Thông tin tài liệu
BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
•
•
•
*ỉ#
•!*#Ị%
•!#wỊ+
*1#0Ẹ9 #Ị% rỊ%
rỊ% rỊ% #Ị% #J* #J%
•
rf% rỊ%
NGUYỄN XUÂN BÁCH
NGHIÊN CỨU ĐIỂU CHẾ GLUCOSE TỪ TINH BỘT
VÀ TỔNG HỢP MỘT s ố DAN c h ấ t c ủ a g l u c o s e
Dự• ĐOÁN CÓ TÁC DỤNG
SINH HỌC
•
•
{KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHÓA 1998-2003}
Cán bộ hướng dẫn
Nơi thực hiện
Thời gian thực hiện
TS. Giang Thị Sơn
Bộ môn Hóa hữu cơ
Trường Đại học Dược Hà Nội
3/2003 - 5/2003
HÀ NỘI, 5 -2 0 0 3
LỜI CẢM ƠN
Em xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Giang Thị Sơn, người
đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện khoá luận này.
Em xỉn chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn
Hóa hữu cơ Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, động viên em trong
quá trình thực hiện khoá luận tại bộ môn.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Ngọc Thanh và cán bộ Phồng thí
nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội; GVC. Nguyễn Lệ Phi
cùng cán bộ bộ môn vỉ sinh trường Đại học Dược Hà Nội; TS. Lê Ngọc
Vân, KS. Lê Thị Tập Khoa Vi sinh, Viện lao và bệnh phổi TW.
Cuối cùng em xin bầy tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô giáo,
các cán bộ trong trường vê những giúp đỡ trong suốt 5 năm học qua.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2003
Sinh viên
Nguyễn Xuân Bách
MỤC LỤC
Đặt vấn đ ề ................................................................................................... 1
Phần 1 : Tổng quan...................................................................................2
1.1. Glucose và các phương pháp điều chế.............................................. 2
1.1.1. Sơ lược về Glucose................................................................... 2
1.1.2. Phương pháp điều chế Glucose............................................... 3
1.1.3. Chất lượng Glucose.................................................................. 6
1.2. Dẫn chất hydrazon............................................................................10
.1.2.1.Tác dụng sinh học của hydrazon........................................... 10
1.2.2. Các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon.....................13
Phần 2 : Thực nghiệm và Kết quả........................................................ 15
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.........................................15
2.2. Điều chế Glucose.............................................................................. 15
2.2.1. Thủy phân tinh bột................................................................. 16
2.2.2. Tinh chế dịch thủy phân ....................................................... 16
2.2.3. Kết tinh, phân ly, tạo sản phẩm cuối cù n g ...........................17
2.3. Tổng hợp dẫn chất hydrazon của Glucose...................................... 19
2.3.1 Tổng hợp isonicotinoyl hydrazon ....................................... 19
2.3.2. Tổng hợp Thiosemicarbazon............................................... 20
2.3.3. Tổng hợp semicarbazon.......................................................21
2.3.4. Tổng hợp 2,4-dinitro phenylhydrazon ................................23
2.3.5. Tổng hợp oxazon..................................................................24
2.4. Tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học ................................................ 25
2.5. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được....................... 29
2.5.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng n ấ m ...............................29
2.5.2. Thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao .....................................31
2.6. Bàn luận và nhận xét kết q u ả......................................................... 35
Kết luận và đề x u ấ t................................................................................36
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT :
IR
uv
SKLM
MeOH
EtOH
DMF
M
GA
a ( Ị3,y )-a
: Phổ hồng ngoại
: Phổ tử ngoại
: Sắc ký lớp mỏng
: Methanol
: Ethanol
: Dimethylformamid
: Khối lượng phân tử
: Gluco Amyĩase
: a ( p,y )-amylase
ĐẶT VẤN ĐỂ
Từ trước đến nay, Glucose đã và đang được sử dụng trong nhiều lĩnh vực
như công nghiệp thực phẩm, kỹ nghệ rượu bia, kỹ nghệ đồ hộp... và một
ngành mà ta không thể không nhắc tới đó là : Công Nghiệp Dược Phẩm.
Trong ngành Dược, Glucose được dùng để pha huyết thanh nhân tạo,
dùng làm tá dược trong công nghệ bào chế thuốc viên ... Ngoài ra Glucose còn
được dùng làm nguyên liệu để tổng hợp một số dẫn chất có tác dụng sinh học
đang lưu hành trên thị trường như [9,18]:
1 - Glucametacin với các biệt dược Teoremac ( Sanfer - Italia ), Euminex (
Lacer-Tây Ban N h a)... có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm.
2 - Glucosamin, có biệt dược: Dona của Ofermann - Đức và Rottapharm Italia. Có tác dụng trị thấp khớp.
3 - Streptozocin, có biệt dược là Zanoar của Upjohn. Là một kháng sinh
tổng hợp chống khối u.
4 - Metrizamide có biệt dược là Amipaque của Sanofi. Là thuốc cản quang
chứa iod.
Tại Việt Nam đã có nhiều cơ sở sản xuất Glucose đi từ nguồn nguyên
liệu là tinh bột trong đó chỉ có 1 nhà máy sản xuất Glucose dược dụng là Nhà
máy đường 19-5 tại Sơn Tây-Hà Tây với công suất 200 tấn/năm (Theo số liệu
thống kê năm 2002 của nhà máy). Với công suất này chưa thể đáp ứng đủ cho
cả hệ thống Y-Dược của chúng ta.
Trong đề tài này, với hy vọng là có thể góp một phần nhỏ bé vào công
việc điều chế Glucose dược dụng cũng như tổng hợp một số dẫn chất có tác
dụng sinh học, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu với những mục tiêu sau :
- Điều chế Glucose từ tinh bột.
- Tổng hợp một số dẫn chất của Glucose.
- Thăm dò tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được.
1
PHẢN 1: TONG QUAN
1.1. Glucose và các phương pháp điều chế
1.1.1. Sơ lược về Glucose
Glucose (hay Dextrose) tồn tại dưới dạng tự do trong quả mật của một số
loài thực vật (nho) và cả trong cơ thể động vật: Trong máu người luôn có từ
0.08%- 0.1% Glucose. Ngoài ra người ta còn thấy Glucose dưới dạng kết hợp
như trong Glucosid, trong oligosaccarid, polysacarid, cellulose, tinh bột và
trong Glycogen ở tổ chức gan [1,17].
Glucose tồn tại dưới dạng bột kết tinh mầu trắng, không mùi, vị ngọt, dễ
tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%. Trong môi trường nước, DGlucose kết tinh ở dạng a bền vững, ở dung dịch acid loãng D-Glucose sẽ kết
tinh dưới dạng ị3, tuy nhiên dạng này không bền vững nên khi gặp vết nước sẽ
chuyển ngay sang dạng a [1,17].
Về cấu trúc hoá học, Glucose có mạch gồm 6 nguyên tử carbon không
phân nhánh, chứa 5 chức alcol, 1 chức aldehyd :
H—c —c —c —c —c —c = 0
OH OH OH OH OH
Tuy nhiên khi nghiên cứu sâu hơn, ngưòi ta thấy Glucose còn có một số
cấu trúc dạng vòng, khi đó nhóm aldehyd kết hợp với hidro của nhóm OH
alcol để tạo thành bán acetal:
/O H
/O H
H-CrOH
H
Ò
CH2OH
Dạng vòng của Glucose
Dạng aldehyd của Glucose
2
l/
Công thức vòng của Glucose do Colley (1870) và Tollens (1884) đề
nghị, đến năm 1912 được Fisher công nhận và đến năm 1926, W.N. Haworth
xác định bản chất của vòng :
Sau này bằng phương pháp phân tích tinh thể học vói tia X, người ta
nhận ra Glucose còn có cấu dạng không gian như sau :
Với một số quan niệm như trên về công thức cấu tạo, Glucose có những
tính chất hóa học sau [1]:
+ Phản ứng của nhóm aldehyd (oxi hóa, tạo osazon, tạo cyanhydrin).
+ Phản ứng của dạng vòng bán acetal (tạo Glucosid với một alcol
thấp).
+ Phản ứng của toàn phân tử monosacarid (tác dụng với kiềm, phản
ứng lên men).
