TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN QUỐC CƯỜNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA GÀ TÀU VÀNG ĐỐI VỚI VACCINE LASOTA PHÒNG BỆNH NEWCASTLE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y CẦN THƠ - 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHÀNH THÚ Y KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA GÀ TÀU VÀNG ĐỐI VỚI VACCINE LASOTA PHÒNG BỆNH NEWCASTLE Giáo viên hướng dẫn : Ths. Bùi Thị Lê Minh Sinh viên thực hiện : Nguyễn Quốc Cường MSSV : LT11645 Lớp : CN1167L1 Cần Thơ - 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y ---Đề tài “Khảo sát khả năng đáp ứng miễn của gà Tàu Vàng đối với vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle” Do sinh viên Nguyễn Quốc Cường thực hiện tại Cần Thơ từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013. Cần Thơ, ngày tháng Duyệt Bộ môn năm 2013 Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Duyệt Giáo viên hướng dẫn ThS. Bùi Thị Lê Minh Cần Thơ, ngày … tháng … năm …. Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Tác giả luận văn Nguyễn Quốc Cường ii LỜI CẢM TẠ Trải qua quá trình dài học tập và nghiên cứu của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Ngoài ra tôi còn nhận được sự ủng hộ, chia sẻ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và của quý Thầy Cô! Trước hết con xin ghi nhớ mãi công ơn sinh thành và nuôi dưỡng của cha mẹ, sự giúp đỡ, ủng hộ động viên của ông bà cùng tất cả những người thân trong suốt thời gian sống và học tập. Tôi xin chân thành biết ơn sự hướng dẫn tận tình của cô Bùi Thị Lê Minh là giáo viên hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này. Ngoài ra còn cùng với sự hỗ trợ, giúp đỡ nhiệt tình của thầy Trần Ngọc Bích và cô Huỳnh Ngọc Trang đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Chân thành cảm ơn gia đình chú ba Hoàng quản lý trại đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài này dưới trại. Đồng thời, xin cám ơn đến các bạn lớp Thú Y LTK37 đã giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong suốt những năm học vừa qua. Xin kính gởi đến quí Thầy, Cô, các anh chị, người thân và bạn bè tôi lời chúc sức khỏe, thành công và nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc. Tôi xin chân thành cám ơn! Nguyễn Quốc Cường iii MỤC LỤC Trang Trang duyệt .. ................................................................................................................i Lời cam đoan .............................................................................................................. ii Lời cảm tạ .... ............................................................................................................. iii Mục lục ........ ..............................................................................................................iv Danh mục bảng ............................................................................................................v Danh mục hình ............................................................................................................vi Danh sách biểu đồ ..................................................................................................... vii Danh mục chữ viết tắt .............................................................................................. viii Tóm lược ...... ..............................................................................................................ix CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................1 CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN ..................................................................................2 2.1 Sơ lược tình hình nghiên cứu bệnh Newcastle ................... .......................2 2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới ...............................................2 2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................2 2.2 Căn bệnh học .............................................................................................. 3 2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus Newcsate .....................4 2.2.2 Tính chất sinh học.........................................................................4 2.3 Miễn dịch chống bệnh Newcastle ............................................................... 6 2.3.1 Miễn dịch tế bào ...........................................................................7 2.3.2 Miễn dịch dịch thể ........................................................................7 2.3.3 Miễn dịch tại chổ ..........................................................................7 2.3.4 Miễn dịch thụ động .......................................................................7 2.3.5 Ức chế đáp ứng miễn dịch ............................................................8 2.4 Vaccine phòng bệnh Newcastle ..................................................................8 2.5 Sơ lược về giống gà thí nghiệm ................................................................ 10 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................12 3.1 Nội dung nghiên cứu ................................................................................12 3.2 Phương tiện thí nghiệm.............................................................................12 3.2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu ............................ 12 3.2.2 Vật liệu thí nghệm ......................................................................12 3.3 Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................13 3.3.1 Chuẩn bị nuôi gà để thí nghiệm ..................................................13 3.3.2 Bố trí thí nghiệm .........................................................................14 3.3.3 Qui trình thực hiện phản ứng HA ...............................................17 3.3.4 Qui trình thực hiện phản ứng HI ................................................18 3.4 Phương pháp phân tích số liệu ..................................................................19 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 20 4.1 Kết quả kháng thể thụ động của gà Tàu Vàng ..........................................20 4.2 Đánh giá khả năng bảo hộ của 2 loại vaccine Newcastle .........................21 iv 4.3 Trọng lượng và tăng trọng của gà Tàu Vàng thí nghiệm .........................22 4.4 Đánh giá chỉ tiêu bạch cầu của gà Tàu Vàng đối với vaccine Lasota ......24 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................25 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................26 PHỤ LỤC .... .............................................................................................................29 v DANH MỤC BẢNG 3.1 Quy trình phòng bệnh bằng vaccine ....................................................................14 3.2 Bố trí thí nghiệm với vaccine Newcastle Trên gà Tàu Vàng .............................. 