BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CHIẾT VÀ BẢO QUẢN ĐẾN HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ GIANG (Aganonerion polymorphum) Giảng viên hướng dẫn : PGS TS. Nguyễn Anh Tuấn TS. Nguyễn Thế Hân Sinh viên thực hiện : Nguyễn Văn Trường Mã số sinh viên : 53131859 Lớp : 53 CNTP-1 Khánh Hòa, 06/2015 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho em xin gửi lời biết ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa Công Nghệ thực Phẩm, Phòng Đào Tạo, Phòng Công Tác Sinh Viên cùng các đoàn thể trong Trƣờng Đại Học Nha Trang sự tự hào, đƣợc học tập tại trƣờng trong những năm qua. Trong thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm nhờ sự giúp đỡ và tạo điều kiện của các thầy cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm và các cán bộ phòng thí nghiệm mà em đã hoàn thành xong đồ án tốt nghiệp của mình. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, cán bộ khoa Công Nghệ Thực Phẩm đã giúp đỡ em. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Thế Hân và thầy Nguyễn Anh Tuấn đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tận tình và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Cuối cùng em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và các anh chị Cao học đã giúp đỡ, tạo điều kiện và động viên em trong thời gian qua. Em xin chân thành cám ơn! Khánh Hòa, ngày 15 tháng 6 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Văn Trƣờng ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i MỤC LỤC ............................................................................................................................. ii DANH MỤC HÌNH .............................................................................................................. iv DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................................viii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................1 2. Mục đích của nghiên cứu. ...................................................................................2 3. Ý nghĩa của đề tài nghiên cứu .............................................................................3 4. Đối tƣợng nghiên cứu ..........................................................................................3 5. Nội dung đề tài ....................................................................................................3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN ........................................................................................5 1.1. TỔNG QUAN VỀ LÁ GIANG ........................................................................5 1.1.1. Tên gọi, hình thái .......................................................................................5 1.1.2. Cấu tạo của lá giang ...................................................................................6 1.1.3. Đặc tính sinh thái và địa điểm phân bố lá giang ........................................6 1.1.4. Thành phần hóa học của lá giang ..............................................................6 1.1.5. Ứng dụng của lá giang trong y học và đời sống hàng ngày. .....................7 1.2. Gốc tự do và chất chống oxy hóa .....................................................................9 1.2.1. Gốc tự do ...................................................................................................9 1.2.2. Quá trình hình thành các gốc tự do ............................................................9 1.2.2.1. Chuỗi hô hấp tế bào ............................................................................9 1.2.2.3. Trong hội trứng viêm ........................................................................11 1.2.2.4. Trong quá trình thiếu máu cục bộ và tƣới máu lại ............................11 1.2.2.5. Tác nhân xenobiotic ..........................................................................11 iii 1.2.3. Ảnh hƣởng của gốc tự do tới cơ thể ........................................................12 1.2.4. Chất chống oxy hóa .................................................................................13 1.2.5. Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa ........................................14 1.2.5.1 Các chất chống oxy hóa bậc 1: Vô hoạt các gốc tự do ......................14 1.2.5.2. Các chất chống oxy hóa bậc 2: Ngăn chặn sự tạo các gốc tự do ......14 1.2.5.3. Tạo phức với kim loại .......................................................................17 1.2.6. Một số chất chống oxy hóa ......................................................................18 1.2.6.1. Acid ascorbic (Vitamin C) ................................................................18 1.2.6.2. Carotenoid .........................................................................................21 1.2.6.3. Polyphenol ........................................................................................23 1.2.6.4. Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa ...................................24 1.3.Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa ......................................25 1.3.1. Phƣơng pháp xác định trực tiếp hoạt tính chống oxy hóa. ......................25 1.3.1.1. Phƣơng pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): ......25 1.3.1.2. Phƣơng pháp DPPH(Scavenging ability towards radicals): ...........25 1.3.1.3. Phƣơng pháp ORAC(oxygen radical absorbance capacity): ...........26 1.3.1.4. Phƣơng pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): 27 1.3.1.5. Phƣơng pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): .............27 1.3.2. Phƣơng pháp xác định gián tiếp hoạt tính chống oxy hóa .....................28 1.3.2.1. Phƣơng pháp cân khối lƣợng ..........................................................28 1.3.2.2. Chỉ số peroxide (PV).......................................................................28 1.3.2.3. Chỉ số para-anisidine ........................................................................28 1.3.2.4. Chỉ số acid thiobarbituric (TBA) .....................................................29 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá rình chiết .......................................................29 iv 1.4.1. Lựa chon dung môi trích ly ....................................................................29 1.4.2. Diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi ...................................29 1.4.3. Độ ẩm của nguyên liệu ...........................................................................29 1.4.4. Nhiệt độ trích ly ......................................................................................30 1.4.5. Thời gian trích ly ....................................................................................30 CHƢƠNG 2 ..............................................................................................................31 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................31 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất ...........................................................................31 2.1.1. Nguyên liệu lá giang ................................................................................31 2.1.2. Hóa chất và thuốc thử ..............................................................................31 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................32 2.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm ẩm (phụ lục 1) .............................................32 2.2.2. Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang .........................................32 2.2.3. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết ................33 2.2.4 Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang...........34 2.2.5 Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang...........36 2.2.6. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của số lần chiết đến ............................38 2.2.7. Thí nghiệm ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số ....................................................................................39 2.2.8. Thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản ....................41 2.3. Các phƣơng pháp phân tích ...........................................................................42 2.3.1. Xác định hàm lƣợng polyphenol .............................................................42 v 2.3.2. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH .................................................42 2.3.3. Tổng năng lực khử ...................................................................................43 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu .........................................................................43 CHƢƠNG 3 ..............................................................................................................44 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................................44 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. .................................................................44 3.2. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng ...................... 48 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số ...................51 3.4. Ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số .......................56 3.5. Ảnh hƣởng của sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số ....................57 3.6. Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa .............................................................................................................................61 3.7. Ảnh hƣởng của điều kiện và thời gian bảo quản đến hàm lƣợng .....................63 3.8. Ảnh hƣởng của bộ phận trên cây lá giang tới hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa trong dịch chiết ........................................................................ 66 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ..................................................68 4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................68 4.2. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ........................................................................................69 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................70 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 1 PL vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lá giang tƣơi ............................................................................................... 5 Hình 1.2. Quá trình gây hại của gốc tự do đối với màng tế bào ............................... 13 Hình 1.3. Cấu trúc của Vitamin C ............................................................................. 19 Hình 1.4. Cấu trúc của vitamine E (α-tocopherol) .................................................... 20 Hình 1.5. Một số hợp chất carotenoid ....................................................................... 22 Hình 1.6. Phản ứng giữa DPPH và một số chất chống oxy hóa ............................... 26 Hình 1.7. Đồ thị miêu tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian ......................... 27 Hình 2.1. Quy trình xử lý và bảo quản nguyên liệu lá giang .................................... 31 Hình 2.2. Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang .......................................... 32 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sự ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm ........ 33 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá ................. 37 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Error! Bookmark not d Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của số lần chiết đến đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ lá ......................... 38 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang ................................................................................................. 40 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản........ 4141 vii Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) ............................................................................................................... 45 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá ................................................................................................................................ 46 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) ................................................................................................................ 47 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) ................................................................................................................ 49 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian đến tổng năng lực khử của dịch ...................... 50 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) ................................................................................................................ 55 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) ..................................................................................................................... 53 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang ......................................................................................................................... 50 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến khả năng khử gốc tự do của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05)........................................................................................................................... 51 viii Hình 3.10. Ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê (p< 0,05) .................................................................................................................... 56 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm khả năng khử gốc tự do của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) ..................................................................................................................... 57 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của sóng siêu âm tới hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang ............................................................................................................. 58 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của sóng siêu âm tới tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang .......................................................................................................................... 59 Hình 3. 14. Ảnh hƣởng của sóng siêu âm tới khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang ..................................................................................................... 60 Hình 3.15. Sự tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol tổng số .............................. 62 Hình 3.16. Sự tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng khử gốc tự do DPPH ............................................................................................................... 62 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của điều kiện và thời gian bảo quản tới hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang ............................................................... 64 Hình 3.18. Ảnh hƣởng của điều kiên và thời gian bảo quản tới khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang............................................................................... 65 Hình 3.19 Ảnh hƣởng của các bộ phận trên cây lá giang tới hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết ở nhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết ................................. 66 Hình 3.20 hƣởng của các bộ phận trên cây lá giang tới năng lực khử của dịch chiết ở nhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết 90 phút, dung môi 50% ethanol. ...................... 67 Hình 3.21 Ảnh hƣởng của các bộ phận trên cây lá giang tới khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết ở nhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết 90 phút, dung môi 50% ethanol. ................................................................................................................. 67 ix DANH MỤC BẢNG Trang phụ lục Bảng PL1.1. Hàm lƣợng nƣớc có trong nguyên liệu .............................................2PL Bảng PL2. Đƣờng chuẩn Gallic acid .....................................................................3PL Bảng PL3.1. Hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang ...............4PL Bảng PL3.2. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang ...................................5PL Bảng PL3.3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang ....................6PL Bảng PL3.4. Hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang ...............7PL Bảng PL3.5. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang .................................. 8PL Bảng PL3.6. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang ................... 8PL Bảng PL3.7. Hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết từ lá giang ........................... 9PL Bảng PL3.8. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang ................................ 10PL Bảng PL3.9. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang ................. 10PL Bảng PL3.10. Hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết từ lá giang ....................... 12PL Bảng PL3.11. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang ............... 11PL Bảng PL3.12. Hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết từ lá giang ....................... 12PL Bảng PL3.13.Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang ............................... 12PL Bảng PL3.14. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang ............... 13PL Bảng PL3.15. Hàm lƣợng polyphenol tổng của dich chiết lá giang ................... 13PL Bảng PL 3.16 Ảnh hƣởng của điều kiện, thời gian bảo quản đến khả năng khử gốc tự do DPPH ..........................................................................................................14PL x DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DPPH 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl UV-VIS Ultraviolet-visible spectroscopy TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity DPPH Scavenging ability towards radicals ORAC Oxygen radical absorbance capacity TRAP Total radical-trapping antioxidant potential FRAP Ferric reducing-antioxidant power TPTZ 2,4,6-tripyridyl-s-triazine AAPH 2,2-azobuis(2-amidinopropane) dihydrochlorinde ROS Reactive oxygen species 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cùng với sự lo ngại của ngƣời tiêu dùng đối với những sản phẩm thực phẩm và dƣợc phẩm bổ sung hóa chất có nguồn gốc tổng hợp, trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học và nhà sản xuất đã chú ý quan tâm đến các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên. Polyphenol từ thực vật là nhóm hợp chất có nhiều họat tính sinh học quý nhƣ chống oxy hóa, chữa bệnh…Lá giang là một loài cây trồng rất phổ biến ở Việt Nam và các nƣớc nhiệt đới. Lá giang đƣợc sử dụng rộng rãi trong các bữa ăn hàng ngày của ngƣời dân Việt Nam. Trong y học dân gian cho rằng lá giang có khả năng hỗ trợ điều trị một số bênh: sỏi thận, chữa viêm đƣờng tiết niệu và có sỏi, chữa đau nhức xƣơng khớp, chữa mụn nhọt...