ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ I- LỊCH SỬ Năm Nhà khoa học 1906 Mikhail Tswett 1931 1938 1941 1950 Richard Kuhn và Edgar Lederer Izmailov & Schraiber Martin & Synge 1952 Martin & James 1958 Stahl Cuối năm 1960 1937 – 1972 Đầu năm 2005 Sự kiện  Công bố sắc ký hấp phụ các chất màu trong cây  gọi là sắc ký đồ, đặt tên là phương pháp sắc ký .  sắc ký lỏng hấp phụ trên cột Sắc ký cột tách đồng phân  và  caroten Xây dựng phương pháp SKLM, sắc ký trao đổi ion đặt nền tảng cho sắc ký phân bố: SKG và SKK Sắc ký pha đảo  bài báo đầu tiên về SKK  giải Nobel về sắc ký phân bố. hoàn thiện phương pháp SKLM sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời 12 giải Nobel về sắc ký sắc ký lỏng siêu áp II- ĐỊNH NGHĨA 1- Khái niệm  Sắc ký là sự phát triển một cách logic của sự chiết ngược dòng.  Sắc ký là sự chiết liên tục và sự cân bằng liên tục của chất tan giữa 2 pha.  Phương pháp sắc ký là phương pháp tách các chất bằng phương pháp chuyển pha.  Quá trình tách dựa vào tỷ lệ giữa 2 pha:  Phương pháp chiết.  Phương pháp sắc ký.  Sắc ký là một qui trình trong đó chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học của chúng trong một hệ thống hai hay nhiều pha. Một trong các pha này chuyển động một cách liên tục theo một hướng nhất định và trong pha này các chất riêng biệt thể hiện linh độ khác nhau là do có sự khác nhau về:  phân bố,  kích thước phân tử,  hấp phụ,  độ hòa tan  điện tích,  áp suất hơi. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 1 2- Thành phần của sắc ký  Sắc ký đòi hỏi hai pha:  Pha động: + lỏng, khí, lỏng siêu tới hạn. + chuyển động dọc theo hệ sắc ký.  Pha tĩnh: + cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn + chất rắn hay chất trơ tẩm hay trộn trong chất lỏng + tương tác với chất tan theo các cơ chế: hấp phụ, phân bố, rây phân tử, trao đổi ion, ái lực.  Các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này:  Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (hấp phụ, tính tan, …)  Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.  Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ.  Ứng dụng: tách các chất qua quá trình sắc ký.  Nguyên nhân tách của các loại hình sắc ký:  Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó.  Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan  các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng.  Thực tế, tách là do sự kết hợp nhiều cơ chế.  Phương pháp sắc ký được áp dụng trong các ngành khoa học khác nhau  Ngành Dược: nghiên cứu, phân tích, kiểm nghiệm thuốc.  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 2 3- Quá trình sắc ký a. Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh b. Khai triển sắc ký  Sắc ký khai triển  Sắc ký rửa giải:  Quá trình rửa giải  Dung môi rửa giải (eluent)  Dung dịch rửa giải (eluate) Chuẩn bị cột c. Phát hiện các chất  Màu của chất  Đèn tử ngoại  Phun thuốc thử  Đầu dò (detector) Đưa chất phân tích vào cột ` Triển khai cột Hứng và kiểm tra các phân đoạn Sắc ký khai triển  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 3 III- PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ A. THEO BẢN CHẤT VẬT LÝ CÁC PHA Tên kỹ thuật 1- Sắc ký lỏng (liquid chromatography) Pha động  chất lỏng Thực hiện trên cột hay trên mặt phẳng 2- Sắc ký khí (gas chromatography, GC)  chất khí Chỉ thực hiện trên cột 3- Sắc ký lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid chromatography, SFC)  chất lỏng siêu tới hạn Pha tĩnh  Chất lỏng được hấp phụ trên 1 chất rắn (chất mang)  Pha liên kết  Chất rắn  Chất lỏng được hấp phụ trên chất rắn  Pha liên kết  Chất rắn  Pha liên kết Loại cân bằng Phân bố giữa hai pha  lỏng  Phân bố giữa pha lỏng và bề mặt pha liên kết  Hấp phụ  Phân bố giữa pha khí và pha lỏng  Phân bố giữa pha khí và pha liên kết  Hấp phụ  Phân bố giữa pha lỏng siêu tới hạn và pha liên kết Chỉ thực hiện trên cột B. THEO PHƯƠNG CÁCH CHO PHA ĐỘNG ĐI QUA PHA TĨNH 1- Sắc ký khai triển (development chromatography)  Pha động đưa các thành phần trong mẫu di chuyển và tách ngay trên pha tĩnh.  Sắc ký đồ nằm ngay trên pha tĩnh  Sắc ký khai triển thường được thực hiện trên mặt phẳng. 2- Sắc ký rửa giải (elution chromatography)  Pha động đưa các thành phần trong mẫu di chuyển lần lượt ra ngoài pha tĩnh.  Sắc ký đồ thực hiện ngoài pha tĩnh.  Sắc ký rửa giải thực hiện trên cột. C. THEO BẢN CHẤT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ – THEO CƠ CHẾ TÁCH 1- Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography)  Là kỹ thuật sắc ký trong đó sự phân tách các chất tan là do cân bằng hấp phụ trên bề mặt của chất tan giữa các tiểu phân chất rắn của pha tĩnh với pha động (hệ lỏng-rắn hay khírắn).  Pha động luôn chạy theo một chiều nhất định nên luôn xảy ra quá trình hấp phụ và phản hấp phụ.  Các chất tan sẽ bị kéo theo pha động.  Các chất tan khác nhau có ái lực khác nhau với pha tĩnh.  Là kiểu sắc ký cổ nhất.  Thí nghiệm của Tswett; sắc ký lớp mỏng theo cơ chế này. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 4 2- Sắc ký phân bố (partition chromatography)   Là kỹ thuật sắc ký trong đó chất tan được tách riêng ra do sự cân bằng về sự phân bố của chất tan giữa:  Pha tĩnh lỏng: chất lỏng này được bao trên bề mặt một chất rắn trơ, không tham gia vào quá trình sắc ký (gọi là chất mang).  Pha động: lỏng hay khí.  Phổ biến nhất.  Pha động luôn luôn chuyển động theo một chiều nhất định kéo theo chất tan đi.  Sự phân bố ngược dòng với hàng loạt lần chiết gián đoạn.  Sau một khoảng thời gian nhất định, chất tan dịch chuyển một khoảng nhất định trong pha tĩnh.  Hai chất tan khác nhau với hệ số K khác nhau thì sẽ có linh độ khác nhau trong pha tĩnh và sẽ được tách riêng ra khỏi hỗn hợp của chúng trong một khoảng thời gian nhất định. 3- Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography)  Là kỹ thuật sắc ký hiện đại trong đó sự phân tách các chất tan là do lực hút tĩnh điện giữa các phân tử chất tan mang điện tích trái dấu với các nhóm cation [N(CH3)]+ hay anion (-SO3)- liên kết cộng hóa trị với các tiểu phân của pha tĩnh (nhựa trao đổi ion).  Pha tĩnh là các chất trao đổi ion.  Nhựa trao đổi ion là những hợp chất cao phân tử, thể rắn, không tan trong nước và có chứa nhóm chức có khả năng trao đổi.  Gồm 2 loại: Nhựa trao đổi cation (cationit) Nhựa trao đổi anion (anionit) - +  Cationit acid mạnh -SO3 H  Anionit base mạnh -N(CH3)3+OH Cationit acid yếu -COO-H+  Anionit base yếu -NH3+OH Tiến trình trao đổi: (Mx+ và Ax-: ion chất tan)  Cation: xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)xMx+ + xH+  Anion: xRN(CH3)3+OH- + Ax[RN(CH3)3+]xAx-+ xOHHóa phân tích 2 Trần Trung Trực 5  Pha động thường là các dung dịch đệm có pH và chất điện ly thích hợp.  Pha động có thêm một số dung môi hữu cơ như MeOH, EtOH,…để làm tăng độ hòa tan hay độ chọn lọc cho chất tan  các ion chất tan cạnh tranh trên mạng ion   Xét cân bằng trao đổi ion giữa cation B+ và nhựa cationit RSO3-H+:  RSO3-H++B+↔ (RSO3-)B++H+  𝐾𝑐𝑏 = + + RS O − 3 B [H ] + + RS O − 3 H [B ] + Nếu [H+] trong dung dịch lớn: cân bằng sẽ dịch chuyển sang trái  B+ được phản hấp phụ + Dùng một dung dịch acid rửa giải cột thì B+ sẽ bị đẩy ra khỏi cột  quá trình hoàn nguyên (tái sinh) nhựa. + Nhựa cationit dùng HCl để tái sinh. + Nhựa anionit dung NaOH để tái sinh.  Nhận xét:  Ion có Kcb lớn sẽ bị lưu giữ mạnh trên inoit và ngược lại.  Kcb phụ thuộc điện tích và kích thước của ion đã hydrat hóa.  Chất tan có ái lực khác nhau với nhựa trao đổi ion. Kết quả là sẽ có linh độ khác nhau trong pha tĩnh, sự tách riêng từng chất sẽ xảy ra sau một khoảng thời gian dịch chuyển nhất định trong pha động.  Ứng dụng: tách, định lượng protein, polypeptides, nucleotids, ion, những chất mang điện tích.  Cột HPLC: có mang pha tĩnh nhóm ionic:  sulfonic (trao đổi cation)  tetraalkylamonium (trao đổi anion) Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 6 4- Sắc ký rây phân tử (size exclution chromatography)   Là kỹ thuật sắc ký trong đó sự tách riêng chất tan dựa vào kích thước khác nhau của phân tử chất tan khi đi qua lỗ trống của các gel.  Các phân tử có kích thước nhỏ bị giữ lại trong lỗ trống của gel nên chuyển động chậm hơn các phân tử có kích thước lớn hơn (không bị giữ lại).  Không có bất kỳ một tương tác nào giữa chất tan và pha tĩnh giống như kiểu sắc ký thông thường.  Cơ chế rây phân tử ngược với cơ chế rây cơ học:  Pha tĩnh là hệ thống gel có các lỗ xốp kích thước cỡ phân tử.  Chất tan trong pha tĩnh đi qua gel bằng kỹ thuật thẩm thấu.  Các phân tử lớn không thẩm thấu được vào các lỗ xốp của pha tĩnh nên được rữa giải bằng thể tích dung môi bằng với thể tích cột.  Các phân tử nhỏ ở trong hay ngoài gel cần lượng chất rửa giải nhiều hơn.  Các phân tử của chất tan tùy theo kích thước khác nhau có thể chui hoàn toàn hoặc một phần nào trong lỗ xốp sẽ bị giữ lâu hơn và ra sau cùng.  Các phân tử có kích thước lớn hơn không lọt được vào lỗ xốp của pha tĩnh nên không bị giữ lại và có linh độ lớn nhất trong pha tĩnh.  Cơ chế của rây phân tử phụ thuộc vào sự khuếch tán chọn lọc của các chất tan qua các lỗ. Ở trạng thái cân bằng: Cs  Cm   Cs, Cm: nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động  Hệ số K được tính theo phương trình: K Cs VR Vm  Vs Cm + Vm: tổng thể tích của pha động nằm trong các lỗ xốp của các hạt pha tĩnh + VS: thể tích dung môi giữa các lỗ + VR: thể tích bị lưu giữ của chất tan  Sắc ký rây phân tử = Sắc ký lọc qua gel = Sắc ký thẩm thấu gel.  Ứng dụng:  Dùng trong sinh hóa để tách các protein, các carbohydrat,…  Trong dược liệu  Tách chất bằng SEC. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 7 5- Sắc ký ái lực (affinity chromatography)  Mới và có tính chọn lọc cao  Dựa vào tương tác đặc hiệu giữa một loại phân tử chất tan với một phân tử thứ hai liên kết cộng hóa trị với pha tĩnh  Ví dụ:  phân tử liên kết cộng hóa trị với pha tĩnh là một kháng thể của một protein.  Khi cho hỗn hợp gồm hàng ngàn protein qua cột, chỉ có một protein phản ứng với kháng thể được giữ lại trên cột, các protein còn lại được rửa khỏi cột.  