14 3.3 Trình tự tiến hành thực hiện phản ứng HA ..........................................................17 3.4 Trình tự tiến hành thực hiện phản ứng HI ...........................................................18 4.1 Kết quả kháng thể thụ động của gà Tàu Vàng .....................................................20 4.2 Kết quả kháng thể xuất hiện 14 ngày sau khi tiêm vaccine lần hai .....................21 4.3 Kết quả kháng thể xuất hiện 28 ngày sau khi tiêm vaccine lần hai .....................21 4.4 Kết quả kháng thể xuất hiện 75 ngày tuổi ..........................................................22 4.5 Trọng lượng của gà tàu vàng trong thí nghiệm ...................................................22 4.7 Tăng trọng của gà tàu vàng trong thí nghiệm ......................................................23 4.8 Hệ số chuyển hóa thức ăn ....................................................................................23 4.9 Kết quả bạch cầu của gà Tàu Vàng ở hai nghiệm thức .......................................24 vi DANH SÁCH HÌNH 2.1 Mô hình cấu trúc Paramyxovirus ..........................................................................4 2.2 Gà Tàu Vàng ........................................................................................................11 3.1 Vacine Newcastle chủng lasota ...........................................................................12 3.2 Úm gà con thí nghiệm ..........................................................................................13 3.3 Chủng ngừa vaccine cho gà .................................................................................15 3.4 Lấy máu tim trên gà ............................................................................................. 15 3.5 Cân gà khi kết thúc thí nghiệm ............................................................................16 3.6 Kết quả phản ứng HI ............................................................................................ 19 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT F HI HA HN ICPI IVPI L M MDT ND NDV P PBS PPMV-1 VVND : Fusion Protein : Hemagglutination inhibition test : Hemagglutionation. : Hemagglutinin Neuraminidase : Intra Cerebral Pathogenicity Index : Intra Venous Pathogenicity Index : Large : Matrix : Mean Dead Time : Newcastle disease : Newcastle disease virus : Phosphoprotein : Phosphate Buffer Saline : Pigeon Paramyxovirus Type 1 : Viscerotropic Velogenic Newcastle Disease FAO GMT ELD50 OIE : Food agriculture orgainzation : Geometric Mean titer : Embryo lethal 50 pecent dose : Office international of epizotics viii TÓM LƯỢC Đề tài “Khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch của gà Tàu Vàng đối với vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle” được tiến hành từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013, tại trại chăn nuôi Ba Hoàng quận Bình Thủy Thành Phố Cần Thơ. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẩu nhiên với hai nghiệm thức trên giống Tàu Vàng, đáp ứng miễn dịch của gà sau khi chủng vaccine Lasota được đánh giá bằng phương pháp huyết thanh học để xác định hàm lượng kháng thể. Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau: Tỷ lệ kháng thể bảo hộ của vaccine Lasota lúc gà 35 ngày tuổi và 49 ngày tuổi là 80% . Tỷ lệ bảo hộ của vaccine Lasota đến 75 ngày tuổi giảm còn 60% không còn khả năng bảo hộ với bệnh Newcastle. Hiệu giá kháng thể lúc gà 35 ngày tuổi là 21.1, 49 ngày tuổi là 10.58 và 75 ngày tuổi là 6.10. Khả năng đáp ứng miễn dịch vaccine Lasota đủ bảo hộ gà đến 49 ngày tuổi. Tăng trọng của gà Tàu Vàng từ 0-3 tuần tuổi giữa hai nghiệm thức dao động từ 4.05g/con đến 5.43g/con. Giai đoạn 3-6 tuần tuổi tăng trọng của gà ở hai nghiệm thức đạt cao nhất với NT1 là 15.86g/con, NT2 là 20.58g/con đến giai đoạn 6-12 tuần tuổi tăng trọng của gà đều giảm ở hai nghiệm thức NT1 là 13.60g/con, NT2 là 15.77g/con. Hàm lượng bạch cầu trước khi tiêm vaccine là 29,132 x 103/mm3 và sau khi tiêm vaccine gà được10 ngày tuổi và 24 ngày tuổi lần lược là 26,656 x 103/mm3, 27,254 x 103/mm3. ix CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nước ta hiện nay, ngành chăn nuôi gà ngày càng phát triển với các hình thức chăn nuôi công nghiệp qui mô lớn đã góp phần cung cấp một lượng lớn thực phẩm cho con người đồng thời cũng mang lại nhiều thu nhập. Tuy nhiên, dịch bệnh là điều đáng lo ngại, gây tổn thất cho nhà chăn nuôi đặc biệt là những bệnh do virus gây ra vì chưa có thuốc đặc trị. Hiện nay, ngoài bệnh cúm thì bệnh Newcastle cũng xảy ra rất thường xuyên và gây thiệt hại lớn cho nghành chăn nuôi gà. Bệnh Newcastle do một loại paramyxovirus gây ra, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi của gà và tỷ lệ chết có thể lên đến 100% (OIE, 2008), gà bệnh có những triệu chứng về hô hấp, tiêu hóa và thần kinh. Do đó, việc sử dụng vaccine để phòng bệnh Newcastle là điều cần thiết. Trên thị trường hiện nay, có nhiều loại vaccine phòng bệnh Newcastle cho gà được sản xuất. Hiệu quả phòng bệnh của các loại vaccine này là một yếu tố chọn lựa của nhà chăn nuôi. Tuy nhiên, thông tin về mức bảo hộ của các loại vaccine chưa nhiều, do đó chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch của gà Tàu Vàng đối với vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle” nhằm khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch và khả năng tăng trọng của gà Tàu Vàng sau khi tiêm phòng vaccine Lasota (Navetco) đồng thời khảo sát sự thay đổi hàm lượng bạch cầu trước và sau khi tiêm vaccine. 