Về tác dụng dược lý, Glucose được làm thức ăn dinh dưỡng và trợ lực,
còn dùng làm thuốc lợi tiểu. Được chỉ định trong phòng và chữa mất nước
trong và ngoài tế bào, mất nước do ỉa chảy cấp tính, bệnh nhân bị kiệt sức,
giảm đường huyết. Phòng và chữa chứng tích ceton khi thiếu dinh dưỡng. Làm
giảm áp ở tuỷ sống-não, phù não do mê sảng rượu cấp hay ngộ độc rượu cấp
tính. [11].
3
1.1.2. Phương pháp điều chế Glucose
Để thu được Glucose, ta có thể đi từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau
như tinh bột, cellulose; tuy nhiên trong thực tế nguyên liệu hay được sử dụng
hơn cả là tinh bột, đây là một nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú có trong
gạo, ngô, khoai, sắn ...
Tinh bột cấu tạo bởi hai mạch polysacarid: Amylose và Amylopectin.
+ Phân tử Amylose là một mạch gồm hàng nghìn đơn vị Ot-DGlucose nối với nhau theo dây nối a-l,4-glucosid, đa số mạch thẳng, ít phân
nhánh :
Công thức cấu tạo của Amylose
+ Amylopectin có phân tử lượng lớn hơn, phân nhánh nhiều hơn,
cũng cấu tạo bởi những đơn vị a-D- Glucose. Các đơn vị a-D- Glucose cũng
nối với nhau theo dây nối a-l,4-glucosid, chỗ phân nhánh nối với nhau theo
dây nối a - l,6-glucosid.
Trong tinh bột trung bình tỉ lệ Amylose là 25%, còn Amylopectin là
75%. Tất cả tinh bột đều được tạo nên bởi hai dạng này, nhưng tỉ lệ giữa
chúng tuy thuộc vào nguồn gốc thưc v â t.
Để thu được Glucose từ tinh bột, sử dụng phản ứng thủy phân tinh bột
với các tác nhân hóa học (H2S04, H ơ , H2C204 ) hay vi sinh (enzym ). Dựa vào
tác nhân xúc tác trong quá trình thủy phân tinh bột mà có hai phương pháp
chính để sản xuất Gluose :
♦
Phương pháp acid : Dùng acid thủy phân tinh bột. Đây là phương
pháp được áp dụng từ những năm 1920. Dưới tác dụng của acid, tinh bột thủy
phân thành D- Glucose kết tinh dưới dạng ngậm nước với điều kiện nhiệt độ
dưới 50°c. Còn trong điều kiện nhiệt độ 50°c - 60°c Glucose kết tinh dưới
dạng không ngậm nước [7].
+ Phương pháp enzym : Đây là một phương pháp tiên tiến được
quan tâm từ những năm 1970. Các enzym có khả năng thủy phân tinh bột
gồm : a-a, Ị3-a, enzym trong nấm mốc aspegillus niger, Rhizopus delemar như
GA, Ỵ- a. Enzym phosphorylase có trong đậu, khoai tây, trong lá và bộ phận
dự trữ của thực vật bậc cao. Isoamylase có trong men bia và R-enzym [10].
Trong số những enzym trên, a-a và GA là hay được sử dụng hơn cả, chúng
được sử dụng trong quy trình gồm hai giai đoạn :
2^ Giai đoạn hồ hóa và dịch hóa bằng a-a. Đây là enzym có
khả năng phá vỡ các liên kết cx-l,4-Glucosid tạo thành các dextrin có trọng
lượng phân tử nhỏ làm cho độ nhớt tinh bột giảm nhanh, về sau dextrin mới
phân hủy dần để chuyển thành maltose, isomaltose, dextrose.
>- Giai đoạn đường hóa bằng GA, enzym này có khả năng phân
cắt cả liên kết a-1,4 và a-1,6- Glucosid để tạo Glucose.
5
+ Ngoài hai phương pháp kể trên, người ta còn kết hợp hai phương
pháp acid và enzym gọi là phương pháp acid - enzym: Giai đoạn đầu dùng
acid, giai đoạn sau dùng enzym.
Sau đây là quy trình tiêu chuẩn sản xuất Glucose ở quy mô công nghiệp
của Nhà máy Đường 19-5 được chúng tôi đưa ra để minh hoạ :
Trong quy trình 1 theo phương pháp acid, tinh bột được hòa loãng 35%,
acid hóa bằng acid HC1, trung hòa bằng NaHC03 hay Na2C 0 3, tẩy mầu bằng
than hoạt tính (Sơ đồ 1 trang 7).
Trong quy trình 2 theo phương pháp enzym, hai enzym được sử dụng là
a-a và GA, trước khi dịch hóa cần điều chỉnh pH tạo điều kiện cho oc-a hoạt
động tốt nhất. Sau khi đường hóa xong diệt men bằng cách nâng nhiệt độ (Sơ
đồ 2 trang 8).
1.1.3. Chất lượng Glucose
Glucose được sử dụng rộng rãi trên thế giới, vì vậy hầu hết dược điển các
nước đều có chuyên luận riêng về Glucose. Chúng tôi xin nêu ra một số chỉ
tiêu về Glucose cho ngành Dược theo ba dược điển: Dược điển Việt Nam
III(DĐVN III), Dược điển Anh 98(BP 98), Dược điển Mỹ 24(USP XXIV). Các
tiêu chuẩn về chất lượng Glucose được tổng kết trong bảng 1.1 trang 9.
Nhận xét: qua bảng trên chúng ta thấy DĐVN III, BP 98, USP XXIV
đều quy định một số tiêu chuẩn thử giống nhau nhưng mỗi dược điển cũng có
quy định khác nhau cho từng nước. Nhìn chung các tiêu chuẩn trong USP
XXIV có phần cao hơn trong DĐVN III, còn trong BP 98 gần tương tự như
trong DĐVNIII.
6
Sơ đồl:(Lưij/trình công nghệ sản xuất Glucose tinh thể theo phương pháp
acid
7
Sơ đồ 2: Quy trình sản xuất Glucose theo phương pháp enzym
Bảng 1.1 : Tiêu chuẩn của Glucose trong dược điển của một số nước
Tiêu chuẩn
Góc quay cực riêng
DĐVN III
+52,5° đến +53,3°
BP 98
+52,5° đến +53,3°
2
Đô trong và mầu sắc
dd
Không đậm hơn mẫu NV7
Không đậm hơn mẫu XV7
3
Giới hạn acid
4
Đường ít tan
5
Tinh bột tan
6
7
Arsen
Tro sulfat
Chuẩn độ acid-base
^NaOH 0,02N íí 0 ,3 ml
Chế phẩm phải tan hoàn toàn
trong EtOH
Không cho mầu xanh với dd
iod.
< lppm
< 0 , 1%
Chuẩn độ acid-base
V nhohOjIM ^ 0,15ml
Chế phẩm phải tan hoàn toàn
trong EtOH
Không cho mầu xanh với dd
iod.
< lppm
< 0 , 1%
8
Clorid
< 0,0125%
< 0,0125%
9
Sulfat
< 0 ,0 2 %
< 0 ,0 2 %
10
Sulfit
11
Bari
12
Calci
< 0,02%
< 0,02%
KQĐ
13
Nước
< 1,0%
< 1,0%
Mất khối lượng do sấy khô ở 105°c/ 16 giờ
đối với dang anhydrat < 0,5%; đối với dang
hydrat từ'7 ,5 %- 9,5%
STT
1
DD chế phẩm trong nước ,thêm
dd iod, hồ tinh bột, dd phải có
< 0,0015% Sulfit.
mầu xanh.
DD s :50,0g chế phẩm/ vđ DD s :50,0g chế phẩm/ vđ
100ml H2O.Yêu cầu 10ml dd s 100ml H2O.Yêu cầu 10ml dd s
+ lml dd H2S0 4 không đậm + lm l dd H2S0 4 không đậm
mầu hơn 10ml dd s + lml H ,0. mầu hơn 10ml dd s + lml H ,0
9
USP XXIV
+52,6° đến +53,2°
Không đậm hơn mẫu gồm 3ml dd T pha
loãng thành 50ml.DD T gồm: lml CoCl2 ,
3ml FeCl,, 2ml CuCl„ H2Ố vđ 10ml.
Chuẩn độ acid-base VNaOH0 ,0 2 N < 0,3ml
Chế phẩm phải tan hoàn toàn trong EtOH
Cho mầu vàng với dd iod.
< lppm
< 0 , 1%
Mầu của hỗn hợp gồm 2g chế phẩm+lml
HNO3 +lm l A gN 03+ H20 vđ 50ml không
đậm hơn mẫu chứa 0,5ml HC1 0,020N
Mầu của hỗn hợp gồm 2g chế phẩm+lml
H ơ + 3ml B a ơ 2 + H20 vđ 50ml không
đậm hơn mẫu chứa 0,5ml H,S0 4 0,020N
Cho mầu vàng với dd iod.
