CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH – CHIẾT I- CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH A. ĐỊNH NGHĨA-PHÂN LOẠI 1- Định nghĩa 2- Phân loại  Các phương pháp tách là các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp → hỗn hợp đơn giản → từng chất.  Phương pháp được thực hiện dựa trên sự khác biệt về:  tính chất hóa học,  tính chất vật lý + kích thước, + mật độ, + hình dạng, + ái lực hóa học giữa các thành phần trong 1 hỗn hợp. + khối lượng,  Trong ngành Dược, các đối tượng phân tích thường là những hỗn hợp phức tạp: cây thuốc, thuốc, dịch cơ thể,…. → nhiều chất gây nhiễu → thường phải qua giai đoạn tách để loại để lấy riêng chất cần định lượng.  Ví dụ:  Xác định hàm lượng tinh dầu trong vỏ bưởi,  Đinh lượng paracetamol trong nước tiểu, … a. Cơ chế tách dựa vào -i- Kích thước -ii- Khối lượng và mật độ -iii- Biến đổi mộ t) Vật lý trạng thái hai) Hóa học -iv- Tỉ lệ giữa các pha Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực b. Phương pháp tách  Lọc  Thẩm phân  Sắc ký rây phân tử  Ly tâm  Chưng cất  Thăng hoa  Kết tinh lại  Kết tủa  Bay hơi  Chiết  Sắc ký 1 B. QUÁ TRÌNH TÁCH DỰA VÀO KÍCH THƯỚC  Dựa vào vật liệu có lỗ mà qua đó chất cần phân tích hay chất nhiễu đi qua. 1- Phương pháp lọc (filtration)  Tách pha lỏng khỏi pha rắn.  Giữ tạp lại giấy lọc.  Tách chất phân tích dạng kết tủa khỏi dung dịch. a. Chất liệu dùng để lọc -i- Khái niệm  Là những vật liệu dạng sợi hay dạng chất xốp dùng giữ chất rắn lại và cho chất lỏng đi qua. -ii- Các vật liệu lọc mộ t) Chất vô cơ  Dioxid silic  Amiang  Thủy tinh (phễu lọc thủy tinh xốp/bông thủy tinh):  Chịu được acid và chất oxy hóa  Không chịu kiềm mạnh.  Dễ vỡ hai)  Chất hữu cơ Cellulose (giấy lọc):  Tan trong kiềm.  Hấp thu 1 số chất.  Không chịu chất oxy hóa mạnh.      Màng polymer: là màng mỏng của hợp chất cao phân tử có lỗ rất nhỏ. Có thể giữ cả vi khuẩn. Không chịu được một số dung môi hữu cơ. Ví dụ: màng lọc cellulose acetat (0.45 hay 0.22 m) lọc dung dịch mẫu trước khi phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. b. Các kỹ thuật lọc -i- Lọc ở áp suất thường  Phễu thủy tinh  Giấy lọc. -ii- Lọc ở áp suất giảm (lọc chân không)  Phễu lọc thủy tinh xốp.  Cốc lọc thủy tinh xốp.  Dịch lọc hứng vào bình nón có vòi hút nối với bơm chân không. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 2 2-      Phương pháp thẩm phân (dialysis) Sự dụng màng bán thấm có cấu tạo từ cellulose: lỗ hạt 1-5 nm. Cho các phân tử nhỏ và trung bình đi qua. Giữ lại các phân tử lớn. Chất tan từ dung dịch trong pha A thấm qua màng sang pha B cho tới khi nồng độ của các chất đó trong 2 pha bằng nhau.  Ứng dụng: tách protein, hormone, enzyme (kích thước lớn) ra khỏi dịch sinh học có chứa các chất muối khoáng hòa tan (kích thước nhỏ, qua được màng thẩm tích) 3- Phương pháp sắc ký rây phân tử - sắc ký thẩm thấu gel (size-exclusion chromatography)  Là kỹ thuật tách các chất tan dựa vào kích thước khác nhau của phân tử chất tan khi đi qua lỗ trống các gel.  Các phân tử có kích thước nhỏ bị giữ lại trong các lỗ trống các gel nên chuyển động chậm hơn các phân tử có kích thước lớn hơn (không bị giữ lại nên chuyển động nhanh hơn) khi đi qua cột.  Các chất tan trong pha động khi đi qua gel này bằng kỹ thuật thẩm thấu.  