1 CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Newcastle trên thới giới và trong nước 2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thới giới Bệnh Newcastle xảy ra lần đầu tiên vào năm 1926 tại Java, Indonesia (Kraneveid, 1926) và ở Newcastle –upon – Tyne, Anh (Dolye, 1927). Từ đó, Doyle đã đặt tên là bệnh Newcastle để tránh nhầm lẫn với các bệnh khác. Sau đó, có nhiều báo cáo về sự bùng phát bệnh ở Châu Âu giống như những gì người ta biết về bệnh Newcastle đã từng xảy ra trước đó vào năm 1926 (Halasz, 1912). Ochi và Hashimoto cho rằng bệnh có thể xảy ra sớm hơn ở Hàn Quốc vào năm 1924 (Levine, 1964). Năm 1935, Doly mô tả căn bệnh Newcastle là bệnh truyền nhiễm cấp tính với các bệnh tích chủ yếu là xuất huyết ở đường tiêu hóa. Đặc trưng của bệnh là do virus gây bệnh có tính hướng nội tạng. Bệnh do các chủng độc lực cao Velogenic gây ra, bệnh còn được gọi tên là Viscerotropic Velogenc Newcastle Disease. Bệnh Newcastle còn được mô tả ở thể cấp tính với bệnh tích đặc trưng ở đường hô hấp và thần kinh nên được gọi là neurotropic Newcastle, thể bệnh này cũng do các chủng cường độc gây ra (Beach,1944). Năm 1946, Beaudetta và Black mô tả bệnh ở thể cấp tính với bệnh tích xuất huyết ở đường hô hấp và thần kinh. Bệnh xảy ra chủ yếu ở gà con, gà lớn có tỷ lệ chết thấp, bệnh do các chủng virus thuộc nhóm mesogenic gây ra. Năm 1948, Hitchner và Johnson mô tả bệnh xảy ra ở thể nhẹ với triệu chứng hô hấp, có tỷ lệ chết thấp, bệnh do chủng độc lực yếu gây ra. Đầu năm 1960, có nhiều báo cáo về việc sử dụng vaccine để chống lại chủng virus có độc lực cao ở vùng Trung Đông (Chu và Rizk,1971). Theo ghi nhận của Walker et al.,(1973), ở Mỹ đã áp dụng thành công chương trình phòng bệnh ở miền Nam California. Bệnh đã khống chế thông qua việc tiêu hủy những chim bệnh và quản lý chặt chẽ việc tiêm phòng những loại gia cầm mẫn cảm với bệnh. Tại đảo Western của Scotland năm 1986, một trận dịch xảy ra làm chết toàn bộ gà ở đây, người ta tìm thấy chủng virus gây bệnh Newcastle trên đàn gà địa phương (Saif, 2008). 2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, bệnh Newcastle đã có từ rất lâu ở khắp hai miền Nam Bắc. Trong thời kỳ Pháp thuộc, bệnh được gọi là dịch tả gà. Năm 1933, Phạm Văn Huyến có mô tả một bệnh dịch tả gà mà tác giả gọi là dịch tả gà giả. Năm 1938, Vittoz 2 báo cáo về một bệnh mà tác giả gọi là “dịch tả gà giả Nam bộ” (Dương Nghĩa Quốc, 1997). Tuy nhiên, bệnh được chính thức ghi nhận qua chẩn đoánở phòng thí nghiệm vào năm 1949. Từ đó, bệnh Newcastle được xem là bệnh gây tác hại lớn nhất đối với nền chăn nuôi gà ở Việt Nam (Trần Đình Từ và ctv, 1998). Năm 1956, Nguyễn Văn Lương và Neter đã chẩn đoán được những gà bệnh ở miền Nam là do Newcastle. Cũng trong thời gian này ở miền Bắc, Trần Quang Nhiên và Nguyễn Văn Lương (1956), đã xác định bệnh Newcastle xảy ra rất phổ biến ở nhiều tỉnh thuộc miền Bắc và đã nghiên cứu vaccine phòng bệnh này (Dương Nghĩa Quốc, 1997). Các kết quả nghiên cứu về bệnh Newcastle và áp dụng vaccine phòng bệnh do hai nhà khoa học Nguyễn Bá Huệ và Nguyễn Thu Hồng thực hiện vào thập niên 80 ở viện Thú Y đã phân lập nhiều chủng virus Newcastle từ các ổ dịch ở các trại gà nuôi công nghiệp và gà nuôi thả trong đàn. Hai tác giả này cũng nghiên cứu áp dụng vaccine Lasota bằng các phương pháp cho uống và cho ăn (Nguyễn Trường Giỏi, 1999). Năm 1981, Trần Đình Từ và cộng tác đã nghiên cứu độc lực của các chủng virus Newcastle và có kết luận rằng chủng hệ I2 có nhiều đặc tính tương đồng với chủng Mukterwar (trích dẫn Dương Nghĩa Quốc, 1997). Việc sử dụng vaccine để khống chế bệnh Newcastle được thực hiện vào nhũng năm 1960. Ở thời điểm này, gia cầm được chủng ngừa bằng vaccine virus sống nhược độc, đông khô. Gần đây, phát triển vaccine Newcastle chịu nhiệt được sản xuất từ chủng V4 và I2. Năm 1999, gần 8000 liều vaccine chịu nhiệt đã được Công Ty Navetco sản xuất và cung cấp trên thị trường (Trần Đình Từ, 2005). Nguyen Đinh Quat et al (2004) thử hiệu lực của vaccine chụi nhiệt chủng I2 trên cút nuôi thịt. Kết quả này cho thấy, chim cút có đáp ứng kháng thể thấp hơn so với gà được chủng vaccine này ( trích dẫn Nguyễn Hải Ngân, 2010). Nghiên cứu của Phạm Văn Tự et al (2006) về ảnh hưởng của aflatoxin B1 có trong thức ăn đến đáp ứng miễn dịch của gà công nghiệp đối với bệnh Newcastle, kết quả cho thấy aflatoxin B1 làm giảm đáp ứng miễn dịch của gà đối với bệnh Newcatle. Nghiên cứu của Hồ Thị Việt Thu (2012) so sánh hiệu quả các loại vaccine và đường cấp vaccine trong việc phòng bệnh Newcaste. Kết quả vaccine chủng Lasota cho đáp ứng kháng thể nhanh hơn so với vaccine chủng F, gà con được cấp vaccine qua đường nhỏ mắt cao hơn ở gà được cấp vaccine qua đường uống. Vaccine chủng M cho gà lớn (>60 ngày tuổi) được cấp qua đường tiêm bắp có đáp ứng kháng thể cao hơn so với cấp vaccine qua đường tiêm dưới da. 2.2 Căn bệnh học Virus gây bệnh Newcastle là một Paramyxovirus và trong thời gian dài được coi là một Avian Paramyxovirus duy nhất. Tuy nhiên gần đây, một loạt Avian Paramyxovirus khác được phát hiện. Có 9 serotype đã được xác định ký hiệu 3 từ PMV1 đến PMV9. Virus gây bệnh Newcastle (Newcastle disease virusNDV) thuộc PMV1. 2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus Newcastle Paramyxovirus là một loại virus đa hình thái, ở dạng hình cầu và có kích thước khoảng 100-500nm, ở dạng hình sợi có kích thước chiều ngang khoảng 100nm với chiều dài thay đổi. Hình thái của virus biến đổi theo nồng độ muối của môi trường sống (Nguyễn Đức Hiền, 2011). Bộ gen là một phân tử ARN, một chuỗi âm có trọng lượng phân tử khoảng 5.106 Dalton, chiếm 5% trọng lượng của tiểu thể virus. Virus Newcastle chứa ít nhất 6 protein đặc hiệu; trong đó, có hai kháng nguyên bề mặt là haemagglutinin-neuaminidase (HN) protein và fusion (F) protein, bốn kháng nguyên nằm bên trong là polymerase (L) protein, nucleocapsid (N) protein, phosphoprotein (P) protein và matrit (M) protein. Hình 2.1 Mô hình cấu trúc Paramyxovirus (Nguồn: http://viralzone.expasy.org/all_by_species/84.html) 2.2.2 Tính chất sinh học Đặc tính kháng nguyên Virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu hemagglutination (HA). Đặc tính gây ngưng kết hồng cầu là do sự liên kết giữa protein với các thụ thể có trên bề mặt hồng cầu.Tính chất này và sự ức chế đặc hiệu ngưng kết hồng cầu hemagglunation inhibition (HI) bởi kháng huyết thanh là một công cụ trong chẩn đoán bệnh Newcastle. Kháng nguyên HN có chứa hemagglutinin và neuraminidase. Enzyme neuraminidase có mặt ở tất cả các thành viên của nhóm paramyxovirus, enzyme này có tác dụng làm tách dần các hồng cầu đã ngưng kết. Còn kháng nguyên F gắn liền với sự phản ứng của virus đối với các tế bào đích và kháng thể trung hòa. Các kháng nguyên HN và F, khi mới tạo thành chưa có hoạt tính và nó chỉ thể hiện hoạt tính sau khi bị phân cắt bởi các protease của tế bào chủ. 4 Đặc tính gây bệnh và độc lực của virus Các chủng virus Newcastle khá đồng nhất về tính kháng nguyên nhưng lại rất khác nhau về khả năng gây bệnh. Khả năng này thay đổi từ những chủng gây ra thể quá cấp với tỷ lệ chết 100% đàn gà đến những chủng hoàn toàn không gây bệnh khi chúng lan truyền trong điều kiện tự nhiên. Bên cạnh đó, các yếu tố khác như tuổi, tình hình sức khỏe, trạng thái miễn dịch cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết hoặc triệu chứng lâm sàn của gà (OIE, 