[100]. Tuy nhiên bằng chứng khoa học về khả năng điều trị những bệnh này còn rất hạn chế…Theo nghiên cứu của Sakong tiến hành trên đối tƣợng lá giang thu thập ở Thái Lan thì hàm lƣợng polyphenol và vitamin C trong lá giang chứa một lƣợng rất lớn (polyphenol: 647.05  5.87mg GAE/100g NL khô, 6.92  0.2 mg GAE/100g NL khô) [103], đây là những hợp chất quý và đóng vai trò quan trọng vào quá trình chống oxy hóa. Cho đến nay chƣa có công trình nào công bố về khả năng chống oxy hóa của lá giang trồng tại Việt Nam. Mặc dù về khoa học, lá giang có dƣợc tính cao và đã đƣợc dùng nhƣ một cây thuốc phổ biến ở một số nƣớc nhƣ Thái Lan, Lào…Tuy nhiên ở nƣớc ta loại cây này chỉ mới đƣợc sử dụng làm gia vị [103]. Trên thế giới hiện chỉ có một vài nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của lá giang đƣợc nghiên cứu. Mặc dù vậy những nghiên cứu này đƣợc thực hiện trên đối tƣợng nguyên liệu ở nƣớc ngoài, ví dụ nhƣ nghiên cứu ở Thái Lan của Pornkamon Sakong và cộng sự mới chỉ dừng lại ở việc tìm hiểu thành phần của lá giang, hàm lƣợng polyphenol và vitamin C ở một điều kiện tách chiết: 70% ethanol, 300C trong thời gian 5 phút, trong khi đó mỗi loài thực vật thì thành phần các chất trong nó phụ thuộc nhiều vào điều kiện khí hậu, giống, đất đai…Trong y học dân gian, và đặc biệt là luận án tiến sĩ: Nghiên cứu về thực vật hóa học và một số tác dụng sinh học của cây lá giang (Lê 2 Thế Chính - Đại học Dƣợc Hà Nội) [102] đã cho chúng ta cái nhìn khái quát hơn về loài cây này ở nƣớc ta. Các ứng dụng về việc sử dụng các hoạt chất sinh học từ lá giang để đƣa vào trong sản xuất và đời sống còn hạn chế [100]. Trong khi đó, ngày nay việc ứng dụng các hoạt chất sinh học và sản xuất và bảo quản thực phẩm, cũng nhƣ phục vụ cho y học đang là nhu cầu cấp thiết và có triển vọng cao. Là hƣớng đi mang lại nhiều hiệu quả. Lá giang có khả năng ứng dụng cao, mang lại thu nhập cho ngƣời dân nếu biết cách tận dụng nguồn cây leo này. Xuất phát từ những vấn đề trên cùng với sự hƣớng dẫn của thầy Nguyễn Thế Hân và thầy Nguyễn Anh Tuấn, em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện chiết và bảo quản đến hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang (Aganonerion polymorphum)”, nghiên cứu này đánh giá sự ảnh hƣởng của dung môi chiết, điều kiện chiết đến hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của lá giang thu hoạch ở Khánh Hòa. Nghiên cứu này cũng so sánh hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của lá và thân cây giang. Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy sự thay đổi của hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa trong các điều kiện bảo quản khác nhau. 2. Mục đích của nghiên cứu. - Tìm ra đƣợc điều kiện chiết thích hợp (nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu…) để thu đƣợc dịch chiết từ lá giang có hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa cao. - Đánh giá đƣợc hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang thu hái tại Khánh Hóa. - Đánh giá đƣợc sự thay đổi của hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang trong thời gian bảo quản. - Đánh giá đƣợc hàm lƣợng polyphenol trên các bộ phận lá và thân cây lá giang để tiến hành tách chiết có hiệu quả. 3 3. Ý nghĩa của đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học: - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để khẳng định một số hoạt tính y dƣợc từ thực vật nói chung và cây lá giang nói riêng. - Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn trong việc tách chiết các hợp chất chống oxy hóa từ thực vật. - Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp một số dữ liệu khoa học về lá giang. Ý nghĩa thực tiễn: - Kết quả của đề tài là cơ sở để phát triển một số sản phẩm giá trị gia tăng và thực phẩm chức năng từ lá giang. - Thành công của đề tài sẽ góp phần thúc đẩy ngành trồng thảo dƣợc và ứng dụng sinh học thực phẩm từ đó tạo giá trị kinh tế cho xã hội và nâng cao thu nhập cho ngƣời dân. - Tìm ra hƣớng đi mới cho việc trồng và sử dụng lá giang một cách hiệu quả. 4. Đối tƣợng nghiên cứu Lá giang, tên gọi khác: Cây giang chua, dây dang, tên khoa học: Aganonerion polymorphum Pierre, 1906, tên tiếng Anh: Sour-soup creeper, River-leaf creeper. Ở Việt Nam, cây lá giang mọc ở nhiều nơi thuộc các tỉnh miền Trung và vùng đồng bằng sông Cửu Long. Ở Nam Bộ, cây lá giang thƣờng mọc hoang ven sông rạch, trong vƣờn cây, đƣợc dùng làm rau và làm thuốc. Hiện nay, cây lá giang đƣợc trồng làm nguồn rau sạch đặc sản ở một số hộ nông dân. Ngƣời dân Nam Bộ dùng lá giang nấu canh chua, chế biến nhiều món ăn bổ dƣỡng nhƣ xào với thịt gà, cá nƣớc ngọt, thịt bò.... Canh chua lá giang là một món ăn ngon, bổ.[100]. Lá giang đƣợc thu hái tại các vùng quê, đồi núi xung quanh khu vực thành phố Nha Trang (Diên Khánh, Khánh Vĩnh...) 5. Nội dung đề tài - Nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi chiết (ethanol trong nƣớc) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. 4 - Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện và thời gian bảo quản đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. - So sánh hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của lá và thân lá giang. Trong quá trình thực hiện đề tài này mặc dù em đã cố gắng tìm tòi và học hỏi, do bƣớc đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót, kính mong nhận đƣợc sự góp ý của quý thầy cô, các chuyên gia và các sinh viên để đề tài có thể đƣợc hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn qu ý thầy cô và các bạn! 5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ LÁ GIANG 1.1.1. Tên gọi, hình thái Về tên gọi Lá giang, tên gọi khác: cây giang chua, dây dang, tên khoa học: Aganonerion polymorphum Pierre, 1906, tên tiếng Anh: Sour-soup creeper, River-leaf creeper. Hình 1.1. Lá giang tƣơi 6 Hình thái Lá giang là Dây leo dài 1,5 - 4m, nhẵn, có ít nhựa mủ trắng. Lá có phiến mỏng, hình trái xoan ngọn giáo, đầu nhọn sắc, gốc hình tim hoặc tù ở gốc, mặt trên có màu sáng hơn, dài 3,5 - 10cm, rộng 2 - 5cm. Hoa đỏ hoặc trắng, xếp 2 - 5 cái một thành chùm xim ở ngọn. Quả gồm hai quả đại hình dải, thẳng hay cong, rẽ đôi, màu đen đen, khía rãnh dọc. Hạt dài 3 - 4mm, màu nâu, thuôn, có mào lông mềm màu hung. Cây mọc hoang ở ven rừng, ven suối trong các quần hệ thứ sinh, có khi gặp ở nƣơng rẫy, đồi cây bụi, nơi có nhiều ánh sáng [100]. 1.1.2. Cấu tạo của lá giang Lá giang có cấu tạo tƣơng đối đơn giản. Gồm rễ, thân, lá và hoa quả, là thân dây leo nằm hoặc bám vào các cây bụi khác. 1.1.3. Đặc tính sinh thái và địa điểm phân bố lá giang Ở Việt Nam, cây lá giang mọc ở nhiều nơi thuộc các tỉnh miền Trung và vùng đồng bằng sông Cửu Long. Ở Nam Bộ, cây lá giang thƣờng mọc hoang ven sông rạch, trong vƣờn cây, đƣợc dùng làm rau và làm thuốc. Hiện nay, cây lá giang đƣợc trồng làm nguồn rau sạch đặc sản ở một số hộ nông dân. Ngƣời dân Nam Bộ dùng lá giang nấu canh chua, chế biến nhiều món ăn bổ dƣỡng nhƣ xào với thịt gà, cá nƣớc ngọt, thịt bò.... Canh chua lá giang là một món ăn ngon, bổ. 1.1.4. Thành phần hóa học của lá giang Thành phần hóa học của lá giang phụ thuộc vào giai đoạn sinh trƣởng, vị trí địa lý, môi trƣờng sinh sống. Theo nghiên cứu của viện dữ liệu thực vật Việt Nam: Thành phần dinh dƣỡng trong 100g lá giang tƣơi [101]: Thành phần Khối lƣợng Protein (g) 3,5 Glucid (g) 3,5 Carotein Vitamin C (mg) (mg) 0,6 26 Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lá giang tƣơi Nƣớc (g) 85,3 7 1.1.5. Ứng dụng của lá giang trong y học và đời sống hàng ngày. Lá giang đã đƣợc sử dụng làm thức ăn cho ngƣời và động vật từ rất lâu. Ngày nay, lá giang là một phần trong bữa ăn nhƣ sử dụng lá giang làm các món nhƣ canh chua lá giang, cá cơm xào lá giang… Trong y học dân gian: Lá giang là loại rau này có tác dụng giải nhiệt tốt. Có thể giã nát, lấy nƣớc uống. Có nơi dùng lá của cây này giã lẫn với lá khoai lang, chế nƣớc uống chữa ngộ độc sắn (mì). Cây lá giang là cây thuốc dân gian, dùng chữa chứng ăn uống không tiêu, bụng đầy trƣớng, đau dạ dày, đau nhức xƣơng khớp. Cây lá giang dùng ngoài chữa mụn nhọt, lở ngứa ngoài da; dùng làm thực phẩm có vị chua khi chế biến các món ăn (cá, thịt). Thân lá giang làm thuốc chữa sỏi tiết niệu, viêm đƣờng tiết niệu, viêm thận mạn tính. Đặc biệt, nó còn có tác dụng chữa viêm ruột, phong thấp, sƣng tấy... Về mặt sinh học, cao lỏng lá giang đƣợc chiết xuất không thấy độc tính, có tác dụng ức chế 9 loại vi khuẩn, tiêu viêm cấp tính cả khi uống và tiêm. Bộ phận dùng làm thuốc là thân, rễ và lá. - Lá giang chữa viêm đƣờng tiết niệu và có sỏi: Thân hoặc lá giang 100-200 g, sắc uống nhiều lần trong ngày (theo y học cổ truyền Việt Nam). Hoặc thân lá giang 10-20 g, hãm uống thay trà. - Lá giang chữa ăn không tiêu, bụng trƣớng đầy: Lá giang 30-50 g, sắc uống. Đơn thuốc này uống liên tục chữa đƣợc sỏi và viêm đƣờng tiết niệu. - Lá giang chữa đau nhức xƣơng khớp, đau dạ dày: Rễ hoặc lá 20-40 g, sắc uống, thƣờng kết hợp với một số vị thuốc trị đau khác. - Chữa mụn nhọt, lở ngứa ngoài da, vết thƣơng: Lá tƣơi rửa sạch, giã nát, đắp lên vết thƣơng. - Cá chuồn nấu lá giang (công dụng bổ hƣ tổn, khu phong trừ thấp, cƣờng kiện cân cốt; phòng chữa viêm đƣờng tiết niệu với các triệu chứng đái dắt, đái buốt): Cá chuồn 3-5 con, lá giang 100 g. Cá chuồn bỏ vảy, chặt vây, cắt làm 2-3 khúc; lá giang rửa sạch, vò giập. Nƣớc đun sôi, cho cá vào, sau đó cho lá giang và bột canh 8 (muối, bột ngọt), có thể thêm nắm gạo làm tăng phần đậm đặc của nồi canh. Khi bắc ra, cho thêm trái ớt đập giập. - Chữa viêm bàng quang bằng canh gà lá giang (công dụng thanh nhiệt giải độc dùng cho các trƣờng hợp lao thƣơng khí huyết, phong hàn thấp tí; sản hậu băng huyết, huyết trắng, hội chứng lỵ xuất huyết, trĩ xuất huyết, suy nhƣợc cơ thể): Gà 600 g, lá giang 100 g, gia vị vừa đủ. Gà rửa sạch, để ráo chặt miếng; lá giang bánh tẻ rửa sạch. Cho thịt gà cùng 1 lít nƣớc, đun sôi, vớt bọt, thêm mắm và gia vị vừa ăn. Khi thịt gà chín mềm, cho lá giang đã vò nát vào, đun sôi; trƣớc khi bắc ra thêm ít rau thơm vừa ăn. Không chỉ đƣợc biết đến với công dụng dùng làm gia vị quen thuộc cho các món ăn món lẩu, canh chua,... lá giang còn đƣợc biết đến với tác dụng chữa đƣợc nhiều căn bệnh, đặc biệt là các bệnh về đƣờng tiết niệu, bệnh sỏi thận. Điều này là hoàn toàn có thể và đã đƣợc nghiên cứu, chứng minh. Ngƣời bệnh sỏi thận có thể áp dụng bài thuốc từ cây lá giang để trị bệnh cùng với các phƣơng pháp điều trị chính có tác dụng nhanh chóng loại bỏ sỏi thận ra khỏi cơ thể. Loại lá này trong dân gian còn đƣợc gọi là lá vang, tên khoa học của nó là Ecdysanthera rosea, thuộc họ trúc đào, mọc hoang ở vùng đồi núi, bìa rừng. Với vai trò dùng làm thực phẩm và thuốc chữa bệnh, hiện nay lá giang có mặt phổ biến và trở nên quen thuộc trong cuộc sống hàng ngày. Theo Đông y, lá giang có vị chua, tính bình, không độc, có tính năng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, kháng viêm diệt khuẩn, giảm đau… Đặc biệt, nó còn có tác dụng chữa viêm đƣờng tiết niệu, có sỏi, viêm thận mạn tính, viêm ruột, phong thấp, sƣng tấy… Về mặt sinh học, lá giang không có độc tính, có tác dụng ức chế 9 loại vi khuẩn có nhiều saponin, flavonoid, sterol, coumarin, tamin, chất béo, axit hữu cơ và 12 nguyên tố vi lƣợng có tác dụng chữa viêm đƣờng tiết niệu, có sỏi, viêm thận mạn tính… Các nghiên cứu, thử nghiệm về tác dụng làm tan sỏi thận của lá giang cũng cho kết quả quan giúp khẳng định loại lá này có tác dụng làm giảm các cơn đau, 9 triệu chứng bệnh sỏi thận và đặc biệt những ngƣời bệnh thử nghiệm theo cách này cũng nhận thấy sỏi thận đã đƣợc đào thải ra ngoài qua đƣờng nƣớc tiểu[100], [102]. 1.2. Gốc tự do và chất chống oxy hóa 1.2.1. Gốc tự do Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp ngoài cùng chứa các điện tử không ghép cặp (điện tử đơn độc). Chúng có thể mang điện tích âm hoặc không mang điện và có khả năng phản ứng cao. Vì vậy, gốc tự do thƣờng bất ổn cả về năng lƣợng cũng nhƣ động học. Nó có khuynh hƣớng đạt tới sự ổn định, thời gian tồn tại rất ngắn, hoạt tính rất mạnh. Quá trình sinh gốc tự do là một quá trình chuyển hóa bình thƣờng của cơ thể [16], [30], [84]. Gốc tự do có xu hƣớng mất điện tử để trở thành gốc khử hoặc nhận điện tử để trở thành gốc oxy hóa. Gốc tự do không ghép cặp nên dễ dàng tấn công vào các phân tử tạo ra các phân tử mới, gốc tự do mới và gây ra phản ứng dây chuyền. Các gốc tự do chủ yếu là các dạng oxy hóa hoạt động đƣợc hình thành qua chuỗi hô hấp tế bào, trong quà trình peroxy háo lipid của các acid béo chƣa bão hòa [3], [16], [30]. 1.2.2. Quá trình hình thành các gốc tự do Các gốc tự do trong cơ thể đƣợc tạo ra thƣờng xuyên qua chuỗi hô hấp tế bào, tác nhân phóng xạ, hội trứng viêm, trong hiện tƣợng thiếu máu cục bộ - tƣới máu lại, các tác nhân xenobiotic và một số tác nhân khác. 1.2.2.1. Chuỗi hô hấp tế bào Hô hấp đƣợc thực hiện trong ty thể, bao gồm các phản ứng oxy hóa khử oxy để sinh ra nƣớc và năng lƣợng dƣới dạng ATP (phản ứng oxy hóa khử là quá trình cho và nhận điện tử, do vậy sản sinh ra các gốc), O2 mà chúng ta hít thở nhận một điện tử ở bƣớc đầu tiên tạo ra O-2 Cơ chất e- +ᵒO-Oᵒ O- 2 O-2 sinh ra tỷ lệ thuận với cƣờng độ hô hấp tế bào (tỷ lệ với năng lƣợng sinh ra), là một gốc anion độc hại ở mức trung bình và chúng bị phân hủy bởi nhiều cơ chế khác nhau. Sự phân hủy O-2 đƣợc xúc tác bởi enzyme SOD, chuyển thành H2O2 theo cơ chế tự oxy hóa khử. 10 2 O- 2 + H2 H2 O2 + O2 SOD có hai dạng là MnSOD (là SOD trung tâm hoạt động có mangan) và CuZnSOD (là SOD mà trung tâm hoạt động có đồng và kẽm). Trong ty thể, enzyme MnSOD phân hủy khoảng 80% gốc O-2 khi chúng vừa đƣợc sinh ra, còn gốc nào thoát ra bào tƣơng (khoảng 20%) sẽ bị loại bỏ bởi enzyme CuZnSOD và nhờ hai enzyme này mà gốc O-2 không đến đƣợc màng tế bào, vƣợt ra màng tế bào do vậy dịch ngoại bào hầu nhƣ không có O-2[32], [81]. H2O2 thƣờng xuyên sinh ra do sự phân hủy O-2, nồng độ H2O2 (10-8mol/L) và O-2 (10-12mol/L) trong tế bào tƣơng đối ổn định. Tuy nồng độ thấp nhƣ vậy, nhƣng sự tồn tại đồng thời của chúng trong môi trƣờng sinh học là rất nguy hại. Phản ứng giữa chúng sinh ra những sản phẩm 1O2 cũng rất nguy hại, gốc ᵒOH với hoạt tính cao, có khả năng phá hủy những cấu trúc hữu cơ bền vững nhất của cơ thể và gây ra các quá trình bệnh lý. Khi không có mặt cuat ion Fe2+, Cu2+ thì phản ứng này xảy ra chậm, gọi là phản ứng Harber-Weiss. O- 2 HOᵒ + H 2 O2 + HO- + O- 2 Khi có mặt của các ion Fe2+, Cu2+ thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh (phản ứng Fenton). Hai tiểu phân O-2 và H2O2 không độc có thể tạo ra 1O2, ᵒOH coa khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxide và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. 2 O-2 + 2H+ HOᵒ + HO- + Fe3+ Gốc ᵒOH có khả năng phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc độ khuếch tán, vì vậy nó thƣờng phản ứng trƣớc khi khuếch tán với những nơi có khả năng gây tổn thƣơng lớn, nhƣng chỉ gây tổn thƣơng trong phạm vị bán kính [2], [16], [32], [91]. 1.2.2.2. Tác nhân phóng xạ Các tia phóng xạ hoặc bức xạ có năng lƣợng cao, có khả năng bẻ gãy một phân tử tạo ra 2 hay nhiều gốc tự do. Trong cơ thể chúng ta chiếm phần lớn là nƣớc, do 11 vậy khi các bức xạ có năng lƣợc cao tác động trên cơ thể, sẽ phân hủy nƣớc tạo thành các phân tử khác và sản sinh gốc tự do [2], [76]. 1.2.2.3. Trong hội trứng viêm Theo Almagor và cộng sự, 1984 [25], hội trứng viêm là một phản ứng tự vệ của cơ thể khi có các tác nhân lạ xâm nhập vào cơ thể. Khi các tác nhân (là các kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bắt giữ, đồng thời lại kích hoạt bạch cầu đa nhân trung tính tăng tiêu thụ oxy, kích thích eym của màng tế bào là NADPH-oxidase, từ đó gây phản ứng xúc tác bởi enzyme này, kết quả cuối cùng là tạo ra O-2. Nếu số lƣợng gốc tự do sinh ra quá nhiều sẽ gây nên một tỷ lệ bạch cầu bị chết, giải phóng các gốc ROS ra ngoài gây nên hiện tƣợng viêm. 1.2.2.4. Trong quá trình thiếu máu cục bộ và tƣới máu lại Khi thiếu máu cục bộ do long mạch máu bị hẹp hoặc có cục máu đông, các chất xanthine đƣợc tích lũy do tăng thoái hóa ATP và xanthine oxidase đƣợc hoạt hóa. Khi có sự tƣới máu trở lại, với sự có mặt của oxy, xanthine oxidase xúc tác phản ứng chuyển điện tử từ hypoxanthine và xanthine sang O2 và phản ứng oxy hóa xảy ra rất mạnh, một lƣợng lớn gốc O-2 hình thành lại chuyển thành H2O2, ᵒOH và 1 2H+ O2[2], [16], [138]. Xanthine dạng oxy hóa + O-2 Xanthine + O2 2H+ 2O-2 H2 O2 + 1 O2 1.2.2.5. Tác nhân xenobiotic Các chất xenobiotic (thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, chì…) xâm nhập vào cơ thể bằng nhiều con đƣờng khác nhau, khi vào cơ thể sẽ bị chuyển hóa và làm biến đổi sinh học. Sau quá trình chuyển hóa đó, cấu trúc xenobiotic bị biến đổi rõ rệt, chúng có thể gắn thêm nhóm –OH, -NH2, =SH, -COOH… tạo thành các chất dễ tan trong nƣớc và tiếp tục liên hiệp với các chất, đào thải ra khỏi cơ thể. 12 Trong quá trình chuyển hóa các chất xenobiotic, tạo ra các dạng ROS nhƣ O-2, 1 O2… có độc tính cao và gây ra tình trạng stress oxy hóa. Các chất chống oxy hóa trong cơ thể nhƣ SOD, catalase, protein có nhóm SH, ceruloplasmin trong hồng cầu và gan nhạy cảm với các xenobiotic. Do vậy, khi có các xenobiotic xâm nhập vào cơ thể, các chất chống oxy hóa này sẽ thay đổi theo hƣớng chống lại các tác nhân đó [54], [84]. 1.2.2.6. Một số tác nhân khác Trong một số bện lý bện đái tháo đƣờng, xơ vữa động mạch, bệnh lý nhãn khoa, lão hóa, bệnh Parkinson và Alzheimer… cũng tăng cao các dạng ROS [11], [16]. 1.2.3. Ảnh hƣởng của gốc tự do tới cơ thể Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con ngƣời mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuối trung niên cơ thể mạnh trấn áp đƣợc chúng, nhƣng tới tuổi cao sức yếu gốc tự do lấn áp gây thiệt hại nhiều gấp mƣời lần ở ngƣời trẻ. Nếu không kịp kiểm soát, kiềm chế gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa nhƣ ung thƣ, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ngƣời cao niên. Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dƣỡng thất thoát, tế bào không tăng trƣởng, tu bổ, rồi chết. Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dƣới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đƣờng bột, mỡ, enzyme trong tế bào. Nó gây đột biến gen ở nhiễm thể, ở DNA, RNA. Nó làm chất collagen, Elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc. Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trƣớc hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dƣỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vở nguồn cung cấp năng lƣợng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trƣởng đƣợc. 13 Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già đƣợc coi nhƣ một tích tụ những đổi thay trong mô tế bào. Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong những nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thƣơng các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lƣợng. Do quan sát, ngƣời ta thấy gốc tự do ít ở các sinh vật chết non, có nhiều ở sinh vật sống lâu. Ngƣời cao tuổi có nhiều gốc tự do hơn là khi ngƣời đó còn trẻ. Cơ chế gốc tự do gây bệnh ung thƣ. - Gây tổn thƣơng AND, gây đột biến phân tử, tế bào. - Kích hoạt gen gây ung thƣ, còn gọi là oncogenne. - Ức chế hệ miễn dịch làm hệ miễn dịch của cơ thể suy yếu dẫn đến một loạt bệnh nguy hiểm nhƣ: HIV/AIDS, viêm gan virut B, C... [12] Hình 1.2. Quá trình gây hại của gốc tự do đối với màng tế bào 1.2.4. Chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngƣợc quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể 14 (Jovanovic và Simic, 2000 [59]; Lachaman và cộng sự, 2000 [63]; Singh và Rajini, 2004 [87]), có thể bảo vệ con ngƣời khỏi các bệnh nghiêm trọng nhƣ khối u ác tính, rối loạn tim mạch, đái tháo đƣờng, viêm và các bệnh thoái hóa thần kinh. Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa đƣợc phân thành hai loại; các chất chống oxy hóa bậc I và các chất chống oxy hóa bậc II. Các chất chống oxy hóa bậc I khử hoặc kết hợp với các gốc tự do, do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây truyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc II kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do nhƣ Cu, Fe; vô hoạt hóa đơn) (Singh và Rajini, 2004 [87]). Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể ngƣời đƣợc cung cấp bởi hai nguồn: Bên trong và bên ngoài. Các chất chống oxy hóa bên trong bao gồm protein (ferritine, transferrine, albumine, protein sốc nhiệt) và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathione peroxydase, catalase). Các chất chống oxy hóa bên ngoài là các cấu tử nhỏ đƣợc đƣa vào cơ thể qua con đƣờng thức ăn bao gồm vitamine E, vitamine C, các carotenoid và các hợp chất phenoic (Niki và cộng sự, 1995 [76]). Các chất này có nhiều trong rau quả là con đƣờng đơn giản và hữu hiệu nhất để tăng cƣờng hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa. 1.2.5. Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa 1.2.5.1 Các chất chống oxy hóa bậc 1: Vô hoạt các gốc tự do Khử các gốc tự do: L* + AH LOO* + LH + A* AH LO* +AH LOOH + A* LOH + A* Tạo hợp chất với các gốc tự do: A* + LOO* A* + LO* LOOA LOA 1.2.5.2. Các chất chống oxy hóa bậc 2: Ngăn chặn sự tạo các gốc tự do Superoxid dismutase 15 Superoxid dismutase (SOD) là enzyme chống oxy hóa có chứa kim loại thuộc loại oxidoreductase, nó xúc tác cho phản ứng chuyển hóa superoxid O2 và H2O2: 2 O2 +  2H+  SOD H2 O2 + O 2 SOD có hoạt tính càng cao thì O2 có hoạt tính càng nhỏ, SOD là một chất chống oxy hóa rất cơ bản, làm hạ thấp nồng độ tiền chất O2 , mà từ đó sẽ sản sinh ra tất cả các dạng oxy hoạt động khác. Cơ chế phản ứng SOD: SOD là metalloenzym chống hóa hữu hiệu trong tế bào, xúc tác phản ứng dị ly oxy hóa khử, phân hủy gốc superoxid. Quá trình trao đổi điện tử thực chất xảy ra tại trung tâm hoạt động ion kim loại xảy (Me) theo cơ chế phản ứng oxy hóa khử gồm 2 bƣớc: Me3+ + O2 Me2+ + O2 + 2H+ Me2+ + O2 Me3+ + H2O2 Đầu tiên Me3+ bị khử bằng cách nhận một điện tử của gốc O2 và trở thành dạng oxy hóa Me2+, còn O2 chuyển thành O2. Khi đó Me2+ tiếp tục tƣơng tác với một gốc O2 và nhƣờng điện tử cho nó, với sự có mặt của H+ chúng kết hợp với nhau để tạo thành H2O2. Qúa trình này tiếp tục lặp đi, lặp lại tạo nên một chu trình phản ứng khép kín. Chu trình bán hủy của SOD từ vài phút đến vài giờ, nó phụ thuộc vào nhóm SOD khác nhau. SOD không qua đƣợc màng tế bào nên chỉ có tác dụng cải thiện khả năng chống oxy hóa nội bào [16], [32]. Catalase (CAT) Catalase là enzym xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 và chỉ hoạt động khi H2O2 ở nồng độ cao (lớn hơn 10-8 mmol/L), catalase không phân hủy đƣợc peroxide hữu cơ và H2O2 ở nồng độ thấp vì chúng chỉ đƣợc hoạt hóa khi H2O2 ở nồng độ cao. Catalase H2O2  H2 O + ½ O 2 Catalase có mặt trong hầu hết các tế bào và các mô động vật nhƣng hoạt tính mạnh nhất là ở gan và thận, ít nhất là ở mô, catalase có chủ yếu trong các ty thể và peroxisome [12], [39], [88], [138]. 16 Peroxidase Peroxidase là một nhóm enzym xúc tác các phản ứng oxy hóa khử, thuộc lớp oxidoreductase, xúc tác cho phản ứng sau. peroxidase AH2 + H2O2  A + 2H2O Những gốc O2 đƣợc sinh ra từ O2 trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SOD phân hủy, nhƣng lại tạo ra nhiểu H2O2. Vì vậy việc loại bỏ H2O2 là rất cần thiết, đảm bảo hoạt động nội bào diễn ra bình thƣờng. Peroxidase sử dụng H2O2 nhƣ là một chất nhận điện tử xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hóa khử khác nhau, khi đó H2O2 bị khử thành H2O. Hầu hết các peroxidase có dùng cơ chế xúc tác phản ứng phân giải H 2O2 và đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Tạo thành phức I hoạt động: Enzym + H2O2 Complex I - Chuyển hóa phức hợp I thành phức hợp II hoạt động: Complex II + •AH Complex I + AH2 - Tái tạo enzym bằng quá trình khử phức hợp II: Complex II + AH2 Enzym + •AH + 2 H2O - Tạo thành sản phẩm: • AH + •AH Sản phẩm oxy hóa Không còn gốc tự do (dập tắt phản ứng dây chuyền) Peroxidase có coenzym là nhóm hêm b. Heme b là phức hợp tạo bởi phân tử protoporphyrin IX và một ion Fe2+ hoặc Fe3+ ở trung tâm. Một số peroxidae còn mang gốc amino acid chứa vòng thơm nằm song song với mặt phẳng imidazol và chúng tƣơng tác với nhau bằng lực Vander Waals [3], [33]. Glutathione peroxidae (GPx) GPx là eym xúc tác cho phản ứng loại bỏ các peroxid, hoạt động ở các mô và hồng cầu khi nồng độ H2O2 thấp. GPx ROOH + 2GSH GSSG + ROH + H2O 17 Enzym này chủ yếu tồn tại bên trong ty thể và bào tƣơng của tế bào, ở dịch ngoại bào rất thấp. GPx có hai loại: không phụ thuộc selen chiếm 20% xúc tác sự khử các hydroperoxid hữu cơ khi có mặt glutathion nhƣng không có tác dụng trên H2O2; GPx phụ thuộc selen chiếm 80% xúc tác loại bỏ H2O2. Glutathione có bản chất là một tripeptide (L- γ-glutamyl cysteince), chính nhờ sự liên kết γ-peptide giữa glutamic acid và cysteine đó mà glutathione đƣợc bảo vệ, tránh khởi sự phân hủy bởi amino peptidase. Glutathione tồn tại ở 2 dạng; dạng khử (thiol GSH) và oxy hóa (disulfide GS-SG). Cơ chế phản ứng của glutathione tham gia vào quá trình phân giải hợp chất peroxide nhƣ sau: Hệ thống glutathion peroxidase gồm: glutathion peroxidase, glutathion reductase, glucose-6-phosphat dehidrogenase. Hoạt độ của GPx và catalase phụ thuộc vào nồng độ H2O2, khi nồng độ H2O2 cao ức chế GPx và hoạt hóa catalase hoạt động và ngƣợc lại khi nồng độ H 2O2 thấp chỉ có GPx hoạt động và catalase bị ức chế, điều này rất quan trọng vì nó tiết kiệm glutathion dạng khử cho cơ thể [3], [83]. 1.2.5.3. Tạo phức với kim loại Ion sắt và đồng xúc tác phản ứng Fenton, tạo nên hai dạng oxy hoạt động rất độc hại cho cơ thể là gốc hydroxyl (•OH) và oxy đơn bội. Ion sắt nếu tạo đƣợc phức qua đủ 6 liên kết phối trí thì không có khả năng xúc tác phản ứng trên nữa. Một số chất tạo phức chelat với sắt có đủ 6 liên kết phối trí nhƣ: + Transferrin: là dạng protein vận chuyển sắt của huyết tƣơng, ở ngƣời khỏe mạnh chỉ cần huy động 20 - 30% lƣợng transferrin là đủ làm mất hoạt tính xúc tác của sắt. Trong một số trƣờng hợp quá tải sắt (hồng cầu vỡ nhiều trong huyết tán, 18 uống thuốc chứa sắt quá nhiều, tổn thƣơng cơ...), huyết tƣơng không đủ transferrin và phản ứng Fenton xảy ra rất mạnh. + Lactoferin: có nhiều trong dịch sữa, dịch nƣớc mắt, nƣớc mũi, nƣớc bọt. Lactoferin làm mất hoạt tính xúc tác của sắt trong các dịch trên. + Ceruloplasmin: là một protein chứa đồng, có khả năng tạo phức với đồng và làm mất hoạt tính xúc tác phản ứng Fenton của đồng, nó cũng oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, ngăn cản sự tạo thành các gốc oxy hoạt động từ phản ứng Fenton [32], [58]. - Nhóm các thiol Có cấu trúc RSH (R: gốc hydrocarbon), có tính khử mạnh. Nhóm các thiol cùng với vitamin C chuyển vitamin E từ dạng oxy hóa sang dạng khử, hồi phục chức năng, dập tắt mạch peroxy hóa lipid của vitamin E [2], [12]. Các thiol có khả năng trung hòa gốc tự do nhƣ •OH tạo ra gốc thyil R-SH + HO• RS• + H2 O Các gốc thyil (RS•) có thể kết hợp với nhau để tạo thành phức hợp chất disulfur (RS-SR) hoặc trung hòa một gốc oxy hóa khác: RS• + O2 RSO2• Các thiol gồm glutathion, mercaptopropionylglycin và acetylcystein. - Selen Selen là một thành phần của nhiều enzym, tạo ra các nhóm chức -S-Se, -S-SeS là những tâm hoạt động sinh học mạnh. Selen là một thành phần trong GPx, có tác dụng loại bỏ gốc tự do, đặc biệt là phá hủy H2O2, dập tắt các gốc L•, LOO• của acid béo, bảo vệ màng tế bào và ADN. GPx chứa selen tập trung nhiều ở gan để phân giải các chất độc [2], [16], [84]. 1.2.6. Một số chất chống oxy hóa 1.2.6.1. Acid ascorbic (Vitamin C) Vitamin C hay Acid ascorbic là chất có khả năng vô hoạt các gốc tự do rất tốt do nó có thể chuyển cho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của nó và khi đó nó trở thành dehydroasorbic (Pincemail & công sự, 1998 [78]). 19 Ngoài khả năng vô hoạt trực tiếp các gốc tự do, vitamin C còn có khả năng hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác trong cơ thể nhƣ vitamine E, carotenoid và flavonoid. Khi có sự tiếp xúc giữa vitamine E và gốc tự do peroxide của acid béo, vitamine E chuyển điện tử của nó cho gốc tự do nhƣng đồng thời nó trở thành gốc tự do tocopheryl (vitamine E ở dạng oxy hóa). Vitamine C tiến hành khử gốc tocopheryl thành vitamine E nguyên dạng, sẵn sàng vô hoạt các gốc tự do peroxide mới. các carotenoid và các flavonoid khi vô hoạt các gốc tự do cũng đƣợc hoàn nguyên với cơ chế tƣơng tự bởi vitamine C. điều này góp phần hạn chế sự tự kích hoạt oxy hóa (pro-oxydante) của các gốc vitaine E và flavonoid (Burke và cộng sự, 2001 [37]; Jovanovic và Simic, 2000 [59]). Hình 1.3. Cấu trúc của Vitamin C Vitamin C có hoạt chất chống oxy hóa khi nó làm giảm oxy hóa chất nhƣ hydrogen peroxide. Ngoài ra, nó cũng làm giảm các ion kim loại tạo ra các gốc tự do thông qua các phản ứng Fenton. 2Fe3+ + ascorbate 2Fe2+ + 2H2O2 2Fe2+ 2OH• + + dehydroascorbate 2 OH ‾ Tocopherol (Vitamin E) Vitamin E tồn tại ở tám dạng trong tự nhiên: bốn dạng tocopherol và bốn dạng tocotrienol. Cả tám dạng này đều chứa một vòng thơm và một chuỗi mạch thẳng 16 20 carbon. Các hợp chất tocotrienol khác với các tocopherol là có thêm ba nối đôi ở chuỗi mạch C thẳng. Nhóm hydroxyl gắn với vòng thơm quyết định tính chống oxy hóa của vitamin E trong khi mạch C đảm bảo khả năng hòa tan trong chất béo của chúng (Huang và cộng sự, 2002 [56]). Tính chất hòa tan trong chất béo của vitamine E giúp chúng có khả năng thâm nhập sâu vào các màng sinh học vốn chứa nhiều acid béo không no và ngăn cản chuỗi phản ứng oxy hóa lipit. Các vitamine E sẽ chuyển hydro của nó cho gốc tự do peroxide. Gốc tocopheryl tạo thành đƣợc khử về trạng thái ban đầu nhờ vitamine C (Niki và cộng sự, 1995 [76]; Huang và cộng sự, 2002 [55]; Pincemail, 2006 [78]). Tocopherol – OH + LOOo Tocopherol- O + LOOH Với LOO: gốc tự do peroxide. Khả năng chống oxy hóa của vitamine E phụ thuộc vào mức độ cản trở không gian của các nhóm methyl ở vị trí ortho đối với nhóm hydroxyl ở vòng thơm. Nhóm hydroxyl càng bị cản trở ít (trƣờng hợp δ-tocopherol và δ-tocotrienol), khả năng chống oxy hóa càng cao (Huang và cộng sự, 2002[56]). Các thực phẩm nguồn gốc thực vật giàu vitamin E nhƣ: đậu xanh (4-6mg%), xà lách (3mg%), lạc, lúa mì, ngô hạt, cà rốt… Đặc biệt vitamin E có rất nhiều ở mầm của các loại hạt: giá đỗ xanh, giá đỗ tƣơng, mầm hạt ngô (15-25mg%), mầm lúa mỳ (25mg%)… Vitamin E cũng có trong một số thực phẩm nguồn gốc động vật nhƣ: trứng gà, thịt bò, cá mè… Hình 1.4. Cấu trúc của vitamine E (α-tocopherol) 21 1.2.6.2. Carotenoid Carotenoid là các hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh vật có khả năng quang hợp. tùy thuộc vào sự có mặt hay không của nhóm hydroxyl ở cấu trúc vòng mà các carotenoid đƣợc chia thành carotene và xanthophylle. Đối với con ngƣời, các carotenoid là các chất chống oxy hóa quan trọng vì nó có mặt trong nhiều loại thực phẩm đồng thời nó có khả năng hoạt động trong môi trƣờng chất béo là nới rất dễ xảy ra sự oxy hóa và gây hậu quả nghiêm trọng (màng tế bào). Cơ chế hoạt động chống oxy hóa của các carotenoid bao gồm (Sergio và Robert, 1999 [85]; Mortensen và cộng sự, 2001 [73]; Stahl và Sies, 2003 [90]) Vô hoạt hóa đơn  Vô hoạt hóa các gốc tự do Oxi đơn (1O2) là sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa sinh học và là một cấu tử có mặt trong không khí (Jovanovic và Simic, 2000 [58]; Corol và cộng sự,2002 [46]). Dƣới tác dụng của tia cực tím A (UVA, λ = 320 – 400nm), các phân tử ribofavine, flavinmononucleotid (FMN) và flavin adenine dinucleotid (FAD) hấp thụ năng lƣợng và lên trạng thái kích thích. Các chất này chuyển năng lƣợng cho oxy phân tử để trở lại trạng thái bình thƣờng. Oxy khi nhận năng lƣợng của các chất này trở thành oxy đơn (Krinsky, 1998 [62]). Để chuyển một phân tử oxy bình thƣờng thành oxy đơn cần một năng lƣợng 22 kcal. Phân tử oxy đơn không ở dạng nghịch từ nhƣ bình thƣờng mà ở dạng nghịch từ. Chính do vậy chúng rất dễ dàng phản ứng với AND, lipid, các phân tử không no của màng tế bào và gây bệnh (Corol và cộng sự, 2002 [46]). Trong số tất cả các chất chống oxy hóa tự nhiên, các carotenoid có khả năng vô hoạt oxy đơn mạnh nhất (Krinsky, 1998 [62]) bởi một cơ chế vật lý. Năng lƣợng dƣ của oxy đơn đƣợc chuyển cho carotenoid, oxy trở về trạng thái bình thƣờng của nó khi carotenoid đƣợc chuyển lên trạng thái kích thích. Các carotenoid này sau đó quay trở lại trạng thái bình thƣờng của nó bằng cách phát ra môi trƣờng năng lƣợng dƣ thừa mà nó nhận đƣợc từ oxy đơn. Khả năng vô hoạt oxy đơn của carotenoid phụ thuộc vào số liên kết đôi có trong mạch C của nó. Mỗi phân tử carotenoid có 22 khả năng vô hoạt 1.000 phân tử oxi đơn trƣớc khi tham gia vào các phản ứng hóa học và bị biến đổi thành các hợp chất khác (Krinsky, 1998 [62]). 1 3 O2 + 3 Car O2 + Car Car Car + nhiệt Ngoài khả năng vô hoạt oxy đơn, các carotenoid còn vô hoạt các gốc tự do bằng cách kết hợp với các gốc này theo một trong các cơ chế sau (Britton, 1995 [35]; Mortensen và cộng sự, 2001 [73]): 1- Chuyển điện tử : Car + ROO Car+ 2- Chuyển hydro : Car + ROO Car 3- Cộng hợp : Car + ROO + ROO+ ROOH ROOCar Trong cơ thể, các carotenoid hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác. Các gốc tocopheryl đƣợc khử thành dạng hoạt động tocopherol nhờ nhận đƣợc hydro từ vitamine C với chất vận chuyển trung gian là carotenoid [76]; [90]. Khác với polyphenol và vitamine C không đƣợc tích lũy trong cơ thể mà bị thải ra ngoài qua con đƣờng nƣớc tiểu, các carotenoid với đặc điểm hòa tan trong chất béo đƣợc tích lũy trong cơ thể, xâm nhập dễ dàng vào các vị trí dễ bị oxy hóa của chúng cao hơn các chất oxy hóa hòa tan trong nƣớc [55]. Hình 1.5. Một số hợp chất carotenoid 23 1.2.6.3. Polyphenol Polyphenol là hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng Benzen, trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm Hydroxyl. Dựa vào đặc trƣng cấu tạo hóa học, ngƣời ta chia các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính:[12]  Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid Galic.  Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid Cafeic.  Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6: Catechin, Flavonoid. Các polyphenol có chứa gốc Pyrocatechic hoặc Pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng cộng và ngƣng tụ. Polyphenol đƣợc chú ý đến bởi khả năng oxy hóa của chúng. Chúng có khả năng chuyển electron trong chuỗi hô hấp bình thƣờng định cƣ trong ti thể. Chúng có đƣợc khả năng đó là do chúng có khả năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do đó làm mất hoạt tính xúc tác của chúng, đồng thời chúng có khả năng nhận các gốc tự do tức là có khả năng dập tắt các quà trình tạo ra gốc tự do. Ngoài ra polyphenol còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm. nhiều polyphenol có hoạt tính vitamine P, nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và chuẩn hóa tính thẩm thấu của vi ti huyết quản. Hiện nay kể cả trong nƣớc và ngoài nƣớc nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol có khả năng chống oxy hóa của chúng nhƣ: - Nghiên cứu của Anesini và cộng sự (2003) [26] nghiên cứu hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của trà (Camellia sinensis). - Nghiên cứu của Chakraborty và cộng sự (2013) [39] xác định hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa từ rong nâu - Nghiên cứu của Trƣơng Thị Thƣơng (2011) [23] xác định động thái biến đổi hợp chất polyohenol và khả năng chống oxy hóa của quả sim thu hái tại Hải dƣơng - Nghiên cứu của Đàm Kim Nhung và cộng sự (1995) [18] nghiên cứu các chất polyphenol ở một số cay họ cúc (Asteraceae). 24 1.2.6.4. Một số thực vật có tác dụng chống oxy hóa [1] - Cây chè: Trong trà xanh chứa nhiều EGCG (Epigallocatechin-3-gallate) là một trong bốn loại polyphenol bao gồm epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin–3-gallate (ECG), và EGCG (Epigallocatechin-3-gallate). Trƣớc kia, các nhà nghiên cứu không đánh giá cao EGCG, thậm chí còn cho rằng nó làm giảm vị ngon của trà. Sau này, với sự nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản về vai trò của trà xanh với sức khỏe, ngƣời ta mới khẳng định công dụng của hoạt chất này. Ngày nay, EGCG đƣợc coi là một chất chống oxy hóa cực hữu hiệu, gấp 100 lần so với vitamine C và 25 lần so với vitamine E. ngoài ra EGCG còn ngăn ngừa bệnh ung thƣ. Ngăn ngừa nguy cơ tiểu đƣờng theo nghiên cứu mới nhất của tiến sĩ Zhuo Fu (2010), EGCG hạ thấp lƣợng đƣờng trong máu ở những con chuột ăn thức ăn có bổ sung EGCG. Hơn nữa, nó còn chống lại sự phá hủy tế bào –một loại tế bào đặc biệt làm nhiệm vụ sản xuất insulin. - Gấc: trong quả gấc chứa nhiều lycopen. Theo tỷ lệ khối lƣợng nó chứa nhiều lycopen gấp 70 lần cà chua. Ngƣời ta cũng phát hiện thấy nó chứa beta-caroten nhiều gấp 10 lần cà rốt hoặc khoai lang. Ngoài ra, các carotenoit có mặt trong gấc liên kết với các acid béo mạch dài, tạo ra kết quả là nó có tính hoạt tính sinh học cao hơn. Một nghiên cứu gần đây cho thấy gấc chứa các loại protein có thể ngăn cản sự phát triển của các tế bào ung thƣ. Beta-carotene là một loại chất có khả năng chống oxy hóa rất cao. Nó có tác dụng chống lại sự lão hóa và các bệnh lý ở phổi, tim, mạch máu, thần kinh… do tiến trình oxy hóa gây ra. - Nho: nho xanh (hay trắng) cũng đều có chứa chất chống oxy hóa. Một nghiên cứu mới đây khi nhìn vào tổng khả năng chống oxy hóa (theo nhƣ cách đo của ORAC) đã tìm thấy mức độ đáng kể của nho xanh và nho; khả năng chống oxy hóa của nho đỏ là 2016 trong khi của nho xanh là 1789. Nho chứa một hợp chất polyphenol phong phú bao gồm các Flanvoratrol dƣợc biết đến nhƣ là chất chống oxy hóa và có đặc tính chống viêm nhiễm. 25 - A-ti-sô: Cung cấp một lƣợng đáng kể chất chống oxy hóa. Trong đó silymarin là chất chống oxy hóa chính, có khả năng chống bệnh ung thƣ da và giảm cholesterol. 1.3. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa của các dịch trích từ thực vật[70] 1.3.1. Phƣơng pháp xác định trực tiếp hoạt tính chống oxy hóa. 1.3.1.1. Phƣơng pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): Xác định hoạt tính chống oxy hóa so với khả năng chống oxy hóa của Trolox [99] Cation ABTS+[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. đây là một chất phát quang màu xanh, đƣợc đặc trƣng ở độ hấp thụ 372nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng 734nm để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong môi trƣờng kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền hai ngày ở nhiệt độ phòng trong tối. 1.3.1.2. Phƣơng pháp DPPH(Scavenging ability towards radicals): Khả năng khử gốc tự do DPPH [80]. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, do màu tía và có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picryldrazine (DPPH-H), khi bị khử màu sắc của dung dịch mất dần từ màu tím sang màu vàng [39], [88] do độ giảm độ hấp thụ bằng máy quang phổ (Huang và cộng sự, 2005) ở bƣớc sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa [28]. 26 Hình 1.6. Phản ứng giữa DPPH và một số chất chống oxy hóa Khả năng khử gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trong vitro thƣờng sử dụng nhất trong nghiên cứu, có đến 90% các nghiên cứu về chất chống oxy hóa sử dụng phép phân tích này (JoonKwan và Takeyuki, 2009) [10]. 1.3.1.3. Phƣơng pháp ORAC(oxygen radical absorbance capacity): xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động[70],[99] phƣơng pháp này có mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của peroxy. Phản ứng trong điều kiện này đƣợc so sánh với phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamine E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt tính. Khi fluorescein bị oxy hóa, cƣờng độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo cƣờng độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi them chất oxy hóa vào. Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân giả fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đƣờng cong biễu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dƣới đƣờng cong dùng để tính toán. Kêt quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu. Ƣu điểm của phƣơng pháp ORAC là xác định đƣợc có hoặc không có sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxy hóa. Đây là một điều rất thuận lợi khi đo các thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxy hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều. 27 Hình 1.7. Đồ thị miêu tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian 1.3.1.4. Phƣơng pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): khả năng chống oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do [70]. Phƣơng pháp TRAP sử dụng các gốc tự do đƣợc tạo thành từ 2,2-azobuis(2amidinopropane) dihydrochlorinde) (AAPH). Khi AAPH vào môi trƣờng plasma, các chất khử sẽ bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa này đƣợc đo đạt thông qua hàm lƣợng oxy tiêu thụ bằng một điện cực. khi có mặt chất chống oxy hóa trong môi trƣờng plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm đƣợc tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dai pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol trolox/kg mẫu lỏng. 1.3.1.5. Phƣơng pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): Lực chống oxy hóa bằng phƣơng pháp khử sắt [70], [99] FRAP đƣợc đánh giá bằng phƣơbg pháp quang phổ theo Benzie và Strain (1993). Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phƣơng pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử phức Fe3+ -TPTZ [2,4,6tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+ -TPTZ (màu xanh) ở pH thấp. Khi đó, độ tăng cƣờng độ màu xanh tỷ lệ với hàm lƣợng chất chống oxy hóa 28 có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cƣờng độ màu này đƣợc đo ở bƣớc sóng 593nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butyllated Hydroxy Toluene). Khi cho phức Fe3+ -TPTZ vào môi trƣờng chứa chất chống oxy hóa, các chất chống oxy hóa sẽ nhƣờng điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+ -TPTZ cùng lúc. Đây là một hạn chế của phƣơng pháp FRAP. 1.3.2. Phƣơng pháp xác định gián tiếp hoạt tính chống oxy hóa 1.3.2.1. Phƣơng pháp cân khối lƣợng Trong giai đoạn đầu tiên của quá trình oxy hóa, khối lƣợng dầu tăng liên tục do phản ứng giữa các acid béo và oxy để hình thành nên hydroperoxide. Vì vậy, có thể đánh giá sự oxy hóa dầu bằng cách cân khối lƣợng của nó.[99] 1.3.2.2. Chỉ số peroxide (PV) Chỉ số peroxide vẫn là một phƣơng pháp đo trực tiếp sự phân hủy dầu do oxy hóa. Mặc dù các hydroperoxide bị phân hủy thành một hỗn hợp các sản phẩm bay hơi và chúng có thể phản ứng với nhau để hình thành nên các endoperoxide, chỉ số PV vẫn là một phƣơng pháp rất hữu ích. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cần kết hợp với các phƣơng pháp khác để cung cấp nhiều thông tin hơn cho tiến trình oxy hóa dầu. Phƣơng pháp truyền thống để xác định chỉ số peroxide là phƣơng pháp chuẩn độ. Khi có mặt KI, hydroperoxide sẽ oxy hóa iodide thành iod tự do. Định phân iod tạo thành bằng thiosulphate để xác định hàm lƣợng hydroperroxide [99]. 1.3.2.3. Chỉ số para-anisidine Para-anisidine sẽ phản ứng với aldehyde để tạo thành một sản phẩm có cự đại hấp thụ ở bƣớc sóng 350nm. Chỉ số p-anisidine đƣợc định nghĩa là một độ hấp thu của dung dịch từ phản ứng của 1g chất béo trong 100ml isooctane với panisidine(0,25% trong acid acetic băng). Sản phẩm hình thành bởi phản ứng giữa panisidine và andehyde không bão hòa (2-ankenal) hấp thụ mạnh tại bƣớc sóng này nên phản ánh đƣợc sự oxy hóa. Mặc dù phƣơng pháp này không phân biệt các sản phẩm bay hơi hay không bay hơi nhƣng phản ứng giữa andehyde bay hơi không bão 29 hòa xảy ra nhiều hơn so với andehyde bay hơi bão hòa. Vì vậy, chỉ số p-anisidine đƣợc dùng để đánh giá sự hình thành các sản phẩm bậc 2 [99]. 1.3.2.4. Chỉ số acid thiobarbituric (TBA) Manlonaldehyde có thể hình thành từ các acid béo tự do có ít nhất 3 liên kết đôi. Nồng độ của malonadehyde có thể đƣợc tính toán thông qua phản ứng của nó với acid thiobarbituric. Phản ứng giữa hai chất này cho ra một sản phẩm màu đỏ, có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 532-535nm. Tuy nhiên, phản ứng này không đặc hiệu. Thiobarbituric có thể phản ứng với các thành phần khác nhƣ 2,4 Alkadienal (2,4decadienal), protein sản phẩm Maillard [99]. 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá rình chiết 1.4.1. Lựa chon dung môi trích ly Dung môi trích ly là dung môi hòa tan đƣợc các chất cần trích ly. Các polyphenol là các hợp chất phân cực nên chủ yếu sử dụng các dung môi phân cực nhƣ: Nƣớc, Ethanol, Acetone, Ethyl acetate… Chủ yếu ngƣời ta dùng Ethanol.[1], [22]. 1.4.2. Diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi Cần tăng diện tích này để làm tăng hiệu quả quá trình chiết. đối với nguyên liệu rắn để làm tăng diện tích này thì có thể nghiền hoặc băm nhỏ nguyên liệu. Mặt khác, nghiền hoặc băm có tác dụng làm vỡ tế bào làm thúc đẩy quá trình tiếp xúc triệt để giữa nguyên liệu và dung môi. Tuy nhiên, kích thƣớc và hình dạng của nguyên liệu làm nhỏ cũng có giới hạn. Vì nếu chúng quá mịn sẽ bị lắng đọng lên lớp nguyên liệu, tắc các ống mao dẫn hoặc bị dòng dung dịch có nhiều cặn và làm phức tạp cho quá trình xử lý tiếp theo [1]. 1.4.3. Độ ẩm của nguyên liệu Độ ẩm của nguyên liệu giảm thì tốc độ trích ly tăng, vì độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nƣớc khác, ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu sẽ làm chậm quá trình khuếch tán [1]. 30 1.4.4. Nhiệt độ trích ly Theo công thức tính hệ số khếch tán của Eintein, nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lƣợng chất khuếch tán cũng tăng lên. Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trƣờng hợp sau: + Đối với hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: Nhiệt độ cao sẽ gây phá hủy một số hoạt chất nhƣ Vitamine, glycoside, alkaloid… + Đối với tạp: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp. Nhất là đối với một số tạp nhƣ gôm, chất nhầy… khi nhiệt độ tăng sẽ bị trƣơng nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch sẽ tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế. + Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ tấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi sễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và có bộ phận hồi lƣu dung môi. Từ những phân tích trên tùy từng trƣờng hợp cụ thể mà chọn lựa nhiệt độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố nhƣ nguyên liệu chiết, dung môi, phƣơng pháp chiết…) [22] 1.4.5. Thời gian trích ly Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lƣợng phân tử nhỏ thƣờng là hoạt chất sẽ đƣợc hòa tan và khuếch tán vào dung môi trƣớc, sau đó mới đến các chất có phân tử lƣợng lớn (thƣờng là tạp chất nhƣ nhựa, keo…). Do đó nếu thời gian chiết ngăn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dƣợc liệu; nếu thời gian chiết áu dài thì dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết, thành phần dƣợc liệu dung môi, phƣơng pháp chiết… phù hợp [22]. 1.4.6. Phƣơng pháp trích ly Thông thƣờng khuấy trộn hay dung các tác nhân vật lý nhƣ song siêu âm, điện từ sẽ tăng cƣờng quá trình hòa tan của các hợp chất, tăng khả năng khuếch tán, quá trình trích ly hiệu quả cao hơn. 31 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu lá giang Lá giang đƣợc thu hái tại các vùng quê, đồi núi xung quanh khu vực thành phố Nha Trang (Diên Khánh, Khánh Vĩnh...). Nguyên liệu lá giang dạng tƣơi (10 kg) đƣợc làm sạch bằng tay, sau đó phơi khô dƣới ánh nắng mặt trời. Sau đó đƣợc xay thành bột, chia thành các phần nhỏ, rồi đem bảo quản trong các túi PA trong điều kiện hút chân không, ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng (Hình 2.1). Cây lá giang tƣơi Làm sạch Phơi khô, tách lá Xay nhỏ Bao gói, bảo quản Hình 2.1. Quy trình xử lý và bảo quản nguyên liệu lá giang 2.1.2. Hóa chất và thuốc thử Acid tricloaxetic (TCA), acid gallic và ethanol đƣợc sản xuất tại Trung Quốc; 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), thuốc thử Folin–Ciocalteu, 32 Potassium ferricyanide (K3(Fe[CN]6), Ferric chloride (FeCl3), Sodium carbonate (Na2CO3) đƣợc mua từ công ty Sigma Ardrich (Hoa Kỳ); acid galic mua từ công ty Wako (Nhật Bản). Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt hạng phân tích. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm ẩm (phụ lục 1) 2.2.2. Quy trình tổng quát thu dịch chiết từ lá giang Nguyên liệu lá giang tƣơi Làm sạch Phơi khô tự nhiên Tách lá và thân Xay bột Bảo quản Chiết Bảo quản lạnh 4oC Nhiệt độ phòng Đánh giá: -Polyphenol -Năng lực khử -Khả năng chống oxy hóa Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Điều kiện chiết: -Dung môi: 0; 25; 50; 75; 100% ethanol -Thời gian: 10; 30; 50; 70; 90; 120 phút -Nhiệt độ: 40; 50; 60; 70; 80oC -Phƣơng pháp chiết: chiết tĩnh và chiết siêu âm 33 Quy trình tổng quát thu dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở Hình 2.2. Lá giang khô nguyên liệu đƣợc chiết trong các điều kiện (nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết) khác nhau. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Sau đó, hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết đƣợc xác định, để tìm ra điều kiện chiết thích hợp. 2.2.3. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang Bột lá giang khô (xay bột) Cố định các thông số: + Tỷ NL/DM(w/v): 1/100 + Thời gian chiết: 30 phút + Nhiệt độ chiết: 60oC Chiết Nồng độ ethanol 0% ethanol 25% ethanol 50% ethanol 75% ethanol 100% ethanol Lọc Dịch Chiết - Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Đánh giá khả năng chống oxy hóa: + Tổng năng lực khử + Khả năng khử gốc tự do DPPH Chọn nồng độ dung môi chiết thích hợp Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sự ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm 34 lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch lá giang Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở Hình 2.3. Cân chính xác 0.25 g nguyên liệu lá giang khô và cho vào bình nón thủy tinh dung lích 25ml. Lá giang khô nguyên liệu đƣợc chiết bằng dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau bao gồm 0; 25; 50; 75 và 100%. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) (w/v): 1/100, nhiệt độ chiết là 60C và thời gian chiết là 30 phút, đƣợc giữ cố định. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đem bổ sung thêm cùng loại dung môi chiết đến một thể tích chính xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH. 2.2.4. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang 35 Lá giang khô (xay bột) Cố định các thông số: Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 Nhiệt độ chiết 60oC Dung môi Ethanol 70 % Chiết Thay đổi thời gian chiết 10 phút 30 phút 60 phút 90phút 120phút Lọc Dịch Chiết - Xác định hàm lƣợng polyphenol - Phân tích hoạt tính chống oxy hóa:  Năng lực khử  Khả năng khử gốc tự do DPPH Chọn ra đƣợc thời gian chiết thích hợp Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang Cân chính xác khoảng 0.25g lá giang khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Lá giang nguyên liệu đƣợc chiết bằng 70% ethanol ở các thời gian chiết khác nhau là 10; 30; 50; 70; 90 và 120 phút, tại cùng nhiệt độ là 60oC, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) (w/v): 1/100 (Hình 2.5). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đƣợc đem bổ sung thêm dung môi chiết (Ethanol 50%) đến một thể tích chính 36 xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH. 2.2.5. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang đƣợc mô tả ở hình 2.4. Cân chính xác 0.25g lá giang nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích ml. Lá giang nguyên liệu đƣợc chiết bằng 50% ethanol ở các nhiệt độ khác nhau bao gồm 40; 50; 60; 70 và 80oC, trong cùng khoảng thời gian là 30 phút, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) (w/v): 1/100. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đƣợc đem bổ sung thêm dung môi chiết (Ethanol 50%) đến một thể tích chính xác (25ml) rồi tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH. 37 Lá giang nguyên liệu (xay bột) Cố định các thông số: + Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 + Thời gian chiết: 30 phút + Dung môi Ethanol 50% Chiết Thay đổi nhiệt độ chiết 40oC 50oC 60oC 70oC 80oC Lọc Dịch Chiết - Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Đánh giá khả năng chống oxy hóa: + Tổng năng lực khử + Khả năng khử gốc tự do DPPH Chọn nhiệt độ chiết thích hợp Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang 38 2.2.6. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết lá giang Lá giang khô (xay bột) Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60oC Chiết lần 1 Dịch chiết lần 1 Thời gian chiết: 90 phút Bã chiết lần 1 Tỷ lệ NL/DM (v/w): 1/100 Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60oC Chiết lần 2 Dịch chiết lần 2 Thời gian chiết: 90 phút Bã chiết lần 2 Tỷ lệ NL/DM (v/w): 1/100 Dung môi: 50% ethanol Nhiệt độ chiết: 60oC Chiết lần 3 Dịch chiết lần 3 Thời gian chiết: 90 phút Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của số lần chiết đến đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ lá giang Lá giang khô nguyên liệu (0.25g) đƣợc cho vào bình nón thủy tinh và tiến hành chiết ở điều kiện chiết thích hợp đã đƣợc xác định ở các bƣớc trên (nồng độ ethanol: 50%; nhiệt độ chiết: 60oC; thời gian chiết: 90 phút, NL/DM (w/v): 1/100. Kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 1). Phần bã thu đƣợc từ chiết lần 1 đƣợc tiếp tục chiết trong điều kiện nhƣ trên. Hỗn hợp chiết lần hai đƣợc lọc qua giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 2). Phần bã thu đƣợc từ lần chiết thứ hai tiếp tục thực hiện lần chiết thứ 3 với các điều kiện nhƣ trên. Sau bƣớc nay, ta thu đƣợc dịch chiết thứ 3 (Hình 2.6). Dịch chiết thu đƣợc từ lần chiết thƣ 1, 2 và 3 đƣợc đem đi tiến hành phân tích hoạt tính hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa. 39 2.2.7. Thí nghiệm ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang Lá giang khô (xay bột) Cố định các thông số: + Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 + Nhiệt độ chiết: 50oC + Dung môi: 60% ethanol + Thời gian: 90 phút Chiết bằng hai phƣơng pháp khác nhau Để ở chế độ thƣờng Đánh sóng siêu âm Lọc Dịch chiết - Xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số - Xác định hoạt tính chống oxy hóa: + Tổng Năng lực khử + Khả năng khử gốc tự do DPPH Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang 40 Chính xác 0.25 g nguyên liệu bột lá giang khô đƣợc cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Sau đó, cho 25 mL dung dịch 50% ethanol vào bình chứa mẫu và tiến hành chiết ở nhiệt độ 60oC, trong thời gian 90 phút, NL/DM (w/v): 1/100. bằng hai phƣơng pháp khác nhau (chiết tĩnh và dùng sóng siêu âm). Máy tạo sóng siêu âm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là máy Elma, S300H, Elmasonic, Germany. Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp chiết theo hai phƣơng pháp trên đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 (Hình 2.7). Dịch chiết thu đƣợc đem tiến hành phân tích hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa. 41 2.2.8. Thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản Lá giang khô (xay bột) Cố định các thông số: Tỷ lệ NL/DM (w/v): 1/100 Nhiệt độ chiết 60oC Dung môi Ethanol 50% Thời gian 60 phút Chiết Lọc Dịch Chiết Bảo quản dịch chiết trong các điều kiện khác nhau Nhiệt độ lạnh ở 4 C 0 ngày 1 ngày Nhiệt độ phòng 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày - Xác định hàm lƣợng polyphenol - Phân tích hoạt tính chống oxy hóa:  Tổng năng lực khử  Khả năng khử gốc tự do DPPH Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản Hình 2.8 mô tả thí nghiệm để xác định sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản. Cân chính xác 0.25g nguyên liệu lá giang khô và cho vào bình nón thủy tinh dung tích 25 ml. Sau đó, lá giang nguyên liệu đƣợc chiết với 50% ethanol trong thời gian 90 phút, ở nhiệt 42 độ 60oC, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) (w/v): 1/100. Hỗn hợp sau khi kết thúc quá trình chiết đƣợc lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu đƣợc sau khi lọc đƣợc đem đi bảo quản ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ lạnh (4 oC). Sau 1, 2, 3, 4, 5 và 6 ngày bảo quản, dịch chiết đƣợc đem đi xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa. 2.3. Các phƣơng pháp phân tích 2.3.1. Xác định hàm lƣợng polyphenol Hàm lƣợng polyphenol đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Singleton và cộng sự (1999) [88]. Chính xác 0,1 ml dịch chiết lá giang đƣợc cho vào ống nghiệm. Sau đó, 0,9 ml nƣớc cất và 1 ml dung dịch thuốc thử Folin–Ciocalteu đƣợc thêm vào. Hỗn hợp đƣợc lắc đều bằng máy Vortex và ủ trong thời gian 20 phút. Sau đó, cho 2,5 ml dung dịch Na2CO3 (7,5%) vào, lắc đều và hỗn hợp tiếp tục đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 30 phút. Bƣớc sóng của hỗn hợp sau thời gian ủ đƣợc đo ở 760 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50). Hàm lƣợng polyphenol tổng số đƣợc xác định bằng mg acid gallic tƣơng đƣơng trên 1g nguyên liệu khô (mg GAE/g nguyên liệu khô). Đƣờng chuẩn acid gallic đƣợc trình bày ở phụ lục 2. 