BÔ Y TÉ TRÜÔNG DAI HOC DlTOC HÀ NÔI ... C8 8 S ... f f l ...Cî«BD... NGUYEN THIANH TUYET NGHIÊN CtJXJ DINH LlTONG THUÔC NHÔ MÂT TOBRAMYCIN 0,3 % BANG PHI/ONG PHÂP HPLC VÔI DETECTOR HUŸNH QUANG, TAO DÂN CHAT SAU CÔT (KHOÀ LUÂN TOT NGHIÊP DÜOC SŸ KHOA 2002- 2007) Nguùi huâng dân: PGS.TS Thâi Phan Quÿnh Nhu PGS.TS Thâi Duy Thîn Nai thuc hiên: Phông hoâ lÿ I - Viên kiêm nghiêm thuôc trung uang Bô mon Hoâ duçfc - Tnrcmg Dai hoc Dirac Hà Nôi Thâi gian thuc hiên : Tûr thâng 10/2006 dén thâng 5/2007 Hà Nôi, Thâng 5 -2007 L Ô 3 C Â H I0 R Khoâ luân này duac thuc hiên và hoàn thành tai phông Hoâ lÿ I - Viên kiëm nghiêm thuôc trung uong và Bô mon Hoâ duac - Truông Dai hoc Duac Hà Nôi. Trong quâ trînh thuc hiên khoâ luân này, tôi dâ nhân duac su giüp dà tân tinh cua câc thày, cô huông dân, câc giâng viên cüa bô mon Hoâ duac và câc cân bô cüa phông Hoâ Lÿ I - Viên kiëm nghiêm thuôc trung uong. Loi dàu tiên tôi xin bày tô long biet on sâu sac toi: • PGS.TS THÂI DUY THÎN • PGS.TS THÂI PHAN QUŸNH NHlT Dâ giüp dô tôi nhüng tài liêu và hucfng dân nhùng kÿ nâng cân thiët trong quâ trînh thuc hiên khoâ luân. Tôi xin câm an su giüp dô cüa câc thày, câc cô, câc kÿ thuât viên trong bô mon Hoâ duac và câc cân bô phong Hoâ lÿ I Viên kiëm nghiêm thuôc trung uong dâ giüp dô tôi hoàn thành tôt khoâ luân tôt nghiêp cüa minh. Tôi xin câm an su quan tâm cüa Ban giâm hiêu, phông dào tao Nhà truàng và câc thây giâo, cô giâo dâ truyên dat kiên thuc cho tôi trong suôt thôi gian tôi hoc tâp tai trucmg. Cuôi cüng tôi xin tô long biét an tôi gia dînh, ban bè và nhüng nguôi thân luôn sât cânh bên tôi trong suôt quâ trînh hoc tâp cüng nhu thuc hiên dê tài. Hà Nôi ngày 20 thâng 5 nâm 2007 Sinh viên Nguyên Thi Ânh Tuyet MUC LUC Trang DAT VAN DÊ...................................................................................1 » PHAN 1: TÔNG QUAN..................................................................... 3 1.1. Tong quan vé Tobramycin..........................................................................3 1.2. Mot so phirang phâp duac âp dung de djnh luong Tobramycin........ 4 1.2.1. Phirang phâp vi sinh vât...................................................................... 4 1.2.2. Phirang phâp HPLC.............................................................................6 1.3. Tong quan vè phirong phâp HPLC........................................................... 8 1.3.1. Khâi quât chung................................................................................... 8 1.3.2. Nguyên tâc câu tao cûa hê thong mây HPLC.................................... 8 1.3.3. Câc dai luçrng dâc trung.......................................................................9 1.4. Co sô lÿ thuyët ve huÿnh quang...............................................................11 1.4.1. Su hinh thành quang pho huÿnh quang............................................ 11 1.4.2. Üng dung cûa phép do huÿnh quang................................................ 13 1.5. Phirong phâp HPLC vol Detector huÿnh quang - tao dân xuât sau côt 13 1.5.1. Phuong phâp HPLC voti detector huÿnh quang............................... 13 1.5.2. Tao dân xuât sau côt..........................................................................14 1.5.3. Phân üng tao dân xuât phât huÿnh quang cüa Tobramycin.............16 PHAN 2: THlTC NGHIÊM VÀ KÉT QUÂ.....................................17 2.1. Nguyên vât lieu và phuong phâp thuc nghiêm......................................17 2.2.1. Doi tuong nghiên cüu........................................................................ 17 2.2.2. Thiét bj và hoâ chât............................................................................ 17 2.2.3. Nôi dung và phirang phâp nghiên ciru..............................................18 2.2. Kët quâ thuc nghiêm và nhân x é t...........................................................20 2.2.1. Lira chon dieu kiên sâc k ÿ ................................................................20 2.2.2. Dânh giâ phirong phâp...................................................................... 28 2.2.3. Üng dung dinh luçmg Tobramycin trong chë phâm.........................36 2.2.4. Bàn luân..............................................................................................38 KÉT LUÂN...................................................................................... 41 TÀI LIEU THAM KHÂO PHU LUC NHÜNG CHÜ VIÊT TÂT BP : Duac diën Anh. Em : Birôc song bure xa (Emission). Ex : Birôc song kfch thfch (Excitation). EP : Duac diën Châu Âu. HD : Han dùng. HPLC : Sâc kÿ long hiêu nâng cao. JP : Duac diën Nhât. NSX : Ngày sân xuât. RSD : Dô lêch chuân tuang dôi. S : Dô lêch chuân. SKS : So kiëm soât. TCCS : Tiêu chuân ca sa USP : Duac diën Mÿ. UV - VIS : Quang ph6 tu ngoai - khâ kiën. VSV : Vi sinh vât. * Câc don vi do lircmg diroc viët tât nhu sau: - Dan vi do chiêu dài: Centimet : cm Milimet : mm Micromet : |im Nanomet : nm Gam : g Miligam : mg Microgam : Hg Lit : L Mililit : mL Microlit : ^L - Dan vi do khoi luang: - Dan vi do thé tich: DAT VAN DE Hiên nay trên thi truông thuôc, câc chë phâm khâng sinh rât phong phu và da dang. Aminoglycosid là nhôm khâng sinh 1cm, rât cô hiêu quâ trong dièu tri, dâc biêt vôi câc nhiêm khuân nàng. Là mot khâng sinh trong nhôm này, Tobramycin duoc chî dinh trong câc truông hop: nhiêm khuân tiët niêu, nhiêm trùng mâu, viêm màng nâo, viêm phoi, nhiêm khuân mât,... do câc chung vi khuân nhay câm. Công ty co phàn Duoc phâm Hà Tây dâ sân xuât và liru hành trên thi truông sân phâm “Thuôc nhô mât Tobramycin 0,3%” vôi tiêu chuân co sô dinh luong bâng phirong phâp vi sinh vât. Cüng nhir câc khâng sinh khâc trong nhôm aminoglycosid, Tobramycin