BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- o0o --- NGUYỄN THỊ KIM THOA CẢI TIẾN CÔNG THỨC BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA VI NHŨ TƯƠNG LUTEIN TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: TS. HOÀNG THỊ HUỆ AN KHÁNH HÒA -06/ 2015 i NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN Nhiệm vụ đồ án là: Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương lutein ổn định trong nước và nghiên cứu khả năng ứng dụng làm chất tạo màu thực phẩm. ii LỜI CẢM ƠN Sau gần 3 tháng em đã thực hiện xong đề tài “Cải tiến công thức bào chế và đánh giá khả năng ứng dụng của vi nhũ tương lutein trong công nghiệp thực phẩm”. Trong thời gian qua cũng như trong suốt quá trình học tập tại trường, ngoài nỗ lực phấn đấu của bản thân, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm cùng quý Thầy cô trong Khoa Công nghệ Thực phẩm và cán bộ phụ trách Phòng Thí nghiệm Hoá (Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành) đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi nhất về cơ sở vật chất, trang thiết bị, giúp chúng em có hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn TS. Hoàng Thị Huệ An đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ về kiến thức, phương pháp nghiên cứu và động viên em trong suốt thời gian qua để em có thể hoàn thiện dần kiến thức đã học, đồng thời hoàn thành đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian học tập cũng như khi thực hiện đề tài này. Do hạn hẹp về kiến thức, kinh nghiệm nghiên cứu và thời gian hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài được hoàn thiện hơn. Nha Trang, tháng 6 năm 2015 Sinh viên thực hiện NGUYỄN THỊ KIM THOA iii TÓM TẮT ĐỒ ÁN Đồ án trình bày những kết quả đạt được trong việc xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương lutein ổn định trong nước sử dụng hỗn hợp Tween 80, lecithin, propylen glycol làm chất nhũ hóa và vitamin E làm chất chống oxy hóa nhằm cải thiện độ bền màu và khả năng ứng dụng của sản phẩm trong công nghiệp thực phẩm. iv MỤC LỤC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN .........................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii TÓM TẮT ĐỒ ÁN ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... viii LỜI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..........................................................................................4 1.1. Thực trạng sử dụng chất màu thực phẩm hiện nay.............................................4 1.1.1. Giới thiệu về chất màu thực phẩm .................................................................4 1.1.2. Thực trạng sử dụng chất màu thực phẩm ở Việt Nam hiện nay ................5 1.2. Tổng quan về chất màu lutein .............................................................................5 1.2.1. Cấu tạo phân tử lutein ....................................................................................5 1.2.2. Tính chất vật lý ................................................................................................ 6 1.2.3 Tính chất hóa học ............................................................................................6 1.2.4. Hoạt tính sinh học ...........................................................................................7 1.2.5. Ứng dụng .........................................................................................................7 1.2.6. Các nguồn lutein tự nhiên ..............................................................................9 1.3. Tổng quan về vi nhũ tương .....................................................................................9 1.3.1. Khái niệm .........................................................................................................9 1.3.2 Thành phần của vi nhũ tương .............................................................................11 1.3.3. Phân loại vi nhũ tương ........................................................................................16 1.3.4. Phương pháp nghiên cứu thành phần và tính chất của vi nhũ tương......16 1.3.5. Ưu và nhược điểm của vi nhũ tương ...........................................................18 1.3.6. Ứng dụng của vi nhũ tương: ........................................................................19 1.3.7. Phương pháp điều chế vi nhũ tương ...........................................................20 1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu về vi nhũ tương .........................................23 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước............................................................... 23 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 26 2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................ 26 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ..................................................................................27 2.4.1. Sơ đồ điều chế nhũ tương lutein ..................................................................27 v 2.4.2. Xác định công thức bào chế vi nhũ tương ..................................................29 2.4.3. Xây dựng giản đồ pha của hệ vi nhũ tương ................................................34 2.4.4. Chọn tỷ lệ vitamin E bổ sung .......................................................................34 2.4.5. Xác định công thức điều chế vi nhũ tương lutein - Điều chế và khảo sát một số tính chất hóa – lý đặc trưng........................................................................36 2.4.6. Nghiên cứu khả năng ứng dụng vi nhũ tương lutein tạo màu thực phẩm ..................................................................................................................................38 2.4.7. Phương pháp phân tích ................................................................................39 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 41 3.1. Xác định công thức bào chế vi nhũ tương lutein ................................................41 3.1.1. Chọn tỷ lệ Tween 80 ......................................................................................41 3.1.2. Chọn tỷ lệ propylen glycol ............................................................................42 3.1.3. Chọn tỷ lệ lecithin .........................................................................................43 3.1.4. Chọn tỷ lệ lutein/dầu nành ...........................................................................45 3.1.5. Chọn tỷ lệ hỗn hợp chất nhũ hóa và pha dầu (S/O) ...................................45 3.2. Xây dựng giản đồ pha của hệ vi nhũ tương lutein ............................................47 3.3. Chọn tỷ lệ vitamin E bổ sung................................................................................49 3.4. Xác định công thức bào chế vi nhũ tương lutein – Bào chế và khảo sát một số tính chất hóa – lý đặc trưng .........................................................................................51 3.4.1. Xác định công thức bào chế vi nhũ tương lutein ........................................51 3.4.2. Tính chất hóa- lý của sản phẩm vi nhũ tương lutein .................................53 3.4.3. Đánh giá độ bền màu của sản phẩm ...........................................................54 3.5. Ứng dụng tạo màu thực phẩm và đánh giá độ bền màu của sản phẩm theo thời gian bảo quản ........................................................................................................56 3.5.1. Chọn nồng độ vi nhũ tương lutein thích hợp để tạo màu ..........................56 3.5.2. Đánh giá độ an toàn của thực phẩm tạo màu bằng vi nhũ tương lutein .57 3.5.3. Độ bền màu của sản phẩm đông sương bổ sung vi nhũ tương lutein.......58 3.6. Đánh giá hiệu quả kinh tế của vi nhũ tương lutein ............................................59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ..........................................................................61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 62 PHỤ LỤC ........................................................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lượng lutein cho phép có trong thực phẩm .............................................8 Bảng 1.2. Các nguyên liệu có chứa lutein trong tự nhiên ................................................9 Bảng 1.3. Sự khác nhau giữa các hệ nhũ tương và vi nhũ tương ..................................10 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của Tween 80 đến độ bền của vi nhũ tương lutein ....................41 Bảng 3.2. Trạng thái của hệ nhũ tương lutein khi thay đổi tỷ lệ propylen glycol .........42 Bảng 3.3. Trạng thái của hệ nhũ tương lutein khi thay đổi tỷ lệ lecithin ......................44 Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm chuẩn độ pha bằng nước đối với các hệ vi nhũ tương có tỷ lệ S/O tăng dần ..........................................................................................47 Bảng 3.5. Thành phần pha của các hệ vi nhũ tương lutein ở ranh giới chuyển pha......48 Bảng 3.6. Một số tính chất hóa - lý của hệ vi nhũ tương lutein .....................................53 Bảng 3.7. Hàm lượng và giới hạn cho phép của các phụ gia thực phẩm ......................57 Bảng 3.8. Bảng mô tả sản phẩm đông sương sau 4 ngày bảo quản ............................... 58 Bảng 3.9. Giá thành ước tính cho 1 kg sản phẩm vi nhũ tương lutein đặc....................59 Bảng 3.10. Giá thành ước tính cho 1 lít sản phẩm đông sương .....................................60 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein .......................................................................................6 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của lecithin ..........................................................................13 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử một số polysorbate .............................................................. 13 Hình 1.4. Mặt cắt ngang của một vi nhũ tương O/W dạng hình cầu ............................. 15 Hình 1.5. Các loại vi nhũ tương thường gặp ..................................................................16 Hình 1.6. Giản đồ pha bậc ba của hệ vi nhũ tương ........................................................17 Hình 1.7. Sự khác nhau về bề ngoài giữa vi nhũ tương và nhũ tương ..........................19 Hình 1.8. Sơ đồ bào chế vi nhũ tương bằng phương pháp chuẩn độ nhũ tương ...........22 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ...................................................................27 Hình 2.2. Sơ đồ điều chế nhũ tương lutein .....................................................................28 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ Tween 80. ..........................................30 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ propylen thích hợp ............................ 31 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ lecithin thích hợp .............................. 32 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ lutein/dầu nành thích hợp .................33 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế độ gia nhiệt và hàm lượng vitamin E đến độ bền của vi nhũ tương lutein .....................................35 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá độ bền của vi nhũ tương lutein ở các điều kiện bảo quản khác nhau ................................................................................. 37 Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn trạng thái bảo quản vi nhũ tương lutein ..........37 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ vi nhũ tương lutein thích hợp ...38 Hình 3.1. Hình ảnh hệ nhũ tương lutein khi tỷ lệ Tween 80 tăng dần...........................42 Hình 3.2. Các hệ nhũ tương lutein tạo thành khi tăng tỷ lệ propylen glycol.................43 Hình 3.3. Các hệ nhũ tương lutein tạo thành khi tăng nồng độ lecithin ........................44 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ lutein đến sự thay đổi độ bền của hệ ......................45 Hình 3.5. Các hệ vi nhũ tương lutein ở điểm cuối của quá trinh chuẩn độ pha bằng nước ứng với tỷ lệ S/O tăng dần .....................................................................46 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ S/O đến độ bền của trạng thái vi nhũ tương lutein ......47 Hình 3.7. Giản đồ pha của hệ vi nhũ tương lutein .........................................................48 Hình 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng vitamin E và nhiệt độ đến ..................................50 Hình 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng vitamin E và thời gian đun sôi đến ....................51 Hình 3.10. Quy trình bào chế các dạng vi nhũ tương lutein: .........................................52 Hình 3.11. Ảnh hưởng của trạng thái bảo quản đến độ bền màu ..................................55 Hình 3.12. Độ bền màu của vi nhũ tương lutein ở các điều kiện ..................................55 Hình 3.13. Tổng điểm cảm quan của sản phẩm ............................................................. 57 viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Food and Agriculture FAO Organization Tổ chức Nông-Lương Thế giới HydrophilicLipophilic Balance Cân bằng ưa nước-ưa béo age-related macular thoái hoá điểm vàng liên quan degenerescence đến tuổi tác Axit Deoxyribo Nucleic ADN European Union Liên minh Châu Âu Food and Drug Cục quản lý dược phẩm Administration và Thực phẩm surfactant hoạt động bề mặt Joint Expert Committee on Ủy ban phối hợp các chuyên Food Additives gia về phụ gia thực phẩm LDL low density lipoprotein chất béo có tỷ trọng thấp rpm round per minute vòng/phút S/O Surfactant/Oil Chất hoạt động bề mặt/Dầu Ultraviolet-Visible Tử ngoại-khả kiến weight/weight khối lượng/khối lượng World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới HLB AMD DNA EU FDA HĐBM JECFA UV-Vis w/w WHO 1 LỜI MỞ ĐẦU Trong chế biến thực phẩm, màu sắc góp phần làm cho món ăn trở nên đẹp mắt, hấp dẫn và phong phú hơn, chính vì thế mà nó luôn đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên giá trị cảm quan của thực phẩm, đặc biệt là sản phẩm được chế biến theo quy mô công nghiệp. Do đó, hiện nay trên thị trường các mặt hàng thực phẩm chế biến vô cùng phong phú và đa dạng về màu sắc, chất lượng cũng như kiểu dáng,… Vì vậy, một mặt hàng thực phẩm muốn người tiêu dùng lựa chọn thì không chỉ đạt yêu cầu về chất lượng mà màu sắc cũng phải hài hòa, bắt mắt. Tuy nhiên, trong quá trình chế biến, do nhiều tác nhân (cơ, nhiệt, lý, hóa) màu sắc tự nhiên của thực phẩm sẽ bị giảm, do đó cần bổ sung các chất tạo màu để tăng cường màu sắc cho thực phẩm. Chính vì lý do này mà rất nhiều chất màu thực phẩm được tạo ra. Hiện nay, chất màu thực phẩm có nhiều loại nhưng có thể chia làm 2 nhóm chính: chất màu tự nhiên (có sẵn trong các nguồn động – thực vật ăn được) và chất màu tổng hợp bằng các phương pháp hóa học. Từ xưa, con người đã biết nhuộm màu thực phẩm bằng màu tự nhiên; các chất màu này không ảnh hưởng đến sức khỏe con người nhưng nó thường kém bền màu và ít kinh tế. Cùng với sự tiến bộ của công nghệ hóa học, chất màu tổng hợp đã ra đời và nhanh chóng được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, đặc biệt là các thức ăn chế biến sẵn nhờ chúng có ưu điểm là tạo ra nhiều gam màu đẹp, bền màu, dễ sử dụng lại rẻ tiền [3]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy nhiều chất màu tổng hợp có độc tính nên đã cấm sử dụng trong chế biến thực phẩm; một số khác có khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng nếu sử dụng quá liều lượng cho phép do đó cần được kiểm soát nghiêm ngặt. Trong khi đó, ở Việt Nam nói riêng và một số nước kém phát triển nói chung chất màu tổng hợp độc hại vẫn đang được