TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------------o0o--------------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT HÓA LÝ VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PROTEIN CHIẾT TỪ RONG ĐỎ KAPPAPHYCUS ALVERAZII GVHD: TS. Lê Đình Hùng TS.Nguyễn Văn Duy SVTH: Trương Minh Tuấn MSSV: 53131945 Khánh Hòa, tháng 6/2015 i LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Đình Hùng (Trưởng phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) và TS. Nguyễn Văn Duy (Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang), những người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp đại học. Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang và Viện Công nghệ sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang đã dạy dỗ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập. Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 26 tháng 6 năm 2015 Sinh viên TRƯƠNG MINH TUẤN ii TÓM TẮT Đã thực hiện các bước tinh sạch và thu được chế phẩm lectin từ rong đỏ K.alvarezii có hoạt độ tổng 3584 HU, hoạt độ riêng đạt 387,46 HU/mg, nồng độ nhỏ nhất gây NKHC 0,003 mg/HU, đạt độ tinh sạch gấp 8,6 lần sao với dịch thô ban đầu. Trên gel polyacrylamide thấy xuất hiện một band có khối lượng phân tử 28 kDa. Lectin từ rong đỏ K. alvarezii khá bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động khá rộng từ 20 đến 60oC. Nhiệt độ hoạt động ổn định của lectin (duy trì 100% hoạt tính sau 60 phút phản ứng) là 20 đến 50oC. Hoạt tính NKHC không thay đổi từ vùng pH 3 đến 10. Lectin từ rong đỏ K.alvarezii kháng lại 5/6 loài vi khuẩn thí nghiệm: Staphylococcus hominis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi. Lectin từ rong đỏ K. alvarezii có khả năng kháng lại sâu tơ Plutella xylostella hại rau và mọt gạo Sitophilus oryzae. iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i TÓM TẮT ...................................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ ........................................................................ vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1 . TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN .................................................................. 3 1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển .................................................................. 3 1.1.2. Phân loại rong biển .................................................................................. 4 1.1.3. Rong đỏ Kappaphycus alvarezii .............................................................. 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN ........................................................................... 6 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu lectin ......................................................................... 6 1.2.2. Sự phân bố của lectin trong sinh giới ....................................................... 9 1.3 . LECTIN TỪ RONG BIỂN ......................................................................... 10 1.3.1. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài ....... 10 1.3.2. Cấu tạo của lectin từ rong biển ............................................................... 12 1.3.3. Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển.................... 15 1.4. ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN ............................................ 17 1.5. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN ...................................................... 19 1.5.1. Các kĩ thuật chiết xuất lectin...................................................................... 19 1.5.2. Các kỹ thuật tinh chế lectin .................................................................... 20 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ....................... 23 2.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ............................. 23 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 24 2.3.1. Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu ............ 24 2.3.2. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)............... 25 iv 2.3.3. Phương pháp tách chiết lectin từ rong đỏ K. alvarezii............................. 27 2.3.4. Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S- 200 ..... 29 2.3.5. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE .................................................................................... 30 2.3.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong đỏ K. alvarezii ...................................................... 32 2.3.7. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong đỏ K. alvarezii .............................................................................................................. 33 2.3.8. Bố trí thí nghiệm diệt sâu tơ ................................................................... 34 2.3.9. Bố trí thí nghiệm xua đuổi mọt gạo ........................................................ 35 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 37 3.1 . KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH LECTIN TỪ RONG ĐỎ KAPPAPHYCUS ALVERAZII ................................................................................. 37 3.1.1. Chiết và tinh sạch lectin từ rong đỏ K.alverazii ...................................... 37 Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 ................................... 38 3.1.2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE ..................................................................................... 39 3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA LECTIN.................... 42 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ......................................................................... 42 3.2.2. Ảnh hưởng của pH ................................................................................. 44 3.3 . ỨNG DỤNG CỦA LECTIN ĐỂ KHÁNG KHUẨN, DIỆT SÂU RAU VÀ XUA ĐUỔI MỌT GẠO ......................................................................................... 46 3.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lectin .............................................. 46 3.3.1 Khảo sát hoạt tính diệt sâu của lectin từ rong đỏ K. alvarezii.................. 48 3.3.2 Khảo sát hoạt tính xua đuổi Mọt gạo của lectin từ rong đỏ K. alvarezii .. 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................... 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 52 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 59 Phụ lục A. Phụ lục các bảng giá trị ......................................................................... 59 Phụ lục B. Phụ lục các hình .................................................................................... 64 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT K. alvarezii Kappaphycus alvarezii DC Dịch chiết EDTA Axit ethylene diamine tetra acetic HA Hemaggllutinin assay (hoạt tính ngưng kết) HC Hồng cầu HĐR Hoạt độ riêng HĐTS Hoạt độ tổng số HU Hemaggllutinin unit (đơn vị ngưng kết) MAC Minimum agglutination concentration (nồng độ ngưng kết nhỏ nhất) NKHC Ngưng kết hồng cầu OD Optical density (mật độ quang) PBS Phosphate buffered saline (đệm phosphat chứa NaCl 0,85%) PL Phụ lục vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Trình tự sắp xếp các axit amin đầu tận cùng N của các chuỗi α ở một số loài rong thuộc chi Eucheuma .......................................................................... 14 Bảng 1.2. Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng ................................ 19 Bảng 2.1. Các vi khuẩn dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii.................................................................................... 35 Bảng 3.1. Kết quả quá trình thu chiết lectin từ rong K. alvarezii ................................ 38 Bảng 3.2. Trọng lượng phân tử protein từ rong K. alvarezii ....................................... 42 Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng lại một số loại vi khuẩn gây bệnh của lectin từ rong K. alvarezii .......................................................................... 47 Bảng PL 1. Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/mL) .............. 60 Bảng PL 2. Giá trị Rf và lg M của protein trong thang chuẩn ..................................... 60 Bảng PL 3. Hàm lượng protein tổng số ...................................................................... 61 Bảng PL 4. Kết quả đo OD280 và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi sắc lọc gel trên cột Sephacryl S-200 .............................................................. 61 Bảng PL 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii .................................................................. 62 Bảng PL 6. Độ bền nhiệt độ của lectin từ rong K.alvarezii ......................................... 62 Bảng PL 7. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii .... 63 Bảng PL 8. Kết quả thí nghiệm diệt sâu tơ bằng dịch lectin từ rong K.alvarezii ......... 64 vii DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Rong đỏ Kappaphycus alvarezzi................................................................... 5 Hình 2.1. Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry ................................... 27 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình công nghệ thu nhận và tinh chế lectin từ rong K. alvarezii ................................................................................... 28 Hình 2.3. Nguyên tắc của sắc ký lọc gel ................................................................... 30 Hình 2.4. Đồ thị tương quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn ............... 33 Hình 2.5. Sâu tơ (Plutella xylostella) ....................................................................... 35 Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm diệt sâu tơ (Plutella xylostella) bằng dịch lectin từ rong K. alvarezii ................................................................................................ 36 Hình 2.7. Mọt gạo (Sitophilus oryzae) ....................................................................... 36 Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm xua đuổi mọt gạo bằng dịch lectin chiết từ rong K. alvarezii ................................................................................................ 37 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (A = 280 nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 ............................... 39 Hình 3.2. Kết quả điện di protein lectin từ rong K. alvarezii qua từng bước tinh sạch 41 Hình 3.3 . Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii .................................................................................. 43 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền nhiệt của hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii ...................................................................................... 45 Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong K.alvarezii ....... 46 Hình 3.6. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh của lectin từ rong K. alvarezii ......................................................................... 48 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện số lượng sâu chết dưới tác động của lectin từ rong đỏ K. alvarezii .............................................................................................. 49 Hình 3.8. Kết quả thí nghiệm xua đuổi mọt gạo bằng dịch lectin từ rong K. alvarezii ............................................................................................... 50 Hình PL 1. Hoạt tính NKHC của dịch thô lectin thu từ rong K.alvarezii ................... 65 Hình PL 2. Hoạt tính NKHC tại một số phân đoạn sau khi chạy sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 ................................................................................... 65 Hình PL 3. Một số hình ảnh thí nghiệm diệt sâu bằng dịch lectin từ rong viii K.alvarezii ............................................................................................ 67 Hình PL 4. Sự thay đổi màu sắc và trạng thái của sâu sau khi ăn phải lectin từ rong K.alverazii ............................................................................................... 68 1 MỞ ĐẦU Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu, liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch. Lectin giữ vai trò quan trọng như là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tế bào với tế bào vì chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào. Những đặc tính này làm cho lectin trở thành một công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứu miễn dịch học, hóa sinh, sinh học tế bào, xác định và phát hiện nhóm máu, nghiên cứu tế bào ung thư [62]. Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứng dụng của lectin từ rong biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [23,24]. Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp, tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực với glycoprotein (đặc biệt là các glycoprotein từ động vật), thuộc nhóm protein rất bền nhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II [54]. Với những tính chất ưu việt trên, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng của chúng trong tương lai. Mặt khác, Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển khoảng 3260km, với hơn 1000 loài rong biển đã được tìm thấy. Trong đó, đã xác định được 151 loài thuộc ngành rong Lục (Chlorophyta), 269 loài thuộc ngành rong Đỏ (Rhodophyta), 143 loài thuộc ngành rong Nâu (Phaeophyta) và 76 loài thuộc ngành rong Lam (Cyanophyta) [70].Đây là nguồn vật liệu vô cùng phong phú cung cấp cho việc nghiên cứu, điều chế những hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ rong biển, mà lectin là một trong những đối tượng nghiên cứu được quan tâm hiện nay. Kết quả khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 80 loài rong biển thuộc vùng biển Ninh Thuận và Khánh Hòa từ năm 2009 đến 2013 của TS. Lê Đình Hùng và cộng sự cho thấy: hơn 90% dịch chiết từ rong được khảo sát cho thấy sự hiện diện lectin. 