KQĐ
1.2. Dẫn chất hydrazon
1.2.1. Tác dụng sinh học của dẫn chất hydrazon
+ Tác dụng kháng khuẩn
Đây là tác dụng quan trọng nhất của dẫn chất hydrazon, đáng chú ý nhất
là dẫn chất hydrazon của 5- nitrofurfural có công thức chung [3]:
I
0 2n /
I
xc h = n —n h - r
Vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis) là loại vi khuẩn rất
khó tiêu diệt nên tác dụng kháng lao của các hydrazon là một đặc tính quý
ỡ
giá.
sJ
Năm 1948 G. DẤnayk đã tổng hợp được Tibion (Thiosemicarbazon của
aldehyd para- acetylaminobenzoic) có tác dụng chống lao và đã áp dụng vào
thực tế lâm sàng có kết quả tốt với các tên biệt dược như TBI, Corteben,
Livazon[9,12,18]:
o
s
J
H3C — c —HN—Y
II
y - C H = N —NH—C —NH 2
Năm 1948 MN. Soulina và E. Michina đã tổng hợp được một dẫn chất
khác của Thiosemicarbazon có tác dụng chống lao lấy tên là Cutizon có công
thức như sau[9,12,18]:
? H3/ = \
H 3C—H C ^
s
C H = N —NH—C —NH 2
Dãy có tác dụng kháng lao mạnh thứ hai là dẫn chất isonicotinoyl
như[9,12,18]:
CO— NH— N = H C —
|
/= \
ỳ —OH
OCH3
/
Ftivazidỷ, Vanizid^
(Isonicotinoyl hydrazon của 3- metoxy- 4- hydroxy benzandehyd)
10
Năm 2000, các tác giả Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc
Vân, Lê Thị Tập đã nghiên cứu và thử tác dụng chống lao của một số dẫn
chất Thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogen
isatin. Kết quả cho thấy tất cả các chất tổng hợp được đều có tác dụng mạnh
trên chủng Mycobacterium tuberculosis H37RV. Ngoài ra có 6 dẫn chất của 3isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5- halogen isatin có tác dụng cả trên
chủng vi khuẩn lao đã kháng isoniazid [4].
+ Các tác dụng khác .
Ngoài các tác dụng chính kể trên một số hydrazon còn có tác dụng
chống khối u, chống viêm, chống virus, chống ký sinh trùng như :
i^Bis thiosemicarbazon của 5- nitro furfurylglyoxan có tác dụng kìm
hãm sự phát triển của các tế bào ung thư[12] :
s
I
I
O jN ' N0
NH— C —NH 2
C -C H = N -N H -C -N H 2
5^4- hydroxybenzoic acid [(5- nitro-2- furanylmethylen)] hydrazid
còn có tên là Nifuroxazide, có tác dụng sát khuẩn đường ruột và sát khuẩn
ngoài da[9,12,18]:
1
0 2N
TI
o
o
CH=N—NH—c —(ỵ
V - OH
>*Hydrazin carboximidamid, 2[ 2,6- dicloro phenyl methylen còn có
tên là Guanabenz, có tác dụng điều trị tăng huyết áp[9,12,18] :
C1
■C H = N —NH—
^
^
c —NH 2
L
NH
Sau đây là bảng tổng kết một số dẫn chất hydrazon được sử dụng làm
thuốc (Bảng 1.2 trang 12).
11
Bảng 1.2: Một số hydrazon, thiosemicarbazon và semicarbazon được sử
dụng làm thuốc[12]
s
T
T
Công thức cấu tạo
Tên khoa học
co —NH—N= c
Isonicotinoyl
hydrazon của 3metoxy-4- hydroxy
benzandehyd
1
N
Ố
J
CH 3O
ồ
OH
Isonicotinoyl
hydrazon của 3,4dimetoxy- 2carboxybenzaldehyd
CO—NH—N= c
2
ộ
: ? ệ >
OCHị
0
5
s
CH= N NH—C—NH2
^
___ .N-NH-ị^-NH,
c
y
7
1
N—NH—C—NH2
6
7
02>r 0
Vanizidy!
Chống
lao
Saluzid
Chống
lao
Tibion
Chống
lao
Thiosemicarbazon
của p- isopropyl
benzaldehyd
Cutizon
Chống
lao
1- Guanyl hydrazon
3- Thiosemicarbazon
củaIndandion
Tiogin
Chống
lao
của aldehyd- p3 H3C—c—HN—( ^ 3 ) ~ CKF=N~NH—C—NH2
acetyl- aminobenzoic
4
Ftivazid^
Tác
dụng
Thiosemicarbazon
s
ch3
H3C—CH ^
Biệt dược
CH=N—NH—-C—NH2
Ằ Ắ
/= y
02N/ 0 CH=N—N
N
12
Semicarbazon của 5nitro-2Furacillin
furfuraldehyd
Kháng
khuẩn
l-(5’ nitro- 2 furfuryliden amino)1,3,4-Triazon
Kháng
khuẩn
Furazonal
Xúc tác cho phản ứng có thể là acid vô cơ hoặc hữu cơ, lượng acid dùng
làm xúc tác ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng. Mỗi cặp hydrazin-carbonyl có
một trị số pH đặc trưng, ở pH đó nồng độ [Rr COR2].[H2N-NH-Z] đạt được
cực đại và hiệu suất phản ứng là cao nhất. Tùy theo hợp chất ban đầu và
hydrazon tạo thành mà chọn dung môi, xúc tác, nhiệt độ, thời gian phản ứng
thích hợp.
+ Phản ứng kết hợp muối diazoni với hợp chất cố chứa nhóm methylen hoạt
động ị Công thức z - CH2 - Z )
> Phương trình phản ứng tổng q u á t:
z -C H ,-z !
AcONa
ArN,
*
z - c = N -N H A r
I
z, z có thể là P-keto este, P-keto amid, este malonic, nitro alkal.
+ Phản ứng phân cắt liên kết đôi bằng ion hydranium hoặc muối diazoni
r 2c = c r 2 + n h 2 - n h —
► r 2c h 2 +
r 2c = n - n h 2
Hoặc
PhCH = CHMe
+
ArN,
PhC H -C H M e
I
N = NAr
OHo
I
H2O
—
PhCH— CHMe
PhCH
I
II
N=NAr
+
N -N H A r
14
0=C H M e
V
\T
PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ
Na2C 0 3, NaCH3COO, HC1, CH3COOH đặc, Than hoạt, Ethanol 99%, Tinh
bột.
Các hydrazin (fh£? Isoniazid, Thiosemicarbazid, Semicarbazid, 2,4-Dinitro ĩ Y
phenyl hydrazin, Phenyl hydrazin.
Máy khuấy từ Heidolf, Máy đo độ chảy Gallenkamp, Bản sắc ký Silicagen
Kieselgel. 60 F254
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để điều chế các
chất như dự kiến:
>- Điều chế Glucose từ tinh bột bằng phương pháp thủy phân acid.
>- Tổng hợp các dẫn chất hydrazon của Glucose bằng phương pháp
ngưng tu giữa nhóm carbonyl và các hydrazin thế.
-
Theo dõi quá trình/bằng SKLM.
-
Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy.
-
Xác nhận cấu trúc các chất tổng hợp được dựa trên phân tích phổ IR, u v .
-
Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được bằng
phương pháp đục lỗ thạch theo quy định trong DĐVNIII.
Thử tác dụng trên vi khuẩn lao của các chất tổng hợp dựa trên phương pháp
thử độ nhậy cảm của vi khuẩn lao với chất thử theo phương pháp tỉ lệ CannettiGrosset.
2.2.
Điều chế Glucose
Trong các phương pháp điều chế Glucose, căn cứ vào điều kiện phòng thí
nghiệm chúng tôi chọn phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid .
>*Phương trình phản ứng tổng q u á t:
(C gH nP s^
+
nH20
15
nC6H120 6
Khi phản ứng xảy ra hoàn toàn thì sản phẩm cuối cùng là Glucose. Trên
thực tế phản ứng xảy ra qua các giai đoạn :
( C6H10O5 ^
Tinh bột
H2O ( CgHịQƠs ^ C^H^Oịi - ^ 2^ C5H12O5
Dextrin
Maltose
Glucose
Quá trình thực nghiệm được tiến hành qua các bước sau :
2.2.1. Thuỷ phân tinh bột
Hoà 20g tinh bột đã tinh chế vào 100ml nước cất trong cốc thuỷ tinh,
khuấy kỹ tạo hỗn dịch. Rót hỗn dịch vào trong bình cầu dung tích 250ml, tăng
nhiệt độ lên 100°c, điều chỉnh tốc độ khuấy 100 vòng/ phút để tránh tinh bột bị
vón cục và bị hồ hóa đồng thời để hiệu suất đạt cao nhất [7]. Rót từ từ 5ml acid
chlohydric đặc làm xúc tác. Giữ nhiệt độ ổn định trong 3 giờ 30 phút. Trong
quá trình đun kiểm tra dịch thủy phân bằng thuốc thử iod và SKLM.
+ Định tính dịch thủy phân bằng thuốc thử iod :
Cho vào ống nghiệm 5ml nước cất và 2-3 giọt thuốc thử iod, lắc đều.
Thêm vào ống nghiệm 2-3 giọt dịch thủy phân, mẫu dịch chỉ đạt khi không cho
mầu xanh với thuốc thử iod.
+ Định tính dịch thủy phân bằng SKLM :
Trên bản mỏng sắc ký chấm một vết Glucose chuẩn và một vết dịch
thủy phân. Thời điểm kết thúc giai đoạn thủy phân khi dịch lọc cho một vết sắc
ký trùng với vết Glucose chuẩn. Dung môi hoà tan là Methanol- Nước ( 3 : 2 ) ,
dung môi khai triển là hệ Nước- Methanol- Acid acetic khan-(Ếthyỉẽnckmáx 10 ? ? v '
: 15 : 25 : 50 ). Hiện mầu bằng đèn tử ngoại.
2.2.2. Tinh chế dịch thủy phân
Khi đã xác định được thời điểm kết thúc phản ứng, để nguội, chuyển dịch
thủy phân sang cốc thủy tinh sạch, tiến hành trung hòa bằng Natri carbonat đã
nghiền mịn đến khi không còn bọt khí nổi lên và pH dung dịch đạt từ 6,5 - 7,0
thì kết thúc phản ứng trung hòa và đem lọc.
16
Tẩy mầu dịch lọc bằng than hoạt : Dùng than với tỉ lệ 3% - 4%[7], giữ
nhiệt độ ở 100°C/30 phút, sau đó lọc nóng lấy dịch lọc. Tiến hành tẩy mầu bằng
than hoạt hai lần, dịch lọc trong suốt có ánh vàng.
Dịch lọc sau khi tẩy mầu được cho đi qua lần lượt cột trao đổi cation loạiị
acid mạnh và anion loại base yếu để loại các ion lạ.
2.2.3. Kết tinh, phân ly, tạo sản phẩm cuối cùng
Tiền hành cô dịch lọc đến thể tích 50ml. Sau đó để dịch lọc trong 24 giờ ở
nhiệt độ phòng sẽ có kết tủa. Lọc hút lấy tủa, đem sấy khô trong tủ sấy chân
không ở 60°c trong 6 giờ. Phần dịch lọc được tái thu hồi sản phẩm.
+ Thu hồi sản phẩm : Trong cốc thủy tinh có chứa dịch lọc, thêm đồng
lượng ethanol, khuấy cho hai lớp đồng nhất rồi để kết tinh trong ít phút, tiến
hành lọc hút lấy tủa, sấy khô trong tủ sấy chân không ở 60°c trong 6 giờ.
Kết quả thu được 11,1 lg Glucose. Hiệu suất thu hồi là 55,6%.
Quy trình điều chế Glucose được mô tả trong sơ đồ 3 trang 18.
Sản phẩm chính và sản phẩm thu hồi được định tính và thử tinh khiết theo
tiêu chuẩn DĐVNIII trình bày trong bảng 2.1 trang 17.
Bảng 2.1: Kết quả kiểm nghiệm Glucose theo DĐVNIII
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Tiêu chuẩn
Góc quay cực riêng
Độ trong và mầu sắc dung dịch
Giới han acid
Đường ít tan
Tinh bôt tan
Arsen
Tro sulfat
Clorid
Sulfat
Sulfit
Bari
Calci
Nước
Kết quả
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Sơ đồ 3: Quy trình điều chế Glucose trong phòng thí nghiệm
Tinh bột
r ^loãng
Ả 20%
h 2° ----------------Hòa
HC1------------------- —►!
Thủy phân
Na2C 0 3
Trung hòa
l Ị c hút
Than hoạt
►!
Tẩ^mầu 1
Lọc hút
►ị
Than hoạt
Tẩy mầu 2
L hút
,.
Li cation
Trao đổi anion
Cổ^đặc
Kếtịtinh
ị --------------- Lọc hút---------------ị
Tua
Dich
U--------
ị
Sấy
Loc hút
,
Sản fphẩm
í
T ịa
EtOH
Sấy
« .
T ......... í :
sản
pham
thu hồi
18
2.3. Điều chế dẫn chất hydrazon của Glucose
Trong các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon, căn cứ vào các chất
dự kiến tổng hợp và căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã chọn
phương pháp ngưng tụ Glucose với dẫn chất hydrazin thế.
Phương trình phản ứng tổng q u á t:
C H =0
C H = N —N H — R
+
h 2n
- nh- r
+ h 20
H— ►
c h 2o h
c h 2o h
Glucose
hydrazin thế
hydrazon
2.3.1.Tổng hợp isonicotinoyl hydrazon
> S ơ đồ phản ứng :
C H =0
H2N—NH —CO
+
H—C = N —NH—CO
►
c h 2o h
CH2OH
isoniazid
Glucose
(I)
5>Tiến hành :
Trong bình cầu dung tích 100ml có lắp sinh hàn hồi lưu, cho vào hỗn
hợp gồm l , 8g Glucose (0,01mol), l,37g isoniazid (0,01mol), 20ml alcol
ethylic 99%, 2ml acid acetic đặc. Đun hồi lưu cách thủy trong 90 phút. Khi
phản ứng kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để
lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không lấy tủa, rửa tủa bằng alcol
ethylic ba lần, mỗi lần 5ml. Kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi nước- ethanol
( 1 : 1 ) . Sấy khô ở 60°c trong tủ sấy chân không thu được 1,16g tinh thể mầu
trắng.
Nhiệt độ nóng chảy : 190°c - 192°c
Hiệu suất
:
38,8%
19
sản phẩm tan trong nước, ít tan trong EtOH, aceton.
Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi
hòa tan là nước-ethanol (1 : 1). Dung môi khai triển là hệ methanol- cloroform
( 10:40).
Phổ tử ngoại X Sẩx = 268, 889.
Phổ hồng ngoại có các đỉnh đặc trưng sau :
3313.2 c m 1
^CO-NH
2911.3 cm' 1
5CH2
1650.4 cm'1
VC=N
1571.3 cm'1
v c.car0matic
1 4 1 3 .0 c m
^ O l l trong mặt phẳng
1223.4 cm'1
VC_N
1079.4 c m 1
VOHalcol
1025.0 c m 1
Vpyridin
2.3.2. Tổng hợp Thiosemicarbazid
2>Sơ đồ phản ứng :
C H =0
H—C = N —NH—C—NH2
+
H2N —NH— C—NH2
ĩS
^ -
c h 2o h
Glucose
s
---------*
+H20
c h 2o h
thiosemicarbazid
(II)
5>Tiến hành :
Trong bình cầu dung tích lOOml có lắp sinh hàn hồi lưu, hoà tan 0,46g
Thiosemicarbazid ( 0,005 m o l) vào 20ml ethanol 99% bằng cách đun nóng
đến tan hoàn toàn. Thêm từ từ vào bình phản ứng 0,9g Glucose ( 0,005 m o l)
và 2ml acid acetic đặc. Đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Khi phản ứng kết
thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho sản
20
phẩm kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không thu được tủa, rửa tủa bằng
ethanol 99% ba lần, mỗi lần 5ml. Kết tinh lại bằng hỗn hợp nước-ethanol (1:
1 ). Để lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc tủa, sấy khô ở 60°c trong tủ sấy chân
không thu được 0,39g tinh thể mầu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy : 203°c - 205°c
Hiệu suất
: 30,83%
Sản phẩm tan trong nước, ít tan trong EtOH, aceton.
Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi
hòa tan là nước-ethanol (1 : 1). Dung môi khai triển là hệ methanol- cloroform
li
( 10:40).
Phổ tử ngoại X
nm = 265, 556.