Dùng trong sinh hóa, tách các phân tử có kích thước lớn: protein, các carbohydrate, … C. PHƯƠNG PHÁP LY TÂM - QUÁ TRÌNH TÁCH DỰA VÀO KHỐI LƯỢNG VÀ TỶ TRỌNG (CENTRIFUGATION)   Dùng sức ly tâm (lực ly tâm) để làm lắng tủa. Lực ly tâm càng lớn, tốc độ lắng càng cao. F=42n2mR. F=1.12*R* 𝟐 𝒏 𝟏𝟎𝟎𝟎  n: số vòng quay trong một phút (rpm)  m: khối lượng tiểu phân chất kết tủa.  R: bán kính vòng quay hay cánh tay đòn.  Tăng tốc độ lắng, tăng số vòng quay n. Thành phần Tế bào có nhân Màng tế bào Ty thể Tế bào vi khuẩn Tiêu bào Màng vi khuẩn Ribosome Lực ly tâm (g) 1000 4000 Số vòng quay (n) 7 128 14 257 Thời gian (phút) 5 10 15 000 27 610 20 30 000 39 046 30 100 000 71 289 180  Ví dụ: tách hỗn hợp protein, AND, RNA khi mật độ của chúng khác nhau. Phân tử có mật độ càng lớn càng lắng sâu xuống ống ly tâm. (mật độ: ARN>AND>protein). Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 3 D. QUÁ TRÌNH TÁCH DỰA VÀO BIẾN ĐỔI TRẠNG THÁI 1-   Trạng thái vật lý a. Phương pháp cất Lỏng  hơi. Dựa trên sự khác biệt về nhiệt độ sôi.  b. Phương pháp thăng hoa  Rắn  hơi.  Phân lập acid amin từ sò hóa thạch và trầm tích biển sâu.  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 4 c. Phương pháp kết tinh lại  Tinh chế chất rắn.  Dựa trên sự khác nhau rõ rệt về độ tan của các chất trong một dung môi ở các nhiệt độ khác nhau  Chất rắn được hòa tan với lượng dung môi nóng tối thiểu mà ở đó độ tan của chúng ở 2 trạng thái nóng & lạnh khác nhau đáng kể  Quá trình làm lạnh sẽ giúp xuất hiện những mầm tinh thể kết tinh.  Chất rắn tinh khiết sau khi kết tinh lọc  tách ra khỏi hỗn hợprửa sạch lại loại bỏ tạp chất hòa tansấy khô loại dung môi.  Nguyên tắc chọn dung môi:  Không tương tác hóa học với chất cần tinh chế ở cả điều kiện nóng và lạnh.  Hòa tan rất ít chất cần tinh chế khi làm lạnh.  Chất phân cực dễ tan trong dung môi phân cực và ngược lại.  ứng dụng: trong tổng hợp hóa dược tinh chế làm sạch mẫu sau khi tổng hợp aspirin, acetanilide, acid benzoic, …  2 Trạng thái hóa học Tách ra bằng phản ứng hóa học tạo chất dễ bay hơi hay kết tủa, … Chất phân tích/ Tạp chất CO32NH4+ SO32S2-  Phản ứng hóa học CO32-+2H3O+CO2+2H2O NH4++OH-NH3+H2O SO32-+2H3O+SO2+3H2O S2-+2H3O+H2S+2H2O Ví dụ: tách các chất bằng phản ứng tạo thành kết tủa  Định lượng Cu trong hỗn hợp đồng thau có lẫn tạp chất là Sn.  Hòa tan mẫu với acid mạnh, SnO2 được loại khỏi hỗn hợp bằng cách lọc. E. QUÁ TRÌNH TÁCH DỰA VÀO TỶ LỆ GIỮA CÁC PHA 1- Các phương pháp chiết (extraction)  Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn/hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.  Cơ chế tách: bằng chuyển pha dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha Avà B không hòa tan lẫn được vào nhau.  Thường gặp: chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung môi hữu cơ  Mục đích: tách riêng từng phần hay hoàn toàn chất cần nghiên cứu ra khỏi các thành phần gây trở ngại có trong mẫu  xác định cấu trúc,  định lượng, ...  định tính  vai trò quan trọng trong kiểm nghiệm  phân loại:  chiết lỏng-lỏng  chiết lỏng-rắn    chiết rắn-lỏng  chiết khí rắn dung môi có tỷ trọng nhỏ hơn nước: ether, benzene, hydrocarbur, … dung môi có tỷ trọng lớn hơn nước: chloroform, tetrachloride carbon, dichloroetan, … Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 5 2- Phương pháp sắc ký  Sắc ký là một quá trình trong đó các chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học của các chất này trong một hệ thống >=2 pha.  Pha động:  chuyển động một cách liên tục và theo một hướng nhất định.  