải bức xạ UV-VIS (thường các detector PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang. Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp. Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thụ ở một bước sóng nhất định. Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý. Kết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính hoặc được lưu trữ để in ra dưới dạng bản phổ bằng máy in. Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước. 1.3.4.Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao trong kiểm nghiệm thuốc Trước tình hình thuốc đa thành phần và các thuốc phức tạp được sản xuất ngày càng nhiều thì việc ứng dụng kỹ thuật HPLC trong công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc ngày càng chiếm ưu thế. Dược điển Việt Nam IV (2009), có 168 chuyên luận sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng (HPLC) để kiểm tra các chỉ tiêu định tính, định lượng, và xác định tạp chất liên quan. Trong khi đó Dược điển Việt Nam III có 27 chuyên luận sử dụng các kỹ thuật: quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS; sắc ký bản mỏng (TLC); phương pháp chuẩn độ hóa học để thực hiện các chỉ tiêu định tính, định lượng, xác định tạp chất đến Dược điển Việt Nam IV đã chuyển sang kỹ thuật HPLC. Điều này cho thấy rõ xu hướng phát triển và yêu cầu nâng cấp tiêu chuẩn và khả năng ứng dụng của phương pháp HPLC. HPLC giúp ta thực hiện phép thử định tính, định lượng và tạp chất nhiều khi không cần xử lý. 13 Định tính Sự giống nhau về thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử là cơ sở của phép thử định tính. Trên máy HPLC hiện đại với Detector Diod array có thể quét phổ UV-VIS của pic ứng với chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sự giống nhau về hình dạng phổ thông qua hệ số match. + Hệ số match xấp xỉ 1,000 thì hai phổ định tính giống nhau hoàn toàn. + Hệ số match > 0,900 thì hai phổ định tính tương tự nhau. + Hệ số match < 0,900 thì hai phổ định tính khác nhau. Ngoài ra đối với Detector Photo Diod Array cò có thể kiểm tra được mức độ tinh khiết của pic thông qua hệ số angel purity; threshold purity. Định lượng Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic chuẩn và pic thử (phương pháp chuẩn ngoại) hoặc tỷ lệ đáp ứng của pic chuẩn và pic thử so với đáp ứng chuẩn nội (phương pháp chuẩn nội) trong cùng một điều kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép thử định lượng. Khi mẫu thử là một thuốc đa thành phần thì ta có thể định lượng đồng thời các thành phần hoạt chất được tách ra đạt yêu cầu theo quy định. Thử tạp chất Về cơ sở giống với phép thử định lượng. Ngoài ra đối với phép thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chuẩn ta có thể tính tỷ lệ tạp chất dựa vào % diện tích pic tạp so với diện tích pic hoạt chất. 1.4. Nội dung thẩm định phương pháp bằng HPLC 1.4.1 Tính phù hợp của hệ thống sắc ký Tính phù hợp của hệ thống khẳng định các thông số kỹ thuật, các điều kiện sắc ký đã chọn ổn định trong điều kiện phân tích. 1.4.2. Độ đặc hiệu/chọn lọc Độ đặc hiệu là khả năng phân biệt rõ chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử. Thông thường gồm các tạp chất, sản phẩm phân hủy, chất nền. 14 Trong HPLC, tính chọn lọc/đặc hiệu được thể hiện khi kết quả thu được trên sắc ký đồ (mẫu trắng, mẫu placebo thêm chuẩn, mẫu thử, mẫu chuẩn) cho thấy pic của chất cần phân tích được phân tách hoàn toàn với các pic tạp. 1.4.3. Độ tuyến tính Độ tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng của quy trình (trong khoảng xác định) để thu được các kết quả tỉ lệ trực tiếp đến nồng độ của chất phân tích trong mẫu thử. Độ tuyến tính được xác định bằng cách quan sát đồ thị đáp ứng giữa nồng độ hoặc hàm lượng của chất phân tích với giá trị đo được. Như vậy khoảng tuyến tính phải phủ toàn bộ khoảng xác định. Đường chuẩn phải có dạng đồ thị: Y = ax + b Yêu cầu: - Số điểm đường chuẩn n ≥ 5 - Hệ số tương quan r ≥ 0,998 - % Hệ số chắn b < 2% - 5% 1.4.4. Độ đúng Độ đúng của một quy trình phân tích biểu diễn mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy kết quả thực nghiệm với giá trị thực của chất phân tích có trong mẫu thử hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận. Thường tiến hành ≥ 3 mức nồng độ nằm trong khoảng xác định của phương pháp. Mỗi mức nồng độ tối thiểu 3 mẫu. Yêu cầu: - Định lượng: Thu hồi 98,0 – 102,0 %; RSD ≤ 2,0% - Độ hòa tan: Thu hồi 97,0 – 103,0 %; RSD ≤ 3,0% - Tạp chất: phụ thuộc vào mức giới hạn. 15 Thu hồi 95,0 – 105,0 % hoặc 90,0 – 110,0% ; RSD ≤ 10 -15%(20%) ( Tỉ lệ thu hồi: lượng tìm thấy/ lượng lí thuyết) 1.4.5. Độ chính xác Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả mức độ gần nhau (mức độ phân tán) giữa một dãy kết quả thu được của các mẫu thử được chuẩn bị từ một mẫu đồng nhất trong điều kiện đã đề ra. Độ chính xác chia làm 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp. Độ lặp lại Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích tiến hành trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại biểu thị độ chính xác trong định lượng. Thường được tiến hành trên 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ 3 lần (suy ra từ độ đúng). Cũng có thể 6 lần ở nồng độ 100% Yêu cầu: - Định lượng: RSD ≤ 2,0% - Độ hòa tan: RSD ≤ 3,0% - Tạp chất: RSD ≤ 10 -15% Độ chính xác trung gian Độ chính xác trung gian diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm, nhưng được thực hiện: Các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác nhau, điều kiện phân tích khác nhau. Yêu cầu: - Định lượng: RSD ≤ 3,0% - Độ hòa tan: RSD ≤ 4,0% - Tạp chất: RSD ≤ 10 -15% 16 Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Hóa chất, vật liệu Hóa chất + Kali dihydrophophat: KH2PO4 (Merck); + Triethylamin tinh khiết dùng cho phân tích; + Acid Phosphoric tinh khiết dùng cho phân tích; + Ethanol loại tinh khiết dùng cho phân tích; + Methanol loại dùng cho phân tích sắc ký lỏng (for HPLC); + Acid hydroclorid (HCl): loại tinh khiết dùng cho phân tích; + Isopropanol: loại dùng cho sắc ký lỏng; Tá dược + Lactose loại dược dụng; + Tinh bột mỳ loại dược dụng; + Sodium starch glycolate loại dược dụng; + Tinh bột ngô loại dược dụng; + Magnesi stearat loại dược dụng; + PVP K30 loại dược dụng; 2.1.2 Chất chuẩn + Chuẩn Flunarizin. 2HCL, nguồn gốc: chuẩn làm việc được thiết lập tại phòng kiểm tra chất lượng của Công ty CP Dược – VTYT Thanh Hóa, SKS: 020614, Hàm lượng 99,40% tính theo nguyên trạng. 17 2.1.3 Mẫu thử nghiên cứu Để phù hợp với mục tiêu của đề tài chúng tôi đã tiến hành thu thập các thuốc viên nang cứng Flunarizin của các cơ sở sản xuất trong nước với mã hóa như bảng 2.1: Bảng 2.1: Danh sách các mẫu phân tích Mẫu Tên sản phẩm Nhà sản xuất SKS; hạn dùng NC01 Viên nang cứng Công ty CP. Dược – VD-18040-12 Sibethepharm 5,0 mg VTYT Thanh Hóa. SKS:001; HD: 12/2015 NC02 Viên nang cứng Công ty TNHH liên VD-11963-10 Fluzinestad 5,0mg doanh Standa Việt SKS:010513; Nam HD: 05/2016 NC03 Viên nang Sibetab Công ty CP. Dược VD-19624-13 5mg phẩm Traphaco. SKS:004; NSX: 020614; HD: 06/2017 NC04 Viên nang Quanazine Công ty CP Dược VD-19917-13 5,0 mg phẩm OPC SKS: 011214; HD: 12/2017 NC05 Viên nang Flurassel Công ty TNHH Dược VD-21044-14 5,0 mg phẩm Đạt Vy Phú SKS:021 HD: 12/2015 NC06 Viên nang Hagizine Công ty CP Dược VD-178850-12 5,0 mg Hậu Giang SKS:020314 HD:03/2017 18 Mẫu Tên sản phẩm Nhà sản xuất SKS; hạn dùng NC07 Viên nang Công ty CP Dược VD-21796-12 Apharmazin 5mg phẩm Armepharco SKS:042 HD:04/2016 NC08 Viên nang Zolfastel Công ty CP. Sản xuất VD-13094-10 5,0mg - Thương mại dược SKS:012 phẩm Đông Nam. HD: 08/2016 2.1.4 Thiết bị và dụng cụ + Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters e2695; Detector PDA. + Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm); + Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (150 mm x 4,6 mm; 5 µm); + Cột sắc ký C8 Symmetry Waters (150 mm x 4,6 mm; 5 µm); + Tiền cột C18 Symmetry Waters; + Tiền cột C8 Symmetry Waters; + Cân kỹ thuật XT1200c. + Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g (Thụy Sỹ). + Máy đo pH: pH Metler 744 (Thụy Sỹ) + Máy quang phổ Shimadzu 1800 (Nhật Bản) + Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 20 mL, 50 mL, cốc có mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL. - Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm. 19 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích định tính, định lượng thành phần hoạt chất Flunarizin trong viên nang cứng Flunarizin bằng kỹ thuật HPLC. Mẫu Placebo: Qua tham khảo các công thức thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất trong nước chúng tôi nhận thấy các công thức tá dược trong thành phần của viên thuốc có các thành phần như trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần tá dược trong các chế phẩm thuốc viên nang Flunarizin sản xuất trong nước. STT Thành phần Chức năng Tỷ lệ hàm lượng (%) 1 Lactose Tá dược độn 30% - 50% 2 Microcrystaline Cellulose Tá dược độn 20% - 60% 3 Tinh bột ngô Tá dược độn 20% - 80% 3 Sodium starch glycolate Tá dược rã, giúp quá trình hòa tan 2,0% 4 Crosscarmellose sodium Tá dược rã, giúp quá trình hòa tan 1,0% - 2,0% 5 PVP K30 Tá dược dính 1,0% - 2,0% 6 Magnesi stearat Tá dược trơn 0,5% - 1,0% 7 Aerosil 200 Tá dược trơn 0,1% 20 Từ kết quả khảo sát trên chúng tôi quyết định xây dựng mẫu Placebo chung nhất dùng để thẩm định phương pháp thử có thành phần như bảng 2.3. Bảng 2.3. Công thức bào chế mẫu Placebo STT Thành phần Hàm lượng (%) 1 Lactose 35,0 mg 2 Microcrystaline Cellulose 35,0 mg 3 Tinh bột ngô 35,0 mg 3 Sodium starch glycolate 2,0 mg 4 Crosscarmellose sodium 2,0 mg 5 PVP K30 2,0 mg 6 Magnesi stearat 1,0 mg 7 Aerosil 200 0,1mg Tổng cộng 112,1 mg Các tá dược được cân, nghiền mịn và trộn đều với nhau để được hỗn hợp Placebo. - Dung dịch mẫu chuẩn và dung dịch mẫu thử: được chuẩn bị như quy định của phương pháp. 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất Flunarizin trong chế phẩm thuốc viên nang bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Từ kết quả nghiên cứu tham khảo các tài liệu tiến hành nghiên cứu khảo sát tối ưu hóa các điều kiện sắc ký bao gồm: 21 Cột sắc ký: loại cột, chiều dài cột; Pha động: (thành phần pha động, tỷ lệ, tốc độ dòng); Detector: khảo sát xác định bước sóng tối ưu; Thể tích tiêm mẫu: Điều kiện xử lý mẫu. 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích định tính, định lượng đã xây dựng Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu Placebo. - Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác Pc = 0,0243 g chuẩn Flunarizin. 2HCl, cho vào bình định mức 200 ml, hòa tan và thêm HCl 0,1 N vừa đủ 200 ml. - Dung dịch mẫu chuẩn làm việc: Hút 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc pha loãng trong pha động vừa đủ 50 ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. - Dung dịch mẫu thử: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình viên. Nghiền mịn, cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương với 10 mg hoạt chất cho vào bình định mức 100ml, thêm 70 ml dung dịch HCl 0,1N, lắc 5 phút thêm dung dịch HCl 0,1N vừa đủ 100ml. Lắc đều. Lọc qua giấy lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 50 ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. - Dung dịch mẫu Placebo: cân khoảng 220 mg hỗn hợp Placebo trên. Tiến hành xử lý như mẫu thử. Lọc qua màng lọc 0,45μm. Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích của Asean [3]. Các nội dung thẩm định phương pháp bao gồm: Độ phù hợp của hệ thống Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn làm việc đã chuẩn bị ở trên vào hệ thống ghi lại sắc ký đồ. Đánh giá sự ổn định phù hợp của hệ 22 thống thông qua giá trị RSD diện tích pic, RSD của thời gian lưu và số đĩa lý thuyết [3]. Độ chọn lọc của phương pháp Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên mẫu Placebo, ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng của mẫu trắng với mẫu chuẩn tại vị trí thời gian lưu của chuẩn [3]. Độ tuyến tính Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn gốc thành một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau tương ứng 50%; 75%; 100%; 125%; 150% nồng độ định lượng. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ hoạt chất và diện tích pic đáp ứng [3]. Độ chính xác Độ lặp lại Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong cùng một ngày, cùng một kiểm nghiệm viên, cùng thiết bị. Tính toán kết quả và đánh giá độ lặp lại của phương pháp [3]. Độ chính xác trung gian Tiến hành phân tích lặp lại độc lập 6 lần trên cùng mẫu thử, trong cùng ngày hôm sau, với kiểm nghiệm viên khác, sử dụng cột phân tích khác. Tính toán kết quả và đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp bằng cách so sánh kết quả phân tích của hai kiểm nghiệm viên trong hai ngày [3]. Độ đúng Độ đúng của phương pháp được tiến hành bằng cách thêm chuẩn vào mẫu tá dược ở ba khoảng nồng độ 80%; 100% và 120% nồng độ định lượng. Mỗi nồng độ được tiến hành độc lập 03 mẫu. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, tính toán kết quả. Độ đúng được đánh giá dựa 23 trên tỷ lệ thu hồi hoạt chất định lượng được so với nồng độ thực của mẫu [3]. 2.3.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng kiểm nghiệm một số mẫu thuốc viên nang Flunarizin lưu hành trên thị trường + Tiến hành phân tích độc lập song song trên mẫu viên nang Sibethepharm 5,0mg 6 lần bằng phương pháp đã xây dựng và phương pháp đã được đăng ký trong TCCS. Cụ thể các điều kiện đo quang như sau: + Bước sóng: 254 nm + Dung môi pha mẫu: HCl 0,1N : iso propanol (11:89) + Mẫu chuẩn và mẫu thử được pha nồng độ 0,01mg/ml trong dung môi pha mẫu. So sánh kết quả bằng xử lý thống kê. + Tiến hành phân tích đánh giá chất lượng một số mẫu thuốc sản xuất tại Việt Nam, đánh giá kết quả. 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU - Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lý bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC - Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Excel để tính toán: kết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn, phương sai, độ lệch chuẩn tương đối, hệ số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp. 24 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT FLUNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM THUỐC VIÊN NANG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Tham khảo các tài liệu cho thấy: Flunarizin ở dạng muối HCl nên hoạt chất tan tốt trong dung dịch HCl loãng (0,1N). Tiến hành pha mẫu flunarizin chuẩn trong dung dịch HCl nồng độ 0,1N để được nồng độ 0,01 mg/ml. Tiến hành quét phổ UV-VIS từ 200 nm đến 400 nm trên máy quang phổ Shimadzu 1800. Kết quả Flunarizin hấp thụ tử ngoại ở bước sóng cực đại 253 nm, vì vậy chúng tôi chọn bước sóng 253 nm làm bước sóng detector để thu được tín hiệu cao nhất, đảm bảo độ nhạy của thiết bị, đối với Detector PDA dùng bước sóng 253 nm để lấy pic. Qua tham khảo một số tài liệu [8], [14], [15], dựa trên độ phân cực, khả năng hòa tan của hoạt chất Flunarizin chúng tôi quyết định chọn cột C18; C8 để khảo sát các điều kiện sắc ký để phân tích mẫu, đây cũng là loại cột thông dụng và sẵn có trong phòng thí nghiệm. Sau khi đã lựa chọn được pha tĩnh sử dụng sắc ký pha đảo, bước sóng để phát hiện cực đại 253 nm. Tiến hành pha mẫu chuẩn trong pha động với nồng độ mẫu 0,01 mg/ml. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.1: 25 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các điều kiện sắc ký Pha tĩnh (cột) Pha động (tốc độ pha động 1,0 ml/phút) MeOH : dung dịch 250 x 4,6 mm; 5 µm KH2PO4 10 mM (70:30) tR C18; AcCN : MeOH : 250 x 4,6 mm; 5 µm dung dịch KH2PO4 10 mM (50:25:25) 2,40 Pic xuất hiện sớm, nhọn, cân đối, độ lặp lại kém. 12,66 Pic xuất hiện muộn, thời gian phân tích kéo dài. Độ cân đối của pic kém, pic bị kéo đuôi. C18; C8; AcCN : MeOH : 150 x 4,6 mm; 5 µm dung dịch KH2PO4 10 mM (50:25:25) C8; MeOH : dung dịch 150 x 4,6 mm; 5 µm KH2PO4 10 mM pH=7,0 (60:40) C8; MeOH : dung dịch 150 x 4,6 mm; 5 µm KH2PO4 10 mM pH=4,0 (60:40) C8; MeOH : dung dịch 150 x 4,6 mm; 5 µm KH2PO4 10 mM pH=3,5 (60:40) 26 Nhận xét (phút) 9,82 Pic doãng, không cân đối. 15,50 Pic doãng, không cân đối. Pic nhọn, cân đối. 6,89 3,17 Pic nhọn, cân đối. Hệ số dung lượng và yếu tố đuôi ở mức chấp nhận được. Kết quả thực nghiệm nhận thấy: + Khi thêm thành phần Acetonitril vào pha động thời gian lưu của pic Flunarizin tăng lên. Acetonitril có độ phân cực lớn (dung môi trơ) trong khi Flunarizin khó tan hơn trong các dung môi phân cực nên tăng ái lực với pha tĩnh nên bị lưu giữ lâu hơn. + Khi thay đổi từ pha tĩnh C18 sang pha tĩnh C8 đã làm giảm ái lực của pha tĩnh với chất phân tích Flunarizin nên pic bị rửa giải sớm hơn. Các pic thu được từ sắc ký đồ khi phân tích trên pha tĩnh C8 nhọn và cân đối hơn so với khi phân tích trên pha tĩnh C18 với cùng pha động. Từ những kết quả khảo sát trình bày ở trên chúng tôi xây dựng phương pháp định tính, định lượng Flunarizin bằng kỹ thuật HPLC như sau: + Cột: C8 (150 mm x 4,6; 5 µm; end-capped) hoặc cột tương đương. + Detector: UV-VIS 253 nm; + Pha động: MeOH : dung dịch KH2PO4 10 mM pH=3,5 (60:40) tt/tt + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Nồng độ mẫu phân tích: 0,01 mg/ml pha trong pha động. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl; + Nhiệt độ buồng cột: nhiệt độ phòng. 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG 3.2.1 Chuẩn bị mẫu Như mục 2.3.2 3.2.2. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch mẫu chuẩn làm việc đã chuẩn bị ở trên, ghi lại sắc ký đồ. Độ phù hợp của hệ thống được đánh giá thông qua độ lặp lại của thời gian lưu tR và diện tích pic. 27 Yêu cầu: RSD thời gian lưu < 1,0% RSD diện tích pic < 2,0% Hệ số đối xứng (tail factor) < 2,0 Số đĩa lý thuyết > 3000. Kết quả được trình bày tại bảng 3.2: Bảng 3.2. Kết quả thẩm định độ thích hợp của hệ thống sắc ký. Mũi tiêm tR Diện tích pic (AU. phút) 1 3,178 561986 2 3,158 560053 Các thông số hệ thống Hệ số kéo đuôi (Tailing factor): 1,25 Số đĩa lý thuyết: 4.226 3 3,141 558042 4 3,155 563123 5 3,164 563687 6 3,115 555298 Trung bình: 3,152 560364,8 RSD (%): 0,69 0,58 Kết quả thực nghiệm cho thấy: Thời gian lưu trung bình của pic Flunarizin là: 3,152 ; RSD: 0,69% RSD của diện tích pic: 0,58% Hệ số kéo đuôi (Tailing factor): 1,25 Số đĩa lý thuyết: 4.226 28 Như vậy hệ sắc ký đã chọn đáp ứng yêu cầu dùng cho phân tích thành phần Flunarizin trong chế phẩm thuốc viên nang. Hệ thống sắc ký ổn định đáp ứng yêu cầu của phép phân tích. 3.2.3 Độ đặc hiệu của phương pháp Tiêm lần lượt mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu Placebo đã chuẩn bị ở trên vào hệ thống sắc ký với điều kiện sắc ký đã xây dựng. Ghi lại sắc ký đồ của các mẫu. Sắc ký dồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu placebo được trình bày ở hình 3.1; 3.2; 3.3. Hình 3.1. Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn Flunarizin. Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử Flunarizin. 29 Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch mẫu Placebo. Kết quả thực nghiệm cho thấy: mẫu chuẩn và mẫu thử xuất hiện pic với thì gian lưu tương ứng nhau tR chuẩn = 3,152 phút; tR thử = 3,161 phút, mẫu Placebo không xuất hiện píc có thời gian lưu trùng với mẫu thử và mẫu chuẩn. Pic mẫu thu được có hệ số: Purity angel: 0,233; Purity Threshold 0,538; Vậy hệ sắc ký đã lựa chọn có tính đặc hiệu tốt đối với nền mẫu đã khảo sát. 3.2.4. Khoảng nồng độ tuyến tính Pha một dãy các dung dịch chuẩn có các nồng độ khác nhau từ 4,59 µg/ml đến 13,77µg/ml. Tiến hành sắc ký và ghi lại sắc ký đồ. Đánh giá sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ Flunarizin và diện tích pic đáp ứng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3; hình 3.5. 30 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính. STT % so với nồng độ định lượng Nồng độ Flunarizin (µg/ml) Diện tích pic (Au x phút) 1 50 4,59 286293 2 75 6,88 375439 3 100 9,18 581828 4 125 11,47 683559 5 150 13,77 814314 Phương trình hồi quy: y = 61270,47 x – 723,71 Hệ số tương quan tuyến tính: r = 1,0000 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic flunarizin 31 Kết quả thực nghiệm cho thấy: + Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ Flunarizin đã khảo sát và diện tích pic thu được với hệ số tương quan tuyến tính r = 1,0000. + Khoảng tuyến tính đã khảo sát rộng từ 4,59 µg/ml đến 13,77 µg/ml. 3.2.5. Độ chính xác Độ lặp lại được đánh giá trên mẫu thử viên nang Sibethepharm 5,0mg của Công ty CP Dược – VTYT Thanh Hóa sản xuất. Cân 20 viên, mtb = 0,1135 g/viên, nghiền thành bột mịn, cân chính xác một lượng bột thuốc tương đương với 10 mg hoạt chất. Xử lý mẫu như điều kiện đã mô tả ở trên và tiến hành sắc ký. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4. 32 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp Mẫu Lượng cân (g) Diện tích pic (AU x phút) Hàm lượng % so với nhãn Chuẩn 1 0,0243 626187,5 Thử 1 0,2275 624213 101,80 Thử 2 0,2311 635785 102,08 Thử 3 0,2254 627874 103,36 Thử 4 0,2265 627666 102,82 Thử 5 0,2215 621009 104,02 Thử 6 0,2241 626771 103,77 Trung bình: 102,98 SD: 0,90 RSD (%): 0,88% Từ kết quả thực nghiệm cho thấy: + Phương pháp định lượng đã khảo sát có độ lặp lại tốt (RSD của 6 lần phân tích trên một mẫu là 0,88%  2,0%). Độ chính xác trung gian Độ chính xác trung gian hay còn gọi là độ chính xác khác ngày được đánh giá trên cùng mẫu thử, được tiến hành phân tích bởi kiểm nghiệm viên khác và ngày phân tích khác. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5. 33 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp Lượng cân (g) Diện tích peak Chuẩn 2 0,0245 639628 Thử 1 0,2231 622315 102,95 Thử 2 0,2299 626907 100,64 Thử 3 0,2209 611244 102,13 Thử 4 0,2241 623209 102,64 Thử 5 0,2231 621454 102,81 Thử 6 0,2243 621119 102,20 Mẫu (AU x phút) Hàm lượng % so với nhãn Trung bình: 102,23 SD: 0,84 RSD (%): 0,82 Trung bình (n=12): 102,60% RSD (n=12): 0,90% Ttest = 1,48 < tα (0,05; Df =5) = 2,57 Từ kết quả thực nhiệm cho thấy: + Phương pháp phân tích định lượng Flunarizin bằng phương pháp HPLC đã xây dựng có độ chính xác trung gian tốt, RSD của 12 kết quả phân tích thu được từ 02 kiểm nghiệm viên, hai ngày phân tích khác nhau là 0,90%; 34 + Dùng phép kiểm chuẩn Ttest cho thấy giá trị hàm Ttest=1,48 < 2,57 nghĩa là kết quả kiểm nghiệm của hai kiểm nghiệm viên khác nhau không có ý nghĩa thống kê với mức tin cậy 95%. 3.2.6. Độ đúng Độ đúng của phương pháp phân tích định lượng được tiến hành trên nền mẫu Placebo bằng cách thêm chuẩn để được các mẫu có nồng độ Flunarizin đã biết tương đương 80%; 100% và 120% nồng độ trong mẫu thử. Tiến hành định lượng theo phương pháp đã xây dựng, mỗi mẫu tiến hành độc lập 3 lần, tính toán hàm lượng Flunarizin tìm lại được. Chuẩn bị mẫu chuẩn: như mục 2.3.2. Chuẩn bị mẫu thử 80%: cân tương ứng 200 mg tá dược + 9,7 mg chuẩn Flunarizin vào bình định mức 100 ml, thêm HCl 0,1N vừa đủ tới vạch, lắc cho tan hoàn toàn. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên + pha động vừa đủ 50 ml. Chuẩn bị mẫu thử 100%: cân tương ứng 200 mg tá dược + 12 mg chuẩn Flunarizin vào bình định mức 100 ml, thêm HCl 0,1N vừa đủ tới vạch, lắc cho tan hoàn toàn. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên + pha động vừa đủ 50 ml. Chuẩn bị mẫu thử 120%: cân tương ứng 200 mg tá dược + 14 mg chuẩn Flunarizin vào bình định mức 100 ml, thêm HCl 0,1N vừa đủ tới vạch, lắc cho tan hoàn toàn. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên + pha động vừa đủ 50 ml. Tiến hành tiêm các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử đã chuẩn bị vào hệ thống sắc ký, mỗi mức lặp lại 3 lần, ghi lại sắc ký đồ, tính toán lượng hoạt chất tìm lại được. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6. 35 Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp Mẫu tá dược (g) % so với nồng độ định lượng Lượng chuẩn Flu thêm vào (g) Chuẩn 0,2164 Diện tích Lượng Flu pic tìm lại (AUxphút) được (g) % Flu tìm lại 626187,5 0,00973 500987 0,00972 99,87 0,00976 502556 0,00975 99,86 0,2156 0,00977 504677 0,00979 100,18 0,2276 0,01199 626112 0,01215 101,32 0,01208 627009 0,01217 100,71 0,2176 0,01209 627099 0,01217 100,64 0,2172 0,01458 750111 0,01455 99,79 0,01468 751437 0,01458 99,32 0,01464 752007 0,01459 99,67 0,2169 0,2387 0,2262 0,2162 80% 100% 120% Trung bình: 100,15 RSD (%): 0,63 Kết quả thực nghiệm cho thấy: + Phương pháp định lượng đã khảo sát có độ tìm lại tốt ở cả ba khoảng nồng độ: - Khoảng nồng độ 80%: 99,97%; RSD = 0,18%. - Khoảng nồng độ 100%: 100,89%; RSD = 0,37%. - Khoảng nồng độ 120%: 99,59%; RSD = 0,25%. 36 + Độ tìm lại trung bình trên cả ba khoảng nồng độ 100,15%; RSD = 0,63% + Như vậy phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu cho phép phân tích định lượng. 3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU THUỐC THU THẬP TRÊN THỊ TRƯỜNG 3.3.1 So sánh phương pháp đã xây dựng với phương pháp đã đăng ký trong TCCS (phương pháp đo quang, kèm chất chuẩn) Để so sánh đánh giá phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng mới xây dựng với phương pháp định lượng đã đăng ký trong TCCS chúng tôi phân tích song song mẫu thử viên nang Sibethepharm 5,0mg (Flunarizne 5,0 mg) của Công ty CP Dược – VTYT Thanh Hóa sản xuất SKS: 001; HD 12/2015. Mỗi phương pháp tiến hành độc lập 6 lần, so sánh kết quả giá trị trung bình của 2 dãy sử dụng hàm T-test. + Kết quả định lượng mẫu thử bằng phương pháp đã đăng ký (UV-VIS). Dung dịch mẫu chuẩn: Cân 0,0246g chất chuẩn Flunarizin HCl cho vào bình định mức 200 ml, hòa tan và pha loãng vừa đủ thể tích bằng dung dịch HCl 0,1N. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch HCl 0,1N vừa đủ tới vạch và lắc đều. Dung dịch mẫu thử: khối lượng trung bình viên: 0,1135 g/viên. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 2 viên cho vào bình định mức 100 ml, thêm 50 ml HCL 0,1N, lắc siêu âm trong 5 phút, thêm dung dịch HCl 0,1N vừa đủ 100 ml. Lọc. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên, cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung dịch HCl 0,1N vừa đủ. Đo mật độ quang ở bước sóng λ = 253 nm; cuvet 1 cm; mẫu trắng là dung dịch HCl 0,1N Kết quả được thể hiện trong bảng 3.7. 37 Bảng 3.7 Kết quả định lượng mẫu thử bằng phương pháp UV-VIS STT 1 Khối lượng cân mẫu (g) Mật độ quang Mẫu chuẩn Hàm lượng so với nhãn (%) 0,421 2 0,2213 0,408 101,74 3 0,2301 0,431 103,37 4 0,2298 0,424 101,82 5 0,2235 0,408 100,74 6 0,2251 0,414 101,50 7 0,2199 0,407 102,14 Trung bình 101,88 SD 0,87 RSD (%): 0,85 + Kết quả định lượng bằng phương pháp HPLC. Kết quả định lượng mẫu thử bằng phương pháp HPLC đã xây dựng được lấy từ mục 3.2.5; bảng 3.4 Kết quả so sánh được trình bày ở bảng 3.8. 38 Bảng 3.8. Kết quả so sánh hai phương pháp thử STT Phương pháp HPLC Phương pháp UV-VIS 1 101,80 101,74 2 102,08 103,37 3 103,36 101,82 4 102,82 100,74 5 104,02 101,50 6 103,77 102,14 Trung bình 102,98 101,88 0,90 0,87 SD. T-test = 2,02 < 2,57 Tbảng (0,05; Df =5) Kết quả thực nghiệm cho thấy: + Khi định lượng song song mẫu thử bằng phương pháp HPLC mới xây dựng và phương pháp UV-VIS đã được đăng ký trong TCCS của thuốc viên nang Sibethepharm 5,0 mg của Công ty CP. Dược – VTYT Thanh Hóa. Kết quả định lượng bằng 2 phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy 95%. 3.3.2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng phân tích một số mẫu nghiên cứu Chúng tôi đã ứng dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để tiến hành định lượng flunarizin trong một số mẫu thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg. Kết quả trược trình bày ở bảng 3.9. 39 Bảng 3.9 Kết quả phân tích các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp HPLC đã xây dựng. STT Mẫu NC/ Khối lượng TB viên Lượng cân mẫu (g) Thời gian lưu tR (phút) Diện tích pic (AU . phút) Hàm lượng % so với nhãn Trung bình 1 Chuẩn 0,0241 3,154 624398 - - 621990 102,28 580935 103,72 0,2311 589908 102,04 NC02 0,2218 611243 102,76 0,1151 g/v 0,2191 602334 102,51 0,2201 600389 101,71 NC03 0,2099 578909 100,25 0,1122 g/v 0,2192 597805 99,13 0,2181 602319 100,38 NC04 0,2344 575532 96,40 0,1212 g/v 0,2314 567744 96,33 0,2311 559906 95,13 0,2547 547768 92,45 2 3 4 5 NC01 0,2431 0,1234 g/v 0,2239 NC05 6 0,1327 g/v 3,156 3,181 3,149 3,155 3,158 0,2533 102,33 ± 0,53 99,92 ± 0,69 95,95 ± 0,75 92,74 ± 0,29 546689 40 102,68 ± 0,88 92,78 STT 7 8 9 Mẫu NC/ Khối lượng TB viên Lượng cân mẫu (g) Thời gian lưu tR (phút) Diện tích pic (AU . phút) Hàm lượng % so với nhãn 0,2547 550957 92,99 NC06 0,2256 577779 93,67 0,1129 g/v 0,2231 578897 94,90 0,2199 576884 95,95 NC07 0,2207 587788 95,68 0,1109 g/v 0,2231 589099 94,86 0,2214 590025 95,74 NC08 0,2213 500806 102,20 0,1394 g/v 0,2456 552398 101,57 549806 100,68 Trung bình 3,125 3,172 3,174 0,2466 94,84 ± 1,20 95,43 ± 0,51 101,48 ± 0,75 Kết quả thực nghiệm cho thấy. + Từ kết quả định lượng 08 mẫu thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg được sản xuất tại Việt Nam cho thấy phương pháp định tính, định lượng bằng kỹ thuật HPLC đã xây dựng phù hợp với mục đích sử dụng. 41 CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN Đau nửa đầu là một bệnh khá thường gặp, ngày nay với xã hội hiện đại và áp lực cuộc sống gia tăng đã làm tăng tỷ lệ mắc bệnh và càng trầm trọng hơn. Các thuốc điều trị bệnh này khá đa dạng, tuy nhiên Flunarrizin vẫn là thuốc được ưu tiên lựa chọn nhất bởi ít tác dụng không mong muốn. Các công ty Dược của Việt Nam rất quan tâm đến mặt hàng này, tại Việt Nam tính đến thời điểm hiện tại có 16 số đăng ký thuốc đang sản xuất, lưu hành. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện nghiên cứu này dựa trên các tài liệu tham khảo, các trang thiết bị hiện có tại phòng thí nghiệm nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng thuốc và tiến tới có thể chuyển giao cho các công ty đăng ký sản xuất thuốc. Từ quá trình thực nghiệm chúng tôi rút ra một số bàn luận sau: 4.1 VỀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phương pháp thử được xây dựng dựa trên các quy định hiện hành về tiêu chuẩn kỹ thuật về thuốc, các dược điển của các nước tiên tiến (Dược điển Anh; dược điển Mỹ) với các phiên bản cập nhật nhất phù hợp về tính hiện đại, khoa học của tiêu chuẩn kỹ thuật. Phương pháp phân tích định tính, định lượng, được xây dựng trên kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật vừa tách và định lượng đảm bảo độ chính xác và chọn lọc cao. Qua quá trình nghiên cứu, khảo sát các điều kiện sắc ký lỏng chúng tôi đã tìm được phương pháp sắc ký với các dung môi, hóa chất, vật tư tiêu hao phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam. Tốc độ dòng thấp với tỷ lệ dung môi hữu cơ 60% góp phần bảo vệ môi trường và rất kinh tế khi tiến hành sắc ký bằng hai kênh dung môi riêng biệt. Qua quá trình thực nghiệm chúng tôi thấy chương trình sắc ký lỏng đã xây dựng sử dụng các hóa chất thông dụng tại phòng thí nghiệm, điều 42 kiện sắc ký không quá ngặt nghèo (không cần điều kiện ổn nhiệt cột) các pic sắc ký nhọn, gọn và các thông số đạt yêu cầu. Phương pháp sắc ký đã xây dựng đủ hiệu năng tách các chất có trong thành phần thuốc viên nang thông dụng sản xuất tại Việt Nam, các thông số của pic sắc ký như: hệ số bất đối, hệ số dung lượng, số đĩa lý thuyết đạt yêu cầu đề ra. 4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Các số liệu thu được trong quá trình nghiên cứu thẩm định phương pháp phân tích cho thấy các tá dược trong viên không ảnh hưởng đến kết quả phân tích, điều này chứng tỏ phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đặc hiệu với thành phần Flunarizin trong phép phân tích định tính và định lượng. Với hệ sắc ký đã lựa chọn trong phương pháp thử định lượng kết quả cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Flunarizin và diện tích pic thu được có hệ số tuyến tính cao (r = 1,000) và sự tuân thủ tuyến tính trong một khoảng rộng (từ 4,59µg/ml đến 13,77 µg/ml). Việc này rất thuận lợi cho việc phân tích của các kiểm nghiệm viên và đảm bảo độ chính xác của phép phân tích và có thể áp dụng phương pháp này để định lượng hoạt chất giải phóng trong phép thử độ hòa tan. Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đã xây dựng trong tiêu chuẩn cho độ lặp lại tốt với RSD của 6 lần thử nghiệm với cùng một kiểm nghiệm viên làm trong cùng thời gian là 0,88%< 2,0% đạt yêu cầu so với quy định xây dựng phương pháp thử. Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo phương pháp mẫu tự tạo, tức là đánh giá dựa trên nền của mẫu placebo (mẫu trắng chỉ có tá dược) bằng phương pháp thêm chuẩn rồi xác định lượng hoạt chất được tìm lại bằng phương pháp định lượng đã quy định ở các mức nồng độ 80,0%; 100,0%; 120,0% so với nồng độ định lượng, kết quả thẩm định cho thấy độ tìm lại của phương pháp xây dựng trung bình 100,15%; RSD = 0,63%, các 43 kết quả trải từ 99,32% -101,32%. Chứng tỏ độ đúng của phương pháp đạt yêu cầu dùng cho phân tích chất lượng thuốc. 4.3 VỀ SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC MỚI XÂY DỰNG VỚI PHƯƠNG PHÁP UV-VIS MÀ NHIỀU TCCS ĐÃ XÂY DỰNG. Chúng tôi đã tiến hành phân tích định lượng trên nền mẫu thử là thuốc Sibelium 5,0 mg của Thanh Hóa. Kết quả phân tích cho thấy hai phương pháp cho kết quả khác nhau không có ý nghĩa thống kê ở mức yin cậy 95%. Tuy nhiên mới chỉ đánh giá được trên một nền mẫu, và tính đến thời điểm đánh giá thuốc này mới được sản xuất, kết quả định lượng đạt khá cao. Để đánh giá đầy đủ hơn về tính chọn lọc và mức độ ưu việt của phương pháp cần tiến hành khảo sát trên nền nguyên liệu được lão hóa cấp tốc cũng như trong điều kiện bảo quản dài hạn để theo dõi các tạp hình thành và khả năng tách các tạp ra khỏi hoạt chất chính của phương pháp HPLC đã xây dựng. 4.3 VỀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH CÁC MẪU THUỐC VIÊN NANG FLUNARIZIN 5,0 mg SẢN XUẤT TRONG NƯỚC Phương pháp phân tích định tính, định lượng thành phần hoạt chất Flunarizin trong chế phẩm viên nang đã xây dựng được ứng dụng để kiểm tra chất lượng trên nền chế phẩm Viên nang Sibethepharm 5,0 mg do Công ty Dược – VTYT Thanh Hóa sản xuất có so sánh với phương pháp UV-VIS đã được đăng ký trong TCCS. Kết quả phân tích cho thấy kiểm tra mẫu thử bằng hai phương pháp hàm lượng hoạt chất so nhãn khác nhau không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Kết quả kiểm tra các mẫu viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất trong nước cho thấy phương pháp đã xây dựng phù hợp với mục đích sử dụng. 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Từ kết quả thực nghiệm chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Đã xây dựng được phương pháp định tính, định lượng hoạt chất Flunarizin trong chế phẩm thuốc viên nang bằng HPLC với các điều kiện cụ thể như sau: Điều kiện sắc ký + Cột: C8 (150 mm x 4,6; 5 µm; end cap) hoặc cột tương đương. + Detector: UV-VIS 253 nm; + Pha động: MeOH : dung dich đệm KH2PO4 10 mM pH=3,5 (60:40) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Chuẩn bị mẫu + Dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử được hòa tan trong pha động với nồng độ 0,01 mg/ml. Đánh giá kết quả + Định tính: kết quả định tính được đánh giá thông qua sự trùng khớp thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu chuẩn với pic trong sắc ký đồ mẫu thử. + Định lượng: kết quả định lượng được tính toán % hàm lượng so nhãn thông qua diện tích pic mẫu chuẩn, mẫu thử, nồng độ mẫu chuẩn, lượng cân, độ pha loãng mẫu thử. 2. Đã thẩm định được phương pháp xây dựng đầy đủ theo hướng dẫn của Bộ Y tế về hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích chất lượng thuốc. Kết quả thẩm định đạt theo quy định cụ thể: Độ chọn lọc (độ đặc hiệu) của phương pháp với mẫu placebo chung cho các thuốc sản xuất trong nước, mẫu trắng không có đáp ứng pic tại vị trí thời gian lưu của mẫu chuẩn, mẫu thử. 45 Độ tuyến tính: tiến hành thẩm định độ tuyến tính của thành phần hoạt chất trong khoảng 50% đến 150% nồng độ định lượng (4,59µg/ml đến 13,77 µg/ml) có hệ số tương quan tuyến tính r = 1,0000 đạt yêu cầu đề ra. Độ lặp lại (độ chính xác trong ngày) n = 6 giá trị RSD từ 0,88%; độ chính xác trung gian (độ chính xác khác ngày) n = 12 giá trị RSD từ 0,90% phù hợp với yêu cầu của phép phân tích định lượng. Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi hoạt chất trung bình 100,15%; với RSD của tỷ lệ thu hồi 0,630% phù hợp với yêu cầu của phép phân tích định lượng. 3. Đã ứng dụng phương pháp xây dựng kiểm tra chất lượng một số chế phẩm viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất tại Việt Nam Quy trình phân tích ở trên được áp dụng để kiểm tra chất lượng 08 mẫu thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất tại Việt Nam. Kết quả cho thấy: các mẫu thuốc đều đạt chất lượng theo quy định của TCCS. Từ các kết quả thu được, nhận thấy phương pháp HPLC đã xây dựng là phù hợp để định tính, định lượng Flunarizin trong chế phẩm viên nang. ĐỀ XUẤT Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra chất lượng các chế phẩm thuốc chứa flunarizin lưu hành trên thị trường. Với kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp đề nghị Hội đồng dược điển Việt Nam xem xét ban hành chuyên luận viên nang Flunarizin vào Dược điển Việt Nam trong lần xuất bản tiếp theo. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt. 1. Trần Tử An và cs, 2007. Hóa phân tích- tập 2- Phân tích dụng cụ. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Trần Tử An và cs, 2010. Kiểm nghiệm dược phẩm. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 3. Hướng dẫn thẩm định quy trình phân tích của Asean (bản Tiếng Việt). 4. Bộ Y tế, 2014. Thông tư 44/2014/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm 2014, Hướng dẫn đăng ký thuốc. 5. Tào Duy Cần và cs, 2013. Thuốc và Biệt Dược. Nhà xuất bản Y học. 6. Công ty CP. Dược – VTYT Thanh Hóa, 2012. Tiêu chuẩn kỹ thuật viên nang Sibethepharm 5 mg. 7. Công ty CP. Dược – VTYT Vĩnh Phúc, 2013. Tiêu chuẩn kỹ thuật viên nang Flunarizin 5,0 mg. 8. Công ty TNHH Dược Sao Kim, 2010. Tiêu chuẩn kỹ thuật viên nang Siberizin 5 mg. 9. Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang, 2012. Tiêu chuẩn kỹ thuật viên nang Hagizin 5 mg. 10. Hội đồng Dược điển, 2009. Dược điển Việt Nam 4, Nhà xuất bản Y học. 11. Trịnh Văn Lẩu, 2010. Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, trang 158 – 178, Nhà xuất bản y học. 12. Trần Cao Sơn và cs, 2010. Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật, Trang 120 -125, Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật. Tiếng Anh 13. Bristish Pharmacopoiea, 2013, 2015, 2013, 2015. CD ROM. 14. The Pharmacopoeia of People's Republish of China, 2010. Volume 2; Page 361-363. 15. Janssen -Cilag; Olic (Thailand) Ltd., 2008. Specification of Sibelium capsule 5,0 mg. 16. New Gene Pharm Co. Inc. India, 2010. Specification of Serapid Capsule 5,0 mg. 17. Sean C Sweetman, 2009. Martindale 36, PP Pharmaceutical Press Page 580-2. 18. The United States of Pharmacopeia 34-NF 29 (2012). 19. Bhavini N. Patel, Ankul K Doshi, Chahaga N. Patel, 2012. Rp_HPLC method for simutanous estimation of popranolol HCl and Flunarizin HCl in their combine dose fomulation; Orginal Article 2012, vollume 3, Issue 4, page 274-278. Doi 10.4103/22295186.103094. PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Điều kiện sắc ký + Cột: C8 (150 mm x 4,6; 5 µm; end cap) hoặc cột tương đương. + Detector: UV-VIS 253 nm; + Pha động: MeOH : dung dich đệm KH2PO4 10 mM pH=3,5 (60:40) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Chuẩn bị mẫu + Dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác chuẩn Flunarizin và hòa tan trong pha động để được nồng độ 0,01 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. + Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng 10 mg Flunarizin hòa tan trong HCl 0,1N vừa đủ 100 ml. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên, thêm pha động vừa đủ 50 ml. Lọc qua màng lọc 0,45 µm. Đánh giá kết quả + Định tính: kết quả định tính được đánh giá thông qua sự trùng khớp thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ mẫu chuẩn với pic trong sắc ký đồ mẫu thử. + Định lượng: kết quả định lượng được tính toán % hàm lượng so nhãn thông qua diện tích pic mẫu chuẩn, mẫu thử, nồng độ mẫu chuẩn, lượng cân, độ pha loãng mẫu thử và khối lượng trung bình viên. PQ sua Flunarizin Ov erlaid Chromatogram 0.030 AU 0.020 0.010 0.000 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 4; Injection: 1; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 10:50:05 AM ICT Vial: 4; Injection: 3; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 10:59:53 AM ICT Vial: 4; Injection: 2; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 10:54:59 AM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name Name Area Height % Area % Height Retention Time (min) 1 50% Flunarizin 287157 37599 100.00 100.00 3.148 2 50% Flunarizin 284424 37618 100.00 100.00 3.144 3 50% Flunarizin 287299 37037 100.00 100.00 3.060 Mean Std. Dev. 286293.222 37418.190 1620.674 330.153 0.6 0.9 % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:14619 14619 Page: 1 of 1 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/4/2015 2:56:04 PM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Ov erlaid Chromatogram Flunarizin 0.050 0.040 AU 0.030 0.020 0.010 0.000 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 5; Injection: 3; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 11:14:40 AM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name 1 75% Mean Name Area Flunarizin 375440 Height 49502 % Area % Height 100.00 100.00 Retention Time (min) 3.085 375439.956 49502.438 Std. Dev. % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:14619 14619 Page: 1 of 1 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/4/2015 2:57:48 PM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Flunarizin Ov erlaid Chromatogram 0.06 AU 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 6; Injection: 2; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 11:24:31 AM ICT Vial: 6; Injection: 1; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 11:19:35 AM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name Name Area Height % Area % Height Retention Time (min) 1 100% Flunarizin 589174 73709 100.00 100.00 3.063 2 100% Flunarizin 574484 72442 100.00 100.00 3.059 Mean Std. Dev. 581828.996 73075.448 10387.978 896.237 1.8 1.2 % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:14619 14619 Page: 1 of 1 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/4/2015 2:59:06 PM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Flunarizin Ov erlaid Chromatogram 0.08 AU 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 7; Injection: 3; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 11:47:11 AM ICT Vial: 7; Injection: 1; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 11:34:20 AM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name Name Area Height % Area % Height Retention Time (min) 1 125% Flunarizin 683493 88810 100.00 100.00 3.130 2 125% Flunarizin 683627 89252 100.00 100.00 3.137 Mean 683559.950 89031.131 Std. Dev. % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:14619 14619 Page: 1 of 1 94.257 313.055 0.0 0.4 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/4/2015 2:59:45 PM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Ov erlaid Chromatogram Flunarizin 0.12 0.10 AU 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 8; Injection: 3; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 12:01:56 PM ICT Vial: 8; Injection: 1; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 11:52:06 AM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name Name Area Height 1 150% Flunarizin 815741 2 150% Flunarizin 812888 Mean Std. Dev. 114902 100.00 3.094 111111 100.00 100.00 3.127 113006.406 2017.146 2681.097 0.2 2.4 Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:14619 14619 Page: 1 of 1 Retention Time (min) 100.00 814314.412 % RSD % Area % Height Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/4/2015 3:01:13 PM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Flunarizin Ov erlaid Chromatogram AU 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 Vial: Vial: Vial: Vial: Vial: Vial: 2; 2; 2; 2; 3; 2; 1.50 Injection: Injection: Injection: Injection: Injection: Injection: 1; 2; 3; 5; 3; 4; Channel: Channel: Channel: Channel: Channel: Channel: 2.00 Minutes 2998; 2998; 2998; 2998; 2998; 2998; Date Date Date Date Date Date 2.50 Acquired: Acquired: Acquired: Acquired: Acquired: Acquired: 3.00 5/4/2015 5/4/2015 5/4/2015 5/4/2015 5/4/2015 5/4/2015 3.50 10:05:29 10:10:27 10:15:22 10:25:27 10:45:06 10:20:18 AM AM AM AM AM AM 4.00 ICT ICT ICT ICT ICT ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name Name Area Height % Area % Height Retention Time (min) USP Tailing USP Plate Count 1 chuan Flunarizin 561986 72319 100.00 100.00 3.178 1.259169e+000 4.311452e+003 2 chuan Flunarizin 560053 71576 100.00 100.00 3.158 1.265137e+000 4.236593e+003 3 chuan Flunarizin 558042 72075 100.00 100.00 3.141 1.242435e+000 4.213362e+003 4 chuan Flunarizin 563123 72217 100.00 100.00 3.155 1.260972e+000 4.240004e+003 5 chuan Flunarizin 563687 72832 100.00 100.00 3.164 1.259602e+000 4.332364e+003 6 chuan Flunarizin 555298 71960 100.00 100.00 3.115 1.223696e+000 4.163270e+003 Mean Std. Dev. 560364.819 72163.096 3238.433 416.828 0.6 0.6 % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:14618 14618 Page: 1 of 1 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/4/2015 2:50:04 PM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Flunarizin Ov erlaid Chromatogram 0.06 AU 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 2; Injection: 2; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 10:10:27 AM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name 1 Mean chuan Name Flunarizin Area 560053 Height USP Tailing 71576 1.265137e+000 USP Plate Count Retention Time (min) 4.236593e+003 3.158 Purity1 Angle 0.174 Purity1 Threshold 0.341 560053.144 71575.730 td. Dev. % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:15262 15262 Page: 1 of 1 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/11/2015 8:30:26 AM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Flunarizin Ov erlaid Chromatogram AU 0.06 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 3; Injection: 1; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 12:16:45 PM ICT Vial: 3; Injection: 4; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 12:31:27 PM ICT Vial: 3; Injection: 3; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 12:26:33 PM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name Name Area Height % Area % Height Retention Time (min) 1 thu Flunarizin 564863 72356 100.00 100.00 3.109 2 thu Flunarizin 567152 72415 100.00 100.00 3.116 3 thu Flunarizin 565354 68763 100.00 100.00 3.107 565789.567 71177.789 1205.037 2091.387 0.2 2.9 Mean Std. Dev. % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:14619 14619 Page: 1 of 1 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/4/2015 2:55:17 PM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Flunarizin Ov erlaid Chromatogram 0.06 AU 0.04 0.02 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 3; Injection: 4; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 12:31:27 PM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name 1 Mean thu Name Flunarizin Area 565354 Height USP Tailing 68763 1.301637e+000 USP Plate Count Retention Time (min) 3.716712e+003 3.107 Purity1 Angle 0.233 Purity1 Threshold 0.538 565354.122 68763.103 td. Dev. % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:15262 15262 Page: 1 of 1 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/11/2015 8:25:38 AM Asia/Ho_Chi_Minh PQ sua Ov erlaid Chromatogram 0.002 AU 0.001 0.000 -0.001 -0.002 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 2.50 3.00 3.50 4.00 Vial: 1; Injection: 2; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 10:00:34 AM ICT Vial: 1; Injection: 1; Channel: 2998; Date Acquired: 5/4/2015 9:55:37 AM ICT Component Summary Table Name: Flunarizin Sample Name Name Area Height % Area % Height Retention Time (min) 1 trang Flunarizin 3.176 2 trang Flunarizin 3.176 Mean Std. Dev. % RSD Reported by User: System Report Method: PQ sua Report Method ID:14619 14619 Page: 1 of 1 Project Name: VITAMINE Date Printed: 5/4/2015 3:01:59 PM Asia/Ho_Chi_Minh Sample Summary Table Reported by User: System Project Name: Test cot Sample Name: Data Acquired: Flunarizin std 2. 5/4/2015 13:01:21 PM ICT Vial: 9 Inj. #: 1 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.178 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 626198 100.00 46964 Flunarizin Rep 1. 5/4/2015 13:18:43 PM ICT Vial: 10 Inj. #: 1 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.143 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 624213 100.00 46691 Flunarizin Rep 2. 5/4/2015 13:42:12 PM ICT Vial: 11 Inj. #: 2 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.171 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 635785 100.00 47683 Flunarizin Rep 3. 5/4/2015 13:51:13 PM ICT Vial: 12 Inj. #: 1 Processed Channel: Peak Name 1 Flunirazin Retention Time (min) 3.143 Area % Area Height 627874 100.00 47090 Report Method: Sample Summary Table Printed 17:14: 28 PM As 5/4/2015 Page: 1 of 4 Sample Summary Table Reported by User: System Project Name: Test cot Sample Name: Data Acquired: Flunarizin Rep 4. 5/4/2015 14:15:43 PM ICT Vial: 13 Inj. #: 2 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.136 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 627666 100.00 46949 Flunarizin Rep 5. 5/4/2015 14:23:23 PM ICT Vial: 14 Inj. #: 1 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.153 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 621009 100.00 46451 Flunarizin Rep 6. 5/4/2015 14:46:41 PM ICT Vial: 15 Inj. #: 2 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.123 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 626771 100.00 46882 Flunarizin dd 80/1. 5/4/2015 14:55:43 PM ICT Vial: 16 Inj. #: 1 Processed Channel: Peak Name 1 Flunirazin Retention Time (min) 3.131 Area % Area Height 500987 100.00 37473 Report Method: Sample Summary Table Printed 17:14: 28 PM As 5/4/2015 Page: 2 of 4 Sample Summary Table Reported by User: System Project Name: Test cot Sample Name: Data Acquired: Flunarizin dd 80/2. 5/4/2015 15:18:48 PM ICT Vial: 17 Inj. #: 2 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.119 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 502556 100.00 37591 Flunarizin dd 80/3. 5/4/2015 15:26:23 PM ICT Vial: 18 Inj. #: 1 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.173 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 504677 100.00 37749 Flunarizin dd 100/1. 5/4/2015 15:35:42 PM ICT Vial: 19 Inj. #: 1 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.125 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 626112 100.00 46958 Flunarizin dd 100/2. 5/4/2015 15:52:53 PM ICT Vial: 20 Inj. #: 2 Processed Channel: Peak Name 1 Flunirazin Retention Time (min) 3.114 Area % Area Height 627009 100.00 46900 Report Method: Sample Summary Table Printed 17:14: 28 PM As 5/4/2015 Page: 3 of 4 Sample Summary Table Reported by User: System Project Name: Test cot Sample Name: Data Acquired: Flunarizin dd 100/3. 5/4/2015 16:01:23 PM ICT Vial: 21 Inj. #: 1 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.126 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 627099 100.00 46907 Flunarizin dd 120/1. 5/4/2015 16:18:43 PM ICT Vial: 22 Inj. #: 1 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.133 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 750111 100.00 56258 Flunarizin dd 120/2. 5/4/2015 16:34:46 PM ICT Vial: 23 Inj. #: 1 Processed Channel: Retention Time (min) Peak Name 1 Flunirazin 3.126 Sample Name: Data Acquired: Area % Area Height 751437 100.00 56357 Flunarizin dd 120/3. 5/4/2015 16:58:12 PM ICT Vial: 24 Inj. #: 2 Processed Channel: Peak Name 1 Flunirazin Retention Time (min) 3.138 Area % Area Height 752007 100.00 56400 Report Method: Sample Summary Table Printed 17:14: 28 PM As 5/4/2015 Page: 4 of 4 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lâp -Tự do – Hạnh phúc BÁO CÁO SỬA CHỮA LUẬN VĂN DSCK CẤP I KHÓA 16 Kính gửi: - Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp DSCK cấp I; - Phòng Sau đại học Trường đại học Dược Hà Nội; - Giáo viên hướng dẫn. Họ và tên học viên: Đỗ Ngọc Hạnh Tên đề tài: Nghiên cứu nâng cao tiêu chuẩn chất lượng thuốc viên nang Flunarizin sản xuất tại Việt Nam. Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc. Mã số: Đã bảo vệ luận văn tốt nghiệp DSCK cấp I vào hồi: 8 giờ 30 phút ngày 13 tháng 9 năm 2015 tại thành phố Thanh Hóa. Quyết định số: 611/QĐ-DHN ngày 07 tháng 8năm 2015 của Hiệu trưởng Trường Đại học Dược Hà Nội. NỘI DUNG SỬA CHỮA, HOÀN CHỈNH 1. Những nội dung đã được sửa chữa theo yêu cầu của Hội đồng:  Tên luận văn chưa phù hợp với nội dung: + Xin đổi tên mới cho đề tài như sau: “Nghiên cứu phân tích hoạt chất Flunarizin trong thuốc viên nang bằng kỹ thuật HPLC”.  Lỗi trú giải chữ viết tăt PVP K: + Xin chú giải lại cho đúng như sau: Polyvinyl Pyrovidon Kali.  Tổng quan về các phương pháp định lượng dược chất chưa phong phú. + Đã bổ sung thêm phương pháp định lượng hoạt chất Flunarizin: băng kỹ thuật chuẩn độ môi trường khan.  Thẩm định phương pháp phân tích: chỉ tiêu độ ổn định có cần thiết không? + Thực tế trong luận văn không đề cập đến độ ổn định.  Nên có quy trình thiết lập chất chuẩn làm việc: Quy trình thiết lập chất chuẩn làm việc Flunarizine được ban hành bởi phòng kiểm tra chất lượng Công ty CP. Dược - VTYT Thanh Hóa.  Cách viết tài liệu tham khảo chưa đúng, một số tài liệu tham khảo đã quá cũ. + Đã trình bày lại các tài liệu tham khảo theo đúng quy định về cách trình bày các tài liệu tham khảo trong luận văn và nghiên cứu khoa học. + Bỏ bớt tài liệu đã quá cũ.  Sửa từ “Độ thô” thành “Độ vững”. + Trong các tài liệu về kiểm nghiệm từ trước tới nay vẫn sử dụng từ chuyên môn dịch từ tiếng Anh sang đó là “Độ thô = Robustness”. Trong hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích mới dịch từ tài liệu của Asean dịch là “Độ vững”. Xin đổi lại thành “Độ vững” cho phù hợp với quy định mới.  Bàn luận: cần so sánh với các kết quả đã công bố. Bỏ phần bàn luận về tác dụng dược lý. + Đã bỏ phần bàn luận về tác dụng dược lý; + Thêm phần bàn luận về so sánh các kết quả định lượng bằng phương pháp mới HPLC với phương pháp đã xây dựng trong TCCS. 2. Những nội dung xin bảo lưu (nếu có) Không Xác nhận của cán bộ hướng dẫn PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2015 Học viên Đỗ Ngọc Hạnh XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN Ủy viên thư ký Hội đồng Chủ tịch Hội đồng TS. Nguyễn Trần Linh PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện [...]... nang bằng phương pháp HPLC với mục tiêu: 1 Xây dựng và hoàn chỉnh phương pháp định tính, định lượng hoạt chất cho thuốc viên nang Flunarizin và nghiên cứu thẩm định phương pháp bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng kiểm tra một số chế phẩm thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất tại Việt Nam, đánh giá so sánh kết quả với phương pháp đã đăng ký trong bản... phân tích hiện đại Phương pháp đã được các phòng kiểm tra chất lượng của các công ty sản xuất dược phẩm, các phòng thí nghiệm của Trung tâm kiểm nghiệm triển khai, áp dụng để kiểm tra chất lượng nguyên liệu, thành phẩm sản xuất thuốc và coi đây là phương pháp quy chiếu Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu phân tích hoạt chất Flunarizin trong thuốc viên nang bằng. .. lượng thành phần hoạt chất Flunarizin trong viên nang cứng Flunarizin bằng kỹ thuật HPLC Mẫu Placebo: Qua tham khảo các công thức thuốc viên nang Flunarizin 5,0 mg sản xuất trong nước chúng tôi nhận thấy các công thức tá dược trong thành phần của viên thuốc có các thành phần như trình bày ở bảng 2.2 Bảng 2.2 Thành phần tá dược trong các chế phẩm thuốc viên nang Flunarizin sản xuất trong nước STT Thành... pha nồng độ 0,01mg/ml trong dung môi pha mẫu So sánh kết quả bằng xử lý thống kê + Tiến hành phân tích đánh giá chất lượng một số mẫu thuốc sản xuất tại Việt Nam, đánh giá kết quả 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU - Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lý bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC - Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán... chuyên luận quy định về chất lượng và phương pháp thử nghiệm cho thuốc viên nang Flunarizin với chỉ tiêu định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhưng các điều kiện sắc ký chưa được chỉ rõ ràng dẫn đến sự lúng túng khi tiến hành phân tích chất lượng mẫu thuốc (thiếu điều kiện về cột sử dụng và tốc độ pha động) [14] Trong tiêu chuẩn chất lượng của một chế phẩm thuốc chỉ tiêu định tính... dịch mẫu chuẩn và dung dịch mẫu thử: được chuẩn bị như quy định của phương pháp 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất Flunarizin trong chế phẩm thuốc viên nang bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Từ kết quả nghiên cứu tham khảo các tài liệu tiến hành nghiên cứu khảo sát tối ưu hóa các điều kiện sắc ký bao gồm: 21 Cột sắc ký:... đúng được đánh giá dựa 23 trên tỷ lệ thu hồi hoạt chất định lượng được so với nồng độ thực của mẫu [3] 2.3.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng kiểm nghiệm một số mẫu thuốc viên nang Flunarizin lưu hành trên thị trường + Tiến hành phân tích độc lập song song trên mẫu viên nang Sibethepharm 5,0mg 6 lần bằng phương pháp đã xây dựng và phương pháp đã được đăng ký trong TCCS Cụ thể các điều kiện đo quang như... liệu Flunarizin dạng muối HCl trong đó phương pháp định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhưng các điều kiện sắc ký không được quy định cụ thể gây khó khăn cho người phân tích [14] Các cơ sở sản xuất thuốc viên nang Flunarizin xây dựng và công bố tiêu chuẩn cơ sở của mình, trong TCCS quy định phương pháp định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), dựa vào phổ... cao (High performance Liquid Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau Lựa chọn thành phần pha động để chất phân tích ra khỏi cột được rửa giải với thời gian... đối với phép thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chuẩn ta có thể tính tỷ lệ tạp chất dựa vào % diện tích pic tạp so với diện tích pic hoạt chất 1.4 Nội dung thẩm định phương pháp bằng HPLC 1.4.1 Tính phù hợp của hệ thống sắc ký Tính phù hợp của hệ thống khẳng định các thông số kỹ thuật, các điều kiện sắc ký đã chọn ổn định trong điều kiện phân tích 1.4.2 Độ đặc hiệu/chọn ... dựng phân tích số mẫu nghiên cứu 37 37 39 Chương BÀN LUẬN 42 4.1 VỀ XÂY DỰNGPHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 41 4.2 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43 4.3 VỀ SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC. .. tra chất lượng nguyên liệu, thành phẩm sản xuất thuốc coi phương pháp quy chiếu Xuất phát từ thực tế tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu phân tích hoạt chất Flunarizin thuốc viên nang phương. ..BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ NGỌC HẠNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH HOẠT CHẤT FLUNARIZINE TRONG THUỐC VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC LUẬN VĂN DƯỢC SỸ CHUYÊN KHOA CẤP I CHUYÊN NGÀNH: CNDP