không cô hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kiën, vi vây phirong phâp dinh luong ph6 biên vân là phirong phâp vi sinh vât. Phirong phâp này mât nhiêu thôi gian, dô chrnh xâc chira thât cao và không cô khâ nàng dinh tmh. Vi vây, chat lirong sân phâm không diroc dânh giâ mot câch on dinh. De giüp cho công ty co phàn Diroc phâm Hà Tây cô môt phirong phâp dinh lirong sân phâm chfnh xâc, on dinh và nhanh chông hon, chüng tôi nhân thây râng: Diroc diën Mÿ USP 28 [26] dâ âp dung phirong phâp sâc kÿ long hiêu nâng cao vôi detector UV - VIS, tao dân xuât tnrôc côt dë dinh lirong Tobramycin, nhimg qui trînh tao dân xuât này rât phüc tap. Gân dây trong EP 2003 [22] hay BP 2005 [18], phirong phâp sâc kÿ long hiêu nàng cao vôi detector diên hôa (detector do dong) dâ duoc dira vào sü dung dë thay thé phuong phâp vi sinh vât. Phirong phâp này tiên hành nhanh, kêt quâ tin cây, song hàu hët câc co sô kiëm nghiêm trong nirôc hiên nay không dâp üng diroc câc dieu kiên dinh lirong. Mât khâc dë dinh luong câc chë phâm cô chüa hoat chât vôi lirong nhô hoac không cô hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kiën thi phirong phâp sâc kÿ long hiêu nàng cao vôi detector UV - VIS lai không âp dung duoc. 1 Detector huÿnh quang hiên nay cüng dâ diroc dùng phë bien düng thü hai sau detector UV- VIS tai câc co sô kiêm nghiêm trong kÿ thuât HPLC. No duoc âp dung dë phât hiên tôt nhiêu chat phât huÿnh quang tu nhiên cüng nhu câc dân chat co huÿnh quang. Tobramycin là hop chat aminoglycosid, tuong tu nhu câc hop chat amin khâc no cüng cô khâ nàng tao dân chat phât huÿnh quang vôi mot sô thuôc thü. Viêc phât hiên câc chat bàng quang phô huÿnh quang lai cô tmh dâc hiêu cao và rât nhay. Do dô, chüng tôi dâ tien hành nghiên cüu dê tài: “Nghiên cûu dinh luong thuôc nhô mât Tobramycin 0,3% bàng phuong phâp HPLC vâi detector huynh quang, tao dân chat sau côt” vôi câc mue tiêu sau: - Xây dung duoc mot phuong phâp dinh luong Tobramycin bàng HPLC vôi Detector huÿnh quang - tao dân chât sau côt và dânh giâ phuong phâp vùa xây dung - Üng dung phuong phâp vùa xây dung dë dinh luong Tobramycin trong chë phâm, tien tôi tiêu chuân hôa lai “Thuôc nhô mat Tobramycin 0,3%” cüa công ty co phân Duoc phâm Hà Tây. 2 PHAN 1. TONG QUAN 1.1. TONG QUAN VE TOBRAMYCIN Tobramycin là môt khâng sinh nhôm aminoglycosid thu duoc tir môi truông nuôi cây Streptomyces tenebrarius hoàc cô thé bân tong hop tir Kanamycin. Công thûc phân tü '• c 18H37N5o 9. Phân tü luong : 467,5. Công thûc eau tao : Tên khoa hoc: 4-0-(3-Amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-60-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [1]. Tinh chat: [1], [18] + Bôt tràng hoàc tràng ngà. Dë tan trong nuôc, rât khô tan trong ethanol 96%, thuc të không tan trong cloroform và ether. + Gôc quay eue riêng [a]D20 tir +138° dën +148°. Duoc lÿ và co che tac dung: [1], [4] + Tobramycin là môt khâng sinh nhôm aminoglycosid cô tâc dung vôi nhiêu vi khuân Gram (-) hiëu khi và môt sô vi khuân Gram (+) hiëu khi. Thuôc không cô tâc dung vôi Chlamydia, nam, virus và da sô vi khuân yëm khi. 3 + Tobramycin rât giông Gentamycin vê tfnh chat vi sinh hoc và dôc tfnh: tâc dung manh trên vi khuân Gr(-) dâc biêt trên truc khuân mü xanh; gây dôc vôi thînh giâc và thàn, tuy nhiên dàc diëm quan trong nhâ't cûa Tobramycin là cô hoat tfnh manh hon Gentamycin dôi vôi phàn lôn câc chüng Pseudomonas aeruginosa và ît dôc vôi thàn hon so vôi Gentamycin. + Co ché tâc dung cüa Tobramycin: Lie ché su tong hop protein à câc vi khuân nhay câm bàng câch gàn không thuàn nghich vôi câc tiëu don vi 30S cüa Ribosom. Chïdinh: [4] Duoc chî dinh trong câc bênh nhiêm khuân nàng de doa tôi tmh mang, dàc biêt vôi câc bênh mà nguyên nhân chua rô ràng hoàc bi nhiêm khuân huyét do vi khuân Gram (-). Dang thuôc và hàm luçfng: [4] Thuôc không hâp thu qua duông uong, thuông duoc dùng duôi câc dang: Lo 5 mL 0,3% dë nhô mat. Tuÿp 3,5 g mô tra mât 0,3%. Thuôc tiêm: Lo 20 mg/2 mL; 60 mg/6 mL; 80 mg/8 mL; 80 mg/2 mL; 1,2 g/30 mL. 1.2. MOT SÔ PHÜGNG PHÂP DlTOC ÂP DUNG DE DINH LlTONG TOBRAMYCIN 1.2.1. PHUONG PHÂP VI SINH VÂT Nguyên tâc: Tobramycin khuyêch tân vào môi truông dung dich dac dâ cây vi sinh vât chï thi, tao ra câc vông üc ché vi sinh vât cô duông kinh tÿ lê thuân vôi logarit nông dô tuong üng. Hoat lue cüa chat thü duoc so sânh vôi chat chuân theo phuong phâp thông kê. + Xâc dinh hoat lue khâng sinh cüa Tobramycin bàng phuong phâp vi sinh vât theo JP 14 [25]. Chüng vi khuân: Bacillus subtilis ACTT 6633 4 + Dinh luçmg Tobramycin bâng phirong phâp vi sinh vât theo tiêu chuân co sô cüa mot sô ché phâm sân xuât trong nirôc: [5], [6] a. Chüng vi khuân: Bacillus pumilus NCTC 8241. b. Dung dich dêm phosphat pH 8,0 ± 0,1 : c. Môi trudng dinh litong: Cao men bia 3,0 g Pepton 6,0 g Casein pancreatic 4,0 g Glucose 1,0 g Cao thit 1,5 g Thach 15,0 g Nuôc cât 100 mL pH sau khi tiêt trùng 8,2 ± 0,2 d. Chuân bi dung dich chuân và dung dich thü: + Dung dich chuân: Cân chmh xâc khoâng 25,0 mg Tobramycin chuân, hôa tan và pha loâng trong dung dich dêm phosphat 8,0 dë diroc câc dung dich chuân cô nông dô Tobramycin chmh xâc khoâng 10 IU/mL, 20 IU/mL và 40 IU/mL. + Dung dich thü (ché phâm): Hüt chmh xâc 5,0 mL ché phâm (tuong üng vôi khoâng 3 mg Tobramycin), pha loâng vôi dung dich dêm phosphat pH 8,0 dë diroc câc dung dich thü cô nông dô Tobramycin khoâng 10 IU/mL, 20 IU/mL và 40 IU/mL. + Tien hành thü và trnh toân két quâ theo phirong phâp xâc dinh hoat lue khâng sinh - Duoc diën Viêt nam III [3]. 