Protein bị giữ lại trên cột sẽ được tách ra khỏi kháng thể bằng cách thay đổi pH hay nồng độ ion trong pha động.   Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 8 D. THEO PHƯƠNG CÁCH LƯU GIỮ PHA TĨNH 1-   Sắc ký cột (Column chromatography) Pha tĩnh được giữ trong ống nhỏ: sắc ký khí – GC, sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC. Pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hay trọng lực. Chất di chuyển nhanh nhất  2- Sắc ký phẳng (planar chromatography)  Pha tĩnh được cố định trên cột mặt phẳng: a. Sắc ký lớp mỏng b. Sắc ký giấy  Pha động chuyển qua mặt đó nhờ mao dẫn hoặc tác động của trọng lực. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 9 E. THÔNG THƯỜNG  Phân chia sắc ký theo thiết bị hình thành sắc ký đồ hoặt phân chia theo pha động 1- Sắc ký cột (Column Chromatography, CC) 2- Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC) 3- Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC) 4- Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC) 5- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 6- Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC) hoặc UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography) IV- SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ A. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao Xét sự tách 2 chất A và B trên cột   Tại thời điểm to, cho hỗn hợp 2 chất này lên cột thì A và B tự phân vào 2 pha.  Thêm một ít dung môi mới vào cột, phần dung môi mới sẽ đẩy dung môi hòa tan A, B xuống phần cột bên         dưới. Có sự phân bố lại A, B giữa 2 pha ở cả 2 phần cột trên và dưới. Tiếp tục thêm dung môi mới, A và B sẽ bị kéo dần xuống. Tại thời điểm t1 tách nhau chưa hoàn toàn. Tại thời điểm t2, 2 dải A và B tách riêng khỏi nhau trên cột  ta có sắc ký đồ ngay trên cột. Tiếp tục thêm dung môi mới, tại thời điểm t3 dải chất A ra khỏi cột, gặp đầu dò và cho tín hiệu dưới dạng 1 đỉnh (1 pic). Tại t4 dải B ra khỏi cột lại cho thêm 1 pic.  Ta thu được sắc ký đồ gồm 2 pic riêng biệt ứng với 2 chất A và B. Vị trí của pic trên trục thời gian là cơ sở để định tính chất tương ứng diện tích đỉnh hay chiều cao đỉnh là đặc trưng định lượng của chất. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 10 B. ẢNH HƯỞNG CỦA TỐC ĐỘ DI CHUYỂN CỦA CHẤT TAN VÀ SỰ MỞ RỘNG DẢI       Hình 1: Tại t1, 2 dải A và B xen phủ nhau 1 phần. Tại t2, chúng tách khỏi nhau. (phần dưới cột). Theo thời gian, các dải bị mở rộng làm ảnh hưởng tới việc tách 2 dải cạnh nhau. Hình 2 mô tả 2 cách làm tăng độ phân giải 2 chất trong hỗn hợp: Sắc ký đồ a, 2 pic xen phủ nhau: + ta thay đổi điều kiện sắc ký  thay đổi tốc dộ di chuyển của chất tan (tăng tốc độ chất I và giảm tốc độ chất II) để tách riêng 2 pic (sắc ký đồ b). + giảm sự mở rộng dải (giảm sự giãn pic) để tách riêng 2 pic: sắc ký đồ c.   Để tách sắc ký được tốt, cần quan tâm đến tốc độ di chuyển của chất tan và hiện tượng giãn pic. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 11 V- LÝ THUYẾT ĐỘNG HỌC TRONG SẮC KÝ ĐỒ  Sự giãn pic (sự mở rộng dải) được nghiên cứu qua lý thuyết đĩa và lý thuyết động học.  Sắc ký cột. A. HÌNH DẠNG PIC VÀ SỰ GIÃN PIC 1- Hình dạng pic và sự bất đối xứng của pic  Chất tan di chuyển theo pha động qua pha tĩnh sẽ mở rộng dải và pic trên sắc ký đồ thường trở nên không đối xứng.  Diện tích đỉnh (phần dưới pic) càng gần giống tam giác cân thì phân bố Gaussian càng tốt.  Lý tưởng: hệ số đối xứng =1.  Hệ số đối xứng: AF  BC (0,8 < AF < 1,2) AC  BC: nửa chiều rộng phía sau của pic được đo ở 1/10 chiều cao của pic.  AC: nửa chiều rộng phía trước của pic được đo ở 1/10 chiều cao của pic.  2     Hệ số kéo đuôi: As  AC  BC 2 AC (1/20 chiều cao) Sự giãn pic (peak spreading) – mở rộng dải (band broadening) Hiện tượng đặc biệt trong sắc ký Nghiên cứu qua thuyết về đĩa và thuyết động học Là kết quả di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân tử cùng một chất khi qua cột Pic ra muộn tù hơn pic ra sớm Cột sắc ký tốt (hiệu lực cao) sẽ cho pic nhọn (ít bị giãn)  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 12 3- Nguyên nhân gây giãn pic  Khuếch tán xoáy (eddy diffusion): Pha động phải qua các kẽ hở giữa các hạt nhồi trong cột  Quãng đường di chuyển theo pha động của các phân tử chất tan qua cột không hoàn toàn như nhau  pic giãn rộng ra do di chuyển theo nhiều đường khác nhau.  Phân tử chất tan khuếch tán dọc theo cột (longitudinal diffusion).  Quá trình phân bố chất tan giữa pha tĩnh và pha động tức là quá trình chuyển khối (mass transfer) không xảy ra tức thời.  Ảnh hưởng của kích thước hạt nhồi cột:   Khi cỡ hạt giảm, hiệu lực cột sẽ tăng.  Khi tốc độ dòng tăng, hiệu lực cột giảm.   Dòng chảy tầng: Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 13 B. LÝ THUYẾT ĐĨA 1- Khái niệm đĩa lý thuyết 2- Hiệu lực cột (column efficiency)  Cột sắc ký được chia thành N lớp.  Ở mỗi lớp, sự phân bố chấ tan vào 2 pha lại đạt đến trạng thái cân bằng.  