2 Chúng có khả năng làm ngưng kết với ít nhất một trong các loại hồng cầu được thử nghiệm. Trong đó, dịch chiết từ các loài rong Đỏ cho hoạt tính ngưng kết hồng cầu với cả hồng cầu thỏ và hồng cầu cừu [34, 41]. Loài rong đỏ Kappaphycus alvarezii đã và đang được trồng rất phổ biến ở ven biển tỉnh Khánh Hòa và Ninh Thuận là nguồn nguyên liệu dồi dào cho nghiên cứu lectin từ rong. Với những kết quả khảo sát sơ bộ và cơ sở nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính chất hóa lý và một số ứng dụng của protein chiết từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii”  Mục tiêu nghiên cứu Tách chiết và tinh chế lectin từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii. Xác định các tính chất lý, hóa của lectin từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii để định hướng khả năng ứng dụng lectin này trong các lĩnh vực khác nhau.  Nội dung nghiên cứu Chiết và tinh chế sơ bộ lectin từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii. - Chiết và thu dịch lectin thô từ mẫu rong đỏ K.alverazii. - Tinh chế lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200. - Xác định khối lượng phân tử lectin từ rong đỏ K.alverazii bằng phương pháp điện di SDS-PAGE. Xác định tính chất lý hóa của lectin từ rong đỏ K.alverazii. - Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ NKHC của lectin. - Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ NKHC của lectin. Khảo sát khả năng ứng dụng của lectin từ rong đỏ K.alverazii. - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn. - Khảo sát hoạt tính kháng sâu tơ hại rau. - Khảo sát hoạt tính xua đuổi mọt gạo. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 . TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN 1.1.1. Giới thiệu chung về rong biển Rong biển là một loài thực vật sinh sống ở biển. Chúng mọc trên các rạn san hô, vách đá hoặc có thể mọc dưới các tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp. Sự có mặt của rong biển trong thủy vực không chỉ đóng hai vai trò quan trọng là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của sinh vật biển mà còn là nguồn cung cấp thức ăn cho các loài động vật ven biển khác [4]. Rong biển có kích thước và hình dạng rất phong phú, chúng có kích thước từ hiển vi cho đến hàng chục mét; hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay nhiều hình thù rất đặc biệt. Hằng năm, đại dương cung cấp cho con người khoảng 200 tỷ tấn rong. Hơn 90% lượng cacbon trên Trái Đất được tổng hợp hằng năm là nhờ quang hợp trong môi trường lỏng, trong đó 20% là từ rong biển [54, 58]. Rong biển rất giàu chất dinh dưỡng. Ngoài thành phần đạm, rong biển còn chứa rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lượng và vitamin. Trong đó, nổi bật là iốt yếu tố vi lượng tối cần thiết cho tuyến giáp, canxi với hàm lượng cao hơn trong sữa, vitamin A cao gấp 10 lần trong bơ, vitamin B2 gấp 7 lần trong trứng, vitamin C, E cao gấp nhiều lần trong rau quả. Ngoài ra, các hợp chất protein và polysaccharide từ rong biển còn là đối tượng nghiên cứu của rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, y dược, nông nghiệp và công nghệ sinh học…[4]. Những nghiên cứu khoa học trong thời gian gần đây cũng đã xác nhận, nhiều loài rong biển có tác dụng phòng chống virus và ung thư [34]. Theo báo Telegraph dẫn một cuộc nghiên cứu mới đây, các loài rong biển cũng chứa nhiều thành phần hoạt chất sinh học giúp giảm lượng cholesterol, hạ huyết áp, tăng cường sự ngon miệng và thậm chí nó còn có khả năng loại bỏ những gốc phân tử tự do là tác nhân chính gây ung thư. Trong khi đó, kết quả báo cáo được đăng tải trên chuyên san Hiệp hội Nghiên cứu Ung thư Mỹ vào tháng 3/2011 cho biết, một số hợp chất từ rong biển có thể ngăn chặn sự tăng trưởng của các tế bào ung thư dẫn đến ung thư hạch bạch huyết. Ở Việt Nam, việc sử dụng rong biển tuy chưa phổ biến như các nước phát triển nhưng những tác dụng “thần dược” của chúng đang dần được người ta quan tâm, nghiên cứu và sử dụng nhiều như một liệu pháp an toàn cho sức khỏe. 4 Ở nước ta có khoảng hơn 1000 loài rong biển, phân bố chủ yếu ở vùng biển các tỉnh phía Nam và phía Bắc. Với hơn 200 loài được tìm thấy ở cả hai miền Bắc Nam. Trong đó, có các đối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong Mơ (Sargassum), rong Đông (Hypnea), rong Mứt (Porphyza), và rong Bún (Enteromorpha) [33]. 1.1.2. Phân loại rong biển Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia làm 9 ngành sau đây [4]: 1) Ngành rong lục (Chlorophyta) 2) Ngành rong nâu (Phaeophyta) 3) Ngành rong đỏ (Rhodophyta) 4) Ngành rong trần (Englenophyta) 5) Ngành rong giáp (Pyrophyta) 6) Ngành rong khuê (Bacillareonphyta) 7) Ngành rong kim (Chrysophyta) 8) Ngành rong vàng (Xantophyta) 9) Ngành rong lam (Cynophyta) Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong lục, rong nâu và rong đỏ. Trong đó, rong đỏ được sử dụng phổ biến nhất với khối lượng lớn để phục vụ con người. Một số loài có hàm lượng cao về Agar, Carrageenan, Furcuellaran được sử dụng để chế biến keo rong. Thành phần hóa học của rong Đỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, thời gian sinh trưởng và điều kiện sống như cường độ bức xạ, thành phần hóa học của môi trường. Trong đó, nước chiếm đến 77 đến 91%, hàm lượng protein của rong Đỏ Việt Nam dao động trong giới hạn 5 ÷ 22% trọng lượng rong khô [2]. Thành phần chủ yếu của chất khoáng trong rong Đỏ là Canxi, Kali, Lưu huỳnh và hàng loạt các nguyên tố khác, chiếm khoảng 20% trọng lượng khô. Ngoài ra, rong Đỏ còn chứa các sắc tố như: diệp lục tố, sắc tố đỏ, sắc tố vàng, sắc tố xanh lam. Nói chung sắc tố của rong Đỏ kém bền hơn sắc tố trong rong Nâu [4]. 1.1.3. Rong đỏ Kappaphycus alvarezii (Doty)  Đặc điểm sinh học  Hệ thống phân loại 5 Theo Yoshida (1998), hệ thống phân loại của rong Sụn như sau[75]: Ngành: Rhodophyta Lớp: Rhodophyceae Bộ: Gigartinales Họ: Solieriaceae Hình 1.1. Rong đỏ Kappaphycus alvarezzi Chi: Kappaphycus Loài: K. alvarezii (Doty ex P.C Silva 1996) [68].  Đặc điểm hình thái Các tản rong K. alvarezii đều có sụn, thân hình trụ đặc, là loài có nhiều biến thái, dài khoảng 15 – 40 cm [73]. Có một số nhánh cụt hay nhánh nhỏ, trên bề mặt các nhánh có các u lồi hay mấu nhỏ. Các nhánh mọc cách không đều. Tản rong màu xanh lục hay nâu vàng tùy điều kiện sống, giai đoạn sinh trưởng và độ sâu phân bố. Cá thể có hai dạng hình thái chính là dạng thân bò (phân nhánh mạnh, dạng bụi lớn, nhiều nhánh nhỏ) và dạng thân thẳng (ít phân nhánh, các nhánh mập và dài). Soi trên kính giải phẫu một lát cắt ngang thân cho thấy tầng da trong có chứa các tế bào hình tròn lớn nằm rải rác xen lẫn các tế bào nhỏ có vách ngăn dày. K. alvarezii là loài rong ưa mặn và độ mặn dưới 30‰ đã ảnh hưởng bất lợi tới sinh trưởng của rong. K. alvarezii là loài rong trồng phổ biến nhất và phát triển nhanh nhất của chi rong Kappaphycus, đồng thời cho hàm lượng Carrageenan chất lượng tốt nhất [61].  Đặc điểm sinh học: Theo Luxton (1999), rong sụn Kappaphycus alvarezii trong điều kiện tự nhiên ở biển thường sống bám vào các vật bám cứng, tồn tại ở 3 dạng cây: cây giao tử đực (male gametophyte), cây giao tử cái (female gametophyte) và cây bào tử bốn (tetrasporophyte) đồng nhất về mặt hình dạng và hình thái (nghĩa là không phân biệt về mặt hình dạng khi chưa hình thành cơ quan sinh sản) [51]. Theo Azanza và Aliaza (1999), trong tự nhiên rong Sụn sinh sản theo các kiểu sau [13]:  Sinh sản vô tính bằng đoạn thân, nhánh (từ một đoạn thân, nhánh dù là ở dạng cây giao tử đực, giao tử cái hay cây bào tử bị đứt gãy hay tách ra có thể sinh trưởng và phát triển thành một cây mới).  Sinh sản dinh dưỡng (vegetative reproduction). 6  Sinh sản vô tính bằng bào tử (ở cây bào tử bốn)  Sinh sản hữu tính bằng sự kết hợp giữa tinh tử của cây giao tử đực với trứng của cây giao tử cái qua quá trình kết hợp, phát triển phóng thích, bám, sinh trưởng để trở thành các cây bào tử mới, từ cây bào tử qua quá trình sinh sản bằng bào tử sẽ cho ra các cây giao tử đực và giao tử cái. Các hình thức sinh sản này luân phiên xảy ra trong điều kiện tự nhiên và các dạng cây khác nhau của rong Sụn cùng đồng thời tồn tại và phát triển [27]. Cho đến nay việc trồng rong Sụn vẫn mới chỉ dựa vào hình thức sinh sản dinh dưỡng ở điều kiện không bám của cây rong Sụn [53, 55]. Giống rong Sụn để trồng là các đoạn thân trong nhánh của cây rong Sụn, được cố định bằng cách buộc, treo vào các hệ thống trồng bằng dây hay giàn. Vì vậy trong nuôi trồng cây rong Sụn, về bản chất có thể là cây giao tử đực, giao tử cái hay cây bào tử bốn nhưng không còn điều kiện và khả năng thực hiện quá trình sinh sản hữu tính mà chỉ sinh trưởng và phát triển theo hình thức sinh sản dinh dưỡng từ chồi mầm để thành cây mới[60].  Ứng dụng của rong Sụn Hàng năm các nước trên thế giới đã cung cấp lượng nguyên liệu rong này khoảng 100000 tấn rong khô. Trong số lượng rong trên, một số ít đã được dùng để làm thực phẩm, còn phần lớn là dùng trong công nghiệp chế biến Kappa – Carrageenan trên toàn thế giới. Và hàng năm các nước trên thế giới đã sản xuất khoảng 20000 tấn Kappa – Carrageenan từ nguồn nguyên liệu rong này [59]. Theo Lindsey (1999), Kappa – Carrageenan là nguồn nguyên liệu trong các ngành công nghiệp [48]:  Công nghiệp thực phẩm: kem, sữa, đồ hộp, thịt, nước chấm, mứt, bánh kẹo…  Công nghiệp mỹ phẩm: các loại xà phòng, các loại kem mỹ phẩm, dịch thơm…  Công nghiệp nhẹ: giấy, da, in, sơn, nhuộm…  Công nghệ sinh học: cố định enzyme và nấm men trong quá trình sinh học, nuôi cấy mô thực vật và nuôi cấy vi sinh… Vì Carrageenan từ lâu đã được xem như chất tạo đông keo và kết dính nên nó rất phổ biến trong việc sản xuất các mặt hàng nói trên. So với Agar và Alginat, nhu cầu về Carrageenan trên thế giới ngày càng rộng và lớn hơn [53]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu lectin 7 Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho các mục đích y tế. Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của các hạt Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein. Những protein như vậy, được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật. Tuy nhiên, tất cả các nhà khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường đại học Dorpat (nay là trường đại học Tartu, Estonia) vào năm 1888. Chất hemagglutinin được Stillmark tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là ricin, một độc tố mà sau đó được xác định là có bản chất protein [36]. Kể từ đó, có thể chia quá trình nghiên cứu lectin thành 3 giai đoạn chính: - Giai đoạn đầu, từ cuối thế kỷ XIX đến nữa đầu thế kỷ XX: đây là giai đoạn mang tính điều tra cơ bản về lectin trong sinh giới. Ngoài công trình nghiên cứu của Stillmark vào năm 1888 thì cũng tại trường đại học Tartu, Hellin cũng đã tách được một độc tố khác có nguồn gốc từ thực vật, đó là dịch chiết từ hạt của cây Abrus precatororius, nó có khả năng làm ngưng kết tế bào hồng cầu người và được đặt tên là abrin. Trong suốt những năm sau đó, các hợp chất có tính chất đặc biệt làm ngưng kết tế bào hồng cầu người và một số loài động vật được phát hiện ngày một nhiều trong giới sinh vật từ virus đến con người. - Tiếp đến, trong những năm 1950 đến năm 1970: năm 1954, Boyd và Shapleigh đã sử dụng thuật ngữ “Lectin” (thuật ngữ “Lectin” bắt nguồn từ chữ “Lectus”, dạng quá khứ của động từ “Legre” trong tiếng Latin có nghĩa là “Lựa chọn”) để chỉ nhóm các “chất ngưng kết” thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu nhóm máu [17], đây có thể được coi là khái niệm đầu tiên về lectin. Trong hai thập kỷ này, bên cạnh các công trình mang tính điều tra về sự hiện diện của lectin trong sinh giới, phần lớn các nhà khoa học đã tập trung vào việc tinh chế lectin để nghiên cứu cấu trúc và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt 8 tính của lectin, trên cơ sở đó tìm cách sử dụng lectin nhằm phục vụ cho đời sống con người. - Từ năm 1970 đến nay: Giai đoạn này, tiến độ nghiên cứu lectin được đẩy nhanh. Nhiều kết quả thú vị đã được công bố như việc tìm thấy lectin ở nấm nhầy và ở cơ thể người. Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đưa ra định nghĩa “Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [26]. Khái niệm này đồng nhất với định nghĩa về lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm 1982: “Lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [28]. Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc liên quan đến chức năng của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [62]. Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạt tính sinh học, Peuman và cộng sự đã phân chia lectin thành 3 loại:  Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liên kết đường, do đó không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các hợp chất liên kết đường. Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan (Orchidaceae).  Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khả năng gây ngưng kết tế bào và gây tủa, do tương tác với nhiều loại hợp chất cộng hợp đường. Đó chính là các lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được phát hiện bởi vì khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi là hemmagglutinin.  Chimerolectin là những phân tử, trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học). Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom typ 2 (RIP, Type 2) có trong hạt thầu dầu (Ricinus communis L.,) hoặc hạt cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.). Song song với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâu vào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các lectin, để sử dụng chúng một cách thiết thực và có hiệu quả hơn. Hiện nay các nhà khoa học đã hiểu biết khá nhiều về bản chất của lectin. Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất về lectin như sau: “Lectin là một loại protein không gây đáp ứng miễn dịch có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết. Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc 9 glycolipid bề mặt. Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau”(www.thuvienkhoahoc.com.vn). 1.2.2. Sự phân bố của lectin trong sinh giới  Sự phân bố lectin trong giới thực vật Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt. Tác giả Allen và Brillantine (1969), đã tiến hành điều tra ở 2663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó các cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [11]. Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin. Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [7]. Lectin từ họ Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [3]. Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y (Lichenes) và Rong (Algae). Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [17], từ đó đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khác nhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam… Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật .  Sự phân bố lectin trong giới động vật Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm. Lectin trong giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus). Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra. Ở Việt Nam, khi khảo sát 10 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang-Khánh Hòa xuất hiện 10 loài có chứa lectin [9]. Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều tra cơ bản. Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) cũng có chứa lectin. Ngoài ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)…. Một kết quả nghiên cứu khá thú vị, là ở mô người như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin. Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin. Đó cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [14].  Lectin có nguồn gốc vi sinh vật Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện là vào năm 1942, khi Hirst và cộng sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [9]. Trên đối tượng là vi khuẩn E. coli, Ofek (1987) đã cho biết: trên bề mặt của tế bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào. Hoạt tính này mất đi khi có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất amin của nó. Đó chính là lectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn. Dạng lectin này cũng đã được phát hiện ở một số loài vi khuẩn khác như Houssto năm 1983 hay của Smit và cộng sự năm 1984 [57].  Sự định khu của lectin trong tế bào và cơ thể sinh vật Nghiên cứu sự xuất hiện của lectin đã cho thấy, trong một cơ thể, lectin có thể có ở bộ phận, cơ quan này nhưng lại không có ở bộ phận, cơ quan khác. Hàm lượng lectin cũng biến đổi trong quá trình sinh trưởng của sinh vật. Với các cơ thể ở thực vật, sự định khu của lectin khá rộng: ở lá, hoa, thân và đặc biệt là hạt, hầu hết các loài thực vật hạt kín, hạt thường chứa nhiều lectin nhất. Trong cơ thể động vật, lectin có trong huyết thanh ở một số mô và cơ quan đặc biệt là mô cơ. Ngoài ra, còn có ở giao tử hoặc tế bào trứng. Ở mức độ tế bào, sự định khu của lectin cũng đã được phát hiện. Một số công trình đã khẳng định lectin có trong nguyên sinh chất và một số bào quan của tế bào. Gần đây cũng đã chứng minh sự tồn tại của lectin ở trong nhân tế bào ở một số loài bò sát và động vật có vú [9]. 1.3 . LECTIN TỪ RONG BIỂN 1.3.1. Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài 11  Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Công trình khoa học đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vào năm 1966, ông đã phát hiện rong biển cũng có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu ở người [17]. Kể từ đó có rất nhiều công trình công bố sự có mặt của lectin trong rong biển: Năm 1988, Hori đã khảo sát hoạt tính ngưng kết hồng cầu của 31 loài rong biển trên hồng cầu người và động vật. Từ kết quả nghiên cứu đạt được ông đã cho rằng hoạt tính ngưng kết hồng cầu đóng một vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tế bào rong biển. Và hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loài rong biển khác nhau [30]. - Tại Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phong trong việc nghiên cứu lectin từ rong biển. Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loài rong biển thuộc 3 dòng rong: rong đỏ, rong nâu và rong xanh. Trong đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu từ rong đỏ là phổ biến nhất [23, 33]. - Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ở nhiều địa điểm khác nhau trên thế giới với quy mô ngày càng lớn hơn: từ Nam Mỹ, Châu Âu, Châu Á cho đến các vùng Nam cực. Hơn thế nữa, không chỉ dừng lại ở việc khảo sát sự có mặt của lectin trong rong biển mà những tính chất cơ bản của nó cũng đã được chú tâm đến [17, 29]. - Tuy nhiên, cho đến nay số lượng lectin được tinh sạch cũng như khảo sát đặc tính hóa sinh vẫn còn rất khiêm tốn, đặc biệt là khi so sánh với lectin từ thực vật bậc cao . Hầu hết trong số đó là các lectin từ rong biển mà chủ yếu là ở một số dòng rong đỏ như: Bryothamnion seaforthii, B. triquetrum; Solieria filiformis [22]; Pterocladiella capillacea [69] ….Trong số đó, có một vài lectin từ dòng rong đỏ đã được làm sáng tỏ về cấu trúc bậc 1 như: H. japonica và Vidalia obtusiloba [22]. Trong khi đó, mặc dù chức năng sinh học của lectin vẫn chưa được làm rõ, nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng lectin từ rong biển có khả năng điều chỉnh hệ miễn dịch, kháng u, kháng ung thư…Đặc biệt, hàng loạt lectin có khả năng liên kết với glycoprotein N-glycan dạng high manose như: lectin ESA_2 của rong đỏ Eucheuma serra , lectin từ rong đỏ Griffithsia sp. [34] hay lectin KAA_2 của rong đỏ Kappaphycus alvarezii [65]…có khả năng gắn kết với bề mặt của các tế bào có 12 glycoprotein dạng high manose đặc biệt là trên lớp vỏ của virus HIV, HBV và một số loài virus gây bệnh khác [33]. Những kết quả đạt được cho thấy rằng, lectin từ rong biển mà đặc biệt là rong đỏ là nguồn nguyên liệu hữu ích để sử dụng trong các nghiên cứu hóa sinh và y sinh trong giai đoạn sắp tới.  Tình hình nghiên cứu trong nước Khác với lectin từ thực vật cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ rong biển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu của Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang. Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiên cứu tại đây đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển khác nhau, thuộc 3 dòng: rong đỏ, rong nâu và rong xanh. Kết quả cho thấy, hầu hết các loài rong biển đều có khả năng gây ngưng kết với ít nhất một loại hồng cầu từ động vật như thỏ, cừu, gà, ngựa và 3 nhóm máu A, B, O của người. Một số tính chất hóa sinh như liên kết carbohydrate, khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứng dụng của các lectin này cũng đang được nghiên cứu [33, 34,10]. 1.3.2. Cấu tạo của lectin từ rong biển  Khối lượng phân tử của lectin từ rong biển Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ion hóa phun điện tử (electron spray ionization-mass spectrometry) khối lượng phân tử của khá nhiều dạng lectin đã được xác định. Kết luận có thể dẫn ra ở đây là khối lượng phân tử của lectin từ rong biển cũng có sự dao động khá lớn và lectin có nguồn gốc khác nhau thì khối lượng có thể giống nhau hoặc khác nhau. Lectin có nguồn gốc từ rong biển có khối lượng phân tử bé nhất là lectin của Hypnea japonica thuộc dòng rong Đỏ, khoảng 4,2 kDa. Trong khi đó lectin có khối lượng phân tử lớn nhất cũng thuộc dòng rong Đỏ, Ptilota plumose, gồm một chuỗi polypeptide khoảng 170 kDa [35]. Năm 1991, Rogers đã tinh chế lectin từ rong xanh Codium fragile và đã xác định khối lượng phân tử của nó là 60 kDa, bao gồm 4 chuỗi polypeptide có cùng khối lượng là 15 kDa cấu tạo nên [63]. Dạng lectin này có điểm đẳng điện trong khoảng từ 3,8 đến 3,9. Bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, Jong Won Han và các cộng sự 13 (2011) đã xác định khối lượng phân tử của Bryopsis plumosa là 11,5 kDa, lectin này ở dạng đơn phân [35]. Cho đến nay, có khá nhiều nghiên cứu công bố về khối lượng phân tử của lectin và đã cho thấy mức độ biến đổi khá mạnh của chúng. Tuy nhiên, so với khối lượng phân tử của lectin từ thực vật bậc cao như lectin từ hạt đậu rựa (Canavalia ensiformis L.,) là 108 kDa hay lectin từ động vật như sam biển Việt Nam (Tachpleus tridentatus) có khối lượng phân tử lên đến trên 700 kDa thì khối lượng phân tử của lectin từ rong biển lại khá thấp, phần lớn trong chúng dao động tập trung trong khoảng từ 15 đến 45 kDa. Các nhà khoa học cho rằng chưa thể tìm thấy được mối liên hệ nào giữa khối lượng phân tử lectin và hoạt tính của chính nó. Khối lượng phân tử của lectin không mang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóa của loài hay cá thể đó [9].  Cấu tạo phân tử lectin từ rong biển Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, khi nghiên cứu trình tự axit amin trong phân tử lectin từ rong biển các nhà khoa học đã nhận thấy: trình tự axit amin trong phân tử lectin phản ánh mối quan hệ trong quá trình tiến hóa. Khi nghiên cứu cấu trúc bậc nhất chuỗi α của lectin ở 3 loài rong cùng chi Eucheuma là E. serra, E. amakusaensis và E. cottonii, Kawakubo và cộng sự đã cho biết: trình tự của 20 axit amin đầu N của có tỷ lệ tương đồng rất cao, thành phần gốc axit amin chủ yếu giàu các gốc Glx, Asx, Gly và Ser [37, 38]. Bảng 1.1. Trình tự sắp xếp các axit amin đầu tận cùng N của các chuỗi α ở một số loài rong thuộc chi Eucheuma Trọng lượng Trình tự sắp xếp (kDa) (20 axit amin đầu N) ESA-1 29 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAG ESA-2 29 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAG EAA-1 29 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAG EAA-2 29 GRYTVKNQWGGSSAPWNDAG EAA-3 29 GRYTVKNQWGGSSAPWNDAG ECA-1 29 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAG ECA-2 29 GRYTVQNQWGGSSAPWNDAG Loài E. serra E. amakusaensis E. cottonii 14 Có khá nhiều công trình đã chỉ ra rằng hầu hết các dạng lectin từ rong biển được cấu tạo từ một mạch polypeptide. Chỉ một số ít lectin có cấu tạo từ hai mạch polypeptide trở lên, mỗi mạch polypeptide tạo thành một tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị này có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau. Ví dụ như lectin từ rong đỏ Vidalia obtusiloba có cấu trúc dimer, trọng lượng của 2 chuỗi polypeptide lần lượt là 59,6 và 15,2 Da [22], trong khi đó lectin từ rong xanh Codium fragile lại có cấu tạo tetramer với khối lượng mỗi đơn phân đều là 15000 Da [63]. Vào năm 2000, khi Hori và cộng sự nghiên cứu cấu trúc bậc nhất của 2 đồng phân lectin hypnin A-1 và hypnin A-2 từ rong đỏ Hypnea japonica cho thấy: chúng có cấu tạo đơn phân chỉ do một chuỗi polypeptide gồm 90 gốc axit amin tạo thành; trong đó, có 4 gốc cystines tạo thành 2 cầu nối disulfide: cys5-cys62 và cys12-cys89; 3 loại axit amin là serine, glycine và proline chiếm đến 43% số gốc axit amin có trong chuỗi polypeptide; trình tự axit amin của 2 lectin này chỉ khác nhau ở 3 vị trí: 19, 31 và 52, sự khác nhau của các gốc axit amin này không ảnh hưởng đến sự giống nhau về hoạt tính ngưng kết hồng cầu cũng như khả năng liên kết với một số glycoprotein của 2 loại lectin này. Mặt khác, ngoài glycoprotein, hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng còn bị ức chế bởi protein phospholipase A-2, điều này cho phép chúng ta nhận định rằng lectin hypnins không chỉ chứa vị trí liên kết với carbohydrate mà còn chứa vị trí liên kết với protein. Với trọng lượng phân tử chỉ xấp xỉ 9,1 kDa cùng với 2 cầu nối disulfide, đây được xem là 2 yếu tố chính làm tăng khả năng chịu nhiệt của 2 lectin này. Không những vậy, khi alkyl hóa hoặc cắt đứt cầu disulfide, Hori cũng nhận thấy hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng cũng bị mất đi, từ đây có thể đưa ra giả định rằng trung tâm hoạt động của 2 lectin này có chứa cầu nối disulfide [22]. Bất kỳ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc I hoặc cấu trúc không gian phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động. Đó là trung tâm liên kết carbohydrate. Chính trung tâm này quyết định hoạt tính của lectin. Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của chúng là các gốc axit amin hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin trung tâm hoạt động của chúng là do một số gốc axit amin như tyrozine, xerine, treonine, tryptophan… có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên. Các dạng lectin khác nhau thì có thành phần axit amin trong trung tâm hoạt động là khác nhau. Cho đến nay, vấn đề về trung tâm hoạt động của lectin vẫn còn rất phức tạp [18, 29]. 15 Về cơ chế hoạt động của lectin từ rong biển nói riêng đến sinh vật tự nhiên nói chung, các nhà khoa học đều thống nhất như sau: “Các trung tâm hoạt động của các phân tử lectin đều có khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt màng tế bào. Các liên kết sẽ được hình thành giữa các receptor trên bề mặt màng tế bào với các trung tâm hoạt động của lectin. Nhờ các liên kết này mà lectin đã kết dính các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết tế bào. Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các receptor trên bề mặt tế bào cũng khác nhau. Giống như enzyme, trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi nó nằm trong một chỉnh thể thống nhất, hoàn chỉnh của cấu trúc phân tử. Bất kỳ một tác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân tử lectin cũng đều làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của trung tâm này. Chính vì vậy, hoạt độ của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một số tác nhân lý hóa của môi trường” [9]. 1.3.3. Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển  Tính tan và kết tủa Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng. Lectin có bản chất là protein nên chúng dễ bị kết tủa bởi một số tác nhân lý hóa của môi trường như: tác dụng của ethanol, acetone, của một số muối trung tính ở nồng độ cao đặc biệt là ammonium sunphate.  Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của nó Qua các thí nghiệm về khả năng liên kết với các loại đường ở lectin được tách chiết từ rong biển, người ta nhận thấy lectin từ rong biển ít liên kết với các loại đường đơn hay đường đa như ở thực vật bậc cao hay động vật mà ngược lại nó liên kết với các glycoprotein dạng N-glycan hay O-glycan như: porcine stomach mucin, lactotransferrin, asialofetuin…[43, 69]. Phương pháp xác định sự tương tác giữa đường và lectin đang được sử dụng hiện nay là xác định hoạt độ ngưng kết hồng cầu của lectin khi có mặt một loại đường hoặc glycoprotein nào đó. Trường hợp hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn chứng tỏ đường hoặc glycoprotein đã kìm hãm hoạt tính của lectin. Ngược lại, hoạt độ lectin vẫn ổn định chứng tỏ đường hoặc glycoprotein không ức chế. Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường hoặc glycoprotein của lectin vẫn còn khá phức tạp. Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong 16 các nghiên cứu về lectin. Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó [33]. Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu. Gần đây, dựa vào các loại đường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học.  Khả năng gây ngưng kết tế bào Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật và người. Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin. Số lượng lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít vì chúng đồng thời có thể gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, cừu, gà, dê hay ngựa…. Theo tác giả Allen và Billantine, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loài chứa lectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loài chứa lectin không đặc hiệu nhóm máu. Lectin từ rong biển Ptilota plumosa ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu A đã xử lý papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác của người như O, B hay AB [63]. Các lectin đặc hiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng. Theo Sharon (1989), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi…[67].  Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ của lectin  Ảnh hưởng của pH Các nghiên cứu về điểm đẳng điện của lectin cho thấy: Tại điểm đẳng điện (pHi) hoạt độ lectin là bé nhất. Tại đó, lectin dễ bị kết tủa. pH ngoài điểm đẳng điện, lectin ở trạng thái phân ly tích điện, dễ hòa tan và có hoạt độ. Mỗi dạng lectin thường có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà ở đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định. Ở pH vùng axit và kiềm mạnh, hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn. So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển có khoảng pH thích hợp rất rộng, hầu hết từ pH từ 5 đến 9, đặc biệt có một số loại rong 17 như B. composite, D. versluysii hay V. fastigiata không bị giảm hoạt độ trong khoảng pH từ 3-9 [33].  Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường Lectin có bản chất là protein và glycoprotein nên nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt độ của chúng. Ở nhiệt độ thấp, hoạt độ lectin giảm. Nhiệt độ tăng dần lên, hoạt độ lectin cũng tăng lên và đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp. Hầu hết các lectin đều bị mất hoạt độ ở nhiệt độ cao. Ở nhiệt độ cao, protein lectin bị biến tính không thuận nghịch. Hiện tượng sốc nhiệt cũng có thể làm mất hoạt độ lectin. So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, hoạt độ của lectin từ rong biển khá ổn định với mức nhiệt độ khá cao. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong Pterocladiella capillacea cho thấy, hoạt độ vẫn ổn định ở mức 600C trong 30 phút, 50% hoạt độ chỉ bị mất đi sau 30 phút ở mức nhiệt là 700C và mất hoàn toàn ở 800C sau 10 phút [69]. Thí nghiệm này cũng có kết quả tương đồng với nhiều nghiên cứu của các tác giả khác khi khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển [22].  Ảnh hưởng của một số nhân tố khác Enzyme có khả năng làm tăng hoạt độ lectin. Trong nhiều thí nghiệm, các hồng cầu được xử lý bằng các enzyme như trypsin, chimotrypsin, papain… thì chúng dễ bị lectin làm ngưng kết. Ví dụ, khi xử lý hồng cầu nhóm máu O bằng papain thì hoạt độ của lectin từ dòng rong xanh Ulva lactuca tăng lên 7-8 lần [43]. Sở dĩ có hiện tượng này là vì khi hồng cầu xử lý với enzyme thì chính enzyme đã thủy phân giới hạn một số protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các nhóm carbohydrate của nó, vì vậy lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, dẫn đến hoạt độ lectin tăng lên. Cho đến nay, chưa có một công trình nào nghiên cứu đầy đủ về sự ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin. Mặc dù theo kết quả nghiên cứu của Benevides và Fabio thì hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ 2 loài rong đỏ Enantiocladia duperreyi và Vidalia obtusiloba phụ thuộc vào sự có mặt của cation hóa trị 2 là Ca2+ và Mn2+ [16, 22]. Nhưng rất nhiều dẫn liệu khoa học gần đây cho thấy rằng, khác với lectin từ thực vật bậc cao, hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển không bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại [29, 43]. 1.4. ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN 18 Lectin từ rong biển đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống. Các ứng dụng đó có thể được tóm tắt như sau:  Lectin trong huyết học Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫn còn được áp dụng rộng rãi. Phương pháp xác định nhóm máu bằng lectin cho kết quả nhanh, chính xác mà không cần dùng huyết thanh mẫu. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi lectin phải tinh khiết và có tính đặc hiệu cao. Việc sử dụng lectin từ rong biển để xác định nhóm máu cũng đã được sử dụng trong nhiều năm nay. Lectin từ rong Ptilota plumose gây ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ rong Codium fragile chỉ ngưng kết với hồng cầu máu A đã xử lý papain mà không thể ngưng kết với các nhóm máu khác như A, B, O hay AB [63].  Lectin trong tế bào học Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng tế bào và những biến đổi trên bề mặt màng tế bào trong quá trình biệt hóa bệnh lý thông qua sự thay đổi thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào. Năm 1988, lectin được tinh sạch từ Codium tomentosum được sử dụng như một công cụ để phát hiện sự có mặt của nhiều loại glycoprotein khác nhau mà phần lớn là Glu-NAc.  Lectin trong thuốc bảo vệ thực vật và ngũ cốc Lectin mà đặc biệt là lectin từ rong biển có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ và côn trùng có hại cho cây trồng vì chúng có khả năng liên kết với glycoprotein đường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tự chết. Bảng 1.2. Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng Nguồn lectin Loại côn trùng Ảnh hưởng Gracilaria cornea (rong Đỏ) Boophilus microplus Gracilaria ornate (rong Đỏ) Callosobruchus maculates Làm côn trùng chậm phát triển, giảm trọng lượng trứng và lượng trứng nở thành con… Làm côn trùng chậm phát triển… Liên kết đặc hiệu Fetuin, porcine stomach mucin Lima et al 2005 [47]. Fetuin, porcine stomach mucin Leite et al 2005 [44]. Tác giả 19  Lectin trong y học Lectin có tiềm năng rất lớn trong nhiều lĩnh vực. Lectin được sử dụng như một công cụ chẩn đoán có hiệu quả. Dựa vào khả năng phân biệt và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật, lectin từ rong biển được sử dụng kết hợp với các xét nghiệm thông thường khác để nâng cao giá trị chẩn đoán và điều trị bệnh trên sinh vật biển. Dịch chiết lectin từ rong Eucheua serra và Galaxaura marginata ức chế sự phát triển của vi khuẩn biển gây hại cho cá là Vibrio pelagius và Vobrio vulnificus, 2 loại vi khuẩn này gây bệnh ở cá [47]. Lectin từ một số loài rong nâu như Fucus vesiculosus, Dictyopteris membranacea, Fucus serratus…có khả năng gây ngưng kết và ức chế sự phát triển của các chủng nấm nhầy gây bệnh như Candida guilliermondi [74]. Lectin từ một số loài rong đỏ như Eucheuma serra, Oscillatoria agardhii hay Griffithsia sp. Có khả năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein dạng high manose Nglycan ở nồng độ rất thấp, đây là những glycoprotein có mặt chủ yếu trên bề mặt của màng tế bào HIV, do đó có thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế được khả năng mắc bệnh [33]. Như vậy có thể thấy, lectin đã và đang được nghiên cứu để sử dụng trong chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và rối loạn trao đổi chất, trong nghiên cứu sinh học và miễn dịch, làm mitogen trong nuôi cấy tế bào với mục đích chữa bệnh, tăng năng suất trong trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [9].  Lectin trong virus học Gần đây, lectin từ rong biển đang được xem là nguồn sản phẩm tự nhiên phong phú, có khả năng kháng virus mạnh mẽ. Ví dụ như grifftithsin (GRFT) [33], Oscillatoria agardhii (OAA) (Sato et al, 2007) [34], Eucheuma serra (ESA-2) [65] những lectin này đã cho thấy hoạt tính rất mạnh kháng lại virus HIV và những virus khác. Không giống như phần lớn các liệu pháp điều trị kháng virus hiện tại, những lectin có khả năng hoạt động qua sự ức chế chu kỳ sống của virus, ngăn chặn sự xâm nhập vào tế bào vật chủ của virus. Thêm vào đó, những lectin này thường chịu được nhiệt độ cao, pH thấp, không có mùi, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein trên bề mặt lớp vỏ của virus. Vì vậy, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong các nghiên cứu cơ bản và những ứng dụng của chúng trong tương lai. 1.5. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN[34] 1.5.1. Các kĩ thuật chiết xuất lectin 20 Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết xuất lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất. Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%; CaCl2 0,1M; dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl…  Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại. Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị 1, anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2O4, Na2SO4….Các protein khác nhau được kết tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau. Người ta sử dụng phương pháp này trong các quy trình chiết xuất lectin để cô đặc dung dịch protein cần tách.  Kết tủa phân đoạn bằng dung môi Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong nước như axetone, polyetylenglycol, ethanol…làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể bị kết tủa nhanh chóng. Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất dễ gây biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp.  Thẩm tách Phương pháp thẩm tách được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn. Trong phương pháp này, màng bán thấm ở dạng túi chứa chất cần thẩm tách đặt trong môi trường có pH nhất định, các phân tử nhỏ trong túi sẽ khuếch tán ra môi trường ngoài nhờ tác động của máy khuấy từ. Thẩm tách thường dùng để loại muối và những chất phân tử nhỏ không phải protein ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tích. 1.5.2. Các kỹ thuật tinh chế lectin  Sắc ký lọc gel Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thước phân tử. Chất giá thường được sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp. Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ xốp khác nhau. Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có 21 kích thước phân tử khác nhau. Để tinh chết lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G-75 và Sephadex G-100. Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân tử của chất cần tách.  Sắc ký trao đổi ion Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tùy thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm. Lợi dụng tính chất này người ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAEtrisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi cation. Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi. Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định.  Sắc ký ái lực Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là chất kết hợp (ligand) được gắn vào một chất giá tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất giá được sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình thực hiện sắc ký ái lực được tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực. - Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp có ái lực đặc hiệu với protein cần tách có ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của protein cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa protein và chất kết hợp. Trong các thí nghiệm tinh chế lectin người ta thường lựa chọn các chất đường, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đường có ái lực hóa học với một lectin nhất định. - Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái lực với cột: Các protein có ái lực với cột cần được tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột. 22 - Giai đoạn 3: Giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: Cần phải dùng một dung dịch giải hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột. Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy. 23 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Rong đỏ Kappaphycus alvarezii thu ở vùng biển Cam Ranh-Khánh Hòa. Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha TrangTp. Nha Trang-Tỉnh Khánh Hòa. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2/2015 đến tháng 6/2015. 2.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Vật liệu - Mẫu rong đỏ Kappaphycus alvarezii thu ở vùng biển Cam Ranh-Khánh Hòa. - Hồng cầu của máu thỏ lấy từ Viện Vaccine - Nha Trang. - Sâu tơ (Plutella xylostella ) và mọt gạo (Sitophilus oryzae) được cung cấp từ Chi cục bảo vệ thực vật - Kilomet 4 đường 23/10, xã Vĩnh Thạnh, Nha Trang, Khánh Hòa. - Chủng vi sinh vật được cung cấp từ bộ sưu tập của phòng Công nghệ sinh học biển – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang. 2.2.2. Hóa chất - BSA (Bovine serium albumin), enzyme Trypsin, EDTA(USA), thuốc thử Folin, agar, NaCl, NaH2PO4, Na2HPO4,… 2.2.3. Thiết bị nghiên cứu Thiết bị Model máy Xuất sứ Máy đo quang phổ UV-Vis 2505UV/VIS Labomed-Mỹ Máy ly tâm Z36HK Hermel-Đức Máy ly tâm eppendorf 5417R Eppendorf-Đức Máy đo pH 827pH Lab Metrohm-Thụy Sỹ Bể ổn nhiệt B12 Heraeus-Đức 24 Hệ thống sắc ký lọc gel FCF-920 Intertek-Thụy Điển Thiết bị điện di đứng AJ-6530 Atto-Japan Bể rửa siêu âm UC-20 Jeiotech-Hàn Quốc Cân phân tích CP224S OCE-Đức Máy khuấy PTN hình đĩa siêu CB 162 Stuart-UK Tủ ấm ON-11E Gallenkamp Tủ cấy vi sinh AV-100 Telstar-Tây Ban phẳng(x4) Nha 2.3. Tủ sấy chân không XF020 Etuves-Pháp Tủ sấy Model ON-11E Gallenkamp Nồi hấp khử trùng ES-315 TOMY-Nhật Thiết bị điện di đứng AJ-6530 Atto-Japan PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu [29] Hồng cầu được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của lectin là hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin.  Tiến hành: - Cho 25µL NaCl 0,85% vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. - Thêm 25µL mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngưng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha là 1/2n (n: số lần pha loãng). - Tiếp tục cho 25µL hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng. - Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.  Đọc kết quả: - Kết quả âm tính: tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ. 25 - Kết quả dương tính: hồng cầu trong giếng bị ngưng kết hơn 50%.  