Các chất riêng biệt thể hiện linh độ khác nhau về: + sự phân bố, + điện tích, + độ hòa tan, + sự hấp phụ, + kích thước phân tử, + áp suất hơi.  Chỉ có các phân tử pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký.  Các chất khác nhau có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hế lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp thụ và phản hấp thụ.  Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất thương tác yếu hơn pha này. II- CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT A. CHIẾT LỎNG-LỎNG 1- Một số thông số sử dụng trong chiết lỏng-lỏng a. Hệ số phân bố K  Lắc dung dịch A chứa chất tan S với dung môi B (dung môi chiết) thì khi quá trình phân bố S vào 2 pha trên đã đạt tới trạng thái cân bằng có Hệ số phân bố K  CB CA  CA, CB lần lượt là nồng độ S trong pha A và pha B ở trạng thái cân bằng.  K: + Là hằng số ở một nhiệt độ xác định và trong những điều kiện lý tưởng + Đặc trưng cho một chất tan và một cặp dung môi xác định A và B + Phụ thuộc vào nhiệt độ, áp suất, tính chất của chất tan và dung môi + K càng lớn, quá trình chiết càng hiệu quả  VD: Fe3+ Pha A Pha B K Ether etylic nước + HF 0,001 Ether etylic nước + HCl 99,0  Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 6  Giả sử chất tan được phân bố giữa hai pha 𝐾  S1 (pha 1) S2 (pha 2) [𝑆]1  K= [𝑆]2  Pha 1 (thể tích V1) có chứa m mol chất tan S được chiết bằng pha 2 (thể tích V2) 𝑚 ∗𝑞 1  Gọi q1 là % S còn lại trong pha 1, nồng độ S trong pha 1: 𝑉1  (1-q1) là % S được chiết sang pha 2, nồng độ S trong pha 2: (1 q )  m 1 V V 2 1  K q  q m 1 V  KV 1 1 2 V 1  (1 q )  m 1 V 2 Nếu loại pha 2 cũ đi và thay bằng pha 2 mới và lắc lại với pha 1, phần chất tan còn lại sau   V V 1 q  1  khi cân bằng (Tiến hành chiết lần 2): q  2 V  KV 1  (V  KV )  1 2 2   1 n   V   1  Sau n lần chiết với V2, S còn lại trong pha 1: qn     V  KV   2   1 2  q luôn luôn nhỏ hơn 1, sau n lần chiết nào đấy tức là qn sẽ vô cùng nhỏ và có thể coi như bằng 0  Ví dụ: Chất tan A trong nước - benzen có K = 3, có nồng độ 0,01 M trong 100 ml dung dịch nước  Chiết một lần với 500 ml benzen: q1  100  0,062  6,2% 100  3  500 5   100  Chiết 5 lần mỗi lần với 100 ml dung môi: q5     0,1%  100  3 100  Nhận xét: “Chiết nhiều lần với lượng nhỏ tốt hơn chiết một lần với lượng lớn”  Bài toán:  Chất B có hệ số phân bố giữa nước/ete là 2. Ban đầu có 200ml dung dịch B/nước.  Hỏi phải chiết bao nhiêu lần, mỗi lần 100ml ete để lấy được hết B ra? (xem chiết kiệt khi H = 99.9%) Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 7 b. Hệ số phân bố biểu kiến KD – hệ số phân chia D  Điều kiện không lý tưởng: K D   CB C A  CB, CA: tổng nồng độ các dạng khác nhau của chất tan trong B và A  KD: không bắt buộc là hằng số  B là một base hữu cơ:  BH+ chỉ tồn tại trong pha nước BH+  Pha 1: pha nước  Pha 2: pha DMHC  Khi lắc 2 pha với nhau và khi cân bằng: D   Ta có: K  B + H+ [ B]2 [ B]1  [ BH  ]1 [ B]  [ H  ] [ B]1  [ H  ] [ B ]2 ===>[B]2 = K[B]1 và K a   [ BH  ] [ BH  ]1 [ B]1 K  Ka Ka  [H  ] Hệ số phân chia phụ thuộc vào pH HA là một acid và A không tồn tại trong dung môi hữu cơ. Pha 1: nước Pha 2: DMHC HA = A+H+ [ HA]2 D  [ A ]1  [ HA]1  D       [ A ]  [ H  ] Kx[ H  ] [ HA]2 [HA]2=K[HA]1 VÀ K a  D  hệ số phân chia phụ thuộc pH [ HA]1 Ka  [H  ] [ HA]1  Ví dụ: Dung dịch nước của một amin 0,010 M có K = 3, Kb = 1 x 10-5, 50 ml dung dịch trên được chiết bằng 100 ml dung môi  Lượng amin chiết vào pha hữu cơ ? (3,0 1,0 109 )  Ở pH = 10,00 D   2,73 , (1,0 109  1,0 1010 ) 50 q  0,15  15% (50  2,73 100)  K  Ở pH = 8,00 D  q  D (3,0 1,0 109 )  0,273 , (1,0 109  1,0 108 ) 50  0,65  65% (50  0,273 100) K  Ka ; Ka  [H  ] qn   V   1    V  DV   2   1 n  So sánh: pH Nồng độ amin còn lại trong pha nước 10,00 0,0015 M 8,00 0,0065 M + ở pH 10 (tồn tại dạng [B] dễ bị chiết vào dung môi hữu cơ) lượng amin chiết được vào pha hữu cơ nhiều hơn ở pH 8 (tồn tại dạng [BH+] nên được giữ lại pha nước). Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 8 c. Hiệu suất chiết – độ chiết – hệ số chiết  R Q B QAO  QB: toàn bộ lượng QB của S chiết được vào pha hữu cơ  QAO: lượng chất tan S trong dung dịch nước ban đầu 2- Các phương pháp chiết lỏng-lỏng a. Chiết đơn:  hiệu suất chiết thấp  Hiệu suất chiết: R  1  1 1 k' với k '  K D 𝑉 VB hay 𝑘 ′ = 𝐾𝑃 𝐴 𝑉𝐵 VA  Trong phòng thí nghiệm, tiến hành chiết trong những bình gạn, lắc bằng tay hay lắc bằng máy. b. Chiết lặp  hiệu suất chiết cao hơn nhưng tốn nhiều thời gian, công sức  hệ số phân bố không đủ lớn, phải chiết nhiều lần.  sau khi chiết một lần, trong dung dịch còn lại một lượng chất tan đáng kể thì thường cho vào một lượng dung môi chiết mới và chiết tiếp.  Chiết n lần, VB ml dung môi/lần: R  1  V 1 với k '  K D B n VA (1  k ' )  Chiết n lần, VB ml dung môi/n lần: R  1  1  K D VB  1  n V  A  n  Phòng thí nghiệm: chiết gián đoạn hay chiết liên tục  Dịch chiết được đun sôi liên tục để chu hồi dung môi chiết B và cho dung môi thu hồi liên tục chảy vào dung dịch A cần chiết.  Tiết kiệm dung môi nhưng do dịch chiết bị đun nóng liên tục có thể làm biến đổi chất tan S. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 9 c. Chiết ngược dòng  hiệu suất chiết rất cao, tách được nhiều chất  -i- Nguyên tắc  dung môi chiết và dung dịch chiết chạy ngược chiều và tiếp xúc với nhau chặt chẽ  quá trình xảy ra liên tục -ii- Mục tiêu  tách hai hay nhiều chất tan bằng một loạt sự phân chia giữa hai pha lỏng – lỏng -iii- Phân loại mộ t) Chiết gián đoạn qua nhiều bước  Giả sử có hai chất tan A và B trong hỗn hợp AB đang tồn tại ở pha dưới L (lower phase), được chiết bằng pha trên U (upper phase)  Ban đầu:  [A] = 1 mM  [B] = 1 mM  DA = [A]U/[A]L = 4, DB = [B]U/[B]L = 1.  Điều kiện cần thiết cho sự tách riêng là hai chất phải có D hoàn toàn khác nhau Böôùc 0: Böôùc 1: Böôùc 2: Pha A (mM) B (mM) U0 0,8 0,5 OÁng 0 L0 0,2 0,5 U1 (môùi) 0,16 0,25 OÁng 0 L0 0,04 0,25 U0 0,64 0,25 OÁng 1 L1 (môùi) 0,16 0,25 Pha U0 ñöôïc chuyeån vaøo oáng coù L2 môùi Pha U1 ñöôïc chuyeån vaøo oáng coù L1 cuõ Pha U2 môùi ñöôïc ñoå leân pha L0 cuõ Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 10   Sau khi cân bằng ở mỗi ống sự phân chia theo DA = 4, DB = 1 Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 11  Sau 5 bước gộp các ống 0, 1 và 2 vào lọ I và các ống 4 và 5 vào lọ II. Ta có:   Mức độ tinh khiết của A: [A]/([A] + [B]) và B: [B]/([A] + [B])  Nhận xét: A càng ngày càng cách xa B khi số bước càng tăng hai)  Chiết liên tục qua nhiều bước Sơ đồ minh họa chiết ngược dòng liên tục từ sơ đồ chiết gián đoạn qua nhiều bước  Với: + Pha trên U di động dọc theo pha dưới L bất động + Pha trên gọi là pha động MP (Mobile Phase) + Pha dưới gọi là pha tĩnh SP (Stationary Phase)  Khi pha trên di động dọc theo pha dưới: 𝑀𝑃 𝑙𝑢ô𝑛 𝑙𝑢ô𝑛 𝑡𝑖ế𝑝 𝑥ú𝑐 𝑣ớ𝑖 𝑆𝑃 𝑚ớ𝑖. 