Những lớp giả định này được gọi là đĩa lý thuyết (không có thực).  ở mỗi đĩa sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động.  khi 1 phần mới pha động đưa vào đĩa sẽ làm dịch chuyển cân bằng và một phần chất tan theo pha động sang đĩa tiếp theo, …  nhờ thiết lập cân bằng ở các đĩa nối tiếp như thế, chất tan sẽ được phân bố vào một số đĩa.  Trong số các đĩa, các đĩa ở giữa có nồng độ cực đại so với các đĩa lân cận ở 2 bên. 𝐋  Cột sắc ký có chiều dài L thì: 𝐍 = . 𝐇  Lý thuyết đĩa chưa xem xét các yếu tố trong và ngoài cột ảnh hưởng đến pic sắc ký, làm giãn pic.       t L N   16 R W H  2      5,54 t R  W    1/ 2   2 N: số đĩa lý thuyết biểu kiến H: chiều cao đĩa lý thuyết W: chiều rộng của pic ở đáy pic W1/2: chiều rộng của pic đo ở nữa chiều cao N tốt khi N gần bằng Nmax, N max  4000 L dp + L: chiều dài cột (cm) + dp: đường kính hạt pha tĩnh (m)  Khi cột có hiệu lực cao (H nhỏ, N lớn) thì: W nhỏ (độ giãn pic nhỏ). Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 14 C. LÝ THUYẾT ĐỘNG HỌC 1- Phương trình Van Deemter  Mối liên quan của H với các yếu tố động học trong quá trình rửa giải:  Khuếch tán chất tan khi di chuyển trong cột  Thiết lập cân bằng theo tương tác: chất tan – pha động – pha tĩnh  Tốc độ của các quá trình tương tác diễn ra trong cột B  Phương trình Van Deemter H  A   Cu u  U: vận tốc pha động.  A: liên quan đến khuếch tán xoáy của chất tan.  B: tác động đến khuếch tán dọc, tỷ lệ nghịch với tốc độ pha động.  C: quá trình chuyển khối tỉ lệ thuận với tốc độ dòng. 2- Khuếch tán xoáy 3- Khuếch tán dọc  Tốc độ pha động thay dổi từ điểm này đến điểm khác phụ thuộc vào nhiều yếu tố:  Khoảng các dến bề mặt hạt nhồi trong cột, độ đồng đều của hạt (hình dáng và kích thước hạt).  Hiệu ứng thành cột.  Ngay trong một ống rỗng, dòng chảy qua ống do hiệu ứng thành ống có vận tốc khác nhau:  ở thành ống có vận tốc bé, gần bằng 0.  Trung tâm ống (trục ống) có vận tốc max.  Thay đổi tốc độ dòng tác động không đáng kể vào khuếch tán xoáy của chất tan.  B  Cu u Các phân tử chất tan sẽ khuếch tán từ vùng có nồng độ cao sang vùng có nồng độ thấp H  A  hơn,  Trong cột sắc ký, phân tử chất tan sẽ khuếch tán ra khỏi dải ở cả 2 phía: trước và sau dải  mở rộng dải.  Nếu thời gian ở trong cột càng lâu, sự khuếch tán dọc theo cột càng mạnh.  Khi tốc độ khuếch tán tăng, thời gian lưu lại cột của chất tan càng ngắn và hiệu ứng khuếch tán dọc càng giảm: tác động khuếch tán dọc tỉ lệ nghịch với tốc độ pha động u. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 15 4- Chuyển khối 5- Nhận xét  Chất tan di chuyển trong pha động, trong pha tĩnh và ở cả mặt phân cách 2 pha với tốc độ khác nhau.  Nếu tốc độ dòng càng lớn, sự cân bằng càng khó vì:  phân tử chất tan trong pha động càng ít có cơ hội chuyển vào pha tĩnh mà lướt nhanh lên phía trước dải.  phân tử chất tan pha tĩnh đi vào pha động càng chậm nên nằm phía sau dải.  Kết quả: mở rộng dải về 2 phía.  Hiệu ứng mở rộng pic sắc ký liên quan đến động học của quá trình hấp và giải hấp chất tan, tăng tỉ lệ thuận với tốc độ dòng, Cu.  Khuếch tán xoáy của chất tan qua cột ít chịu ảnh hưởng với tốc độ dòng pha động.  Khuếch tán dọc theo cộ của chất tan thay đổi tỉ lệ nghịch với tốc độ u. Tác động này thể hiện đáng kể khi u nhỏ. Khi u càng lớn, tác động này càng nhỏ.  Quá trình chuyển khối, ngược lại với khuếch tán dọc, tỉ lệ thuận với tốc độ dòng.   Khi tốc độ dòng nhỏ, chiều cao H giảm theo chiều tăng của u, H giảm và đạt cực tiểu sau đó tăng dần theo tốc độ dòng.  Vì hiệu lực cột đạt tối ưu khi chiều cao H đạt cực tiểu cho nên hiệu quả cột tối ưu ứng với cực tiểu trên đường cong.  𝐇𝐦𝐢𝐧 = 𝐀 + 𝟐 𝐁 𝐂  Tối ưu hóa quá trình rửa giải: xác định được tốc độ dòng tối ưu để có hiệu lực cột đạt cực đại. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 16 VI- ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ A. ĐỊNH TÍNH VÀ THỬ ĐỘ TINH KHIẾT 1- Định tính – so sánh với một chất chuẩn a. Sắc ký khai triển (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy): Rf  Chấm trên >=3 bản.  Mỗi bản chấm 3 vết.  Khai triển với >= 3 hệ dung môi khác nhau.  Nếu trên cả 3 sắc đồ mẫu thử và chuẩn đều đồng nhất (về Rf, hình dạng vết, màu sắc vết trước/sau khi hiện màu) → mẫu thử và mẫu chuẩn đồng nhất. b. Sắc ký rửa giải (sắc ký cột, HPLC, GC): tR  So sánh tR mẫu thử và mẫu chuẩn phải giống nhau.  Kết hợp thêm phổ IR hoặc khối phổ. 2- Thử tinh khiết a. Sắc ký khai triển (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy): Rf  Chấm đậm trên >=3 bản.  Khai triển với >= 3 hệ dung môi hoàn toàn khác nhau.  Nếu cả 3 sắc ký đồ  vết gọn trong vùng Rf=0.3-0.75 thì mẫu thử là hợp chất tinh khiết.  Để khẳng định độ tinh khiết  đo UV, IR, NMR, MS.  Tóm lại: sắc ký giúp chúng ta khẳng định đúng kết quả âm tính, tức là xác nhận một chất không có mặt trong hỗn hợp. B. ĐỊNH LƯỢNG  Trong sắc ký rửa giải.  