5 1.2.2. PHUONG PHÂP HPLC 1.2.2.1. Chirong trînh HPLC 1: [181, [22] * Dieu kiên sac ky: - Côt styren-divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8 |um). - Nhiêt dô côt: 55°C. - Pha dông: Hôn hop pha trong nuôc dâ loai carbon dioxyd chüa: 52 g/L natri sulfat khan; 1,5 g/L natri octansulfonat; 3 mL/L tetrahydrofuran và 50 mL/L dung dich kali dihydrophosphat 0,2 M dâ duoc chînh pH vè 3,0 bâng acid phosphoric loâng. - Toc dô dông: 1 mL/phüt. - Dung dich tao dân xuât sau côt: Dung dich natri hydroxyd 2% pha trong nuôc dâ loai carbon dioxyd. Toc dô 0,3 mL/phüt. - Detector: Detector diên hôa (detector do dông) hoàc câc thiê't bi tuong tu. Nhiêt dô detector dât ô 35°C. - Thë tich tiêm: 20 (aL. - Nông dô dung dich chuân và thü: khoâng 0,1 mg/mL trong nuôc. 1.2.2.2. Chirong trinh HPLC 2: [14] * Dieu kiên sac ky: - Côt Purospher® STAR RP-18e (4 x 55 mm, 3 |um, Merck). - Pha dông: Acetonitril - nuôc (50 : 50). - Toc dô dông: 1,3 mL/phüt. - Dung dich tao dân xuât: Dung dich 1-naphthyl isothiocyanat (NITC) trong pyridin. - Detector UV-VIS: 230 nm. - Thë tich tiêm: 10 ^iL. - Nông dô dung dich chuân và thü: khoâng 5 |ng/mL trong nuôc. 6 I.2.2.3. Chiïcmg trînh HPLC 3: [19] * Dieu kiên sâc ky: - Côt Ultrasphere RP 8 (4,6 x 250 mm, 5 ^m). - Pha dông: Acetonitril - dêm phosphat 0,05 M (62 : 38),diêu chînh vè pH 3,5 bàng acid phosphoric. - Toc dô dông: 2,5 mL/phüt. - Dung dich thuôc thü acid 2,4,6 trinitrobenzensulfonic: Hôa tan 2,5 g acid 2,4,6 trinitrobenzensulfonic trong vùa dû 10 mL hôn hop (Acetonitril nuôc) (80 :20). - Detector UV-VIS: 340 nm. - Thë tich tiêm: 20 (ixL. - Nông dô dung dich chuan và thü: khoâng 0,02 mg/mL trong dêm phosphat pH 7,4. Ngoài câc phirong phâp trên, ngirôi ta cüng dâ nghiên cüu phirong phâp dinh luong Tobramycin bàng sac kÿ long trao dôi anion vôi detector diên hôa (detector do dông) [27]. Câc phirong phâp dinh lirong Tobramycin nêu trên thuông mât nhiêu thôi gian (phirong phâp vi sinh vât) hoàc tien hành phüc tap và dôi hôi phâi cô thuôc thü, trang thiê't bi dâc biêt (phirong phâp HPLC). Mât khâc do Tobramycin cô câu trüc cüa môt aminoglycosid, không hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kién, nên khô cô thë dinh luong bàng phuong phâp hoâ hoc hoàc phât hiên bàng quang phô UV- VIS. Môt trong câc biên phâp thuông duoc sü dung dë phât hiên ra câc chat không cô khâ nàng hâp thu quang ô vùng tü ngoai - khâ kiên bàng câc detector quang phô là cho no phân üng vôi môt thuôc thü dë tao thành dân xuât cô khâ nàng dâp üng vôi câc detector thich hop. Tobramycin là hop chat aminoglycosid, tuong tu nhu câc hop chat amin khâc nô cüng cô khâ nàng tao dân xuât phât huÿnh quang vôi môt sô thuôc thü. Viêc phât hiên câc chât bàng quang phô huÿnh quang cô 7 tfnh dàc hiêu cao và rât nhay, do dô chüng tôi dâ chon huông nghiên cüu là dinh lirong Tobramycin bàng sàc kÿ long hiêu nàng cao vôi detector huÿnh quang. 1.3. TONG QUAN VE PHlTONG PHAP HPLC [2], [8], [10] 1.3.1. KHÂI QUÂT CHUNG Sàc kÿ long hiêu nàng cao (HPLC) là mot phirong phâp phân tich hoâ lÿ, dùng dë tâch và dinh luong câc thành phàn trong hôn hop dua vào âi lue khâc nhau cüa câc chât vôi hai pha luôn tiép xüc và không dông tan vcfi nhau. Pha dông là chât long chây qua côt vôi môt toc dô nhât dinh duôi âp suât cao, côn pha tînh chûa trong côt hiêu nàng cao (hat nhôi). Khi dung dich cûa hôn hop câc chât cân phân tich dua vào côt, chüng së duoc hâp thu hoàc phân bô' vào pha tînh tuÿ thuôc vào bân chât cüa côt và cüa chât cân phân tich dua vào côt. Khi ta bom pha dông vôi âp suât cao thi tuÿ thuôc vào âi lue cüa câc chât vôi hai pha, chüng së di chuyën qua côt vôi toc dô khâc nhau dân dén su phân tâch. Câc chât sau khi ra khôi côt duoc nhân biêt bôi bô phàn phât hiên goi là detector, két quâ xü lÿ cuô'i cüng duoc hiën thi trên màn hinh mây vi tfnh. 1.3.2. NGUYÊN TÂC CAU TAO CÜA HÊ THONG MÂY HPLC Hê thông kÿ thuàt HPLC bao gôm câc bô phân chmh: - Bînh chûa dung môi pha dông: Bînh thuông làm bàng thuÿ tinh hoàc thép không rî. Dung môi chay sàc kÿ duoc loc qua màng loc (thuông màng loc cô 0,45 (im) và duéi khi hoà tan. -Bom cao âp: Bom này cô chüc nàng bom dung môi vào côt dë thuc hiên quâ trînh tâch. Bom này duoc dieu chînh âp suât dë tao ra duoc nhüng toc dô on dinh nhât cüa câc chât cho phù hop vôi quâ trînh sàc kÿ. -Van bom mâu: Van này dë bom mâu phân tich vào côt tâch theo nhüng luçfng nhât dinh không doi trong mot quâ trînh sàc kÿ. Câc van này cô dung tich tü 5-500 jil, thuông dùng 20, 50, 100 [il. -Côt tâch: Là côt chüa pha tînh, quyét dinh hiêu quâ cüa su tâch mot 8 hôn hop mâu. Côt tâch thucmg làm bàng thép không rî, dàc biêt tro vôi hoâ châ't và chiu duoc âp suât cao, cô chiêu dài khoâng 10- 30 cm, duông ki'nh trong 4- 10 mm, hat chât nhôi cô (J> =5- 10 (im. Thông thucmg chât nhôi côt là Silicagel hoàc Silicagel dâ duoc silan hoâ hoàc duoc bao mot lôp mông hüu co, ngoài ra con dùng câc hat khâc: Nhôm oxit, châ't trao doi ion... -Hê thong phât hiên chât phân tich ( detector): Là bô phân phât hiên câc chât khi chüng ra khôi côt. Tuÿ theo tfnh chât cüa câc chât cân phân tich mà nguôi ta sü dung câc detector khâc nhau nhu: > Detector hâp thu UV-VIS: 190- 900 nm dë phât hiên câc chât hâp thu quang. Dây là loai thông dung nhât. > Detector huÿnh quang: Dë phât hiên câc châ't hüu co phât huÿnh quang tu nhiên cüng nhu câc dân chât cô huÿnh quang. Dây là loai detector cô dô chon loc cao nhât. > Detector diên hoâ (do dông, dô dân, eue pho, diên luong.. ) > Detector khôi pho. > Detector tân xa ânh sang bay hoi. > Detector chiê't xuât vi sai: Detector khüc xa. > Detector do dô dân nhiêt, hiêu üng nhiêt... - Hê thong thu nhân và xü lÿ kê't quâ: Dë ghi tm hiêu phât hiên do detector truyên sang. 1.3.3. CÂC DAI LUONG DÀC TRUNG • Thâi gian liûi ( tR ) Thôi gian luu cüa môt châ't là thôti gian tfnh tù lüc tiêm mâu dê'n lüc xuâ't hiên dinh cûa pic trên sàc dô. Thôi gian luu