2009). Trong tự nhiên, virus Newcastle có biểu hiện độc lực ở những mức độ khác nhau. Có những ổ dịch xảy ra rất nặng, tỷ lệ chết cao và bệnh tích rất điển hình nhưng cũng có những ổ dịch xảy ra rất nhẹ, tỷ lệ chết không đáng kể, độc lực của Newcastle ở Châu Á và Châu Âu thường cao hơn Bắc Mỹ (Nguyễn Trường Giỏi, 1999). Hiện nay, người ta đã phân loại được nhiều chủng Newcastle, các chủng khác nhau về độc lực nhưng giống nhau về tính kháng nguyên. Có 3 nhóm độc lực: - Nhóm cường độc (velogenic): được chia thành 2 nhóm phụ + Viscertropic velogenic: thường gây ra bệnh quá cấp tính, gây chết 100% gà với bệnh tích xuất huyết đường tiêu hóa. Chủng này gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi gà ở châu Á. + Neurotropic velogenic: dạng bệnh quá cấp tính, cũng gây chết 100% gà với triệu chứng thần kinh và hô hấp. - Nhóm độc lực vừa (mesogenic): gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính và đôi khi có triệu chứng thần kinh, có thể gây chết 50% đàn gà, làm giảm tỷ lệ đẻ trứng. Những virus gây bệnh nhẹ cho gà trên 6 tuần tuổi như chủng H (Herforshire), chủng M (Mukteswar), hai chủng này khi tiêm cho phôi gà 10-11 ngày, làm chết phôi và xuất huyết toàn phôi thai. - Nhóm độc lực yếu (lentogenic): là các chủng có độc lực thấp như B1, Lasota và F, có thể làm giảm đẻ trứng nhưng ít gây chết trừ gà con mới nở không có kháng thể hoặc gà đang mắc bệnh khác, gây nhiễm trùng nhẹ ở gà con với triệu chứng chủ yếu ở đường hô hấp. Ngoài ra, còn có chủng V4 và Ulster khi gây nhiễm cho gà thì không có triệu chứng bệnh. Trong cùng một chủng virus Newcastle, độc lực của chúng có thể tăng lên do liều virus đưa vào cơ thể, đường đưa virus, tuổi gà và điều kiện ngoại cảnh. Gà càng nhỏ, tính thụ cảm với virus càng mạnh. Sự mẫn cảm của virus ít liên quan đến giống gà (Nguyễn Văn Khanh, 2011). Theo OIE (2000), để đánh giá độc lực của virus Newcastle ta có thể căn cứ vào các chỉ số sau đây: MDT (Mean dead Time): chỉ số thời gian gây chết phôi trung bình. 5 ELD50 (Embryo lethal dose): liều gây chết 50% phôi gà. ICPI (Intracerebral pathogenicity index): chỉ số gây chết khi tiêm vào não gà con một ngày tuổi. IVPI (Intravenous pathogenicity index): chỉ số gây chết khi tiêm vào tĩnh mạch gà 6 tuần tuổi. Virus xâm nhiễm qua niêm mạc hầu họng rồi vào máu. Khi vào cơ thể virus nhân lên tại chổ nhiễm và trong bạch cầu. Virus gây nhiễm trùng huyết, bại huyết và đi đến hầu hết các cơ quan của cơ thể đặc biệt là lách, gan, có ở buồng trứng, các noãn ở thời kỳ phát triển gây viêm hoại tử (Beaudette, 1946). Sau đó virus xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương. Nội mô thành huyết quản bị phá hủy gây xuất huyết và thâm nhiễm dịch thẩm xuất vào các xoang trong cơ thể (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007). Phần lớn bệnh ở thể cấp tính, gà thường chết trong thời kỳ nhiễm trùng huyết. Trong trường hợp bệnh kéo dài (thể mãn tính), virus xâm nhiễm vào hệ thần kinh trung ương. Sức đề kháng của virus Virus Newcastle có sức đề kháng tương đối yếu. Virus không thể tồn tại quá 24 giờ trong thịt thối rửa, trong phân, xác chết. Trong ổ rơm, nền chuồng, virus bị tiêu diệt mạnh. Trong điều kiện khô ráo virus có thể sống trong vài tháng. Nhiệt độ thấp có thể bảo quản virus trong thời gian dài Gough et al. (1988). Ở 1-2oC virus có thể tồn tại trong 3 tháng, ở -20oC virus có thể tồn tại trong 1 năm. Virus trong phôi gà bệnh được bảo quản ở trạng thái khô, lạnh có thể giữ được tính gây bệnh trong 2 năm. Trong tủy xương, thịt giữ lạnh, virus còn độc lực trong 6 tháng. Ở 100oC virus bị diệt trong 1 phút, ở 60oC virus trong 30 phút, ở 56oC độc lực của virus bị phá hủy trong 5 phút đến 6 giờ, ở 8oC đến 20oC phải nhiều tháng mới phá hủy được virus. Ở nhiệt độ bình thường, trong nước sinh lý, virus còn sống sau 3 tháng. Virus dễ bị tiêu diệt bởi các chất sát trùng như crezyl 5%, NaOH 2%. Một số hóa chất như formol, priolactone làm vô hoạt virus nhưng không làm thay đổi tính kháng nguyên của virus. Spalatin và Hanson (1976), đã chứng minh có sự thay đổi về tính bền với nhiệt của các chủng virus Newcastle và tính chất này đã được áp dụng trong nghiên cứu dịch tể học (Trần Đình Từ, 1998). Năm 1995, Glolam và Hanson đã chọn lọc được một chủng virus Newcastle chịu nhiệt dùng trong nghiên cứu tái tổ hợp virus. Phát hiện này đã gợi ý cho các nhà khoa học Úc phát triển virus Newcastle chịu nhiệt từ chủng V4. Vaccine này đã áp dụng thành công trong phòng bệnh Newcastle trên gà nuôi ở nông thôn của nhiều nước Đông Nam Á (Trần Đình Từ, 1998). 2.3 Miễn dịch chống bệnh Newcastle Ngày nay người ta biết rõ đáp ứng miễn dịch chống bệnh Newcastle gồm miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. 6 2.3.1 Miễn dịch tế bào Đáp ứng miễn dịch đầu tiên của cơ thể đối với sự nhiễm virus Newcastle là miễn dịch qua trung gian tế bào và có thể phát hiện vào ngày thứ 2-3 sau khi chủng vaccine. Điều này giải thích khả năng bảo hộ của gà hình thành rất sớm trước khi xuất hiện kháng thể. Miễn dịch qua trung gian tế bào là một bộ phận của cơ chế bảo vệ của gia cầm. Hàng rào bảo vệ niêm mạc bao gồm cả yếu tố tế bào của hệ thống miễn dịch và các kháng thể của dịch tiết. Một nghiên cứu gần đây (Reynolds và Maraqa, 2000) đã kết luận rằng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đối với bệnh Newcastle bởi đáp ứng này không đủ bảo hộ chống nguy cơ nhiễm virus Newcastle độc. Tuy nhiên, tầm quan trọng của miễn dịch trung gian tế bào trong sự bảo hộ vaccine thì không rõ lắm và một đáp ứng thứ cấp mạnh đối với mầm bệnh tương tự đáp ứng kháng thể dường như không xảy ra (Nguyễn Đức Hiền, 2011). 2.3.2 Miễn dịch dịch thể Trong thực tế người ta thường dùng xét nghiệm HI để đánh giá hiệu lực vaccine sau khi chủng (Allison et al., 2005). Lee và Hanson (1979) kháng thể xuất hiện trong huyết thanh của gà 6-10 ngày sau khi tiếp xúc với kháng nguyên. Kháng thể thường xuất hiện trong tuần đầu sau khi tiêm chủng vaccine nhưng đạt mức cao nhất vào tuần thứ hai và duy trì tới tuần thứ tư rồi giảm dần. Kháng thể có thể kéo dài một năm sau khi chủng vaccine mesogen (độc lực vừa), hoặc được tái chủng bằng vaccine lentogen (độc lực yếu). Nếu đàn gà mẹ được miễn dịch chắc chắn thì hàm lượng gà con nở ra có hàm lượng kháng thể ngang bằng lượng kháng thể trong máu gà mẹ (Heller et al., 1977). Theo Lâm Minh Thuận (2004), hàm lượng kháng thể thụ động ở gà con phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể mẹ truyền. 