Đo chiều cao hay diện tích pic. 1- Phương pháp chuẩn ngoại 1 điểm a. Phân tích bằng chiều cao của pic   C x  Co hx ho ho: Chiều cao pic chuẩn, hx: Chiều cao pic thử b. Phân tích bằng diện tích pic Sx So  C x  Co   So: Diện tích pic của chuẩn, Sx: Diện tích pic của thử C0 và Cx càng gần nhau kết quả càng chính xác 2- Phương pháp chuẩn ngoại nhiều điểm (dùng đường chuẩn)  Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau rồi tiêm mẫu đó vào máu sẽ được các đỉnh tương ứng.  Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn  Vẽ đường chuẩn độ biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic theo nồng độ  Tiến hành sắc ký mẫu thử.  Dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ mẫu thử Cx theo Sx. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 17 3- Phương pháp nội chuẩn a. Trường hợp ứng dụng  Kết quả phân tích không lặp lại: sắc ký khí (GC), điện di mao quản (CZE) khi áp dụng phương pháp ngoại chuẩn (thời gian lưu tR, diện tích đỉnh S, xử lý mẫu phức tạp, hàm lượng chất phân tích thấp hay thể tích tiêm mẫu không lặp lại) b. Nguyên tắc  Thêm một chất chuẩn khác với chất cần định lượng (chuẩn nội) vào mẫu thử và dung dịch chuẩn  Mẫu phân tích gồm nhiều chất: chọn một trong các chất làm chuẩn nội  Tỷ số diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội là thông số được sử dụng để xây dựng đường chuẩn (S/SIS, C) c. Yêu cầu của chuẩn nội  Pic của chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác  tR của chuẩn nội phải gần với tR của chất phân tích  Nồng độ chuẩn nội thêm vào gần bằng nồng độ chất phân tích d. Nhận xét  Phương pháp này cho kết quả đáng tin cậy nhất (99%-99.5%).  Sai số do tiêm mẫu được loại bỏ. 4-    Phương pháp thêm chuẩn Thêm một lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử Nồng độ Cx của mẫu thử có diện tích pic là Sx Thêm C vào làm tăng S C S  Cx  S x  Áp dụng khi có ảnh hưởng của chất phụ. 5- Phương pháp chuẩn hóa diên tích - Phương pháp qui về 100% diện tích pic a. Trường hợp ứng dụng  Hay áp dụng để xác định độ tinh khiết của hoạt chất b. Yêu cầu  Mọi cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích đều phải được rửa giải, phát hiện và tách hoàn toàn  Sự đáp ứng của đầu dò trên các cấu tử là như nhau Ax 100 %X   Ax  Ay  Az  % X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z  Ax, Ay, Az: diện tích pic của cấu tử X, Y, Z Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 18 VII- MỤC LỤC I- LỊCH SỬ ........................................................................................................................................................................... 1 II- ĐỊNH NGHĨA ............................................................................................................................................................................................................................................................. 1 1- Khái niệm.................................................................................................................................................................. 1 2- Thành phần của sắc ký............................................................................................................................................. 2 3- Quá trình sắc ký ....................................................................................................................................................... 3 III- a. Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh ................................................................................................................................. 3 b. Khai triển sắc ký ................................................................................................................................................. 3 c. Phát hiện các chất.............................................................................................................................................. 3 PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ...................................................................................................................................................................................... 4 A. THEO BẢN CHẤT VẬT LÝ CÁC PHA .................................................................................................................................4 1- Sắc ký lỏng ...............................................................................................................................................................4 2- Sắc ký khí ..................................................................................................................................................................4 3- Sắc ký lỏng siêu tới hạn ...........................................................................................................................................4 B. THEO PHƯƠNG CÁCH CHO PHA ĐỘNG ĐI QUA PHA TĨNH ..........................................................................................4 1- Sắc ký khai triển .......................................................................................................................................................4 2- Sắc ký rửa giải ..........................................................................................................................................................4 C. THEO BẢN CHẤT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ – THEO CƠ CHẾ TÁCH ..............................................................................4 1- Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography) ......................................................................................................4 2- Sắc ký phân bố (partition chromatography) .......................................................................................................... 5 3- Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography) ............................................................................................ 5 4- Sắc ký rây phân tử (size exclution chromatography) ............................................................................................ 7 5- Sắc ký ái lực (affinity chromatography) ................................................................................................................ 8 D. THEO PHƯƠNG CÁCH LƯU GIỮ PHA TĨNH .................................................................................................................. 9 1- Sắc ký cột (Column chromatography) ................................................................................................................... 9 2- Sắc ký phẳng (planar chromatography) ................................................................................................................ 9 E. a. Sắc ký lớp mỏng ............................................................................................................................................... 9 b. Sắc ký giấy ......................................................................................................................................................... 9 THÔNG THƯỜNG .......................................................................................................................................................... 10 1- Sắc ký cột (Column Chromatography, CC) ........................................................................................................... 10 2- Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC) ............................................................................................................. 10 3- Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC) .......................................................................................... 10 4- Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC) .................................................................................................................. 10 5- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)................................................ 10 6Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC) hoặc UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography) ............................................................................................................................................................. 10 IV- SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ .......................................................................................................................................................................................................... 10 A. SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ .................................................................................................................................. 10 sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao .................................................................................................................... 10 Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 19 V- LÝ THUYẾT ĐỘNG HỌC TRONG SẮC KÝ ĐỒ ............................................................................................................................................................................... 12 A. HÌNH DẠNG PIC VÀ SỰ GIÃN PIC ................................................................................................................................. 12 1- Hình dạng pic và sự bất đối xứng của pic............................................................................................................. 12 2- Sự giãn pic (peak spreading) – mở rộng dải (band broadening) ........................................................................ 12 3- Nguyên nhân gây giãn pic ..................................................................................................................................... 13 B. LÝ THUYẾT ĐĨA ............................................................................................................................................................. 