dàc trung cho toc dô di chuyën cüa mot châ't, no là hàng dinh và câc chât khâc nhau thi thcfi gian luu sê khâc nhau trong cüng mot diêu kiên HPLC dâ chon. Do dô no là dai luong dùng dë dinh tînh mot chât. 9 • Hê so dung litçfng (k ’): r r r Hê sô dung luçmg là tÿ sô giüa luçmg chât tan trong pha tînh và luçmg chât tan trong pha dông ô thoi diêm cân bàng. k'= ———= -^--1 ( t0 là thcfi gian luu cüa chât không bi luu giü) to to *Dô chon loc a: r r r Dô chon loc a cho biêt hiêu quâ tâch cüa hê thông sàc kÿ. —t a _ ak ' At_ LR B lO b-* t ^ B lRAf L0 B là chât bi luu giü manh hon A Dê tâch hai chât cân co a >1, thuàng dùng trong khoâng 1,05-2,0. Nêu a quâ Ion thi thoi gian phân tich kéo dài. r f 'y r •Sô âîa lÿ thuyêt N và chiêu cao âïa lÿ thuyêt H: Côt sâc kÿ duoc coi nhu cô N lôp mông, ô môi lôp su phân bô chât tan vào hai pha duoc coi là dat dên mot trang thâi cân bàng.Nhüng lôp mông này duoc goi là dïa lÿ thuyêt. H là chiêu cao dïa lÿ thuyêt H =— N (L là chiêu dài côt) Sô dïa lÿ thuyêt là dai luçmg biêu thi hiêu nàng cüa côt trong mot diêu kiên sâc kÿ nhât dinh. r r \ Sô dïa lÿ thuyêt duoc tfnh bâng công thuc sau: N = 16(—)2 = 5,54(-^—)2 W W05 W: chiêu rông do ô dây pic. W05: chiêu rông do ô nüa chiêu cao pic. Côt cô N lôn hay H nhô là côt cô hiêu lue cao, khi dô dô doâng pic nhô. Trong thuc té N nam trong khoâng 2500 dén 5500 là vùa dü. 10 •Dô phân giâi R: Dô phân giâi là dai luçmg biêu thi dô tâch cûa câc chât ra khôi nhau trên mot diêu kiên sàc kÿ dâ cho. _ 2(tRB ~ ïra) _ 1,1 ~Ï ra) _ ^ oc—\ b Wa +W b W0,5A+W0i5B 4 a k'A r f f •Hê sô bât dôi xüng: r r r r r Hê sô bât dôi xüng cho biêt mue dô không dôi xüng cüa pic trên sâc dô thu duoc. T = ‘H Ï 2a a, b là dô rông do ô 1/20 chiêu cao pic. T nam trong khoâng 0,5-2,5 thî phép dinh luçmg duoc châp nhân. 1.4. CO SÔ LŸ THUYÊT VE HUŸNH QUANG 1.4.1. SUHÎNH THÀNH QUANG PHO HUŸNH QUANG [2], [3], [7], [9] Hiên tuçmg huÿnh quang là quâ trînh phât xa quan trong cüa nguyên tü, ion hay phân tü duoc kfch thfch nho hâp thu büc xa diên tü. Theo thuyêt luong tü, môi hat so câ'p (nguyên tü, ion, phân tü) co mot hê thong duy nhât câc trang thâi nàng luçmg. Trang thâi nàng luçmg thâp nhât goi là trang thâi co bân (S0). Khi bi kfch thich, nhu duoc hâp thu photon ânh sang thî nàng luçmg cüa photon sê duoc truyên sang hat và hat së duoc chuyén sang mot nàng luçmg cao hon goi là trang thâi kfch thich Sf, S2 ... (ô môi trang thâi phân tü cô thë ton tai à câc phân müc nàng luçmg khâc nhau 0; 1; 2; 3...). Hiên tuong huÿnh quang xây ra khi: Câc nguyên tü tü müc thâp nhât cûa trang thâi kfch thfch vê trang thâi co bân giâi phông ra nàng luçmg bàng câch büc xa câc photon ânh sâng, goi là su phuc hôi cô büc xa, và ânh sâng büc xa này chmh là huÿnh quang (kéo dài 10'9 —» 10'6 giây). So phân tü co khâ nàng huÿnh quang tuong dôi ft bôi vî huÿnh quang yêu câu câc dàc diëm vê câu trüc sao cho quâ trînh phuc hôi không büc xa xây ra vôi toc dô thâp và tâng cuong toc 11 dô phât huÿnh quang. Nhiêu phân tü không co câc dâc diëm này và toc dô quâ trînh hôi phuc không büc xa vè müc nàng luong co bân lôn hon dâng kë so vôi quâ trînh hôi phuc co büc xa. Vî thé mà quâ trînh huÿnh quang không xây ra. Trong hiên tuong phât quang, mot phàn nàng luong cüa ânh sâng kfch thich bi tiêu tôn chuyën thành nhiêt nàng do va cham, vi vây nàng luong ânh sâng kfch thich bao gicf cüng lôn hon nàng luong ânh sâng büc xa, hay nôi câch khâc, buôc song ânh sâng büc xa luôn dài hon buôc song cüa ânh sâng kfch thfch. Trong phô huÿnh quang thuông dùng 2 khâi niêm: a). Pho kich thich: Excitation spectrum (Ex) Là duông biëu diên su phu thuôc cûa cuong dô phât quang tuong dôi (relative intensity) theo buôc song cûa ânh sâng kfch thfch. Buôc song eue dai cüa phô kfch thfch cüng chmh là buôc song eue dai hâp thu cüa chât duoc kfch thfch (duoc hoat hôa) vî vây phô kfch thfch cüng chmh là duông biëu diên môi quan hê giüa cuông dô hâp thu cüa chât dô và buôc song büc xa hâp thu. b). Pho bûc xa (pho huÿnh quang): Emission spectrum (Em) Là duông biëu diên su phu thuôc cüa cuông dô huÿnh quang cüa chât dâ duoc hoat hoâ theo buôc song cüa ânh sâng phât ra (bûc xa huÿnh quang). c). Vi du: Pho kich thich Pho birc xa Histamin dihydroclorid 1 |ig/ml ""T 300 nm 400 nm 400 nm 500 nm 6Ô0 nm Hïnh 1. Pho kich thich và pho bûc xa cüa Histamin (Dung dich 1 /JglmL, eue dai Ex = 350 nm, eue dai Em = 440 nm) 12 1.4.2. ÜNG DUNG CÛA PHÉP DO HUŸNH QUANG [7], [9]. 1.4.2.1. Dinh tînh Dua vào câp buôc song eue dai Ex/Ei n dë dinh tfnh vî vôi mot châ't nhât dinh duoc kich thfch bàng mot tia cô buôc song nào dô thî së cho mot tia cô buôc song huÿnh quang nhât dinh. 1.4.2.2. Dinh lurong Dua vào su phu thuôc tuyê'n tfnh giüa cuông dô huÿnh quang vôi nông dô chât phât quang mà phuong phâp duoc âp dung dë dinh luong. Phép do huÿnh quang duoc âp dung dë dinh luong câc chât cô khâ nàng phât huÿnh quang tu nhiên hoàc câc châ't cô thë tao ra dân chât thfch hop cô khâ nàng phât huÿnh quang. 1.5. PHlTCNG PHÂP HPLC VÔI DETECTOR HUŸNH QUANG - TAO DÂN XUÂT SAU CÔT 1.5.1. PHUONG PHÂP HPLC VÔI DETECTOR HUŸNH QUANG Quang pho huÿnh quang ngoài viêc âp dung dë dinh tfnh, dinh luong câc châ't trên mây do quang pho huÿnh quang thî nô côn duoc âp dung dë chê' tao bô phân phât hiên cûa mây sàc kÿ long hiêu nàng cao: Detector huÿnh quang. Vê nguyên tâc câu tao detector huÿnh quang gôm hai bô don sâc hoâ, mot bô cung câ'p chùm tia kfch thfch, mot bô thu nhân chùm tia phât xa huÿnh quang. Hai bô phân này bô' tri truôc và sau buông do. Trong detector huÿnh quang, dèn nguôn tao chùm tia kfch thfch thuông dùng là dèn xénon cô khâ nàng phât ra bure xa trong khoâng rông 200 - 800 nm. Detector huÿnh quang dông vai trô nhu mot mây quang pho huÿnh quang kê't nô'i vôi sâc kÿ long dë phât hiên vê dinh tfnh và dinh luong câc chât sau khi ra khôi côt sâc kÿ. Nô duoc âp dung dë phât hiên tôt nhiêu châ't hüu co phât huÿnh quang tu nhiên cüng nhu câc dân chât cô huÿnh quang. Nguyên 13 tâc cüa phép do huÿnh quang là: Khi chiéu môt chùm tia sâng kich thfch cô buôc song xâc dinh vào châ't mâu, châ't này phât ra chùm tia phât xa huÿnh quang cô buôc song xâc dinh tuÿ thuôc tùng chât và cô cuông dô phu thuôc vào hàm luong cüa chüng.