2.3.3 Miễn dịch tại chỗ Các kháng thể trong dịch tiết ở đường hô hấp và đường tiêu hóa của gà xuất hiện đồng thời với kháng thể trong máu. Ở đường hô hấp trên, các immunoglobulin (Ig) chủ yếu là IgA. Tương tự, sự tiết kháng thể ở tuyến Harder xảy ra sau khi nhỏ vaccine. Miễn dịch tại chỗ đống vai trò quan trọng bảo vệ các của xâm nhập tự nhiên của virus (Malkinon và Small, 1977). IgA được tạo ra khi chủng các loại vaccine sống, nhưng hình như không có đáp ứng thứ phát khi tái chủng vaccine. 2.3.4 Miễn dịch thụ động Kháng thể của gà mẹ có thể truyền cho gà con qua lòng đỏ trứng. Mức kháng thể ở gà con một ngày tuổi gần tương đương với hiệu giá kháng thể gà mẹ. Allan et al., (1974) đã ước lượng thời gian bán hủy của kháng thể thụ động khoảng 4-5 ngày. Kháng thể thụ động có tác dụng bảo vệ gà con trong những ngày đầu. Mặt khác, nó có thể làm giảm hiệu lực phòng bệnh của vaccine, do 7 vậy cần được xem xét khi xác định thời điểm chủng vaccine lần đầu cho gà con nhất là khi sử dụng vaccine virus sống. 2.3.5 Ức chế đáp ứng miễn dịch Sự ức chế đáp ứng miễn dịch có tác động quan trọng đến khả năng gây bệnh của các chủng virus gây bệnh Newcastle và mức bảo hộ được tạo thành bởi tiêm chủng dự phòng. Trong điều kiện tự nhiên, sự ức chế đáp ứng miễn dịch Newcastle có thể xảy ra do gà bị nhiễm các virus khác như Gumboro. Hậu quả thiếu hụt miễn dịch sẽ dẫn đến bệnh do virus gây bệnh Newcastle gây ra sẽ nghiêm trọng hơn và không đáp ứng đầy đủ với tiêm chủng vaccine (Faragher et al., 1974). 2.4 Vaccine phòng bệnh Newcastle Vaccine nhược độc Các chủng vaccine nhược độc phòng bệnh Newcastle được chia làm 3 nhóm. - Nhóm mesogenic gồm các chủng: Roakin, Mukteswar, Standard, Komarov. - Nhóm lentogenic gồm các chủng Lasota, Hichner B1. - Nhóm: Avirulent không độc lực gồm các chủng Ulster 2C, vaccine4, V4HR. Trong 3 nhóm trên thì 2 nhóm Mesogenic và Lentogenic là 2 nhóm truyền thống đã được sử dụng từ lâu ở nước ta và đã có kết quả đáng khích lệ trong việc hạn chế tác hại của bệnh Newcastle. Ngày nay các chủng thuộc nhóm Avirulent đang được thừa nhận và đang dần thay thế các nhóm truyền thống. Một số loại vaccine nhược độc đã được sử dụng ở nước ta - Vaccine F được điều chế tại Weybridge (Anh) năm 1975 được đưa sang Việt Nam (1956). Đây là một loại vaccine có độc lực thấp tạo miễn dịch yếu và không bền. Có thể dùng cho gà con một ngày tuổi. - Vaccine Newcastle chịu nhiệt chủng H4N4 đã được kiểm nghiệm và đưa vào sản xuất bước đầu cho những kết quả đáng khích lệ. Vaccine H4N4 có thể vận chuyển trong điều kiện bình thường đã tạo ra thuận lợi cho việc đưa về nông thôn. - Vaccine Mukteswar còn gọi là vaccine hệ I, vaccine dịch tả dùng cho gà lớn. Loại vaccine này có nguồn gốc từ Ấn Độ, nó có độc lực cao nhất trong các tất cả các loại vaccine sống tạo miễn dịch cao và bền. - Vaccine Herfordshire có độc lực thấp hơn chủng M và cũng tạo miễn dịch cao và bền. Vaccine này cũng có thể gây phản ứng cho gà trên 8 tuần tuổi và gà đang đẻ. - Vaccine K (Komarov) loại vaccine này có độc lực yếu hơn vaccine M nhưng có ưu điểm tạo miễn dịch nhanh sau 3 ngày tiêm chủng. 8 - Vaccine R (Roakin) được phân lập từ giống cường độc tự nhiên và làm giảm độc có nguồn gốc ở Mỹ. - Vaccine dạng đông khô (của công ty Navetco) được sản xuất từ virus nhược độc chủng Lasota, tạo miễn dịch mạnh và bền hơn chủng F. Mỗi liều vắcxin chứa ít nhất 106EID50 virus Newcastle chủng Lasota nhược độc. - Vaccine BAL-ND-IB (Bestar) vaccine sống dạng đông khô phòng bệnh Newcastle (ND) và bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm (IB). mỗi liều vaccine chứa 106.0EID50virus ND và 102.5EID50virus IB. - Ngoài ra còn các loại vaccine nhược độc có tên thương mại: Vaccine Pestos, Sotasee, Bipetos. Được nhập từ nước ngoài. Vaccine vô hoạt Là chế phẩm sinh học được chế từ chủng virus cường độc hoặc nhược độc, được khử độc tính bằng formol hoặc P-Propiolacton có bổ sung thêm chất bổ trợ nhằm tăng cường hiệu quả của vaccine. Tá chất có tác dụng gây phản ứng viêm nhẹ làm tăng khả năng thực bào, tá chất còn có tác dụng hấp phụ kháng thể, sau đó giải phóng từ từ có tác dụng giống như chủng vaccine nhắc lại nhiều lần. Những thí nghiệm gần đây còn chứng minh rằng tá chất làm tăng hiệu quả của lympho THB. Tuy nhiên vaccine vô hoạt có những nhược điểm là: thời gian bảo quản không được lâu, để đông lạnh dể làm hư vaccine, phải chủng cho từng con và giá thành cao. Một số loại vaccine vô hoạt đang được lưu hành ở nước ta - Vaccine Imopest do Rhone Merieus (Pháp) sản xuất. Vaccine thuộc chủng Texas có hiệu giá trước khi vô hoạt là 108ETD50 chất bảo quản là Methiolate 0.005mg, chất bổ trợ dạng dầu vừa đủ 0,3 cc/liều. - Vaccine Gumboro+ND là vaccine vô hoạt phòng 2 bệnh Newcastle và Gumboro do Công Ty Interviet (Hà Lan) sản xuất thành phần một liều gồm Newcastle Clone 30>/ 50 PD50(PD: Protective dose)+Gumboro D78>/ 12,5 log2 VN (VN: virus Neuteralization). - Vaccine Gumboro+Newcastle do Pháp sản xuất mỗi liều chứa 108EID50 virus Newcastle chủng texas và 1057CCID50 virus Gumboro chủng VNIO. Đây là vaccine chết nhị giá dùng tiêm cho gà mẹ để gây miễn dịch chủ động cho gà mẹ và gà mẹ truyền kháng thể thụ động cho gà con. Tiêu chuẩn cho một vaccine Newcastle Vaccine lý tưởng để sử dụng phải thỏa những tiêu chuẩn quan trọng sau đây. - An toàn: vaccine không gây ra các dấu hiệu lâm sàng khi dùng với bất kì đường tiêm chủng nào ở gà con và gà trước hoặc trong kỳ đẻ trứng. 9 - Thuần khiết (Purty): vaccine phải không nhiễm vi sinh vật ngoại lai. - Ổn định: Chủng vaccine phải ổn định về mặt di truyền không chuyển đổi thành dạng có độc lực cao hơn khi lây truyền qua gà. Vaccine phải có thời gian sống có thể chấp nhận được. - Hiệu lực: Liều tiêm chủng của virus có khả năng kích thích miễn dịch thích hợp, thường nằm giữa 106-107 EID 50/liều. Quy trình chủng ngừa Hiện nay, trong các xí nghiệp chăn nuôi gà công nghiệp đang tồn tại khá nhiều quy trình chủng ngừa vaccine phòng bệnh Newcastle. Chúng tôi xin giới thiệu quy trình được các xí nghiệp nuôi gà áp dụng. Quy trình do Viện Chăn Nuôi ban hành năm 2010 - Đối với gà thương phẩm hướng thịt: ngày 7-21 chủng vaccine ND-IB - Đối với gà đẻ: ngày 7-21 chủng vaccine ND-IB và ngày 70-120-7 tháng NDIB Quy trình Công Ty NAVETCO - Đối với gà hướng thịt: 3-5 ngày vaccine chủng F, ngày 21 vaccine lasota. - Đối với gà đẻ: 3-5 ngày vaccine chủng F, ngày 21 vaccine lasota trên 60 ngày chủng M. Quy trình Công Ty BESTAR - Đối với gà hướng thịt: 1-3 ngày (BAL ND-B1 hoặc ND-IB), 21 ngày (BAL ND “lasota” hoặc BAL ND-IB). - Đối với gà đẻ: 1-3 ngày (BAL ND-IB), 21 ngày (BAL ND-IB), 70 ngày, 7 tháng (BAL ND-IB). 