14 1- Khái niệm đĩa lý thuyết .......................................................................................................................................... 14 2- Hiệu lực cột (column efficiency) ........................................................................................................................... 14 C. LÝ THUYẾT ĐỘNG HỌC................................................................................................................................................. 15 1- Phương trình Van Deemter ................................................................................................................................... 15 2- Khuếch tán xoáy .................................................................................................................................................... 15 3- Khuếch tán dọc ...................................................................................................................................................... 15 4- Chuyển khối............................................................................................................................................................ 16 5- Nhận xét ................................................................................................................................................................. 16 VI- ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ ............................................................................................................................................................................................................................. 17 A. ĐỊNH TÍNH VÀ THỬ ĐỘ TINH KHIẾT ............................................................................................................................ 17 1- Định tính – so sánh với một chất chuẩn ............................................................................................................... 17 a. Sắc ký khai triển (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy): Rf ....................................................................................... 17 b. Sắc ký rửa giải (sắc ký cột, HPLC, GC): tR ........................................................................................................ 17 2- Thử tinh khiết......................................................................................................................................................... 17 a. B. Sắc ký khai triển (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy): Rf ....................................................................................... 17 ĐỊNH LƯỢNG ................................................................................................................................................................ 17 Trong sắc ký rửa giải..................................................................................................................................................... 17 Đo chiều cao hay diện tích pic. ..................................................................................................................................... 17 1- Phương pháp chuẩn ngoại 1 điểm ........................................................................................................................ 17 a. Phân tích bằng chiều cao của pic .................................................................................................................... 17 b. Phân tích bằng diện tích pic ............................................................................................................................ 17 2- Phương pháp chuẩn ngoại nhiều điểm (dùng đường chuẩn) ............................................................................ 17 3- Phương pháp nội chuẩn ........................................................................................................................................ 18 a. Trường hợp ứng dụng .................................................................................................................................... 18 b. Nguyên tắc ....................................................................................................................................................... 18 c. Yêu cầu của chuẩn nội ..................................................................................................................................... 18 d. Nhận xét ........................................................................................................................................................... 18 4- Phương pháp thêm chuẩn .................................................................................................................................... 18 5- Phương pháp chuẩn hóa diên tích - Phương pháp qui về 100% diện tích pic ..................................................... 