[9], [20], [21], [24] ; Bènnguon^snon Bô phân don sàc ' da'bûc xa Thâukinh Thâu klnh / Ông nhân quang BÔ phân dtm =( jÇ........... v .......B ...... » .... I kich thich r , %J y r^ ® Mâu do ( J BanS dlodc Hinh 2. Sa âô câu tao cüa môt detector huÿnh quang 1.5.2. TAO DÂN XUAT SAU CÔT Tùy theo câc chât cân dinh luong cô khâ nàng phât quang hay không mà nguôi ta tien hành dinh luçmg truc tiê'p hay giân tiê'p thông qua dân chât cüa nô. Cô nhüng hop châ't bînh thuông thi không phât quang hoàc phât quang yê'u, nhung khi chuyën sang câc dân châ't khâc thî phât quang rât manh. (VD: môt sô câc amino acid, duông, ion vô c o ,...) [7], [9]. Trong truông hçrp dô, nguôi ta cô thë cho châ't cân phân tfch phân üng vôi câc thuôc thü dë tao dân xuâ't phât huÿnh quang manh truôc khi di dê'n detector huÿnh quang. Nê'u chât cân phân tfch duoc phân üng vôi thuôc thü truôc khi qua côt thî kÿ thuât này goi là tao dân xuât truôc côt (pre-column). Nê'u châ't cân phân tfch duoc phân üng vôi thuôc thü sau khi dâ di qua khôi côt và truôc khi dê'n detector, thî duoc goi là tao dân xuât sau côt (post-column). 14 Kÿ thuât tao dân xuât tnrôc côt không doi hôi phâi cô thiét bô phân üng di kèm theo mây HPLC nhir kÿ thuât tao dân xuât sau côt. Nhung tao dân xuât trirôc côt doi hôi dân xuât tao thành phài turong dôi bên, on dinh và luçfng thuôc thCr du cô thé gây ânh hiïông trong qüa trînh tâch trên côt. Sir dung kÿ thuât tao dân xuât sau côt cô thé khàc phuc dirçfc câc nhuoc diêm này nên pham vi ûng dung cua no rât 1dm [7], [21], [24]. Viêc tao dân xuât sau côt doi hôi phâi cô bô phân tao dân xuât hay côn goi là buông phân iïng sau côt thich hop. Buông phân rïng sau côt cô thé cô nhiêu kiêu thiét ké khâc nhau, nhung dêu dira trên nguyên lÿ hoat dông là: câc thuôc thü së diroc bam vào buông phân irng theo mot hê thông bofm riêng, Dông thdi chat cân phân tfch sau khi ra khôi côt cüng duoc di qua buông phân ûng tao dân xuât vôi thuôc thü. Dân xuât duoc tao thành së duoc dua dén detector dé phât hiên. B otti thuoc thû Hîtih 3. Sa âô eau tao cüa mot mây HPLC Vâi detector huynh quang và bô tao dân xuât sau côt Phân ufng tao dân xuât sau côt cân duoc thuc hiên trong thdi gian ngàn à nhiêt dô thfch hop. Nên chon thuôc thur mà trong diêu kiên tao dân xuât, thuôc thü du không bi phât hiên bcfi detector [24]. 15 Câc thuôc thir tao dân xuât sau côt thirdng duac su dung vôi detector huÿnh quang [24]: Thuôc thu Fluorescamin Câc chât cô thé tao dân chât vôi Detector phât hiên chât thuôc thur dân xuât Câc horp chât chüa nhôm amin bâc Ex = 390 nm nhât: Câc amin, acid amin, peptid. Dansyl clorid Em = 470 nm Câc protein, amin, acid amin, hçfp Ex = 335 nm - 365 nm Em = 520 nm chât phénol. O- Câc hop chât chu'a nhôm amin bâc Ex = 300 nm Phthalaldehyd nhât. Em = 400 nm - 600 nm 1.5.3. PHÂN ÜNG TAO DÂN XUAT PHÂT HUŸNH QUANG CÜA TOBRAMYCIN Phân tuf Tobramycin cô ch ira câc nhôm chrïc amin dang R-NH2, do do no cô thé tao dân xuât phât huÿnh quang vôi câc thuoc thü nhu fluorescamin, dansyl clorid và ortho-phthalaldehyd. Trong do thuoc thü ortho-phthalaldehyd duac su dung pho bien hcfn câ [21] [24]. Phucfng trinh phân rïng tao dân xuât phât huÿnh quang cüa hop chât chüa nhôm amin vôi thuôc thu ortho-phthalaldehyd: Hdp chât phât huÿnh quang Trong phân ung tao dân xuât phât huÿnh quang vôi ortho-phthaldehyd phâi cô thêm mot chât cô nhôm mercapto (-SH), thucfng sü dung là mercaptoethanol hoac mercaptoacetic. 16 PHAN 2. THl/C NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ 2.1. NGUYÊN VÂT LIÊU VÀ PHI/ONG PHÂP THIIC NGHIÊM 2.1.1 DÜI TlTONG NGHIÊN CT J tJ • Thuoc nhô mât Tobramycin 0,3 % cüa công ty co phân Duoc phâm Hà Tây (HATAPHAR). Thành phân: Tobramycin sulfat tucfng üng voi Tobramycin 3.0 mg Benzalkonium clorid 0,1 mg Natri clorid 9.0 mg Nuôc cât Vd 1,0 mL • Chât chuân Tobramycin (C18H37N50 9); SKS: 0103167, duoc sân xuât tai Viên kiëm nghiêm thuôc Trung uong (Hàm luong nguyên trang: 949,64 )ig/mg). 2.1.2. THIÊT BI VÀ HOÂ CHAT 2.I.2.I. Dung môi, hoâ chât + Methanol tinh khiét HPLC. + Natri pentansulfonat tinh khiét HPLC. + Acid boric. + Natri hydroxyd. + O-phthalaldehyd (Ortho-phthalaldehyd, OPA). + Mercaptoethanol. + Dung dich polyoxyethylen lauryl ether + Natri sulfat khan. + Acid acetic tinh khiét HPLC. 17 2.I.2.2. Thiet bi, dung eu + Mây HPLC vôi detector huÿnh quang và bô phàn üng tao dân xuàt sau côt. + Mây lac siêu âm. + Mây do pH. + Bô loc dung môi, loc mâu vol màng loc 0,45 jim. + Cân phân tfch co dô chmh xâc ±0,1 mg. + Câc dung eu thuÿ tinh chrnh xâc: binh dinh mire, pipet chmh xâc, ong dong ... 