sử dụng tràn lan, thiếu kiểm soát, đặc biệt là trong chế biến thực phẩm tại các chợ và các hộ gia đình sản xuất nhỏ lẻ. Trong số đó việc sử dụng phẩm màu Tartrazine (mã số E102) để tạo ra màu vàng-vàng cam trong chế biến thực phẩm là khá phổ biến. Các nhà khoa học tại Đại học Southampton (Anh Quốc) cho biết phẩm màu E102 có trong chế độ ăn sẽ làm tăng sự hiếu động thái quá và gây kém tập trung ở trẻ từ 3-8 tuổi; một kết quả nghiên cứu khác tại Mỹ lại cho thấy chuột đực được tiêm Tartrazine sẽ có số lượng tinh trùng giảm và có hiện tượng bất thường về hình thái tinh trùng [35]. Do đó, vấn đề đặt ra trong lĩnh vực công nghệ thực 2 phẩm ở nước ta là tìm kiếm chất màu tự nhiên không độc hại thay thế cho các chất màu tổng hợp nói trên. Một trong những chất màu tự nhiên đang được quan tâm nghiên cứu là lutein. Đây là sắc tố carotenoid màu vàng cam có trong nhiều loài động-thực vật. Ngoài khả năng tạo màu vàng rất đẹp, lutein còn có những hoạt tính sinh học quan trọng như khả năng chống oxy hóa, giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch (Halliwell, 2000), chứng xơ vữa động mạch, ngăn ngừa một số bệnh ung thư (De Stefani và cộng sự, 1999; Reddy, Odhav & Bhoola, 2003; Tavani và cộng sự , 1999), đặc biệt là giảm nguy cơ mù lòa ở người cao tuổi do thoái hóa điểm vàng [38]. Nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu lutein nhất hiện nay là hoa cúc vạn thọ châu Phi với hàm lượng carotenoid tổng số trong cánh hoa chiếm 1-1,6 % (tính theo trọng lượng khô), trong đó lutein chiếm trên 90% carotenoid tổng số, zeaxanthin khoảng 5% [19]. Lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ đã được EU và FDA ở Canada, New Zealand công nhận là an toàn và cho phép sử dụng làm phụ gia tạo màu cho thực phẩm (nước giải khát, sữa, bánh, kẹo, giò chả, …), là chất chống oxy hóa trong mỹ phẩm (kem chống nắng) và dược phẩm bổ sung [13]. Tuy nhiên, cũng như các carotenoid khác, lutein kém tan trong nước, đồng thời lại kém bền màu dưới tác động của nhiệt, oxy không khí và ánh sáng, dẫn đến việc ứng dụng tạo màu cho thực phẩm bị hạn chế [38]. Do vậy, việc nghiên cứu chuyển hóa lutein thành các dạng chế phẩm dễ tan trong nước và bền màu hơn là vấn đề cần thiết. Một trong những giải pháp cho vấn đề này là bào chế lutein dưới dạng vi nhũ tương dầu/nước, trong đó lutein được phân tán thành các hạt có kích thước micro được bao bọc bằng các chất nhũ hóa ưa nước. Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu điều chế vi nhũ tương carotenoid ứng dụng trong thực phẩm [39]. Ở Việt Nam hiện có rất ít công trình nghiên cứu đã công bố liên quan đến vấn đề này, hơn nữa độ bền của sản phẩm vi nhũ tương thu được vẫn còn khá hạn chế để có thể ứng dụng trong thực tiễn [1]. Chính vì vậy, em thực hiện đề tài: “Cải tiến công thức bào chế và đánh giá khả năng ứng dụng của vi nhũ tương lutein trong công nghiệp thực phẩm”. Mục tiêu của đề tài: Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương lutein ổn định trong nước và có khả năng ứng dụng làm chất tạo màu thực phẩm. 3 Nội dung nghiên cứu: - Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương dầu/nước của lutein sử dụng hỗn hợp Tween 80, lecithin, propylen glycol làm chất nhũ hóa. - Nghiên cứu bổ sung vitamin E trong công thức bào chế vi nhũ tương lutein nhằm cải thiện độ bền màu. - Đánh giá độ bền màu và khả năng ứng dụng của sản phẩm vi nhũ tương thu được. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Thực trạng sử dụng chất màu thực phẩm hiện nay 1.1.1. Giới thiệu về chất màu thực phẩm Chất màu đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chế biến thực phẩm. Chất màu thực phẩm hay phụ gia tạo màu được bổ sung vào thực phẩm nhằm phục hồi màu sắc bị mất đi trong quá trình chế biến, làm tăng độ đồng nhất cho sản phẩm, tạo cho nó có màu sắc đặc trưng của sản phẩm hay tăng cường màu sắc để làm tăng tính hấp dẫn cho sản phẩm [36]. Do vậy, màu sắc là một trong những chỉ tiêu cảm quan quan trọng để đánh giá chất lượng thực phẩm. Chất màu thực phẩm được chia làm 2 nhóm chính: chất màu có nguồn gốc tự nhiên và chất màu tổng hợp. Chất màu tự nhiên là những hợp chất hữu cơ thu nhận được từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên có thể ăn được (động vật, thực vật, vi sinh vật). Ngoài ra chất màu tự nhiên cũng có thể được hình thành trong quá trình nấu nướng (ví dụ: caramel). Từ xưa con người đã biết sử dụng chất màu tự nhiên trong chế biến thực phẩm. Tuy nhiên, chất màu tự nhiên thường kém bền màu và có giá thành cao do việc thu hồi, tách chiết chúng từ các nguồn tự nhiên khá tốn kém nên ứng dụng hạn chế. Chất màu tổng hợp là những chất màu được tạo ra bằng các phản ứng tổng hợp hóa học (ví dụ: Tartrazine, Azorubin, Amaranth, ...). Những chất màu này có nhiều ưu điểm là có màu sắc rất đẹp, phong phú, bền màu, giá thành rẻ nên trước đây được sử dụng khá rộng rãi trong sản xuất thực phẩm công nghiệp (thịt quay, bánh kẹo, đồ uống, đồ hộp,…). Tuy nhiên, những nghiên cứu trong vòng 20-25 năm gần đây cho thấy nhiều loại chất màu tổng hợp (đặc biệt là loại thuốc nhuộm azo) có thể gây ngộ độc cấp tính, mãn tính, đột biến gen và ung thư cho người sử dụng... Chẳng hạn, một số nghiên cứu đã phát hiện những enzyme trong ruột non có khả năng xúc tác cho phản ứng khử các phẩm màu azo để sinh ra các tác nhân gây ung thư. Do đó, các chất màu tổng hợp dùng trong chế biến thực phẩm phải nằm trong danh mục phụ gia cho phép và liều lượng sử dụng phải không vượt quá mức quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm của từng quốc gia [3]. 5 1.1.2. Thực trạng sử dụng chất màu thực phẩm ở Việt Nam hiện nay Ở nước ta việc sử dụng các chất màu không có trong danh mục cho phép đang là vấn đề nhức nhối trong xã hội. Nhiều vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có ngộ độc do phẩm màu ngày càng tăng do sự kiểm soát không nghiêm ngặt của các cơ quan chức năng. Một số chất màu bị cấm nhưng vẫn được bày bán tràn lan trên thị trường. Một số nhà sản xuất do chạy theo lợi nhuận thậm chí còn sử dụng một số chất màu độc hại bị cấm hay thuốc nhuộm trong công nghiệp dệt để tạo màu cho thực phẩm, gây nguy cơ lớn với sức khỏe của con người (ví dụ: Rhodamine B trong bột ớt, trong hạt dưa ngày tết, malachit trong bánh cốm,…). Do vậy, những thực phẩm có màu sắc sặc sỡ tuy tạo giá trị cảm quan tốt nhưng nếu người tiêu dùng không có sự lựa chọn sáng suốt thì chúng có thể trở thành hiểm họa tiềm ẩn trong cơ thể và đến một lúc nào đó chúng sẽ phát tác bởi các chất màu gây độc. Trong khi đó, chất màu tự nhiên là phụ gia thực phẩm rất tốt, hầu như không có hại với sức khoẻ con người. Trước tình hình đó, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu ra nhiều chất màu tự nhiên để thay thế cho chất màu tổng hợp độc hại. 1.2. Tổng quan về chất màu lutein Một trong số những chất màu tự nhiên đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước chú ý đến là lutein. Nó thuộc nhóm carotenoid có đặc tính tan trong dầu, không tan trong nước và có khả năng chống oxy hóa [37]. Lutein đã được EU và các Tổ chức FDA ở Canada, Úc, New Zealand cho phép sử dụng làm chất màu thực phẩm (mã số E161b) để tạo màu vàng, vàng cam cho nhiều loại nước giải khát, làm phụ gia tạo màu trong thức ăn chăn nuôi. Qua nhiều khảo sát cho thấy hoa cúc vạn thọ là nguồn nguyên liệu thu nhận lutein lý tưởng vì ở cánh hoa này có khoảng 90% carotenoid là lutein và 5% zeaxanthin [13]. 1.2.1. Cấu tạo phân tử lutein Lutein là một sắc tố carotenoid có màu vàng cam rất phổ biến trong các mô của động - thực vật. Lutein là dẫn xuất 3,3’ diol của β, ε-caroten [21] [25] [30], nó có tính chất của một provitamin A [4]. Lutein thuộc nhóm sắc tố xanthophyll có chứa 2 vòng đầu mạch (một vòng β-và một vòng là α-ionone), có cấu trúc tetraterpenoid với bộ khung C40 cơ bản chung cho tất cả các carotenoid [16],[26]. 6 Các liên kết đôi tồn tại trong lutein có thể tồn tại ở dạng cis (mono-cis hay polycis) hoặc trans nhưng trong tự nhiên phần lớn chúng tồn tại ở cấu hình all-trans (Hình 1.1.) 18' 16 17 19 6 21 HO 3 4 7 11 9 8 5 20 10 15 13 12 14 18 14' 15' 12' 13' 11' 20' 10' 8' 9' 19' 4' 3' 5' 6' 1 OH 2' 7' 17' 16' Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all- trans). (Công thức phân tử lutein: C40H56O2; Phân tử lượng: M = 568,88) 1.2.2. Tính chất vật lý 1.2.1.1. Tính tan Tinh thể lutein ở dạng bột, có màu đỏ cam, không tan trong nước nhưng hòa tan trong hexan và alcol, ete, chất béo và một số dung môi không phân cực khác, đặc biệt tan tốt trong diclorometan [19]. Lutein kết tinh ở dạng tinh thể hình kim, khối lăng trụ đa diện, dạng lá hình thoi, với điểm nóng chảy 190-193oC. Tinh thể lutein được bảo quản tốt nhất ở -18°C[19]. 1.2.1.2. Đặc tính hấp thụ ánh sáng Chuỗi polyen liên hợp đặc trưng cho màu thấy được của carotenoid. Dựa vào quang phổ hấp thụ của nó, người ta thấy khả năng hấp thụ ánh sáng của nó phụ thuộc vào số nối đôi liên hợp với trên 7 nối đôi và nhóm C9 mạch thẳng hoặc mạch vòng. Ngoài ra, khả năng hấp thụ ánh sáng cũng khác nhau khi dung môi hòa tan khác nhau. Độ hấp thụ cực đại của lutein tự do ở bước sóng 445 nm. Tuy nhiên, cực đại hấp thụ này thay đổi ít nhiều tùy theo dung môi được sử dụng [37]. Lutein hấp thụ ánh sáng màu xanh do đó dung dịch của nó thường có màu vàng ở nồng độ thấp và đỏ da cam ở nồng độ cao. 1.2.3 Tính chất hóa học Chuỗi polyene (hay hệ thống nối đôi liên hợp) cũng là nguyên nhân làm cho các phân tử lutein ở dạng tự do rất dễ bị oxy hóa, bị đồng phân hóa hoặc hydro hóa bởi các tác nhân acid dẫn đến sự mất màu hay nhạt màu. Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu của lutein gồm: oxy không khí, ozone, peroxyt, gốc tự do, ion kim loại, nhiệt độ, 7 ánh sáng, acid, enzyme [44]. Tuy nhiên, lutein bền trong môi trường kiềm. Trong các mô động-thực vật lutein có khả năng liên kết với các acid béo, lipid, lipoprotein,… vì vậy, độ bền của lutein được thay đổi đáng kể so với khi ở trạng thái tự do. Lutein dễ bị oxy hóa trong không khí nên cần bảo quản trong môi trường khí trơ, chân không hoặc nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng mặt trời [44]. 1.2.4. Hoạt tính sinh học Cũng như các carotenoid, lutein có khả năng hấp thụ tia tử ngoại và ánh sáng xanh, có hoạt tính chống oxy hóa và bắt giữ các gốc tự do sinh ra trong tế bào. Hơn nữa, khác với các hydocarbon carotenoid không phân cực (như α-,β-caroten, lycopen,..), nhờ có các nhóm chức hydroxyl ở 2 vòng 6 đầu mạch, lutein phân cực hơn nên có thể đi sâu vào phần ưa nước bên trong màng tế bào, do đó thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn. 1.2.5. Ứng dụng Trong y học: Lutein là hoạt chất có ý nghĩa về mặt dược học (phòng chống ung thư, bảo vệ da và mắt khỏi tác hại của tia tử ngoại, ngăn ngừa một số bệnh về mắt do tuổi già, giảm nguy cơ xơ vữa động mạch …) [13], [19], [27]. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc cung cấp đủ lutein và zeaxanthin (10 mg lutein và 2 g zeaxanthin/ ngày) sẽ giảm 40% sự thoái hóa điểm vàng có liên quan đến tuổi tác [31]. Alves-Rodrigues A. và Shao A. (2004) kết luận các hợp chất carotenoid (đặc biệt là lutein và zeaxanthin) có thể ức chế các yếu tố làm thoái hóa võng mạc và bệnh tim mạch [10]. Hơn nữa, khác với các hydocarbon carotenoid không phân cực (như α-, β-caroten, lycopen,..), nhờ có các nhóm chức hydroxyl ở 2 vòng 6 đầu mạch, lutein phân cực hơn nên có thể đi sâu vào phần ưa nước bên trong màng tế bào, do đó thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn. Chế độ ăn uống cung cấp ít lượng lutein cho cơ thể còn có thể dẫn đến các bệnh về mắt như đục thủy tinh thể, thoái hóa điểm vàng ở người già,… [17], [19], [22]. Một số kết quả nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng việc bổ sung các loại thực vật giàu lutein (như trứng, bông cải xanh, cải bina,…) vào bữa ăn hàng ngày có thể làm giảm được nguy cơ đục thủy tinh thể lên đến 20% và thoái hóa điểm vàng lên đến 40% [9]. 8 Trong công nghiệp thực phẩm Lutein có màu vàng cam khá đẹp nên còn được ứng dụng làm chất tạo màu trong công nghiệp chế biến thực phẩm (bánh kẹo, sữa, nước giải khát,…). Năm 2006, Ủy ban Chuyên gia về Phụ gia thực phẩm (JECFA) của FAO/WHO đã đánh giá sự an toàn của lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ và cho phép sử dụng làm phụ gia tạo màu cho nhiều loại thực phẩm (bánh nướng, nước giải khát, nước ép trái cây, ngũ cốc điểm tâm, kẹo cao su, kẹo cứng, các sản phẩm từ sữa, trứng, các loại thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ mới biết đi, chất béo và dầu, nước thịt, nước sốt và súp hỗn hợp,…) [14]. Theo đó, hàm lượng lutein cho phép có mặt trong một số thực phẩm được cho bởi Bảng 1.1. Bảng 1.1. Hàm lượng lutein cho phép có trong thực phẩm [13] Danh mục thức ăn Loại thực phẩm Liều sử dụng (mg/kg) Ngũ cốc bữa sáng Bột ngũ cốc ăn liền 8,3 Kẹo cao su Kẹo cao su 330 Sản phẩm của trứng Kẹo Trứng (dạng lỏng, đông lạnh hay bột khô) 40 Kẹo dẻo 25 Sữa bột 13 Sữa uống 13 Sữa chua 13 Sữa mô phỏng 8,3 Sữa đậu nành 6,3 Đồ uống trái cây 8,3 Trái cây đã chế biến; nước ép Mật hoa 8,3 trái cây Nước ép trái cây 8,3 Nước ép rau 8,3 Nước sốt cà chua 2,6 Các sản phẩm từ sữa Nước thịt và nước sốt 9 Trong công nghiệp mỹ phẩm: Lutein hoạt động như một chất chống oxy hóa, có khả năng bắt giữ các gốc tự do trong tế bào, ngăn chặn tia cực tím có hại. Vì vậy, lutein còn được ứng dụng trong các loại mỹ phẩm như kem chống nắng, kem chống lão hóa da giúp bảo vệ và chăm sóc da [29]. 1.2.6. Các nguồn lutein tự nhiên Lutein có nhiều trong các loại rau xanh (rau bina, cải xoăn, cải lá xanh,…), một vài loại trái cây, hoa, ngô và lòng đỏ trứng gà, đặc biệt có nhiều trong cánh hoa cúc vạn thọ [11]. Cánh hoa có màu cam sẫm chứa lượng lutein nhiều hơn khoảng 200 lần so với cánh hoa có màu sáng hơn [22]. Bảng 1.2. Các nguyên liệu có chứa lutein trong tự nhiên [12] Loại thực phẩm Thành phần lutein (mg/kg Anh) Cải xoăn Củ cải Rau bina (nấu chín ) 20-33(*) 18,1 12-15(*) Rau spina (tươi ) 6,6 Bắp 6,6 Lòng đỏ trứng 0,3 Quýt 0,3 Nước ép cam 0,3 Cải brussel 3,4 Quả hồng 0,6 Lá đậu Hà Lan 2,3 Bông cải xanh 3,4 (*): tùy thuộc vào từng loại. 1.3. Tổng quan về vi nhũ tương 1.3.1. Khái niệm Vi nhũ tương được hai nhà khoa học Hoar và Schuman khám phá vào năm 1943 khi tình cờ thêm các alcol mạch trung bình vào một hệ nhũ tương thô O/W (dầu/nước) và thu được một hệ lỏng trong suốt. 10 Năm 1981 Danielson và Lindman (1981) đã đưa ra định nghĩa: Vi nhũ tương là một dung dịch lỏng gồm pha dầu và pha nước được phân tán đồng nhất vào nhau và được ổn định bởi phân tử các chất hoạt động bề mặt (surfactant, còn gọi là chất diện hoạt, viết tắt: HĐBM), bền về mặt nhiệt động học và đẳng hướng về mặt quang học. Sự khác biệt cơ bản giữa nhũ tương thông thường và vi nhũ tương là kích thước hạt của giọt chất lỏng phân tán. Trong vi nhũ tương kích thước hạt của pha phân tán chỉ từ 10-100 nm [34]. Do kích thước hạt nhỏ nên chúng tán xạ ánh sáng yếu, do đó trong suốt. Bảng 1.3. Sự khác nhau giữa các hệ nhũ tương và vi nhũ tương [30] Hệ nhũ tương Tính chất Hệ vi nhũ tương Hình thức Đục Trong suốt hay trong mờ Tính chất pha Đa pha Đơn pha hay đa pha Tính đẳng hướng quang học Bất đẳng hướng Đẳng hướng Tỷ lệ của pha phân tán 30-60% 23-40% (độ nhớt không tăng theo tương ứng) Sức căng bề mặt Cao Rất thấp Cấu trúc vi mô Tĩnh (bề mặt phân chia Động (bề mặt phân chia pha tự pha không thay đổi) thay đổi liên tục) Kích thước hạt 100 nm-600 nm Yêu cầu năng lượng Cần tiêu tốn nhiều Tự hình thành, không đòi hỏi năng lượng để điều chế năng lượng Tính bền Không bền về mặt nhiệt động học và động học (dễ tách pha) Bền về mặt nhiệt động học và động học (thời gian ổn định dài) Nồng độ chất nhũ hóa 2-3% khối lượng > 6% khối lượng Bản chất Kỵ lỏng Trung gian giữa hệ keo kỵ lỏng và ưa lỏng Điều chế Đòi hỏi năng lượng lớn, giá thành cao Dễ điều chế, giá thành tương đối thấp đối với các sản phẩm thương mại Độ nhớt Cao Thấp (có đặc tính của chất lỏng Newton) 10-100 nm 11 1.3.2 Thành phần của vi nhũ tương[7] Khi phối hợp hai pha dầu và nước lại với nhau thì hệ vi nhũ tương được hình thành một cách dễ dàng do có sự vận động không ngừng giữa các pha, trong đó chất HĐBM và chất đồng HĐBM là các yếu tố quyết định. Các yếu tố ảnh hưởng đến hệ vi nhũ tương là loại pha dầu sử dụng, loại chất HĐBM, pha nước, tỷ lệ giữa các thành phần, nhiệt độ, pH, ánh sáng,… nhưng bản chất của chất HĐBM, chất đồng HĐBM, pha dầu và tỷ lệ giữa các thành phần này là yếu tố ảnh hưởng chủ yếu đến hệ vi nhũ tương tạo thành. a) Pha dầu: gồm những chất lỏng không phân cực như dầu lạc, dầu nành, dầu hướng dương, isopropyl myristat, triglycerit mạch cacbon trung bình, acid oleic…và các chất hòa tan hay đồng tan vào chúng như menthol, terpen, tinh dầu… Bản chất pha dầu ảnh hưởng đến tính chất bề mặt phân cách pha do ảnh hưởng đến sự thấm ướt phần đuôi không phân cực của chất HĐBM. Các loại dầu chứa mạch hydrocarbon ngắn dễ thấm ướt phần đuôi không phân cực của chất HĐBM hơn nên sức căng bề mặt trên ranh giới 2 pha dầu/nước giảm nhiều hơn. Các acid béo no (ví dụ: acid lauric, myristic, capric) và không no (như acid oleic, linoleic, linolenic) có tính chất thấm ướt tốt đã được nghiên cứu sử dụng từ lâu. Các ester của acid béo như ester methyl hay ethyl của acid lauric, myristic và oleic cũng được dùng làm pha dầu. Tiêu chuẩn chính để chọn lựa pha dầu là có khả năng hòa tan tốt hoạt chất, điều này sẽ làm giảm thiểu liều lượng vi nhũ tương sử dụng để chuyển giao hoạt chất. b) Pha nước: gồm những chất lỏng phân cực như nước, etanol, propylen glycol và những chất dễ hòa tan hay đồng tan vào chúng. c) Chất HĐBM: là những chất có khả năng làm giảm sức căng bề mặt phân chia pha, qua đó giúp hình thành và ổn định vi nhũ tương. Một chất HĐBM điển hình là những hợp chất lưỡng thân, trong phân tử có chứa 2 phần: - Phần ưa nước (đầu phân cực): có mômen lưỡng cực cao và thường được cấu tạo bởi các nhóm chức phân cực như nhóm hydroxyl-OH, nhóm amin -NH2 carboxylCOO-, sulfat SO42-, sunfit SO32-… - Phần ưa dầu là gốc hydrocacbon không phân cực hoặc ít phân cực, có mômen lưỡng cực thấp . 