Phổ hồng ngoại có các đỉnh đặc trưng sau :
3345.4 cm' 1
V NH
1619,7 cm' 1
V C=N
1467.4 cm' 1
^ O H trong mặt phẳng
1288,0 cm'1
v c=s
1080,9 cm'1
^ O H alcol
795,5 c m 1
ÔcH
2.3.3. Tổng hợp semicarbazon
>“Sơ đồ phản ứng :
H—C = N —NH— C—NH2
CH =0
ìr
+
0
H2N—NH— C—NH2
+ H20
Ồ
c h 2o h
c h 2o h
Glucose
semicarbazon
(III)
>*Tiến h àn h :
21
Trong bình cầu dung tích 100ml có lắp sinh hàn hồi lưu, hoà tan 0,56g (
0,005 mol ) semicarbazid hydroclorid, 0,4lg Natri acetat trong một lượng
nước tối thiểu. Thêm 0,9g ( 0,005 m o l) Glucose, 1,5ml acid acetic đặc. Cho
thêm alcol ethylic đến khi trong. Đun hồi lưu cách thủy trong 1 giờ. Khi phản
ứng kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho
sản phẩm kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không thu được tủa, rửa tủa bằng
ethanol 99% ba lần , mỗi lần 5ml. Kết tinh lại bằng hỗn hợp nước-ethanol (1 :
1 ). Để lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc tủa, sấy khô ở 60°c trong tủ sấy chân
không thu được 0,56g tinh thể mầu trắng ngà.
Nhiệt độ nóng chảy : 200°c - 202°c
Hiệu suất
: 47,26%
Sản phẩm tan trong nước, không tan trong EtOH, aceton.
Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi
hòa tan là nước-ethanol (1:1). Dung môi khai triển là hệ methanol- cloroform (
10:40).
Phổ hồng ngoại có các đỉnh đặc trưng sau :
3418.5
3418,5 cm' 1
V
VNH
2924.0 cm'
1659.6 cm'
1460.1 cm'
^ O H trong mặt phẳng
1232,8 cm'
V c-N
1103.6 cm'
^ O H a lc o l
2.3.4. Tổng hợp 2,4- dinitro phenylhydrazon
5^Sơ đồ phản ứng :
C H =0
CH2OH
H—C = N — NH
HoN—NH
I
CH2OH
no2
Glucose
2,4 - dinitro phenyl hydrazin
22
(IV)
>*Tiến hành :
Trong bình cầu dung tích 100ml có lắp sinh hàn hồi lưu, hoà tan lg 2,4 dinitro phenyl hydrazin ( 0,005 mol ) vào 20ml ethanol 99% bằng cách đun
nóng đến tan hoàn toàn. Thêm từ từ vào bình phản ứng 0,9g Glucose ( 0,005
m o l) và 2mlacid acetic đăc. Đun hồi lưu cách thủy trong 2 giờ. Khi phản ứng ? ?
kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho sản
phẩm kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không thu được tủa, rửa tủa bằng
ethanol 99% ba lần, mỗi lần 5ml. Kết tinh lại bằng hỗn hợp nước-ethanol
(1:1). Để lạnh cho kết tinh hoàn toàn. Lọc tủa, sấy khô ở 60°c thu được 0,64g
tinh thể mầu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy :
85°c - 87°c
Hiệu suất
35,54%
:
Sản phẩm khó tan trong nước lạnh, alcol ethylic lạnh. Dễ tan trong alcol
ethylic nóng, nước nóng, ít tan trong aceton.
Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi
hòa tan là ethanol. Dung môi khai triển là hệ methanol - cloroform ( 10:40 ).
Phổ tử ngoại Ằ,
nm = 272, 354.
Phổ hồng ngoại có những đỉnh đặc trưng sau :
3351.8 cm'
2898,5 cm'
1624.0 cm'
1517.8 cm"
VC-Caromatic
1422.9 cm'
V N 02 thơm
1343.1 cm1083.0 cm'
^ O H alcol
714.0 c m 1
Ô c -H
23
I
2.3.5. Tống hợp oxazon
>~Sơ đồ phản ứng :
CH =0
H— c =N— NH— C6H5 + 2H20
+ 3C6H5—NH—NH2 — ►
CH2OH
_ = N —NH—C6H5
_
+ 3N H 3
CH2OH
Glucose
(V)
phenyl hydrazin
>T iến h àn h :
Trong bình cầu dung tích 100ml có lắp sinh hàn hồi lưu cho vào lml
phenyl hydrazin ( 0,005 m o l), 0,9g Glucose ( 0,005 m o l) và 2ml acid acetic
đặc, 2ml natri acetat 1% . Đun hồi lưu cách thủy trong 15 phút. Khi phản ứng
kết thúc, chuyển hỗn hợp phản ứng sang cốc thủy tinh 100ml, để lạnh cho sản
phẩm kết tinh hoàn toàn. Lọc hút chân không thu được tủa, rửa tủa bằng
ethanol 99% ba lần, mỗi lần 5ml. Kết tinh lại bằng ethanol. Để lạnh cho kết
tinh hoàn toàn. Lọc tủa, sấy khô ở 60°c trong tủ sấy chân không thu được
0,95g tinh thể mầu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy : 208°c
Hiệu suất
: 54,29%
Sản phẩm không tan trong nước. Tan kém trong EtOH.
Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với dung môi
hòa tan là ethanol. Dung môi khai triển là hệ methanol - cloroform (10:40 ).
Phổ tử ngoại À,
nm = 268, 556, 889.
Phổ hồng ngoại có các đỉnh đặc trưng sau :
3308.2 c m 1
2909.2 c m 1
1601.2 cm' 1
24
1535,2 cm'1
Vex: aromatic
1389.7 c m 1
^ O H trong mặt phẳng
1080,0 c m 1
^ O H alcol
787.7 cm'1
Ỗc-H
2.4. Tóm tắt kết quả tổng hợp
Như vậy chúng tôi đã tổng hợp được 5 dẫn chất của Glucose. Chúng tôi
đã tiến hành khảo sát một số hằng số vật lý của các chất này. Kết quả được
trình bầy trong bảng 2.2 và 2.3.
Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác định bằng phổ hồng ngoại và
phổ tử ngoại:
+ Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm
viên nén KBr trong vùng 4000 - 500 cm 1 tại phòng thí nghiệm trung tâmTrường Đại học Dược Hà Nội. Các kết quả trình bầy ở bảng 2.3.
♦ Phổ tử ngoại của các chất được ghi trên máy Cary IE UV- Visible
DMF
spectrophotometer Yarian, dung môi DMF. Các giá trị Ả max được ghi trong
bảng 2.3.
25
Bảng 2.2: Các hợp chất hydrazon của Glucose tổng hợp được
Chất
Tên
Công thức
Công thức cấu tạo
H - -C=N—NH—CO
I
Isonicotinoyl hydrazon
của Glucose
c ,2h 17o6n 3
Ỏ
—
N
c h 2o h
H— c: =
II
n—
Thiosemicarbazon của
Glucose
nh—c—nh2
II
S
c 7h 15o5n 3s
C:h 2o h
III
Semicarbazon của
Glucose
c7h 15o6n 3
H— c:= n —nh—c—nh2
II
0
C:h 2o h
H—c: = N—NH
IV
2,4- dinitro phenyl
hydrazon của Glucose
C12H1609N4
:
[ ộ
C:h2o h
r ”
-
no2
H— C = N — NU— CgH,
V
Phenyl osazon_của
= N— NH— C6Hj
c , 8H 220 4n 4
t/
Glucose
c h 2o h
26
Bảng 2.3: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại và tử ngoạỉ của các chất tổng hợp được
ST
T
Công thức
M
Mầu
sắc
Độ chảy
Dung môi
(°C)
kết tinh
Hiệu
Phổ tử
suất
Phổ hồng ngoại ( cm'1)
(%)
ngoại
(nm)
Vco_nh=3313,2 cm'1, 0 (^2= 2911,3 cm'1
H—-C=N—NH—CO
VC=N= 1650,4 c m 1, v c.car0matic=1571,3 cm 1
I
-—
ch2oh
Ố
N
299
Trắng
190-192
Et0H -H 20
(1 : D
38,8
^OH trongmf=1413,0 cm \V C_Nthơm= 1223,4 cm
V
H—c = N—NH—c—NH,
II
S
253
II
0
H
a ic o i=
268,
889
1079,4 cm'1, Vpyridin=1025,0 cm'1
Vnh=3345,4 cm'1, v ^ l 619,7 cm 1
Trắng
203-205
EtOH-H2ơ
(1 : D
30,83
265,
VOH
tro n g
m
f =
1467,4 cm'1, Vc=s=1288,0 cm'1
Ch2oh
v oHaicoi=1080^ em ', ỖCH= 795,5 cm'1
27
556
^co-NH2 ’ vnh=3418,5 cm 1, ÔCH2=2924,0 cm 1
H—c = N—NH—c—NH2
ỈÍ
o
237
III
Trắng
200-205
47,26 VC=N= 1659,6 cm
Et0H-H20
(1 : D
ngà
c h2oh
VOH trongmf= 1460,1 cm 1
Vc_n=1232,8 cm 1, VOII aicoi= 1 103,6 c m 1
Vnh=3351,8 cm'1, 0(^2=2898,5 cm'1
H—c = N—NH
N02
IV
VC=N= 1624,0 c m 1, v c.caromatic=1517,8 cm'1
360
-
Vàng
121-126
EtơH-H20
(1 : D
¥
CH2OH N02
272,
35,54
VN0 2 tham=1422,9 cm'1, V (S)N02= 1343,1 c m 1
354
^OH aicoi= 1083,0 cm 1, Ôc_h=714,0 cm 1
V nh=3308,2 cm'1, ôcm=2909,2 cm'1
H—C=N—NH—CgHc
= N—NH—C6H5
V c=n= 1601,2 cm'1, V c_car0matic=1535,2 cm'1
350
V
Vàng
208
EtOH
556,
54,29
^OH trongmf= 1389,7 cm
ch2oh
Ôc.h=787,7 c m 1
28
268 ,
alcol= 1080,0 cm 1 889
2.5. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được
Với mục đích tìm ra các chất có triển vọng đưa vào điều trị, chúng tôi đã
tiến hành thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được.