𝑆𝑃 𝑙𝑢ô𝑛 𝑙𝑢ô𝑛 đượ𝑐 𝑡𝑖ế𝑝 𝑥ú𝑐 𝑣ớ𝑖 𝑀𝑃 𝑚ớ𝑖 → 2 𝑑ò𝑛𝑔 𝑛à𝑦 𝑐𝑕𝑢𝑦ể𝑛 độ𝑛𝑔 𝑛𝑔ượ𝑐 𝑐𝑕𝑖ề𝑢 𝑛𝑕𝑎𝑢 → 𝑐𝑕ấ𝑡 𝑡𝑎𝑛 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑀𝑃 đượ𝑐 𝑝𝑕â𝑛 𝑐𝑕𝑖𝑎 𝑚ộ𝑡 𝑐á𝑐𝑕 𝑙𝑖ê𝑛 𝑡ụ𝑐 𝑔𝑖ữ𝑎 𝑕𝑎𝑖 𝑝𝑕𝑎.  2 chất tan có hệ số phân chia khác nhau giữa 2 pha sẽ dẫn tới linh độ của chúng trong hệ khác nhau  có chất dịch chuyển với vận tốc nhanh có D lớn và có chất dịch chuyển vối vận tốc chậm hơn  chúng ngày càng xa cách trong quá trình phân chia ngược dòng.  Giả sử A được chiết bằng phân chia ngược dòng theo sơ đồ trên. Phân đoạn A ở pha trên là p% và ở pha dưới là q%. Ta có p + q = 1 Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 12    Phân đoạn A ở mỗi ống sau mỗi bước di chuyển của pha động Böôùc chieát n Soá oáng r 2 0 1 1 q p 2 2 q 2pq p2 3 q3 3pq2 3p2q 4 q4 4pq3 6p2q2 .... ..... ..... .....  Nhận xét: Nhị thức (p + q)n khai triển Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 3 4 p3 4p3q ..... p4 .... 13  Phân đoạn f (fraction) trong ống r sau bước chiết n: f n! pr qnr (n  r)!r!  Với n lớn, ống chứa lượng chất A cao nhất (rmax): rmax # np  Ví dụ: tính lượng chất tan A trong ống 4 sau 5 bước chiết (n=5). 5! 1 + A có D=4, p=4/5, q=1/5: 𝑓𝐴 = (4/5)4 ( 5−4 = 0.40960. + B có 𝑓𝐵 = 5! 1 (1/2)4 ( )5−4 5−4 !4! 2 5−4 !4! 5) = 0.15625.  Ví dụ: + A có p = 4/5, sau 100 bước chiết ta có rmax =100 x 4/5 =80: ống 80 + B có p = ½, sau 100 bước chiết ta có rmax = 100 x 1/2 = 50: ống 50  Độ rộng của dải và năng suất phân giải  Tách A và B bằng phân chia ngược dòng qua 100 bước chiết  Với A ứng với ống thứ 80 là cực đại còn các ống ở về 2 phía sẽ cho f giảm dần, hình thành độ rộng của dải.  Với B cũng vậy, ống thứ 50 cực đại.   Nhận xét: độ rộng của dải cũng như năng suất phân giải phụ thuộc vào: + Hệ số phân chia của chất tan trong hệ + Số bước chiết chiết tách (số đĩa lý thuyết trong sắc ký). Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 14 3- Ứng dụng của chiết lỏng-lỏng a. Chiết bằng dung môi hữu cơ  Nhiều phân tử CHC và một số ít chất VC có độ tan trong dung môi hữu cơ lớn gấp nhiều lần độ tan trong nước  Các yếu tố ảnh hưởng:  Cấu trúc phân tử  Thuốc thử tạo phức mang điện tích: Au, Fe trong HBr tạo phức tan trong ether etylic + Khi chiết phân tử I2 từ dung dịch nước (dung dịch I3-) bằng CCl4, nồng độ I- càng cao, hiệu suất chiết I2 càng giảm. + Các kim loại như Au, Fe, … trong dung dịch HBr sẽ tạo thành acid phức kim loại như HAuBr4, HFeBr4, … có thể chiết bằng ether ethylic.  pH: anion và cation tan trong nước  không chiết được bằng dung môi hữu cơ nhưng dạng phân tử trung hòa của chúng thì chiết được. ảnh hưởng của pH rất mạnh khi chất tan là acid hay base. + Xà phòng/pH thấp tạo acid tan trong DMHC + Muối alcaloid/pH cao chuyển alcaloid base tan trong DMHC b. Chiết với Chelator kim loại  Ion kim loại/nước + chất phối trí (ligand) hữu cơ chọn lọc phức  chiết vào DMHC  Chất phối trí (ligand) hay dùng:   Các phản ứng:  HL H+ + L nL- + Mn+ MLn  MLn (Nước) MLn (Hữu cơ)  Trong đó HL là ligand, Mn+ là ion kim loại.  Hệ số phân chia D: D  [ MLn ] (Höõu cô ) [ MLn ] (Pha nöôùc )  Hệ số này phụ thuộc vào  nồng độ của ligand  pH của dung dịch Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 15  Ví dụ: Định lượng Pb2+ trong nước bằng phản ứng tạo phức với dithizone   + Dithizone trong ống C tạo phức đỏ với Pb++ và được chiết vào lớp hexan. + Dithizone trong ống B tạo phức đỏ với các ion kim loại trong nước máy và đi vào lớp hexan.  