12 Vị trí của các nhóm chức phân cực, độ dài và độ phân nhánh của gốc hydrocarbon không phân cực là các thông số quan trọng ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng nhũ hóa của chất HĐBM. Chẳng hạn, đuôi hydrocarbon càng dài thì độ tan của chất HĐBM trong pha dầu càng tăng nhưng độ tan trong nước càng giảm, dẫn đến khả năng nhũ hóa nhũ tương O/W giảm. Các chất HĐBM được chia thành 4 loại tùy theo điện tích của chúng: - Chất HĐBM anion: khi cho vào nước phân ly cho các đầu phân cực tích điện âm do sự có mặt của các nhóm chức nucleophile. - Chất HĐBM cation: khi cho vào nước phân ly cho các đầu phân cực tích điện dương do sự có mặt của các nhóm chức electrophile. Các chất HĐBM ion nhạy với sự thay đổi pH và nồng độ chất điện ly trong dung dịch. Khi vi nhũ tương được nhũ hóa bằng các chất HĐBM ion thì độ bền của chúng được duy trì nhờ lực đẩy tĩnh điện gây ra bởi điện tích của đầu phân cực của chất HĐBM. Do đó, khi tăng nồng độ chất điện ly trong dung dịch sẽ làm nén lớp kép trên bề mặt giọt, làm giảm điện tích bề mặt giọt nên các giọt có thể đến gần nhau và keo tụ. - Chất HĐBM lưỡng tính (zwitterionic surfactant): chứa 2 nhóm chức ion hóa ngược dấu nhau trong phân tử, do đó điện tích của nó phụ thuộc vào pH dung dịch. Mỗi phân tử chất HĐBM lưỡng tính tồn tại một giá trị pI, đó là pH tại đó điện tích dương bằng điện tích âm (pI: được gọi là điểm đẳng điện). Khi pH < pI thì chất HĐBM lưỡng tính mang điện tích dương; khi pH > pI thì mang điện tích âm. Chất HĐBM lưỡng tính thường hiệu quả hơn khi dùng kết hợp với chất HĐBM anion hay không ion. Chất HĐBM lưỡng tính hay dùng trong thực phẩm là lecithin, đó là một hỗn hợp chiết từ đậu tương hay lòng đỏ trứng gồm một số phospholipid, trong đó chủ yếu là phosphatidyl cholin và phosphatityl etanolamin. Lecithin có điểm đẳng điện pI  3,5 được sử dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm bởi cấu trúc lưỡng tính của nó: một cực của các phân tử có ái lực với nước (ưa nước) và phần còn lại là gốc hydrocarbon không phân cực (ưa béo), làm cho lecithin có tính chất của một chất HĐBM. 13 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của lecithin[40] Chất HĐBM không ion (non-ionic surfactant): không mang điện tích nên tương thích với nhiều hệ dung dịch do không tương tác với các chất mang điện tích khác. Do vậy, vi nhũ tương được nhũ hóa bằng chất HĐBM không ion kém nhạy với sự thay đổi pH và lực ion của dung dịch. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng thì độ tan của chất HĐBM không ion trong dung dịch nước giảm. Chất HĐBM không ion thường dùng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm là ester của đường. Ví dụ: saccharose monopalmitate, polyoxyethylen ether (POE, tức Brij 96), các sorbitan ester như Span, Tween (tức polysorbate). Tween 20 (Polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate) Tween 80 (Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate) là chất HĐBM ưa nước Hình 1.3. Cấu trúc phân tử một số polysorbate [42][43] Ghi chú: Chỉ số 20 kèm theo tên 'polyoxyethylene' để chỉ tổng số nhóm oxyethylene(CH2CH2O)-có trong phân tử. Chỉ số theo sau tên 'polysorbate' để chỉ loại acid béo gắn với phần polyoxyethylene sorbitan của phân tử (monolaurate ứng với Tween 20, monopalmitate ứng với Tween 40, monostearate-Tween 60, and monooleate-Tween 80). 14 Khi cho chất HĐBM vào hỗn hợp pha nước và pha dầu, phân tử chất HĐBM sẽ tự sắp xếp trên bề mặt hai pha, trong đó đầu phân cực hướng vào pha nước còn gốc không phân cực hướng vào pha dầu, tạo thành cấu trúc tự liên kết như micell hình cầu, micell hình ống, micell dạng bản mỏng, micelle đảo…[4]. Nhờ sự định hướng này của chất HĐBM trên bề mặt giọt chất lỏng ở ranh giới phân chia 2 pha dầu/nước nên sức căng bề mặt của hệ giảm (có thể xuống khoảng 10-4-10-2 N/m), làm cho hệ bền vững về nhiệt động học. Chất HĐBM còn làm thay đổi đặc tính hòa tan của chất lỏng được phân tán. Sự tổ hợp giữa chất HĐBM anion và chất HĐBM cation sẽ làm tăng khả năng hòa tan của pha nước và pha dầu trong hệ vi nhũ tương (X. Li và cs [4]). Trong công thức vi nhũ tương, tỷ lệ chất HĐBM cao hơn trong nhũ tương thông thường. Chỉ có chất HĐBM mà trong phân tử có hai thành phần phân cực (ưa nước) và không phân cực (ưa dầu) không cân bằng mới có thể làm giảm năng lượng tự do bề mặt pha, từ đó làm giảm sức căng bề mặt phân cách hai pha. Để phản ánh mối tương quan giữa hai phần ưa dầu và ưa nước trong một phân tử chất HĐBM, người ta dùng giá trị cân bằng dầu-nước HLB (Hydrophile-Lipophile Balance). Theo hệ thống phân loại HLB của W. Griffin, mỗi chất HĐBM có một giá trị HLB xác định, cao nhất là natri lauryl sulfat, thấp nhất là acid oleic. Các chất HĐBM còn lại có HLB trung gian. Khi một phân tử không thay đổi cấu trúc hóa học thì giá trị này không đổi. Dựa vào chỉ số HLB có thể xác định được khả năng sử dụng chất HĐBM đó. Ví dụ: Chất HĐBM có HLB từ 3-6: nhũ hóa cho nhũ tương nước/dầu. Chất HĐBM có HLB từ 7-9: dùng làm chất thấm ướt. Chất HĐBM có HLB từ 8-13: nhũ hóa cho nhũ tương dầu/nước. Chất HĐBM có HLB từ 13-15: dùng làm chất tẩy rửa. Chất HĐBM có HLB từ 15-18: hỗ trợ làm tăng độ tan. Một số chất HĐBM hay dùng như natri lauryl sulfat, polyoxyethylen oleyl ether, … Các chất HĐBM không ion có HLB cao thường dùng trong điều chế vi nhũ tương O/W là Tweens (polysorbates) và Labrafil (polyoxyethylated oleic glycerid). 15 d) Chất đồng HĐBM (cosurfactant): Các chất đồng HĐBM là các chất HĐBM không ion hóa, đó thường là các alcol, các acid alkanoic, các alkyl amin mạch ngắn hay trung bình C3-C8 (có giá trị HLB trung bình) [5]. Thông thường, nếu chỉ sử dụng chất HĐBM sẽ không đảm bảo cho sự giảm sức căng bề mặt và cấu trúc vi mô của hệ vi nhũ tương. Khi cho thêm chất đồng HĐBM sẽ lấp được các khoảng trống giữa chất diện hoạt và pha dầu vì chất đồng diện hoạt có mạch carbon ngắn hơn để tạo sự linh hoạt đủ nhanh để bao lấy các hạt vi nhũ tương, đồng thời làm giảm sự tương tác giữa đầu phân cực và đầu không phân cực [15]. Mặt khác, nó còn có vai trò giảm bớt sự khác biệt giữa hai chất diện hoạt chính trong công thức, phá vỡ các tinh thể lỏng hay cấu trúc gel trong hệ. Các chất đồng HĐBM điển hình là các alcol mạch ngắn (etanol đến butanol), các glycol (như propylen glycol), các amin hay acid mạch trung bình. e) Đồng dung môi (co-solvent): Việc điều chế các vi nhũ tương tối ưu thường đòi hỏi phải sử dụng lượng lốn chất HĐBM (thường >30% w/w). Các dung môi hữu cơ như ethanol, propylen glycol (PG), polyethylen glycol (PEG) cũng thường được thêm vào thành phần vi nhũ tương để cải thiện tính tan và độ bền của vi nhũ tương, đồng thời chúng cũng đóng vai trò là chất đồng HĐBM. Ngoài ra, vi nhũ tương còn có thể có thêm những chất khác như: chất tăng hấp thu, chất tạo mùi, chất bảo quản…[4] Chất HĐBM Chất đồng HĐBM Đuôi không phân cực Pha dầu Pha nước Đầu phân cực Hình 1.4. Mặt cắt ngang của một vi nhũ tương O/W dạng hình cầu[40] 16 1.3.3. Phân loại vi nhũ tương - Sự liên kết giữa hai pha dầu, nước với chất HĐBM và chất đồng HĐBM tạo cho vi nhũ tương có nhiều cấu trúc khác nhau. Vi nhũ tương 2 pha liên tục giàu nước Vi nhũ tương 2 pha liên tục giàu dầu Vi nhũ tương O/W Vi nhũ tương Hình 1.5. Các loại vi nhũ tương thường gặp[14] 1.3.4. Phương pháp nghiên cứu thành phần và tính chất của vi nhũ tương Cấu trúc vi mô thể hiện đặc tính của vi nhũ tương. Để nghiên cứu cấu trúc vi mô của vi nhũ tương cần đánh giá tính chất của nó bằng các kỹ thuật khác nhau [4]. Tuy nhiên, sự đánh giá này thường gặp khó khăn do sự phức tạo và tính đa dạng về cấu trúc và các thành phần có trong hệ vi nhũ tương cũng như sự hạn chế của các kỹ thuật đo. Vì vậy, cần kết hợp các công cụ trên để hiểu được các tính chất hóa lý và cấu trúc của hệ vi nhũ tương nghiên cứu. a) Giản đồ pha: là phương tiện thường được dùng trong nghiên cứu vi nhũ tương để tìm ra vùng có cấu trúc khác nhau như vùng tạo vi nhũ tương, vùng tạo nhũ tương,… Giản đồ pha gồm ba thành phần có hình tam giác, trong đó: - Mỗi đỉnh tam giác ứng với hệ chỉ gồm 1 thành phần duy nhất (dầu; nước hay chất HĐBM) – tức chiếm 100% w/w trong công thức vi nhũ tương. - Một điểm nào đó trên cạnh tam giác biểu thị hệ có 2 thành phần [4]. - Một điểm nằm trong mặt phẳng trong tam giác biểu thị hệ có 3 thành phần 17 Hình 1.6. Giản đồ pha bậc ba của hệ vi nhũ tương gồm isopropyl palmitat (IPP) trong phân bố trong pha nước (water) với hỗn hợp chất HĐBM(Tween 20) - chất đồng HĐBM (butanol) [20] Ghi chú: Vùng xám đậm là vùng vi nhũ tương (hệ trong suốt); vùng bên ngoài (xám nhạt) là vùng nhũ tương (đục) Giản đồ pha của hệ vi nhũ tương cung cấp thông tin về ranh giới giữa 2 vùng vi nhũ tương (ứng với hệ trong suốt) và vùng nhũ tương (ứng với hệ mờ đục). Nó thường được dùng để xác định tỷ lệ các pha và thành phần chất HĐBM. Giản đồ pha còn dùng để so sánh hiệu quả của các chất HĐBM khác nhau đối với một hệ vi nhũ tương. Biên giới giữa các pha có thể xác định cách quan sát sự thay đổi từ dạng trong sang đục khi thay đổi tỷ lệ và bản chất các của thành phần trong hệ vi nhũ tương (phương pháp chuẩn độ pha). Phương pháp này đơn giản nhưng mất thời gian (cần chở để cân bằng pha được thiết lập). b) Các phương pháp nghiên cứu tính chất hóa - lý của vi nhũ tương * Tính chất vĩ mô: - Cảm quan: màu sắc, trong suốt hoặc trong mờ, ánh sáng có thể đi qua. - Sức căng bề mặt: Sức căng bề mặt trên ranh giới phân chia pha càng nhỏ thì vi nhũ tương càng bền. Do đó, đây cũng là tiêu chuẩn đánh giá độ bền của hệ vi nhũ tương. - Độ khúc xạ ánh sáng: đánh giá bằng khúc xạ kế. - Độ đục: Kích thước giọt vi nhũ tương càng lớn thì khả năng phân tán ánh sáng càng mạnh nên độ đục càng cao, hạt càng lớn. Có thể đo độ đục bằng quang phổ kế UV-Vis. 18 - Độ nhớt: đánh giá bằng nhớt kế. - Tính tan của thuốc nhuộm: Hòa tan thuốc nhuộm tan trong nước nêu thấy vi nhũ tương được nhuộm màu thì đó là vi nhũ tương O/W, ngược lại là vi nhũ tương W/O. - Tính tan trong nước: Vi nhũ tương O/W tan được trong nước, còn vi nhũ tương W/O không tan trong nước. - Tính dẫn điện: được đánh giá bằng cách đo độ dẫn điện của vi nhũ tương, Vi nhũ tương O/W có pha bên ngoài là nước nên độ dẫn điện cao, vi nhũ tương W/O thì không dẫn điện. Phương pháp này cũng cho phép xác định vi nhũ tương là dạng dầu liên tục hay dạng nước liên tục cũng như việc kiểm tra về tính chảy hay sự đảo pha. - Độ bền: đánh giá thông qua khảo sát sự thay đổi tính chất hóa - lý của hệ vi nhũ tương (kích thước hạt, thế zeta, độ nhớt, độ dẫn điện, pH, tính chất hóa học,…) khi giữ ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ thấp (4-80C) và nhiệt độ cao (50  20C). * Tính chất vi mô: - Các kỹ thuật nhiễu xạ ánh sáng, nhiễu xạ tia X góc hẹp (SAXS: Small angle X-rays scattering), nhiễu xạ neutron góc hẹp (SANS) thường được áp dụng để thu được thông tin định tính và định lượng về kích thước giọt, hình dạng và tính chất động học của vi nhũ tương. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR: Nuclear Magnetic Resonance) cũng cho phép thu thông tin về cấu trúc hạt và tính chất động học của vi nhũ tương. - Chụp ảnh TEM (Transmission Electron Microscopy): Chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua): cho phép ghi hình ảnh và xác định kích thước giọt vi nhũ tương với độ phân giải cao. 1.3.5. Ưu và nhược điểm của vi nhũ tương [24]  Ưu điểm: - Hệ vi nhũ tương làm tăng khả năng hòa tan các hoạt chất ưa dầu trong trong nước, đặc biệt là các hoạt chất ít tan trong nước, giúp tăng khả năng hấp thụ hoạt chất qua đường uống. - Chất HĐBM và chất đồng HĐBM có khả năng làm giảm sức căng bề mặt giữu các pha do tính lưỡng thân của chúng. Vì vậy, vi nhũ tương dễ dàng thấm qua các màng sinh học, làm tăng tính sinh khả dụng của hoạt chất. - Có khả năng bảo vệ các hoạt chất cao, đặc biệt là các hoạt chất dễ bị phân hủy và oxy hóa. 19 - Hình thức vi nhũ tương trong suốt, đẹp hơn so với nhũ tương. - Hệ thống nhiệt động ổn định, bền vững vì vậy có thể duy trì ổn định, không bị phân lớp trong thời gian dài. - Kỹ thuật bào chế đơn giản. Vi nhũ tương được tạo thành tức thời và ít tiêu tốn năng lượng như bào chế nhũ tương thông thường  Nhược điểm: - Số lượng các chất HĐBM không độc hại cho việc sử dụng các ứng dụng dược phẩm, thực phẩm hạn chế - Các thông số nhiệt độ, ánh sáng, pH,… ảnh hưởng nhiều đến sự ổn định của vi nhũ tương. - Khó xác định tỷ lệ các thành phần trong công thức để tạo thành vi nhũ tương. Giá thành cao. Sử dụng nhiều chất HĐBM hơn so với nhũ tương thông thường. Vi nhũ tương Nhũ tương Hình 1.7. Sự khác nhau về bề ngoài giữa vi nhũ tương và nhũ tương 1.3.6. Ứng dụng của vi nhũ tương: Sự có mặt của chất HĐBM trong vi nhũ tương làm cho kích thước hạt của hệ vi nhũ tương rất nhỏ, tăng hàm lượng hoạt chất trong công thức và tăng độ ổn định vật lý. Điều này giúp cho vi nhũ tương được ứng dụng để cải thiện độ tan của các hoạt chất khó tan trong nước, do đó có ứng dụng quan trọng trong dược phẩm, mỹ phẩm và đặc biệt là công nghiệp thực phẩm. 20 1.3.7. Phương pháp điều chế vi nhũ tương [32] Có nhiều kỹ thuật khác nhau để điều chế vi nhũ tương nhưng có thể chia thành 2 kỹ thuật chính (Acosta, 2009): a) Phương pháp năng lượng cao (phương pháp cơ học): dùng các thiết bị cơ học như máy đồng hóa áp suất cao, máy đồng hóa siêu âm,… để phá vỡ pha phân tán thành các giọt nhỏ. Nhược điểm của phương pháp này là tốn nhiều năng lượng, thiết bị đắt tiền nên giá thành cao, khó áp dụng trên quy mô công nghiệp. Thông thường khó đạt được kích thước giọt dưới 100 nm chỉ bằng cách dùng phương pháp năng lượng cao mà phải kết hợp với phương pháp thay thế/bay hơi dung môi (Wooster và cộng sự 2008). Ví dụ: điều chế vi nhũ tương O/W bằng cách sau: pha dầu được hòa tan trong dung môi hữu cơ, sau đó vừa thêm pha nước (là dung dịch chất HĐBM