2.3.2. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Fu và cộng sự (2002) [50] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Một lƣợng 0,5 ml dịch chiết đƣợc cho vào ống nghiệm. Sau đó, 1ml dung dịch DPPH (0,1 mM) và 2,5 ml nƣớc cất đƣợc thêm vào. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 30 phút. Bƣớc sóng của hỗn hợp sau khi ủ đƣợc đo ở 517 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50). Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang đƣợc xác định theo công thức sau: Khả năng khử gốc tự do DPPH = A 0 −A 1 A0 x 100 (1) Trong đó: A0 là độ hấp thụ quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết. A1 là độ hấp thụ quang học của mẫu chứa dịch chiết. 43 2.3.3. Tổng năng lực khử Tổng năng lực khử đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Oyaizu (1986) [77] với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết lá giang. Sau đó, 0,5 ml dung dịch K3[Fe(CN)6] (1%) và 0,5 ml đệm phosphat rồi đem lắc đều. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50oC trong thời gian 20 phút, sau đó thêm 0,5ml dung dịch TCA (10%) và 2 ml nƣớc cất. Cuối cùng, 0,4 ml dung dịch FeCl3 (0,1%) đƣợc cho vào và lắc đều, rồi đem đi đo ở bƣớc sóng 700 nm bằng máy quang phổ (Spectrophotometer, Carry 50). Độ hấp thụ ở 700 nm đƣợc dùng để đánh giá tổng năng lực khử của dịch chiết. 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các kết quả thí nghiệm đƣợc xác định từ trung bình cộng của hai lần thí nghiệm độc lập. Đồ thì đƣợc vẽ bằng phần mềm MS Excel 2007. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bản 16.0. Giá trị trung bình đƣợc phân tích ANOVA theo phép thử Ducan. Giá trị p < 0,05 chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê. 44 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. Dung môi chiết là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng tới quá trình chiết. Thí nghiệm này đã tiến hành xác định ảnh hƣởng của của nồng độ dung môi chiết (ethanol) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (Hình 3.1; 3.2 và 3.3). Hình 3.1 cho thấy nồng độ ethanol ảnh hƣởng mạnh đến hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết lá giang. Sipgno và cộng sự (2007) [89] chỉ ra rằng hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol của hỗn hợp dung môi nƣớc - ethanol cao hơn so với dung môi nƣớc và ethanol đơn lẻ. Kết quả nghiên cứu của đã cho thấy phù hợp với nhận định này. Ở nồng độ 0 và 100% ethanol thì dịch chiết cho hàm lƣợng polyphenol thấp hơn so với nồng độ 50 và 75% ethanol. Khi tăng nồng độ ethanol từ 0 đến 75% thì hàm lƣợng polyphenol tăng lên từ 50,2-80,2 mg GAE/g chất khô. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ ethanol từ 75 lên 100% thì hàm lƣợng polyphenol lại giảm xuống từ 80,2-47.9 mg GAE/g chất khô. Theo kết quả thu đƣợc, trong dải nồng độ nghiên cứu, 50% ethanol cho hiệu quả chiết polyphenol là cao nhất. Dung môi chiết là một thông số quan trọng trong quá trình chiết các hợp chất từ nguyên liệu thực vật và động vật. Từ kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng nồng độ dung môi chiết (ethanol) có ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang. Kết quả này tƣơng tự với nhiều nghiên cứu trƣớc đây trên đối tƣợng rong biển và các loài thực vật trên cạn. Chew và cộng sự (2011) [41] nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol (0-100%) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của rau má Centella asiatica. Kết quả cho thấy nồng độ ethanol có ảnh hƣởng đáng kể đến hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết thu đƣợc. Nồng độ ethanol ở 40% đƣợc xác định là nồng độ cho hàm lƣợng polyphenol tổng số là cao nhất. tƣơng tự thì Nghiên cứu của Baraniak và cộng sự (2002) [29] khi nghiên cứu trên súp lơ đã chọn nồng độ Ethanol là 80%, Emanul và cộng sự (2011) [49] nghiên 45 cứu trên đối tƣợng trà Atiso (Cynarae folium), đã lựa chon 75% Ethanol là nồng độ Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g NL khô) tối ƣu để chiết dịch. 120 100 c b b 80 60 a a 40 20 0 0 25 50 75 100 Nồng độ ethanol (%) Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Từ hình 3.2 nhận thấy tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang chịu ảnh hƣởng bởi nồng độ ethanol. Cụ thể, khi tăng nồng độ ethanol từ 0-100% tổng năng lực khử của dịch chiết đƣợc xác định bằng độ hấp thụ tại bƣớc sóng 700 nm, tăng từ 0.53 đến 1.06. Do đó trong dải nồng độ đã nghiên cứu thì ở 100% ethanol là nồng độ tối ƣu nhất. Kết quả này tƣơng tự với nghiên cứu của In Du.H, Seenivasan.R (2013) [57] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol (20; 60; 80 và 100%) tới tổng năng lực khử của dịch chiết rong biển thì kết quả cho thấy ở nồng độ 100% ethanol là mạnh nhât. Nhƣ vậy, nồng độ 100% ethanol là nồng độ dung môi cho tổng năng lực khử là cao nhất. Điều này đƣợc giải thích rằng: ngoài hợp chất polyphenol là những chất có khả năng chống oxy hóa thì trong lá giang còn tồn tại một loại chất mà sẽ đƣợc 46 trích ly tốt trong môi trƣờng 100% ethanol, loại chất này có khả năng cho năng lực khử tốt, do đó mà tại nồng độ dung dịch 50% ethanol cho hàm lƣợng polyphenol Độ hấp thụ đo ở bƣớc sóng 700 nm tổng số cao nhất, cong ở 100% ethanol lại cho năng lực khử cao nhất. 1.2 e 1 d 0.8 0.6 a b 0 25 c 0.4 0.2 0 50 75 100 Nồng độ ethanol (%) Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Từ hình 3.3 ta có thể thấy nồng độ ethanol cũng ảnh hƣởng tới khả năng khử gốc tự do DPPH theo xu hƣớng tƣơng tự nhƣ hàm lƣợng polyphenol tổng số. Cụ thể, trong khoảng nồng độ ethanol từ 0-50% thì khả năng khử gốc tự do tăng từ 62,98 đến 97,88%. Tại nồng độ ethanol 100% thì khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang chỉ là 96,05%. Kết quả nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) [41] cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết rau má tăng lên theo mức độ tăng của nồng độ ethanol từ 0-50%. Khi tiếp tục tăng nồng độ ethanol thì khả năng khử gốc tự do DPPH không tăng. Kết quả này tƣơng tự với kết quả nghiên cứu trong đề tài trên đối tƣợng lá giang. Tƣơng tự, nghiên cứu của Hisamoto và cộng sự (2011) [55] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol (30; 50; 70 và 100%) tới khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết quả nho, kết quả cho thấy chiết xuất ethanol 50 và 70% cho khả năng khử DPPH cao nhất và nghiên cứu 47 gần đây của Samuagam và cộng sự (2013) [82] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH của một số loại trái cây nhiệt đới, cho thấy 80% ethanol cho khả năng khử lớn nhất đối với chôm chôm (Nepheliumlappaceum), 60% ethanol đối với măng cụt (Garciniamangostana) và 80% ethanol đối với vỏ bòn bon (Lansiumdomesticum). 1.2 Khả năng khử gốc DPPH (%) 1 0.8 c c c 50 75 100 b a 0.6 0.4 0.2 0 0 25 Nồng độ ethanol (%) Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Nhƣ vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng nồng độ ethanol có ảnh hƣởng rất lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Điều này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: ethanol phá hủy nguyên sinh chất của tế lá, thấm sâu vào bên trong, làm tăng khả năng khuếch tán chất tan ra môi trƣờng bên ngoài. Nồng độ ethanol thấp sẽ làm giảm khả năng phá hủy tế bào lá giang, do đó diện tích tiếp xúc với dung môi sẽ nhỏ đi, khả năng chiết giảm. Ngoài ra, nồng độ càng thấp thì nƣớc trong dung môi càng nhiều. Nƣớc sẽ thấm vào tế bào làm nó trƣơng nở đồng thời làm chậm quá trình khuếch tán còn chất tan. Do đó lƣợng chất chiết thu đƣợc càng ít. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ lên quá cao sẽ làm các tạp chất cũng tan ra môi trƣờng trích ly do đó sẽ làm giảm hàm lƣợng polyphenol khả 48 năng chống oxy hóa [22], [41], [42]. Nhƣ vậy, để thu đƣợc dịch chiết từ lá giang có hàm lƣợng các chất polyphenol cao và khả năng chống oxy hóa mạnh, thì nồng độ ethanol ở 50% ethanol là dung môi chiết thích hợp. 3.2. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. Thời gian là một thông số ảnh hƣởng lớn đến quá trình chiết. Thông thƣờng hiệu quả chiết các hợp chất trong thực vật tăng lên cùng với thời gian chiết [41]. Trong thí nghiệm này đã tiến hành xác định ảnh hƣởng của của thời gian chiết (10, 30, 60, 90 và 120 phút) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.7, 3.8 và 3.9. Hình 3.7 cho thấy thời gian chiết ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết lá giang. Khi chiết trong khoảng thời gian từ 10-50 phút thì hàm lƣợng polyphenol tổng số tăng từ 61,31-93,63 mg GAE/g chất khô. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nhiệt độ từ 50-120 phút thì hàm lƣợng polyphenol tổng số tăng chậm 93,63-96,89 mg GAE/g chất khô. Theo nhƣ kết quả phân tích số liệu, 90 phút cho hiệu quả chiết polyphenol là ổn định và phù hợp. Kết quả này tƣơng tự với nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) [41]. Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian (60300 phút) chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của rau má C. asiatica, tác giả xác định đƣợc rằng thời gian có ảnh hƣởng đáng kể đến hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết thu đƣợc. 90 phút là khoảng thời gian cho hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol là tốt nhất kể cả về hầm lƣợng polyphenol tổng số và năng lƣợng nhiệt. Nhƣ vậy, thời gian có ảnh hƣởng lớn tới hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang. Điều này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: thời gian đầu các chất có phân tử nhỏ thƣờng là hoạt chất hòa tan và khuếch tán vào môi trƣờng chiết trƣớc, sau đó mới là hỗn hợp polyphenol (thƣờng là các hợp chất cao phân tử) [22]. Do đó, khi thời gian chiết quá ngắn thì chƣa đủ để chiết triệt để các hợp chất polyphenol. Lƣợng chất tan trong nguyên liệu vẫn còn nhiều. Khi thời gian chiết dài, sẽ tăng thời gian khuếch tán cơ chất ra khỏi lá giang, giúp ethanol thẩm thấu vào trong cơ tế 49 bào lá giang qua các mao quản, khi đó sự hòa tan và khuếch tán chất tan tăng lên [22]. Vì vậy dịch chiết thu đƣợc có hàm lƣợng polyphenol tổng số tăng lên nhanh trong khoảng từ 10 đến 50 phút. Tuy nhiên hàm lƣợng polyphenol trong lá giang có mức giới hạn nhất định, nên nếu tăng thời gian chiết thêm thì cũng không tách thêm đƣợc nhiều nữa. Với thời gian 90 phút, trong điều kiện nhiệt độ và dung môi chiết xác định, hầu hết các hợp chất polyphenol trong lá giang có thể đã đƣợc chiết ra môi trƣờng. Nếu tiếp tục tăng thời gian gian chiết, trong điều kiện nhiệt độ cao (60ᴼC), các hợp chất polyphenol (đặc biệt là các hợp chất không bền ở nhiệt độ cao) sẽ bị phân hủy. Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g NL khô) 120 100 b c c cd de 50 70 90 120 80 a 60 40 20 0 10 30 Thời gian chiết (phút) Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Hình 3.5 mô tả ảnh hƣởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang. Tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang tăng lên trong khoảng thời gian chiết từ 10 đến 120 phút. Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian chiết, năng lực khử giảm xuống. Nhƣ đã đề cập ở phần trên, polyphenol có thể là hợp chất chính đóng vai trò vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang, tuy nhiên, theo sự tăng lên về thời gian chiết, một lƣợng chất có tính khử trong lá giang đƣợc tách ra, do đó 50 tổng năng lực khử đƣợc tăng lên theo thời gian. Từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng ở dải thời gian đã khảo sát thì tại 90 phút cho tổng năng lực khử của dịch Độ hấp thụ đo ở bƣớc sóng 700 nm chiết thích hợp nhất 1.2 1 c 0.8 0.6 e f 90 120 d b a 0.4 0.2 0 10 30 50 70 Thời gian chiết (phút) Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Hình 3.6 mô tả thời gian chiết cũng ảnh hƣởng tới khả năng khử gốc tự do DPPH theo xu hƣớng tƣơng tự nhƣ hàm lƣợng polyphenol tổng số. Cụ thể, trong khoảng thời gian từ 10-90 phút thì khả năng khử gốc tự do DPPH tăng từ 47,3669,95%. Tuy nhiên, khi ta tăng thời gian từ 90 – 120 phút thì khả năng khử gốc tự do DPPH lại giảm từ 69,95-69,72%. Do đó gian 90 phút trong dải thời gian nghiên cứu là thời gian mà cho khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang là cao nhất. Kết quả này phù hợp với kết quả công bố của Samuagam và cộng sự (2013) [82] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian tới khả năng chống oxy hóa của dịch chiết quả măng cụt. Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) 51 0.80 0.70 c e e 90 phút 120 phút b 0.60 0.50 d a 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 10 phút 30 phút 50 phút 70 phút Thời gian (phút) Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến khả năng khử gốc tự do của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Nhƣ vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng nồng độ ethanol có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Điều này đƣợc giải thích nhƣ sau: trong quá trình trích ly, dung môi tác dụng trực tiếp thì còn có yếu tố thời gian. Trong khoảng 90 phút đầu, quá trình khuếch tán vật chất xảy ra nhanh dần và đạt giá trị cực đại tại 90 phút. Sau thời gian này, tốc độ khuếch tán vật chất sẽ tăng chậm hoặc không tăng nữa. Lúc này, nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly. Nếu thời gian kéo dài các chất chống oxi hóa trong dịch chiết phải chịu nhiệt độ càng lâu nên độ bền của nó sẽ giảm xuống. Các thành phần không bền nhiệt sẽ bắt đầu phân hủy sau khi quá trình khuếch tán vật chất đạt đến cân bằng. 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. Giống nhƣ dung môi, thời gian chiết thì nhiệt độ chiết cũng là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hƣởng tới quá trình chiết, kết quả nghiên cứu của Radojkovića và cộng sự (2012) [79] khi nhiên cứu trên lá dâu tằm cho thấy hàm lƣợng polyphenol tổng số chịu ảnh hƣởng đáng kể của nhiệt độ. Thí nghiệm này đã tiến 52 hành xác định ảnh hƣởng của của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa trong dải nhiệt độ từ 40-80ᵒC (Hình 3.7; 3.8 và 3.9). Hình 3.7 cho thấy nhiệt độ chiết ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết lá giang. Khi tăng nhiệt độ từ 40 đến 60ᵒC thì hàm lƣợng polyphenol tăng lên từ 72,66-94,43 mg GAE/g chất khô. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ từ 60 lên 80ᵒC thì hàm lƣợng polyphenol lại tăng rất ít từ 94,43-97,77 mg GAE/g chất khô. Nhƣ vậy, trong dải nhiệt độ nghiên cứu, ở nhiệt độ 60ᵒC cho hiệu quả chiết polyphenol là cao nhất. Một số tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng thu dịch chiết cho hàm lƣợng các hợp chất chống oxy hóa cao. Nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) [42] khi khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ (25-65ᵒC) trên đối tƣợng bạc hà (Orthosiphon) đã lựa chọn nhiệt độ tối ƣu là 65oC để chiết dịch chiết. Kết quả công bố của của Benmeziane và cộng sự (2014) [31] khi khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết tới hàm lƣợng polyphenol tổng số trên đối tƣợng nho tƣơi trong dải nhiệt độ (25; 40; 50; 60 và 70ᵒC), kết quả cho thấy nhiệt độ có ảnh hƣởng đáng kể tới hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết thu đƣợc và nhiệt độ 60ᵒC đƣợc chọn làm nhiệt độ tối ƣu để tách chiết polyphenol từ nho.Tƣơng tự, thì kết quả nghiên cứu của Spigno và cộng sự (2007) [89] khi nghiên cứu ở nhiệt độ 45 và 60ᵒC thì 60ᵒC cho hàm lƣợng polyphenol cao hơn. Từ kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng nhiệt độ chiết có ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang. Điều này có thể giải thích nhƣ sau:khi nhiệt độ tăng thuận lợi cho việc phá hủy màng tế bào thực vật và tăng tốc độ hòa tan của polyphenol [22], sự gia tăng nhiệt sẽ làm tăng hệ số khuếch tán và làm tăng hàm lƣợng polyphenol [52]. Đồng thời độ nhớt sẽ giảm, làm tăng tốc độ phản ứng giữa các thành phần hóa học trong lá giang với nhau, cũng nhƣ các thành phần đó với Ethanol tăng lên. Dẫn tới độ khuếch tán của các chất tan cũng nhƣ polyphenol từ trong tế bào thoát ra môi trƣờng chiết tăng, đồng thời sự thẩm thấu giữa dung môi và tế bào nguyên liệu cũng tăng. Do đó, hàm lƣợng polyphenol thu đƣợc nhiều. Khi tăng nhiệt độ sẽ làm tăng hiệu quả chiết vì nhiệt độ sẽ làm độ nhớt của dịch chiết giảm, làm tăng tốc độ phản ứng giữa các thành phần hóa học trong lá 53 giang với nhau, cũng nhƣ các thành phần đó với hỗn hợp dung môi chiết [31]. Tuy nhiên nhiệt độ là yếu tố giới hạn, vì nhiệt độ tăng cao có thể xảy ra các phản ứng không mong muốn, làm biến tính hay thay đổi một số thành phần chất tan cần thiết. Khi nâng nhiệt độ lên cao sẽ làm tăng tốc độ phản ứng đồng thời nhiệt độ cao có thể phân hủy các chất chống oxy hóa vốn đã đƣợc chiết ra ở nhiệt độ thấp (Liyana- Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g NL khô) Pathira và Shahidi, 2005 [68]). 120 100 c d e 60 70 80 b 80 a 60 40 20 0 40 50 Nhiệt độ (oC) Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Qua hình 3.8 cho thấy cũng giống nhƣ hàm lƣợng polyphenol tổng số thì tổng năng lực khử của dịch cũng chịu ảnh hƣởng bởi nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng từ 4060-78oC thì tổng năng lực khử cũng tăng lần lƣợt từ 0,78-0,98-1,01. Nhƣ vậy, với nhiệt độ 60oC cho hiệu quả tổng năng lực khử là tốt nhất 0,98. Từ 60 oC đến 80 oC tổng năng lực khử tăng không đáng kể. Độ hấp thụ đo ở bƣớc sóng 700 nm 54 1.2 1 0.8 c c c 60 70 80 b a 0.6 0.4 0.2 0 40 50 Nhiệt độ (oC) Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Hình 3.9 cho thấy nhiệt độ chiết cũng ảnh hƣởng tới khả năng khử gốc tự do DPPH theo xu hƣớng tƣơng tự nhƣ hàm lƣợng polyphenol tổng số. Cụ thể là: khi tăng nhiệt độ từ 40-70oC thì khả năng khử gốc tự do DPPH tăng từ 55,73-70,59%. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nhiệt độ từ 70 lên 80oC thì khả năng khử gốc tự do DPPH lại giảm xuống từ 70,59-69,78%. Nhƣ vậy, có thể thấy tại nhiệt độ 60oC thì khả năng khử gốc tự do DPPH là phù hợp nhất và đạt 69,45%. Nhiều nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh đƣợc rằng nhiệt độ có ảnh hƣởng đáng kể tới khả năng chiết các hợp chất chống oxy hóa từ thực vật. Kết quả nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) [42] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ (25-65ᵒC) tới khả năng chống oxy hóa trên đối tƣợng lá bạc hà (Orthosiphon) đã lựa chọn nhiệt độ tối ƣu là 65oC để chiết dịch chiết. Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) 55 80 70 60 a cd e ed 60 70 80 b 50 40 30 20 10 0 40 50 Nhiệt độ chiết (oC) Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p< 0,05) Nhƣ vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng nhiệt độ chiết có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Điều này đƣợc giải thích nhƣ sau: trong khoảng nhiệt độ 40-70oC thì tốc độ đối lƣu của dòng lƣu chất tăng làm tốc độ khuếch tán các phân tử từ lá giang vào dung môi tăng. Nhƣng khi tiếp tục tăng nhiệt độ đến 80oC thì mặc dù tốc độ dòng khuếch tán lƣu chất tăng nhƣng nhiệt độ cũng làm phân hủy các chất chống oxi hóa kém bền nhiệt vì thế trong khi tăng nhiệt độ từ 70 lên 80oC hoạt tính chống oxi hóa giảm xuống. bởi, nếu nhiệt độ thấp sẽ không đủ khả năng để trích ly hết các chất cần trích ly ra môi trƣờng nhƣ vậy khả năng chống oxi hóa sẽ kém và khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng và trao đổi chất tăng lên. Do đó những chất đang ở trạng thái năng lƣợng cao sẽ kích thích phản ứng hoặc chuyển sang trạng thái khác, dẫn đến cấu hình có thể thay đổi, mất đi hoạt tính nếu ban đầu có hoạt tính. Đối với việc sử dụng dung môi là Ethanol để tách chiết thì khi nhiệt độ tăng cao tới 80oC sẽ làm Ethanol bị bay hơi một phần (Ethanol có nhiệt độ sôi khoảng 78,4oC), do đó tỷ lệ Ethanol trong dung môi sẽ thấp hơn, kết quả là khả năng tách chiết các chất chống oxi hóa kém [22], [41], [42]. 56 3.4. Ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. Số lần chiết cũng là một trong những nhân tố có ảnh hƣởng tới quá trình chiết. Trong thí nghiệm này, ảnh hƣởng của số lần chiết (3 lần) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa đƣợc nghiên cứu (Hình 3.10 và 3.11). Qua kết quả hình 3.10 cho thấy số lần chiết có ảnh hƣởng tới hàm lƣợng polyphenol tổng số. Cụ thể, khi chiết lần 1 thì hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết là cao nhất ở mức 1,16 mg GAE/g lá giang khô (p  0,05). Ở lần chiết thứ hai 2, thì hàm lƣợng polyphenol giảm xuống đáng kể chỉ còn 0,41 mg GAE/g lá giang khô. Tiếp tục chiết đến lần 3 thì hàm lƣợng polyphenol thu đƣợc chỉ còn 0,114 g GAE/g lá giang khô. Kết quả nghiên cứu tƣơng tự với kết quả nghiên cứu trên rong S. Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g NL khô) mcclurei của Nguyễn Thị Thảo (2012) [22]. 120 100 c 80 60 b 40 20 a 0 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Số lần chiến Hình 3.4. Ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê (p < 0,05) Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của số lần chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang đƣợc thể hiện trên hình 3.11. Kết quả cho thấy khi 57 chiết lần 1 thì khả năng khử gốc tự do DPPH là 67,66 %, trong khi đó giá trị này ở Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) lần chiết thứ 2 và 3 lần lƣợt là 46,87 và 28,41%. 80 70 c 60 50 40 b 30 20 a 10 0 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Số lần chiết Hình 3.5. Ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm khả năng khử gốc tự do của dịch chiết từ lá giang (chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có nghĩa thống kê p < 0,05) 3.5. Ảnh hƣởng của sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. Ảnh hƣởng của của sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa đƣợc thể hiện ở hình 3.12; 3.13 và 3.14. Kết quả trên hình 3.12 cho thấy sóng siêu âm có ảnh hƣởng tới hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết lá giang. Khi chiết dịch chiết có sử dụng sóng siêu âm thì hàm lƣợng polyphenol chiết đƣợclà 102,94 mg GAE/g chất khô cao hơn khi chiết ở chế độ thƣờng ở mức 94,43 mg GAE/g chất khô (p  0,05). Đã có một số nghiên cứu sử dụng sóng siêu âm để tách chiết các hợp chất polyphenol từ thực vật cũng nhƣ rong biển. Seug-Hong và cộng sự (2013) [86] đã nghiên cứu ảnh hƣởng của sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của rong nâu Ecklonia cava. Kết quả cho thấy hàm lƣợng polyphenol tổng số của lá giang chiết trong điều kiện sử dụng siêu âm cao hơn so với điều kiện chiết thƣờng. Kết qủa này cũng 58 tƣơng tự với phát hiện của Lan và cộng sự (2013) [64] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số của trà xanh. Nhƣ vậy, sóng siêu âm giúp cho quá trình chiết giúp cho quá trình chiết nhanh hơn. Phƣơng pháp này có thể là một phƣơng pháp hữu hiệu để rút ngắn thời gian chiết các hợp chất có Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g NL khô) hoạt tính sinh học từ thực vật. 106 b 104 102 100 98 96 a 94 92 90 88 Thƣờng Siêu âm Phƣơng pháp chiết Hình 3.6. Ảnh hƣởng của sóng siêu âm tới hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang Từ hình 3.13 cho thấy tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang chịu ảnh hƣởng bởi sóng siêu âm. Phƣơng pháp chiết có sử dụng sóng siêu âm cho tổng năng lực khử của dịch chiết cao hơn so với phƣơng pháp chiết thƣờng. Cụ thể, với thể tích dịch chiết là 800 l thì phƣơng pháp đánh sóng siêu âm cho dịch chiết có tổng năng lực khử là 1,24nm còn đối với chiết thƣờng là 0,99nm. Thể tích dịch chiết tăng thì tổng năng lực khử cũng tăng. Nhƣ vậy, tƣơng tự với kết quả của hàm lƣợng polyphenol tổng số, khi sử dụng sóng siêu âm trong quá trình chiết cho tổng năng lực khử mạnh hơn so với chiết thƣờng. Độ hấp thu đo ở bước sóng 700 nm 59 1.4 b 1.2 1 a 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Thường Siêu âm Phƣơng pháp chiết Hình 3.7. Ảnh hƣởng của sóng siêu âm tới tổng năng lực khử của dịch chiết lá giang Hình 3.14 cho thấy sóng siêu âm có ảnh hƣởng tới khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang. Khi sử dụng siêu âm trong quá trình chiết thì dịch chiết thu đƣợc có khả năng khử gốc tự do DPPH cao hơn so với phƣơng pháp chiết thƣờng. Cụ thể, với thể tích của dịch chiết là 0,5ml thì ở phƣơng pháp chiết sử dụng siêu âm cho khả năng khử gốc tự do DPPH là 71,23% còn phƣơng pháp chiết thƣờng chỉ có 67,83%. Khi giảm thể tích dịch chiết thì khả năng khử gốc tự do cũng giảm theo. Nghiên cứu của Veggi và cộng sự 2013) [93] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của sóng siêu âm tới dịch chiết của vỏ cây tòng chi (jatoba) cũng đã báo cáo rằng khi phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH khẳng định đƣợc chất chiết xuất có hổ trợ siêu âm cho hoạt động chống oxy hóa cao. 60 Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) 74 b 73 72 71 70 69 a 68 67 66 65 64 Thường Siêu âm Phƣơng pháp chiết Hình 3.8. Ảnh hƣởng của sóng siêu âm tới khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang Nhƣ vậy, từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng sóng siêu âm có ảnh hƣởng rất lớn đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Điều này đƣợc giải thích nhƣ sau, hiệu quả trích ly các hợp chất khi sử dụng sóng siêu âm tăng lên là nhờ sự tạo thành các bọt khí trong dung môi khi sóng truyền qua. Dƣới tác dụng của sóng, các bọt khí bị kéo nen, sự tăng áp suất và nhiệt độ làm các bọt khí nổ vỡ, tạo nên hiện tƣợng “sốc sóng’’. Khi sự nổ vỡ của các bọt khí ở gần bề mặt pha rắn, xảy ra sự mất đối xứng, sinh ra tia dung môi có tốc độ cao vào thành tế bào, do đó làm tăng sự xâm nhập của dung môi vào tế bào và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn và pha lỏng. Điều này làm tăng sự truyền khối và phá vỡ cấu trúc tế bào. Sự nổ vỡ của các bọt khí làm tăng sự thoát ra của các chất nội bào vào dung dịch [2]. Bên cạnh đó sự phân hủy của hợp chất polyphenol bằng siêu âm chậm hơn nhiều so với những hợp chất thơm dễ bay hơi và chúng khuếch tán dễ dàng hơn vòa các khoảng trống bong bóng khi bị nhiệt phân (Chowdhury và Viaraghavan, 2009 [45]). Ngoài ra, hiệu suất chiết xuất là một yếu tố quan trọng để đánh giá một quá trình chiết xuất hiệu suất chiết xuất của siêu âm là 10,9% và 8,6% là của chiết thƣờng. Điều này làm cho siêu âm có một tiềm năng 61 để chiết những sản phẩm tự nhiên cho năng suất tốt hơn so với kỹ thuật truyền thống, không chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm mà còn tại cơ sở sản xuất thử nghiệm (Boonkird và Phisalaphong, 2008) [34]. 3.6. Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa Từ các hình 3.1; 3.4; 3.7; 3.10 và 3.12 của hàm lƣợng polyphenol tổng số với các hình 3.2; 3.5; 3.8 và 3.13 của tổng năng lực khử và hình 3.3; 3.6; 3.9; 3.11 và 3.14 của khả năng khử gốc tự do DPPH ta thấy xu hƣớng của chúng đều giống nhau ở các điều kiện tách chiết. Các hợp chất polyphenol đƣợc biết đến là hợp chất chống oxy hóa. Do đó, có thể hợp chất polyphenol là thành phần đóng góp một phần lớn trong việc chống oxy hóa của dịch chiết. Để minh chứng cho điều đó, đã có hình 3.15 và 3.16 Mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol tổng số với hoạt tính chống oxy hóa đƣợc trình bày trong hình 3.15 và 3.16. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lƣợng polyphenol tăng thì hoạt tính chống oxi hóa cũng tăng. Phù hợp với kết quả nghiên cứu của Cristina và cộng sự (2011) [47] khi nghiên cứu về mối tƣơng quan giữa polyphenolic và hoạt động chống oxy hóa của keo ong đã báo cáo rằng mẫu có hàm lƣợng polyphenol cao sẽ cho hoạt động chống oxy hóa cao. Phân tích tƣơng quan hồi quy cho thấy: Ở đồ thị hình 3.15 mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol và tổng năng lực khử có hệ số R2 = 0,169. Chúng biến thiên theo hàm tuyến tính: 62 Năng lực khử đo ở 700 nm 1.2 1 y = 0.004x + 0.439 R² = 0.169 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 120 Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g NL khô) Hình 3.9. Sự tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol tổng số và tổng năng lực khử Ở đồ thị hình 3.16 thì mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol và khả năng Khả năng khử gốctự do DPPD (%) khử gốc tự do DPPH là R² = 0.886, đồ thị biến tính theo hàm tuyến tính 120 100 y = 1.399x - 0.733 R² = 0.886 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g NL khô) Hình 3.10. Sự tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng khử gốc tự do DPPH Từ kết quả này cho thấy polyphenol là thành phần chính góp phần tạo nên khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang trong nghiên cứu. 63 Một số nghiên cứu cũng đã báo cáo về mối tƣơng quan giữa polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa nhƣ: Nghiên cứu của Bambang và cộng sự (2013) [28] khi nghiên cứu rong nâu cũng đã báo cáo rằng khi hàm lƣợng polyphenol cao thì xu hƣớng hoạt động chống oxy hóa cũng cao, tƣơng quan của cả hai yếu tố rất chặt chẽ với R2 = 0,886; nghiên cứu của Nguyễn Xuân Duy và Hồ Bá Vƣơng (2013) [9] cũng cho thấy R2 = 0,716; nghiên cứu của Aikkarach và cộng sự (2011) [26] cũng đã báo cáo về mối tƣơng quan của hàm lƣợng polyphenol với giá trị DPPH là rất cao với R2 = 0,84. Nghiên cứu của Kettawan và cộng sự (2012) [61] cũng đã chỉ ra mối tƣơng quan cao (R2> 0,92) giữa hàm lƣợng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa DPPH của rong biển. 3.7. Ảnh hƣởng của điều kiện và thời gian bảo quản đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hàm lƣợng polyphenol trong dịch chiết lá giang đƣợc mô tả trong hình 3.17. Nhìn chung, hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết bảo quản ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ lạnh (4ᴼC) đều có xu hƣớng giảm xuống trong thời gian bảo quản. Tuy nhiên mức độ giảm cuả hai mẫu này là khác nhau. Mẫu dịch chiết lá giang bảo quản ở nhiệt độ phòng giảm nhanh hơn so với mẫu bảo quản ở nhiệt độ lạnh (Hình 3.17). Dịch chiết lá giang trƣớc khi đƣa vào bảo quản (ngày 0) có hàm lƣợng polyphenol tổng số là 99,54mg GAE/100 ml dịch chiết. Sau một ngày bảo quản, hàm lƣợng polyphenol tổng số trong mẫu bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh lần lƣợt giảm xuống còn 99,20 và 93,48 mg GAE/100 ml dịch chiết. Ở cả hai mẫu, hàm lƣợng polyphenol giảm xuống đáng kể sau 6 ngày bảo quản. So với thời điểm ban đầu bảo quản (ngày 0), hàm lƣợng polyphenol trong dịch chiết ở ngày thứ 6 bảo quản ở nhiệt độ thƣờng và nhiệt độ lạnh giảm xuống, còn lại lần lƣợt là 89,39 và 62,28 mg GAE/100 ml dịch chiết. Kết quả này cũng phù hợp với công bố của Zam và cộng sự (2012) [97] khi nghiên cứu sự thay đổi hàm lƣợng polyphenol và proanthocyanidins trong dịch chiết vỏ quả lựu ở nhiệt độ bảo quản khác nhau trong 14 ngày. Tác giả thấy rằng 64 nhiệt độ và thời gian bảo quản đều ảnh hƣởng đến hàm lƣợng polyphenol tổng số. Hàm lƣợng polyphenol tổng giảm theo thời gian bảo quản. Mẫu bảo quản ở nhiệt độ thấp (nhiệt độ dƣới điểm băng và nhiệt độ lạnh) giảm chậm hơn nhiều so với mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng. Sự giảm xuống của hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết lá giang trong quá trình bảo quản có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Các hợp chất polyphenol là những chất có khả năng chống oxy hóa mạnh, do đó trong thời gian bảo quản, một số hợp chất polyphenol có thể bảo vệ sự oxy hóa của một số chất khác trong dịch chiết, bằng các cơ chế khác nhau, dẫn đến sự giảm hàm lƣợng khi bảo quản. Kết quả bƣớc đầu từ nghiên cứu này cho chúng ta kết luận rằng, trƣớc khi chế biến, dịch chiết lá giang nên đƣợc bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian ngắn, để duy trì các hợp chất polyphenol, một thành phần quan trọng có nhiều Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAe/g NL khô) hoạt tính sinh học. 100 90 80 70 60 50 40 30 Bảo quản lạnh 20 Bảo quản thường 10 0 1 2 3 4 5 6 Thời gian bảo quản (ngày) Hình 3. 11. Ảnh hƣởng của điều kiện và thời gian bảo quản tới hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết lá giang 65 80 70 60 50 40 30 Bảo quản lạnh 20 Bảo quản thường 10 0 1 2 3 4 5 6 Hình 3.18. Ảnh hƣởng của điều kiên và thời gian bảo quản tới khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang Từ kết quả hình 3.17 và 3.18 cho thấy sự tƣơng quan giữa hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rất mạnh, do đó hợp chất lƣợng polyphenol là thành phần chính đóng góp vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang. Nhƣ vậy trong điều kiện và thời gian bảo quản làm giảm hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết thu đƣợc đồng nghĩa với việc khả năng chống oxy hóa của dịch chiết cũng giảm theo. Mặt khác, nhiệt độ bảo quản có ảnh hƣởng tới hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang, cụ thể trên hình 3.17 và 3.18 cho thấy, điều kiện bảo quản lạnh kéo dài độ bền và tác dụng chống oxy hóa của polyphenol trong dịch chiết. Điều này đƣợc giải thích là với nhiệt độ thấp sẽ ức chế sự phân giải các hợp chất và làm chậm các quá trình oxy hóa do vi sinh vật cũng nhƣ do các thành phần hóa, lý trong môi trƣờng tới polyphenol. 66 3.8. Ảnh hƣởng của bộ phận trên cây lá giang tới hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa trong dịch chiết Trên hình 3.19 và 3.20 v à 3.21 cho thấy, trong cùng điều kiện chiết, cụ thể ở đây là dung môi chiết 50% ethanol, nhiệt độ 600C, thời gian 90 phút thì lƣợng polyphenol tổng số, năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH đƣợc chiết ra từ bộ phận lá giang lớn hơn ở bộ phận thân cây lá giang. Theo số liệu thu đƣợc: Hàm lƣợng thu đƣợc ở lá cây giang là 94,43 mg GAE/g NL khô trong khi đó ở thân cây lá giang là 66,45 mg GAE/g NL khô. Điều này đƣợc giải thích là ở bộ phận lá giang chứa nhiều nguyên sinh chất, các thành phần tổng hợp duy trì sự sống cho cây, hàm lƣợng polyphenol tập trung ở đây nhiều hơn, còn ở thân cây thì thành phần chủ yếu là xenlulozo, mặt khác, thành tế bào của thân cây vốn cứng và bền hơn thành tế bào của lá cây giang, do đó việc phá vỡ thành tế bào để trích ly polyphenol trở nên khó Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g NL khô) khăn hơn. 120 100 b 80 a 60 40 20 0 Lá cây Thân cây Bộ phận chiết Hình 3.19. Ảnh hƣởng của các bộ phận trên cây lá giang tới hàm lƣợng polyphenol tổng số trong dịch chiết ở nhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết 90 phút, dung môi 50% ethanol. Độ hấp thụ đo ở bƣớc sóng 700 nm 67 1.2 b 1 0.8 a 0.6 0.4 0.2 0 Lá cây Thân cây Bộ phận chiết Hình 3.20. Ảnh hƣởng của các bộ phận trên cây lá giang tới năng lực khử của dịch chiết ở nhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết 90 phút, dung môi 50% Khả năng khử gốc tự do DPPH (%) ethanol. 80 70 b 60 a 50 40 30 20 10 0 Lá cây Thân cây Bộ phận chiết Hình 3.21. Ảnh hƣởng của các bộ phận trên cây lá giang tới khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết ở nhiệt độ chiết 600C, thời gian chiết 90 phút, dung môi 50% ethanol. 68 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1. KẾT LUẬN Những năm gần đây, thực vật là nguồn nguyên liệu đƣợc chú rất nhiều bởi những tác dụng tốt của nó đối với sức khỏe con ngƣời. Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đã đƣợc tìm thấy trong thực vật, trong các nhóm hợp chất này polyphenol có vai trò quan trọng, đóng góp vào hầu hết các hoạt tính sinh học của thực vật. Lá giang, một loài thức ăn đƣợc sử dụng rộng rãi trong các bữa ăn của ngƣời Việt. Nhƣng cho đến nay, ngƣời ta chỉ chú ý đến nó nhƣ một loại thức ăn. Dữ liệu khoa học về các hoạt tính y dƣợc của loại cây này còn rất hạn chế. Đây là lý do mà tại sao nó chỉ đƣợc sử dụng làm thực phẩm. Để có có sở phát triển các sản phẩm nhƣ nƣớc uống có hoạt tính sinh học từ lá giang,...trong nghiên cứu này, điều kiện thu nhận dịch chiết giàu polyphenol và khả năng chống oxy hóa của lá giang đƣợc nghiên cứu. Kết quả của đề tài đã xác định điều kiện thu nhận polyphenol từ lá giang nhƣ sau: Loại dung môi là 50% ethanol, nhiệt độ chiết là 60OC; thời gian chiết là 90 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết trong điều kiện sử dụng sóng siêu âm cho hiệu quả chiết cao hơn so với phƣơng pháp chiết thƣờng. Nhƣ vậy, siêu âm có thể là một phƣơng pháp hữu hiệu để thu nhận dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa từ thực vật. Kết quả của đề tài còn chứng tỏ dịch chiết lá giang có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh. Đây là cơ sở quan trọng để phát triển sản phẩm có khả năng ngằn ngừa các bệnh liên quan đến quá trình oxy hóa từ nguồn nguyên liệu này. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa giảm dần theo số lần chiết. Nghiên cứu cho thấy dịch chiết lá giang bảo quản lạnh trong thời gian ngắn cho hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa cao. Tuy nhiên để kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng vào thực tế, nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào một số hƣớng cụ thể nêu ở mục 4.2. 69 4.2. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Sau gần 3 tháng thực tập và hoàn thành đề tài tại trung tâm thí nghiệm trƣờng Đại Học Nha Trang do thời gian tiến hành và điều kiện về máy móc, thiết bị dụng cụ còn nhiều khó khăn, kết quả đề tài còn có nhiều hạn chế. Do đó, xin có một số ý kiến sau để phát triển thêm hƣớng nghiên cứu từ lá giang:  Chất chống oxy hóa là những chất có vai trò quan trọng đối với sức khỏe. Lá giang ở nƣớc ta với số lƣợng lớn, có chứa hợp chất polyphenol rất đáng kể nhƣng hầu nhƣ chỉ dùng để làm thức ăn hàng ngày, dung làm dƣợc liệu trong các bài thuốc dân gian. Vì vậy, cần có những nghiên cứu sâu hơn, rộng hơn về lá giang.  Từ kết quả của nghiên cứu này nên có những nghiên cứu tƣơng tự đối với nguyên liệu khác nhằm tạo ra nguồn chất chống oxy hóa phong phú hơn.  Tinh sạch các chất có khả năng chống oxy hóa trong lá giang để hiểu rõ cơ chế chống oxy hóa của nó.  Nghiên cứu phát triển sản phẩm giá trị gia tăng từ lá giang nhƣ nƣớc uống từ lá giang.  Sử dụng dịch chiết lá giang trong bảo quản thực phẩm.  Kết quả nghiên cứu cho thấy lá giang có chứa các hợp chất polyphenol từ đó có thể nghiên cứu ứng dụng của hợp chất polyphenol chiết đƣợc từ lá giang để bổ sung vào thực phẩm cũng nhƣ sử dụng lá giang trong thực phẩm, thực phẩm chức năng một cách có hiệu quả.  Nên có những nghiên cứu xác định các hợp chất polyphenol trong dịch chiết để tìm ra những chất có hoạt tính chống oxy hóa, phục vụ tốt cho các nghiên cứu liên quan.  Dịch chiết lá giang có khả năng chống oxy hóa vì vậy cần có những nghiên cứu áp dụng dịch chiết lá giang hạn chế sự oxy hóa của các đối tƣợng thủy sản.  Nghiên cứu cho thấy quá trình chiết sử dụng sóng siêu âm cho hiệu quả cao, tuy nhiên cần nghiên cứu các chế độ (dung môi; nhiệt độ; thời gian chiết…) ảnh hƣởng tới sóng siêu âm. 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Hoàng Kim Anh, Nguyễn Xuân Trình và Nguyễn Xuân Phƣớc, 2009, Luận văn nghiên cứu trích ly polyphenol từ lá sakê và ứng dụng tạo sản phẩm đồ uống giàu polyphenol 2. Nguyễn Văn Bằng, Nguyễn Hoàng Thanh, Trịnh Thanh Hùng (2013), “Biến đổi một số chỉ số chống oxy hóa ở ngƣời tiếp xúc nghề nghiệp với chì vô cơ”, Tạp chí Y dược học Quân sự, (5), tr. 69 - 75. 3. Đàm Trung Bảo, Hoàng Tích Huyền (2004), “Mạng lƣới các chất chống oxy hóa cần cho cơ thể”, Tạp chí nghiên cứu y học, 32(6), tr. 117-121. 4. Ngô Quốc Bƣu, Lê Đình Hùng, Huỳnh Quang Năng, Lê Lan Anh (2002), ảnh hƣởng của kiềm đối với hàm lƣợng, chất lƣợng và thành phần hóa của agar từ rong câu. 5. Đặng Xuân Cƣờng (2009), Nghiên cứu thu nhận dịch chiết có tính kháng khuẩn từ rong nâu Dictyota Dichotoma Việt Nam, Luận văn thạc sỹ, Trƣờng Đại học Nha Trang. 6. Đình Ngọc Chất, Hồ Hữu Nhƣợng (1986), rong câu chỉ vàng, nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nôi. 7. Nguyễn Hữu Dinh (1969), Rong câu, nhà xuất bản Khoa học, Hà Nội. 8. Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng, Trần Ngọc Bút, Nguyễn Văn Tiến (1993), Rong biển Việt Nam phần phía Bắc. 9. Nguyễn Xuân Duy và Nguyễn Anh Tuấn (2013), Sàng lọc thực vật có hoạt tính chống oxy hóa và áp dụng trong chế biến thủy, Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 28, tr. 59-68. 10. Nguyễn Xuân Duy và Hồ Bá Vƣơng (2013), Hoạt tính chống oxi hóa và ức chế enzyme polyphenoloxidase của một số loài thực vật ăn đƣợc ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Phát triển 11(3) pp.364-372. 71 11. Trƣơng Ngọc Dƣơng (2009), Nghiên cứu nồng độ c-peptid, insulin, tự kháng thể kháng insulin, một số chỉ số oxy hóa/chống oxy hóa ở bệnh nhân đái tháo đường typ 1, Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội. 12. Lại Thị Ngọc Hà, vũ Thị Nhƣ (2009) Oxidantive Stress and Natural Antioxidants, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(5), 667 – 677, trƣờng đại học nông nghiệp Hà Nội. 13. Lê Nhƣ Hậu, Nguyễn Hữu Đại (2008), Rong Câu Việt Nam nguồn lợi và sử dụng, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ. 14. Lê Nhƣ Hậu (2006), Đặc điểm sinh học và nguồn lợi chi rong câu (Gracilaria Greville) ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Hải dƣơng học Nha Trang. 15. Phạm Hoàng Hộ (1985), Thực vật ở đảo Phú Quốc, nhà xuất bản Hà Nội. 16. Hoàng Tích Huyền (1992), “Gốc tự do trong dƣợc lý học và độc chất học”, Một số chuyên đề hóa sinh tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr. 70-82. 17. Nguyễn xuân Lý (1990), Nghiên cứu đặc điểm sinh học, kỹ thuật sản xuất giống và trồng rong câu chỉ vàng, báo cáo tổng kết KHKT đề tài rong câu 08A-05-02, Viện nghiên cứu Hải sản. 18. Đào Kim Nhung,Nguyễn Quốc Tuấn,Nguyễn Thị Nguyệt,Trần Thị Long (1995), Nghiên cứu các chất Polyphenol ở một số cây họ cúc (Asteraceae), Đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ B-93-05-90, Trƣờng Đại học tổng hợp Hà Nội. 19. Đàm Đức Tiến và Nguyễn Văn Tiến (2000), Rong kinh tế quần đảo Trƣờng Sa, tài nguyên và môi trường biển, NXB KH & KT Hà Nội. 20. Nguyễn Văn Tiến (1993), Nguồn lợi rong biển dải ven bờ Việt Nam, Hội thảo khoa học “Nghiên cứu và quản lý vùng ven bờ biển Việt Nam”, Hà Nội. 21. Dƣơng Đức Tiến, Đỗ Văn Khƣơng, Trần Văn Trấn (1991), Một số nghiên cứu về chất lƣợng rong câu ở ven biển miền Bắc Việt Nam, tuyển tập các báo cáo khoa học, Hà Nội, 1, tr.316 -327. 72 22. Nguyễn Thị Thảo (2012), Nghiên cứu chiết pholrotannin chống oxy hóa từ rong mơ Sargassum Mcclurei bằng phƣơng pháp hồi lƣu gia nhiệt, đồ án tốt nghiệp đại học, trƣờng Đại học Nha Trang. 23. Trƣơng Thị Thƣơng (2011), Xác định động thái biến đổi hợp chất polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của quả sim thu hái tại Hải Dƣơng, luận văn thạc sỹ 24. Vũ Minh Triết, Bùi Thiên Duy, Trần Quốc Tuấn, Thực phẩm chống oxy hóa, bộ môn công nghệ thực phẩm, Trƣờng đại học bách khoa TP.HCM. Tài liệu tiếng anh 25. Almagor M., Kahane I., Yatziv S. (1984), “Role of superoxide anion in host cell injury induced by mycoplasma pneumoniae infection”, A study in normal and trisomy 21 cells. The American Society for Clinical Investigation, 73, pp. 842-847. 26. Anesini C., Graciela E. Ferraro and Rosana Filip (2008), Total polyphenol content and antioxidant capacity of commercially available tea (Camellia sinensis) in Argentina, J. Agric. Food Chem. Five, 56, 9225-9229. 27. Ariana C.M., Ana Elsa B.G., Diadelis M., Yosdel S.L., Brito-Navarro V., Ana M.V., Brömme D., Zaldívar-Muñoz C., Vidal-Novoa A., Silva A.M.O., Mancini-Filho J. (2012), Inhibition of LDL oxidation and antioxidant properties related to the polyphenol content of hydrophilic fractions from seaweed Halimeda Incrassata (Ellis) Lamouroux, Braz. J. Pharm. Science fiction, 48(1). 28. Bambang B.S, Kumalaningsih S., Susinggih W. and Hardoko (2013), Polyphenol Content and Antioxidant Activities of Crude Extract from Brown Algae by Various Solvents, J. Life Sci. Biomed, 3(6): 439-443. 29. Baraniak B., Krzepilko A., Stryjecka M., 2002. Aktywnosc antyutleniajaca zwiazkow fenolowych ekstrahowanych nymi rozpuszczalnikami z ro kalafiora 73 [polyphenol antioxidant activity after various solvent extracts from cauliflower]. ywn. NAUKA Techn. Jakosc 3 (32), pp. 58-66. 30. Barry H., John M. C. G. (2001), “Antioxydant defences”.In: Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford University press, Third edition, pp. 225-231. 31. Benmeziane F.,Djamai R., Cadot Y. and Seridi R. (2014), Optimization parameters extraction of phenolic compounds from Algeria table grapes (Vitis Vinifera), Food Research International Journal 21 (3), pp.1025-1029. 32. Berrahal A. A., Lasram M., Elj N. E., et al. (2009), “Effect of age-dependent exposure to lead on hepatotoxicity and nephrotoxicity in male rats”, Environmental Toxicolory, 26, pp. 68-78. 33. Birben E., Sahiner U. M., Sackesen C. (2012), “Oxidative stress and antioxidant defense”, WAO Journal, 5, pp. 9-19. 34. Boonkird S., Phisalaphong C. and Phisalaphong M. 2008. Ultrasound frutescens support of capsaicinoids from peppers on a laboratory and pilot plant scale. Ultrasonic Sonochemistry 15, pp. 1075-1079. 35. Britton G. (1995). Structure and properties of carotenoids in relation to function. FASEB Journal, 9, p. 1551- 1558 Vansant G., Pincemail J., Defraigne J. O., Van Camp J., Goyens P. et Hercberg S. (2004). Antioxidants et alimentation. Institut Danone, 67 pp. 36. Brown C. R., Culley D., Yang C.-P. and Navarre D. A. (2003). Breeding Potato with High Carotenoid Content, Proceedings Washington State Potato Conference, February 4-6, 2003, Moses Lake, Wa., p. 23-26. 37. Burke M., Edge R., Land E. J., Truscott T. G. (2001). Characterization of carotenoid radical cations in liposomal environments: interaction with vitamin C. Journal of photochemistry and photobiology B: Biology, 60, pp. 1-6. 38. Cadenas E., Boveris A. (2005), “Mitochondrial free radical production, antioxidant defenses and cell signaling”, in: The Handbook of Environmental Chemistry, 2, pp. 219-234. 74 39. Chakraborty K., Praveen N.K., Vijayan K.K., Syda R.G. (2010), inventors; Indian Council of Agricultural Research assignee , assignee. A process to prepare antioxidant and anti-inflammatory concentrates from brown and red seaweeds and a product thereof, Indian patent Appl. No. 2064. 40. Chang C.F và Xia B. (1963), Polycavernosa, a new genus of the Gracilariacease, Stud, Mar, Sin, 3, pp. 119-129. 41. Chew K. K., Ng S. Y., Thoo Y. Y., Khoo M. Z., Wan Aida W. M. and Ho C.W (2011), Effect of ethanol concentration, extraction time and extraction temperature on the recovery of phenolic compounds and antioxidant capacity of Centella asiatica extracts, International Food Research Journal 18, pp. 571578. 42. Chew K.K, Khoo M.Z, Ng S.Y, Thoo Y.Y, Wan Aida W.M and Ho C.W (2011), Effect of ethanol concentration, extraction time and extraction temperature on the recovery of phenolic compounds and antioxidant capacity of Orthosiphon extract stamineus, Food Research International Journal 18 (4), pp.1427-1435. 43. Chirinos R., Rogez H., Campos D., Pedreschi R. and Larondelle Y. (2007), Optimization of extraction conditions of antioxidant phenolic compounds from mashua (Tropaeolum tuberosum Ruíz and Pavón) tubers, Separation and Purifcation Technology 55(2), pp. 217-225. 44. Cho S.H , Kang S.W, Cho J.Y, Kim A.R, Park S.M, Hong Y.K, Ahn D.H (2007), The antioxidant properties of brown seaweed (Sargassum siliquastrum) extracts, J Med Food 10 (3) pp. 479-85. 45. Chowdhury P., Viraraghavan T. (2009) Sonochemical degradation of chlorinated organic compounds, phenolic compounds and organic dyesreviewed. Science fiction Total Environment 407:2474-2492. 46. Corol D., Dorobantu I.I., Toma N. and Nitu R. (2002). Diversity of BiologicalFunctions of Carotenoids. Roumanian Biotechnological Letters, 8 (1), pp. 1067 – 1074. 75 47. Cristina M., Liviu A.M., Daniel S.D., Barnutiu L. (2011), The relationship between Polyphenolic profile and antioxidant activity of propolis from Transylvania, Animal Science and Biotechnology, 44 (2). 48. Dawson E.Y. (1949), Marine plants in the Vicinty of the institute oceanographique de Nha Trang, viet Nam, Pac.Sci., 8 (4), pp. 373-481. 49. Emanul V., Advian V., Nitãsultana C.S. (2011), Antioxidant and antimicrobial acivityties of Ethanol extracts of Cynara Scolymus ((Cynarae-leaves, family Asteraceae), Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 10 (6), pp. 777783. 50. Fu H., Shiech D., HO C. (2002), Antioxydant and free radical Scavenging activities of edible mushrooms. J. Food lipid 9, pp. 35-46. 51. Gargilulo G. M., Mái F. và Tripodi G. (1992), Morphology, reproduction and taxonomy of the Mediterranean species of Gracilaria (Gracilarialé, Rhodophyta). Phycologia 3, pp. 521 -537. 52. Gressler V., Fujii M.T., Martins A.P., Colepicolo P., Mancini-Filho J., Pinto E. (2011), Biochemical composition of two red seaweed species grown on the Brazilian coast, J Sci Food Agric. 2011 Jul;91(9):1687-92. 53. Greville R. K. (1830), Algae Britannincae, Edinburgh, Lindon. 54. Griffiths H. R. (2005), “Chemical modifications of biomolecules by oxidants”, in: The Handbook of Environmental Chemistry, 2, pp. 33-62. 55. Hisamoto M., Hirokazu M. and Tohru O. (2011), Antioxidant activity of different parts of Koshu grapes, J. ASEVJpn., 22 (3), pp. 133-142. 56. Huang D., Ou B., Hampsch-Woodill M., Flanagan J. A. and Deemer E. K. (2002). Development and validation of oxygen radical absorbance capacity assay for lipophilic antioxidants using randomly methylated β-cyclodextrin as the solubility enhancer. Journal of agricultural and food chemistry, 50, pp. 1815-1821. 76 57. Indu. H, Seenivasan. R (2013), In vitro antioxidant activity of selected seaweeds from Southeast Coats of India, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(2), ISSN 0975-1491. 58. Jomova K., Valko M. (2011), “Advances in metal- induced oxidative stress and human disease”, Toxicology, 283, pp. 65-87. 59. Jovanovic S. V. and Simic M. G. (2000), Antioxidants in nutrition, Annals of the New York Academy of Sciences, 899, p. 326-334. 60. Kasperczyk S., Birkner E., Kasperczyk A., et al. (2004). “Activity of superoxide dismutase and catalase in people protractedly exposed to lead compounds”, Ann Agric Environ Med,11(2), pp. 291-296. 61. Kettawan, A., Charnlekha, K., Kongkachuichai, R., Charoensri, R. (2011). Effect of cooking on antioxidant activity and polyphenol content edible mushrooms commonly consumed in Thailand. Pakistan Journal of Nutrition 10, 1094-1103. 62. Krinsky N. I. (1998). The Antioxidant and Biological Properties of the Carotenoids. Annals of the New York Academy of Science, 854, p. 443 - 447. 63. Lachman J., Hamouz K., Orsak M. and Pivec V. (2000). Potato tuber as a significant source of antioxidants in human nutrition. Rostlinna vyroba, 46, pp. 231-236. 64. Lan-Sook L., Namhyouck L., Ho K.Y., Chang-Ho L., Hong S.P., Yeo-Won J. and Young-Eon K. (2013), Optimization of Ultrasonic Extraction of Phenolic Antioxidants from Green Tea Using response surface methodology, 18 , pp. 13.530-13.545. 65. Li D.D., Fang M.L., Liu Q., Li Q.L, Gao Y.T. (2011), Research the extraction of polyphenols from Scindapsus officinalis with ultrasound technology optimized by means of response surface designs integrated center, Zhong Yao Cai, 34 (1), pp. 129-33. 66. Lin A.L.M., Suhaimi M.D.Y., Matanjun P. and Bakar M.F.A., Antioxidant Activity, Total Phenolic and Flavonoid Contents of Selected Commercial 77 Seaweeds of Sabah, Malaysia, International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological Research (eIJPPR), pp. 2250-1029. 67. Liu L., Heinrich M., Myers S., Dworjanyn S.A. (2012) Towards a better understanding ofmedicinalusesof the brown seaweed Sargassum in traditional Chinese medicine, A phytochemical and pharmacological review. J Ethnopharmacol, (142), pp.591–619. 68. Liyana-Pathirana C. and Shahidi F. 2005. Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology. Food Chemistry 93(1), pp. 47-56. 69. Manivannan K., Thirumaran G., Devi G.K., Hemalatha A. and Anantharaman P. (2008), Biochemical Composition of Seaweeds from Mandapam Coastal Regions along Southeast Coast of India, American-Eurasian Journal of Botany, 1 (2): pp. 32-37. 70. Michael A., Paul D.P., Emilios Patsalides, Suzanne McDonald and Kevin Robards (2011),Methods for testing antioxidant activity, pp. 183–198. 71. Mihai M. C., Marghitas L. Al., Daniel S. D., Barnutiu L. (2011), The relationship between Polyphenolic profile and antioxidant activity of propolis from Transylvania, Animal Science and Biotechnology, 44 (2). 72. Mole M.N., Anjali S.B. (2013), Antioxidant Potential of Seaweeds from Kunakeshwar along the West Coast Maharashtra, Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, all rights reserved, 3(22), PP. 45-50. 73. Mortensen A., Skibsted L. H. and Truscott T. G. (2001). The interaction of dietary carotenoids with radical species. Archive of biochemistry and biophysics, 385 (1), pp. 13-19. 74. Mugica C.A., Gonzalez B.A.E., Diadelis M., soto-López Y., Brito-Navarro V., Ana Maria Vázquez, Dieter Brömme, Claudina Zaldívar-Muñoz, Alexis Vidal-Novoa, Ana Mara de Oliveira e Silva, Jorge Mancini-Filho (2012), Inhibition of LDL oxidation and antioxidant properties related to the 78 polyphenol content of hydrophilic fractions from seaweed Halimeda Incrassata (Ellis) Lamouroux, Braz. J. Pharm. Science fiction, 48(1). 75. Naczk M. and Shahidi F. (2004), Extraction and analysis of phenolics in food, Journal of Chormatography A 1054, (1-2), pp. 95-111. 76. Niki E., Noguchi N., Tsuchihashi H. and Gotoh N. (1995). Interaction among vitamin C, vitamin E, and beta-carotene. American Journal of Nutrition, 62, pp. 1322-1326. 77. Oyaizu M. (1986), Studies on products of browning reaction antioxidantive activity of products of browining reaction prepared from glucosamine. J. Nutr, 44, 307-315. 78. Pincemail J., Dafraigne, Meurisse M. et Limet R. (1998). Antioxydants et prévention des maladies cardiovasculaires, lère partie: la vitamine C. MédiSphere, 89, p. 27-30. 79. Priscilla C. Veggi, Diego T. Santos, Anne-Sylvie Fabiano-Tixier, Carine Le Bourvellec, M. Angela A. Meireles, Farid Chemat (2013), Ultrasonic Extraction of polyphenols support from jatoba (Hymenaea courbaril L.var stilbocarpa) Bark, Food and Public Health, 3 (3), pp. 119-129. 80. Radojkovića M., Zoran Zekovića, Stela Jokićb, Senka Vidovića (2012), Determination of optimal extraction parameters of mulberry leaves using Response Surface Methodology (RSM), 17(3), pp. 7295 – 7308. 81. Samano J. M., Torres-Duran P. V., Juarez-Oropeza M. A., et al. (2012), “Effect of acute extremely low frequency electromagnetic field exposure on the antioxidant status and lipid levels in rat brain”, Archives of Medical Research, 43, pp. 183-189. 82. Samuagam L., Sia C.M., Akowuah G.Ab., Okechukwu P.N., Yim H.S. (2013), The Effect of Extraction Conditions on Total Phenolic Content and Free Radical Scavenging Capacity of Selected Tropical Fruits’ Peel, Health and the Environment Journal, 2013, 4(2), pp. 80-102. 79 83. Sastre J., Pallardo F. V., Vina J. (2005),“Glutathion”, in: The Handbook of Environmantal Chemistry, 2, pp. 91-108. 84. Scott K., Powers., Malcolm J. J. (2012),“Exercise-induced oxidative stress: cellular mechanisms and impact on muscle force production”, 88(4), pp. 1243-1276. 85. Sergio A.R. Paiva, and Robert M. Russell (1999). -Carotene and Other Carotenoids as Antioxidants. Journal of the American College of Nutrition, 18 (5), p. 426-433. 86. Seung-Hong L., Min-Cheol K., Sang-Ho M., Byong-Tae J. and You-Jin J. (2013), The ability to use ultrasound in the extraction of antioxidants from Ecklonia cava, Algae, 28 (4), pp. 371-378. 87. Singh N. and Rajini P. S. (2004). Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel. Food chemistry, 85, pp. 611-616. 88. Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventos R.M. (1999), Analysis of total phenol and other oxidation substrates and antioxidants by means of FolinCiocalteu reagent, Method enzymol 299, pp. 152-78. 89. Spigno G., Tramelli L., De Faveri D.M, 2007, the effect of extraction time, temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics, J. Food Eng., 81 , 200-208. 90. Stahl W. and Sies H. (2003). Antioxidant activity of carotenoids. Molecular Aspects of Medicine, 24, p. 345-351. 91. Sugawara E., Nakamura K., Miyake T., et al. (1991), “Lipid peroxidation and concentration of glutathione in erythrocytes from workers exposed to lead”, Br. J. Ind. Med, Apr, 48(4), pp. 239-242. 92. Tam S.F., Lian A., Kuppusamy P., Mashitah M.Y., Govindan N. (2013), Studies on in-vitro antioxidant activity of marine edible seaweeds from the east coastal region of Peninsular Malaysia using different extraction methods, Journal of Coastal Life Medicine, 1(3) pp. 193-198. 80 93. Tan M. C., Tan C. P. and Ho C. W. (2013), Effects of extraction solvent system, time and temperature on total phenolic content of henna (Lawsonia inermis) stems, International Food Research Journal 20(6), pp.3117-3123. 94. Veggi P.C., Santos D.T., Fabiano-Tixier A.S., Bourvellec C.L., Angela M.A., Chemat F.(2013), Ultrasonic Extraction of polyphenols support from jatoba (Hymenaea courbaril L.var stilbocarpa) Bark, Food and Public Health p-ISSN: 2162-9412 e-ISSN: 2162-8440, 3 (3), pp.119-129. 95. Vijayabaskar P., Shiyamala V. (2012), Antioxidant properties of seaweed polyphenol from fromTurbinaria ornate(Turner) J. Agardh, 1848,Asian Pac J Trop Biomed, 1(1), pp. 90–98. 96. Yamamoto H. (1984), an evolution of some vegetative features and some interesting ptoblems in Japanese populations of Gracilaria, Hydrobiologia. 