Có thể phá vỡ cân bằng trên bằng cách: + Thêm vào ống C vài giọt HCl 1M và lắc: lớp hexan có màu xanh lam do HCl đã giữ Pb++ trong môi trường nước. + Thêm vào ống B vài giọt EDTA 0.05M và lắc: lớp hexan có màu xanh lam do EDTA là ligand mạnh hơn. c. Chiết với cặp ion  Base (hay acid) + acid (hay base)/pha nước  cặp ion tan trong DMHC  A- + BH+ A-BH+  [A-BH+] (nước) [A-BH+] (hữu cơ)  A-BH+: cặp ion tạo thành +  A hoặc BH : tác nhân tạo cặp ion (ion pair agent, IPA)  Cơ sở của phương pháp  chiết đo quang,  acid màu,  acid màu-base hữu cơ  Ứng dụng trong kiểm nghiệm  Chiết và đo quang: chlorpheniramin, loperamid, promethazine  Chuẩn độ tạo cặp ion: dung dịch chuẩn độ là chất diện hoạt anion dùng định lượng alcaloid, chỉ thị vàng methyl, môi trường chloroform  Định lượng alkaloid, phenothiazin, … ở dạng cation dựa trên phản ứng tạo cặp ion với lauryl sulfat (LS) hay dioctylsulfosuccinate (DOSS) với chỉ thị vàng methyl/chloroform chuyển sang đỏ. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 16 -i- Các IPA thường dùng mộ t)  acid perchloric, acid sulfuric, acid phosphoric, acid hydrochloric,…. hai)       Các hợp chất sulfonic Heptansulfonat natri, laurylsulfat natri Helianthine, tropeoline,… Xanh bromothymol, xanh bromophenol, xanh bromocresol,… Dẫn chất sulfonic của naphthalen Dẫn chất sulfonic của fluorescein ba)  Các acid mạnh Các ammonium tetrabutylammonium (C4H9)4N+ 𝐼𝑃𝐴 thuốc ion ion pair  chiết tách. -ii- Các ứng dụng trong kiểm nghiệm mộ t) Chiết và đo quang  Cho ion cần định lượng tạo với một cặp ion trái dấu có màu rồi chiết vào dung môi hữu cơ và đem đo quang.  Một số ion (alkaloid, phenothiazin) có hấp thụ tử ngoại nên có thể chiết vào dung môi hữu cơ dưới dạng cặp ion và đem đo mật độ quang. hai) Chuẩn tạo cặp ion  Dùng phương pháp này định lượng các anion là chất diện hoạt (dùng làm chất nhủ hóa trong dược phẩm và mỹ phẩm).  Định lượng base hữu cơ quan trọng trong ngành dược: Định lượng alkaloid, phenothiazin, … ở dạng cation dựa trên phản ứng tạo cặp ion với lauryl sulfat (LS) hay dioctylsulfosuccinate (DOSS) với chỉ thị vàng methyl/chloroform chuyển sang đỏ.  Ví dụ:  Định lượng chlorpheniramin meleat trong viên Padol forte bằng phép chiết đo quang + chlorpheniramin tạo cặp ion với helianthine ở pH 4.4-4.6 + chiết vào chloroform. + Dịch chiết chloroform màu vàng và cặp ion trong chloroform có độ hấp thụ ở 410nm. + Khoảng nồng độ tuân theo địnhl luật Lambert-Beer từ 2-10g/ml. + Việc đo nồng độ hấp thụ của cặp ion trong chloroform phép định lượng chlorpheniramin. + Sự có mặt của paracetamol không trở ngại cho phép định lượng.  Định lượng promethazine trong siro Promethazine bằng natri laurylsulfat trong hệ 2 pha nước-chloroform, + chỉ thị Jaune methyl. + Natri laurylsulfat là chất chuẩn độ. + Promethazine là chất cần chuẩn độ. + Thực hiện như phương pháp chuẩn độ thể tích thong thường. + Cặp ion hình thành được chiết vào pha hữu cơ. + Kết thúc phản ứng, natri laurylsulfat thừa làm dung dịch có màu hồng. Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 17 B. CHIẾT PHA RẮN – SOLID PHASE EXTRACTION, SPE  Đây là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng một chất rắn, sau dó rửa giải bằng dung môi thích hợp.  Tinh chế dịch chiết trong cân bằng chiết lỏng – lỏng  SPE được cài đặt vào hệ thống GC, MS hoặc HPLC-MS tạo thành hệ phân tích hoàn chỉnh ghép nối kỹ thuật tinh chế và phân tích. 1- Các loại pha rắn  Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo ra pha liên kết và còn sử dụng cả pha không liên kết. a. Pha liên kết Pha tĩnh Bản chất hóa học Pha đảo Pha thuận Nhựa trao đổi ion Đặc điểm  Lưu giữ chất phân tích kém phân cực trên cột.  