tan trong nước) vào pha dầu vừa đồng hóa. Dung môi hữu cơ sau đó được đuổi khỏi hệ bằng cách bay hơi dùng thiết bị cô quay, khi đó tạo ra những giọt dầu kích thước nhỏ phân tán trong nước. Các dung môi hữu cơ dùng trong phương pháp này phải tan trong dầu, không độc hại, có nhiệt độ sôi thấp để dễ loại bỏ bằng cách cô quay (thường dùng acetate ethyl, hexan). b) Phương pháp năng lượng thấp (phương pháp hóa học): dựa trên sự tạo thành các giọt nhỏ của pha phân tán được ổn định nhờ các chất HĐBM (tức dùng năng lượng hóa học). Các phương pháp hóa học thông dụng là phương pháp đảo pha (phase inversion method) và chuẩn độ pha (phase titration method). Ưu điểm của phương pháp này là nhũ tương được tạo thành tức thời, không cần tốn năng lượng. Nhược điểm là cần dùng lượng lớn chất HĐBM và chất đồng HĐBM. Việc chọn chất HĐBM không độc hại để điều chế vi nhũ tương ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm khá hạn chế. * Phương pháp đảo pha: Trong phương pháp này hệ chuyển từ loại vi nhũ tương W/O thành O/W hay ngược lại bằng cách thay đổi thành phần nhũ tương và/hay điều kiện môi trường (nhiệt độ, pH, lực ion). Phương pháp này bao gồm: - Đảo pha bằng nhiệt độ (PIT: Phase Inversion Temperature): Phương pháp dựa trên khả năng thay đổi cấu trúc hình học (độ uốn cong) của chất HĐBM không ion khi thay đổi nhiệt độ. Nhiệt độ tại đó hệ chuyển từ nhũ tương O/W sang nhũ tương W/O 21 gọi là nhiệt độ chuyển pha (ký hiệu: PIT). Ở nhiệt độ thấp hơn PIT đầu phân cực của chất HĐBM có kích thước khá lớn nên hướng ra ngoài pha nước, do đó bao bọc các giọt dầu tạo thành các nhũ tương O/W. Ở nhiệt độ bằng PIT, phần đuôi không phân cực bị bẻ cong do chuyển động nhiệt, các giọt nhũ tương O/W bị phá vỡ tạo thành cấu trúc có dạng tấm. Ở trên PIT thì đuôi không phân cực có kích thước lớn do bị bẻ cong nhiều nên quay ra ngoài, do đó chuyển nhũ tương thành dạng W/O. - Đảo pha bằng cách thay đổi thành phần (PIC: Phase Inversion Composition): Phương pháp này dựa trên sự thay đối đặc tính uốn cong phân tử chất HĐBM bằng cách thay đổi thành phần hệ vi nhũ tương (ví dụ: thay đổi pH, thêm muối vào) để thay đổi điện tích đầu phân cực của chất HĐBM thay vì thay đổi nhiệt độ. Phương pháp này chỉ áp dụng để điều chế vi nhũ tương ổn định bằng chất HĐBM ion. Việc thêm muối vào hệ có thể làm giảm điện tích bề mặt của chất HĐBM. Việc tăng pH > pKa của chất HĐBM chứa nhóm –COOH sẽ làm tăng khả năng ion hóa nhóm carboxyl, làm cho chất HĐBM dễ tan trong nước hơn nên hệ trở thành nhũ tương O/W; ngược lại, khi pH < pKa thì hệ trở thành nhũ tương W/O. Tương tự, việc tăng lực ion của hệ cũng có thể đảo pha vi nhũ tương O/W thành W/O và ngược lại, khi pha loãng dung dịch thì thành vi nhũ tương O/W. Phương pháp điểm đảo nhũ tương (EIP: Emulsion Inversion Point): Khác với phương pháp PIT và PIC, trong phương pháp EIP việc chuyển từ vi nhũ tương W/O thành O/W thông qua giai đoạn trung gian tạo thành vi nhũ tương 2 pha liên tục xảy ra khi thêm dần pha nước vào vi nhũ tương W/O đã được tạo thành ban đầu, hay khi thêm dần pha dầu vào vi nhũ tương O/W. Nhược điểm của phương pháp này là chỉ có thể sử dụng các chất HĐBM phân tử nhỏ tan tốt trong nước và dầu, có khả năng ổn định cả vi nhũ tương O/W và W/O. Tuy nhiên, phương pháp này ít tiêu tốn năng lượng và không cần thay đổi nhiệt độ. - Phương pháp chuẩn độ pha loãng nhũ tương (Emulsion Titration/Dilution Method) Phương pháp này được phát triển trong những năm gần đây và có thể được xếp vào phương pháp năng lượng cao hay năng lượng thấp. Quá trình điều chế thông qua 2 bước, trong đó một nhũ tương O/W thông thường (pha dầu có thể là dầu chanh, vitamin E, vitamin D) được tạo thành trước đó và sau đó được pha loãng bằng cách thêm dần dung dịch chứa micelle keo của một chất HĐBM không ion (ví dụ: Tween 22 20, 40, 60, 80). Sơ đồ điều chế vi nhũ tương bằng phương pháp pha loãng nhũ tương được thể hiện trong sơ đồ (Hình 1.8). Pha dầu: Cho hoạt chất vào pha dầu Pha nước: Hòa tan các chất (có thể thêm chất HĐBM ưa dầu để HĐBM và chất đồng HĐBM tăng độ tan của hoạt chất). Đồng hóa tan trong nước Khuấy trộn (dùng máy khuấy từ hay máy đồng hóa áp suất cao) Vi nhũ tương Hình 1.8. Sơ đồ bào chế vi nhũ tương bằng phương pháp chuẩn độ nhũ tương Kết quả nghiên cứu cho thấy bản chất chất HĐBM không ion ảnh hưởng không đáng kể đến sự hình thành và khả năng phân tán của hệ keo. Trong phương pháp này nồng độ dầu có thể dùng để tạo thành các hạt vi nhũ tương bị giới hạn và được xác định bằng lượng nhũ tương đem chuẩn độ. Thực nghiệm cũng cho thấy rằng để tạo hệ vi nhũ tương O/W có kích thước giọt dưới 100 nm thì nồng độ dầu trong hỗn hợp cuối cùng phải không quá 1,5% w/w. Nói cách khác, khi nồng độ dầu trong nhũ tương O/W ban đầu thấp thì các phân tử dầu trong các giọt nhũ tương này sẽ đi ra khỏi giọt và chui vào bên trong các hạt micelle của chất HĐBM. Phương pháp này cho phép điều chế vi nhũ tương khá dễ dàng và có thể dùng để chuyển giao các hoạt chất ưa dầu như dược phẩm, chất màu, chất thơm hay chất bảo quản nhằm ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và nước giải khát. Nhược điểm của phương pháp chuẩn độ nhũ tương là chỉ có thể sử dụng các chất HĐBM không ion phân tử nhỏ và pha dầu phải có độ nhớt thấp và không phải là triglycerid, nồng độ dầu cuối cùng nạp trong micelle chất HĐBM cũng khá thấp. Trong số các phương pháp điều chế vi nhũ tương nói trên thì phương pháp pha nhữ tương và chuẩn độ nhũ tương là các phương pháp đơn giản nhất, ít đòi hỏi năng lượng. Do đó, trong đề tài này sử dụng 2 phương pháp này để điều chế vi nhũ tương O/W của lutein. 23 1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu về vi nhũ tương 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về vi nhũ tương và ứng dụng của nó trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Việc bào chế vi nhũ tương dầu trong nước sử dụng chất hoạt động bề mặt HLB cao hoặc HLB thấp do Rosano thực hiện năm 1979. Nhưng nghiên cứu này vẫn còn dừng lại ở hai chất nhũ hóa [24]. Trong y học, Belenduik và cộng sự (1995) đã nghiên cứu sự kết hợp các hạt dược phẩm, trong đó các hoạt chất kết hợp chặt chẽ với nhau thành các hạt ở dạng vi nhũ tương. Lớp ngoài các hạt là lớp vỏ chất ưa nước hoặc ưa dầu ngăn cách các hạt với nhau. Hỗn hợp bao gồm chất nhũ hóa polysorbate 80 hoặc glycerol monooleate [24]. Nagahana và cộng sự (2001), nghiên cứu những vi nhũ tương sử dụng trong các loại thuốc tan trong dầu. Hỗn hợp cần có một loại dầu có tính phân cực cao, một loại dầu có tính phân cực thấp, polyglycerol, và alcol chứa nhiều nhóm hydroxyl có khả năng hòa tan trong nước [24]. Van Den Braak và cộng sự (2003) nghiên cứu vi nhũ tương beta carotene sử dụng hỗn hợp hai chất HĐBM. Những vi nhũ tương này cũng có thể sử dụng hỗn hợp ba chất HĐBM. Nghiên cứu chỉ ra rằng acid béo của chất nhũ hóa kết hợp với acid béo của pha dầu tạo thành hỗn hợp đồng nhất [24]. Kahlweit (1982), Lessner và cộng sự (1983), Sottmann & Strey (1997) đã nghiên cứu về khả năng hòa tan và các đặc tính bề mặt của các vi nhũ tương phụ thuộc vào áp suất, nhiệt độ và tính chất, nồng độ của các thành phần [8]. Acosta và cộng sự (2004, 2005) nghiên cứu các mối liên kết, cũng như sức căng bề mặt giữa bề mặt phân cách pha: hydrophilic và các mối liên kết ưa mỡ (ví dụ như hexyl polyglucoside và sorbitan monoleate tương ứng) cùng với các hoạt động bề mặt (ví dụ: lecithin) giảm sức căng bề mặt. Điều này tạo điều kiện hình thành vi nhũ tương và ứng dụng vào khai thác dầu [8]. H.S. Ribeiro, K.Ax, Andh. Schubert đã nghiên cứu độ ổn định của nhũ tương lycopene trong ba loại thực phẩm sữa tách kem, nước cam và nước cho thấy rằng sự ổn định của nhũ tương lycopene phụ thuộc nhiều vào loại thực phẩm, còn chất nhũ hóa sử dụng ít ảnh hưởng đến độ ổn định của nhũ tương lycopen [8]. 24 Vào năm 2003, Hua và cộng sự đã nghiên cứu vi nhũ tương vinpocetin dùng qua da. Vinpocetin là chất hòa tan kém vì vậy nó được điều chế dưới dạng vi nhũ tương để tăng khả năng hòa tan và hấp thu in vitro của thuốc. Pha dầu là acid oleic có khả năng hòa tan và hấp thu tốt qua da. Cremophor RH 40 được chọn làm chất diện hoạt và Transcutol P là chất đồng diện hoạt. Công thức vi nhũ tương tối ưu thu được: 1% vinpocetin, 4% acid oleic, 20% Cremophor RH 40, 10% Transcutol P và 65% nước [18]. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong nước gần đây đã có một số công trình nghiên cứu bào chế các loại thuốc bôi ngoài da dưới dạng vi nhũ tương dầu/nước nhằm tăng độ thấm qua da cho các loại thuốc bôi ngoài da. Ví dụ: nghiên cứu của tác giả Khương Thị Mai Lan (2008) về bào chế vi nhũ tương natri diclofenac dùng qua da [4] . Một số loại dược phẩm sử dụng theo đường uống cũng được nghiên cứu bào chế dưới dạng vi nhũ tương để kéo dài thời gian phóng thích hoạt chất và khả năng hấp thu thuốc trong cơ thể Ví dụ: bào chế hệ nano piroxicam của Nguyễn Thị Mai Anh (2011) [2]. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu ứng dụng vi nhũ tương trong công nghiệp thực phẩm hầu như chưa có. Võ Đình Nguyên Thảo (2015) lần đầu tiên đã nghiên cứu điều chế vi nhũ tương lutein tan trong nước sử dụng hỗn hợp Tween 80 và lecithin làm chất nhũ hóa [7]. Theo nghiên cứu này, tác giả đã xây dựng được quy trình tối ưu điều chế vi nhũ tương lutein tan trong nước như sau: Cho pha dầu chứa lutein 10% w/w trong dầu nành vào hỗn hợp chất nhũ hóa gồm Tween 80 và lecithin, khuấy đều. Thêm nước cất 2 lần vào pha dầu đã trộn với hỗn hợp chất nhũ hóa và đồng hóa ở 9000 rpm trong 30 phút. Để điều chế được vi nhũ tương lutein có cường độ màu lớn nhất và trong suốt nhất thì tỷ lệ dầu/nước tối ưu là 0,02 % w/w; nồng độ Tween 80 và lecithin trong hệ vi nhũ tương thu được lần lượt là 17,31 và 0,5% w/w. Quy trình điều chế vi nhũ tương lutein nói trên đơn giản, dễ thực hiện. Kết quả cho thấy hệ vi nhũ tương thu được có màu cam đậm, trong suốt rất đẹp, có kích thước hạt 10 - 25 nm, tan vô hạn trong nước. Sản phẩm có bổ sung 0,1% vitamin E tương đối bền màu trong môi trường acid yếu-trung tính và ở 40C trong tối. Tuy nhiên, khi bảo quản ở nhiệt phòng có ánh sáng chiếu trực tiếp thì cường độ màu suy giảm nhanh (chỉ còn lại là 48,24% sau 1 tháng bảo quản). Do sản phẩm kém bền màu nên sản phẩm chỉ 25 có thể ứng dụng tạo màu cho các loại thực phẩm bảo quản lạnh hay các thực phẩm ăn trong ngày, thực phẩn có thời gian bảo quản ngắn. Vì vậy, trong đồ án này sẽ nghiên cứu cải tiến công thức vi nhũ tương (điều chỉnh thành phần chất nhũ hóa, điều chỉnh tỷ lệ bổ sung vitamin E, thay đổi phương pháp bảo quản vi nhũ tương) nhằm cải thiện độ bền và mở rộng khả năng ứng dụng của sản phẩm vi nhũ tương thu được. 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Lutein tinh thể (tinh khiết > 92%) thu nhận được từ hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.) theo quy trình của tác giả Hoàng Thị Huệ An và cộng sự [6]. - Tween 80 (tức polyoxyethylen (20) sorbitan monooleat): mã số E433, là chất HĐBM ưa nước (có HLB = 15), ở dạng lỏng hơi sệt, có màu vàng, là hóa chất tinh khiết hóa học (Xilong, Trung Quốc). - Lecithin từ đậu nành (mã số E322): là chất HĐBM ưa dầu, có HLB = 7-9; là chất lỏng hơi sệt, màu vàng nâu, hóa chất thực phẩm (Tianjin, Trung Quốc). - Propylen glycol (tinh khiết 99,5%): hóa chất thực phẩm (Shandong, Trung Quốc). - Acid citric monohydrate (tinh khiết 99,5%): hóa chất thực phẩm (Sanghai, Trung Quốc). - Hương cam: ở dạng lỏng, hóa chất thực phẩm (Guangdong, Trung Quốc). - Dầu đậu nành: loại dùng trong chế biến thực phẩm của Công ty Dầu Tường An (TP. Hồ Chí Minh). - Vitamin E: loại dùng trong chế biến thực phẩm (Sanghai, Trung Quốc). - Bột agar-agar loại dùng trong chế biến thực phẩm của Công ty TNHH Hải Long (TP. Hải Phòng). - Nước cất 2 lần do Trung tâm Thí nghiệm-Thực hành (Trường Đại học Nha Trang) cung cấp. 2.2. Thiết bị - Cân phân tích chính xác  10-4 g (Satorius, Nhật) - Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA, Đức) - Bể siêu âm Elmasonic S100 H (ELMA, Đức) - Quang phổ kế tử ngoại-khả kiến Cary 50 (Varian, Úc) - Nhớt kế LVDV-E (Brookfield, Mỹ) - Khúc xạ kế để bàn AR40 (Kruss, Đức) - Thiết bị đo kích thước hạt nano Mastersizer Range (Malvern, Anh) 27 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Sơ đồ điều chế nhũ tương lutein Trong nghiên cứu này, tiến hành điều chế nhũ tương lutein bằng phương pháp thay thế dung môi, trong đó pha dầu (chứa lutein tan trong dầu nành) được phối trộn với hỗn hợp chất HĐBM (lecithin và Tween 80). Ngoài ra, còn thêm chất propylen glycol là chất đồng HĐBM và cũng là đồng dung môi. 28 Phương pháp điều chế nhũ tương lutein như sau: Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp chất HĐBM (ký hiệu: S) Cho Tween 80 và lecithin vào một cốc thủy tinh với tỷ lệ xác định, khuấy nhẹ cho đến khi thu được hỗn hợp đồng nhất. Bước 2: Chuẩn bị pha dầu chứa lutein (ký hiệu: O) Chuẩn bị dung dịch dầu nành chứa lutein bằng cách thêm từng lượng nhỏ lutein tinh thể (đã nghiền mịn) vào dầu nành khuấy đều, sau đó siêu âm ở 60oC trong 20 phút để lutein tan hoàn toàn. Bước 3: Tạo nhũ tương O/W bằng phương pháp đảo pha Cho pha dầu vào hỗn hợp chất HĐBM, khuấy nhẹ cho đến khi hệ sệt đồng nhất. Tiếp theo, cho propylen glycol vào với tỷ lệ xác định, khuấy đều cho đến khi hệ trở thành nhũ tương W/O chứa propylen glycol phân tán trong pha dầu. Thêm từ từ nước cất 2 lần vào hỗn hợp trên, vừa thêm vừa đồng hóa. Khi đó, các giọt dầu sẽ được phân tán trong pha nước và được ổn định bằng các chất HĐBM tạo thành hệ nhũ tương O/W. Chất HĐBM (S): - Tween 80 = ? %w/w - Lecithin = ? %w/w Pha dầu (O) Lutein/dầu = ? %w/w Khuấy nhẹ Propylen glycol(CoS) = ? %w/w (S+CoS)/O = ? w/w Hỗn hợp chất nhũ hóa - pha dầu Nước cất 2 lần Đồng hóa Nhũ tương lutein trong nước Hình 2.2. Sơ đồ điều chế nhũ tương lutein Ghi chú: % w/w lutein được tính theo khối lượng pha dầu % w/w Tween 80, lecithin, propylen glycol được tính theo khối lượng của toàn hệ sau khi nước được thêm vào 29 2.4.2. Xác định công thức bào chế vi nhũ tương Để hệ phân tán điều chế được là hệ vi nhũ tương thì các thành phần cấu tạo nên hệ phải được phối trộn theo một tỷ lệ thích hợp sao cho các giọt dầu được phân tán đến kích thước 10-100 nm và được ổn định tốt bởi các hỗn hợp chất nhũ hóa HĐBM-chất đồng HĐBM. Khi đó, hệ sẽ có vẻ ngoài trong suốt, đồng nhất do không xảy ra hiện tượng tán xạ ánh sáng trên bề mặt các giọt dầu. Nếu quan sát thấy hệ trở nên đục nghĩa là đã xảy ra quá trình keo tụ các hạt vi nhũ tương thành các hạt có kích thước lớn, tức là hệ không bền vững. Do đó, trong nghiên cứu này sẽ sử dụng độ trong suốt (được quan sát bằng mắt) là tiêu chuẩn để xác định sự tồn tại của hệ vi nhũ tương. Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành vi nhũ tương là: - Thành phần chất nhũ hóa (Tỷ lệ Tween 80, lecithin, propylen glycol) - Tỷ lệ dầu (O): với một lượng chất nhũ hóa đã cho, nếu tỷ lệ dầu càng nhỏ thì các giọt dầu được nhũ hóa càng hoàn toàn, hệ vi nhũ tương sẽ càng bền vững. - Nồng độ lutein/dầu: Nồng độ lutein càng lớn thì màu của hệ vi nhũ tương càng đậm. Tuy nhiên, nồng độ lutein/dầu quá lớn cũng sẽ làm cho một phần lutein không tan được nên bị tách ra khỏi pha dầu, đi vào pha nước làm hệ vẩn đục. - Điều kiện đồng hóa: Tốc độ đồng hóa và thời gian đồng hóa càng lớn thì các giọt dầu có kích thước càng nhỏ, do đó hệ càng trong suốt. Trong nghiên cứu này đồng hóa bằng máy khuấy từ, cố định tốc độ khuấy trộn là 1250 rpm trong 30 phút. Để xác định công thức điều chế vi nhũ tương lutein, trong nghiên cứu này sẽ khảo sát sự thay đổi đặc tính trong suốt của hệ nhũ tương thu được khi thay đổi các thông số ảnh hưởng trên: - Tween 80: 3-18% w/w - Lecithin: 0,1-0,5 % w/w - Propylen glycol: 0-4% w/w - Tỷ lệ pha dầu: 1,60% w/w - Nồng độ lutein trong dầu nành: 5-10% w/w (tính theo lượng dầu nành). 