Đơn vị hoạt độ 1 đơn vị hoạt độ lectin hay 1 đơn vị hoạt độ NKHC trên 1 mL (HU/mL) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng.  Hoạt độ lectin được xác định theo 2 chỉ số: - Hoạt độ tổng (Utổng): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất định. Đơn vị: HU Utổng = V. 2n Trong đó: V: tổng thể tích (mL) n: số lần pha loãng - Hoạt độ riêng (Uriêng): là số đơn vị hoạt độ lectin có trong 1mg protein. Đơn vị: HU/mg ê = U Protein Trong đó: Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính. Proteintổng: tổng hàm lượng protein. - MAC (minimum agglutination concentration) là nồng độ nhỏ nhất có khả năng gây ngưng kết hồng cầu thỏ đã được xử lý trypsin. Đơn vị (mg/HU). 2.3.2. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)[50] Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm 1951 , dùng Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn.  Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein ở nồng độ vài chục micro gram (µg).  Hóa chất Dung dịch A: 4 g NaOH (0,1M) và 20 g Na2CO3 (2%) pha trong 1000 mL nước cất. 26 Dung dịch B: 0,5 g CuSO4.5H2O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%. Dung dịch C: Hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi sử dụng). Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng. Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1 mg/mL.  Các bước tiến hành Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10 mL nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/mL. Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/mL để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn. Lấy chính xác 0,5 mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 mL thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 750 nm. Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường. 0.25 y = 0.001x + 0.027 R² = 0.994 0.2 OD750 0.15 0.1 0.05 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Nồng độ protein (µg/mL) Hình 2.1. Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị và tiến hành bổ sung các hóa chất như đã nêu trên. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính giá trị protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình. 27 2.3.3. Phương pháp tách chiết lectin từ rong K. alvarezii[10, 34] Rong Kappaphycus alvarezii Bảo quản -200C Cắt, xay nhuyễn ở 40C  Nhiệt độ chiết: 40C.  Dung môi: dung dịch ethanol 20%. Chiết  Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi(w/v) = 1:2  Thời gian chiết: 8 giờ. Lọc Loại bã  Dung môi ethanol 95%.  Tỉ lệ nguyên liệu: dung Kết tủa lectin môi(v/v) = 1:4.  Nhiệt độ: 40C. Ly tâm thu kết tủa lectin Thẩm tách làm sạch lectin  Thời qian: 4 giờ. 28 Chế phẩm lectin thô Săc ký lọc gel S-200 Xác định: Điện di SDS - PAGE     Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của nhiệt độ Khả năng kháng khuẩn Khả năng diệt sâu xanh hại rau  Khả năng xua đuổi mọt gạo Lectin Hình 2.2. Sơ đồ quy trình công nghệ thu nhận và tinh chế lectin từ rong K. alvarezii Mẫu rong K. alvarezii thu từ biển Cam Ranh. Sau đó, rong được bảo quản trong các thùng xốp để tránh dập nát rồi đưa về phòng thí nghiệm. Tiến hành rửa sạch rong, cho vào các túi nilong, bảo quản trong tủ đông -20oC, xay rong thành bột mịn bằng cối xay inox có bổ sung Nitơ lỏng, chia đều rong thành các mẫu có khối lượng như nhau để chuẩn bị cho quá trình tách chiết. Dung môi dùng để chiết lectin là ethanol 20%, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) 1:2, thời gian chiết 8 giờ và nhiệt độ chiết 4oC. Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lẫn trong DC, thu dịch trong để chuẩn bị cho quá trình tinh chế tiếp theo. Sau đó, tiến hành kết tủa lectin bằng ethanol 95% với tỷ lệ DC : ethanol (v/v) là 1:4, nhiệt độ tủa 4oC và thời gian tủa 4 giờ. Tiến hành ly tâm lạnh dịch sau tủa ở 4oC với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút để thu phần kết tủa. Phần kết tủa được loại 29 muối và các phân tử nhỏ không phải là lectin ra khỏi dung dịch chứa lectin bằng phương pháp thẩm tách trong dung môi là PBS 0,05M, pH 7, 40C trong 8 giờ. Tiếp tục tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sepharyl S – 200. Xác định độ tinh sạch và trọng lượng phân tử của lectin qua các bước tinh sạch bằng phương pháp điện di SDS-PAGE. 2.3.4. Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S- 200 [12, 24, 54]  Nguyên tắc Hình 2.3. Nguyên tắc của sắc ký lọc gel Khi cho hỗn hợp chứa những phân tử có kích thước khác nhau qua cột sắc ký, chứa những lỗ có kích thước giới hạn nhất định thì các phân tử có kích thước lớn hơn không khuếch tán qua lỗ. Do đó, chúng sẽ ra khỏi cột trước. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào trong lỗ gel và di chuyển trong lỗ gel. Sau đó, chúng sẽ được đẩy ra khỏi cột bằng một dung dịch đẩy. Kết thúc quá trình sắc ký sẽ thu được các protein có kích thước khác nhau được phân tách. Sephacryl S -200: là gel agarose, có khả năng phân tách những protein có kích thước từ 5 × 103 - 2.5 × 105 Da. Vì vậy khi cho dung dịch chứa protein qua cột, những phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trước, những phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ hơn sẽ đi vào trong gel nên ra sau. Các thông số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel được thiết lập như sau: - Gel: Sephacryl S- 200 30 - Kích thước cột: đường kính 1,6 cm, chiều cao 40 cm. - Đệm: PBS 0,05M pH 7 (đã loại khí) - Thể tích mẫu qua cột: 1mL - Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút - Thể tích mỗi phân đoạn thu nhận: 3mL/phân đoạn - Số lượng phân đoạn: 30 phân đoạn 2.3.5. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE [39]  Nguyên tắc Điện di là sự dịch chuyển các chất có điện tích trong điện trường, tốc độ dịch chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của chất đó. SDS- PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol. Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ còn phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết.  Đổ gel  Gel phân tách 12,5% (Separating gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch: Acrylamide/Bis (15,5:1) 3,8 mL Tris – HCl 3M; pH 8.8; 0,8 % SDS 5 mL Glycerine 2g Nước cất 4,2 mL APS 10% 50 µL TEMED 5 µL 31 Sau khi cho TEMED vào, khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 2 giờ).  Stacking gel Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch khác: Acrylamide/Bis (15,5:1) 1 mL Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS 3,1 mL Nước cất 8,4 mL APS 10% 100 µL TEMED 10 µL Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đỗ hết nước bên trên. Tiến hành đỗ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di.  Tiến hành chạy điện di Cho 20µl dung dịch mẫu cần kiểm tra vào các giếng. Tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự dịch chuyển của vạch màu xanh (bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm. Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R250, trong 30 phút. Sau đó cho tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic: nước). Protein sẽ được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.  Xác định trọng lượng phân tử của protein Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối cùng). Tính giá trị Rf. Rf = Khoảng cách di chuyển của protein lectin Khoảng cách từ gel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol) blue 32 Trọng lượng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf trên, nhờ phương pháp ngoại suy theo đồ thị. Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch protein. Kết quả được trình bày trong bảng PL 2. Từ đó, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lượng phân tử) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel. 5.5 5 Lg M 4.5 4 3.5 y = -1.369x + 5.092 R² = 0.985 3 2.5 2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Rf Hình 2.4. Đồ thị tương quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn Phương trình hồi quy tuyến tính thu được từ hình 2.4: Y = -1,369x + 5,092 R2 = 0,985 Trong đó: Y: là lgM (lg trọng lượng phân tử). x: là Rf (tỷ số khoảng cách di chuyển của protein và vạch màu cuối cùng tính từ gel phân tách). Từ phương trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng phân tử của protein theo công thức sau: M = 10y Trong đó: M: là trọng lượng phân tử (đơn vị: Da) y: là lgM 2.3.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii[34] a. Ảnh hưởng của nhiệt độ 33 Cho 0,5-1 ml mẫu dung dịch lectin đun nóng tại những nhiệt độ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100(0C) trong 30 phút, sau đó làm lạnh ngay trong đá và đo lại hoạt tính NKHC để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đế hoạt tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii. b. Ảnh hưởng của pH Cho 0,5 đến 1 ml mẫu dung dịch lectin thẩm tách với dung dịch đệm ở nhiệt độ phòng, qua đêm với các mức pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Sau đó, thẩm tách ngược lại với NaCl 0,85%. Phần dịch trong túi thẩm tách được thu lại và thử hoạt tính NKHC để xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong K. alvarezii. Những dung dịch đệm được sử dụng: Đệm acetate pH: 3, 4, 5 Acitic acid/ acetate natri Đệm phosphate pH: 6, 7 Na2HPO4.12H2O/ NaH2PO4.2H2O Đệm tris HCl pH: 8 Tris/HCl Đệm cacbonate pH: 9, 10 Na2CO3/NaHCO3 2.3.7. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii Đánh giá khả năng kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.  Tiến hành - Chuẩn bị dịch huyền phù của vi khuẩn đã được nuôi cấy qua 24 giờ với mật độ khoảng 109 tế bào/mL. Trải dịch huyền phù vi khuẩn lên môi trường thạch trong đĩa petri. - Sử dụng thanh kim loại vô trùng để tạo thành những giếng nhỏ có đường kính khoảng 5mm trên bề mặt môi trường thạch. - Nhỏ một lượng lectin nhất định vào mỗi giếng của đĩa thạch. Hoạt chất lectin sẽ khuếch tán trên môi trường thạch, ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn. - Ủ đĩa ở 370C. Sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tùy thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ. 34  Vi khuẩn thí nghiệm Bảng 2.1. Các vi khuẩn dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii Kí hiệu Vi khuẩn T1 Staphylococcus hominis T2 Pseudomonas aeruginosa T3 Clostridium perfringens T4 Acinetobacter baumannii T5 Vibrio parahaemolyticus T6 Vibrio harveyi 2.3.8. Bố trí thí nghiệm diệt sâu tơ Giới(regnum): Animalia Ngành(phylum): Arthropoda Lớp(class): Insecta Bộ(ordo): Lepidoptera Hình 2.5. Sâu tơ (P. xylostella) Họ(familia): Plutellidae Chi(genus): Plutella Loài(species): P. xylostella Xác định ảnh hưởng của lectin lên sâu xanh hại rau ở các nồng độ khác nhau của dung dịch lectin sau quá trình tinh chế bằng sắc ký lọc gel ở các nồng độ: 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,4 mg/ml. Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm diệt sâu tơ (P. xylostella) bằng dịch lectin từ rong K. alvarezii 35 Tiến hành phun trực tiếp dịch lectin từ rong lên lá cải rồi đặt chúng vào các hộp nhựa chứa 20 cá thể sâu mỗi hộp và các hộp được đặt trong khay chứa nước để ngăn chặn các côn trùng hại mẫu thí nghiệm. Tiến hành thay lá cho sâu ăn sau 24 giờ trong vòng 7 ngày và tiến hành quan sát ghi nhận kết quả sâu chết, qua đó đánh giá hiệu lực diệt sâu của lectin từ rong. 2.3.9. Bố trí thí nghiệm xua đuổi mọt gạo Giới(regnum): Animalia Ngành(phylum): Arthropoda Lớp(class): Insecta Bộ(ordo): Coleopteran Hình 2.7. Mọt gạo (S. oryzae) Họ(familia): Curculionidae Chi(genus): Sitophilus Loài(species): S. oryzae Xác định ảnh hưởng của lectin lên mọt gạo bằng dung dịch lectin sau sắc ký lộc gel ở nồng độ 0,4 mg/ml. Thí nghiệm được bố trí như trong hình 2.8: Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm xua đuổi Mọt gạo bằng dịch lectin chiết từ rong K. alvarezii Với lượng gạo chiếm khoảng 70% ở khay nhựa có chứa dịch lectin và 100% với khay nhựa chứa gạo trắng. Dịch lectin được thấm vào trong viên bông gòn thấm 36 nước với 200 ul dịch lectin và được đặt vào giữa khay có chứa khoảng 200 cá thể mọt ở những độ tuổi khác nhau, sau 12 giờ lại tiếp tục bổ sung thêm 200 ul vào bông gòn. Kết quả được ghi nhận sau 12 giờ mỗi ngày và sau khi mọt có di chuyển hết khỏi khay chứa dịch lectin thì kết thúc thí nghiệm, ghi nhận kết quả. 2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft office Excel 2007. 37 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 . KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH LECTIN TỪ RONG ĐỎ KAPPAPHYCUS ALVERAZII 3.1.1. Chiết và tinh sạch lectin từ rong đỏ K.alverazii Sau quá trình chiết lectin từ rong Sụn K. alvarezii bằng ethanol 20%, ly tâm thu dịch và bỏ cặn ở 6000 vòng/phút trong 15 phút. Tiếp tục kết tủa dịch chiết bằng ethanol 95%, theo tỷ lệ DC : ethanol (v/v) 1:4; ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/phút trong 30 phút, lượng tủa thu được tiến hành xác định trọng lượng rồi tiến hành thẩm tách qua đêm trong PBS 0,05M - pH 7, mục đích loại bỏ muối và các phân tử có khối lượng phân tử thấp không phải protein, làm tăng thêm độ tinh sạch cho chế phẩm lectin. Kết quả thống kê về hoạt tính ngưng kết (HA), hoạt độ riêng (HĐR), hoạt độ tổng số (HĐTS), nồng độ ngưng kết nhỏ nhất (MAC) của quá trình tách chiết và tinh chế lectin từ rong K.alverazii được trình bày trong bảng 3.1 dưới đây: Bảng 3.1. Kết quả quá trình thu chiết lectin từ rong đỏ K. alvarezii Mẫu Dịch chiết Dịch sau thẩm tích Dịch lectin sau sắc ký lọc gel V (ml) Protein (mg) HA MAC (HU/ (mg/ ml) HU) HĐTS (HU) Độ HĐR tinh (HU/ sạch mg) (lần) 200 284 64 0,022 12800 45,07 1 12,5 58,5 512 0,009 6400 109,4 2,43 7 9,52 512 0,003 3584 387,46 8,6 HĐR dịch lectin sau tinh sạch Trong đó: Độ tinh sạch = (lần) HĐR dịch chiết thô Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy, sau mỗi bước tách chiết, làm sạch dịch chiết lectin thì hoạt độ NKHC (HA) tăng lên đáng kể, điều này là do các phân tử không phải lectin đã bị loại bỏ dần, dẫn đến hàm lượng protein tổng của dịch giảm đi. 38 Hoạt độ riêng (HĐR) của dịch lectin tăng từ 45,07 lên 109,4 (HU/mg) qua các bước thu nhận. Độ tinh sạch của dịch cũng được tăng lên gấp 2,43 lần so với dịch thô ban đầu. Nồng độ nhỏ nhất gây NKHC (MAC) của dịch lectin thu được giảm dần từ 0,022 mg/HU ở dịch thô và giảm xuống chỉ còn 0,009 mg/HU đối với dịch sau thẩm tách.  Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 Lấy 1mL dịch tủa sau thẩm tách cho vào cột gel Sephacry S - 200, tiến hành chạy sắc ký lọc gel ở 40C với tốc độ 1,2mL/phút, dung dịch đẩy là đệm PBS 0,05M pH 7(đã được loại khí), thu 30 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn là 3 ml. Tiến hành đo OD ở bước sóng 280 nm và xác định hoạt độ NKHC của từng phân đoạn thu được. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giá trị OD280, hoạt độ NKHC và thứ tự các phân đoạn. II 70 0.3 Hoạt độ ngưng kết 50 0.25 A 280 nm 40 0.2 30 0.15 20 OD280 Hoạt tính NKHC 60 0.35 0.1 I 10 0.05 0 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Phân đoạn Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (A= 280nm) và hoạt độ NKHC của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacry S - 200 Từ hình 3.1 chúng tôi ghi nhận được 2 peak có chỉ số OD cao, trong đó lượng protein mẫu chủ yếu tập trung vào peak số II. Như vậy, theo dự đoán sơ bộ, hỗn hợp protein qua lọc gel gồm 2 peak chủ yếu có 2 loại protein có khối lượng phân tử khác nhau. Cũng dựa trên kết quả từ sắc ký đồ, mặc dù hàm lượng protein được thể hiện ở 2 peak, nhưng chỉ có peak số II mới thể hiện hoạt độ NKHC một cách rõ rệt nhất, 39 trong khi đó peak I lại không thể hiện hoạt độ NKHC. Từ đó, có thể dự đoán rằng protein lectin cần tinh sạch được phân bố chủ yếu tại peak số II này. Trong peak số II, hoạt độ NKHC và hàm lượng protein tập trung chủ yếu ở các phân đoạn 18, 19, 20, 21, 22 và 23 nên chúng tôi tiến hành thu hồi các phân đoạn này và ultrafilter (dùng màng lọc 10 kDa) dịch lectin sau sắc ký để cô đặc lại nồng độ và thể tích dịch để thực hiện quá trình chạy điện di xác định khối lượng phân tử lectin. Kết quả từ bảng 3.1, qua các bước tinh sạch, chúng ta nhận thấy, HĐTS cũng như hàm lượng protein tổng số của chế phẩm thu được giảm đi đáng kể từ 12800 HU và 284 mg xuống còn 3584 HU và 9,52 mg tương ứng. Điều này có thể giải thích là do sự tổn thất và biến tính bất thuận nghịch của một số phân tử protein trong suốt quá trình tinh sạch. Khi tiến hành tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel, lượng mẫu cho chạy qua cột sắc ký đã bị pha loãng nhiều lần trong pha động, đồng thời sự phân tách protein thành các peak dựa trên trọng lượng phân tử cũng đã loại bỏ được đáng kể những protein không mong muốn nên dẫn hàm lượng protein lại giảm đáng kể. Kết quả từ bảng 3.1 cũng cho thấy, qua các bước tinh sạch HĐR của protein lectin từ rong K. alvarezii tăng lên đáng kể (từ 45,07 HU/mg của DC, sau đó tăng lên 109,4 HU/mg ở dịch sau thẩm tách và đạt 387,46 HU/mg ở bước sắc ký lọc gel. Sự thay đổi này là vì quá trình tủa đã loại bớt được một số tạp chất và các protein không mong muốn cũng đã bị loại bỏ tiếp tục qua quá trình sắc ký lọc gel. Dựa trên nguyên tắc phân đoạn của sắc ký lọc gel với Sephacryl S – 200 cho phép thu được những phân tử protein có khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 5 đến 250 kDa và kết quả xác định hoạt độ NKHC trên mỗi phân đoạn, chúng ta sẽ loại bỏ được các tạp chất và protein có kích thước nằm ngoài giới hạn hoặc không thể hiện hoạt độ NKHC nên HĐR của lectin sau khi tinh sạch và hệ số tinh sạch ở giai đoạn này đều cao nhất (HĐR 387,46 HU/mg, độ tinh sạch là 8,6 lần). Kết quả này cũng được minh chứng rõ hơn, khi nồng độ protein nhỏ nhất có thể tạo nên 1 đơn vị hoạt độ NKHC cũng giảm dần qua các bước tinh sạch: MAC ở dịch thô là 0,022 mg/HU; sau khi tủa giảm còn 0,009 mg/HU và sau khi sắc ký lọc gel giá trị này chỉ còn 0,003 mg/HU. 3.1.2. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 40 Tiến hành chạy điện di các dịch protein thu được qua từng bước tinh sạch trên gel polyacrylamide nồng độ 12,5% với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Thang protein chuẩn là những protein có trọng lượng phân tử từ 6500 đến 116000 Da. Các bước tiến hành chạy điện di được trình bày ở mục 2.3.5. Kết quả thu được như sau: Hình 3.2. Kết quả điện di protein lectin từ rong đỏ K. alvarezii qua từng bước tinh sạch Trong đó: Giếng 1: Thang chuẩn protein Giếng 2: DC thô Giếng 3: Chế phẩm lectin sau thẩm tách Giếng 4: Chế phẩm qua sắc ký lọc gel (peak II phân đoạn 18 đến 23) Giếng 5: Phân đoạn 20 Giếng 6: Phân đoạn 20 + chất khử 2-mercaptoethanol Từ kết quả điện di trên gel và công thức tính trọng lượng phân tử của protein mục 3.1.1, có thể xác định được trọng lượng phân tử protein lectin qua các bước tinh sạch. 41 Bảng 3.2. Trọng lượng phân tử lectin từ rong đỏ K. alvarezii qua các bước tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE Giếng Mẫu 2 Dịch chiết thô - Chỉ lấy band đậm 3 Chế phẩm lectin sau thẩm tách 4 Vạch 1 Vạch 2 Vạch 3 54819 (Da) 28318(Da) 18859(Da) 54819(Da) 28318(Da) 18859(Da) 54819(Da) 28318(Da) _ 28318(Da) _ _ 28318(Da) _ _ Chế phẩm qua sắc ký lọc gel (peak II phân đoạn 18 đến 23) 5 Giếng 5 (phân đoạn 20) 6 Giếng 6 (phân đoạn 20 + 2-mercaptoethanol) Kết quả điện di từ hình 3.2 và bảng 3.2 cho thấy: sau mỗi bước tinh sạch, các protein tạp trong DC đã được loại bỏ đáng kể. So với giếng số 2, các vạch protein ở giếng số 3 có màu đậm hơn và chỉ xuất hiện ở 3 vị trí (54,819; 28,318; 18,859 kDa), trong đó vạch thứ 2 (ở vị trí 28,318 kDa) thể hiện rõ nhất. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả sắc ký đồ với nhựa Sephacryl S-200 khi ở đây xuất hiện lần lượt 2 peak, trong đó peak thứ 2 có nồng độ protein cao hơn rất nhiều so với peak 1. Ở giếng số 4, chỉ xuất hiện 2 vạch ở vị trí 54,819 và 28,318 kDa, trong đó vạch protein thứ 2 có khối lượng khoảng 28,318 kDa được nhận biết là của lectin, vì nó thể hiện hoạt độ NKHC một cách rõ rệt nhất (hình 3.1). Trong khi đó, vạch ở vị trí 54,819 kDa lại rất mờ, đây có thể là do sự lẫn tạp protein từ peak số 1 sang trong quá trình phân tách protein của sắc ký lọc gel. Giếng số 5 và số 6 lần lượt là kết quả điện di của phân đoạn 20 không có chất khử và phân đoạn 20 có bổ sung chất khử 2-mercaptoethanol. Tuy nhiên, kết quả cho thấy, cả 2 giếng này đều chỉ xuất hiện một vạch duy nhất ở cùng một vị trí (28,318 kDa), do vậy có thể nói lectin của rong K. alvarezii đã được phân tách ra khỏi DC, có trọng lượng phân tử xấp xỉ 28,318 kDa và phân tử này tồn tại ở dạng đơn phân. Kết quả thực nghiệm của chúng tôi cho thấy sự tương đồng cao đối với nghiên cứu của Rogers và cộng sự năm 1991 [63] khi cho rằng, lectin từ rong biển thường có 42 trọng lượng phân tử thấp, khoảng từ 12 – 43kDa. Theo nghiên cứu của Kawakubo năm 1997 và 1999 [37, 38], lectin từ rong Eucheuma serra và E. amakusaensis cũng là những protein dạng monomer, có khối lượng phân tử xấp xỉ 29000Da. Ngoài ra, kết quả nghiên của của TS. Lê Đình Hùng và cộng sự năm 2011 về rong Kappaphycus alvarezii và E. denticulatum cũng cho thấy lectin của chúng có trọng lượng khoảng 28000 Da và tồn tại ở dạng monomer. Mặt khác nghiên cứu của TS. Lê Đình Hùng và ctv cũng cho thấy, cũng giống như lectin từ vi khuẩn hầu hết các lectin từ rong biển đều ở dạng monomer và có trọng lượng phân tử thấp. Trong khi đó lectin từ thực vật bậc cao lại được tạo thành từ sự gắn kết của 2 cho đến 4 monomer khác nhau và thường có trọng lượng phân tử lớn hơn, dao động từ 50000 đến 700000 Da [34]. 3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA LECTIN 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ  Nhiệt độ hoạt động tối ưu Để khảo sát nhiệt độ tối ưu của lectin từ rong K. alvarezii, lectin sẽ được xử lý ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 20oC đến 100oC trong vòng 30 phút, sau đó làm lạnh nhanh và xác định hoạt độ NKHC của lectin với hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin. Kết quả được trình bày trong bảng PL 5 và hình 3.3: Hoạt độ NKHC HU/ml 600 Hoạt độ NKHC HU/mL 500 400 300 200 100 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nhiệt độ Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii Ở nhiệt độ 20oC HĐTS của lectin đạt giá trị cực đại HA = 29. Khi tăng dần nhiệt độ từ 20 đến 60oC thì hoạt độ của lectin vẫn không không thay đổi. Nhưng khi 43 nhiệt độ vượt quá 60oC thì hoạt độ NKHC bắt đầu giảm dần. Ở nhiệt độ 80oC, HĐTS chỉ còn 64 HU và mất đi hoàn toàn khi nhiệt độ tăng đến 90oC. Nguyên nhân có thể do khi nhiệt độ tăng cao đã làm đứt gãy một số liên kết yếu trong phân tử lectin, làm thay đổi cấu trúc của phân tử này, đặc biệt là cấu trúc trung tâm hoạt động của lectin, làm nó mất khả năng liên kết với các glycoprotein trên bề mặt tế bào hồng cầu thỏ, từ đó làm ảnh hưởng đến khả năng ngưng kết của lectin. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của luận văn này cho thấy, cũng giống như một số lectin từ rong biển khác, lectin từ rong K. alvarezii là một lectin khá bền nhiệt. Theo nghiên cứu của Stelio và cộng sự, khi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong Pterocladiella capillacea, hoạt độ vẫn đạt được giá trị cực đại ở nhiệt độ 600C và chỉ mất hoàn toàn hoạt độ khi nhiệt độ tăng lên 80oC [69]. Trong khi đó, khi nghiên cứu về 2 loài rong là Codium fragile và Hypnea japonica, Hori cũng nhận thấy hoạt độ NKHC của chúng vẫn không bị ảnh hưởng ở mức nhiệt độ rất cao là 80oC [34, 64]. Khả năng chịu nhiệt là một trong những điểm khác biệt đặc trưng giữa lectin từ rong biển so với lectin từ thực vật bậc cao và động vật. Nhiều nghiên cứu cho thấy, hoạt độ NKHC của lectin từ thực vật bậc cao hay động vật bị ảnh hưởng khá mạnh bởi nhiệt độ. Theo kết quả nghiên cứu của TS. Trương Văn Châu, ở mức nhiệt độ 60oC thì hoạt độ NKHC của lectin từ mít na đã giảm hơn 50% và mất hoàn toàn ở 70oC [1]. Khả năng chịu nhiệt tốt của lectin từ rong K. alvarezii sẽ là một yếu thuận lợi cho việc nghiên cứu cũng như ứng dụng lectin này trong nhiều lĩnh vực khác nhau.  Độ bền nhiệt độ Mặc dù lectin từ rong biển được xem là một protein bền nhiệt nhưng nhiệt độ vẫn có ảnh hưởng đến hoạt độ NKHC của lectin. Nhiệt độ có thể làm cho một số liên kết yếu tham gia vào việc giữ vững cấu trúc của phân tử bị đứt gãy. Mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào mức nhiệt độ cao hay thấp và thời gian ủ ngắn hay dài. Để đánh giá độ bền nhiệt độ của lectin từ rong K. alvarezii, tiến hành xác định hoạt độ NKHC của lectin, sau khi được ủ ở các nhiệt độ khác nhau (30, 50, 70, 90, 100oC) với các khoảng thời gian khác nhau (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 phút). Kết quả khảo sát độ bền nhiệt độ của lectin từ rong K. alvarezii được trình bày trong bảng PL 6 và hình 3.4: Hoạt tính NKHC tương đối (%) 44 120 100 80 60 40 20 0 0 10 30˚C 20 30 40 Thời gian ủ (phút) 50˚C 70˚C 50 90˚C 60 70 100˚C Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền nhiệt của hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii Kết quả trên hình 3.4 và bảng PL 6 cho thấy, ở mức nhiệt độ 30oC và 50oC hoạt độ NKHC không bị ảnh hưởng khi thời gian ủ kéo dài đến 60 phút. Tuy nhiên, ở những nhiệt độ ủ cao hơn, hoạt độ NKHC cũng bị ảnh hưởng đáng kể. Sau 20 phút ủ ở 70oC, hoạt độ tương đối còn lại 50%, hoạt độ này tiếp tục giảm và chỉ đạt 25,5% khi thời gian ủ được kéo dài từ 40 cho đến 60 phút. Khi tăng nhiệt độ ủ lên 90oC và 100oC thì hoạt độ giảm rất nhanh và bị mất hoàn toàn sau khi ủ 30 phút. Khảo sát độ bền nhiệt độ của hoạt độ NKHC từ lectin của các loài rong biển khác như Enantiocladia deperreyi [16], Gracilaria ornate [43] và Pterocladiella capillacea [69] cho thấy, khi kéo dài thời gian ủ lên đến 60 phút ở 50oC thì hoạt độ của chúng không hề bị thay đổi, chỉ ở mức nhiệt độ cao như 70oC, 80oC thì hoạt độ ban đầu bắt đầu giảm sau khi được ủ từ 10 đến 20 phút. Các kết quả này cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của luận văn khi cho rằng hầu hết hoạt độ NKHC của lectin từ rong biển chỉ mất hoàn toàn khi mức nhiệt tăng lên rất cao là 90oC và 100oC. Có thể thấy lectin từ rong biển, là một protein khá bền nhiệt. 3.2.2. Ảnh hưởng của pH Để tìm ra khoảng pH tối ưu cho hoạt động của lectin từ rong K. alvarezii, tiến hành thẩm tích lectin trong 18 giờ ở nhiệt độ phòng với các loại đệm có pH khác nhau từ 3 đến 10. Sau đó tiến hành thẩm tích một lần nữa với NaCl 0,85% để loại bỏ sự ảnh hưởng của pH với hồng cầu thỏ. 45 Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii được trình bày trong bảng PL 7 và hình 3.5: Hoạt độ tổng số (HU) 600 500 400 300 200 100 0 3 4 5 6 7 8 9 10 pH Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong K.alvarezii Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii không hề bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi của pH, ở cả 3 môi trường axit, kiềm và trung tính. Đây là một tính chất khá thú vị của lectin từ rong K. alvarezii và tính chất này cũng đã được nhận thấy ở một số loài rong khác như Ulva pertusa hoạt động tốt trong khoảng pH từ 3 đến 10, hay rong Enteromorpha linza không thay đổi hoạt độ trong khoảng pH từ 4 đến 10 [63]. Các nghiên cứu trên cũng tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của TS. Lê Đình Hùng cùng cộng sự vào năm 2012, khi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của 8 loài rong thuộc vùng biển Ninh Thuận, Việt Nam. Kết quả từ nghiên cứu trên cho thấy, hầu hết hoạt độ NKHC của các lectin này đều không bị ảnh hưởng bởi pH, tiêu biểu như rong Boodlea composite và rong Dictyosphaeria versluysii hoạt độ tương đối của chúng đạt 100% trong khoảng pH từ 4 đến 9 [33]. Mặc dù hoạt độ NKHC của một số loài rong biển khác cũng bị ảnh hưởng khi pH môi trường thay đổi như rong Avrainvillea obscura và rong Amansia rhodantha, bị giảm hoạt độ trong môi trường axit mạnh và kiềm mạnh, khoảng pH tối ưu cho hoạt độ của chúng là từ 5 đến 8. Tuy nhiên, so với lectin từ thực vật bậc cao thì tính chất này cũng có sự khác biệt rõ rệt. Khi nghiên cứu về lectin từ thực vật bậc cao, người ta nhận thấy khoảng pH tối ưu cho hoạt độ NKHC là ở môi trường trung tính, axit yếu hoặc 46 kiềm yếu. Hoạt độ NKHC của lectin từ mít na Artocarpus melinoxylus đạt tối ưu trong khoảng pH từ 6,5 đến 8, trong khoảng pH từ 4 đến 6 hay từ 8-10 khả năng NKHC của lectin giảm mạnh hoặc mất hoàn toàn [1]. 3.3 . ỨNG DỤNG CỦA LECTIN ĐỂ KHÁNG KHUẨN, DIỆT SÂU RAU VÀ XUA ĐUỔI MỌT GẠO 3.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lectin Đĩa thạch sau khi được trải vi khuẩn và bổ sung 200µL dịch lectin đã tinh sạch nồng độ 1 mg/mL vào lỗ thạch, sẽ được ủ ở 370C trong 24 giờ. Hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ rong K. alvarezii được tính bằng mm đường kính vòng vô khuẩn trên đĩa thạch. Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh của lectin từ rong K. alvarezii Đường kính Kí hiệu Vi khuẩn T1 Staphylococcus hominis T2 Pseudomonas aeruginosa Đặc điểm vi khuẩn Gram (+), hình cầu. Gây nhiễm trùng ở bệnh nhân có hệ vòng vô khuẩn (mm) 23 thống miễn dịch kém [37]. Gram (-), hình que. Gây viêm nhiễm ở người và động vật, kháng kháng sinh [11]. 11 15 T3 Clostridium perfringens Gram (+), sinh bào tử. Gây ngộ độc thực phẩm ở người, bệnh đường ruột ở gia súc, gia cầm [52]. T4 Acinetobacter baumannii Gram (-). Gây viêm phổi, nhiễm trùng máu, kháng thuốc mạnh [48]. _ T5 Vibrio parahaemolyticus Gram (-), hình que. Gây viêm ruột cấp tính [24]. 17 Vibrio harveyi Gram (-). Gây bệnh cho động vật biển sò, cá đặc biệt là tôm [10]. 16 T6 47 Hình 3.6. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh của lectin từ rong K. alvarezii Kết quả từ bảng 3.3 và hình 3.6 cho thấy, lectin từ rong K. alvarezii có khả năng kháng lại 5/6 loài vi khuẩn gây bệnh (trong đó có 2 loài vi khuẩn biển) với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 23, 11, 15, 17,16 mm. Các loài vi khuẩn trên được biết đến như là những tác nhân gây nên những căn bệnh nguy hiểm cho cả gia súc, gia cầm, thủy sản và con người như: nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường hô hấp, ngộ độc thức ăn, viêm ruột hoại tử…. Mặt khác, các mầm bệnh này đã kháng rất nhiều loại kháng sinh thông dụng vì vậy việc chữa trị và loại bỏ chúng ngày càng gặp nhiều khó khăn và tốn kém [10, 34]. Một số nghiên cứu trước đây của Liao W.R. (2003) và Souza J.B. (2007) cũng cho thấy lectin từ rong biển mà đặc biệt là rong đỏ Eucheuma serra và Galaxaura marginata cũng có khả năng ngăn chặn sự phát triển của một số loài vi khuẩn biển và tụ cầu streptococci [45]. Do đó, phát hiện khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh trên của lectin từ rong K. alvarezii sẽ là một trong những phát hiện quan trọng nhằm định hướng sử dụng lectin như là một công cụ y dược hữu hiệu trong tương lai. 48 3.3.1 Khảo sát hoạt tính diệt sâu của lectin từ rong đỏ K. alvarezii Sau thời gian nuôi invitro có bổ sung dịch lectin vào lá sâu ăn, chúng tôi thu được kết quả diệt sâu như trong bảng PL 8 thể hiện qua biểu đồ sau: Số cá thể sâu 25 0,1 mg/ml 0,2 mg/ml 0,4 mg/ml 20 15 10 5 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện số lượng sâu còn lại dưới tác động của lectin từ rong đỏ K. alvarezii Kết quả thí nghiệm thể hiện trong hình 3.7, hình PL 4 cho thấy lectin có ảnh hưởng đến sâu tơ (P. xylostella) ở các nồng độ khác nhau thì sự ảnh hưởng có sự khác nhau trên đối tượng thí nghiệm, cụ thể: số lượng sâu chết và tốc độ sâu chết qua các ngày có sự thay đổi giảm dần từ nồng độ cao 0,4 mg/ml xuống nồng độ 0,1 mg/ml.  Nồng độ 0,4 mg/ml: tốc độ sâu chết rất nhanh. Bắt đầu từ ngày thứ 2 sau khi ăn phải lectin số lượng sâu giảm rất nhanh, chỉ đến ngày thứ 5 của thí nghiệm thì số sâu thí nghiệm đã chết toàn bộ.  Nồng độ 0,2 mg/ml: tốc độ sâu chết khá nhanh. Do nồng độ thấp hơn nồng độ 0,4 mg/ml nên ở nồng độ này tuy ngày thứ 2 thí nghiệm đã có số sâu chết 4 con (thấp hơn 2 con so với nồng độ 0,4 mg/ml ở ngày thí nghiệm thứ 2) nhưng phải qua ngày thứ 2 thì tốc độ sâu chết đạt cực đại 7 con/ ngày và duy trì trong ngày thứ 4 rồi ngày thứ 5 chỉ còn lại 1 con và qua ngày thứ 6 thì toàn bộ sâu đã chết hết.  Nồng độ 0,1 mg/ml: tốc độ sâu chết chậm hơn so với hai nồng độ trước của thí nghiệm. Do là nồng độ thấp nhất nên trong hai ngày đầu không có hiện tượng sâu chết như hai nồng độ cao hơn, mà phải sang ngày thứ 3 với số sâu chết là 3/20 con và tốc độ sâu chết giảm mạnh trong hai ngày tiếp theo. Sau ngày thứ 5 số sâu chỉ còn 2 con nhưng sang hai ngày tiếp theo thì hai cá thể còn lại này vẫn không có dấu hiệu chết mà chỉ có dầu hiệu chậm lớn lại, điều này có thể giải thích do sự kháng lại lectin của hệ 49 miễn dịch của hai cá thể này giống với sự kháng thuốc với các loại thuốc hóa học khác. Quá trình thực hiện các thí nghiệm lặp lại và căn cứ vào bảng PL 8 cũng như hình 3.7, có thể cho rằng lectin tách chiết từ rong K. alvarezii có khả năng diệt được sâu tơ Plutella xylostella hại rau cũng giống như các kết quả khác từ : thí nghiệm ảnh hưởng lectin trên ấu trùng Plutella xylostella cho thấy lectin phá gãy các vi nhung mao trên lớp màng hấp thu dưỡng chất của ruột non và cảm ứng sự phát triển bất bình thường tế bào biểu mô của ấu trùng [19]; Lectin từ Annona coriacea ảnh hưởng đến sự thay đổi môi trường của màng ruột và ức chế nhiều enzyme tiêu hóa thông qua việc liên kết với protein ruột non, của ấu trùng Anagasta kuehniella khiến ấu trùng giảm đẻ trứng và làm rối loạn giai đoạn biến thái lên thể trưởng thành [20]. 3.3.2 Khảo sát hoạt tính xua đuổi mọt gạo của lectin từ rong đỏ K. alvarezii Kết quả xua đuổi mọt hoàn toàn trong 4 ngày của lectin từ rong đỏ K. alvarezii thể hiện trong hình 3.8: Hình 3.8. Kết quả thí nghiệm xua đuổi mọt gạo bằng dịch lectin từ rong K. alvarezii Kết quả thí nghiệm trên cho thấy, qua thời gian thí nghiệm 4 ngày toàn bộ mọt gạo đã di chuyển đi hết khỏi mẫu thí nghiệm có chứa dịch lectin trong đó một phần số mọt đã di chuyển qua mẫu gạo bình thường và một phần số mọt còn lại bị chết do rơi xuống nước trong quá trình di chuyển từ mẫu có lectin sang mẫu không có lectin. Tuy rằng việc bố trí thí nghiệm không đi đến mục đích có tiêu diệt được Mọt gạo bằng dịch lectin như các thí nghiệm trước đó: Lectin từ Olneya tesota liên kết làm bao quanh lớp vi nhung mao và những cấu trúc glycoconjugate trên ruột giữa của ấu trùng loài bọ Zabrotes subfasciatus cùng họ với mọt gạo [40]; Lectin từ lá cây hoa móng bò một nhị (Bauhinia monandra) gây chết Zabrotes subfaciatus và 50 Callosobruchus maculatus khi tẩm lectin vào thức ăn của ấu trùng. Loại lectin từ B.monandra này làm giảm 40% khối lượng của ấu trùng A. kuehniella và liên kết với protein trên ruột non của loài bọ Callosobruchus maculatus [52]; lectin từ Gracilaria ornate (Rong Đỏ) làm chậm sự phát triển của loài bọ Callosobruchus maculates [44]. Nhưng với bằng chứng việc toàn bộ số mọt đã di chuyển khỏi khay gạo có lectin đã cho thấy ứng dụng xua đuổi mọt gạo bằng dịch lectin là có. Và việc xua đuổi thay vì diệt mọt mang lại ưu điểm là không có hiện tượng lẫn mọt chết trong nông sản làm giảm giá trị nông sản khi sử dụng. 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  KẾT LUẬN 1. Sau các bước tinh sach chế phẩm lectin thu được có hoạt độ tổng 3584 HU, hoạt độ riêng đạt 387,46 HU/mg, nồng độ nhỏ nhất gây NKHC 0,003 mg/HU. 2. Trọng lượng phân tử lectin chiết tách từ rong đỏ K. alvarezii khoảng 28 kDa. 3. Nghiên cứu bước đầu xác định một số tính chất đặc trưng của lectin từ rong đỏ K. alvarezii bao gồm: - Lectin này khá bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động khá rộng từ 20 đến 60oC. Nhiệt độ hoạt động ổn định của lectin (duy trì 100% hoạt tính sau 60 phút phản ứng) là 20 đến 50oC. - Hoạt tính NKHC không thay đổi từ vùng pH 3 đến 10. 4. Lectin kháng lại 5/6 loài vi khuẩn thí nghiệm: Staphylococcus hominis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio harveyi. 5. Lectin từ rong đỏ K. alvarezii có khả năng kháng lại sâu tơ Plutella xylostella hại rau và mọt gạo Sitophilus oryzae.  KIẾN NGHỊ Để hoàn thiện hơn quá trình tinh sạch và đảm bảo tính thuyết phục của kết quả thu được, chúng tôi có những kiến nghị sau đây: 1. Nâng cao khả năng phân tách và độ tinh sạch của lectin có hoạt tính NKHC cao bằng cách:  Tăng chiều cao cột gel.  Sử dụng các loại gel khác Sephacryl S-200.  Tiếp tục tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion sau khi qua sắc ký lọc gel. 2. Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm sau khi tinh sạch. 3. Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm lectin từ rong đỏ K. alvarezii trong các lĩnh vực y học, nông nghiệp và một số lĩnh vực khác. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Trương Văn Châu (2004), “Một số tính chất hóa sinh của Lectin mít na”, tạp chí khoa học-ĐHSP Hà Nội, 4, 83-87. [2]. Lê Đình Hùng (2009a). Một vài tính chất của lectin từ rong đỏ. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc ở Thái nguyên 26-27/11/2009, 177-181. [3]. Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh (1991), “Tách tinh chế và một số tính chất của Lectin từ hạt chay A. tonkinensis”, Tạp chí khoa học, 13(2), 20-27. [4]. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa, “Chế biến rong biển”, Giáo trình Đại học Nha Trang. [5]. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2004), “Công nghệ emzyme”, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [6]. Lê Thanh Mai và các cộng sự (2006), “Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [7]. Nguyễn Thị Thịnh, Lê Doãn Diên, Nguyễn Quốc Khang và Phan Huy Bảo (1983), “Kết quả điều tra Lectin ở một số giống đậu ở Việt Nam”, Tạp chí sinh học, 5(4), 11-18. [8]. Đặng Thị Thu và các cộng sự (2003), “Công nghệ enzyme”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [9]. Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú, Đỗ Hoa Viên (2009), “Cơ sở công nghệ sinh học_Tập 2: Công nghệ hóa sinh”, NXB Giáo dục Việt Nam, Đà Nẵng. [10]. Võ Thị Diệu Trang (2011), Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ Kappaphycus striatum và khảo sát khả năng ứng, Luận Văn Thạc sĩ kỹ thuật, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh [11]. Allen, N. K and Brillantine L. (1969), “A survey of hemagglutinins in various seeds”, J. Immunol, 102, 1295-1299. [12]. Amersham Pharmacia Biotech. Gel Permeation Chromatography: Principle and Methods. 53 [13]. Azanza, R. V., và T. T. Aliaza, 1999. In vitro carpospore release and germination in Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty from Tawi-Tawi, Philippines. Botanica Marina. 42(3): 281-284. [14]. Barondes S.H., Cooper D.N., Gitt M.A., Leffler H. (1994), “Galectin: Structure and function of a large family of animal lectin”, J. Biol. Chem., 269, 20807-10. [15]. Bartolomeu Warlene S. de Souza et al (2007), “A survey of Antarctic algae for agglutinins”, Oecol. Bras., 11(1), 122-130. [16]. Benevides N. M. B., Holanda M. L., Melo F. R., Freitas A. L. P. and Sampaio A. H. (1998), “Purification and Partial Characterisation of the Lectin from the Marine red alga Enantiocladia duperreyi (C. Agardh) Falkenberg”, Botanica Marina, vol 41, 521-525. [17]. Boyd W.C., Almodavar L.R., Boyld L.G. (1966), “Agglutinins in marine algae for human erythrocytes”, Transfusion (Philadelphia), 6, 82-83. [18]. Calvete J. J., Costa F. H. F., Saker S. S., Murciano M. P. M., Nagano C. S., Cavada B. S., Grangeiro T. B., Ramos M. V., Bloch C., Freitas B. T. and Sampaio A. H. (2000), “The amino acid sequence of the agglutinin isolated from the red marine alga Bryothamnion triquetrum defines a novel lectin structure”, CMLS. Cell. Mol. Life Sci., 57, 343-350. [19]. Chen SJ, Chen NT, Wang SH, Hsu JC, Ding WH, Kuo-Huang LL,Huang RN (2009b). Insecticidal action of mammalian galectin-1against diamondback moth (Plutella xylostella). Pest Manag Sci 65 : 923–930. [20]. Coelho MB, Marangoni S, Macedo ML (2007). Insecticidal action of Annona coriacea lectin against the flour moth Anagasta kuehniella and the rice moth Corcyra cephalonica (Lepidoptera: Pyralidae). Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 146:406–414. [21]. David Freifelder, 1976. Physical biochemistry. [22]. Fabio R.M., Norma M.B.B., Maria G.P., Marjory L.H., Francisca N. P.M., Stelio R. M.O., Ana L.P.F. and Luana M.C.M.S (2004), “Purification and partial characterization of a lectin from the red marine alga Vidalia obtusiloba C. Agardh”, Revista Brasil. Bol., 27(2), 263-269. [23]. Fabregas J. et al (1992), “A comparative study of seafish erythrocytes and agglutinins from seaweeds”, Comp. Biochem. Physiol., Vol 103A, No. 2, 307-313. 54 [24]. Finkelstein R. A. (1996), “Cholera, Vibrio cholera O1 and O139 and other Pathogenic Vibrios”, Barron’s Medical Microbiology, 4. [25]. Freitas A. L. P., Teixeira D. I. A., Costa F. H. F., Farias W. R. L., Lobato A. S. C., Sampaio A. H. and Benevides N. M. B. (1997), “A new survey of Brazilian marine algae for agglutinins”, Journal of Applied Phycology, 9, 495-501. [26]. Goldstein I. J., Hughes R. C., Monsigny M., Osawa T. and Sharon N. (1980), “What should be call a letin?”, Nature (London), 285, 66. [27]. Granbom, M., F. Chow, P. F. Lopes, M. C. Oliveira, P. Colepicolo, E. J. Paula và M. Pedersen, 2004. Characterisation of nitrate reductase in the marine macroalga Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta). Aquatic Botany 78: 295 – 305. [28]. Houston, L. L. and Dooley, T. P. (1982). Binding of two molecules of 4- methylumbelliferyl galactosesamine or 4-methylumbelliferyl N-acetylgalactosamine to the B-chain of ricin and Ricinus comnunis agglutinin and to purified ricin B-chain. J. Biol. Chem. 257: 4147-4151. [29]. Hori K., Keisuke M. & Keiji I. (1990), “Some common properties of lectins from marine algae”, Hydrobiologia, 204/205, 561-566. [30]. Hori K., Oiwa C., Miyazawa K. and Ito K. (1988), “Evidence for wide distribution of Agglutinins in Marine Algae”, Botanica Marina, 31, 133-138. [31]. Hori, K., Matsubara, K. & Miyazawa, K. (2000). Biochim. Biophys. Acta, 1474, 226–236. [32]. Hung L.D, Hori K., Nang H.Q. (2009a), “Screening and preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese marine algae”, J. Appl Phycol, 21, 89–97. [33]. Hung L.D, Ly B.M, Trang V.T.D., Ngoc N.T.D., Hoa L.T.H., Trinh P.T.H. (2012), “A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae”, J. Appl. Phycol., 24, 227-235. [34]. Hung L.D, Trang V.T.D., Ngoc N.T.D. (2011),“High-manose type N-glycan specific lectins from red marine algae, carragenophytes”, Biotechnology 9(1), 87-98. [35]. Jong Won Han, Kang Sup Yoon, Tatyana A. Klochkova, Mi-Sook Hwang, Gwang Hoon Kim (2011), “Purification and characterization of a lectin, BLP-3, from the marine green alga Bryopsis plumose”, J. Appl. Phycol, 23, 745-753. 