2.5.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Tại bộ môn Vi sinh truờng Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành
thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được với 5 chủng
vi khuẩn kiểm định và 1 chủng nấm theo phương pháp đục lỗ thạch.
+ Nguyên tắc
Dựa trên sự khuyếch tán của chất thử vào môi trường dinh dưỡng có
chứa vi sinh vật kiểm định. Nếu chất thử có hoạt tính kháng khuẩn sẽ tạo ra
vòng vô khuẩn tỷ lệ với logarit nồng độ tương ứng.
+ Môi trường
Môi trường chúng tôi sử dụng gồm có
^ M ô i trường 1: Môi trường canh thang
>"Môi trường 2: Môi trường thạch thường
ỉ^Môi trường 3: Môi trường Sabouraud
+ Vi sinh vật kiểm định
Chúng tôi tiến hành thử trên 4 chủng vi khuẩn Gram (+), 1 chủng Gram
(-) và một chủng nấm :
Bacillus cereus
ATTC
21778
Bacillus pumilus
ATTC
8241
Bacillus subtilis
ATTC
9158
Staphylococcus aureus
ATTC
1228
ATTC
75922
ATTC
10231
. Escherichia coli
Candida albicans
29
Các chủng vi sinh vật nhận được từ Viện Kiểm nghiệm TW, trước khi
thử 24 giờ được cấy vào môi trường dinh dưỡng thích hợp, sau đó được chế
thành nhũ dịch vi sinh vật có nồng độ khoảng 107- 108 tế bào trong lml.
+ Các chất đem thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm:
Isonicotinoyl hydrazon của Glucose
Thiosemicarbazon của Glucose
Semicarbazon của Glucose
2,4-Dinitro phenylhydrazon của Glucose
+ Cách tiến hành
Các môi trường được hấp tiệt trùng ở 120°c trong 20 phút. Sau đó để
nguội đến 45°C-50°C trộn chủng vi sinh vật kiểm định vào với tỷ lệ 1% để có
nồng độ khoảng 106tế bào trong lml (đối với vi khuẩn trộn trong môi trường
2, vi nấm trong môi trường 3), đổ khoảng 15ml-18ml môi trường vào các hộp
petri có đường kính như nhau.
Sau khi thạch nguội, dùng dụng cụ đục lỗ thạch theo quy định, cho dịch
chất thử với lượng như nhau vào các lỗ. Sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 3060 phút để chất thử khuyếch tán vào môi trường. Đọc kết quả bằng cách đo
đường kính vòng vô khuẩn sau 18- 20 giờ ở 37°c bằng thước kẹp Palmer.
+ Kết quả
Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm của các chất được thể hiện bằng
đường kính vòng vô khuẩn được ghi ở bảng 2.4 trang 31 (Kết quả được lấy của
3 mẫu thí nghiệm).
+ Nhận xét
Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi nhận thấy: các dẫn chất hydrazon của
Glucose không có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
30
Bảng 2.4: Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các
hydrazon
( - ) : Không có tác dụng
2.5.2. Thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao[6,14]
Tại khoa Vi sinh (Viện lao và bệnh phổi) chúng tôi đã tiến hành thử độ
nhậy cảm của các chất tổng hợp được với vi khuẩn lao (Mycobacterium
tuberculosis) theo phương pháp tỷ lệ Cannetti- Grocet. Chúng tôi chọn 4 chất
là dẫn chất của Glucose, đem thử với chủng Mycobacterium tuberculosis
h 37r v , các chất này cũng được thử với chủng Mycobacterium tuberculosis đã
kháng INH.
+ Nguyên tắc
Tính tỷ lệ vi khuẩn lao sống sót trong môi trường có chứa chất thử so với
số vi khuẩn lao trong môi trường đối chứng không có chất thử.
+ Môi trường
Môi trường chúng tôi sử dụng để thử tác dụng vói vi khuẩn lao là môi
trường Lowenstein-Jensen có thành phần như sau:
KH2P 0 4
2,4g
31
Magie citrat
0,6g
Glycerin
12ml
Bột khoai tây
30g
Nước cất
600ml
MgS04.7H20
0,24g
Asparagin
3,6g
Malachite green 2%
20ml
Trứng đồng nhất
1000ml
Môi trường được đổ vào ống nghiệm (loại 20
X
150mm có nắp xoáy) và
làm đông ở 85°C-90°C trong 50 phút. Sau đó tiệt trùng ở 37°c trong 48 giờ.
+ Vi khuẩn kiểm định
Mycobacterium tuberculosis H37RV.
Mycobacterium tuberculosis lấy từ bệnh nhân đã kháng INH.
Các chủng vi khuẩn này được chế thành nhũ dịch có nồng độ lmg/ml.
Từ nhũ dịch này pha thành các nhũ dịch có nồng độ lO 'mg/ml (tương đương
107 vi khuẩn), 10'3mg/ml (tương đương 105 vi khuẩn), 10'5mg/ml (tương đương
103 vi khuẩn).
+ Các chất đem thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao
Chất I:
Isonicotinoyl hydrazon của Glucose.
Chất II: Thiosemicarbazon của Glucose.
Chất III: Semicarbazon của Glucose.
Chất IV: 2,4-dinitrophenylhydrazon của Glucose.
Chúng tôi tiến hành thử đối chứng vói isoniazid.
+ Tiến hành
Các ống nghiệm có chứa môi trường nuôi cấy chuẩn bị theo công thức ở
trên được cho thêm dung dịch chất thử. Mỗi chất được thử ở 3 nồng độ vi
khuẩn khác nhau của 1 chủng vi khuẩn (nồng độ 1 0 1, 10‘3,10"5mg/ml) bằng
32
cách cấy 0,2ml nhũ dịch vi khuẩn ở các nồng độ tương ứng vào ống môi
trường đã có chất thử. Để vào tủ ấm 37°c. Kiểm tra nhiễm trùng sau 24 giờ,
48 giờ, 1 tuần. Song song trong cùng điều kiện thử với mẫu chuẩn không có
dung môi và chất thử.
Đọc kết quả sau 40 ngày bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc ở các ống
chuẩn, ống có chất thử. Kết quả được đánh giá là có tác dụng chống vi khuẩn
lao khi:
Có khuẩn lạc mọc ở ống chứng (ống chuẩn).
Không có khuẩn lạc mọc ở các ống có chứa chất thử.
Sau đây là bảng kết quả thử test nhậy cảm trên vi khuẩn lao được tiến
hành trên chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis H37RV và trên chủng đã
được xác định là kháng isoniazid ( bảng 2.5,2.6 trang 34).
♦ Kết quả:
- Với chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis H37RV: Chỉ có
isonicotinoyl của Glucose là thể hiện tác dụng. Còn lại các chất II, III, IV đều
không thể hiện tác dụng.