2.4.2.1. Chọn tỷ lệ Tween 80 Điều chế hệ nhũ tương lutein như đã mô tả ở mục 2.4.1, trong đó nồng độ Tween 80 thay đổi lần lượt là: 3; 6; 9; 12; 15; 18 (% w/w), còn các tỷ lệ sau giữ cố định: 30 - Lecithin: 0,5% w/w - Propylen glycol: 4% w/w - Tỷ lệ dầu: 1,60% w/w - Nồng độ lutein/dầu nành: 0,5% w/w Sau khi cho pha dầu vào hỗn hợp chất nhũ hóa, thêm nước cất 2 lần vào từng lượng nhỏ (vừa thêm vừa đồng hóa, để yên trong 10 phút rồi quan sát) cho đến lúc thấy hệ bắt đầu chuyển từ trong suốt sang mờ đục (dấu hiệu của sự chuyển từ trạng thái vi nhũ tương sang nhũ tương). Ghi thể tích nước cất đã dùng. Tỷ lệ Tween 80 được chọn ứng với thể tích nước cần dùng để chuẩn độ lớn nhất. Chất HĐBM (S): - Tween 80: 6; 9; 12; 15; 18 %w/w - Lecithin: 0,5% w/w Pha dầu (O): - Lutein/dầu: 0,5 % w/w - Dầu: 1,6% w/w Khuấy nhẹ Propylen glycol: 4 %w/w Hỗn hợp chất nhũ hóa - pha dầu Nước cất 2 lần Đồng hóa Hệ bắt đầu đục VH2O (ml) chuẩn bị chuẩn độ % Tween 80 thích hợp Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ Tween 80. 2.4.2.2. Chọn tỷ lệ propylen glycol Phối trộn hỗn hợp chất HĐBM với pha dầu tương tự như mục 2.4.2.1, trong đó tỷ lệ propylen thay đổi lần lượt là: 0; 1; 2; 3; 4 % w/w. Các thông số sau được giữ cố định: - Tỷ lệ Tween 80 thích hợp đã chọn Lecithin: 0,5 % w/w 31 - Tỷ lệ dầu: 1,60% w/w - Nồng độ lutein/dầu nành: 0,5% w/w Nước cất 2 lần được thêm vào đến đủ 100% w/w. So sánh độ trong suốt của các hệ nhũ tương thu được. Từ đó, chọn tỷ lệ lecithin thích hợp. Pha dầu (O): - Lutein/dầu: 0,5 % w/w - Dầu: 1,6% w/w Chất HĐBM (S): - Tween 80: tỷ lệ thích hợp - Lecithin: 0,5% w/w Propylen glycol: 0;1;2;3; 4% w/w Khuấy nhẹ Hỗn hợp chất nhũ hóa - pha dầu Nước cất 2 lần Đồng hóa Nhũ tương lutein trong nước Quan sát độ trong suốt % Propylen glycol thích hợp Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ propylen thích hợp 2.4.2.3. Chọn tỷ lệ lecithin Tiến hành tương tự như mục 2.4.2.1, trong đó tỷ lệ lecithin thay đổi lần lượt là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 % w/w. Các thông số sau được giữ cố định: - Tỷ lệ Tween 80 và propylen glycol thích hợp đã chọn - Tỷ lệ dầu: 1,60% w/w - Nồng độ lutein/dầu nành: 0,5% w/w Nước cất 2 lần được thêm vào đến đủ 100% w/w. So sánh độ trong suốt của các hệ nhũ tương thu được. Từ đó, chọn tỷ lệ lecithin thích hợp. 32 Pha dầu (O): - Lutein/dầu: 0,5 % w/w - Dầu: 1,6% w/w Chất HĐBM (S): - Tween 80: tỷ lệ thích hợp - Lecithin: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5%w/w Khuấy nhẹ Propylen glycol: 4 %w/w Hỗn hợp chất nhũ hóa - pha dầu Nước cất 2 lần Đồng hóa Nhũ tương lutein trong nước Quan sát độ trong suốt Tỷ lệ lecithin thích hợp Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ lecithin thích hợp 2.4.2.4. Chọn tỷ lệ lutein/dầu nành Tiến hành tương tự như mục 2.4.2.1, trong đó tỷ lệ lutein/dầu nành thay đổi lần lượt là 5,00; 6,25; 7,50; 8,75; 10,00% w/w (tỷ lệ này được tính theo % khối lượng dầu). Các thông số sau được giữ cố định: - Tỷ lệ Tween 80, propylen glycol, lecithin,thích hợp đã chọn - Tỷ lệ dầu: 1,60% w/w Nước cất 2 lần được thêm vào đến đủ 100% w/w. So sánh độ trong suốt của các hệ nhũ tương thu được. Từ đó, chọn tỷ lệ lutein thích hợp. 33 Pha dầu (O): - Lutein: 5; 6,25; 7,50; 8,75; 10% w/w - Dầu: 1,6% w/w Chất HĐBM (S): - Tween 80: tỷ lệ thích hợp - Lecithin: tỷ lệ thích hợp Tỷ lệ propylen glycol thích hợp Khuấy nhẹ Hỗn hợp chất nhũ hóa - pha dầu Nước cất 2 lần Đồng hóa Nhũ tương lutein trong nước Quan sát độ trong suốt Tỷ lệ lutein/dầu thích hợp Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ lutein/dầu nành thích hợp 2.4.2.5. Chọn tỷ lệ chất nhũ hóa/dầu (S/O) Sau khi xác định được thành phần hỗn hợp chất nhũ hóa thích hợp (tỷ lệ Tween 80, lecithin, propylen glycol) và tỷ lệ lutein/dầu, để xác định tỷ lệ S/O thích hợp tiến hành xây dựng giản đồ pha của hệ nhũ tương lutein bằng phương pháp chuẩn độ pha với nước cất 2 lần, trong đó: - Cố định tỷ lệ các chất nhũ hóa (Tween 80:Lecithin: Propylen glycol bằng tỷ lệ thích hợp đã chọn). - Thay đổi tỷ lệ S/O lần lượt từ 1/99 – 99/1 w/w và lượng nước được thêm từ từ vào hỗn hợp pha dầu – chất nhũ hóa cho đến lúc quan sát thấy hệ bắt đầu chuyển từ trong suốt sang hơi mờ đục (mỗi lần thêm từng lượng nhỏ, vừa thêm vừa đồng hóa, để hệ vi nhũ tương ổn định 10 phút rồi quan sát). Ghi thể tích nước cất tiêu tốn để chuẩn 34 độ (VH2O, ml). Tỷ lệ S/O được chọn là giá trị nhỏ nhất có thể được để hệ vi nhũ tương gần như tan vô hạn trong nước. 2.4.3. Xây dựng giản đồ pha của hệ vi nhũ tương Dựa vào kết quả khảo sát ở mục 2.4.2.5 có thể xây dựng giản đồ pha của hệ vi nhũ tương lutein. Đây là giản đồ 3 pha, chứa 3 thành phần sau: - Hỗn hợp chất nhũ hóa (Tween 80-Lecithin-Propylen glycol): ký hiệu S - Pha dầu (% O, w/w) - Pha nước (% W, w/w) = 100% - %S - % O Ranh giới giữa vùng vi nhũ tương (hệ trong suốt) và vùng nhũ tương (hệ mờ đục) ứng với các điểm chuyển trạng thái của hệ được xác định bằng phương pháp chuẩn độ pha (hệ chuyển từ trong suốt sang mờ đục). Dựa vào giản đồ pha của hệ đã xây dựng, có thể xác định tỷ lệ S/O thích hợp cho từng mục đích ứng dụng khác nhau của vi nhũ tương lutein. 2.4.4. Chọn tỷ lệ vitamin E bổ sung Theo kết quả nghiên cứu trước đây, hệ vi nhũ tương lutein thường kém bền màu khi có mặt của không khí, đặc biệt dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ [7]. Nguyên nhân là khi đó đã xảy ra sự phân hủy sắc tố này do sự oxy hóa lutein bởi oxy không khí. Vì vậy, để cải thiện độ bền màu của vi nhũ tương lutein đồng thời tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm chúng tôi nghiên cứu bổ sung chất chống oxy hóa là vitamin E trong pha dầu chứa lutein. Quá trình thí nghiệm như sau: Chuẩn bị pha dầu chứa lutein, trong đó bổ sung vitamin E với các tỷ lệ khác nhau 0,00; 25; 50; 75; 100% w/w. Nồng độ lutein trong dầu nành, thành phần hỗn hợp chất nhũ hóa S (Tween 80: lecithin: propylen glycol) và tỷ lệ phối trộn chất nhũ hóa và pha dầu (S/O) được xác định từ các kết quả đã khảo sát trên đây. Thêm nước cất 2 lần vào và đồng hóa để thu được vi nhũ tương lutein. Tỷ lệ vitamin E bổ sung được chọn dựa trên việc khảo sát khả năng bảo vệ vi nhũ tương lutein dưới tác động của môi trường (nhiệt độ; tác động của ánh sáng; thời gian). Trong nghiên cứu này, để rút ngắn thời gian khảo sát, tiến hành gia nhiệt mẫu ở các điều kiện sau: - Mẫu đối chứng: để ở nhiệt độ phòng (300C; 15 phút; 45 phút) - Mẫu gia nhiệt: 600C (15 phút); 800C (15 phút); 1000C (15 phút; 45 phút) 35 Đo cường độ màu bằng quang kế UV-Vis ở 455 nm để đánh giá % lutein còn lại. Từ đó, chọn tỷ lệ vitamin E thích hợp. Đây cũng là cơ sở để đánh giá khả năng ứng dụng vi nhũ tương lutein trong các loại thực phẩm được chế biến có gia nhiệt. Pha dầu (O): - Lutein/dầu nành: tỷ lệ thích hợp Chất HĐBM (S): - Tween 80: tỷ lệ thích hợp - Lecithin: tỷ lệ thích hợp - Propylen glycol: tỷ lệ thích hợp - Vit E/Lutein: 0; 25; 50; 75; 100% w/w - Dầu nành - S/O thích hợp - Khuấy đều Hỗn hợp chất nhũ hóa - pha dầu (S+O) Nước cất 2 lần (W) Đồng hóa Vi nhũ tương lutein trong nước Gia nhiệt 300C (15; 45 phút) 600C (15 phút) 800C (15 phút) 1000C (15; 45 phút) So sánh độ bền màu Tỷ lệ vitamin E thích hợp Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế độ gia nhiệt và hàm lượng vitamin E đến độ bền của vi nhũ tương lutein 36 2.4.5. Xác định công thức điều chế vi nhũ tương lutein - Điều chế và khảo sát một số tính chất hóa – lý đặc trưng Dựa vào những kết quả khảo sát ở trên, xác định công thức điều chế vi nhũ tương lutein. Từ đó, tiến hành điều chế và khảo sát một số đặc trưng hóa-lý của hệ vi nhũ tương thu được. Các đặc tính hóa lý khảo sát bao gồm: a) Màu sắc b) Cường độ màu c) Độ khúc xạ ánh sáng d) Độ nhớt e) Phân bố kích thước hạt vi nhũ tương f) Độ bền màu của sản phẩm: đánh giá qua việc khảo sát ảnh hưởng của trạng thái bảo quản và điều kiện bảo quản khác nhau * Ảnh hưởng của trạng thái bảo quản Cân mẫu vi nhũ tương đậm đặc đã điều chế được thành những lượng chính xác (1,000 g), cho vào các bình nón. Bảo quản các mẫu ở nhiệt độ phòng, trong tối. Định kỳ 4 ngày/lần lấy mẫu ra, cho từ từ nước cất 2 lần vào (tỷ lệ pha loãng giống như đối với mẫu vi nhũ tương dạng loãng), đồng hóa (1250 rpm, 30 phút). Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch ở 455 nm và tính % lutein còn lại trong dung dịch. So sánh với kết quả thu được với các mẫu bảo quản vi nhũ tương ở dạng loãng. Từ đó, chọn trạng thái bảo quản thích hợp (Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Hình 2.8). * Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản Tiến hành thí nghiệm bảo quản vi nhũ tương dạng loãng trong lọ kín ở 3 điều kiện khác nhau: - Nhiệt độ phòng, trong tối (kí hiệu là P-T). - Nhiệt độ phòng có tác động trực tiếp của ánh sáng (kí hiệu là P-S) - Ở 40C, trong tối (kí hiệu là 4-T). Định kỳ 4 ngày/lần lấy mẫu ra xác định nồng độ lutein còn lại của từng mẫu. Đánh giá ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến độ bền màu của hệ vi nhũ tương (Sơ đồ bố trí thí nghiệm : Hình 2.9). 37 Nước cất 2 lần Vi nhũ tương đậm đặc Vi nhũ tương loãng Bảo quản (t0 phòng; tối): Bảo quản (t0 phòng; tối): 0; 4; 8; 12; 16; 20; 24 ngày 0; 4; 8; 12; 16; 20; 24 ngày Đồng hóa Vi nhũ tương lutein loãng Đo cường độ màu (455 nm) % Lutein còn lại Chọn trạng thái bảo quản thích hợp Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá độ bền của vi nhũ tương lutein ở các điều kiện bảo quản khác nhau Vi nhũ tương lutein dạng loãng (0,5000 g/40 ml nước) Bảo quản P-S P-T 4-T Đo cường độ màu (455 nm) % Lutein còn lại Điều kiện bảo quản thích hợp Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn trạng thái bảo quản vi nhũ tương lutein 38 2.4.6. Nghiên cứu khả năng ứng dụng vi nhũ tương lutein tạo màu thực phẩm Do thời gian nghiên cứu hạn chế, trong nghiên cứu này chỉ thử nghiệm ứng dụng sản phẩm vi nhũ tương lutein để tạo màu cho đông sương. 2.4.6.1. Chọn nồng độ vi nhũ tương lutein thích hợp để tạo màu Cho 10 g bột agar-agar vào 1000 ml nước, đem đun sôi. Sau 5 phút, bổ sung đường (25% w/w), hương cam (0,05% v/v), acid citric (0,05% w/v), trộn đều. Chia ra nhiều phần bằng nhau (mỗi phần 25 ml, cho vào các cốc thủy tinh giống hệt nhau). Tiến hành tạo màu bằng cách thêm dung dịch vi nhũ tương lutein đã pha loãng vào dịch agar với tỷ lệ thay đổi lần lượt như sau: 2%, 4%, 6%, 8% và 10% (v/v). Hỗn hợp được khuấy cho đến khi đồng nhất, rồi để nguội cho đông tụ. Đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm. Từ đó, chọn nồng độ vi nhũ tương lutein thích hợp để tạo màu. Nước Bột agar Khuấy đều Đun sôi (5 phút) Khuấy đều Dịch agar - Đường : 25% w/v - Hương cam 0,05% v/v - Acid citric 0,05% w/v Bổ sung vi nhũ tương lutein: 2; 4; 6; 8; 10 % v/v Để nguội Đánh giá cảm quan Chọn nồng độ vi nhũ tương lutein thích hợp Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ vi nhũ tương lutein thích hợp tạo màu cho đông sương 39 2.4.6.2. Đánh giá độ bền màu của sản phẩm đông sương tạo màu bằng vi nhũ tương lutein Sản phẩm đông sương tạo màu bằng vi nhũ tương lutein được bảo quản ở nhiệt độ 40C, trong tối. Theo dõi sự thay đổi màu sắc của sản phẩm theo thời gian, từ đó đánh giá được độ bền màu của chúng. 2.4.7. Phương pháp phân tích a) Đặc tính hấp thụ ánh sáng - Màu sắc: quan sát bằng mắt - Cường độ màu: được xác định qua giá trị độ hấp thụ của hệ vi nhũ tương ở 455 nm (A455)1 với dung dịch so sánh là mẫu vi nhũ tương được tiến hành tương tự như quy trình điều chế dự kiến trên nhưng pha dầu không có lutein (mẫu trắng). c) Độ khúc xạ ánh sáng: đo bằng khúc xạ kế AR-40 (Kruss, Đức) d) Độ nhớt: dùng nhớt kế LVDV-E (Brookfield, Mỹ), sử dụng spindle LV1-Code S6, tốc độ quay 60 vòng/phút. e) Độ tan trong nước: Lấy 1 ml vi nhũ tương thu được cho vào cốc 250 ml và đặt trên một máy khuấy từ. Thêm từ từ nước cất vào, khuấy đều đến lúc thấy hỗn hợp bắt đầu có sự tách pha thì dừng lại. Ghi thể tích nước đã thêm vào. Từ đó, tính được độ tan của vi nhũ tương điều chế được trong nước (% v/v). f) Phân bố kích thước giọt vi nhũ tương: đựợc xác định bằng thiết bị Mastersizer Range (Malvern, Anh). g) Xác định hàm lượng lutein trong vi nhũ tương: Lấy Vpt ml vi nhũ tương lutein định mức bằng nước cất lên V0 ml (hệ số pha loãng D thích hợp). Đo độ hấp thụ của dung dịch ở 455 nm (dùng mẫu trắng là mẫu chuẩn bị và bảo quản trong điều kiện giống hệt nhưng không có lutein) Từ đó, tính được nồng độ lutein trong hệ vi nhũ tương theo công thức (*): .D.V0 .10 4 Lutein (mg/L)  1% E1cm .l.Vpt Trong đó: A: độ hấp thụ của vi nhũ tương sau khi pha loãng; V0: thể tích của hệ vi nhũ tương sau khi pha loãng (ml); D: hệ số pha loãng; (1) 455 nm là bước sóng hấp thụ cực đại của trong hệ vi nhũ tương thu được 40 % E 11cm = 2500 (hệ số hấp thụ trung bình của dung dịch lutein 1% w/v đo với cuvet dày 1 cm ở 445 nm) l: chiều dày cuvet; Vpt (ml): thể tích hệ vi nhũ tương đem phân tích. h) % Lutein còn lại được xác định theo công thức: % Lutein còn  A455 (t ) A455 (t 0 ) trong đó: A455 (t) và A455 (t0) lần lượt là độ hấp thụ của mẫu ở thời điểm khảo sát và ở thời điểm ban đầu (đo trong điều kiện y hệt nhau) i) Đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm: theo tiêu chuẩn TCVN 3215-79 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu - Các kết quả đều là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm song song. So sánh sự khác biệt giữa các giá trị trung bình với độ tin cậy p = 0,95. - Xử lý và vẽ đồ thị bằng phần mềm MS Excel 2010. - Vẽ giản đồ pha của hệ vi nhũ tương bằng phần mềm CHEMIX School 3.60. 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định công thức bào chế vi nhũ tương lutein 3.1.1. Chọn tỷ lệ Tween 80 Tween 80 là chất HĐBM ưa nước mạnh (có HLB = 15), khi cho vào hệ sẽ hướng gốc hydrocarbon kém phân cực vào pha dầu, các nhóm -OH phần cực sẽ hướng ra ngoài môi trường nước, làm cho các giọt dầu nành có lớp vỏ bọc bên ngoài ưa nước. Ảnh hưởng của nồng độ Tween 80 đến sự hình thành vi nhũ tương lutein thể hiện qua Bảng 3.1. Theo đó, ta thấy tỷ lệ Tween 80 ảnh hưởng mạnh đến độ đục của hệ nhũ tương tạo thành. Khi nồng độ Tween 80 từ 6-12 % w/w thì hệ vi nhũ tương lutein tạo thành không bền vững, các hạt nhũ tương dễ dàng bị keo tụ khi thêm nước vào. Tuy nhiên, khi tỷ lệ Tween 80 tăng lên thì hệ vi nhũ tương tạo thành rất bền, được phân tán và ổn định tốt trong môi trường nước. Điều này là do khi thêm nước vào xảy ra sự giải hấp một phần Tween 80 vào môi trường nước. Tỷ lệ Tween 80 càng thấp thì khi pha loãng lớp vỏ chứa các phân tử Tween 80 bao bọc các giọt dầu càng mỏng, làm cho hệ dễ bị keo tụ khi thêm nước vào. Ngược lại, tỷ lệ Tween 80 càng lớn thì các giọt dầu sẽ được nhũ hóa hoàn toàn, do đó được bảo vệ chống lại sự keo tụ tốt hơn khi pha loãng. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của Tween 80 đến độ bền của vi nhũ tương lutein Tween 80 Lecithin Pha dầu Propylen glycol VH20 (%w/w) (%w/w) (%w/w) (%w/w) (ml) 1 3 0,5 1,6 4 1,80 2 6 0,5 1,6 4 2,70 3 9 0,5 1,6 4 3,50 4 12 0,5 1,6 4 8,20 5 15 0,5 1,6 4 75,00 6 18 0,5 1,6 4 100,00 Mẫu Tuy nhiên, không nên cho quá nhiều Tween 80 vì khi đó sẽ gây ra mùi và vị khó chịu, khi sử dụng tạo màu cho các hệ thực phẩm sẽ làm giảm giá trị cảm quan của sản 42 phẩm. Do vậy, chúng tôi chọn tỷ lệ Tween 80 là 18% w/w. Tỷ lệ này cũng xấp xỉ với tỷ lệ đã được Ford và cộng sự (1994) khi điều chế vi nhũ tương β-caroten có bổ sung α-tocopherol và acid ascorbic làm chất chống oxy hóa (khi đó sử dụng Tween 80 với tỷ lệ là 16,67% w/w) [25]. Hình 3.1. Hình ảnh hệ nhũ tương lutein khi tỷ lệ Tween 80 tăng dần (Từ trái sang phải: Tween 80 = 3; 6; 9; 12; 15; 18 % w/w) 3.1.2. Chọn tỷ lệ propylen glycol Bảng 3.2 và Hình 3.2 cho thấy ảnh hưởng của propylen glycol đến sự tạo thành hệ vi nhũ tương lutein phân tán trong nước. Bảng 3.2. Trạng thái của hệ nhũ tương lutein khi thay đổi tỷ lệ propylen glycol Mẫu Tỷ lệ propylen glycol (% w/w) Trạng thái cảm quan 1 0,0 Hơi đục 2 1,0 Trong suốt 3 2,0 Trong suốt 4 3,0 Trong nhưng hơi mờ đục 5 4,0 Mờ đục Kết quả này cho thấy việc thêm propylen glycol có ảnh hưởng đến khả năng hình thành vi nhũ tương lutein, tuy nhiên ảnh hưởng này không nhiều lắm. Khi tỷ lệ propylen glycol từ 1-2% w/w thì hệ vi nhũ tương trong suốt hoàn toàn, nhưng với nồng độ propylen glycol từ 3% w/w trở lên thì hệ bắt đầu đục. 43 Hình 3.2. Các hệ nhũ tương lutein tạo thành khi tăng tỷ lệ propylen glycol (Từ trái sang phải: propylen glycol = 0; 1; 2; 3; 4 %w/w ) Có thể giải thích ảnh hưởng của propylen glycol đối với sự hình thành vi nhũ tương như sau: Propylen glycol có cấu trúc phân tử tương tự như các chất HĐBM, nhưng phần đuôi hydrocarbon không phân cực ngắn và linh hoạt hơn nên nó có thể xen vào các kẽ hỡ trong lớp vỏ chất HĐBM bao bọc các hạt dầu, hấp phụ tại các vị trí này (trong đó gốc hydocarbon hướng vào pha dầu, đầu ưa nước hướng ra môi trường nước). Như vậy, propylen cũng góp phần đảm bảo cho việc nhũ hóa các hạt dầu lutein hoàn toàn hơn (nó đóng vai trò như là chất đồng HĐBM). Tuy nhiên, chỉ cần bổ sung propylen glycol vào hệ nhũ tương với một lượng vừa phải vì nếu nhiều quá thì một mặt sẽ tạo ra mùi vị không tốt cho sản phẩm, một mặt sẽ cạnh tranh với các phân tử chất HĐBM phân tử lớn, đẩy chúng ra môi trường nước làm cho hệ trở nên vẩn đục (do chất HĐBM các phân tử lớn kém tan). Do vậy, tỷ lệ propylen glycol được chọn là 1% w/w. 3.1.3. Chọn tỷ lệ lecithin Kết quả nghiên cứu (Bảng 3.3. và Hình 3.3) cho thấy trong khoảng khảo sát thì nồng độ lecithin có ảnh hưởng đến độ đục của nhũ tương lutein nhưng không nhiều. Nồng độ lecithin quá cao ( 0,5% w/w) hoặc quá thấp ( 0,1% w/w) đều ảnh hưởng đến sự bền vững của trạng thái vi nhũ tương. Nguyên nhân là do lecithin là chất nhũ hóa ưa dầu hơn (có HLB = 8), khi cho vào hệ nó sẽ hấp phụ tốt hơn trên các giọt dầu tạo thành lớp hấp phụ thứ nhất (lớp hấp phụ này có tác dụng làm giảm bớt sự cách biệt về độ phân cực giữa pha dầu và pha nước); sau đó các phân tử Tween 80 (HLB = 15) sẽ hấp phụ tiếp tục tạo thành lớp hấp phụ thứ hai ưa nước hơn, làm cho các giọt dầu phân tán và ổn định tốt hơn trong môi trường nước nên hệ sẽ trong suốt. Việc kết hợp 44 sử dụng lecithin và Tween 80 hay hỗn hợp 2-3 chất nhũ hóa có HLB từ thấp đến cao cũng được một số tác giả áp dụng, kết quả cho thấy các hệ nhũ tương tạo thành thường bền vững hơn [35]. Chẳng hạn, Akashe và cộng sự (2002) đã nghiên cứu sự ổn định của các hệ vi nhũ tương trong đó sử dụng hỗn hợp 3 chất HĐBM (trong đó một chất có HLB = 2-6, một chất có HLB = 6-9, một chất có HLB = 9-22, khi đó hệ tạo thành không có sự phân cách giữa pha dầu và pha nước nhưng các hạt nhũ tương có kích thước khá lớn (2-10 µm) [25]. Bảng 3.3. Trạng thái của hệ nhũ tương lutein khi thay đổi tỷ lệ lecithin Mẫu Tỷ lệ lecithin (% w/w) 1 2 3 4 0,1 0,2 0,3 0,4 Hơi đục Trong mờ Trong suốt Trong mờ 5 0,5 Mờ đục Trạng thái cảm quan Hình 3.3. Các hệ nhũ tương lutein tạo thành khi tăng nồng độ lecithin (Từ trái sang phải: nồng độ lecithin 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 % w/w) Tuy nhiên, cũng chỉ nên cho một lượng lecithin vừa đủ. Nếu nồng độ lecithin quá thấp sẽ không đủ để tạo lớp nhũ hóa thứ nhất, ảnh hưởng đến khả năng nhũ hóa của Tween 80 nên hệ kém ổn định, các giọt dầu dễ keo tụ và làm hệ bị đục. Ngược lại, nồng độ lecithin lớn quá thì lượng lecithin dư thừa sẽ hấp phụ cạnh tranh với Tween 45 80, làm cho hệ kém ưa nước và trở nên đục hơn. Vì vậy, tỷ lệ lecithin trong vi nhũ tương bằng 0,3% w/w là thích hợp nhất. 3.1.4. Chọn tỷ lệ lutein/dầu nành Để tạo ra hệ vi nhũ tương lutein có màu đậm có thể tăng nồng độ lutein trong dầu nành lên. Thực nghiệm cho thấy khi nồng độ lutein trong dầu nành tăng từ 5-10% w/w thì hệ nhũ tương tạo thành có vẻ trong nhưng ngày càng hơi mờ đục. Hơn nữa, sau một thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng thì các mẫu ứng với nồng độ lutein 7,5%; 10% w/w lúc đầu có tách ra các hạt chất rắn nhỏ màu cam lơ lửng trong hệ, sau đó dần dần lắng xuống đáy. Điều này chứng tỏ ở những nồng độ trên dầu nành không hòa tan hết lutein. Khi đó, việc tăng nồng độ lutein quá 5% w/w không những không có tác dụng tăng cường độ màu của hệ nhũ tương mà còn làm giảm giá trị cảm quan và hiệu quả kinh tế của sản phẩm. Do đó, tỷ lệ lutein trong dầu nành thích hợp nhất là 5% w/w. Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ lutein đến sự thay đổi độ bền của hệ (Nồng độ lutein từ trái sang phải: 5,00; 6,25; 7,50; 8,75; 10,00 % w/w). 3.1.5. Chọn tỷ lệ hỗn hợp chất nhũ hóa và pha dầu (S/O) Kết quả khảo sát cho thấy: Khi tăng tỷ lệ hỗn hợp chất nhũ hóa và pha dầu (S/O) thì thể tích nước cần dùng để chuẩn độ pha tăng dần: khi tỷ lệ S/O dưới 90/10 w/w thì chỉ cần thêm một lượng nước khá nhỏ cũng đủ làm cho hệ trở nên đục, nhưng khi tỷ lệ này lớn hơn 91/9 w/w thì lượng nước cần dùng tăng lên đáng kể (Bảng 3.4 và Hình 3.5). Điều này có nghĩa là tỷ lệ S/O tăng sẽ làm cho hệ vi nhũ tương càng bền vững khi tăng độ phân cực của pha phân tán. Khi tỷ lệ S/O đạt giá trị từ 94/6 w/w trở lên thì hệ hầu như tan vô hạn trong nước, tức là rất bền với sự keo tụ. Điều này là do khi ta tăng tỷ lệ S/O sẽ làm cho các 46 giọt dầu chứa lutein được bao bọc bởi chất nhũ hóa càng nhiều, làm cho các hạt dầu càng ưa nước nên càng dễ phân tán và ổn định hơn trong pha nước. Tuy nhiên, nếu tỷ lệ S/O quá cao sẽ làm giảm khả năng ứng dụng của sản phẩm trong tạo màu thực phẩm do khi đó cường độ màu nhạt và tạo ra mùi vị khó chịu. Vì vậy, để tạo thành hệ vi nhũ tương có khả năng tan vô hạn trong nước thì tỷ lệ S/O là 94/6 w/w là thích hợp. a) Từ trái sang phải: S/O = 10/90; 20/80; 30/70; 40/60; 50/50; 60/40; 70/30; 80/20; 90/10 w/w b) Từ phải sang trái: S/O = 91/9; 92/8; 93/7;94/6; 95/5; 96/4; 97/3; 98/2; 99/1 w/w Hình 3.5. Các hệ vi nhũ tương lutein ở điểm cuối của quá trinh chuẩn độ pha bằng nước ứng với tỷ lệ S/O tăng dần 47 Bảng 3.4. Kết quả thí nghiệm chuẩn độ pha bằng nước đối với các hệ vi nhũ tương có tỷ lệ S/O tăng dần S/O 10/90 20/80 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 80/20 90/10 V H2O 2,29 2,54 2,50 2,40 2,12 2,18 1,96 1,99 4,02 (ml)  0,11  0,54  0,11  0,29 0,13  0,22  0,29  0,26  0,09 91/9 92/8 93/7 94/6 95/5 96/4 97/3 98/2 99/1 (w/w) S/O (w/w) V H2O 12,7 15,24 22,49 105 205 307 440 525 690 (ml)  0,83  1,89  4,4 5 5 8  10 5  10 800 H2O chuẩn độ pha (ml) 700 600 500 400 300 200 100 98/2 96/4 94/6 92/8 90/10 70/30 50/50 30/70 10/90 0 S/O, w/w Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ S/O đến độ bền của trạng thái vi nhũ tương lutein 3.2. Xây dựng giản đồ pha của hệ vi nhũ tương lutein Từ kết quả chuẩn độ pha ở trên (Bảng 3.4), có thể tính được thành phần của các hệ ở ranh giới chuyển pha từ vi nhũ tương sang nhũ tương như sau: 48 Bảng 3.5. Thành phần pha của các hệ vi nhũ tương lutein ở ranh giới chuyển pha S/O (w/w) 0/100 S (%,w/w) 0,00 6,84 13,30 19,92 27,05 41,78 50,30 O (% w/w) 100,00 61,81 53,27 46,84 W (% w/w) 0,00 S/O (w/w) 91/9 92/8 93/7 S (%,w/w) 40,13 36,59 O (% w/w) 3,98 3,21 W (% w/w) 55,89 60,20 10/90 20/80 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 80/20 90/10 35,10 57,26 49,95 40,65 35,130 27,94 21,69 14,36 5,59 32,30 29,77 28,37 44,47 94/6 95/5 96/4 97/3 98/2 99/1 100/0 28,96 8,19 4,42 3,03 2,16 1,83 1,41 0,00 2,20 0,52 0,23 0,13 0,07 0,04 0,02 0,00 68,83 91,29 95,35 96,84 31,305 33,43 33,25 30,28 28,01 97,78 98,13 Giản đồ pha xây dựng được có dạng như sau: Hình 3.7. Giản đồ pha của hệ vi nhũ tương lutein Ghi chú: S (surfactants): hỗn hợp chất nhũ hóa (Tween 80-Lecithin-Propylen glycol) Oil (Oil): Dầu nành chứa lutein; W (water): Nước Vùng màu vàng: Vùng vi nhũ tương (hệ trong suốt); Vùng màu cam: Vùng nhũ tương (hệ bị đục) 98,57 100,00 49 Giản đồ này cho thấy với hỗn hợp chất nhũ hóa đã sử dụng (Tween 80: Lecithin: propylen glycol = 93,22: 1,56: 5,21 w/w/w) thì diện tích vùng vi nhũ tương tạo thành khá lớn (chiếm gần ½ diện tích của toàn bộ giản đồ), nghĩa là khả năng ổn định của hệ vi nhũ tương khá tốt. Từ giản đồ pha trên đây, có thể mở rộng ứng dụng của sản phẩm vi nhũ tương lutein bằng cách thay đổi tỷ lệ S/O có trong thành phần của hệ. Ví dụ: - Để tạo màu cho thực phẩm ưa dầu (dầu/mỡ phết lên đồ nướng, phomai,…) thì cần sử dụng vi nhũ tương W/O (tan tốt trong dầu). Khi đó, chọn tỷ lệ S/O  10/90 w/w - Để tạo màu cho các thực phẩm dạng rắn hay sệt (bánh mì, bánh nướng, sữa chua đặc) thì sản phẩm vi nhũ tương chỉ cần độ tan vừa phải, do đó có thể chọn tỷ lệ S/O = 30/70 - 70/30 w/w (tùy yêu cầu về cường độ màu và giới hạn cho phép các chất nhũ hóa trong loại thực phẩm sử dụng). - Để tạo màu cho thực phẩm ưa nước (đồ uống) thì sản phẩm vi nhũ tương cần có độ tan tốt trong nước (vi nhũ tương O/W). Khi đó, nên chọn tỷ lệ S/O  94/6 w/w. Trong đề tài này chỉ định hướng ứng dụng tạo màu cho thực phẩm ưa nước nên chọn tỷ lệ S/O = 94/6 w/w. 3.3. Chọn tỷ lệ vitamin E bổ sung Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ vitamin E bổ sung đến sự phân hủy của vi nhũ tương lutein ở các nhiệt độ khác nhau (hình 3.8) cho thấy: - Với mẫu không bổ sung vitamin E: Sau 15 phút gia nhiệt ở dưới 600C cường độ màu ít thay đổi, nhưng trên 800C thì cường độ màu của mẫu suy giảm mạnh. Như vậy, việc bổ sung chất vitamin E là cần thiết nếu sử dụng vi nhũ tương lutein cho sản phẩm có gia nhiệt trong quá trình chế biến hay thanh trùng nhiệt. - Với các mẫu có bổ sung vitamin E: Không có sự suy giảm đáng kể về cường độ màu khi gia nhiệt dưới 800C trong 15 phút. Tuy nhiên, ở 1000C thì cường độ màu của mẫu bổ sung 25% vitamin E/lutein chỉ giảm đi khoảng 7,3% trong khi đó cường độ màu của các mẫu chứa vitamin E/lutein từ 50% trở lên giảm đáng kể (từ 26 - 35%). Điều này có thể được giải thích như sau: Vitamin E là chất chống oxy hóa tan tốt trong dầu nên sẽ hòa tan vào pha dầu cùng với lutein, do đó có tác dụng bảo vệ lutein khỏi bị oxy hóa bởi oxy không khi. Tuy nhiên, khi tỷ lệ vitamin E/lutein cao quá (> 25%) nó sẽ hòa tan cạnh tranh với lutein, làm pha dầu trở nên bão hòa chất tan, đẩy một phần 50 lutein vào môi trường phân tán. Kết quả là làm cho lutein không được bảo vệ bởi chất nhũ hóa và chất chống oxy hóa nên dễ bị phân hủy. Nhiệt độ càng tăng thì tốc độ oxy hóa lutein càng mạnh nên cường độ màu giảm càng mạnh. Ảnh hưởng của hàm lượng vitamin E và nhiệt độ đến độ bền của vi nhũ tương lutein Vit E = 0% 120 Vit E = 25% Vit E = 50% % Luten còn lại 100 Vit E = 75% Vit E = 100% 80 60 40 20 0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Nhiệt độ (độ C) Hình 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng vitamin E và nhiệt độ đến sự phân hủy vi nhũ tương lutein Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian gia nhiệt ở 1000C đến độ bền màu của vi nhũ tương lutein (Hình 3.8) cũng cho thấy: Mẫu vi nhũ tương lutein được bổ sung 25% vitamin E/lutein có độ bền màu cao hơn các mẫu không hay bổ sung vitamin E với nồng độ cao hơn (50; 75; 100% w/w). Thời gian gia nhiệt càng dài thì độ suy giảm cường độ màu càng mạnh. Nếu đun sôi quá 30 phút thì mẫu có bổ sung 25% vitamin E/lutein cũng bị suy giảm màu rất mạnh (gần 20%). Như vậy, tỷ lệ vitamin E bổ sung /lutein được chọn là 25% w/w. Tuy nhiên, sản phẩm vi nhũ tương lutein được bổ sung vitamin E này cũng chỉ nên sử dụng để tạo màu cho các loại thực phẩm không cần gia nhiệt hay chỉ gia nhiệt trong thời gian ngắn (< 15 phút). . 51 Ảnh hưởng của tỷ lệ vitamin E bổ sung và thời gian đun sôi đến sự phân hủy vi nhũ tương lutein 100 90 80 Vita E = 0% % Lutein còn lại 70 Vit E = 25% 60 Vit E = 50% 50 Vit E = 75% 40 Vit E = 100% 30 20 10 0 0 15 30 45 60 Thời gian (min) Hình 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng vitamin E và thời gian đun sôi đến sự phân hủy nhũ tương lutein. Tóm lại, thành phần tối ưu của hệ vi nhũ tương lutein O/W như sau: Tween 80: 18% w/w; lecithin: 0,5% w/w; propylen glycol: 1,0% w/w; ứng với tỷ lệ - Tween 80: lecithin: propylen glycol trong hỗn hợp nhũ tương là 93,26: 1,55: 5,18 w/w/w - Tỷ lệ hỗn hợp chất nhũ hóa (S) với pha dầu (O) là: 96/4 w/w - Nồng độ lutein trong dầu nành là: 5% w/w - Tỷ lệ vitamin E/lutein là 25% w/w (ứng với nồng độ vitamin E trong dầu nành là 1,25% w/w). 3.4. Xác định công thức bào chế vi nhũ tương lutein – Bào chế và khảo sát một số tính chất hóa – lý đặc trưng 3.4.1. Xác định công thức bào chế vi nhũ tương lutein Từ kết quả khảo sát trên đây, có thể tính toán và đưa ra công thức bào chế 100 kg vi nhũ tương lutein dạng đậm đặc nhất, có khả năng phân tán tốt trong nước như sau:  Pha dầu (O): chiếm 6% w/w khối lượng vi nhũ tương đặc, gồm: - Dầu nành: 6,000 kg - Lutein: 0,300 kg - Vitamin E: 0,075 kg 52  Hỗn hợp chất nhũ hóa (S): chiếm 94% w/w khối lượng vi nhũ tương đặc, gồm: - Tween 80: 87,664 kg - Lecithin: 1,457 kg - Propylen glycol: 4,869 kg Như vậy, hàm lượng các chất trong mẫu nhũ tương đậm đặc ban đầu là: - Lutein: 3.000 mg/kg - Tween 80: 876.644 mg/kg - Lecithin: 14.570 mg/kg - Propylen glycol: 48.692 mg/kg - Vitamin E: 750 mg/kg  Nước cất 2 lần (W): có thể được thêm vào với tỷ lệ thích hợp tùy theo yêu cầu về cường độ màu của sản phẩm. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn tỷ lệ pha loãng là 1:40 v/w; khi đó, lượng nước cất 2 lần được cho vào là 4.000 kg. Hỗn hợp chất nhũ hóa (S): - Tween 80: 87,664 kg - Lecithin: 1,457 kg - Propylen glycol: 4,869 kg Pha dầu (O): - Lutein: 0,300 kg - Vitamin E: 0,075 kg - Dầu nành: 6,000 kg Khuấy đều a) Vi nhũ tương lutein đậm đặc (100 kg) Nước cất 2 lần (W): (4.000 kg) Đồng hóa (1250 rpm, 30 phút) b) Vi nhũ tương lutein pha loãng (4.100 kg) Hình 3.10. Quy trình bào chế các dạng vi nhũ tương lutein: a) dạng đậm đặc; b) dạng pha loãng 53  Thuyết minh quy trình:  Chuẩn bị hỗn hợp chất nhũ hóa: Cân lần lượt 87,664 kg Tween 80; 1,457 kg lecithin, 4,869 kg propylen glycol cho vào thùng phản ứng. Khuấy đều cho đến khi hỗn hợp đồng nhất.  Chuẩn bị pha dầu: Cân 0,300 kg lutein, 0,075 kg vitamin E, tất cả cho vào thùng phản ứng có chứa sẵn 6,000 kg dầu nành. Đun nóng hỗn hợp đến 600C (kết hợp siêu âm 15 phút) cho đến khi các chất hòa tan hoàn toàn.  Bào chế vi nhũ tương đậm đặc Cho pha dầu vào hỗn hợp chất nhũ hóa và khuấy trộn nhẹ cho đến khi hỗn hợp đồng nhất.  Bào chế vi nhũ tương pha loãng Thêm từ từ 4.000 kg nước cất 2 lần vào hỗn hợp vi nhũ tương đậm đặc nói trên, vừa thêm vừa đồng hóa với tốc độ 1250 rpm trong 20 phút. Bảo quản dung dịch vi nhũ tương thu được trong bình kín ở nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng. 3.4.2. Tính chất hóa- lý của sản phẩm vi nhũ tương lutein Khảo sát tính chất hóa lý của dạng vi nhũ tương loãng, kết quả như sau: Bảng 3.6. Một số tính chất hóa – lý của hệ vi nhũ tương lutein STT Tính chất (ở 300C) Đặc tính 1 Cảm quan Trong suốt, màu vàng tươi 2 Cường độ màu (A455 nm) 0,4688  0,0313 3 Chỉ số khúc xạ ánh sáng (RI) 1,33  0,02 4 Độ nhớt (cP) 0,8872  0,0168 5 Tỷ trọng (g/ml) 1,02  0,14 6 Hàm lượng lutein (mg/L) 73  5 11,58 (70,4%); 7 Phân bố kích thước hạt (nm) 329,8 (26,2%); 4846 (3,4%) 54 Kết quả trên đây cho thấy: Vi nhũ tương loãng điều chế được theo quy trình này có màu vàng sáng và trong suốt với hàm lượng lutein 73 mg/L, thấp hơn khoảng 90 lần so với mẫu của tác giả Võ Đình Nguyên Thảo (có hàm lượng lutein 6.970 mg/L, có màu cam đậm và trong mờ) [7]. Nguyên nhân là mẫu này đã được pha loãng nhiều hơn (40 lần), hơn nữa hàm lượng lutein/dầu nành ở đây chỉ là 5% w/w, tức là thấp hơn 2 lần so với mẫu của tác giả Nguyên Thảo (10% w/w). Do mẫu pha loãng nhiều nên có độ nhớt cũng thấp hơn nhiều so với mẫu trước đây (0,88 cP so với 44 cP). Hệ nhũ tương điều chế được theo quy trình này là hệ đa phân tán, trong đó khoảng 79% là các hạt có kích thước ứng với giới hạn dưới của hệ vi nhũ tương (trung bình là 11,58 nm); 26,2% ứng ở giới hạn trên của hệ vi nhũ tương (329,8 nm), ngoài ra còn một phần rất nhỏ các hạt (3,4%) có kích thước rất lớn lớn so với kích thước hạt vi nhũ tương. Kết quả này khác với kết quả đạt được của tác giả Võ Đình Nguyên Thảo: khi sử dụng máy đồng hóa tốc độ cao (9000 rpm, 20 phút) sẽ cho hệ vi nhũ tương có kích thước hạt nhỏ và đồng đều hơn (10-25 nm) [7]. Như vậy, tốc độ đồng hóa ảnh hưởng nhiều đến độ phân tán của các hạt vi nhũ tương. Do vậy, để tạo ra hệ vi nhũ tương nên sử dụng thiết bị đồng hóa tốc độ cao, hay các thiết bị kết hợp vừa đồng hóa vừa siêu âm. 3.4.3. Đánh giá độ bền màu của sản phẩm 3.4.3.1. Ảnh hưởng của trạng thái bảo quản Kết quả khảo sát cho thấy: Sau 24 ngày bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng, trong tối thì hàm lượng lutein trong cả 2 mẫu đều giảm đi khoảng 11-14% (Phân tích ANOVA cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa mức độ suy giảm này giữa 2 mẫu). Lẽ ra ở dạng đặc thì oxy không khí sẽ khó thâm nhập vào mẫu hơn khi ở dạng phân tán loãng, nhưng kết quả lại cho thấy trái với dự đoán. Điều này có lẽ là do: một mặt do ở trạng thái loãng các giọt dầu chứa lutein được bao bọc bằng một lớp các phân tử chất nhũ hóa sắp xếp trật tự thành một lớp vỏ kín nên chúng được bảo vệ; mặt khác ở trạng thái phân tán cao trong dung dịch, các giọt dầu này cũng tiếp xúc với oxy không khí ở lớp khí quyển tiếp xúc nhiều hơn nên cũng dễ bị oxy hóa nhiều hơn. Trong khi đó, mẫu ở dạng đặc tuy diện tích tiếp xúc với không khí ít hơn nhưng các giọt dầu lại không được bọc bởi lớp chất nhũ hóa để tạo thành lớp vỏ có cấu trúc 55 chặt chẽ như ở dạng lỏng, do đó nó cũng bị oxy hóa. Tuy nhiên, có thể là thời gian khảo sát ngắn nên chưa có sự khác biệt rõ giữa 2 kết quả này. 120,00 % Lutein còn lại 100,00 80,00 60,00 Vi nhũ tương đặc Vi nhũ tương loãng 40,00 20,00 0,00 0 4 8 12 16 20 24 28 Thời gian bảo quản (ngày) Hình 3.11. Ảnh hưởng của trạng thái bảo quản đến độ bền màu của vi nhũ tương lutein 3.4.