2.1.3. NÔI DUNG VÀ PHI/ÛNG PHÂP NGHIÊN CÜU 2.I.3.I. Nôi dung Khâo sât lua chon dieu kiên sac kÿ Tobramycin là chat htfu co phân eue, tan nhiêu trong nirôc. Vi vây de phân tfch và dinh ltfông tôt, chüng tôi chon phuong phâp HPLC pha dâo: Tien hành trên mây sàc kÿ long hiêu nâng cao detector huÿnh quang cô bô tao dân xuât sau côt. Và trên ca sô cô sân côt RP-18 Brava ODS (150 x 4,6 mm; 5 fj,m), chuong trînh sàc kÿ duoc xây dung trên chuân Tobramycin cùng vôi viêc phân tfch mâu nghiên cûu nhâm khâo sât chon diêu kiên sâc kÿ thfch hop: ❖ Khâo sât chon càp biréc song kfch thfch và buôc song phât xa cho detector huÿnh quang. ♦♦♦ Khâo sât chon thành phàn pha dông thfch hçfp cho phép phân tfch Tobramycin. ♦♦♦ Khâo sât chon dung dich thuôc thû tao dân xuât sau côt. ♦♦♦ Khâo sât chon toc dô dong pha dông và toc dô bom thuôc thü’. Tir câc diêu kiên dâ lua chon chüng tôi tien hành dânh giâ tfnh thfch hop cüa hê thông sàc kÿ. 18 Dânh giâ phuong phâp: [13] Phircfng phâp phân tfch cân diroc dânh giâ theo câc tiêu chf sau : o Tfnh dàc hiêu cûa phirong phâp o Dô tuyén tfnh giüa nông dô Tobramycin và diên tfch pic o Dô lap lai cüa phirong phâp o Dô düng cûa phirong phâp 2.1.3.2. Phirong phâp nghiên cuu - Phirong phâp thuc nghiêm dë tîm ra diëu kiên sàc kÿ tôi iru, thu thâp sô lieu và xü lÿ thông kê (sü dung công eu hô tro là phân mêm thông kê SPSS) dë dânh giâ két quâ. - Phirong phâp eu thë : HPLC vôi detector huÿnh quang- tao dân chât sau côt dua trên phân üng cüa Tobramycin vôi thuôc thü tao dân xuât cô khâ nàng phâp huÿnh quang. 2.1.3.3. Câc dâc trimg thông kê dë xur lÿ két quâ phân tich. Giâ tri trung binh : Dô lêch chuân: Dô lêch chuân tuong dôi : RSD (%) = ^ . 1 0 0 Trong dô : Xj là két quâ cüa lân xâc dinh thü i. n là sô lân xâc dinh. 19 2.2. KÉT QUÂ THl/C NGHIÊM VÀ NHÂN XÉT 2.2.1. LUÂ CHON DIEU KIÊN SAC KŸ 2.2.I.I. Chon cap btïôc sông kîch thich và phât xa Nhu dâ dè câp à phân tong quan, Tobramycin là môt chât hâp thu UV VIS rât thâp, dô hâp thu UV - VIS cüa Tobramycin không thfch hop de phât hiên bàng detector UV - VIS. Vôi mot detetor cô dô nhay rât cao là detector huÿnh quang, chüng ta cô thé phât hiên duoc nhiêu chât à nông dô rât thâp. + De chon câp buôc sông kfch thfch và birc xa eue dai cho detector huÿnh quang, chüng tôi tien hành quét pho nhu sau: - Cô dinh buôc sông kfch thfch (Ex) (dat ô 1 sô buôc sông khâc nhau), quét pho buôc sông büc xa dé tim buôc sông büc xa eue dai. Duoc ÀXEm)max = 455 nm (Hïnh 4.). i‘‘ \ *jpV» »*»**«»» . m m GL*& MÊÊËÊÊÈ'"È rË-Èï*M '** Hînh 4. Pho bûc xa huÿnh quang cüa dân chât Tobramycin vôi thuoc thü o-phthalaldehyd. 20 - Co dinh burôc song büc xa (Em), quét pho buôc song kich thich dê tim buôc song kfch thich eue dai. Duoc X(Ex)max = 338 nm (Hinh 5.). Hinh 5. Pho kich thich huÿnh quang cüa dân chât Tobramycin vôi thuôc thü o-phthalaldehyd. + Két quâ, lua chon duoc cap buôc song eue dai Ex/Em = 338 nm /455 nm. 2.2.I.2. Khâo sât lira chon thành phàn và tÿ le pha dông Qua nghiên cüu tfnh châ't lÿ hoâ cüa Tobramycin và dua trên mot sô' tài lieu tham khâo [15] [16] [23], chüng tôi dâ tiê'n hành khâo sât so bô vôi nhiêu pha dông khâc nhau. Tü két quâ khâo sât so bô, chüng tôi chon pha dông pha trong nuôc vôi thành phàn gôm natri sulfat, natri pentansulfonat và acid acetic dë tiép tue khâo sât lua chon nông dô tôi Uu cho câc thành phàn trong pha dông. • Ânh huông cüa nông dô natri sulfat trong pha dông Khâo sât câc pha dông chüaO,l% acid acetic và 0,02 M natri pentansulfonat vôi nông dô natri sulfat thay doi làn luot là: 0,1 M; 0,125 M; 0,15 M và 0,2 M. Két quâ khâo sât cho thâ'y khi tàng nông dô natri sulfat trong pha dông, thôi gian luu cüa Tobramycin së giâm di và pic së gon hon (Xem Hinh 6). 21 Bâng 1 : Khâo sât nông dô natri sulfat trong pha dông Nông dô natri sulfat trong pha dông Thôi gian luti cüa Tobramycin 0,20 M 4,9 phüt 0.15 M 6,4 phüt 0,125 M 6,6 phüt 0,10 M 11,4 phüt Hinh 6. Hînh ânh chông câc sâc kÿ dô de so sânh thôi gian lieu và hinh dang pic cüa Tobramycin khi thay doi nông dô natri sulfat trong pha dông. Nhân thây ràng khi thay doi nông dô natri sulfat xuông 0,1 M, pic Tobramycin ra châm hon nhiêu và pic bi doâng rât xâu. Trong khoâng nông dô natri sulfat tù 0,125 M dên 0,20 M, hînh dang pic ft bi ânh huông bai sir thay doi nông dô natri sulfat và pic dêu cô hînh dang cân xûng. Qua két quâ dâ khâo sât, chung tôi chon nông dô natri sulfat cho pha dông là 0,125 M. 22 Nhu vây, chî cân dùng môt lirang hôa chat toi thiëu nhung vân dâm bâo duoc dô cân xung cüa pic dâp ûng và thôi gian liru khoâng 6 phüt là thfch hop. • Ânh huong cüa nông dô natri pentansulfonat trong pha dông: Khâo sât câc pha dông chüa 0,1% acid acetic và 0,125 M natri sulfat vôi nông dô natri pentansulfonat thay doi lân liïçrt là: 0,015 M; 0,0175 M và 0,02 M. Kêt quâ khâo sât cho thây khi giâm nông dô natri pentansulfonat trong pha dông, thôi gian liru cüa Tobramycin së giâm di nhung pic së doâng hon và Fluorescence không cân doi (Xem Hinh 7). Hinh 7. Sâc kÿ dô cüa Tobramycin vâi pha dông chûa 0,015 Mnatri pentansulfonat Nhân thây ràng khi thay doi nông dô natri pentansulfonat xuông 0,015 M, pic Tobramycin bi doâng rât xâu. Vori nông dô natri pentansulfonat là 0,0175 M hay 0,020 M, hinh dang pic it bi ânh huong bôi su thay doi nông dô natri pentansulfonat và pic dêu co hinh dang cân xûng. Qua két quâ dâ khâo sât, chüng tôi chon nông dô natri pentansulfonat cho pha dông là 0,0175 M. 23 Nhu vây, giâm duac luong hôa chât natri pentansulfonat nhung vân dâm bâo duoc dô cân xüng cüa pic dâp üng. 2.2.1.3. Khâo sât lua chon câch pha thuôc thu* Qua khâo sât mot sô câch pha thuôc thü, chüng tôi thây nông dô OPA khoâng 1% là thich hop. Trong thuôc thü, ngoài thành phàn chmh là OPA và 2-mercaptoethanol, chüng tôi cho thêm mot luong nhô polyoxyethylen lauryl ether. Vôi su cô màt cûa polyoxyethylen lauryl ether, hinh dang pic së dep hon do dâp üng cüa pic thu duoc lôn hon. Tü câc két quâ khâo sât thu duoc, chüng tôi lua chon pha dông và thuôc thü nhu sau: Pha dông: Dung dich chüa 0,125 M natri sulfat; 0,0175 M natri pentansulfonat và 0,1 % acid acetic. Thuoc thü tao dân xuât sau côt: Dung dich 1% o-phthalaldehyd; 0,2% 2mercaptoethanol; 0,3% dung dich polyoxyethylen lauryl ether 12% trong hôn hop (Methanol : dung dich dêm borat pH 10,4) (30 : 70). * Dung dich dêm borat pH 10,4: Pha theo BP 2005 [18]. 2.2.1.4. Khâo sât toc dô dông pha dông và toc dô bom thuôc thiï Vôi pha dông và thuôc thü nhu trên, viêc thay doi toc dô dông cüa pha dông và tôc dô bom thuôc thü trong khoâng 0,5 mL/phüt - 1,5 mL/phüt it ânh huông dén hînh dang cüa pic dâp üng. Tuy nhiên, khi thay doi tôc dô dông cüa pha dông thî së làm thay dôi thoi gian luu cüa pic dâp üng. Qua khâo sât, chüng tôi chon tôc dô dông cüa pha dông là 1,0 mL/phüt và tôc dô bom thuôc thü là 0,7 mL/phüt. Tôm lai, sau quâ trînh khâo sât, chüng tôi xâc dinh duoc dièu kiên sàc kÿ thich hop nhu sau: 24 - Côt RP-18 Brava ODS (150 x 4,6 mm : 5 |uim). - Detector huÿnh quang : Ex / Em = 338 nm / 455 nm. - Toc dô dông pha dông : 1,0 m L / phüt. - Toc dô thuôc thir : 0,7 mL / phüt. - Thé tfch tiêm : 20 \xL. - Nhiêt dô phân tich : Nhiêt dô phông thf nghiêm. Pha dông: Hôa tan 17,75 g natri sulfat khan; 3,05 g natri pentansulfonat và 1,0 mL acid acetic bâng trong 1000 mL nircfc, lâc dêu, loc qua màng loc 0,45 |um. Thuôc thü tao dân xuât sau côt: Hôa tan 0,5 g o-phthalaldehyd trong 150 mL methanol, thêm 1,0 mL 2-mercaptoethanol, lâc 3 phüt. Thêm 1,5 mL dung dich polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 mL dung dich dêm borat pH 10,4, lâc dêu. * Dung dich dêm borat pH 10,4: Hôa tan 24,64 g acid boric trong 900 mL ntiôc. Diêu chînh pH dê'n 10,4 bâng dung dich natri hydroxyd 40%, thêm mtôc tôi vùa dû 1000 mL, lâc dêu, loc qua màng loc 0,45 jum (Pha theo BP 2005). 2.2.I.5. Thü tînh thich hçrp cüa hê thong sac kÿ De tien hành sac kÿ dinh ltfçmg, chüng tôi tiên hành xâc dinh tfnh thich hop cüa hê thông sàc kÿ bâng câch tiêm làp lai nhiêu làn dung dich chuân Tobramycin cô nông dô nâm trong khoâng tuyên tfnh. Ghi lai diên tfch pic dâp üng qua câc làn tiêm. Yêu câu chênh lêch diên tfch pic giûa câc lân tiêm cüa cùng mot dung dich, biëu thi bâng dô lêch chuân tucmg doi RSD(%), không 1cm hon 2%. - Pha dung dich Tobramycin chuân : Cân chmh xâc khoâng 25,0 mg chat chuân Tobramycin, hôa tan và pha loâng trong pha dông dên vùa dü 25,0 mL. Hüt chmh xâc 3,0 mL dung dich này cho vào bînh dinh mire 25 mL, thêm pha dông vira dü dén vach, lâc dêu. Hüt chmh xâc 2,0 mL dung dich thu duoc, pha 25 loâng vôi pha dông dê'n vira du 20,0 mL, làc dêu, diroc dung dich cô nông dô khoâng 12 jig/mL . Loc qua màng loc 0,45 jam, dem dich loc di tiêm sâc kÿ. - Tien hành sâc kÿ dung dich chuân theo câc dieu kiên dâ chon. - Câc sô lieu vê diên tfch dâp üng và thôi gian liru tirong üng cüa Tobramycin thu duoc ô Bàng 2. Bàng 2. Kët quâ dânh giâ tinh thich hop cüa hê thông. Sô TT Thôi gian lim(phut) Diên tich pic (mAU) 1 6,419 123269361 2 6,413 123531291 3 6,431 123031491 4 6,431 123765211 5 6,440 124330001 6 6,452 123918256 TB 6,431 123640935,2 RSD (%) 0,219 0,377 26 Sô dïa lÿ thuyêt Hê sô bât trung bînh (N) dôi(T) N = 3347 T = 1,18 Hinh 8. Sac kÿ do cüa dung dich chuân Tobramycin. Hinh 9. Hinh ânh sâc kÿ dô cüa 6 lân tiêm duoc chông khit lân nhau 27 * Nhân xét: Két quâ cho thây RSD(%) cüa câc thông so dâc trufng cüa diêu kiên sâc kÿ dâ lua chon phù hop và dam bâo su 6n dinh cho phép phân tich. 2.2.2. DÂNH GIÂ PHUONG PHÂP 2.2.2.I. Tînh dâc hiêu Mue dich : Chüng minh su cô mât cüa chât khâc không ânh huong dên câch tiên hành dinh luong bâng câch : Tao mâu trâng vôi câc thành phàn tâ duoc tucrng tu nhu à trong ché phâm, nhung không cô hoat chât Tobramycin. Tien hành chay sâc kÿ nhu doi vôi mâu thü. Trên sâc kÿ dô thu duoc, tai thôi diëm xuât hiên pic cüa Tobramycin không duoc cô pic nào. - Pha dung dich thü : Hüt chfnh xâc 1,0 mL dung dich thü (tuong duong vôi 3,0 mg Tobramycin) cho vào bînh dinh müc 25 mL, thêm pha dông vira dü dê'n vach, lâc dêu. Hüt chmh xâc 2,0 mL dung dich trên, pha loâng vôi pha dông dên vîra dü 20,0 mL, lâc dêu. Loc qua màng loc 0,45 jam. - Mâu trâng tu tao cô thành phàn nhu sau: - Benzalkonium clorid - Natri clorid 10 mg 900 mg vd 100,0 mL - Nuôc cât - Tien hành sâc kÿ dung dich thü và dung dich mâu trâng theo câc diêu kiên dâ lira chon * Két quâ: - Doi vôi mâu thü, sâc kÿ dô cho 1 pic cân xüng vôi thôi gian liru khoâng 6,4 phüt. Dô là pic cüa Tobramycin duoc tao dân chât vôi thuôc thü (Hînh 9). 28 ” J»005000.00- 4500 OÛ- 4000 LU- 3500 00-; § : jLooc^ S 3000 Xi j 2000 00- 1500.00- 1 ! i ! 1000 00- 5001»- i A * 1.00 ' ' ' ' 2 00 ' ' ' 3.00 ' ' 4.00 ' ' ' ' 5.00 ' ' * 6.00 ' l ' ' ' 7.00 ' Minutes 6 ' “ ' 8.00 ' ....... ' 9.(30 ^ '"lo.'oo ' ' 11 OC 12.00 '3 'oC Hinh 10. Sâc kÿ do cüa dung dich thü Tobramycin. - Doi vôi mâu tràng, trên sàc kÿ dô không cô pic nào xuât hiên trong khoâng thôi gian luu cûa pic Tobramycin (Hînh 10). Hinh 11. Sac kÿ do cüa dung dich mâu trâng, không cô Tobramycin. * Kët luân: Vây phuong phâp dinh luong Tobramycin duoc xây dung cô tînh dàc hiêu cao. 29 22.2.2. Khâo sât khoâng tuyen tmh De dam bâo su chînh xâc cüa phép dinh lirçmg, chüng tôi tien hành khâo sât su phu thuôc tuyén tfnh giûa nông dô vôi diên tfch pic dâp lîng cüa Tobramycin trên chât chuân Tobramycin. Thuàng làm tùr 5 ^7 diëm nông dô cüa chât phân tfch. Moi tuong quan giüa tfn hiêu dâp üng vôi nong dô chât phân tfch duoc biëu diên bàng phuong trînh và hê sô tuong quan hôi qui. Yêu câu duông hôi qui thu duoc phâi cô dang duông thang và giâ tri hê sô tucfng quan hôi qui phâi không nhô hdn 0,99. - Qiuân bi mot dây dung dich chuân cüa Tobramycin trong pha dông cô nong dô bién thiên trong khoâng tù 1 dên 20 jag/mL. Câch pha : Cân chmh xâc khoâng 25,0 mg chât chuân Tobramycin, hôa tan và pha loâng trong pha dông dên vira dü 25,0 mL. Hüt chmh xâc 2,0 mL dung dich này cho vào bînh dinh mire 25 mL, thêm pha dông vira dû dên vach, làc dêu. Sau dô cho vào 5 bïnh dinh miïc 20,0 mL câc thë tfch chmh xâc nhu sau: Bàng 3. Câch pha 5 dung dich chuân. Bïnh 1 2 3 4 5 Tobramy cin(mL) 1 2 3 4 5 Nong dô(fig/mL) 4 8 12 16 20 Thêm pha dông vira dû dên vach, làc dêu duoc câc dung dich cô nông dô nhu a bâng, loc qua màng loc 0,45 fim, dung dich loc dem tiêm sac kÿ. Dë pha dung dich chuân cô nông dô l|ug/mL : hüt chmh xâc 5,0 mL dung dich chuân 4|ag/mL dâ pha à trên cho vào bïnh dinh mire 20,0 mL, thêm pha dông vira dü dên vach, làc dêu, loc qua màng loc 0,45 jim. - Tiên hành sac kÿ theo diêu kiên dâ lira chon. - Két quâ duoc trînh bày trong Bàng 4. 