- Với chủng vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis được xác định là
kháng isoniazid: isonicotinoyl của Glucose thể hiện tác dụng ở nồng độ pha
loãng cao của vi khuẩn (10'5mg/ml). Các chất II, III, IV đều không thể hiện
tác dụng.
33
Bảng 2.5: Kết quả thử test nhậy cảm vói vi khuẩn lao trên chủng chuẩn
H37RV
Chủng H37RV ở các nồng độ pha loãng
Chất thử
10-yg/ml
103|0.g/ml
+
I
10'5|j,g/ml
+
+
II
—
—
—
III
—
—
—
IV
—
—
—
—
—
—
Isoniazid
Bảng 2.6: Kết quả thử test nhậy cảm vói vi khuẩn lao trên chủng kháng
INH
Chủng H37RV ở các nồng độ pha loãng
Chất thử
lO ^g/m l
10"3|Lxg/ml
10"5|ug/ml
I
—
—
+
II
—
—
—
III
—
—
—
IV
—
—
—
—
—
—
Isoniazid
(+ ): Có tác dụng; ( - ) : Không có tác dụng
34
2.6. Bàn luận và nhận xét kết quả
2.6.1. Về tổng họp hoá học
- Chúng tôi đã điều chế Glucose từ tinh bột bằng phương pháp thủy phân.
- Từ Glucose, chúng tôi thực hiện phản ứng ngưng tụ loại nước với 5
hydrazin thế, thu được 5 hydrazon tương ứng trong đó có 4 chất chưa thấy có
trong các tài liệu tham khảo được, đó là chất I, II, III, IV.
- Các hydrazon tổng hợp được đều là chất rắn kết tinh, có mầu từ trắng
ngà đến vàng, dạng tinh thể hình kim.
- Phản ứng ngưng tụ được thực hiện trong dung mồi ethanol tuyệt đối,
đây là một dung môi phân cực có tác dụng làm tăng khả năng phân cực của
liên kết carbonyl, tạo điều kiện cho phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.
- Hiệu xuất của phản ứng không chỉ phụ thuộc vào xúc tác, dung môi,
4 ung~mỏi keTtinhlaj) thời gian, nhiệt độ phản ứng mà còn phụ thuộc vào cấu
trúc hoá học của các hydrazin.
2.6.2. Thăm dò tác dụng sinh học
+ Tác dụng kháng khuẩn kháng nấm
Các hydrazon tổng hợp được đều không có tác dụng trên 5 chủng vi
khuẩn và 1 chủng nấm kiểm định.
+ Test nhậy cảm với vi khuẩn lao
Từ kết quả có thể rút ra một số nhận xét sau:
- Hydrazon của isoniazid đều thể hiện tác dụng trên hai chủng vi khuẩn.
- Hydrazon của các hydrazin thế khác không có tác dụng trên hai chủng vi
khuẩn.
Tuy nhiên tất cả những nhận xét trên đây mới chỉ là thăm dò sơ bộ mang
tính chất định tính. Để đưa ra được những kết luận chính xác cần phải lặp lại
phép thử nhiều lần và mang tính chất định lượng. Nhưng vì thời gian và điều
kiện không cho phép, chúng tôi chưa thể thực hiện được thử nghiệm có tính
chất chuyên sâu hơn.
35
'S '
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
•
Từ những kết quả thực nghiệm đã trình bày ở trên chúng tôi rút ra một số
kết luận sau:
1. Đã điều chế được Glucose đạt tiêu chuẩn dược điển.
2. Tổng hợp được 5 dẫn chất hydrazon của Glucose trong đó 4 dẫn chất chưa
thấy công bố trong các tài liệu đã tham khảo, cụ thể là các chất I, II, III, IV.
Tất cả các chất tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và đo
nhiệt độ nóng chảy. Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác nhận bằng phân
tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại. Kết quả thu được cho phép chúng tôi kết
luận rằng các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến.
3. Đã thử tác dụng kháng khuẩn của 4 chất tổng hợp được đối với 5 chủng vi
khuẩn kiểm định và 1 chủng nấm Candida albicans. Kết quả cho thấy các chất
đều không có tác dụng.
4. Thử test nhạy cảm với vi khuẩn lao của 4 dẫn chất isonicotinoyl hydrazon
của Glucose:
Đối với chủng chuẩn Mycobacterium tuberculosis H37RV. Kết quả chỉ
có dẫn chất isonicotinoyl của Glucose có tác dụng, các dẫn chất khác không
có tác dụng.
Đối với chủng Mycobacterium tuberculosis đã được xác nhận là kháng
isoninazid. Kết quả dẫn chất isonicotinoyl của Glucose có tác dụng ức chế vi
khuẩn ở nồng độ 10"5mg/ml, ở các nồng độ khác không có tác dụng. Các dẫn
chất II, III, IV không có tác dụng.
Với điều kiện có hạn cả về thời gian và kinh phí, cùng với sự nỗ lực của
thầy và trò, chúng tôi đã thực hiện thành công đề tài này. Chúng tôi hy vọng
rằng, các hydrazon sẽ tiếp tục được nghiên cứu ở mức độ chuyên sâu hơn theo
các hướng khác nhau nhằm phát hiện ra những chất có thể được ứng dụng
trong lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
Bộ môn Hoá hữu cơ (1990), Hoá hữu cơ, Trường Đại học Dược Hà Nội,
tập 2, tr.309-337.
2.
Bộ Y tế (2000), Dược điển Việt Nam ///, Nxb Y học Hà Nội, tr.128-130.
3.
Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Ngô Mai Anh, Nguyễn Thị
Thủy (2000), ‘Tổng hợp và tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5-( 5 Nitro-2 -Furfuryliden)- Thỉazolidỉn-2,4-dion và dẫn chất”, Tạp chí dược học,
SỐ1 0 , t r . 1 2 - 1 4 .
4.
Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc Vân, Lê Thị Tập
(2000), “Nghiên cứu tác dụng chống lao của một số dẫn chất
thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogen isatirì\
Tạp chí dược học, số 8, tr.15-17.
5.
Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt (1984), Nguyên lý tổng hợp thuốc
hữu cơ, Nxb Y học Hà Nội, tr.65-224.
6.
Nguyễn Khang, Phạm Gia Khôi, Trần Mạnh Bình, Nguyễn Thị Liên,
Nguyễn Thị Lý, Nguyễn Thị Như Mai (1975), ”Nghiên cứu về các
isonicotinoyl hydraion cỏ tác dụng kháng vi trùng lao ”, Thông báo khoa học
số 22, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 15-32.
7.
Hoàng Hướng Quỳ (1986), Báo cáo kết quả nghiên cứu sản xuất đường
mật tinh bột theo phương pháp enzym, Bộ công nghiệp thực phẩm, tr. 2-8.
8.
Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn, Đặng Như Tại (1980), Cơ sở hoá học
hữu cơ, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, tập 2, tr.98-110.
9.
Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thúy (2002), Thuốc biệt dược và cách sử dụng,
Nxb Y học Hà Nội, tr.436-901.
10. Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu, Trường Đại học Dược Hà
Nội, tập 1, tr.28-32.
11. Từ điển bách khoa Dược học (1999), Nxb Từ điển Bách khoa, tr.272.
12. Vũ Trần Anh (2001), Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất isoniazid và thử tác
dụng sinh học, Luận văn thạc sỹ dược học, tr.6-9.
13. H er M ajetsty’s Stationery office (1998) British pharmacopoeia The
Stationery office, p.642-643.
14. Cannetti G., Froman s. Grosset J. (1963), “Mycobacteria: Laboratory
methods fo r testing drug sensitility and resistence”, Bull. WHO (29), p.565578.
15. Jerry
March
(1977),
Advanced
organic
chemistry:
Reaction,
mechanism and structure, Me Graw-hill book company, Newyork, St.Louis
San Francisco, Toronto, London, Sydney, p.308-1096.
16. Kathleen Parfitt (1999), Martindale-The complete drug reference
Martindale, Pharmaceutical Press, p. 1343-1344.
17. Susan Budavari (2001), The Merck Index, Merck and Co, .Inc, p.5781669.
18. Swiss Pharmaceutical Society (2000), Index Norminum 2000, Med
Pharm Scientific Publisher, p.494-963.
19. US
Pharmacopeial
Convention, Inc(1999),
pharmacopeia 24 -The National formulary, p.531-532.
The
United States
PHỤ LỤC
TRANG 1 — 7
ABS
1.43077
- 0 . 0 0 0 3
_ABS____________
NM
268.889
Samp.0 1 -X . Bach/DHF
Gain
109
SBU
Basel ine______ OFF Page
9 May 2003
Z.0
3
4 0 0 . 0 0
________
HU
DISPLAY DATA
2.0000
1.6000.