18 a. Trường hợp ứng dụng .................................................................................................................................... 18 b. Yêu cầu ............................................................................................................................................................. 18 Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 20 [...]... 16 VI- ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ 17 A ĐỊNH TÍNH VÀ THỬ ĐỘ TINH KHIẾT 17 1- Định tính – so sánh với một chất chuẩn 17 a Sắc ký khai triển (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy): Rf 17 b Sắc ký rửa giải (sắc ký cột, HPLC, GC): tR 17 2- Thử tinh khiết 17 a B Sắc ký khai triển (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy): Rf ... ĐI QUA PHA TĨNH 4 1- Sắc ký khai triển .4 2- Sắc ký rửa giải 4 C THEO BẢN CHẤT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ – THEO CƠ CHẾ TÁCH 4 1- Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography) 4 2- Sắc ký phân bố (partition chromatography) 5 3- Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography) 5 4- Sắc ký rây phân tử (size exclution... 5- Sắc ký ái lực (affinity chromatography) 8 D THEO PHƯƠNG CÁCH LƯU GIỮ PHA TĨNH 9 1- Sắc ký cột (Column chromatography) 9 2- Sắc ký phẳng (planar chromatography) 9 E a Sắc ký lớp mỏng 9 b Sắc ký giấy 9 THÔNG THƯỜNG 10 1- Sắc ký cột (Column Chromatography, CC) 10 2- Sắc ký. .. phần của sắc ký 2 3- Quá trình sắc ký 3 III- a Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh 3 b Khai triển sắc ký 3 c Phát hiện các chất 3 PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 4 A THEO BẢN CHẤT VẬT LÝ CÁC PHA 4 1- Sắc ký lỏng .4 2- Sắc ký khí 4 3- Sắc ký lỏng... hiệu lực cột đạt cực đại Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 16 VI- ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ A ĐỊNH TÍNH VÀ THỬ ĐỘ TINH KHIẾT 1- Định tính – so sánh với một chất chuẩn a Sắc ký khai triển (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy): Rf  Chấm trên >=3 bản  Mỗi bản chấm 3 vết  Khai triển với >= 3 hệ dung môi khác nhau  Nếu trên cả 3 sắc đồ mẫu thử và chuẩn đều đồng nhất (về Rf, hình dạng vết, màu sắc vết trước/sau khi... 10 3- Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC) 10 4- Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC) 10 5- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 10 6Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC) hoặc UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography) 10 IV- SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ ... trước/sau khi hiện màu) → mẫu thử và mẫu chuẩn đồng nhất b Sắc ký rửa giải (sắc ký cột, HPLC, GC): tR  So sánh tR mẫu thử và mẫu chuẩn phải giống nhau  Kết hợp thêm phổ IR hoặc khối phổ 2- Thử tinh khiết a Sắc ký khai triển (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy): Rf  Chấm đậm trên >=3 bản  Khai triển với >= 3 hệ dung môi hoàn toàn khác nhau  Nếu cả 3 sắc ký đồ  vết gọn trong vùng Rf=0.3-0.75 thì mẫu thử là... Liquid Chromatography) 10 IV- SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ 10 A SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ 10 sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao 10 Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 19 V- LÝ THUYẾT ĐỘNG HỌC TRONG SẮC KÝ ĐỒ 12 A HÌNH DẠNG PIC VÀ SỰ GIÃN PIC 12 1- Hình dạng pic và sự bất đối xứng... Hình 2 mô tả 2 cách làm tăng độ phân giải 2 chất trong hỗn hợp: Sắc ký đồ a, 2 pic xen phủ nhau: + ta thay đổi điều kiện sắc ký  thay đổi tốc dộ di chuyển của chất tan (tăng tốc độ chất I và giảm tốc độ chất II) để tách riêng 2 pic (sắc ký đồ b) + giảm sự mở rộng dải (giảm sự giãn pic) để tách riêng 2 pic: sắc ký đồ c   Để tách sắc ký được tốt, cần quan tâm đến tốc độ di chuyển của chất tan và hiện... giãn pic Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 11 V- LÝ THUYẾT ĐỘNG HỌC TRONG SẮC KÝ ĐỒ  Sự giãn pic (sự mở rộng dải) được nghiên cứu qua lý thuyết đĩa và lý thuyết động học  Sắc ký cột A HÌNH DẠNG PIC VÀ SỰ GIÃN PIC 1- Hình dạng pic và sự bất đối xứng của pic  Chất tan di chuyển theo pha động qua pha tĩnh sẽ mở rộng dải và pic trên sắc ký đồ thường trở nên không đối xứng  Diện tích đỉnh (phần dưới pic) ... 6- Sắc ký lỏng siêu hiệu (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC) UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography) IV- SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ A SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ sắc ký lớp mỏng sắc. .. động 1- Sắc ký cột (Column Chromatography, CC) 2- Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC) 3- Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC) 4- Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC) 5- Sắc ký lỏng... pha tĩnh  Sắc ký đồ thực pha tĩnh  Sắc ký rửa giải thực cột C THEO BẢN CHẤT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ – THEO CƠ CHẾ TÁCH 1- Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography)  Là kỹ thuật sắc ký phân tách