2.5 Sơ lược về giống gà thí nghiệm Theo Lê Minh Hoàng (2002) giống gà Tàu Vàng có xuất xứ từ Trung Quốc, nhưng giống gà này được đưa vào miền Nam từ rất lâu và trở thành giống gà địa phương, được nuôi rộng rãi các tỉnh Nam Bộ. Giống gà Tàu Vàng có ngoại hình khá đẹp, lông màu vàng đến màu vàng rơm, cổ có cườm đen từ nhiều đến ít, da và chân vàng, mào đơn. Đặc điểm nổi bật của gà là dọc bàn chân có hàng lông nhỏ mọc phía ngoài chân và hướng xuống dưới. Gà rất nhanh nhẹn và ưa thích kiếm mồi trong vườn. Gà có trọng lượng vừa phải, khi trưởng thành (6 tháng tuổi) con mái nặng khoảng 1,5-1,7kg, con trống khoảng 2-2,2kg. Khả năng sinh sản của gà kém, khi nuôi tập trung và áp dụng kỹ thuật cai ấp thì tỷ lệ đẻ bình quân toàn đàn chỉ từ 25-30%. Nếu không có chế độ cai ấp thì tỷ lệ này nhiều khi đạt tới 20%. Thời gian đẻ sớm, ham ấp và khỏe nuôi con là đặc thù của giống gà này. Trọng lượng trứng bình quân 10 nặng khoảng 42-45g. Trong môi trường nuôi chăn thả và ấp tự nhiên thì tỷ lệ nở cao từ 90-95%. Nếu nuôi nhốt và ấp theo lối ấp công nghiệp thì tỷ lệ nở chỉ đạt 73-77%. Đặc tính quan trọng nhất của giống gà Tàu Vàng là chất lượng thịt thơm ngon và được nhiều người ưa chuộng (Bùi Xuân Mến, 2007). Hình 2.2 Gà Tàu Vàng Nguồn: http://www.khoahoc.com.vn/doisong/ung-dung/48973_An-Giang-phuc-trang-thanhcong-ga-giong-tau-vang.aspx 11 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch của gà Tàu Vàng đối với vaccine Lasota (Navetco) phòng bệnh Newcastle. Khảo sát khả năng tăng trọng và sự thay đổi hàm lượng bạch cầu của gà Tàu Vàng sau khi tiêm phòng vaccine. 3.2 Phương tiện thí nghiệm 3.2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng thí nghiệm Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2013. Địa điểm: gà thí nghiệm được nuôi tại trại chăn nuôi Ba Hoàng, tổ 7 khu vực Thới Thạnh, phường Thới An Đông, quận Bình Thủy, Thành Phố Cần Thơ. Địa điểm xét nghiệm: phòng thí nghiệm Bệnh Truyền Nhiễm Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Phòng xét nghiệm bệnh viện 121 CHC-QK9. Đối tượng thí nghệm: gà Tàu Vàng từ 1 ngày tuổi đến 90 ngày tuổi. 3.2.2 Vật liệu thí nghiệm Các hóa chất và sinh phẩm: dung dịch sinh lý 0,85%, dung dịch alserver, nước cất, cồn, hồng cầu gà, huyết thanh gà, vaccine phòng đậu gà, vaccine phòng bệnh Gumboro, vaccine Newcastle chủng Lasota (Navetco). Hình 3.1 Vaccine Newcastle chủng lasota (Nguồn:http://www.navetco.com.vn) Vật liệu và dụng cụ: ống tiêm y tế, kim tiêm, ống nghiệm vô trùng, bông gòn vô trùng, cồn, khẩu trang, găng tay, bình trữ lạnh, máy ly tâm, máy 12 hematocrite, type nhựa đựng huyết thanh, đĩa microplate đáy tròn có 96 giếng micropipette, cân. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị nuôi gà thí nghiệm Chuẩn bị chuồng nuôi: chuồng nuôi được chuẩn bị trước khi đem gà về, kiểu chuồng lồng diện tích 1m x 2m, xung quanh được bao lại bằng lưới chì. Dưới đáy được trải lớp trấu có rắt men vi sinh (Balasa No.1). Chuồng được sát trùng bằng iodine trước khi đưa gà vào nuôi. Thức ăn: thức ăn cho gà thí nghiệm là thức ăn của Công Ty Cổ Phần Việt Pháp PROCONCO gà được ăn tự do bằng thức ăn dạng viên phù hợp với từng lứa tuổi. Quy trình chăm sóc: gà từ 0-3 tuần tuổi được nuôi úm trên lồng, mỗi lồng úm được sử dụng một bóng đèn tròn có công suất 75W. Xung quanh chuồng được che kín cẩn thận để tránh mưa tạt, gió lùa, lót sàn bằng giấy báo suốt 3 ngày đầu và thay giấy mỗi ngày. Sử dụng máng ăn tròn treo để tránh thức ăn bị rơi vãi và bị dính phân. Tuần thứ 4 và 5 gà không còn được nuôi úm, cho ăn uống bình thường, vệ sinh tốt chuồng nuôi. Gà được cho ăn uống tự do, bổ sung thêm vitamin C, glucose. Mật độ nuôi gà như nhau: 1 đến 2 ngày tuổi: 50 con/m2. 2 tuần đến 3 tuần tuổi: 35 con/m2. 3 tuần đến 4 tuần tuổi: 30 con/m2. 4 tuần đến 5 tuần tuổi: 25 con/m2. 5 tuần đến 6 tuần tuổi: 20 con/m2. 6 tuần đến 7 tuần tuổi: 15 con/m2. 7 tuần tuổi đến xuất bán: 10 con/m2. Hình 3.2 Úm gà con thí nghiệm 13 Quy trình tiêm phòng bệnh chung được tóm tắt qua bảng 3.1 Bảng 3.1 Quy trình phòng bệnh bằng vaccine tại trại gà thí nghiệm Ngày tuổi Tên vaccine Tên công ty Cách tiêm ngừa 7 Newcastle+ Gumboro Navetco Nhỏ mắt, nhỏ mũi 10 Đậu Navetco Chủng qua cánh 15 Cúm gia cầm Navetco Tiêm dưới da cổ 21 Newcastle + Gumboro Navetco Nhỏ mắt, nhỏ mũi 45 Cúm gia cầm Navetco Tiêm dưới da cổ 60 Tụ huyết trùng Navetco Tiêm dưới da cổ 3.3.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Lasota (Navetco) Trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm, gà thí nghiệm được lấy máu để kiểm tra kháng thể thụ động trước khi tiêm phòng bệnh Newcastle. Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm với vaccine Newcastle trên gà Tàu Vàng. Nghiệm thức Vaccine sử dụng Đường cấp Số lần lập lại Số gà mỗi nghiệm thức Thời gian tiêm chủng (ngày) NT1 Không Không 3 15 Không NT2 Lasota Nhỏ mắt 3 15 7 và 21 Mô tả nghiệm thức: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức là 15 con gà) với 3 lần lập lại. Ở nghiệm thức 1 (NT1) không dùng vaccine, nghiệm thức 2 (NT2) dùng vaccine Lasota (Navetco) để chủng ngừa cho gà. Gà được chủng ngừa 2 lần vào lúc 7 ngày tuổi và 21 ngày tuổi. Gà thí nghiệm được tiêm phòng đầy đủ các bệnh theo quy trình phòng bệnh chung. 14 Hình 3.3 Chủng ngừa vaccine cho gà Phương pháp thu thập mẫu để đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Lasota. Để theo dõi sự truyền kháng thể thụ động từ đàn gà giống bố mẹ sang gà con, chúng tôi thực hiện lấy máu trên NT1 (không tiêm vaccine), thời điểm lấy máu lúc 3 ngày, 10 ngày, 17 ngày, 24 ngày và sau đó mỗi tháng lấy máu một lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm, lấy 5 mẫu. Để kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle và để đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Lasota (Navetco) chúng tôi lấy máu thực hiện phản ứng HA và HI. Lấy máu tĩnh mạch cánh lúc gà 35 ngày tuổi (sau 2 tuần khi tiêm vaccine lần 2), lúc 49 ngày và lúc 75 ngày tuổi, mỗi lần lấy 5 mẫu. Phương pháp lấy máu để kiểm tra kháng thể trong các lô gà thí nghiệm: mỗi con lấy khoảng (0,5ml-2ml) máu cho vào ống nghiệm vô trùng, để nghiêng 1 gốc 45o và giữ yên khoảng 30 phút cho đến khi ra huyết thanh, tiến hành chiết huyết thanh cho vào ependoff, ghi lại ký hiệu của gà thí nghiệm. Hình 3.4 Lấy máu tim trên gà con Bảo quản mẫu: máu sau khi lấy sẽ được trữ ở 4oC trong thùng trữ mẫu rồi chuyển đến phòng thí nghiệm. Mẫu huyết thanh phải được bảo quản trong điều kiện lạnh (từ 2-8 oC) nếu tiến hành xét nghiệm ngay trong vòng 48-72 giờ. Nếu mẫu chưa được xét nghiệm trong vòng 48-72 giờ thì giữ trong tủ âm (-20 oC) đến khi xét nghiệm. 