55 [36]. Judd, W. J. (1980), “The role of lectin in blood group serology”, CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 12, 171-214. [37]. Kawakubo A., Makino H., Hirohara H., Hori K. (1997), “The marine red alga Eucheuma serra J. Agardh, a high yielding source of two isolectins”, J. appl. Phycol, 9, 331-338. [38]. Kawakubo A., Makino H., Ohnishi J., Hirohara H. & Hori K. (1999), “Occurrence of highly yielded lectins homologous within the genus Eucheuma”, Journal of Applied Phycology, 11, 149-156. [39]. Laemmli U.K. (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227, pp.680-685. [40]. Lagarda-Diaz I, Guzman-Partida AM, Urbano-Hernandez G, OrtegaNieblas MM, Robles-Burguex Mr, Winzerling J, VazquezMoreno L (2009). Insecticidal action of PF2 lectin fromOlneyatesota (Palo Fierro) against Zabrotes subfasciatus larvae andmidgut glycoconjugate binding. J Agric Food Chem 57:689–694. [41]. Le Dinh Hung, Sato T, Shibata H, Hori K (2009b). Biochemical comparisonof lectins among three different color strains of the red alga, Kappaphycus alvarezii. Fish.Sci 75: 723-730. [42]. Le Dinh Hung, Sato Y, Hori K (2011). High-mannose N-glycan-specific lectins from the red alga Kappaphycus striatum (Carrageenophyte). Phytochemistry 72: 855861. [43]. Leite Marques Y. F. M., Silva Melo L. M. C., Amorim Neves R. C., Freire E. A., Jorge D. M., Grangeiro T. B., Benevides N. M. B. (2005), “Purification of a lectin fro the marine red alga Gracilaria ornata and its effect on the development of the cowpea weevil Callosobruchus maculatus ( Coleoptera: Bruchidae)”, Biochimica et Biophysica Acta, 137-145. [44]. Leite YF, Silva LM, Amorim RC, Freire EA, de Melo Jorge DM, Grangeiro TB, Benevides NM (2005). Purification of a lectin from the marine red alga Gracilaria ornataand its effect on the development of the cowpea weevil Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae). Biochim Biophys Acta 1724:137–145. [45]. Liao W.R., Lin J.Y. & Huang R. (2003), “ Antibiotic activity of Lectins from marine algae against marine vibrios”, Microbiol Biotechnol, 30, 433-439. 56 [46]. Luxton, D. M. và P. M. Luxton, 1999. Development of commercial Kappaphycus production in the Line Islands, Central Pacific. Hydrobiologia 398/399: 477 – 486. [47]. Lima M. E., Carneiro M. E., Nascimento A. E., Grangeiro T. B., Holanda M.L., Amorim R. C. and Benevides N. M. (2005), “Purification of a lectin from the marine red alga Gracilaria cornea and its effects on the cattle tick Boophilus microolus (Acari: Ixodidae)”, J. Agric. Food. Chem, 53, 6414-6419. [48]. Lindsey, Z. W. và Ohno Masao., 1999. World seaweed utilisation: An end – of – century summary. Journal of Applied Phycology 11: 369 – 376, 1999. Kluwer Academic Pulishers. Printed in the Netherlands. [49]. Lindsey, Z. W. vaà Ohno Masao., 1999. World seaweed utilisation: An end – of – century summary. Journal of Applied Phycology 11: 369 – 376, 1999. Kluwer Academic Pulishers. Printed in the Netherlands. [50]. Lowry, O.H.et al, Protein measurement with folinphenol reagent, J.Biol. Chem. 193, (1951), 256 - 257. [51]. Luxton, D. M. và P. M. Luxton, 1999. Development of commercial Kappaphycus production in the Line Islands, Central Pacific. Hydrobiologia 398/399: 477 – 486. [52]. Macedo ML, das Graças Machado Freire M, da Silva MB, Coelho LC (2007). Insecticidal action of Bauhinia monandra leaf lectin ( BmoLL) against Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae), Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculatus(Coleoptera: Bruchidae). Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 146:486–498. [53]. Mairh, O. P., S. T. Zodape, A. Tewari và M. R Rajyaguru, 1995. Culture of marine red alga Kappaphycus striatum (Schmitz) Doty in the Saurashtra region, west coast of India. Indian Journal of Marine Sciences. 24 (1): 24 – 31. [54]. Merrill J.E., Waaland J.R. (1998), “The seaweed resources of the United State of America”, In: Seaweed resources of the world. JICA, 303-323. [55]. Munoz, J., Y. Pelegrin và D. Robledo, 2004. Mariculture of Kappaphycus alvarezii, (Rhodophyta, Solieriaceae) color strains in tropical waters of Yucatan, Mexico. Aquaculture 239 (1 – 4): 161 – 177. 57 [56]. Neish, I.C. and SuriaLink.com (2003), “The ABC of Eucheuma Seaplant Production: Agronomy, Biology and Crop – handling of Betaphycus, Eucheuma and Kappaphycus”, Marine Botanicals. [57]. Ofek I., Beachey E.H. (1987), “Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli”, Infect Immun, 22(1), 247–54. [58]. Ohno M., Critchley A.T. (1997), “Seaweed cultivation and marine ranching”, Bull. Mar. Sci. Fish. [59]. Ohno, M. và Critchley, A.T., 1993. Seaweeds cultivation and marine ranching. ICCA. [60]. Ohno, M., H. Q. Nang, N. H. Dinh và V. D. Tiret, 1995. On the growth of cultivated Kappaphycus alvarezii in Vietnam. Japanese Journal of Phycology. 43 (1): 19 – 22. [61]. Ohno, M., M. Yano và M. Hiraoka, 1999. Cultivation of carrageenophyte, the Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty, in warm waters, Southern Japan. Bulletin of Marine Sciences and Fisheries Kochi University. (19): 37 – 4. [62]. Peumans, W.J. and Van Damme, E. J. (1995), “The role of lectins in plant defence”, Histochem. J, 27, 253-271. [63]. Rogers D.J. and Fish (1991), “Marine algal lectins”, Lectin Reviews, 1, 129-42. [64]. Ron J. D. and Slifkin (1997), “Methods in enzymology”, Academic Press, 310, 145-151. [65]. Sato Y., Morimoto K., Hirayama M., Hori K. (2011), “High mannose-specific lectin (KAA-2) from the red alga Kappaphycus alvarezii potently inhibits influenza virus infection in a strain-independent manner”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 405, 291-296. [66]. Sharon N., Lis H. (2003), “Lectins”, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. [67]. Sharon, N. & Lis, H. (1989) Lectins, Chapman & Hall, London . [68]. Silva, P.C., Basson, P.W. & Moe, R.L. (1996). Catalogue of the benthic marine algae of the Indian Ocean. University of California Publications in Botany 79: 1-1259. [69]. Stelio R.M.O., Antonia E. N., Maria. E. P. L., Yaskara F. M. M. L. and Norma M. B. B. (2002), “Purification and characterization of a lectin from the red alga 58 Pterocladiella capillacea (S. G. Gmel.) Santel. & Hommers”, Revista Brasil. Bol., 25(4), 397-403. [70]. Sudhir Kumar, Urmila Barros (2012), “Isolation of human erythrocyte agglutinins from marine algae”, Journal of Natural Pharmaceuticals, Volume 1, Issue 1, 51-54. [71]. Sugahara T., Ohama Y., Fukyda A., Hayashi M., Kawakubo A., Kato K. (2001), “The cytotoxic effect of Eucheuma serra agglutinin (ESA) on cancer cells and its application to molecular probe for drug delivery systerm using lipid vesicles”, Cytotechnology, 36, 93-99. [72]. Terrance G. Cooper, 1977. The tools of biochemistry. [73]. Trono, C. G. Jr. và T. E.Fortes, 1988: Philippines Seaweeds. National book Store Inc. Publisher Metro manila. [74]. Trono, G. C. J. (1993), “Eucheuma and Kappaphycus :Taxonomy and cultivation”, Seaweed Cultivation and Marine Ranching, 75-88. [75]. Yoshida, T. (1998). Marine algae of Japan. Uchida Rokakuho, Tokyo. [76]. Sato, Tatsuya (2007). Rises and Falls of Clinical Psychology in Japan: A Perspective on the Status of Japanese Clinical Psychology. Ritsumeikan Journal of Human Sciences, 13, 133-144. 59 PHỤ LỤC Phụ lục A. Phụ lục các bảng giá trị Bảng PL 1. Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/mL) OD750 OD1 OD2 ODtb 20 0,051 0,067 0,059 40 0,076 0,09 0,083 60 0,114 0,118 0,116 80 0,157 0,153 0,155 100 0,183 0,171 0,177 120 0,203 0,207 0,205 Nồng độ BSA (µg/mL) Bảng PL 2. Giá trị Rf và lg M của protein trong thang chuẩn Khoảng cách di Trọng lượng phân tử M(Da) chuyển của vạch Rf lg M protein D (cm) 116000 0,3 0,05 5,064 97400 0,5 0,083 4,989 69000 0,9 0,15 4,839 55000 1,5 0,25 4,740 36500 2,1 0,35 4,562 29000 2,8 0,467 4,462 20100 3,7 0,617 4,303 14300 4,4 0,733 4,155 6500 5,3 0,883 3,813 60 Bảng PL 3. Hàm lượng protein tổng số protein mẫu ODtb Y X (ug/ml) X (mg/ml) V (ml) (mg) C 0 0 0 0 0 0 dịch thô 0,24 0,24 1417,333 1,42 200 284 dịch sau thẩm tích 0,0975 0,0975 4673,333 4,68 12,5 58,5 1,36 7 9,52 Dịch sau lọc gel S-200 0,129 0,129 1354,67 (X và Y: hai giá trị trong đường chuẩn BSA(Hình 2.1) dựng từ bảng PL 1) Bảng PL 4. Kết quả đo OD280 và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi sắc lọc gel trên cột nhựa Sephacryl S-200 STT A 280 nm Hoạt độ ngưng kết 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0,009 1 9 0,019 1 10 0,023 1 11 0,055 1 12 0,024 1 13 0,012 1 14 0,005 1 15 0,01 1 16 0,034 1 17 0,047 2 18 0,076 4 61 19 0,187 16 20 0,303 64 21 0,2 32 22 0,132 16 23 0,087 8 24 0,044 2 25 0,019 1 26 0,006 1 27 0,005 1 28 0 1 29 0 1 30 0 1 Bảng PL 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii Hoạt độ NKHC Nhiệt độ (0C) % HU/mL 20 100 512 30 100 512 40 100 512 50 100 512 60 100 512 70 50 256 80 12,5 64 90 0 1 100 0 1 62 Bảng PL 6. Độ bền nhiệt độ của lectin từ rong K.alvarezii Nhiệt độ (0C) Đối chứng 30; 50 70 90 100 Thời gian (phút) Hoạt độ NKHC % HU/mL 0 100 29 10 100 29 20 100 29 30 100 29 40 100 29 50 100 29 60 100 29 10 100 29 20 50 28 30 50 28 40 25 27 50 25 27 60 25 27 10 50 28 20 25 27 30 0 0 40 0 0 50 0 0 60 0 0 10 25 27 20 6,25 25 30 0 0 40 0 0 50 0 0 60 0 0 63 Bảng PL 7. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ rong K. alvarezii Hoạt độ NKHC pH % HU/mL 3 100 29 4 100 29 5 100 29 6 100 29 7 100 29 8 100 29 9 100 29 10 100 29 Bảng PL 8. Kết quả thí nghiệm diệt sâu tơ bằng dịch lectin từ rong K.alvarezii Nồng độ Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày lectin 1 2 3 4 5 6 7 0,1 mg/ml 20 20 17 12 4 2 2 0,2 mg/ml 20 19 15 8 1 0 0 0,4 mg/ml 20 18 10 1 0 0 0 64 Phụ lục B. Phụ lục các hình Hình PL 1. Hoạt tính NKHC của dịch thô lectin thu từ rong K.alvarezii Hình PL 2. Hoạt tính NKHC tại một số phân đoạn sau khi chạy sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 65 Hình PL 3. Một số hình ảnh thí nghiệm diệt sâu bằng dịch lectin từ rong K.alvarezii 66 Hình PL 4. Sự thay đổi màu sắc và trạng thái của sâu sau khi ăn phải lectin [...]... tài: Nghiên cứu tính chất hóa lý và một số ứng dụng của protein chiết từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii”  Mục tiêu nghiên cứu Tách chiết và tinh chế lectin từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii Xác định các tính chất lý, hóa của lectin từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii để định hướng khả năng ứng dụng lectin này trong các lĩnh vực khác nhau  Nội dung nghiên cứu Chiết và tinh chế sơ bộ lectin từ rong đỏ Kappaphycus. .. ích để sử dụng trong các nghiên cứu hóa sinh và y sinh trong giai đoạn sắp tới  Tình hình nghiên cứu trong nước Khác với lectin từ thực vật cao, cho đến nay, việc nghiên cứu lectin từ rong biển ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu của Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang Từ năm 2008 cho đến nay, các công trình nghiên cứu tại đây đã khảo sát được hơn 80 loài rong biển... hoạt động của trung tâm này Chính vì vậy, hoạt độ của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một số tác nhân lý hóa của môi trường” [9] 1.3.3 Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển  Tính tan và kết tủa Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng Lectin có bản chất là protein nên... - Chiết và thu dịch lectin thô từ mẫu rong đỏ K .alverazii - Tinh chế lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 - Xác định khối lượng phân tử lectin từ rong đỏ K .alverazii bằng phương pháp điện di SDS-PAGE Xác định tính chất lý hóa của lectin từ rong đỏ K .alverazii - Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ NKHC của lectin - Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ NKHC của lectin Khảo sát khả năng ứng dụng. .. ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển không bị ảnh hưởng bởi các ion kim loại [29, 43] 1.4 ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN 18 Lectin từ rong biển đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống Các ứng dụng đó có thể được tóm tắt như sau:  Lectin trong huyết học Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫn còn được áp dụng rộng rãi Phương... dòng: rong đỏ, rong nâu và rong xanh Kết quả cho thấy, hầu hết các loài rong biển đều có khả năng gây ngưng kết với ít nhất một loại hồng cầu từ động vật như thỏ, cừu, gà, ngựa và 3 nhóm máu A, B, O của người Một số tính chất hóa sinh như liên kết carbohydrate, khoảng pH hoạt động, nhiệt độ hay khả năng ứng dụng của các lectin này cũng đang được nghiên cứu [33, 34,10] 1.3.2 Cấu tạo của lectin từ rong. .. thanh ở một số mô và cơ quan đặc biệt là mô cơ Ngoài ra, còn có ở giao tử hoặc tế bào trứng Ở mức độ tế bào, sự định khu của lectin cũng đã được phát hiện Một số công trình đã khẳng định lectin có trong nguyên sinh chất và một số bào quan của tế bào Gần đây cũng đã chứng minh sự tồn tại của lectin ở trong nhân tế bào ở một số loài bò sát và động vật có vú [9] 1.3 LECTIN TỪ RONG BIỂN 1.3.1 Tình hình nghiên. .. của 31 loài rong biển trên hồng cầu người và động vật Từ kết quả nghiên cứu đạt được ông đã cho rằng hoạt tính ngưng kết hồng cầu đóng một vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tế bào rong biển Và hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loài rong biển khác nhau [30] - Tại Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phong trong việc nghiên cứu lectin từ rong biển Từ năm 1985 đến... việc lựa chọn chất kết hợp có ái lực đặc hiệu với protein cần tách có ý nghĩa rất quan trọng Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của protein cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa protein và chất kết hợp Trong các thí nghiệm tinh chế lectin người ta thường lựa chọn các chất đường, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đường có ái lực hóa học với một lectin nhất... hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy 23 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Rong đỏ Kappaphycus alvarezii thu ở vùng biển Cam Ranh-Khánh Hòa Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha TrangTp Nha Trang-Tỉnh Khánh Hòa Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2/2015 đến ... cho nghiên cứu lectin từ rong Với kết khảo sát sơ sở nêu trên, tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu tính chất hóa lý số ứng dụng protein chiết từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii”  Mục tiêu nghiên cứu. .. Tách chiết tinh chế lectin từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii Xác định tính chất lý, hóa lectin từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii để định hướng khả ứng dụng lectin lĩnh vực khác  Nội dung nghiên cứu. .. chặt chẽ vào số tác nhân lý hóa môi trường” [9] 1.3.3 Một số tính chất lý, hóa sinh học lectin từ rong biển  Tính tan kết tủa Cũng giống lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển