Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 1 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Trong cơ thể con người, có nhiều quá trình hình thành hoặc huỷ hoại tế bào thường xuyên diễn ra. Có những chất tưởng như là nguồn cung cấp dưỡng chất chính của tế bào nhưng đồng thời cũng có thể làm hại tế bào, có những chất gây ra những tác hại thì cũng có những chất đề kháng lại hoạt động này. Trong đó, gốc tự do, oxy và chất chống oxy hóa là một thí dụ. Những phân tử này có liên hệ với nhau và ảnh hưởng tới hoạt động sống của cơ thể con người rất nhiều, nhất là ở giai đoạn cuối của cuộc đời. Ngoài ra, một trong nhiều lý thuyết cố gắng giải thích nguyên nhân sự lão hóa là tác dụng của những gốc tự do vào các phân tử trong cơ thể. Và để trì hoãn tiến trình này, các chất chống oxy hóa đã được nghiên cứu và rất nhiều người cao tuổi hiện nay đang dùng. Trong quá trình hoá học, một điện tử bị tách rời thì lập tức phân tử đó trở thành một gốc tự do. Do đó, gốc tự do này không cân bằng, không ổn định về điện tử nên dễ tạo ra phản ứng và luôn luôn tìm kiếm điện tử từ các phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn cho sinh hoạt bình thường của tế bào. Trong cuộc đời của một người sống tới 70 tuổi, thì có chừng 17 tấn gốc tự do được tạo ra như vậy. Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là nhà khoa học đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào.Trước đó, người ta cho là gốc này chỉ có ở ngoài cơ thể. Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của hàng chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi trung niên, cơ thể khoẻ mạnh, có thể đề kháng tác hại của chúng, nhưng khi lớn tuổi, gốc tự do hoạt động mạnh mẽ hơn vì sức đề kháng của cơ thể giảm sút, nên gây ảnh hưởng gấp mười lần so với tuổi trung niên. Gốc tự do phá rách màng tế bào khiến cho chất dinh dưỡng bị mất, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết. Gốc tự do còn tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da tạo ra những vết đồi mồi trên cơ thể, và tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 2 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào. Ngoài ra, còn gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA, và làm chất collagen, elastin mất đàn tính khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc. Nhờ quan sát thực nghiệm, gốc tự do có ít ở các sinh vật còn nhỏ và có nhiều hơn ở sinh vật sống lâu. Một người có nhiều gốc tự hơn khi cao tuổi và ít hơn khi người đó còn trẻ. Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh vữa xơ động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan…. Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách, có thể là sản phẩm của những căng thẳng thần kinh, thể xác bệnh hay mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất mầu tổng hợp, nước có nhiều clo và ngay cả oxy. Trong lĩnh vực y khoa hiện nay, vấn đề được đề cập nhiều nhất hiện nay là tác hại của chất oxy hoá, phản ứng oxy hoá và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng các chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khoẻ cho con người. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và tổng hợp ra một loại chất chống oxy hoá có thông số chống oxy hoá xác định và được sử dụng cho con người gồm nhiều giai đoạn rất phức tạp và khó khăn, đòi hỏi chúng ta phải tốn nhiều công sức và kinh phí. Nhưng với sự hỗ trợ của máy tính, cụ thể là hoá tin học, công việc đã thực sự đỡ nặng nề hơn, rút ngắn thời gian và ít tốn kém hơn. Chính điều này đang mở ra một hướng đi mới cho việc tìm ra chất chống oxy hoá nói riêng và trong lĩnh vực nghiên cứu và tổng hợp thuốc, chất hữu cơ nói chung. Với phương pháp này, trong tương lai có thể thấy rõ được hình dạng cấu trúc của chất chống oxy hoá nhằm phục vụ cho quá trình nghiên cứu sau này. Trên thế giới đã có nhiều chất chống oxy hoá được tìm ra và xác định được chỉ số chống oxy hoá, tuy nhiên ở đề tài này, hướng nghiên cứu chính là hợp chất flavonoid. Vì hợp chất này có sự hiện diện rộng rãi trong nhiều loại thực vật xung SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 3 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ quanh đời sống của ta, tiêu biểu là họ cam. đồng thời trên thế giới đã có 4000 loại flavonoid được xác định cấu trúc hoá học. Đây là cơ sở để tạo dữ liệu cho việc thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học các dẫn chất flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa” Nhiêm vụ chính là: - Tập hợp các cấu trúc hóa học của dẫn chất flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa từ các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước - Nghiên cứu xây dựng mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học các dẫn chất flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa bằng các phần mềm hóa tin học thích hợp SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 4 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 5 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 2. TỔNG QUAN 2.1. Tổng quan về chất chống oxy hoá 2.1.1.Khái niệm Các chất chống oxy hóa là những chất khử mạnh và có hoạt tính với oxy cao hơn dược chất mà nó bảo vệ. Các chất chống oxy hóa là những chất mà khi hiện diện ở nồng độ thấp hơn so với dược chất mà nó bảo vệ có khả năng làm trì hoãn hay làm giảm quá trình oxy hóa của dược chất đó. Trong cơ thể có nhiều hệ thống chống oxy hóa nội sinh có khả năng bảo vệ những chất hóa học từ những phản ứng oxy hóa có hại bằng cách phản ứng với các gốc tự do hay những dạng oxy hoạt động khác, vì vậy ngăn cản tiến trình oxy hóa. Tuy nhiên sự cung cấp các chất chống oxy hóa nội sinh này có giới hạn vì thế cần có nguồn bổ sung chất chống oxy hóa từ bên ngoài vào. 2.1.2. Cơ chế tác động của các chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa đóng vai trò là chất cho hydro đến các gốc tự do để tạo thành các gốc tự do mới bền vững hơn. Cơ chế phản ứng được thu gọn như sau: K1 Chất khởi đầu K2 R ° + O2 K4 RO°2 + RO°2 K5 RO°2 + R° R° + R° RO°2 K3 RO°2 + RH R° K6 ROOH + R° sản phẩm bền sản phẩm bền sản phẩm bền Dạng ROOH là dạng bền vững và các sản phẩm ngắt mạch là ổn định. Ngoài cơ chế như trên các chất chống oxy hóa còncó thể tạo phức chelat với ion kim loại (như Fe3+, Cu2+, Ni2+, Mn2+), các ion này thường khơi mào cho phản ứng oxy hóa. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 6 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 2.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa Trong các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa, các phương pháp đánh bắt gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và mô hình beta-caroten acid linoleic dùng để đánh giá rất phù hợp để khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid, do các flavonoid khảo sát không hấp thu trong vùng hấp thu của DPPH và beta-caroten. Hơn nữa sử dụng 2 phương pháp này rất thuận lợi để nghiên cứu đánh giá mang tính sàng lọc và hàng loạt trên đối tượng mẫu khá lớn. Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH và mô hình beta-caroten - acid linoleic cũng được rất nhiều tác giả áp dụng để nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid. 2.1.3.1. Phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH Dựa vào khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH của chất có tác dụng chống oxy hóa. Nguyên tắc: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm. Mô tả: Dùng 1 ml dung dịch flavonoid (nồng độ 10-4M pha trong methanol) cho vào 2 ml dung dịch DPPH ( nồng độ 10 mg/L pha trong methanol). Hỗn hợp được lắc đều và để ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thu sau 5 phút và 30 phút ở bước sóng 517 nm, mỗi lần đo 3 lần lấy giá trị trung bình. Mẫu đối chiếu được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng flavonoid. Khả năng đánh bắt gốc tự do được tính theo công thức sau: Khả năng đánh bắt gốc tự do (S%) được tính như sau: 𝐴𝑡𝑠 𝑆(%) = 100 × (1 − 𝑡 ) 𝐴𝑐 Ast : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm t = 5 phút, 30 phút. Act : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm t = 5 phút, 30 phút. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 7 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 2.1.3.2. Phương pháp mô hình beta-caroten - acid linoleic Nguyên tắc: Dựa vào khả năng làm thay đổi màu của hệ nhũ tương beta-caroten và acid linoleic của các chất thử nghiệm. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa càng cao thì khả năng bảo vệ màu beta-caroten càng lớn. Đo độ hấp thu ở bước sóng 470 nm. Mô tả: Dùng 1 ml beta-caroten (0,2 mg/ml) hòa tan trong cloroform cho vào erlen có chứa 0,02 ml acid linoleic và 0,2 ml tween 20. Bay hơi hết cloroform dưới áp suất giảm. Cho vào hỗn hợp 0,2 ml dung dịch flavonoid thử trong methanol ở nồng độ 10-3M. Cho vào tiếp 50 ml nước cất (đã bão hòa với oxygen trong vòng 15 phút). Hỗn hợp được lắc đều và để ở 50 oC trong vòng 120 phút. Đo độ hấp thu UV của mẫu thử ở bước sóng 470 nm tại thời điểm 0 phút, 60 phút và 120 phút. Mẫu đối chiếu được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng flavonoid. Hoạt tính chống oxy hóa được tính theo công thức sau: Hoạt tính chống oxy hóa (T%) được tính như sau: 𝑇(%) = 100 × (1 − 𝐴0𝑠 −𝐴𝑡𝑠 𝐴0𝑐 −𝐴𝑡𝑐 ) Type equation here. As0 : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm 0 phút. Ast : Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm t = 60 phút, 120 phút Ac0 : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm 0 phút Act : Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở thời điểm t = 60 phút, 120 phút 2.2 .Tồng quan về flavonoid và hoạt tính chống oxy hoá 2.2.1.Flavonoid 2.2.1.1.Định nghĩa: Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng và được chia làm nhiều nhóm khác nhau. Hầu hết flavonoid có cấu trúc polyphenolic. 2.2.1.2.Nguồn gốc của flavonoid Cũng như vitamin C, các flavonoid được khám phá bởi một trong những nhà sinh hoá nổi tiếng nhất thế kỉ 20: Albert Szent – Gyorgyi (1893 – 1986). Ông nhận SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 8 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ giải Nobel năm 1937 với những khám phá quan trọng về đặc tính của vitamin C và flavonoid. 2.2.1.3.Cấu trúc và phân loại Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Cho đến nay có khoảng 4000 chất đã được phân lập và xác định cấu trúc. Chỉ riêng hai nhóm hợp chất flavon và flavonol mang nhóm thế là -OH và/hoặc -OCH3 thì theo lý thuyết số chất tổng hợp được có thể lên tới 38.627 chất. Các flavonoid là những chất có cấu tạo khung theo kiểu diphenyl propan [C6C3-C6] hay nói cách khác chúng có cấu tạo khung cơ bản gồm hai vòng benzen A và B nối với nhau qua mạch 3 carbon (Hình 1). Trong đa số các trường hợp mạch 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng C có oxy (Hình 2). B A Hình 1 . Khung cơ bản diphenyl propan (C6-C3-C6) Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3C [3] gồm các nhóm chính như sau:  Eu-flavonoid là những chất có gốc aryl ở vị trí 2, gồm có: flavon, flavonol, flavanon, antocyanidin, chalcon…  Isoflavonoid là những hợp chất có gốc aryl ở vị trí 3, gồm có: isoflavon, isoflavonol, isoflavanon.  Neoflavonoid là những hợp chất có gốc aryl ở vị trí 4, gồm có: 4-arylchroman, 4-arylcoumarin, daldergion. Ngoài ra, người ta còn phân biệt biflavonoid, triflavonoid cấu tạo tương ứng bởi 2, 3 monomer flavonoid, và flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan. Flavonoid có thể tồn tại ở dạng aglycon (chỉ gồm khung cơ bản), hoặc dạng glycosid (gồm khung cơ bản gắn với chất đường ở các vị trí khác nhau). SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 9 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ O O O O O OH O Flavanon Flavonol Flavon O O OH O O Isoflavonol Isoflavon O O Isoflavanon OH O OH O Chalcon Antocyanidin O Dihydrochalcon Hình 2 . Cấu trúc khung cơ bản của các flavonoid 2.2.1.5.Ứng dụng của flavonoid Hiện tại trên thị trường đã có rất nhiều sản phẩm từ flavonoid như các thuốc Daflon, Ginkor Fort, Legalon, các loại thuốc này là các phân đoạn chiết flavonoid từ dược liệu đã cho kết quả tốt trong điều trị các bệnh lý về mạch máu, thần kinh, chống oxy hoá, bảo vệ tế bào gan… Các thực phẩm chức năng như Orthomo flavon – F hay FFLAVIN – 7, Lipo – flavonoid plus, Flavonoid 1000mg (Davinci Laboratories) được dùng hỗ trợ cho các bệnh nhân xơ vữa động mạch, tiểu đường. Ngoài ra còn có các sản phẩm dùng chăm sóc da, tóc chứa flavonoid được chiết từ dược liệu… Điều đó cho thấy flavonoid là một hợp chất có tiềm năng, cần nghiên cứu sâu hơn, nhất là các flavonoid tổng hợp nhằm sàng lọc những hợp chất thuốc tinh khiết, hoạt tính mạnh, hiệu quả và am toàn để có những bước phát triển lâm sàng. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 10 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 2.2.2.Hoạt tính sinh học của flavonoid Đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học các dẫn chất flavonoid và chalcon cho thấy các dẫn chất này có tác dụng sinh học đáng kể trên cả in vitro và in vivo. Các tác dụng sinh học đã được chứng minh bằng thực nghiệm bao gồm tác dụng kháng khuẩn kháng nấm, tác dụng kháng viêm, tác dụng bảo vệ tim mạch, kháng ung thư… Nhiều nghiên cứu gần đây đã cho thấy các bệnh như ung thư, xơ vữa động mạch, viêm mạn tính có liên quan đến sự stress oxy hóa (oxydative stress) do các tác nhân oxy hóa có hoạt tính (reactive oxygen species) trong cơ thể. Các polyphenol mà đặc biệt là flavonoid đã được chứng minh là những chất có khả năng chống oxy hóa mạnh do có khả năng trung hòa các gốc tự do bằng cách đóng vai trò là chất cho electron hay nguyên tử hydro (hình 3). Hệ thống liên hợp trong phân tử flavonoid và một vài nhóm hydroxyl như nhóm –OH ở vị trí 3 trên dị vòng C và vị trí 3’,4’ trên vòng B có vai trò quan trọng trong việc tạo thành các gốc tự do bền sau khi đã cho electron hay nguyên tử hydro cho các gốc tự do không bền trong cơ thể. Hình 3. Sự chuyển hóa của các gốc tự do flavonoid sau khi cho một nguyên tử hydro SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 11 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Ngoài khả năng thu dọn hay trung hòa các gốc tự do, khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn được biết đến nhờ tính chất có thể tạo phức chelat với ion kim loại như ion Fe2+ ức chế phản ứng Fenton, làm giảm tốc độ phản ứng oxy hóa của các gốc tự do trong cơ thể. Cụ thể đã có nhiều bằng chứng về khả năng chống oxy hóa (khả năng thu dọn các gốc tự do) của các nhóm phụ flavonoid khác nhau như flavon (luteolin, chrysin, apigenin…), flavonol (quercetin, rutin, isoquercitrin…), flavanon (taxifolin, hesperetin,…), flavan-3-ol (catechin, epicatechin,…), anthocyanidin( cyanidin chlorid, malvin,…), chalcon (xanthohumol và các dẫn chất của xanthohumol), isoflavon (daidzein, genistein,…)… Các công trình chủ yếu nghiên cứu về các nhóm hợp chất quen thuộc như flavon, flavonol, flavanol vì có nhiều trong rau quả con người ăn hàng ngày, còn ít nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa trên nhóm chalcon. 2.3 Tổng quan về QSAR 2.3.1.Giới thiệu chung Khả năng tạo ra những chất hữu cơ mới là khổng lồ, dù là trong ngành dược hay những ứng dụng cho nông nghiệp, hương liệu, nước hoa và thực phẩm. Vào năm 1994, chemical abstracts liệt kê hơn 13 triệu chất nhưng chỉ một phần rất nhỏ chúng có thể được tổng hợp. Nếu việc tìm kiếm những sản phẩm mới chỉ bằng cách tổng hợp và thử những hợp chất mới mà không có một hướng dẫn nào thì đó thực sự là một công việc lâu dài và tốn kém. Việc những tính chất hóa học khác nhau có tác dụng sinh học khác nhau đã được biết hàng triệu năm trước. Khả năng xác định cấu trúc đã sớm cho phép người ta thành lập những mối lien hệ cấu trúc – tác dụng (SAR – Structure activity Relationship), là những quan sát đơn giản mà một thay đổi xác định trong cấu trúc hóa học có ảnh hưởng xác định lên hoạt tính sinh học. Khi mà cấu trúc hóa học (hay rộng hơn là tính chất hóa lý hoặc các trường) được mô tả bằng những thông số mô tả định lượng được thì ta có thể xây dựng mối tương quan cấu trúc – tác động sinh học một cách định lượng (QSAR – Quantitative Structure activity Relationship). Sự SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 12 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ định lượng ở đây không liên quan đến việc tác dụng sinh học có định lượng được hay không, mặc dù đó là một nhầm lẫn thường gặp. Mục tiêu của nghiên cứu QSAR là tìm ra mô hình có khả năng dự đoán đáng tin cậy cho dẫn chất, nhờ đó định hướng thiết kế và tổng hợp những chất phù hợp với mục đích nghiên cứu trong vô vàn hợp chất hữu cơ đề cập ở trên. QSAR cổ điển chỉ quan tâm 2D – QSAR (2 Dimensions – QSAR) là những tính toán chỉ dựa trên những thông số công thức hoá học hai chiều. Một cách tổng quát, còn có: -3D – QSAR (3 Dimensions – QSAR): tính toán dựa trên các thông số mô tả công thức hoá học trong không gian 3 chiều. -HQSAR (Hologram – QSAR): phân tích hình ảnh phân tử, thông số mô tả là các phân nhánh cấu trúc. Một cách phân chia khác QSAR bao gồm: -Hồi quy (Regression): kết quả thu được là tác dụng sinh học định lượng (như IC50), bao gồm hồi quy tuyến tính, hồi quy phi tuyến. -Phân loại (Classification) hay BQSAR (Binary – QSAR): cho kết luận có hay không (chẳng hạn có hoạt tính kháng sốt rét hay không). 2.3.2.Phương pháp xây dựng mô hình dự đoán – Bình phương tối thiểu từng phần (PLS – Partial Least Squares) Nghiên cứu 2D – QSAR hồi quy tuyến tính đầu tiên áp dụng phương pháp hồi quy đa tuyến (MLR – MultiLinear Regression). Phương pháp này có nhược điểm là không loại bỏ được các mối liên hệ có sự tương quan lớn giữa các thông số nên ít được dùng hoặc khắc phục bằng cách kết hợp với kĩ thuật phân tích thành phần cơ bản (PCA – Principal Component Analysis), có tên gọi là hồi quy dựa trên thành phần cơ bản (PCR - Principal Component Regression). Với cách thứ hai ta sẽ tiến hành tính các thành phần cơ bản trước (PC - Principal Component) rồi mới xây dựng phương trình hồi quy bằng MLR. Một kĩ thuật khác là PLS cũng dung những lượng, giống như PC, tạo ra từ các biến độc lập, gọi là các biến ẩn (LV – Latent SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 13 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Variable). Các PC hay LV đều là sự kết hợp tuyến tính của tập hợp các biến độc lập. PC1 = a11v1 + a12v2 + …a1 NvN PC2 = a21v1 + a22v2 + …a2 NvN PCq = aq1v1 + aq2v2 + …aq NvN LV1 = b11v1 + b12v2 + …b1 NvN LV2 = b11v1 + b12v2 + …b1 NvN LVq = bq1v1 + bq2v2 + …bq NvN Nhưng khác biệt là PLS tính LV và các hệ số tương quan cùng một lúc. Đây là quy trình lặp nhằm kết hợp bước PCA trong PCR với bước hồi quy. LV cũng như PC được tính để giải thích phương sai trong tập các giá trị x trong khi vẫn giữ sự trực giao với một LV khác. Vì vậy, LV đầu tiên sẽ giải thích phần lớn phương sai trong tập độc lập, LV thứ hai giải thích phần lớn thứ hai và cứ tiếp như vậy. Điểm khác nhau quan trọng giữa PLS và PCR là LV được tạo thành để mà tối đa hoá sự tương quan với biến phụ thuộc. Không như phương trình PCr nơi mà các PC không tham gia vào bất kì một thứ tự riêng nào thì LC sẽ tham gia vào phương trình PLS theo thứ tự một, hai, ba… Một điểm mạnh cần đề cập của PLS là có thể tiến hành trên lượng lớn thông số mô tả. Cụ thể, việc xây dựng tiến hành theo thuật toán sau: Giả sử, ta có m phân tử, mỗi phân tử được mô tả bởi một vector n hướng (hay n phần tử, n vector) gồm các số thực xi=(xi1…xin), gồm các thông số mô tả cho phân tử I (ví dụ, hoạt tính sinh học, logP hay tính khúc xạ). Giả sử mỗi phân tử có một trọng số (con số thể hiện mức độ quan trọng) kèm theo, Wi là một số không âm. Những trọng số này được coi như là xác suất tương đối bắt gặp phân tử kèm theo và thường là tất cà đều bằng 1. Tuy nhiên, trong vài ứng dụng, những trọng số không cân bằng thường đợc dung. Đặt W là tổng các trọng số. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 14 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Một mô hình tuyến tính y có dạng a0+aTx với a0 là một con số (scalar – vô hướng) và a là một vector n hướng. Những thông số này được lựa chọn sao cho sai số bình phương trung bình (MSE – mean square error) là nhỏ nhất 𝑚 1 𝑀𝑆𝐸 (𝑎0 , 𝑎) = ∑ 𝑤𝑖 [𝑦𝑖 − (𝑎0 + 𝑎𝑇 𝑥𝑖 )]2 𝑊 𝑖=1 Bằng cách lấy vi phân MSE theo những thông số này, ta thấy chúng phải thoả mãn những phương trình sau, được gọi là những phương trình bình thường (normal equations). 𝑚 1 𝑎0 = 𝑦0 − 𝑎𝑇 𝑥0 , 𝑆𝑎 = 𝑏 = ∑ 𝑤𝑖 𝑦𝑖 (𝑥𝑖 − 𝑥0 ) 𝑊 𝑖=1 𝑚 1 𝑦0 = ∑ 𝑤𝑖 𝑦𝑖 , 𝑊 𝑖=1 𝑚 1 𝑥0 = ∑ 𝑤𝑖 𝑥𝑖 , 𝑊 𝑖=1 𝑚 1 𝑆 = ∑ 𝑤𝑖 (𝑥𝑖 − 𝑥0 )(𝑥𝑖 − 𝑥0 )𝑇 𝑊 𝑖=1 Phải cẩn thận khi giải các phương trình trên vì S thường suy biến (singular) hoặc gần suy biến. Những phương trình bình thường được giải bằng chéo hoá ma trận. Vì sao S đối xứng và dương, tất cả những giá trị riêng của nó là một số thực và không âm. Vì vậy chúng ta có thể tính một ma trận trực giao Q và một ma trận chéo D sao cho 𝑆 = 𝑄𝑇 𝐷𝑄 và các thành phần của ma trận D được xếp theo thứ tự giảm dần. Ta lấy p giá trị riêng đầu tiên sao cho tất cả đều dương và điều kiện (giná trị lớn nhất của p giá trị riêng được chia cho giá trị nhỏ nhất của p giá trị riêng) nhỏ hơn ngưỡng nào đó được cài đặt trước. Ma trận chéo đảo ngược giả D* sau đó được tạo thành với sự nghịch đảo p giá trị riêng đã chọn nằm trên đường chéo và bất cứ chỗ nào bằng 0. Cuối cùng, ta xác định vector thông số a với 𝑎 = 𝑄𝑇 𝐷 ∗ 𝑄𝑏. Phương pháp này gọi là hồi quy thành phần cơ bản (PCR). Một biến đổi của PCR là bình phương tối thiểu từng phần (PLS) được dung để xác định các thông số mô hình tuyến tính. Phương pháp này sẽ tạo những ước lượng hơi khác mà có lẽ thô hơn. Cũng lập những phương trình bình thường như trên, ta lại tìm một ước lượng cùa a khi S có thể ở trong tình trạng xấu. Một cách để đạt được là xây dựng một ma trận trọng số VA = (v1,v2,…,vA), với vi là vector cột có SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 15 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ n hướng, và A, mức độ phù hợp của PLS, số nguyên nhỏ hơn hay bằng n. Trước tiên ta có các cột của ma trận VA khi tính chéo hoá Gram-Schmidt các vector được tạo bằng chuỗi Krylov {b, Sb,S2b,…, SA-1b}. Sau đó, để có vector hệ số tương quan PLS Ath, ta giải phương trình a =VA(VTASVA)-1 VTA. Một thuật toán xác định được sự phù hợp của PLS đạt được tại bước Ath khi ‖𝑉𝐴+1 ‖ = 0. Tuy nhiên, có thể ta muốn dung vector hồi quy PLS bậc thấp hơn để phù hợp với mô hình tuyến tính. Chú ý rằng nếu thuật toán tiếp tục cho tới khi A=n, ma trận trọng số sẽ vuông và được xếp đầy (full rank). Vector hồi quy kết quả là lời giải của những bình phương tối thiểu thông thường tương đương với việc giải a=S1b. Hình 4: Mô phỏng mô hình gồm 2 thông số, tìm phương trình tuyến tính của x mà tối thiểu hoá phần dư y SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 16 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 2.3.3.Phương pháp lựa chọn thông số mô tả trong xây dựng mô hình QSAR Có hai lý do mà ta không dùng tất cả thông số mô tả tính toán được để xây dựng mô hình dự đoán. Đó là: Độ đúng của dự đoán. Hệ số tương quan phụ thuộc vào cả độ lệch và phương sai. Càng nhiều thông số mô tả thì độ lệch càng nhỏ nhưng độ phương sai càng lớn. Vì vậy để cải thiện độ đúng của dự đoán bằng cách giảm phương sai của những giá trị dự đoán, nên người ta giảm thông số mô tả. Việc diễn giải ý nghĩa của mô hình. Với lượng lớn biến độc lập, ta thường muốn tìm tập nhỏ hơn nhưng ảnh hưởng mạnh nhất. Để lựa chọ thông số mô tả xây dựng mô hình tốt nhất (có khả năng dự đoán tốt nhất) ta nhờ vào công cụ phân tích ngẫu nhiên (QSAR – Contingency) trong phần mềm MOE 2008.10 và phương pháp lựa chọn phản hồi (wrapper) với chiến thuật tìm kiếm lấy thêm (Forward Selection) trong phần mềm WEKA 3.7.0. Phân tích ngẫu nhiên Đây là một ứng dụng thống kê được thiết kế hỗ trợ lựa chọn thông số mô tả cho QSAR. Về cơ bản nó phân tích tính ngẫu nhiên đồng biến của mỗi thông số mô tả với giá trị hoạt tính. Nó cho ra một bảng hệ số mà ta có thể dựa vào đó để chọn những thông số quan trọng. Đặt X là thông số mô tả phân tử ngẫu nhiên và Y là giá trị hoạt tính ngẫu nhiên. Ta muốn tính được mức độ các biến ngẫu nhiên Y và X liên quan với nhau (hay phụ thuộc nhau), gọi là mẫu ngẫu nhiên gồm m cặp (yi,xi). Phân tích tương quan. Tính đồng biến của hai biến X và Y ngẫu nhiên được xác định bởi Cov(X,Y) = E(XY) - E(X) E(Y). Hệ số tương quan tuyến tính thể hiện tính đồng biến và mức độ hai biến tương quan tuyến tính, được xác định: 𝑅2 = [𝐸 (𝑋𝑌) − 𝐸 (𝑋 )𝐸(𝑌)]2 𝑉𝑎𝑟(𝑋 )𝑉𝑎𝑟 (𝑌) Luôn nằm trong khoảng [0,1], bằng 1 nghĩa là sự tương quan tuyến tính hoàn toàn và bằng 0 là hoàn toàn không có tương quan. Nếu khác 0 thì X và Y phụ SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 17 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ thuộc. Phân tích ngẫu nhiên. Là nỗ lực để xác định mức độ hai biến ngẫu nhiên phụ thuộc. Phân tích này được biểu diễn bởi một bảng đếm mij là kết quả từ việc tính biểu đồ tần suất hai chiều trên cặp số của mẫu (yi,xi). Trong trường hợp các biến ngẫu nhiên rời rạc, i và j trải trên các giá trị dương của biến ngẫu nhiên rời rạc. Với các biến ngẫu nhiên liên tục, i và j trải trên tập hợp các hộp hoặc khoảng trong đó các mẫu được cho vào. Ta thấy rằng thống kê: 2 ∑𝑘 𝑚𝑖𝑘 ∑𝑘 𝑚𝑘𝑗 (𝑚𝑖𝑗 − 𝑛𝑖𝑗 ) 𝐵=∑ , 𝑛𝑖𝑗 = 𝑛𝑖𝑗 𝑚 𝑖𝑗 Có phân phối chi thích hợp. Hai hệ số kết hợp thường được dùng: hệ số ngẫu nhiên C và cramer‟s V được xác định như sau: 𝐶 = √𝐵/(𝐵 + 𝑚) 𝑉 = √𝐵/𝑚𝑚𝑎𝑥 (𝐼 − 1, 𝐽 − 1) Với I và J là số hộp i và j tương ứng. Cà hai đều nằm trong khoảng [0,1], với 1 nghĩa là phụ thuộc và 0 là không phụ thuộc. Tuy nhiên, trong thực tế, không có giá trị nào đạt được 1. Hệ số không chắc chắn. Ta có thể xác định một hệ số dựa trên entropy của những phân phối Pr(X,Y), Pr(Y|X) and Pr(X|Y). Hệ số không chắc chắn entropy, U, được định nghĩa: 𝑈=2 𝐻𝑋 −𝐻𝑌 −𝐻𝑋𝑌 𝐻𝑋 +𝐻𝑌 Với HXY, HX và HY theo thứ tự là entropy của các phân phối Pr(X,Y), Pr(X) và Pr(Y). Hệ số U luôn nằm trong khoảng [0,1], với 1 là phụ thuộc hoàn toàn và 0 là không phụ thuộc. Các thông số mô tả phù hợp với phương trình QSAR khi: C > 0,6; V > 0,2; U > 0.2; R2 > 0,2. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 18 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Phương pháp lựa chọn phản hồi với chiến thuật lấy thêm Việc dùng bốn hệ số như trên chỉ giúp ta giới hạn được phần nào số lượng thông số so với ban đầu. Nếu chỉ chọn những thông số có giá trị hệ số lớn thì chưa hẳn đã cho mô hình tương quan tốt. Do đó cần kết hợp phương pháp chọn lọc khác là phản hồi (wrapper) với chiến thuật tìm kiếm lấy thêm và cách đánh giá tổ hợp thông số bằng thuật toán hồi quy đa tuyến (MLR). Cụ thể, chiến thuật tìm kiếm bắt đầu với hệ số chặn k (intercept), là k thông số có ý nghĩa nhất, sau đó ở mỗi bước lần lượt thêm vào mô hình một thông số trong những thông số còn lại. Đánh giá từng tổ hợp thông số bằng kỹ thuật đánh giá chéo dùng thuật toán hồi quy tuyến tính. Thông số cho sự cải thiện nhiều nhất (mô hình nhỏ nhất có sai số dự đoán mong đợi tối thiểu) được giữ lại và tiến hành bước tiếp theo 2.3.4. Phương pháp đánh giá chéo k lần (k-fold cross validation) mô hình dự đoán Nếu tập dữ liệu đủ lớn thì sẽ được chia làm ba phần: tập huấn luyện, tập thử nghiệm và tập ngoại. Việc đánh giá mô hình được tiến hành trên tập thử nghiệm và tập ngoại. Nhưng thường thì số lượng chất không nhiều như mong muốn nên có một cách làm khác là chỉ chia dữ liệu ban đầu làm hai phần: tập xây dựng mô hình và tập ngoại. Thực chất, tập xây dựng mô hình là gộp chung tập huấn luyện và tập thử nghiệm ở trên. Và vừa dùng xây dựng mô hình vừa đánh giá khả năng dự đoán của mô hình. Cách đánh giá lúc này là đánh giá nội và một phương pháp thường sử dụng là đánh giá chéo k lần, với k là sô lần chia nhỏ tập xây dựng mô hình. Thông thường chọn k nhỏ nhất là 5 (số lần chia nhỏ nhất cho đánh giá đáng tin cậy) và lớn nhất chính là số chất trong tập xây dựng mô hình, khi đó gọi là đánh giá chéo LOO (leave one out). Tùy số lượng chất trong tập xây dựng mô hình và cân bằng giữa độ lệch – phương sai mà ta chọn k thích hợp. Cách tiến hành đánh giá chéo k lần như sau: - Tập xây dựng mô hình được chia làm k phần. - Lấy (k – 1) phần làm tập huấn luyện để xây dựng mô hình thứ cấp sử dụng thông SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 19 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ số mô tả đã chọn trước đó. - Đánh giá mô hình thứ cấp bằng phần còn lại được giá trị bình phương hệ số tương quan giữa giá trị dự đoán và giá trị thực nghiệm R2 và căn bậc hai của tổng bình phương độ lệch giá trị dự đoán – giá trị thực nghiệm RMSE. - Xáo trộn ngẫu nhiên k lần tập xây dựng mô hình và lặp lại từ đầu. Kết quả, giá trị đánh giá chéo là trung bình của R2 (nếu là LOO thì là gọi là Q2) và RMSE sau k lần lặp. 2.3.5. Quy trình thực hiện nghiên cứu QSAR SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 20 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Hình 5: Các bước phân tích trong 2D QSAR Chuẩn bị cơ sở dữ liệu Cấu trúc hoá học - Hoạt tính sinh học Tính toán thông số mô tả Thông số mô tả 2D (MOE, Dragon…) Tối thiểu hoá năng lượng (Sybyl) Phân chia tập hợp, xây dựng và đánh giá mô hình Tập xây dựng mô hình (training set)-Tập đánh giá ngoại(External set) Ngẫu nhiên (Random), phân phối đa dạng (Diverse) Lựa chọn thông số mô tả Tập hợp xây dựng mô hình (training set) Loại bỏ các thông số có tương quan chéo Loại các thông số có >15% giá trị 0 (excel) Chia tỉ lệ các thông số mô tả Tập hợp xây dựng mô hình (training set) Chia tỉ lệ trong khoảng 0-1(RapidMiner 5) Chọn lọc thông số mô tả Tập hợp xây dựng mô hình (training set) Phân tích ngẫu nhiên (QSAR-Contingency-MOE 2008.10 Phương pháp dựa trên sự tương quan (CFS – WEKA 3.7.0) Xây dựng mô hình QSAR Tập hợp xây dựng mô hình (training set) Bình phương tối thiểu từng phần (PLS – MOE 2008.10) Đánh giá chéo nội (LOO – MOE 2008.10):XR2,XRMSE Loại bỏ chất gây nhiễu (outlier) Tập hợp xây dựng mô hình (training set) Dựa vào Z – score (Plot – MOE 2008.10) Đánh giá khả năng dự đoán ngoại Tập hợp đánh giá ngoại (external set) R2,RMSE Ứng dụng mô hình trong dự đoán Giải thích mô hình Xây dựng thư viện các hợp chất Áp dụng mô hình dự đoán tìm ứng viên SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 21 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Chương 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 22 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu này xây dựng phương trình QSAR trên dữ liệu IC50 của 60 chất flavonoid bất kì được tổng hợp trong các bài báo khoa học trong nước và quốc tế. Phương trình được xây dựng trên chương trình hoá tin học là SYBYL, MOE 2008.10 cùng các chương trình hỗ trợ khác. Phương trình được xây dựng phải đạt yêu cầu: R2≥0.5 RMSE, XRMSE min XR2≥0.4 3.2. Nghiên cứu QSAR 3.2.1. Thu thập cơ sở dữ liệu Qua nhiều bài báo khoa học, sàng lọc được gần 150 hợp chất có hoạt tính thuộc nhiều nhóm cấu trúc khác nhau. Cấu trúc 2D của các chất được vẽ bằng phần mềm ChemBioDraw Ultra 11.0, 3D của các chất được vẽ bẳng phẩn mềm ChemBio3D Ultra 11.0 Hoạt tính chống oxy hoá của các hợp chất được đánh giá bằng các giá trị IC50 được xác định bằng phương pháp đo quang. Trong phương pháp đo quang có hai cách đo: - Sử dụng DPPH - Sử dụng ᵦ-caroten, acid linoleic Cấu trúc và giá trị hoạt tính kháng sốt của các chất được lưu trữ dạng *.docx. Kết quả tổng hợp lưu trữ trong dạng *.xlsx. Từ tập dữ liệu phức tạp trên các hợp chất được chọn lựa theo tiêu chí: (i) cùng cách đánh giá hoạt tính chống oxy hoá (IC50), (ii) cùng đơn vị đo hoạt tính (nM), (iii) cùng phương pháp xác định hoạt tính, (iv) có giá trị chất đối chiếu tương đương. Số lượng chất không quá ít (≥ 50). Dựa vào chất đối chiếu có thể quy đổi giá trị hoạt tính của các chất theo quy tắc tam suất nếu chênh lệch giữa các giá trị hoạt tính của chất đối chiếu trong các SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 23 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ bài báo khác nhau từ năm lần trở lên. Do các IC50 có giá trị chênh lệch nhau nhiều nên được đổi thành pIC50 = -log (IC50) để phù hợp cho việc xây dựng phương trình tuyến tính quan hệ cấu trúc – tác dụng. 3.2.2. Xây dựng thông số mô tả Cấu trúc 2 chiều (2D – 2 dimensions) và giá trị IC50 của các chất nghiên cứu được lưu trữ bằng tập tin *.mdb trong phần mềm MOE 2008.10 (Molecular Operating Environment phiên bản 2008.10) để tiến hành xây dựng các mô hình. Trước tiên, các cấu trúc 3D được tối thiểu hoá năng lượng và động lực học phân tử trong SYBYL. Sau đó, các cấu trúc 2D được tối thiểu hóa năng lượng nhờ công cụ energy minimize để loại bỏ một số sai sót do xây dựng cấu trúc thủ công. Các cấu trúc được kiểm tra lại để loại bỏ việc xuất hiện những liên kết không có thực sau khi tối thiểu hóa năng lượng. Điều này là do cấu trúc được xây dựng bằng phần mềm ChemBioDraw Ultra 11.0 2008, có thể không tương thích với MOE. Sau đó, 184 thông số mô tả cấu trúc phân tử 2D được tính toán nhờ công cụ descriptors trong MOE. Thông số mô tả thể hiện cấu trúc hóa học hay tính chất vật lý của một phân tử bằng các giá trị số, có ảnh hưởng tới tác dụng sinh học. Phần mềm MOE tính được 327 thông số mô tả phân tử gồm ba nhóm: - 2D: thông số mô tả 2D chỉ dùng các nguyên tử và thông tin liên kết của phân tử để tính toán. Cấu dạng riêng và tọa độ 3D không dùng. - i3D: thông số mô tả 3D nội dùng thông tin tọa độ 3D về mỗi phân tử, tuy nhiên, chúng không quay và không chuyển đổi cấu dạng. - x3D: thông số mô tả 3D ngoại cũng dùng thông tin tọa độ 3D nhưng cũng đòi hỏi một khung tham chiếu tuyệt đối. Tùy theo định hướng nghiên cứu mà chọn lựa tính toán thông số mô tả phù hợp. Nghiên cứu này tiến hành xây dựng mô hình thể hiện mối quan hệ định lượng cấu trúc – tác dụng trên cấu trúc 2 chiều của các hợp chất có tính kháng sốt rét nên chỉ quan tâm các thông số 2D, bao gồm 7 nhóm. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 24 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Bảng 1 :Các nhóm thông số mô tả phân tử 2D tính bằng MOE STT Nhóm thông số mô tả 2D 1 Tính chất vật lý 2 Diện tích bề mặt được phân chia nhỏ 3 Đếm số nguyên tử và số liên kết 4 5 Mô tả Không phụ thuộc cấu dạng Tính theo hệ số phân chia octanol/nước hay tính khúc xạ Chỉ số hình dạng Kappa và chỉ số liên kết Kier&Hall Thông số ma trận khoảng cách và ma Thể hiện mối liên kết giữa các nguyên trận liền kề tử với nhau Thông số đặc trưng cho cấu trúc 6 7 mang hoạt tính (pharmacophore) Thông số điện tích riêng phần Tính diện tích bề mặt có điện tích riêng phần tương ứng 3.2.3. Phân chia tập hợp Để xây dựng mô hình 2D-QSAR và đánh giá mô hình xây dựng, tập dữ liệu ban đầu được chia làm 2 phần là tập xây dựng mô hình (chiếm 80% dữ liệu ban đầu) và tập ngoại. Tập dữ liệu được phân chia ngẫu nhiên (random) hoặc phân chia diverse. 3.2.3.1 Phân chia ngẫu nhiên Tập ngoại để đánh giá mô hình cần tính khách quan nên phân chia tập hợp ngẫu nhiên: - Đánh số ngẫu nhiên cho các chất bằng hàm RAND trong MOE. - Sắp theo thứ tự tăng dần và lấy 20% đầu tiên làm tập đánh giá ngoại. 3.2.3.2. Phân chia diverse Một cách phân chia khác là dựa trên công cụ diverse subset trong MOE, sắp xếp các chất trong tập dữ liệu dựa trên khoảng cách từ chất này đến chất khác. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 25 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Thứ tự sắp xếp cho phép lấy ra một tập con gồm những chất xa nhất so với chất xếp thứ nhất, đó là chất đầu tiên ở vị trí đầu tiên trong tập dữ liệu ban đầu. Chất xa nhất trong những chất còn lại được chọn để sắp thứ tự tiếp theo. Chất xa nhất là chất có giá trị nhỏ nhất của các khoảng cách tới những chất đã xếp hạng là lớn nhất. Lặp lại quá trình này cho tới khi đủ số chất mong muốn. Các chất không được đánh số có cùng số thứ tự là số lớn nhất. Vì chất đầu tiên (có số nhỏ nhất) được xếp cao nhất nên thứ tự sắp xếp phụ thuộc vào thứ tự ban đầu của dữ liệu. Để chuẩn bị dữ liệu cho việc xếp hạng, nên xếp thứ tự các chất trước, chẳng hạn theo năng lượng, như thế chất có năng lượng thấp nhất xuất hiện đầu tiên. Có nhiều cách tính khoảng cách giữa hai chất phụ thuộc vào dữ liệu sử dụng là thông số mô tả, dấu vân tay (fingerprint) hay dữ liệu cấu dạng (conformation data). Với thông số mô tả, khoảng cách giữa hai chất là khoảng cách Euclide giữa hai điểm đại diện cho hai chất trong không gian n-chiều. Mục đích của diverse là chọn ra một tập con khác biệt nhất trong tập hợp ban đầu. Việc này thích hợp cho việc chọn tập xây dựng mô hình có tính đại diện cho cả tập dữ liệu ban đầu. 3.2.3. Lựa chọn thông số mô tả Tập xây dựng mô hình đã loại thô và chia tỉ lệ được chọn thông số mô tả nhờ công cụ QSAR – Contingency trong phần mềm MOE và công cụ select attributes trong phần mềm WEKA 3.7.0. Chọn thông số mô tả trong WEKA gồm 2 chức năng tìm kiếm và đánh giá tập hợp thông số chọn được theo từng bước tìm kiếm. Lựa chọn chiến lược tìm kiếm hiệu quả ít tốn tài nguyên máy, không bỏ sót mô hình tốt và phù hợp độ lớn của tập dữ liệu và thuật toán đánh giá thông số. Trong nghiên cứu này, chiến thuật tìm kiếm lấy thêm được sử dụng, phương pháp đánh giá thông số là phản hồi với thuật toán hồi qui đa tuyến. 3.2.4. Thuật toán QSAR Sử dụng công cụ QSAR – Model trong phần mềm MOE để xây dựng mô hình. Lựa chọn lại thông số mô tả bằng cách loại dần theo hệ số tương quan với pIC50 và đánh giá bằng LOO. Dùng giá trị Z-score để loại chất gây nhiễu. Xây SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 26 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ dựng lại mô hình với những tập đã loại nhiễu. 3.2.5. Đánh giá mô hình Mục tiêu của nghiên cứu QSAR là xây dựng được mô hình có khả năng dự đoán tốt – giá trị dự đoán và giá trị thực gần nhau. Điều đó thể hiện qua giá trị p, bình phương hệ số tương quan R2 và căn của tổng bình phương phần dư RMSE của tập xây dựng mô hình. Các giá trị này được thẩm định bằng đánh giá nội (đánh giá chéo LOO) và đánh giá trên tập ngoại. Đánh giá chéo LOO được tiến hành đồng thời với xây dựng mô hình bằng MOE. Các thồn số đánh giá là giá trị trung bình của bình phương hệ số tương quan của các mô hình thưa cấp Q2 và RMSE đánh giá chéo. Tập ngoại được tách riêng đầu tiên, không tham gia vào quy trình xây dựng mô hình để đảm bảo tính khách quan cho việc đánh giá khả năng dự đoán của mô hình. Ứng dụng tập ngoại vào mô hình xây dựng bằng công cụ model evaluate của MOE. Phần lớn các giá trị dự đoán của tập ngoại phải nằm trong khoảng tin cậy 95% dự đoán đúng của mô hình. Và còn có các thông số đánh giá là bình phương hệ số tương quan R2 và căn của tổng bình phương phần dư RMSE giữa giá trị dự đoán và giá trị thực nghiệm của các chất trong tập ngoại. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 27 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 28 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 4.Kết quả và bàn luận 4.1.Cơ sở dữ liệu Qua quá trình thu thập và chọn lọc, cơ sở dữ liệu gồm 60 chất với chỉ số IC50 (Phụ lục 1). Dựa vào đó vẽ hình 2D và 3D của các chất và tính ra pIC50=-lg IC50. Sau đó, tập dữ liệu được nhập vào MOE với dạng *.mdb gồm có công thức hoá học 3D, tên chất và chỉ số pIC50. Trong chương trình MOE, các chất được tính các thông số mô tả phân tử. Tập xây dựng mô hình của từng mô hình có số lượng thông số mô tả đã chia tỉ lệ được dùng để lựa chọn thông số sử dụng công cụ QSAR – Contingency và/hoặc chiến thuật tìm kiếm trong phần mềm WEKA như trình bày trong phần PPNC. Lượng thông số mô tả chọn ra tối đa bằng 1/5 số lượng chất trong tập hợp. Các thông số mô tả chọn được cho mỗi mô hình được dùng xây dựng phương trình hồi quy bằng phương pháp bình phương tối thiểu từng phần. Phương trình hồi qui thể hiện mối liên quan định lượng giữa cấu trúc (thông số mô tả) và tác dụng chống oxy hoá , có dạng: y=a0+aixi. Trong đó a0 là hệ số chặn của phương trình, nếu tất cả các thông số mô tả xi=0 thì hoạt tính y=a0; ai là hệ số hồi qui của từng thông số xi, thể hiện tỉ lệ và chiều hướng thay đổi hoạt tính sinh học khi giá trị thông số thay đổi. Cụ thể, nếu ai dương thì cấu trúc có thông số mô tả xi sẽ cho hoạt tính tăng và ngược lại. Phương trình hồi quy bao gồm các thông tin trên và hệ số tương quan chéo của từng cặp thông số mô tả, tất cả đều nhỏ hơn 0.90 (90%). Các thông số mô tả có hệ số tương quan chéo cao hơn 0.90 thì được xem như là giống nhau và việc có mặt cả hai trong phương trình là dư thừa, khiến bình phương hệ số tương quan của cả phương trình cao hơn so với thực tế. Khả năng dự đoán của các mô hình được thể hiện bằng căn bậc hai sai số chuẩn (RMSE), bình phương hệ số hồi qui (R2), giá trị p của tập xây dựng. Để đánh giá lại khả năng dự đoán sử dụng các hệ số đánh giá nội gồm căn bậc hai sai số (XRMSE), bình phương hệ số hồi qui (Q2) của đánh giá chéo LOO và các hệ SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 29 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ số đánh giá ngoại khi ứng dụng tập ngoại có phân phối ngẫu nhiên hoặc diverse vào mô hình gồm RMSE và R2. 4.2.Mô hình QSAR dựa trên một thông số mô tả phân tử Sau khi chọn lọc các thông số mô tả bằng QSAR – Contingency, dựa vào sự so sánh độ tương quan thông số mô tả với pIC50, lip_don là thông số mô tả có độ tương quan cao nhất là 85 (hình 6), thực hiện xây dựng phương trình trên thông số mô tả này được phương trình (I). Vì các thông số có sự tương quan với nhau trên 80 thì chúng ta chỉ chọn một thông số mô tả có sự tương quan tốt nhất với pIC50. Các thông số mà ta lựa chọn được liệt kê trong bảng 2. Bảng 2: Thông số mô tả Phương trình Thông số mô tả b-1rotN R2 pIC50 =-1.60003-0.22447 0.30192 RMSE XRMSE XR2 0.65318 0.67642 0.25599 0.65732 0.68786 0.23613 0.69563 0.72413 0.14851 0.67025 0.70021 0.20776 0.41408 0.42415 0.70573 0.68569 0.71249 0.17473 0.66293 0.68673 0.23182 * b_rotN PEOE_VSA+1 pIC50 =-1.04112-0.01700 0.29304 * PEOE_VSA+1 PEOE_VSA+2 pIC50 =-2.63808+0.02576 0.20824 * PEOE_VSA+2 PC+ pIC50 =-3.48780+0.40983 0.26497 * PC+ lip_don pIC50 =-3.09200+0.40233 0.71945 * lip_don SMR_VSA3 pIC50 =-3.31805+0.03920 0.23071 * SMR_VSA3 logP(o/w) pIC50 =-0.59580-0.54516 0.28092 * logP(o/w) SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 30 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Hình 6: Độ tương quan giữa các thông số với pIC50 Vậy thì phương trình (I) là pIC50 =-3.09200+0.40233 * lip_don với hệ số lip_don là tổng số H và OH trong phân tử. Mô hình được xây dựng gồm 60 chất thuộc nhiều nhóm cấu trúc. RMSE thể hiện sai số giữa pIC50 dự đoán và thực nghiệm là 0.41408, tương đương IC50 là ~ 2.5nM, sai số này nhỏ. Mức độ tương quan giữa giá trị dự đoán và thực nghiệm là 71.9%, tương đối tốt. Các giá trị tương tự khi thực hiện đánh giá chéo. 4.3.Mô hình QSAR tổng quát Từ 184 thông số mô tả cấu trúc không gian đượ tính toán từ MOE, các thông số mô tả phân tử được lựa chọn bằng phép hiệu chỉnh của Forward Selection, sử dụng thuật toán MLR, đánh giá trị số p của mỗi thông số, kết quả đánh giá chéo LOO và cuối cùng đưa ra mô hình có 7 thông số. Các thông số được trình bày ở bảng. Sau khi xây dựng phương trình một thông số mô tả, dựa trên các thông số mô tả phân tử, thực hiện xây dựng mô hình QSAR tổng quát dựa trên bảy thông số mô SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 31 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ tả không có sự tương quan lẫn nhau (hình 6). Mô hình có phương trình (II) RMSE = 0.35247, R2= 0.79672, XRMSE = 0.40881, XR2= 0.72942. pIC50 = -2.10317 -0.00339 * PEOE_VSA+2 +0.05470 * PC+ +0.17340 * lip_don +0.02805 * SMR_VSA3 -0.09223 * logP(o/w) -0.01707 * PEOE_VSA+1 +0.02086 * b_rotN SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 32 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ B ảng 3: Các thông số xây dựng phương trình STT 1 Ý nghĩa thông số Tên thông số PEOE_VSA+1 Tổng điện tích dương bề mặt liên kết Van der Waals tại giá trị 0. 2 PEOE_VSA+2 Tổng điện tích dương bề mặt liên kết Van der Waals tại giá trị 2. 3 PC+ Tổng các điện cực qi 4 lip_don Tổng số thành phần OH v à H 5 SMR_VSA3 tổng số vi sao cho Ri trong khoảng (0.35,0.39]. 6 logP(o/w) Log của hệ số phân vùng octanol / nước (bao gồm cả hydrogens ngầm). Thuộc tính này được tính toán từ một loại mô hình tuyến tính nguyên tử [LOGP 1998 với r2 = 0,931, RMSE = 0,393 trên 1.827 phân tử. 7 b_rotN Số của liên kết xoay hướng được. Liên kết là xoay được nếu nó có thứ tự 1, không phải là trong vòng một, và có ít nhất là hai phân tử liền kề lớn Mô hình được xây dựng gồm 60 chất thuộc nhiều nhóm cấu trúc. RMSE thể hiện sai số giữa pIC50 dự đoán và thực nghiệm là 0.35247, tương đương IC50 là ~ 2.25nM, sai số này nhỏ. Mức độ tương quan giữa giá trị dự đoán và thực nghiệm là 79.6%, tương đối tốt. Các giá trị tương tự khi thực hiện đánh giá chéo. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 33 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 4.4. Ứng dụng - Dự đoán giá trị IC50 của những chất chỉ có giá trị hoạt tính phần trăm (phụ lục 2) - Dự đoán giá trị IC50 của những chất chỉ có giá trị hoạt tính nhóm các chất có phương pháp IC50 khác nhau.(phụ lục 2) 4.5.Thử nghiệm đánh giá lại 4.6.Bàn luận Nghiên cứu đã đưa ra 2 mô hình được xây dựng trên 60 chất flavonid khác nhau. Kết quả đã được trình bày ở trên, phương trình đều có các chỉ thoả điều kiện xây dựng phương trình.  R2 : thể hiện độ tin cậy của phương trình được xây dựng trên tập hợp xây dựng.  RMSE : thể hiện độ sai số của IC50 dự đoán và IC50 thực tế của tập hợp xây dựng.  XR2 : thể hiện độ tin cậy của phương trình được xây dựng trong đánh giá chéo trên tập hợp xây dựng.  XRMSE : thể hiện độ sai số của IC50 dự đoán và IC50 thực tế của đánh giá chéo trên tập hợp xây dựng. 4.6.1. Phương trình một thông số Trong mô hình một thông số mô tả, phương trình được chọn là phương trình: pIC50 =-3.09200+0.40233 * lip_don Phương trình xây dựng trên thông số lip_don, thông số này thể hiện sự khác nhau của số OH và H trong công thức hoá học của các chất flavonoid. Vậy chỉ cần sự thay đổi số nguyên tử H và OH của một công thức hoá học ta sẽ có IC50 mới. Tuy nhiên vì phương trình có độ tin cậy 71.9%, độ sai số giữa IC50 dự đoán và IC50 thực tế 41.4% là chưa hoàn hảo nên IC50 dự đoán của phương trình còn hạn chế đối với các chất có công thức hoá học gần như tương tự nhau. 4.6.2. Phương trình bảy thông số SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 34 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Vì những hạn chế trên của phương trình một thông số mô tả, ta xây dựng phương trình trên 7 thông số mô tả. pIC50 = -2.10317 -0.00339 * PEOE_VSA+2 +0.05470 * PC+ +0.17340 * lip_don +0.02805 * SMR_VSA3 -0.09223 * logP(o/w) -0.01707 * PEOE_VSA+1 +0.02086 * b_rotN Ý nghĩa các thông số mô tả được trình bày ở bảng 3. Phương trình được xây dựng có độ tin cậy là 79,6%, độ sai số giữa IC50 dự đoán và IC50 thực tế là 35.2%. Với các chỉ số này thì IC50 được dự đoán từ phương trình này tốt hơn hăn so với phương trình một thông số ở trên, khi các IC50 của các công thức hoá học gần như tương tự nhau được dự đoán đã có sự khác biệt. 4.6.3. Thử nghiệm đánh giá lại SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 35 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 36 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS. Đỗ Tường Hạ 5. Kết luận và đề nghị 5.1.Kết luận Qua quá trình thực hiện, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được những kết quả sau: - Tập hợp các cấu trúc hóa học của dẫn chất flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa từ các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước - Nghiên cứu xây dựng mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học các dẫn chất flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa bằng các phần mềm hóa tin học thích hợp Đồng thời đã áp dụng thành công trong phân tích xây dựng mô hình QSAR trên thông số mô tả 2 chiều và dự đoán được khả năng kháng oxi hoá của một số chất flavonoid. Phân tích được sự tương quan của số OH và H trong phân tử đối với khả ngăng kháng oxi hoá qua phương trình một thông số mô tả với R2= 0.71945, RMSE = 0.41408, XRMSE = 0.42415, XR2 = 0.70573. Từ đó, xây dựng mô hình QSAR tổng quát với bảy thông số mô tả, thể hiện sự tương quan giữa liên kết phân tử Van der Waals, tổng số OH và H, tổng số các điện cực, hệ số phân vùng octanol/nước, số liên kết xoay hướng… với RMSE = 0.35247, R2= 0.79672, XRMSE = 0.40881, XR2= 0.72942. Phương trình trên có khả năng dự đoán IC50 chính xác hơn phương trình một thông số khi có những chất có số OH và H là tương tự nhau thì vẫn có thể dự đoán được IC50 là khác nhau. 5.2. Đề nghị Vì thời gian thực hiện đề tài tương đối hạn chế nên nguồn dữ liệu tổng hợp được là không nhiều. Hướng mở rộng của đề tài là:  Tổng hợp nguồn dữ liệu nhiều hơn, từ đó xây dựng mô hình tổng quát hơn và kết hợp QSAR 3D để đưa ra công thức tối ưu nhất  Nghiên cứu quá trình tổng hợp các chất có hoạt tính kháng oxi hoá cao được đề nghị trong đề tài.  Từ đó, thực hiện đo khả năng kháng oxi hoá của chất này. SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 37 [...]... quan đến sự stress oxy hóa (oxydative stress) do các tác nhân oxy hóa có hoạt tính (reactive oxygen species) trong cơ thể Các polyphenol mà đặc biệt là flavonoid đã được chứng minh là những chất có khả năng chống oxy hóa mạnh do có khả năng trung hòa các gốc tự do bằng cách đóng vai trò là chất cho electron hay nguyên tử hydro (hình 3) Hệ thống liên hợp trong phân tử flavonoid và một vài nhóm hydroxyl... hình Xây dựng thư viện các hợp chất Áp dụng mô hình dự đoán tìm ứng viên SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 21 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS Đỗ Tường Hạ Chương 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 22 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS Đỗ Tường Hạ 3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu này xây. .. 4.6.Bàn luận Nghiên cứu đã đưa ra 2 mô hình được xây dựng trên 60 chất flavonid khác nhau Kết quả đã được trình bày ở trên, phương trình đều có các chỉ thoả điều kiện xây dựng phương trình  R2 : thể hiện độ tin cậy của phương trình được xây dựng trên tập hợp xây dựng  RMSE : thể hiện độ sai số của IC50 dự đoán và IC50 thực tế của tập hợp xây dựng  XR2 : thể hiện độ tin cậy của phương trình được xây dựng... 2.2.2.Hoạt tính sinh học của flavonoid Đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học các dẫn chất flavonoid và chalcon cho thấy các dẫn chất này có tác dụng sinh học đáng kể trên cả in vitro và in vivo Các tác dụng sinh học đã được chứng minh bằng thực nghiệm bao gồm tác dụng kháng khuẩn kháng nấm, tác dụng kháng viêm, tác dụng bảo vệ tim mạch, kháng ung thư… Nhiều nghiên cứu gần đây đã... nhưng cũng đòi hỏi một khung tham chiếu tuyệt đối Tùy theo định hướng nghiên cứu mà chọn lựa tính toán thông số mô tả phù hợp Nghiên cứu này tiến hành xây dựng mô hình thể hiện mối quan hệ định lượng cấu trúc – tác dụng trên cấu trúc 2 chiều của các hợp chất có tính kháng sốt rét nên chỉ quan tâm các thông số 2D, bao gồm 7 nhóm SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 24 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái... thì ta có thể xây dựng mối tương quan cấu trúc – tác động sinh học một cách định lượng (QSAR – Quantitative Structure activity Relationship) Sự SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 12 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS Đỗ Tường Hạ định lượng ở đây không liên quan đến việc tác dụng sinh học có định lượng được hay không, mặc dù đó là một nhầm lẫn thường gặp Mục tiêu của nghiên cứu QSAR... Chọn lọc thông số mô tả Tập hợp xây dựng mô hình (training set) Phân tích ngẫu nhiên (QSAR-Contingency-MOE 2008.10 Phương pháp dựa trên sự tương quan (CFS – WEKA 3.7.0) Xây dựng mô hình QSAR Tập hợp xây dựng mô hình (training set) Bình phương tối thiểu từng phần (PLS – MOE 2008.10) Đánh giá chéo nội (LOO – MOE 2008.10):XR2,XRMSE Loại bỏ chất gây nhiễu (outlier) Tập hợp xây dựng mô hình (training set)... trò quan trọng trong việc tạo thành các gốc tự do bền sau khi đã cho electron hay nguyên tử hydro cho các gốc tự do không bền trong cơ thể Hình 3 Sự chuyển hóa của các gốc tự do flavonoid sau khi cho một nguyên tử hydro SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 11 Luận văn tốt nghiệp đại học GVHD: TS.Thái Khắc Minh, ThS Đỗ Tường Hạ Ngoài khả năng thu dọn hay trung hòa các gốc tự do, khả năng chống oxy hóa của flavonoid. .. được đổi thành pIC50 = -log (IC50) để phù hợp cho việc xây dựng phương trình tuyến tính quan hệ cấu trúc – tác dụng 3.2.2 Xây dựng thông số mô tả Cấu trúc 2 chiều (2D – 2 dimensions) và giá trị IC50 của các chất nghiên cứu được lưu trữ bằng tập tin *.mdb trong phần mềm MOE 2008.10 (Molecular Operating Environment phiên bản 2008.10) để tiến hành xây dựng các mô hình Trước tiên, các cấu trúc 3D được tối... chính là số chất trong tập xây dựng mô hình, khi đó gọi là đánh giá chéo LOO (leave one out) Tùy số lượng chất trong tập xây dựng mô hình và cân bằng giữa độ lệch – phương sai mà ta chọn k thích hợp Cách tiến hành đánh giá chéo k lần như sau: - Tập xây dựng mô hình được chia làm k phần - Lấy (k – 1) phần làm tập huấn luyện để xây dựng mô hình thứ cấp sử dụng thông SVTH: Lê Quang Hiển - 071933H 19 Luận ... trúc hóa học các dẫn chất flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa Nhiêm vụ là: - Tập hợp cấu trúc hóa học dẫn chất flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa từ tài liệu tham khảo nước - Nghiên. .. Hạ quanh đời sống ta, tiêu biểu họ cam đồng thời giới có 4000 loại flavonoid xác định cấu trúc hoá học Đây sở để tạo liệu cho việc thực đề tài: Nghiên cứu xây dựng mối quan hệ giữa cấu trúc. .. cấu trúc hóa học dẫn chất flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa từ tài liệu tham khảo nước - Nghiên cứu xây dựng mối quan hệ cấu trúc hóa học dẫn chất flavonoid hoạt tính chống oxy hóa phần mềm