15 Thí nghiệm 2: Theo dõi sự tăng trọng của gà Tàu Vàng sau khi tiêm phòng vaccine Từ các nghiệm thức trên chúng tôi theo dõi sự tăng trọng của gà Tàu Vàng qua các nghiệm thức, gà được chúng tôi theo dõi qua 3 giai đoạn. Trong đó, giai đoạn nuôi úm từ 0-3 tuần tuổi (nuôi trên chuồng lòng) và giai đoạn nuôi tăng trưởng từ 3-6 tuần tuổi và giai đoạn thịt từ 6-12 tuần tuổi (dưới nền). Các lô gà thí nghiệm được cho ăn cùng một loại thức ăn hỗn hợp Proconco, được chăm sóc và nuôi dưỡng như nhau để khảo sát về sự tăng trọng và hệ số chuyển hóa thức ăn. Tăng trọng của gà (g/con/ngày) được xác định bằng cách cân khối lượng gà trước khi bố trí thí nghiệm để xác định trọng lượng ban đầu, sau đó cân vào cuối mỗi giai đoạn và lúc kết thúc thí nghiệm. Gà thí nghiệm được cân vào lúc sáng sớm trước khi cho ăn, gà được cân từng con và cân toàn bộ số gà có trong mỗi đơn vị thí nghiệm. Tăng trọng bình quân của gà được tính theo công thức sau: Trọng lượng gà mỗi giai đoạn – trọng lượng gà ban đầu Tăng trọng (g/con) = Số ngày thí nghiệm Hệ số chuyển hóa thức ăn được xác định dựa vào lượng thức ăn tiêu thụ và tăng trọng của gà và được thể hiện qua công thức dưới đây: Tiêu tốn thức ăn trong giai đoạn thí nghiệm (g/con) Hệ số chuyển hóa thức ăn = Tăng trọng trong giai đoạn thí nghiệm (g/con) Hình 3.5 Cân gà khi kết thúc thí nghiệm Thí nghiệm 3: Theo dõi sự thay đổi hàm lượng bạch cầu sau khi tiêm phòng vaccine. Từ hai nghiệm thức trên chúng tôi theo dõi sự thay đổi hàm lượng bạch cầu trước và sau khi tiêm vaccine của gà Tàu Vàng máu được lấy sáng sớm trước khi cho gà ăn và vận động trên lô không tiêm vaccine (NT1) để kiểm tra hàm lượng bạch cầu trước khi tiêm vaccine. Tương tự lô tiêm vaccine (NT2) gà được lấy máu hai lần sau khi tiêm vaccine lần 1 và lần 2 (thời điểm lấy 10 16 ngày và 24 ngày). Các mẩu máu cho vào ống nghiệm chứa chất chống đông (heperin), ghi ký hiệu và đưa đến phòng thí nghiệm bệnh viện 121 CHC-QK9. 3.3.3 Qui trình thực hiện phản ứng HA Nguyên lý: virus Newcastle có khả năng ngưng kết hồng cầu. Khi hồng cầu được rửa sạch bằng nước sinh lý 0,85% sẽ bộc lộ ra những thụ thể bề mặt và virus Newcastle sẽ kết hợp với hồng cầu qua thụ thể này. Kết quả là hồng cầu sẽ dàn đều trong giếng của đĩa nhựa microplate chữ U khi thực hiện phản ứng. Đây là đặc điểm quan trọng để xác định một cách gián tiếp sự hiện diện của virus, và chuẩn độ kháng nguyên virus Newcastle dùng cho phản ứng HI. Thành phần phản ứng: kháng nguyên là vaccine chủng Lasota, nước sinh lý 0,85%, hồng cầu gà pha loãng 1% trong nước sinh lý. Tiến hành phản ứng HA: dùng micropipet nhỏ 25µl nước sinh lý vào 12 giếng của đĩa nhựa microplate. Cho vào giếng thứ nhất 25µl kháng nguyên, như vậy kháng nguyên được pha loãng 1/2 trong nước sinh lý, trộn đều rùi hút 25µl của giếng thứ nhất chuyển sang giếng thứ 2 và làm tiếp tục cho đến giếng thứ 11 rút bỏ 25µl. Giếng thứ 12 làm đối chứng hồng cầu, chỉ có 25µl nước sinh lý và 25µl huyễn dịch hồng cầu gà 1%. Thêm vào mỗi giếng 25µl hồng cầu 1%, lắc nhẹ đĩa nhựa để trộn đều kháng nguyên và hồng cầu, để ở nhiệt độ 4oC, đọc kết quả sau 30 phút. Đọc kết quả phản ứng HA: dương tính xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Âm tính hồng cầu tụ lại thành một cụm tròn ở đáy giếng. Hiệu giá ngưng kết của kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của kháng nguyên còn khả năng ngưng kết và được gọi là một đơn vị ngưng kết hay một đơn vị HA. Bảng 3.3 Trình tự tiến hành phản ứng HA Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nước sinh lý 25 0,85% 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Kháng nguyên 25 (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 loãng Hồng cầu 25 25 25 25 25 (µl) Để ở nhiệt độ 4oC trong 30 phút 25 25 17 25 25 25 25 25 3.3.4 Qui trình thực hiện phản ứng HI Nguyên lý: khi cho huyết thanh có kháng thể kháng virus có khả năng ngưng kết hồng cầu tương ứng thì sau một thời gian virus sẽ bị trung hòa và mất khả năng ngưng kết hồng cầu. Trong phản ứng này người ta sử dụng lượng kháng nguyên nhất định, còn huyết thanh được pha loãng cho đến khi lượng kháng thể có trong huyết thanh không còn đủ khả năng ngăn trở hiện tượng ngưng kết hồng cầu. Thành phần phản ứng: nước sinh lý 0,85%, kháng nguyên có 4 đơn vị ngưng kết pha loãng trong dung dịch sinh lý 0,85%, hồng cầu gà 1% pha trong nước sinh lý 0,85% Tiến hành phản ứng HI: dùng micropipet hút 25µl nước sinh lý cho vào mỗi giếng của đĩa micropiplate từ giếng 1 đến giếng thứ 12. Dùng micropipet hút 25µl huyết thanh gà cần xét nghiệm cho vào giếng thứ nhất trộn đều. Như vậy huyết thanh được pha loãng 1/2. Hút 25µl chuyển sang giếng thứ hai, trộn đều, hút 25µl chuyển sang giếng thứ ba tiếp tục như vậy cho đến giếng thứ 9 rút bỏ 25µl. Cho vào mỗi giếng 25µl kháng nguyên (ở 4 đơn vị HA pha loãng trong nước sinh lý 0,85%). Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng thể hiện diện trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên. Thêm vào mỗi giếng 25µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% lắc đều. Sau đó để ở nhiệt độ 4oC cho đến khi các tế bào hồng cầu trong giếng đối chứng đóng thành nút rõ ràng dưới đáy giếng. Đọc kết quả sau 30 phút. Bảng 3.4. Trình tự tiến hánh phản ứng HI Số giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (ĐCA) (ĐCD) (ĐCHC) Nước sinh lý 25 0,85% 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Huyết thanh (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 loãng Kháng nguyên 25 25 25 25 25 (µl) Để ở nhiệt độ 4oC trong 30 phút Hồng cầu 25 25 25 25 25 (µl) Để ở nhiệt độ 4oC trong 30 phút 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 ĐCD: Đối chứng dương; ĐCA: Đối chứng âm; ĐCHC: Đối chứng hồng cầu 18 Thực hiện phản ứng đối chứng: giếng thứ 10, thứ 11 làm đối chứng âm với đối chứng dương, thực hiện tương tự như các mẫu huyết thanh kiểm tra nhưng thay đổi huyết thanh cần kiểm tra bằng mẫu huyết thanh âm tính và dương tính chuẩn. Giếng thứ 12 để làm đối chứng hồng cầu: 25µl nước sinh lý và 25µl huyễn dịch hồng cầu gà 1%. Đọc phản ứng HI: giếng nào không xảy ra ngưng kết hồng cầu là dương tính,giếng nào có ngưng kết hồng cầu là âm tính. Hiệu giá ngăn trở ngưng kết hồng cầu của huyết thanh là độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh còn có khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu có thể đọc được. Dương tính ở giếng thứ 1 đến giếng thứ 9 tương ứng với hiệu giá1/2 đến 1/521. Phản ứng âm tínhhồng cầu xuất hiện từng cụm ngưng kết ở đáy giếng. Hình 3.6 Kết quả phản ứng HI Tiêu chí đánh giá: Hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá thể gia cầm, đàn gia cầm được bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá thể có hiệu giá HI ≥ 1/16 4log2 (Cục thú y, 2005). 3.4 Phương pháp phân tích số liệu So sánh tỷ lệ bảo hộ của gà Tàu Vàng giữa các ngày bằng phương pháp Fisher_Exactly_test1. So sánh trọng lượng và hàm lượng bạch cầu của gà giữa các nghiệm bằng phân tích phương sai so sánh các trị số trung bình bằng ANOVA, sử dụng mềm Minitab 13. 19 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả kháng thể thụ động của gà Tàu Vàng Kết quả kháng thể thụ động của gà Tàu Vàng được trình bày qua bảng 4.1. Bảng 4.1 Kết quả kháng thể thụ động của gà Tàu Vàng (n=5) Hiệu giá kháng thể (x log2) Số mẫu ≥ 4log2 Tỷ lệ bảo hộ (%) Ngày tuổi 0,05). Hiệu giá kháng thể thụ động trung bình cũng dao động và giảm dần từ 3 ngày tuổi (13,92) đến 1 tháng (1,14). Theo Lâm Minh Thuận (2004) hàm lượng kháng thể thụ động ở gà con phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể mẹ truyền. Nếu hàm lượng kháng thể ở gà mẹ cao thì lượng kháng thể mẹ truyền đủ bảo hộ gà con trong giai đoạn đầu. Kháng thể tồn tại ở gà con từ 20-30 ngày. Thông thường lượng kháng thể mẹ truyền hết hẳn vào ngày thứ 28. Hàm lượng kháng thể thụ động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả đáp ứng miễn dịch trong phòng bệnh Newcastle, nếu hàm lượng kháng thể thụ động cao mà đưa vaccine vào, kháng thể thụ động sẽ trung hòa với kháng nguyên có trong vaccine làm giảm lượng kháng thể tạo ra, nên khả năng miễn dịch của đàn gà sẽ giảm (trích dẫn Vũ Thị Thanh Ngân, 2010). Việc xác định hiệu giá kháng thể thụ động để đặt chương trình chủng có một ý nghĩa quan trọng. Nếu ta biết được hiệu giá kháng thể thụ động ở gà con thì ta dễ dàng xác định được thời điểm chủng ngừa thích hợp. 20 4.2 Đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle Kết quả kháng thể của gà Tàu Vàng lúc 35 ngày tuổi sau khi tiêm vaccine lần hai được trình bày qua bảng 4.2. Bảng 4.2 Kết quả kháng thể ở gà 35 ngày tuổi (n=5) Hiệu giá kháng thể (x log2) [...]... một yếu tố chọn lựa của nhà chăn nuôi Tuy nhiên, thông tin về mức bảo hộ của các loại vaccine chưa nhiều, do đó chúng tôi thực hiện nghiên cứu Khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch của gà Tàu Vàng đối với vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle nhằm khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch và khả năng tăng trọng của gà Tàu Vàng sau khi tiêm phòng vaccine Lasota (Navetco) đồng thời khảo sát sự thay đổi hàm lượng... Tỷ lệ kháng thể bảo hộ của vaccine Lasota lúc gà 35 ngày tuổi và 49 ngày tuổi là 80% Tỷ lệ bảo hộ của vaccine Lasota đến 75 ngày tuổi giảm còn 60% không còn khả năng bảo hộ với bệnh Newcastle Hiệu giá kháng thể lúc gà 35 ngày tuổi là 21.1, 49 ngày tuổi là 10.58 và 75 ngày tuổi là 6.10 Khả năng đáp ứng miễn dịch vaccine Lasota đủ bảo hộ gà đến 49 ngày tuổi Tăng trọng của gà Tàu Vàng từ 0-3 tuần tuổi... virus Newcastle chịu nhiệt từ chủng V4 Vaccine này đã áp dụng thành công trong phòng bệnh Newcastle trên gà nuôi ở nông thôn của nhiều nước Đông Nam Á (Trần Đình Từ, 1998) 2.3 Miễn dịch chống bệnh Newcastle Ngày nay người ta biết rõ đáp ứng miễn dịch chống bệnh Newcastle gồm miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào 6 2.3.1 Miễn dịch tế bào Đáp ứng miễn dịch đầu tiên của cơ thể đối với sự...TÓM LƯỢC Đề tài Khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch của gà Tàu Vàng đối với vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle được tiến hành từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013, tại trại chăn nuôi Ba Hoàng quận Bình Thủy Thành Phố Cần Thơ Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẩu nhiên với hai nghiệm thức trên giống Tàu Vàng, đáp ứng miễn dịch của gà sau khi chủng vaccine Lasota được đánh giá bằng... dụng vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle trên gà Tàu Vàng đạt tỷ lệ bảo hộ cao nhất lúc gà 35 ngày tuổi và thấp nhất lúc gà 75 ngày tuổi Tỷ lệ bảo hộ củavaccine Lasota đủ bảo hộ gà đến 49 ngày tuổi Gà Tàu Vàng được tiêm vaccine Lasota vẫn tăng trọng tốt Số lượng bạch cầu của gà Tàu Vàng trước và sau khi tiêm phòng không có sự thay đổi lớn 5.2 Đề nghị Nên thử nghiệm vaccine Lasota trên nhiều giống gà. .. gà hướng thịt: 3-5 ngày vaccine chủng F, ngày 21 vaccine lasota - Đối với gà đẻ: 3-5 ngày vaccine chủng F, ngày 21 vaccine lasota trên 60 ngày chủng M Quy trình Công Ty BESTAR - Đối với gà hướng thịt: 1-3 ngày (BAL ND-B1 hoặc ND-IB), 21 ngày (BAL ND lasota hoặc BAL ND-IB) - Đối với gà đẻ: 1-3 ngày (BAL ND-IB), 21 ngày (BAL ND-IB), 70 ngày, 7 tháng (BAL ND-IB) 2.5 Sơ lược về giống gà thí nghiệm Theo... thấy khả năng đáp ứng miễn dịch của giống gà Tàu Vàng lúc gà 35 ngày tuổi đạt tỷ lệ bảo hộ cao là 80% Ngoài ra hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) cũng rất cao (21.11) với mức hiệu giá này đã tạo miễn dịch chắc chắn cho đàn gà chống lại bệnh Newcastle Theo Allan và Gough (1974), đàn gà có hiệu giá kháng thể trung bình ≥ 8 (3log2) thì có khả năng miễn dịch với bệnh Newcastle Kết quả này cũng phù hợp với. .. của vaccine chụi nhiệt chủng I2 trên cút nuôi thịt Kết quả này cho thấy, chim cút có đáp ứng kháng thể thấp hơn so với gà được chủng vaccine này ( trích dẫn Nguyễn Hải Ngân, 2010) Nghiên cứu của Phạm Văn Tự et al (2006) về ảnh hưởng của aflatoxin B1 có trong thức ăn đến đáp ứng miễn dịch của gà công nghiệp đối với bệnh Newcastle, kết quả cho thấy aflatoxin B1 làm giảm đáp ứng miễn dịch của gà đối với. .. nhất của giống gà Tàu Vàng là chất lượng thịt thơm ngon và được nhiều người ưa chuộng (Bùi Xuân Mến, 2007) Hình 2.2 Gà Tàu Vàng Nguồn: http://www.khoahoc.com.vn/doisong/ung-dung/48973_An-Giang-phuc-trang-thanhcong-ga-giong-tau-vang.aspx 11 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch của gà Tàu Vàng đối với vaccine Lasota (Navetco) phòng bệnh. .. đã kết luận rằng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đối với bệnh Newcastle bởi đáp ứng này không đủ bảo hộ chống nguy cơ nhiễm virus Newcastle độc Tuy nhiên, tầm quan trọng của miễn dịch trung gian tế bào trong sự bảo hộ vaccine thì không rõ lắm và một đáp ứng thứ cấp mạnh đối với mầm bệnh tương tự đáp ứng kháng thể dường như không xảy ra (Nguyễn Đức Hiền, 2011) 2.3.2 Miễn dịch dịch thể Trong thực ... loại vaccine chưa nhiều, thực nghiên cứu Khảo sát khả đáp ứng miễn dịch gà Tàu Vàng vaccine Lasota phòng bệnh Newcastle nhằm khảo sát khả đáp ứng miễn dịch khả tăng trọng gà Tàu Vàng sau tiêm phòng. .. nghiên cứu Khảo sát khả đáp ứng miễn dịch gà Tàu Vàng vaccine Lasota (Navetco) phòng bệnh Newcastle Khảo sát khả tăng trọng thay đổi hàm lượng bạch cầu gà Tàu Vàng sau tiêm phòng vaccine 3.2... THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGHÀNH THÚ Y KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA GÀ TÀU VÀNG ĐỐI VỚI VACCINE LASOTA PHÒNG BỆNH NEWCASTLE Giáo viên hướng dẫn :