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền màu của vi nhũ tương lutein thể hiện ở đồ thị 3.12. P-S 120,00 P-T 4-T % Lutein còn lại 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 0 4 8 12 16 20 24 28 Thời gian bảo quản (ngày) Hình 3.12. Độ bền màu của vi nhũ tương lutein ở các điều kiện bảo quản khác nhau 56 Theo đồ thị, ở nồng độ vitamin E = 25% thì sau 24 ngày bảo quản, mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng có ánh sáng thì lutein bị phân hủy nhanh nhất (chỉ còn khoảng 71,43%); nếu cũng ở nhiệt độ phòng nhưng trong tối thì mức độ suy giảm lutein ít hơn (còn 86,80%), còn nếu ở 40C trong tối hầu như lutein không bị phân hủy (hàm lượng lutein còn lai là 96,12%). Có thể nói yếu tố làm mất màu vi nhũ tương lutein mạnh nhất là ánh sáng, tiếp đó là nhiệt độ. Mặt khác, nếu so sánh kết quả này với kết quả tương tự của tác giả Võ Đình Nguyên Thảo [7], trong đó lutein trong dầu nành được bổ sung 0,1% vitamin E và được nhũ hóa bằng hỗn hợp gồm 17,31% w/w Tween 80 và 0,5% w/w lecithin (không sử dụng propylen glycol) thì sau 28 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối và 40C trong tối mức độ suy giảm lutein cũng xấp xỉ như trên (lần lượt là 85,52% và 96,87%), nhưng ở nhiệt độ phòng có ánh sáng thì phân hủy mạnh hơn nhiều (chỉ còn 48,24%) [7]. Như vậy, việc bổ sung propylen glycol trong công thức bào chế vi nhũ tương lutein ở đây đã có tác dụng cải thiện đáng kể độ bền màu của vi nhũ tương lutein ở nhiệt độ phòng khi có tác động của ánh sáng. Điều này có thể là do các phân tử propylen glycol đã chui vào và lấp đầy các khoàng trống trong lớp vỏ bọc của lecithin-Tween 80 bao quanh giọt dầu, ngăn cản sự xâm nhập của ánh sáng vào bên trong pha dầu. Tuy nhiên, mức độ phân hủy vi nhũ tương ở nhiệt độ phòng có chiếu sáng vẫn khá lớn, do đó vẫn nên bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng. 3.5. Ứng dụng tạo màu thực phẩm và đánh giá độ bền màu của sản phẩm theo thời gian bảo quản 3.5.1. Chọn nồng độ vi nhũ tương lutein thích hợp để tạo màu Kết quả xác định tỷ lệ vi nhũ tương lutein để tạo màu cho sản phẩm đông sương hương cam được trình bày ở các bảng trong phần Phụ lục 6 và Hình 3.13. Từ đó, có thể thấy tỷ lệ vi nhũ tương lutein bổ sung vào đông sương để tạo màu từ 2-4% (v/v) có tổng điểm cảm quan khá cao, trong đó tỷ lệ bổ sung vi nhũ tương lutein bằng 4% (v/v) có tổng điểm cảm quan cao nhất. Bên cạnh đó, khi tăng tỷ lệ vi nhũ tương lutein thì điểm cảm quan giảm dần hay nói cách khác là tổng điểm cảm quan giảm so với tỷ lệ vi nhũ tương lutein bổ sung vào. Điều này có thể giải thích là do ảnh hưởng của mùi và vị khó chịu của các chất nhũ hóa khi sử dụng ở nồng độ cao. 57 Trên cơ sở đó, chọn tỷ lệ vi nhũ tương lutein bổ sung vào đông sương là 4% (v/v) để tạo màu cho sản phẩm là phù hợp nhất. Kết quả này cũng có thể ứng dung để taọ Tổng điểm cảm quan màu cho các dạng thực phẩm tương tự như nước. 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 18.8 17.28 16.4 14.84 12.92 2 4 6 8 10 Tỷ lệ VNT lutein (%) Hình 3.13. Tổng điểm cảm quan của sản phẩm theo tỷ lệ vi nhũ tương lutein bổ sung để tạo màu 3.5.2. Đánh giá độ an toàn của thực phẩm tạo màu bằng vi nhũ tương lutein Dựa vào công thức bào chế vi nhũ tương đã xây dựng được (Mục 2.4.2), có thể tính được thành phần các chất phụ gia có trong vi nhũ tương dạng đặc, dạng loãng (pha loãng 1 : 40 w/v) và trong mẫu đông sương tạo màu dùng vi nhũ tương loãng với nồng độ 4% v/v. Bảng 3.7. Hàm lượng và giới hạn cho phép của các phụ gia thực phẩm trong thành phần vi nhũ tương lutein [44] Hàm lượng (mg/kg) Trong vi nhũ tương đặc Trong vi nhũ tương loãng (pha loãng 1:40, w/w) Trong thực phẩm bổ sung 4% v/v vi nhũ tương loãng 3.000 75 3 100-150 Vitamin E 750 19 0,75 1-700 Tween 80 876.644 21916 877 3.000 Lecithin 14570 364 15 500 Propylen glycol 48.692 1217 49 1.000 Phụ gia Lutein ML(maximum level) : Hàm lượng tối đa cho phép ML (mg/kg) 58 Kết quả cho thấy các phụ gia sử dụng đều dưới mức tối đa cho phép. Như vậy, việc sử dụng sản phẩm vi nhũ tương tạo màu thực phẩm (đông sương, đồ uống có hương liệu.) là an toàn. 3.5.3. Độ bền màu của sản phẩm đông sương bổ sung vi nhũ tương lutein Dựa vào bảng mô tả sản phẩm đông sương sau 4 ngày bảo quản ta thấy: trạng thái, màu sắc, mùi vị của nó vẫn không có sự thay đổi. Điều này có thể được giải thích bởi đường và acid citric ngoài tác dụng tạo vị còn kéo dài được thời gian bảo quản của sản phẩm. Đồng thời đông sương được bảo quản ở 40C trong tối nên đã khắc phục được nhược điểm kém bền màu của lutein. Bảng 3.8. Bảng mô tả sản phẩm đông sương sau 4 ngày bảo quản Ngày bảo Cảm quan quản Trạng thái đồng nhất, đông đặc 1 Màu vàng tươi Mùi của rau câu và hương cam hài hòa Vị ngọt thanh, chua dịu Trạng thái đồng nhất, đông đặc Màu vàng tươi 2 Mùi của rau câu và hương cam hài hòa Vị ngọt thanh, chua dịu Trạng thái đồng nhất, đông đặc Màu vàng tươi 3 Mùi của rau câu và hương cam hài hòa Vị ngọt thanh, chua dịu Trạng thái đồng nhất, đông đặc Màu vàng tươi 4 Mùi của rau câu và hương cam hài hòa Vị ngọt thanh, chua dịu Hình ảnh 59 3.6. Đánh giá hiệu quả kinh tế của vi nhũ tương lutein Việc ước tính giá thành của sản phẩm vi nhũ tương lutein và sản phẩm đông sương thể hiện qua Bảng 3.9 và 3.10. Bảng 3.9. Giá thành ước tính cho 1 kg sản phẩm vi nhũ tương lutein đặc Số Thành (ngàn) tiền Chi phí Đơn vị tính Lutein tinh thể (tinh khiết > Kg 0,003 9,011 27,033 STT 1 Đơn giá lượng (ngàn) 90%) 2 Dầu nành Lít 0,06 40 2,400 3 Tween 80 Lít 0,877 150 131,497 4 Lecithin Kg 0,01457 150 2,186 5 Propylen Glycol Kg 0,049 80 3,895 6 Vitamin E Kg 0,00075 120 0,090 7 Nước cất Lít 0,8996 5 4,498 8 Điện 2 4 8,000 9 Chi phí thiết bị 10 Chi phí nhân công Ngày 0,4 100 40,000 11 Bao bì Chai 1 2 2,000 kWh 0,000 Tổng chi phí 194,565 12 Tiếp thị 10% 19,4565 13 Lãi 10% 19,4565 Giá thành 233,479 Giá thành của 1 lít vi nhũ tương lutein loãng (pha loãng 1: 40, w/v) là: 233.479 đồng / 40 = 5.837 đồng Để tạo màu cho 1 lít đông sương cần dùng 40 ml vi nhũ tương lutein loãng. Vậy chi phí tạo màu cho 1 lít đông sương là: 5.837 đồng/lít *0,04 lít= 233 đồng. Mức chi phí này khá thấp so với giá thành ước tính cho sản phẩm đông sương là 58.591 đồng/lít (Bảng 3.10) nhưng nâng cao giá trị dinh dưỡng và đảm bảo an toàn cho người sử dụng. 60 Bảng 3.10. Giá thành ước tính cho 1 lít sản phẩm đông sương STT Chi phí Đơn vị tính Số lượng Đơn giá Thành (ngàn) tiền (ngàn) 1 Bột agar agar kg 0,01 400 4 2 Đường kg 0,25 16 4 3 Acid citric kg 0,0005 50 0,025 4 Hương cam lít 0,0005 600 0,3 5 Nước cất lít 1,1 5 5,5 6 Gas 7 Chi phí nhân công ngày 0,2 100 20 8 Bao bì hũ 10 0,7 7 Tổng chi phí 8 48,825 9 Tiếp thị 10% 4,883 10 Lãi 10% 4,883 Giá thành 58,591 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận 1/ Đã xây dựng được công thức bào chế dạng vi nhũ tương lutein đậm đặc tan tốt trong nước với các thành phần như sau: - Pha dầu: chứa 5% w/w lutein, 1,25% w/w vitamin E trong dầu nành - Hỗn hợp chất nhũ hóa gồm Tween 80- lecithin- propylen glycol (93,26: 1,55: 5,18 w/w/w) - Tỷ lệ giữa chất nhũ hóa và pha dầu là 96/4 w/w 2/ Sản phẩm vi nhũ tương loãng được điếu chế bằng cách pha loãng vi nhũ tương đặc theo tỷ lệ 1:40 w/v. Có thể dùng sản phẩm này để tạo màu cho thực phẩm dạng lỏng với tỷ lệ 4% v/v. 3/ Các sản phẩm vi nhũ tương lutein cần được bảo quản ở nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng. Đề xuất ý kiến 1/ Cần nghiên cứu thay thế dầu nành bằng chất có khả năng hòa tanlutein tốt hơn nhằm làm giảm tỷ lệ vi nhũ tương tạo màu dùng để tạo màu, tăng độ an toàn cho sản phẩm. 2/ Nghiên cứu sử dụng các chất nhũ hóa và chất chống oxy hóa khác để giảm tỷ lệ chất nhũ hóa sử dụng và cải thiện độ bền của vi nhũ tương lutein. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Hoàng Thị Huệ An, Nguyễn Văn Hòa (2011). Xây dựng qui trình tách chiết và tinh chế lutein từ hoa cúc vạn thọ (Tagetes erecta L.) trồng tại tỉnh Khánh Hòa. Kỷ yếu Hội thảo KHTN lần thứ II (tháng 4/2011), Trường CĐSP Nha Trang, 87-93. 2. Nguyễn Thị Mai Anh và cộng sự (2009). Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của hệ nano piroxicam. Tạp chí Dược học, 8, 50-53. 3. Nguyễn Thị Hiền (2010). Nghiên cứu chiết xuất chất màu Carotenoit từ quả ớt sừng Việt Nam (Capsicum annuum L). Đồ án tốt nghiệp đại học, Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại Học Nha Trang. 4. Khương Thị Mai Lan (2008). Nghiên cứu bào chế vi nhũ tương natri diclofenac dùng qua da. Đồ án tốt nghiệp đại học, Đại học Dược Hà Nội. 5. Nguyễn Công Minh và Nguyễn Văn Ân (2012). Hóa sinh thực phẩm. Trường Đại học Nha Trang. 6. Trần Thị Huyền Nga (2008). Nghiên cứu chiết xuất, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của một vài carotenoid từ cây cỏ Việt Nam dùng để sản xuất thực phẩm chức năng. Luận án Tiến sỹ chuyên ngành Hóa Sinh, Đại học Dược Hà Nội. 7. Võ Đình Nguyên Thảo (2015). Nghiên cứu điều chế vi nhũ tương lutein ứng dụng làm chất màu cho nước giải khát. Luận văn thạc sỹ ngành Công nghệ Sau thu hoạch, Trường Đại học Nha Trang. Tiếng Anh 8. Ashish D. Gadhave, Jyotsna T. Waghmare (2014). A short review on microemulsion and its application in extraction of vegetable oil, IJRET, 3 (09), 147 – 158. 9. Bourre J.M. và Galea J. (2006). An important source omega-3 fattly acids, vitamins D and E, carotenoids, iodine and selenium: a new natural multienriched egg, J. Nutr Health Aging, 10 (5), 371-376. 10. Bunea A.; Lujerdean A.; Pintea A.; Andrei S.; Bunea C.; Bele C.; (2010), 63 Using Cellulases and Pectinases to improve better extraction of carotenoids from the Marigold Flowers (Tagetes erecta L.), Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 67, 1-5. 11. Danso-Boateng E. (2011). Effect of Enzyme and Heat Pretreatment on Sunflower Oil Recovery Using Aqueous and Hexane Extractions. World Academy of Science, Engineering and Technology, 80, 1-7. 12. Delgado Vargas F., Paredes-Lopez O. (1997). Effects of enzymatic treatments of marigold flowers on lutein isomeric profiles. J. Agric Food Chem, 45, 1-6. 13. EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS), (2010). Scientific Opinion on the re-evaluation of lutein (E 161b) as a food additve. EFSA Journal 2010, 8(7):1678, 1-10. 14. European Food Safety Authority (EFSA) (2011). Scientific Opinion on the re-evaluation of lutein (E 161b) as a food additive, EFSA Journal, 9 (5). 15. Ezhil, J, Jeyanthi, C, Narayanan, M, (2008). Marigold as a carotenoid source on Pigmentation and growth of red swordtail, Xiphophorus helleri. Turkey J. Fishery & Aquatic Sciences, 8, 99-102. 16. FAO (2004). Lutein from Tagetes erecta. Chemical and Technical Assessment (CTA), 63, 1-3. 17. He R. R., Bun Tsoi, Fang Lan, Nan Yao, Yao X. S., and Hiroshi Kurihara (2011). Antioxidant properties of lutein contribute to the protection against lipopolysaccharide-induced uveitis in mice. Chinese Medicine, 6 (38). 18. Hua e t a l (2004). Preparation and evaluation of microemulsion of vinpocetine for transdermal delivery. Pharmazie, 59, 274-278. 19. Hugo J. I., José Luis N. B., Enrique B. A., Ramir R. M., Octavio P. L., (2004). An optimization study of solid-state fermentation: xanthophylls extraction from marigold flowers. Appl Microbiol Biotech., 65, 383 – 390. 20. Hussan S Basheer et al (2013). Characterization of Microemulsions Prepared using Isopropyl Palmitate with various Surfactants and Cosurfactants. Tropical J. Pharm. Res., 12 (3), 305-310. 21. Johnson E.J., Hammond B.R., Yeum K.-J., Qin J., Wang X.D., Castaneda 64 C., Snodderly D., Russell R.M (2000). Relation among serum and tissue concentrations of lutein and zeaxanthin and macular pigment density. Am. J. Clin. Nutr, 71, 1555-1562. 22. Josea Luis N. B., Enrique B. A., (2004). Improving Xanthophyll Extraction from Marigold Flower Using Cellulolytic Enzymes. J. Agric. Food Chem, 52, 3394-3398. 23. Kumar P., and Mittal KL (1999). Handbook of Microemulsion Science and Technology. CRC Press, New York 24. Kumar, S. T. K., Abdnlkadir; S.P., Sebastian, S. (2004). Process for the preparation of xanthophyll crystals. US Patent, US 6743953. 25. Landrum J.T., Bone R.A., Joa H., Kilburn M.D., Moore L.L., Sprague K.E (1997). A one-year study on the macular pigment—the effect of 140 days of a lutein supplementation. Exp. Eye Res, 65, 57-62. 26. Manuel S. R.; Enrique B. A. (2008). Enzymatic treatment to Improve extraction of capsaicinoids and carotenoids from Chili (Capsicum annuum) fruits. J. Agric. Food Chem, 56, 10012-10018. 27. Oryza Oil & Fat Chemical Co. (2003). Lutein - Health Food Ingredients for human eyestablish. Numata Kitagata-cho, Ichinomiya-city, Aichi-pref., Japan. 28. Richard Cantrill (2004). Lutein from Tagetes erecta. Chemical and Technical Assessment (CTA). 29. Sarkhejiya Naimisha, Nakum Mayara, Patel Vipulp, Atarasamira Desai Thusarbindur (2011). Emerging trend of microemulsion in formulation and research”, J. Inter. Bulletin of Drug Res.1 (1), 54-83. 30. Shantanu Kale, Megha Gaikwad and Snehal Bhandare (2011). Determination and comparison of in vitro SPF of topical formulation containing Lutein ester from Tagetes erecta L. flowers, Moringa oleifera Lam seed oil and Moringa oleifera Lam seed oil containing Lutein ester. Inter. J. Res in Pharm. and Biomed. Sci., 2 (3), 1220-1224. 31. V.B. Pratheesh, Benny N. & C.H Sujatha, (2009). Isolation, Stabilization and Characterization of xanthophyll from Marigold Flower - Tagetes Erecta L., Modern Applies Science, 3(2), 19-28. 