97. Zam W., Ghada B., Wassim A., Khayata W. (2012), effective extraction of polyphenols and proanthocyanidins from pomerganate’s peel, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4(3), pp. 0975-1491. 98. Zubia M., Fabre M.S, Kerjean V., Lann K.L., Stiger-Pouvreau V., Fauchon M., Deslandes E. (2009), Antioxidant and antitumoural activities of some Phaeophyta from Brittany coasts, Food Chem , (116) pp. 693–701. 99. http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-nghien-cuu-kha-nang-chong-oxi-hoa-cuamot-so-thuc-vat-tren-mo-ca-basa-10203/ 100. http://nld.com.vn/suc-khoe/chua-benh-tu-la-giang-20131214102017566.htm 101. http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Aganonerion%20polymor phum&list=species 102. http://luanan.nlv.gov.vn/luanan?a=d&d=TTkGBCivwvuy1995.1.1&e=------vi-20--1--img-txIN------103. https://vietspice.wordpress.com/tag/bot-la-giang-2/ 1 PL PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HÀM LƢỢNG NƢỚC CÓ TRONG NGUYÊN LIỆU 1.1. Mục đích của phƣơng pháp: Đo độ ẩm của nguyên liệu nhằm xác định hoạt tính chống oxy hóa và hàm lƣợng polyphenol tổng trong mẫu khô (khô tuyệt đối) từ mẫu khô ban đầu. Khi đó so sánh kết quả sẽ có nghĩa hơn. 1.2. Nguyên tắc: Dùng phƣơng pháp phân tích khối lƣợng (sấy mẫu ở 100 – 105oC đến khối lƣợng không đổi. Dựa vào sự chênh lệnh khối lƣợng nguyên liệu trƣớc và sau khi tách ẩm để xác định hàm lƣợng ẩm trong nguyên liệu. 1.3. Tiến hành. - dụng cụ thiết bị: Tủ sấy, cốc sấy, bình hút ẩm, cân phân tích, đủa thủy tinh. - chuẩn bị cốc sấy: Đem cốc và đủa thủy tinh đi rửa rồi để ráo, sau đó sấy ở 100 – 105OC trong vòng 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân. Sau đó sấy lại ở nhiệt độ 100 -105oC rồi đêm cân, lặp lại đến khi khối lƣợng cốc không đổi thì dừng. - chuẩn bị mẫu: Nguyên liệu đƣợc cắt nhỏ rồi đem cân chính xác G g mẫu (khoảng 1 g) cho vào 3 cốc sấy (đã đƣợc xác định khối lƣợng ở trên). Dùng đũa thủy tinh dàn đều mẫu sau đó đem sấy ở nhiệt độ 100 – 105oC trong 6 giờ, lấy mẫu ra, để nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân. Tiếp tục sấy thêm vài lần nữa rồi đem cân đến khi chênh lệch khối lƣợng giữa 2 lần cân liên tiếp chênh lệch không quá 0.2 mg thì dừng và tính hàm lƣợng nƣớc trong nguyên liệu theo công thức sau: Công thức ính % độ ẩm: %𝐻2 𝑂 = 𝐺1 − 𝐺2 𝑥 100 𝐺 Trong đó :  G: Khối lƣợng mẫu ban đầu.  G1: Khối lƣợng cốc, mẫu trƣớc khi sấy.  G2: Khối lƣợng cốc, mẫu sau khi sấy 2 PL Bảng PL1.Hàm lƣợng nƣớc có trong nguyên liệu Mẫu Khối lƣợng mẫu Khối lƣợng mẫu sau sấy (g) Khối lƣợng Hàm Lần 1 mẫu sau sấy lƣợng trung bình (g) nƣớc (%) Lần 2 Lần 3 Mẫu 1 10.001 0.7017 0.7017 0.7016 0.7017 7.02 Mẫu 2 10.000 0.7054 0.7054 0.7054 0.7054 7.06 Mẫu 3 10.001 0.7043 0.7042 0.7042 0.7042 7.04 Trung 7.04 bình PHỤ LỤC 2: ĐƢỜNG CHUẨN GALLIC ACID Cân chính xác 10mg gallic acid, cho vào cốc thủy tinh và cho thêm 100ml nƣớc cất, hòa tan hoàn toàn gallic acid ta đƣợc nồng độ của dung dịch gallic acid vừa pha là 0.1 mg/ml. sau đó tiến hành pha loãng dung dịch vừa pha thành các nồng độ khác nhau (0,075 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,025 mg/ml; 0,01 mg/ml; 0,005 mg/ml; 0 mg/ml) bằng cách: Dùng micropipette để pha loãng ở các nồng độ  mg/ml = 1 ml dug dich gallic acid vừa pha cho vào ống nghiệm  0,075 mg/ml = 0,75 ml dug dich gallic acid vừa pha + 0,25 ml H2O cho vào ống nghiệm  0,05 mg/ml = 0,5 ml dug dich gallic acid vừa pha + 0,5 ml H2O cất cho vào ống nghiệm  0,025 mg/ml = 0,25 ml dug dich gallic acid vừa pha + 0,75 ml H2O cất cho vào ống nghiệm  0,01 mg/ml = 0,1 ml dug dich gallic acid vừa pha + 0,9 ml H2O cất cho vào ống nghiệm  0,005 mg/ml = 0,05 ml dug dich gallic acid vừa pha + 0,95 ml H2O cất cho vào ống nghiệm 3 PL  0 mg/ml = 1 ml H2O cất cho vào ống nghiệm Cách tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn tƣơng tự nhƣ cách tiến hành xác định Độ hập thụ ở bƣớc sóng 760 nm hàm lƣợng polyphenol. 1.6 y = 0,891x + 0,069 R² = 0,992 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.5 1 1.5 Nồng độ gallic acid (mg/ml) 2 Hình PL1 Đƣờng chuẩn Gallic acid Từ kết quả hình PL 2 cho thấy hệ số tƣơng quan giữa nồng độ Gallic acid và độ hấp thụ ở bƣớc sóng 760nm bằng 0,998, điều này có nghĩa rằng mối tƣơng quan giữa nồng độ Gallic acid và độ hấp thụ ở bƣớc sóng 760nm là rất cao. Vì vậy thí nghiệm này có thể sử dụng đƣờng chuẩn Gallic acid để tính hàm lƣợng polyphenol (mg GAE/g chất khô) của dịch chiết từ lá giang và các dịch chiết khác. Bảng PL2. Đƣờng chuẩn Gallic acid Nồng độ Gallic Bƣớc sóng hấp thụ ở 760nm acid Lần 1 Lần 2 Trung bình 0 0,0293 0,0277 0,0285 0,005 0,0369 0,0361 0.0365 0,01 0,0485 0,0429 0,0457 0,025 0,0795 0,0776 0,07855 0,05 0,1326 0,1401 0,13635 0,075 0,1979 0,2068 0,20235 0,1 0,2574 0,2571 0,25725 4 PL PHỤ LỤC 3: SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM  Sự ảnh hƣởng của dung môi và nồng độ Ethanol tới dịch chiết thu đƣợc Bảng PL3. 1.Hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang Bƣớc sóng 760 nm Polyphenol Mẫu H2O(0%) 25% 50% 75% 100% Lần 1 0.5491 0.85 0.8887 0.8422 0.5493 Lần 2 0.5729 0.8612 0.9523 0.8445 0.5377 Lần 3 0.5717 0.8477 1.0109 0.8732 0.5355 Lần 4 0.5523 0.8542 0.986 0.8648 0.5362 48.93986 79.61264 83.55759 78.81753 48.96024 51.36595 80.75433 90.04077 79.05199 47.77778 3 51.24363 79.37819 96.01427 81.97757 47.55352 Chất khô lần 49.26606 80.04077 93.47604 81.1213 47.62487 50.20387 79.94648 90.77217 80.2421 47.9791 1.279161 0.604407 5.396777 1.552485 0.66075 Chất khô lần 1 Chất khô lần 2 Chất khô lần 4 Chất khô trung bình Độ lệch chuẩn 5 PL Bảng PL3. 2. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang Dung môi và Bƣớc sóng hấp thụ ở 700nm Bƣớc sóng nồng độ Thể tích mẫu 800 nm hấp thụ trung Ethanol (%) 0%(H2O) 25% 50% 75% 100% Độ lệch chuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 bình (nm) 0.5324 0.5296 0.5328 0.5316 0.001744 0.5548 0.5694 0.5622 0.562133 0.0073 0.6346 0.6293 0.6306 0.6315 0.002762 0.859 0.8681 0.8541 0.8604 0.007104 1.0739 1.0739 1.0655 1.060333 0.016758 6 PL Bảng PL3. 3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang Dung môi và Bƣớc sóng hấp thụ ở nồng độ 517nm Ethanol (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị trung bình Tỷ lệ DPPH Độ lệch bị khử % chuẩn 0.1478 0.1402 0.1445 0.0574 0.0532 0.0499 0.0535 62.98774 2.12087 0.0428 0.0412 0.0408 0.0416 71.20247 0.813836 50% 0.0032 0.0035 0.0025 0.003067 97.88315 0.301043 75% 0.004 0.004833 96.65565 0.536004 100% 0.0051 0.0062 0.0058 0.0057 96.05435 0.38258 Control 0% (Nƣớc) 25% 0.1455 0.0056 0.0049 7 PL  Sự ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến dịch chiết thu đƣợc Bảng PL3. 4. Hàm lƣợng polyphenol tổng số của dịch chiết từ lá giang Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết tới hàm lƣợng polyphenol tổng số Nhiệt độ chiết(oC) 40 50 60 70 80 Mẫu 1 0.7962 0.8891 1.0066 1.0141 1.0267 Mẫu 2 0.7737 0.8936 0.9895 1.0103 1.0318 Mẫu 3 0.7756 0.8822 0.9902 1.0152 1.0261 x1 0.741284 0.835984 0.955759 0.963405 0.976249 x2 0.718349 0.840571 0.938328 0.959531 0.981448 x3 0.720285 0.82895 0.939042 0.964526 0.975637 74.12844 83.59837 95.57594 96.34047 97.62487 71.83486 84.05708 93.83282 95.95311 98.14475 72.02854 82.89501 93.90418 96.4526 97.56371 72.66395 83.51682 94.43765 96.24873 97.77778 1.271979 0.585316 0.986437 0.262079 0.319275 Chất khô lần 1 (mg GAE/g NL khô) Chất khô lần 2 (mg GAE/g NL khô) Chất khô lần 3 (mg GAE/g NL khô) Trung bình Độ lệch chuẩn 8 PL Bảng PL3. 5. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang Năng lực khử đo ở bƣớc sóng 700 nm Thể tích mẫu thử 800microlit Nhiệt độ(oC) 40 50 60 70 80 0.791 0.8652 0.9833 0.9902 1.0147 0.7821 0.8763 0.9914 1.0017 1.0226 lần 3 0.7852 0.866 0.9865 0.9907 1.0205 Trung bình 0.7861 0.869167 0.987067 0.9942 1.019267 0.004518 0.006191 0.00408 0.0065 0.004092 Độ hấp thụ lần 1 Độ hấp thụ lần 2 Độ hấp thụ Độ lệch chuẩn Bảng PL3. 6.Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang Chống oxyhóa Khả năng khử gốc tự do DPPH đo ở bƣớc sóng 517 nm, 20 microlit mẫu. Control 400C 500C 600C 700C 800C 1 0.1968 0.0869 0.0802 0.0611 0.0572 0.0589 2 0.1989 0.09 0.0783 0.0598 0.0595 0.0612 3 0.1973 0.0856 0.0795 0.0602 0.0577 0.0591 Tỷ lệ khử lần 1 55.8435 59.24797 Tỷ lệ khử lần 2 54.75113 60.63348 69.93464 70.08547 69.23077 Tỷ lệ khử lần 3 56.61429 59.70603 69.48809 Tỷ lệ khử trung bình 55.73631 59.86249 69.45866 70.59187 69.78251 Độ lệch chuẩn 0.936194 0.705886 0.491356 0.447675 Mẫu 68.95325 70.93496 70.07114 70.7552 70.04562 0.47799 9 PL  Sự ảnh hƣởng của thời gian chiết đến dịch chiết thu đƣợc Bảng PL3. 7. Hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết từ lá giang Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng Polyphenol tổng số, độ hấp thụ đo ở bƣớc sóng 760 nm Thời gian 10 30 50 70 90 120 Lần 1 0.6853 0.9332 0.9906 0.9952 1.0106 1.0262 Lần 2 0.6578 0.9204 0.9844 0.9918 1.0122 1.0138 Lần 3 0.6685 0.9257 0.9877 0.9942 1.0105 1.0185 62.82365 88.09378 93.94495 94.41386 95.98369 97.5739 60.02039 86.78899 93.31295 94.06728 96.14679 96.30989 61.11111 87.32926 93.64934 94.31193 95.9735 96.78899 61.31838 87.40401 93.63575 94.26436 96.03466 96.89093 1.413078 0.178122 0.097242 0.638144 chiết (phút) Chất khô (mg GAE/g NL khô) lần 1 Chất khô (mg GAE/g NL khô) lần 2 Chất khô (mg GAE/g NL khô) lần 3 Chất khô trung bình (mg GAE/g NL khô) Độ lệch chuẩn 0.6556 0.316223 10 PL Bảng PL3. 8. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang Ảnh hƣởng của thời gian chiết đến năng lực khử của dịch chiết lá giang Năng lực khử đo ở bƣớc sóng 700 nm Thể tích mẫu thử 800 microlit Thời gian 10 phút 30 phút 50 phút 70 phút 90 phút 120 phút Lần 1 0.53 0.6522 0.8211 0.8931 0.9866 1.0012 Lần 2 0.5298 0.6614 0.842 0.8892 0.9916 1.0137 Lần 3 0.5317 0.6588 0.8299 0.8945 0.9902 1.0214 0.5305 0.657467 0.831 0.892267 0.989467 1.0121 0.001044 0.004743 0.010493 0.002747 0.002579 0.010195 Trung bình Độ lệch chuẩn Bảng PL3. 9. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang Ảnh hƣởng của thời gian chiết tới khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang, đo ở bƣớc sóng 517 nm Thơpì gian 10 phút 30 phút 50 phút 70 phút 90 phút 120 phút Lần 1 0.1027 0.0836 0.0732 0.0695 0.0602 0.0611 0.1988 Lần 2 0.1046 0.0865 0.0748 0.0646 0.0599 0.0583 0.1954 Lần 3 0.1047 0.0842 0.0744 0.0642 0.058 0.0601 0.1986 Tỷ lệ khử lần 1 48.34004 57.94769 63.17907 65.04024 69.71831 69.26559 Tỷ lệ khử lần 2 46.46878 55.73183 61.71955 66.93961 69.34493 70.16377 Tỷ lệ khử lần 3 47.28097 57.60322 62.53776 67.67372 70.79557 69.73817 Tỷ lệ khử trung bình Độ lệch chuẩn 47.36 0.93834 57.09 62.48 66.55 1.19239 0.731547 1.359026 69.95 69.72 0.753242 0.449291 Control 11 PL  Sự ảnh hƣởng của số lần chiết tới dịch chiết thu đƣợc Bảng PL3.10.Hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết từ lá giang Lần chiết Lần 1 Đo lần 1 1.0066 0.4216 0.126 Đo lần 2 0.9895 0.4109 0.1033 Đo lần 3 0.9902 0.4267 0.1064 Chất khô (mg GAE/ g NL khô) 95.57594 35.94292 5.810398 Chất khô (mg GAE/ g NL khô) 93.83282 34.85219 3.496432 Chất khô (mg GAE/ g NL khô) 93.90418 36.46279 3.812436 94.43765 35.75263 4.373089 0.986437 0.821988 1.254734 Chất khô trung bình (mg GAE/ g NL khô) Độ lệch chuẩn Lần 2 Lần 3 Bảng PL3.11.Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang Khả năng khử gốc tự do DPPH đo ở bƣớc sóng 517 nm Control Lần 1 Lần 2 Lần 3 0.1982 0.0611 0.1059 0.1381 0.1931 0.0642 0.106 0.1402 0.1929 0.0635 0.0985 0.1398 Tỷ lệ khử DPPH 69.17255 46.56912 30.32291 Tỷ lệ khử DPPH 66.75298 45.10616 27.39513 Tỷ lệ khử DPPH 67.08139 48.93727 27.52722 Tỷ lệ khử DPPH trung bình 67.66897 46.87085 28.41508 Độ lệch chuẩn 1.312451 1.933296 1.653541 12 PL  Sự ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết tới dịch chiết thu đƣợc Bảng PL3.12.Hàm lƣợng polyphenol của dịch chiết từ lá giang Ảnh hƣởng của phƣơng pháp chiết tới hàm lƣợng polyphenol (mg GAE/g NL khô) Mẫu Thƣờng Siêu âm 1 1.0066 1.1082 2 0.9895 1.0256 3 0.9902 1.103 Chất khô 1 95.57594 Chất khô 2 93.83282 97.51274 Chất khô 3 93.90418 105.4027 Trung bình 94.43765 102.9494 Độ lệch chuẩn 0.330528 4.037866 Bảng PL3.13.Tổng năng lực khử của dịch chiết từ lá giang Tổng năng lực khử đo ở bƣớc sóng 517 nm, thể tích mẫu thử 800 microlit Mẫu Thƣờng Siêu âm Lần 1 1.0066 1.2635 Lần 2 0.9895 1.2146 Lần 3 0.9902 1.2557 Năng lực khử trung bình 0.995433 1.2446 Độ lệch chuẩn 0.009677 0.026272 13 PL  Sự ảnh hƣởng của phƣơng pháp bảo quản đến dịch chiết thu đƣợc Bảng PL3.14.Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết lá giang Khả năng khử gốc tự do DPPH Mẫu Thƣờng Siêu âm Control 1 0.0623 0.0532 0.1963 2 0.0643 0.0562 0.1937 3 0.0625 0.0598 0.1981 Tỷ lệ khử DPPH lần 1 68.26286 72.89862 Tỷ lệ khử DPPH lần 2 66.80434 70.98606 Tỷ lệ khử DPPH lần 3 68.45028 69.81323 bình 67.83916 71.23264 Độ lệch chuẩn 0.901068 1.557409 Tỷ lệ khử DPPH trung Bảng PL3.15. Hàm lƣợng polyphenol tổng của dich chiết lá giang ở điều kiện và thời gian bảo quản Phƣơng Ngày pháp bảo bảo quản quản Bƣớc sóng hấp thụ (nm) Giá trị Hàm lƣợng Độ lệch Lần 1 trung polyphenol chuẩn bình (nm) trung bình (mg Lần 2 Lần 3 (ngày) Bảo quản GAE/g NL khô) 1 1.0066 0.9895 0.9902 0.995433 94.43765 0.986437 2 0.9856 0.9935 0.9971 0.992067 93.37071 1.270344 3 0.9762 0.9711 0.9631 0.978033 91.85865 0.673117 4 0.9512 0.9419 0.9602 0.9587 89.91845 0.932763 5 0.9128 0.9146 0.9109 0.932267 86.01087 0.188606 6 0.8932 0.9014 0.8871 0.8939 82.43289 2.225874 Bảo quản 1 1.0066 0.9895 0.9902 0.995433 94.43765 0.986437 thƣờng 2 0.9215 0.9356 0.9475 0.934867 88.26368 1.326759 lạnh (4oC) 14 PL 3 0.8547 0.8591 0.8629 0.8589 80.51988 0.418314 4 0.7856 0.7936 0.7899 0.7897 73.46585 0.408129 5 0.7211 0.7189 0.7219 0.720633 66.42542 0.158358 6 0.6329 0.6511 0.6492 0.622833 56.456 1.019827 Bảng PL 3.16 Ảnh hƣởng của điều kiện, thời gian bảo quản đến khả năng khử gốc tự do DPPH Bảo quản lạnh Ngày Tỷ lệ trung Độ lệch Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 bình (%) chuẩn 1 0.0598 0.0602 0.0614 69.88922 69.68781 2 0.0612 0.0624 0.0675 68.69565 68.08184 3 0.0689 0.0715 0.0618 63.56425 62.18932 4 0.0766 0.0756 0.0731 60.79836 61.31013 5 0.081 0.0835 0.0822 59.02883 57.76429 6 0.0853 0.0861 0.0873 54.772 54.34783 Tỷ lệ trung Độ lệch Bảo quản thƣờng Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 bình (%) chuẩn 1 0.0598 0.0602 0.0614 69.88922 69.68781 2 0.0711 0.0697 0.0692 63.63171 64.34783 3 0.0749 0.0755 0.0768 60.39133 60.07403 4 0.0872 0.0861 0.0847 55.37359 55.93654 5 0.0954 0.0974 0.0946 51.74507 50.73343 6 0.0996 0.096 0.0985 47.18982 49.09862 Ngày [...]... lá giang - Nghiên cứu ảnh hƣởng của số lần chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang - Nghiên cứu ảnh hƣởng của sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang - Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện và thời gian bảo quản đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang. .. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi chiết (ethanol trong nƣớc) đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang 4 - Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang - Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá. .. cứu này đánh giá sự ảnh hƣởng của dung môi chiết, điều kiện chiết đến hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của lá giang thu hoạch ở Khánh Hòa Nghiên cứu này cũng so sánh hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của lá và thân cây giang Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy sự thay đổi của hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa trong các điều kiện bảo quản khác nhau 2 Mục đích của. .. của nghiên cứu - Tìm ra đƣợc điều kiện chiết thích hợp (nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu…) để thu đƣợc dịch chiết từ lá giang có hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa cao - Đánh giá đƣợc hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá giang thu hái tại Khánh Hóa - Đánh giá đƣợc sự thay đổi của hàm lƣợng polyphenol tổng số và khả năng chống. .. của chúng nhƣ: - Nghiên cứu của Anesini và cộng sự (2003) [26] nghiên cứu hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của trà (Camellia sinensis) - Nghiên cứu của Chakraborty và cộng sự (2013) [39] xác định hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa từ rong nâu - Nghiên cứu của Trƣơng Thị Thƣơng (2011) [23] xác định động thái biến đổi hợp chất polyohenol và khả năng chống oxy hóa của quả sim thu... quả Lá giang có khả năng ứng dụng cao, mang lại thu nhập cho ngƣời dân nếu biết cách tận dụng nguồn cây leo này Xuất phát từ những vấn đề trên cùng với sự hƣớng dẫn của thầy Nguyễn Thế Hân và thầy Nguyễn Anh Tuấn, em đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện chiết và bảo quản đến hàm lƣợng polyphenol và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ lá giang (Aganonerion polymorphum) , nghiên. .. chống oxy hóa của dịch chiết lá giang trong thời gian bảo quản - Đánh giá đƣợc hàm lƣợng polyphenol trên các bộ phận lá và thân cây lá giang để tiến hành tách chiết có hiệu quả 3 3 Ý nghĩa của đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học: - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để khẳng định một số hoạt tính y dƣợc từ thực vật nói chung và cây lá giang nói riêng - Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên. .. chúng có khả năng nhận các gốc tự do tức là có khả năng dập tắt các quà trình tạo ra gốc tự do Ngoài ra polyphenol còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm nhiều polyphenol có hoạt tính vitamine P, nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và chuẩn hóa tính thẩm thấu của vi ti huyết quản Hiện nay kể cả trong nƣớc và ngoài nƣớc nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol có khả năng chống oxy hóa của chúng... chế…Theo nghiên cứu của Sakong tiến hành trên đối tƣợng lá giang thu thập ở Thái Lan thì hàm lƣợng polyphenol và vitamin C trong lá giang chứa một lƣợng rất lớn (polyphenol: 647.05  5.87mg GAE/100g NL khô, 6.92  0.2 mg GAE/100g NL khô) [103], đây là những hợp chất quý và đóng vai trò quan trọng vào quá trình chống oxy hóa Cho đến nay chƣa có công trình nào công bố về khả năng chống oxy hóa của lá giang. .. chống oxy hóa (theo nhƣ cách đo của ORAC) đã tìm thấy mức độ đáng kể của nho xanh và nho; khả năng chống oxy hóa của nho đỏ là 2016 trong khi của nho xanh là 1789 Nho chứa một hợp chất polyphenol phong phú bao gồm các Flanvoratrol dƣợc biết đến nhƣ là chất chống oxy hóa và có đặc tính chống viêm nhiễm 25 - A-ti-sô: Cung cấp một lƣợng đáng kể chất chống oxy hóa Trong đó silymarin là chất chống oxy hóa ... số khả chống oxy hóa dịch chiết từ giang - Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiết đến hàm lƣợng polyphenol tổng số khả chống oxy hóa dịch chiết từ giang - Nghiên cứu ảnh hƣởng số lần chiết đến hàm. .. Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện chiết bảo quản đến hàm lƣợng polyphenol khả chống oxy hóa dịch chiết từ giang (Aganonerion polymorphum) , nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng dung môi chiết, điều kiện chiết. .. lƣợng polyphenol tổng số khả chống oxy hóa dịch chiết từ giang - Nghiên cứu ảnh hƣởng sóng siêu âm đến hàm lƣợng polyphenol tổng số khả chống oxy hóa dịch chiết từ giang - Nghiên cứu ảnh hƣởng điều