30 Bàng 4. Kët quâ khâo sât khoâng tuyën tinh. SoTT Nông dô (ng/mL) Diên tich pic 1 1 8952389 2 4 42096759 3 8 83482531 4 12 123947564 5 16 164998784 6 20 205189027 Phirong trinh hôi qui y = 10297251,34 x + 105788,45 Hê sô tuong quan v R = 0,9998 / p £ifông hôi qui tuyen tinh cua Tobramycin NÔng 0,99. - Phuong phâp cô dô lâp lai tôt vôi dô lêch chuân tuong dôi diên tich pic cüa Tobramycin vôi 6 mâu do dêu nhô hon 2%. - Phuong phâp cô tfnh düng dâm bâo, tÿ lê tîm lai tü 98,04% - 99,06% và dô lêch chuân tuong dôi RSD [...]... hunh quang tu nhiờn hoc cõc chõ't cụ thở tao ra dõn chõt thfch hop cụ khõ nng phõt hunh quang 1.5 PHlTCNG PHP HPLC VễI DETECTOR HUNH QUANG - TAO DN XUT SAU CễT 1.5.1 PHUONG PHP HPLC VễI DETECTOR HUNH QUANG Quang pho hunh quang ngoi viờc õp dung dở dinh tfnh, dinh luong cõc chõ't trờn mõy do quang pho hunh quang thợ nụ cụn duoc õp dung dở chờ' tao bụ phõn phõt hiờn cỷa mõy sc k long hiờu nng cao: Detector. .. Detector hunh quang Vờ nguyờn tõc cõu tao detector hunh quang gụm hai bụ don sõc hoõ, mot bụ cung cõ'p chựm tia kfch thfch, mot bụ thu nhõn chựm tia phõt xa hunh quang Hai bụ phõn ny bụ' tri truục v sau buụng do Trong detector hunh quang, dốn nguụn tao chựm tia kfch thfch thuụng dựng l dốn xộnon cụ khõ nng phõt ra bure xa trong khoõng rụng 200 - 800 nm Detector hunh quang dụng vai trụ nhu mot mõy quang pho... vụi cõc detector thich hop Tobramycin l hop chat aminoglycosid, tuong tu nhu cõc hop chat amin khõc nụ cỹng cụ khõ nng tao dõn xuõt phõt hunh quang vụi mụt sụ thuục thỹ Viờc phõt hiờn cõc chõt bng quang phụ hunh quang cụ 7 tfnh dc hiờu cao v rõt nhay, do dụ chỹng tụi dõ chon huụng nghiờn cỹu l dinh lirong Tobramycin bng sc k long hiờu nng cao vụi detector hunh quang 1.3 TONG QUAN VE PHlTONG PHAP HPLC. .. phõn tich ( detector) : L bụ phõn phõt hiờn cõc chõt khi chỹng ra khụi cụt Tu theo tfnh chõt cỹa cõc chõt cõn phõn tich m nguụi ta sỹ dung cõc detector khõc nhau nhu: > Detector hõp thu UV-VIS: 190- 900 nm dở phõt hiờn cõc chõt hõp thu quang Dõy l loai thụng dung nhõt > Detector hunh quang: Dở phõt hiờn cõc chõ't hỹu co phõt hunh quang tu nhiờn cỹng nhu cõc dõn chõt cụ hunh quang Dõy l loai detector cụ... Toc dụ dụng: 1 mL/phỹt - Dung dich tao dõn xuõt sau cụt: Dung dich natri hydroxyd 2% pha trong nuục dõ loai carbon dioxyd Toc dụ 0,3 mL/phỹt - Detector: Detector diờn hụa (detector do dụng) hoc cõc thiờ't bi tuong tu Nhiờt dụ detector dõt ụ 35C - Thở tich tiờm: 20 (aL - Nụng dụ dung dich chuõn v thỹ: khoõng 0,1 mg/mL trong nuục 1.2.2.2 Chirong trinh HPLC 2: [14] * Dieu kiờn sac ky: - Cụt Purospherđ... Thõu klnh / ễng nhõn quang Bễ phõn dtm =( jầ v .B ằ I kich thich r , %J y r^ đ Mõu do ( J BanS dlodc Hinh 2 Sa õụ cõu tao cỹa mụt detector hunh quang 1.5.2 TAO DN XUAT SAU CễT Tựy theo cõc chõt cõn dinh luong cụ khõ nng phõt quang hay khụng m nguụi ta tien hnh dinh luỗmg truc tiờ'p hay giõn tiờ'p thụng qua dõn chõt cỹa nụ Cụ nhỹng hop chõ't bợnh thuụng thi khụng phõt quang hoc phõt quang yờ'u, nhung... cõp phõn tong quan, Tobramycin l mụt chõt hõp thu UV VIS rõt thõp, dụ hõp thu UV - VIS cỹa Tobramycin khụng thfch hop de phõt hiờn bng detector UV - VIS Vụi mot detetor cụ dụ nhay rõt cao l detector hunh quang, chỹng ta cụ thộ phõt hiờn duoc nhiờu chõt nụng dụ rõt thõp + De chon cõp buục sụng kfch thfch v birc xa eue dai cho detector hunh quang, chỹng tụi tien hnh quột pho nhu sau: - Cụ dinh buục... thiờ't bi dõc biờt (phirong phõp HPLC) Mõt khõc do Tobramycin cụ cõu trỹc cỹa mụt aminoglycosid, khụng hõp thu quang ụ vựng tỹ ngoai - khõ kiộn, nờn khụ cụ thở dinh luong bng phuong phõp hoõ hoc hoc phõt hiờn bng quang phụ UV- VIS Mụt trong cõc biờn phõp thuụng duoc sỹ dung dở phõt hiờn ra cõc chat khụng cụ khõ nng hõp thu quang ụ vựng tỹ ngoai - khõ kiờn bng cõc detector quang phụ l cho no phõn ỹng vụi... phõn irng theo mot hờ thụng bofm riờng, Dụng thdi chat cõn phõn tfch sau khi ra khụi cụt cỹng duoc di qua buụng phõn ỷng tao dõn xuõt vụi thuục thỹ Dõn xuõt duoc tao thnh sở duoc dua dộn detector dộ phõt hiờn B otti thuoc thỷ Hợtih 3 Sa õụ eau tao cỹa mot mõy HPLC Või detector huynh quang v bụ tao dõn xuõt sau cụt Phõn ufng tao dõn xuõt sau cụt cõn duoc thuc hiờn trong thdi gian ngn nhiờt dụ thfch hop... phuong phõp HPLC pha dõo: Tien hnh trờn mõy sc k long hiờu nõng cao detector hunh quang cụ bụ tao dõn xuõt sau cụt V trờn ca sụ cụ sõn cụt RP-18 Brava ODS (150 x 4,6 mm; 5 fj,m), chuong trợnh sc k duoc xõy dung trờn chuõn Tobramycin cựng vụi viờc phõn tfch mõu nghiờn cỷu nhõm khõo sõt chon diờu kiờn sõc k thfch hop: Khõo sõt chon cp birộc song kfch thfch v buục song phõt xa cho detector hunh quang Khõo ... mõt Tobramycin 0, 3% bng phuong phõp HPLC või detector huynh quang, tao dõn chat sau cụt vụi cõc mue tiờu sau: - Xõy dung duoc mot phuong phõp dinh luong Tobramycin bng HPLC vụi Detector hunh quang. .. phõp HPLC vol Detector hunh quang - tao dõn xuõt sau cụt 13 1.5.1 Phuong phõp HPLC voti detector hunh quang 13 1.5.2 Tao dõn xuõt sau cụt 14 1.5.3 Phõn ỹng tao dõn xuõt phõt hunh quang. .. phõt hunh quang tu nhiờn hoc cõc chõ't cụ thở tao dõn chõt thfch hop cụ khõ nng phõt hunh quang 1.5 PHlTCNG PHP HPLC VễI DETECTOR HUNH QUANG - TAO DN XUT SAU CễT 1.5.1 PHUONG PHP HPLC VễI DETECTOR