Dung môi hòa tan mẫu có tính thân nước. Octadecyl (C18) -(CH2)17CH3 Octyl (C8) Phenyl Amino Diol Cyanopropyl Trao đổi cation (SCX) Trao đổi anion (SAX) -(CH2)7CH3 -CH2-(CH2)2-C6H5  Dung môi hòa tan mẫu có -CH2-(CH2)2-NH2 thể là dung môi hữu cơ hay -(CH2)3-OCH2-CHOH-CH2OH dung dịch có tính thân nước -CH2-(CH2)2-CN  Lưu giữ chất phân tích -R-C6H4-SO3H Dẫn chất amoni bậc 4: R4N+X- trên pha rắn là do lực hút tĩnh điện.[acid amin, protein] b. Pha không liên kết  Ngoài pha liên kết, trong SPE pha thuận còn dùng pha không liên kết. Tên pha Đặc điểm Silicagel - SiOH Hạt 40 m Silicagel hoạt tính cao Hạt 55 - 105 m, lỗ xốp 125 A Florisil MgSiO Hạt 50 - 200 m, lỗ xốp 60 A 3 0 0 Alumina trung tính Hạt 25 m, pH = 7,5 Alumina acid Hạt 50 – 300 m, pH = 4 - 5 Alumina base Hạt 50 – 300 m, pH = 9 - 10, lỗ xốp 120 A Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 0 18  Đặc điểm cột SPE Ñaëc ñieåm Coät SPE Poly tetrafluoroethylen (PTFE), poly ethylen (PE), poly propylen (PP) Vaät lieäu taïo coät    Hình daïng haït Khoâng ñeàu Kích thöôùc haït 40 m Soá ñóa lyù thuyeát < 100 Cô cheá taùch Löu giöõ vaø röûa giaûi keá tieáp nhau Söû duïng Duøng moät laàn 2- Cơ chế lưu giữ, rửa giải  Tùy tính chất pha rắn, cơ chế lưu giữ và rửa giải khác nhau. Rửa giải Lưu giữ a. Pha thuận (normal phase SPE)  Hấp thụ các chất phân tích từ dung môi không phân cực lên bề mặt pha rắn phân cực.  Lưu giữ chất phân tích trên pha thuận bắt nguồn từ tương tác phân cực:  Liên kết hydro,  liên kết -   tương tác lưỡng cực – lưỡng cực  Pha không liên kết:  Chất phân tích có tính base được lưu giữ mạnh trên bề mặt có tính acid và ngược lại  Các alcol, aldehyd, dẫn chất halogen hòa tan trong dung môi không phân cực bị hấp thụ mạnh trên silicagel  Sử dụng dung môi phân cực phá vỡ liên kết hydro giữa nhòm chức của chất phân tích và bề mặt chất hấp phụ.  Dung môi phân cực hơn hỗn hợp gốc để rửa giải.  methanol được dùng cho nhiều trường hợp Hóa phân tích 2 b. Pha đảo (reversed phase SPE) c. Trao đổi ion (Exchange SPE)  Cơ chế tương tác: phân bố.  Lực hút tĩnh điện giữa  Tương tác giữa chất phân hai ion tích điện trái dấu. tích và pha liên kết là lực Van der Waals năng lượng thấp (5kcal/mol).  Sự lưu giữ các chất phân tích từ dung dịch phân cực phụ thuôc vào lực hấp dẫn giữa liên kết carbon-hydro của chất phân tích và nhóm chức trên bề mặt pha tĩnh.  Chất phân tích càng sơ nước càng có khuynh hướng nằm lại trên pha liên kết  chọn dung môi phân cực  Cột anionit: NaOH 0,1M đủ để phá vở liên kết do lực  Cột cationit: HCl 0,1M Van der Waals.  Pha liên kết silica  Ví dụ: MeOH, MeCN, ethyl  Rửa giải anion hữu cơ: acetat hỗn hợp NaOH 0,1M –  Chất phân tích rất sơ MeCN (1:1) nước: rửa giải bằng hỗn hợp  Rửa giải acid hữu cơ: ethyl acetat : methylen clorid đệm phosphat – MeOH (1:1) (1:1) Trần Trung Trực 19 3- Thực hành chiết pha rắn a. Chọn pha rắn  Các dụng cụ chiết pha rắn:  Đĩa (disk)  ống (cartridge)  bơm (syringe)  lượng pha rắn dao động từ 50mg-10g ứng với thể tích nền từ 100-60ml.  chất phân tích không quá 5% lượng chất rắn nạp pha tĩnh là chiết tốt nhất.  thường gặp:  lượng pha rắn: 500mg.  thể tích nền tối thiểu: 1-3ml.  thể tích ống SPE: 3ml.  lượng chất phân tích: 25-100mg. b. Quy trình chiết -iBốn bước của quy trình chiết mộ t) Hoạt hóa cột  Xử lý cột bằng dung môi hoặc dung dịch đệm thích hợp để chuyển pha rắn sang trạng thái có thể lưu giữ chất phân tích trong mẫu.  