65 32. Yue Wang (2004). Preparation of Nano- and Microemulsions using Phase Inversion and Emulsion Titration Methods. Luận văn Thạc sĩ. Khoa Công nghệ Thực phẩm, Đại học Massey, Auckland, New Zealand. Internet 33. http://www.allaboutvision.com/nutrition/lutein.htm 34. https://www.academia.edu/9209250/Formulation_of_oil-inwater_%CE%B2carotene_microemulsions_effect_of_oil_type_and_fatty_a ci d_chain_length 35. http://congthuonghn.gov.vn/default.aspx?page=&lang=0&cat=124&content= 476 36. http://text.123doc.org/document/1129680-tong-quan-ve-su-dung-chattao- mau-trong-san-xuat-thuc-pham.htm 37. http://text.123doc.org/document/989255-thuc-trang-su-dung-phammau- trong-thuc-pham-hien-nay.htm 3.8.http://www.researchgate.net/profile/Anabela_Raymundo/publication/228641 712_Rheological_characterization_of_coloured_oil-inwater_food_emulsions_with_lutein_and_phycocyanin_added_to_the_oil_a nd_aqueous_phases/links/02bfe5114f947d2edb000000.pdf 39. http://esatjournals.org/Volumes/IJRET/2014V03/I09/IJRET20140309022.pdf 40. https://vi.wikipedia.org/wiki/Lecithin 41. https://en.wikipedia.org/wiki/Polysorbate_20 42. https://en.wikipedia.org/wiki/Polysorbate_80 43. http://www.foodnk.com/tra-cuu-phu-gia-tu-vfa 44. http://www.slideshare.net/ThanhNguyen114/carotene a PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả chuẩn độ pha khi thay đổi nồng độ Tween 80 trong vi nhũ tương lutein Chuẩn độ pha Mẫu Tween 80 Leucithin Pha dầu Propylen H20 (ml) (g) (g ) (g ) Glycol (g) 1 3,0002 0,2605 0,8029 2,0210 2,70 2 4,5031 0,2558 0,8003 2,0001 3,50 3 6,0029 0,2598 0,8026 2,0077 8,20 4 7,5030 2,5470 0,8055 2,0061 75,00 5 9,0029 0,2516 0,8090 2,0004 100,00 Phụ lục 2: Kết quả xác định tỷ lệ S/O của vi nhũ tương lutein. S/O, w/w 99/1 98/2 97/3 96/4 95/5 94/6 93/7 92/8 91/9 Tween 80 Lecithin Propylen Glycol 8,7755 0,1467 8,7793 S (g ) O (g ) W (g ) S (% ) O( %) W (% ) 0,9902 9,9124 0,1483 690 1,42 0,02 98,56 0,1444 0,9761 9,8998 0,1004 700 1,39 0,01 98,59 8,7755 0,1461 0,9764 9,8980 0,1007 680 1,43 0,01 98,55 8,6897 0,1588 0,9698 9,8183 0,2005 530 1,82 0,04 98,14 8,6842 0,1463 0,9617 9,7922 0,2051 525 1,83 0,04 98,13 8,6887 0,1447 0,9695 9,8029 0,2051 520 1,85 0,04 98,11 8,6052 0,1433 0,9578 9,7063 0,3004 450 2,11 0,07 97,82 8,6019 0,1441 0,9552 9,7012 0,3009 440 2,16 0,07 97,78 8,6033 0,1451 0,9560 9,7044 0,3006 430 2,21 0,07 97,73 8,5123 0,141 0,9456 9,5989 0,4038 300 3,10 0,13 96,77 8,5132 0,1417 0,946 9,6009 0,4007 305 3,05 0,13 96,82 8,5125 0,1415 0,9457 9,5997 0,4005 315 2,95 0,12 96,92 8,424 0,1404 0,9369 9,5013 0,5004 200 4,52 0,24 95,24 8,4231 0,1425 0,9363 9,5019 0,5042 205 4,42 0,23 95,35 8,4233 0,1407 0,9368 9,5008 0,5008 210 4,32 0,23 95,45 8,3359 0,1388 0,9332 9,4079 0,6004 110 7,84 0,50 91,66 8,3352 0,1394 0,9276 9,4022 0,6026 105 8,18 0,52 91,30 8,336 0,1376 0,9265 9,4001 0,6008 100 8,55 0,55 90,91 8,2467 0,1368 0,9188 9,3023 0,7008 21,77 29,28 2,21 68,51 8,2461 0,1371 0,9197 9,3029 0,7191 18,50 32,61 2,52 64,87 8,2467 0,1384 0,9161 9,3012 0,7002 27,21 25,00 1,88 73,12 8,1576 0,136 0,9068 9,2004 0,817 16,33 34,93 3,10 61,97 8,1575 0,1361 0,9076 9,2012 0,8033 13,06 39,89 3,48 56,62 8,1577 0,1363 0,91 9,204 0,802 16,33 34,95 3,05 62,00 8,0689 0,1342 0,8991 9,1022 0,9028 13,60 38,55 3,82 57,62 8,0692 0,1377 0,8979 9,1048 0,9037 12,52 40,42 4,01 55,57 b 90/10 80/20 70/30 60/40 50/50 40/60 30/70 20/80 10/90 8,0697 0,1346 0,8984 9,1027 0,9016 11,97 41,42 4,10 54,48 4,1951 0,0771 0,2345 4,5067 0,5037 4,10 49,47 5,53 45,00 4,1953 0,0782 0,2355 4,5090 0,5090 4,03 49,85 5,63 44,52 4,2004 0,0772 0,2349 4,5125 0,5005 3,92 50,53 5,60 43,87 3,7290 0,0635 0,2089 4,0014 1,0023 2,29 54,89 13,75 31,36 3,7288 0,0636 0,2099 4,0023 1,0033 1,83 58,55 14,68 26,77 3,7284 0,0621 0,2083 3,9988 1,0051 1,85 58,34 14,66 26,99 3,2628 0,0547 0,1822 3,4997 1,5016 1,63 52,75 22,64 24,61 3,2658 0,0539 0,1835 3,5032 1,5069 2,07 49,49 21,29 29,22 3,2662 0,0551 0,1828 3,5041 1,5225 2,18 48,65 21,14 30,22 2,7967 0,0465 0,1562 2,9994 2,001 2,39 40,56 27,06 32,38 2,7952 0,0469 0,1523 2,9944 2,0073 1,96 43,02 28,84 28,14 2,7963 0,0473 0,1543 2,9979 2,0052 2,18 41,75 27,93 30,32 2,3306 0,0398 0,1313 2,5017 2,5014 2,23 34,59 34,58 30,83 2,3357 0,0373 0,1305 2,5035 2,5052 1,98 35,82 35,85 28,33 2,3308 0,0365 0,1332 2,5005 2,5067 2,16 34,89 34,97 30,14 1,8645 0,0311 0,1042 1,9998 3,0047 2,18 27,85 41,84 30,31 1,8628 0,0324 0,1035 1,9987 3,0023 2,29 27,43 41,20 31,37 1,8643 0,0322 0,1028 1,9993 3,0051 2,72 25,88 38,90 35,22 1,3984 0,0237 0,0773 1,4994 3,5031 2,61 19,69 46,01 34,30 1,3992 0,0213 0,0756 1,4961 3,5044 2,50 19,94 46,70 33,36 1,4013 0,0230 0,0778 1,5021 3,569 2,39 20,12 47,81 32,07 0,9322 0,0159 0,0523 1,0004 4,0098 3,16 12,25 49,10 38,65 0,9326 0,0148 0,0514 0,9988 4,008 2,29 13,70 54,96 31,34 0,9332 0,0151 0,0532 1,0015 4,0048 2,18 13,94 55,75 30,30 0,4661 0,0076 0,0242 0,4979 4,5048 2,18 6,94 62,75 30,32 0,4657 0,0072 0,0257 0,4986 4,5011 2,39 6,74 60,87 32,38 0,4652 0,0068 0,0267 0,4987 4,5078 2,29 6,84 61,82 31,34 c Phụ lục 3: Kết quả ảnh hưởng của vitamin E và điều kiện xử lý đến độ bền của vi nhũ tương lutein Điều kiện xử lý Nhiệt độ phòng %Vitamin E/Lutein 0 25 50 75 100 0 25 1000C,15' 50 75 100 0 25 100oC, 45' 50 75 100 Độ hấp thụ % Lutein còn lại 0,510 0,973 0,908 0,379 0,282 0,323 0,320 0,314 0,912 0,901 0,893 0,667 0,664 0,676 0,296 0,294 0,285 0,183 0,185 0,183 0,085 0,087 0,086 0,695 0,689 0,675 0,407 0,412 0,423 0,134 0,139 0,143 0,088 0,086 0,087 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 62,35±0,9472 92,70±0,9656 73,68±0,6616 77,04±1,5322 65,25±0,4085 16,86±0,1947 70,50±1,0582 45,59±0,8972 36,68±1,1853 30,85±0,2931 d 0 25 60oC, 15' 50 75 100 0 25 80oC, 15' 50 75 100 0,510 0,513 0,519 0,974 0,973 0,972 0,873 0,868 0,854 0,354 0,356 0,356 0,367 0,364 0,369 0,451 0,449 0,453 0,973 0,973 0,973 0,867 0,861 0,882 0,379 0,379 0,379 0,278 0,277 0,279 100,78±0,8805 100,00±0,1136 95,26±1,0499 93,67±0,2425 96,39±0,6502 88,43±0,4060 100,00±0,0265 95,81±1,2356 100,00±0,0557 98,58±0,3635 e Phụ lục 4: Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền màu vi nhũ tương lutein Bảng 4.1.Ảnh hưởng của trạng thái bảo quản đến độ bền màu của vi nhũ tương lutein Trạng thái bảo quản Thời gian bảo quản (ngày) 0 4 8 12 16 20 24 Vi A 1,2423 1,2396 1,2087 1,1818 1,1471 1,1349 1,1078 nhũ (455nm) ±0,0602 ± 0,0612 ± 0,0616 ± 0,0598 ±0,0576 ±0,0561 ±0,0558 dạng %Lutein 100,00 99,78 97,29 95,12 92,33 91,35 89,17 đặc; còn lại ± 0,00 ± 0,10 ± 0,27 ± 0,22 ± 0,17 ± 0,09 ± 0,18 tương P-T Trạng thái bảo quản Vi A nhũ (455 tương nm) dạng % loãng Lutein P-T còn lại Thời gian bảo quản (ngày) 0 4 8 12 16 20 24 1,1528 1,1481 1,1331 1,1228 1,0867 0,9776 0,924 0,0022  0,0029  0,0079  0,0013 0,0025 0,0112 0,002 100,00 99,72 99,05 98,27 96,21 90,19 86,80  0,00 0,25  0,85  0,62  0,40  0,34  0,52 f Bảng 4.2. Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền màu của vi nhũ tương lutein (có bổ sung vitamin E 25%) Điều kiện bảo quản 0 4 8 12 16 20 24 1,1528 1,1219 1,1069 1,0247 0,9305 0,8881 0,823  0,0022  0,0042  0,0081  0,0026  0,0032  0,0025 0,0042 % Lutein 100,00 97,32 96,02 88,89 80,72 77,04 71,43 còn lại  0,00  0,18  0,59  0,08  0,16  0,07  0,26 A P- (445 nm) S Thời gian (ngày) Điều kiện bảo quản A Thời gian (ngày ) 0 4 8 12 1,1528 1,1481 1,1331  0,0079 16 1,1228 1,0867 20 24 0,9776 0,924 P- (445 nm)  0,0022  0,0029 T % Lutein 100,00 99,72 99,05 98,27 96,21 90,19 86,80 còn lại  0,00 0,25  0,85  0,62  0,40  0,34  0,52 Điều kiện bảo quản  0,0013  0,0025  0,0112 0,002 Thời gian (ngày) 0 4 8 12 16 20 24 A 1,2423 1,2396 1,2087 1,2268 1,2154 1,2006 1,1912 4- (445 nm)  0,0602  0,0612  0,0616  0,0048  0,0048  0,0009 0,0052 T % Lutein 100,00 99,78 97,29 98,91 97,98 96,80 96,04 còn lại  0,00  0,10  0,26  1,05  0,54  0,58  0,65 g Phụ lục 5. Phân bố kích thước hạt của hệ vi nhũ tương lutein h Phụ lục 6. Phương pháp đánh giá cảm quan (theo TCVN 3215-79) Tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm theo phương pháp cảm quan cho điểm. Hội đồng cảm quan bao gồm 5 thành viên. Theo TCVN 3215-79, dùng thang điểm 20 đánh giá sản phẩm thực phẩm gồm có 6 bậc (từ 0-5) và điểm 5 là điểm cao nhất cho mỗi chỉ tiêu, trong đó có sáu bậc đánh giá tương ứng với mỗi nội dung mô tả dưới đây. Bảng 6.1. Mô tả sản phẩm theo TCVN 3215-79 Bậc đánh giá Điểm đánh giá Cơ sở đánh giá Trong chỉ tiêu đang xét, sản phẩm có tính chất tốt, 1 5 đặc trưng và rõ rệt cho chỉ tiêu đó, sản phẩm không có lỗi và khuyết tật nào. Sản phẩm có khuyết tật nhỏ hoặc sai lỗi nhỏ, hoặc 2 4 cả hai nhưng không làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm. Sản phẩm có khuyết tật hoặc sai lỗi hoặc cả hai. Số 3 3 lượng và mức độ sai tật làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm nhưng vẫn đạt tiêu chuẩn. Sản phẩm có khuyết tật và sai lỗi hoặc cả hai. Số 4 2 lượng và mức độ của sai lỗi làm cho sản phẩm không đạt chất lượng quy định nhưng vẫn có khả năng bán được. Sản phẩm có khuyết tật và sai lỗi ở mức độ trầm trọng, không đạt mục đích chính của sản phẩm đó. 5 1 Song sản phẩm vẫn chưa bị coi là hỏng. Sản phẩm đó không thể bán được nhưng sau khi tái chế thích hợp vẫn có thể sử dụng được. Sản phẩm có khuyết tật và sai lỗi ở mức độ trầm 6 0 trọng, sản phẩm bị coi là hỏng không thể sử dụng được nữa. i Bảng 6.2. Cơ sở đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm đông sương hương cam Điểm 5 4 3 2 1 0 5 4 3 2 1 0 Mô tả Mùi Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng của đông sương và hương cam hài hòa Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng của đông sương, mùi của hương cam nhưng kém hài hòa hơn Mùi thơm của sữa chua và hương cam không thể hiện rõ, hoặc kém hài hòa, bắt đầu có mùi hơi nhẹ của vi nhũ tương lutein Sản phẩm có mùi kém, mùi đặc trưng của vi nhũ tương lutein khá đậm, không hấp dẫn. Sản phẩm có mùi của vi nhũ tương lutein rất đậm, không còn ngửi thấy mùi của đông sương. Sản phẩm có mùi khó ngửi. Vị Sản phẩm hài hòa giữa vị ngọt và chua dịu hài hòa. Sản phẩm có vị chua ngọt tương đối hấp dẫn nhưng kém hài hòa hơn. Sản phẩm không hấp dẫn lắm, kém hài hòa, có vị hơi nhẹ của vi nhũ tương lutein Sản phẩm có vị không hài hòa, vị của vi nhũ tương lutein khá đậm Sản phẩm có vị nồng của vi nhũ tương lutein Sản phẩm có vị quá nồng của vi nhũ tương lutein, không thể chấp nhận được. 5 4 3 2 1 0 Trạng thái Sản phẩm đồng nhất, đông đặc Sản phẩm tương đối đồng nhất, đông đặc Sản phẩm đồng nhất, nhưng có dấu hiệu ít đông đặc Sản phẩm không đồng nhất, đông nhưng hơi mềm Sản phẩm phân không đồng nhất, mềm, tách nước Sản phẩm bị hỏng, không đông đặc 5 4 3 2 1 0 Màu sắc Sản phẩm có màu vàng tươi đẹp, màu sắc đồng nhất. Sản phẩm có màu vàng hơi nhạt hoặc hơi đậm, màu sắc khá đồng nhất. Sản phẩm có màu vàng quá đậm hoặc quá nhạt, khá đồng nhất Sản phẩm có màu kém Sản phẩm có màu kém, không đồng nhất Sản phẩm có màu không chấp nhận được j Bảng 6.3. Hệ số quan trọng (HSQT) đối với sản phẩm đông sương Chỉ tiêu Trạng thái Vị Mùi Màu sắc HSQT 1,4 1,2 0,8 0,6 Bảng 6.4. Điểm cảm quan theo tỷ lệ vi nhũ tương lutein bổ sung Điểm các Mẫu 2% 4% 6% 8% 10% ĐTB ĐTB chưa có TL thành viên Chỉ tiêu HSQT có Tổng TL A B C D E Trạng thái 5 4 4 4 5 4,4 1,4 6,16 Màu sắc 3 3 3 4 3 3,2 0,6 1,92 Mùi 4 4 5 5 5 4,6 0,8 3,68 Vị 5 4 5 5 4 4,6 1,2 5,52 Trạng thái 5 4 5 5 4 4,6 1,4 6,44 Màu sắc 4 5 5 4 5 4,6 0,6 2,76 Mùi 5 5 5 4 5 4,8 0,8 3,84 Vị 5 5 5 4 5 4,8 1,2 5,76 Trạng thái 5 4 5 4 5 4,6 1,4 6,44 Màu sắc 5 4 4 5 5 4,6 0,6 2,76 Mùi 4 3 4 3 4 3,6 0,8 2,88 Vị 3 4 3 4 3 3,6 1,2 4,32 Trạng thái 5 4 5 5 4 4,6 1,4 6,44 Màu sắc 3 4 4 3 4 3,6 0,6 2,16 Mùi 3 3 3 3 3 3 0,8 2,4 Vị 4 3 2 3 3 3,2 1,2 3,84 Trạng thái 4 5 4 4 5 4,4 1,4 6,16 Màu sắc 3 4 3 4 3 3,4 0,6 2,04 Mùi 3 3 2 3 2 2,6 0,8 2,08 Vị 2 2 2 2 3 2,2 1,2 2,64 17,28 18,8 16,4 14,84 12,92 [...]... số công trình nghiên cứu điều chế vi nhũ tương carotenoid ứng dụng trong thực phẩm [39] Ở Vi t Nam hiện có rất ít công trình nghiên cứu đã công bố liên quan đến vấn đề này, hơn nữa độ bền của sản phẩm vi nhũ tương thu được vẫn còn khá hạn chế để có thể ứng dụng trong thực tiễn [1] Chính vì vậy, em thực hiện đề tài: Cải tiến công thức bào chế và đánh giá khả năng ứng dụng của vi nhũ tương lutein trong. .. trong công nghiệp thực phẩm Mục tiêu của đề tài: Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương lutein ổn định trong nước và có khả năng ứng dụng làm chất tạo màu thực phẩm 3 Nội dung nghiên cứu: - Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương dầu/nước của lutein sử dụng hỗn hợp Tween 80, lecithin, propylen glycol làm chất nhũ hóa - Nghiên cứu bổ sung vitamin E trong công thức bào chế vi nhũ tương lutein nhằm cải. .. thành vi nhũ tương Giá thành cao Sử dụng nhiều chất HĐBM hơn so với nhũ tương thông thường Vi nhũ tương Nhũ tương Hình 1.7 Sự khác nhau về bề ngoài giữa vi nhũ tương và nhũ tương 1.3.6 Ứng dụng của vi nhũ tương: Sự có mặt của chất HĐBM trong vi nhũ tương làm cho kích thước hạt của hệ vi nhũ tương rất nhỏ, tăng hàm lượng hoạt chất trong công thức và tăng độ ổn định vật lý Điều này giúp cho vi nhũ tương. .. HĐBM và chất đồng HĐBM tạo cho vi nhũ tương có nhiều cấu trúc khác nhau Vi nhũ tương 2 pha liên tục giàu nước Vi nhũ tương 2 pha liên tục giàu dầu Vi nhũ tương O/W Vi nhũ tương Hình 1.5 Các loại vi nhũ tương thường gặp[14] 1.3.4 Phương pháp nghiên cứu thành phần và tính chất của vi nhũ tương Cấu trúc vi mô thể hiện đặc tính của vi nhũ tương Để nghiên cứu cấu trúc vi mô của vi nhũ tương cần đánh giá. .. phổ kế UV-Vis 18 - Độ nhớt: đánh giá bằng nhớt kế - Tính tan của thuốc nhuộm: Hòa tan thuốc nhuộm tan trong nước nêu thấy vi nhũ tương được nhuộm màu thì đó là vi nhũ tương O/W, ngược lại là vi nhũ tương W/O - Tính tan trong nước: Vi nhũ tương O/W tan được trong nước, còn vi nhũ tương W/O không tan trong nước - Tính dẫn điện: được đánh giá bằng cách đo độ dẫn điện của vi nhũ tương, Vi nhũ tương O/W... vi nhũ tương và ứng dụng vào khai thác dầu [8] H.S Ribeiro, K.Ax, Andh Schubert đã nghiên cứu độ ổn định của nhũ tương lycopene trong ba loại thực phẩm sữa tách kem, nước cam và nước cho thấy rằng sự ổn định của nhũ tương lycopene phụ thuộc nhiều vào loại thực phẩm, còn chất nhũ hóa sử dụng ít ảnh hưởng đến độ ổn định của nhũ tương lycopen [8] 24 Vào năm 2003, Hua và cộng sự đã nghiên cứu vi nhũ tương. .. thiện độ bền màu - Đánh giá độ bền màu và khả năng ứng dụng của sản phẩm vi nhũ tương thu được 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Thực trạng sử dụng chất màu thực phẩm hiện nay 1.1.1 Giới thiệu về chất màu thực phẩm Chất màu đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chế biến thực phẩm Chất màu thực phẩm hay phụ gia tạo màu được bổ sung vào thực phẩm nhằm phục hồi màu sắc bị mất đi trong quá trình chế biến, làm tăng... nghiên cứu bào chế dưới dạng vi nhũ tương để kéo dài thời gian phóng thích hoạt chất và khả năng hấp thu thuốc trong cơ thể Ví dụ: bào chế hệ nano piroxicam của Nguyễn Thị Mai Anh (2011) [2] Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu ứng dụng vi nhũ tương trong công nghiệp thực phẩm hầu như chưa có Võ Đình Nguyên Thảo (2015) lần đầu tiên đã nghiên cứu điều chế vi nhũ tương lutein tan trong nước sử dụng hỗn... lớp trong thời gian dài - Kỹ thuật bào chế đơn giản Vi nhũ tương được tạo thành tức thời và ít tiêu tốn năng lượng như bào chế nhũ tương thông thường  Nhược điểm: - Số lượng các chất HĐBM không độc hại cho vi c sử dụng các ứng dụng dược phẩm, thực phẩm hạn chế - Các thông số nhiệt độ, ánh sáng, pH,… ảnh hưởng nhiều đến sự ổn định của vi nhũ tương - Khó xác định tỷ lệ các thành phần trong công thức. .. bậc ba của hệ vi nhũ tương gồm isopropyl palmitat (IPP) trong phân bố trong pha nước (water) với hỗn hợp chất HĐBM(Tween 20) - chất đồng HĐBM (butanol) [20] Ghi chú: Vùng xám đậm là vùng vi nhũ tương (hệ trong suốt); vùng bên ngoài (xám nhạt) là vùng nhũ tương (đục) Giản đồ pha của hệ vi nhũ tương cung cấp thông tin về ranh giới giữa 2 vùng vi nhũ tương (ứng với hệ trong suốt) và vùng nhũ tương (ứng với ... độ bền sản phẩm vi nhũ tương thu hạn chế để ứng dụng thực tiễn [1] Chính vậy, em thực đề tài: Cải tiến công thức bào chế đánh giá khả ứng dụng vi nhũ tương lutein công nghiệp thực phẩm Mục tiêu... dựng công thức bào chế vi nhũ tương lutein ổn định nước nghiên cứu khả ứng dụng làm chất tạo màu thực phẩm ii LỜI CẢM ƠN Sau gần tháng em thực xong đề tài Cải tiến công thức bào chế đánh giá khả. .. Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương lutein ổn định nước có khả ứng dụng làm chất tạo màu thực phẩm 3 Nội dung nghiên cứu: - Xây dựng công thức bào chế vi nhũ tương dầu/nước lutein sử dụng hỗn