Làm cho chất cần phân tích dễ dàng tương tác với bề mặt pha tĩnh của cột và loại một số tạp chất còn lại trên cột.  Hoạt hóa cột bằng chính dung môi rửa giải.  Nhựa trao đổi hoạt hóa bằng đệm. hai) Nạp mẫu  Lượng mẫu nạp [...]... 4 c Phương pháp kết tinh lại 5 Trạng thái hóa học 5 Q TRÌNH TÁCH DỰA VÀO TỶ LỆ GIỮA CÁC PHA 5 1- Các phương pháp chiết (extraction) 5 2- Phương pháp sắc ký 6 Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 28  II- CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 6 A CHIẾT LỎNG-LỎNG 6 1- Một số thơng số sử dụng trong chiết lỏng-lỏng... 2 2- Phương pháp thẩm phân (dialysis) 3 3- Phương pháp sắc ký rây phân tử - sắc ký thẩm thấu gel (size-exclusion chromatography) 3 C PHƯƠNG PHÁP LY TÂM - Q TRÌNH TÁCH DỰA VÀO KHỐI LƯỢNG VÀ TỶ TRỌNG (CENTRIFUGATION) 3 D Q TRÌNH TÁCH DỰA VÀO BIẾN ĐỔI TRẠNG THÁI 4 1- 2E Trạng thái vật lý 4 a Phương pháp cất 4 b Phương pháp thăng hoa... 8 c Hiệu suất chiết – độ chiết – hệ số chiết 9 2- Các phương pháp chiết lỏng-lỏng 9 a Chiết đơn: 9 b Chiết lặp 9 c Chiết ngược dòng 10 -i- Ngun tắc 10 -ii- Mục tiêu 10 -iii- Phân loại 10 mợt) Chiết gián đoạn qua nhiều bước 10 hai) 3- Chiết liên tục qua nhiều... MEMBRANE EXTRACTION) 1- Ngun tắc và ứng dụng a Chiết màng lỏng 3 pha – Phương pháp chiết hỗ trợ màng lỏng (nước/dung mơi hữu cơ/nước) Ngun tắc Ứng dụng 2     b Chiết màng lỏng 2 pha – Phương pháp chiết màng vi xốp lỏng-lỏng (nước/dung mơi hữu cơ)  Chiết phân tích được chiết từ  Chất phân tích trong dung dịch dung dịch nước qua lớp dung mơi nước được chiết vào dung mơi hữu hữu cơ, lớp này được cố... Ứng dụng của chiết lỏng-lỏng 15 a Chiết bằng dung mơi hữu cơ 15 b Chiết với Chelator kim loại 15 c Chiết với cặp ion 16 -i- Các IPA thường dùng 17 mợt) Các acid mạnh 17 hai) Các hợp chất sulfonic 17 ba) Các ammonium 17 -ii- Các ứng dụng trong kiểm nghiệm 17 mợt) Chiết và đo... 24 b Thiết bị SPME 25 c Thực hành chiết SPME 25 CHIẾT MÀNG LỎNG (LIQUID MEMBRANE EXTRACTION) 26 1- Ngun tắc và ứng dụng 26 a Chiết màng lỏng 3 pha - Phương pháp chiết hỗ trợ màng lỏng 26 (nước/dung mơi hữu cơ/nước) 26 b Chiết màng lỏng 2 pha - Phương pháp chiết màng vi xốp lỏng-lỏng 26 (nước/dung mơi hữu cơ)... ion ion pair  chiết tách -ii- Các ứng dụng trong kiểm nghiệm mợ t) Chiết và đo quang  Cho ion cần định lượng tạo với một cặp ion trái dấu có màu rồi chiết vào dung mơi hữu cơ và đem đo quang  Một số ion (alkaloid, phenothiazin) có hấp thụ tử ngoại nên có thể chiết vào dung mơi hữu cơ dưới dạng cặp ion và đem đo mật độ quang hai) Chuẩn tạo cặp ion  Dùng phương pháp này định lượng các anion là chất... thuật điều ché dễ dàng hơn, ít mất thời gian hơn Hóa phân tích 2 Trần Trung Trực 27 III- MỤC LỤC  I-CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH 1 A ĐỊNH NGHĨA-PHÂN LOẠI 1 1- Định nghĩa 1 2- Phân loại 1 a Cơ chế tách dựa vào 1 b Phương pháp tách 1 -i- Kích thước 1 -ii- Khối lượng và mật độ 1 -iii-... cực: Hỗn hợp các chất ... b Phương pháp thăng hoa c Phương pháp kết tinh lại Trạng thái hóa học Q TRÌNH TÁCH DỰA VÀO TỶ LỆ GIỮA CÁC PHA 1- Các phương pháp chiết. .. c Hiệu suất chiết – độ chiết – hệ số chiết 2- Các phương pháp chiết lỏng-lỏng a Chiết đơn: b Chiết lặp c Chiết ngược dòng ... TỶ LỆ GIỮA CÁC PHA 1- Các phương pháp chiết (extraction)  Chiết phương pháp dùng dung mơi (đơn/hỗn hợp) để tách lấy chất hay nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu  Cơ chế tách: chuyển pha dựa