H— C = N — NH— CO
1 . 2000 .
0.8000-
CH2OH
0.40000.0000J
200.00
240.00
280.00
fiBS
0.0800 -> 2.0000
B aselin e
Erase
Uieu
R e-sca le
Zoom
Use the graphics cu rsor, tra ck , slo p e _____
ABS
0 . 65507
NM
265 . 556
. - 0 . 0 0 3 7
g W - 02- x -B»':J ^ nF
Page
•ÂBS_______________ Basel ine_____ OFF
320.00
MM
Label
360.00
ZBB.B9 ->
More
1—
_l
400.00
489.00
9^May 2003
4 0 0 . 0 0
3__________________________________m
ABS
: 0.0000 -> 1.0000
MM
: 200.00 -> 400.00
I Basel ilie
Erase
Uieu
R e-sca le
Zoom
SCTHcfflB Label
More
Use the graphics cu rsor, tra ck , slo p e ___________________________________________
ABS
ABS:
-
0.50538
0.21600
0.0001
flBS____________
NM
NM
354.444
272.222
3 May 2003
2 .0
3____________
Samp. 04-X . Bach/DMF
Gain
84
SBU
Page
Basel ine_____OFF
5 5 0 . 0 0
___________ tin
DISPLAY DATA
1.0000
0.8000.
0.6000.
0.4000.
0 . 2000 -
V
0.0000-
1
200.00
__ I
380.00
------ 1---- ~i— ------- 1-------------1---------400.00
500.00
ftHS
: 0.0008
u .m m
m
Z00.00 ->
_ABS______________
-> l.HHHH
1.BB89_______MB_________
:: 290.00
Basel ilie
Erase
Ụieu
R e-sca le
Zoom
'?TT»3ĨTĨ
Label
More
ABS
ABS
ABS
0 . 55230
0 . 29992
0 .23690
NM
NM
NM
550.00
395.556
307.778
268.889
♦
QQQ1
- 0 . t J c j tJ -L
ABS
Sanp.05-X.Bach/DMF
Gairi
84
SBU
B a se lin e
OFF
Page
9 Nay 2003
2 .0
3
5 5 0 . 0 0
NM
DISPLAY DATA
1.0000
' 0.8000.
H—C=N—NH— ƠH5
: N— NH— C«H5
» 0.6000.
0.4000-
/
ch2oh
0 .2000 0 . 0000 200.00
300.00
400.00
1
500. 00
hBS
: 0.00H0
0.0808 -> 1.0000
NM
: 200.00
Z00.00 ->
Basel i lie
Erase
Uieu
R e -sc a le
Zoom
BTTHffl
Label
More
Use th e graphics cu rsor, tr a c k , s lo p e ___________________
550.00
I
UJ
CD
CO
£D
ooi-d.,1 —
CD
^Ơ1_1
Ẽi
is ị
ro
C
esD Ii
® j
2911.3—
oGD
03/05/15 09:05 Phong TNTT-DH Duoc
X: 1 scan, 4 .0 c m -l, -flat, smooth
Samp. 01-X .B ach/H c
ro
1500
1000
cm'1
500
H— c = N— NH— c— NH2
_u
PERKIN ELM ER
2 4 .0 1 XI
ch 2o h
/Ạ
'3:
òi
-0 .4 Í
4000
3500
30014
—0 3 / 0 5 / 1 5 0 9 :0 9 Phong TNTT-DH Duoc
—Y: 1 s c an, 4 . 0cm -l , f l a t , smooth
Samp. 02 —
JK. Bach/He 0
*
*
2500
Ĩs
PERKIN ELM ER
3 1 .6 6 -
yj
— j----------------------------------r
■1.444000
3500
3000
0 3 / 0 5 / 1 5 0 9 :1 4 Phong TNTT-DH Duoc
Z; 1 scan, 4 . 0CIH-1, smooth------------samp. 03“J[...]... cho thấy tất cả các chất tổng hợp được đều có tác dụng mạnh trên chủng Mycobacterium tuberculosis H37RV Ngoài ra có 6 dẫn chất của 3isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5- halogen isatin có tác dụng cả trên chủng vi khuẩn lao đã kháng isoniazid [4] + Các tác dụng khác Ngoài các tác dụng chính kể trên một số hydrazon còn có tác dụng chống khối u, chống viêm, chống virus, chống ký sinh trùng như : i^Bis... cơ để điều chế các chất như dự kiến: >- Điều chế Glucose từ tinh bột bằng phương pháp thủy phân acid >- Tổng hợp các dẫn chất hydrazon của Glucose bằng phương pháp ngưng tu giữa nhóm carbonyl và các hydrazin thế - Theo dõi quá trình/bằng SKLM - Xác định độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy - Xác nhận cấu trúc các chất tổng hợp được dựa trên phân tích phổ IR, u v - Thử tác dụng. .. sinh học của các chất tổng hợp được Với mục đích tìm ra các chất có triển vọng đưa vào điều trị, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 2.5.1 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Tại bộ môn Vi sinh truờng Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được với 5 chủng vi khuẩn kiểm định và 1 chủng nấm theo phương... Cổ^đặc Kết tinh ị - Lọc hút -ị Tua Dich U ị Sấy Loc hút , Sản fphẩm í T ịa EtOH Sấy « T í : sản pham thu hồi 18 2.3 Điều chế dẫn chất hydrazon của Glucose Trong các phương pháp tổng hợp dẫn chất hydrazon, căn cứ vào các chất dự kiến tổng hợp và căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã chọn phương pháp ngưng tụ Glucose với dẫn chất hydrazin thế Phương trình phản ứng tổng q... kháng nấm của các chất tổng hợp được bằng phương pháp đục lỗ thạch theo quy định trong DĐVNIII Thử tác dụng trên vi khuẩn lao của các chất tổng hợp dựa trên phương pháp thử độ nhậy cảm của vi khuẩn lao với chất thử theo phương pháp tỉ lệ CannettiGrosset 2.2 Điều chế Glucose Trong các phương pháp điều chế Glucose, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi chọn phương pháp thủy phân tinh bột bằng... acetylaminobenzoic) có tác dụng chống lao và đã áp dụng vào thực tế lâm sàng có kết quả tốt với các tên biệt dược như TBI, Corteben, Livazon[9,12,18]: o s J H3C — c —HN—Y II y - C H = N —NH—C —NH 2 Năm 1948 MN Soulina và E Michina đã tổng hợp được một dẫn chất khác của Thiosemicarbazon có tác dụng chống lao lấy tên là Cutizon có công thức như sau[9,12,18]: ? H3/ = \ H 3C—H C ^ s C H = N —NH—C —NH 2 Dãy có tác dụng. .. lấy của 3 mẫu thí nghiệm) + Nhận xét Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi nhận thấy: các dẫn chất hydrazon của Glucose không có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 30 Bảng 2.4: Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các hydrazon ( - ) : Không có tác dụng 2.5.2 Thử test nhậy cảm với vi khuẩn lao[6,14] Tại khoa Vi sinh (Viện lao và bệnh phổi) chúng tôi đã tiến hành thử độ nhậy cảm của các chất tổng hợp. .. Chế phẩm phải tan hoàn toàn trong EtOH Cho mầu vàng với dd iod < lppm < 0 , 1% Mầu của hỗn hợp gồm 2g chế phẩm+lml HNO3 +lm l A gN 03+ H20 vđ 50ml không đậm hơn mẫu chứa 0,5ml HC1 0,020N Mầu của hỗn hợp gồm 2g chế phẩm+lml H ơ + 3ml B a ơ 2 + H20 vđ 50ml không đậm hơn mẫu chứa 0,5ml H,S0 4 0,020N Cho mầu vàng với dd iod KQĐ 1.2 Dẫn chất hydrazon 1.2.1 Tác dụng sinh học của dẫn chất hydrazon + Tác dụng. .. trong mặt phẳng 1080,0 c m 1 ^ O H alcol 787.7 cm'1 Ỗc-H 2.4 Tóm tắt kết quả tổng hợp Như vậy chúng tôi đã tổng hợp được 5 dẫn chất của Glucose Chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số hằng số vật lý của các chất này Kết quả được trình bầy trong bảng 2.2 và 2.3 Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác định bằng phổ hồng ngoại và phổ tử ngoại: + Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật... kháng lao mạnh thứ hai là dẫn chất isonicotinoyl như[9,12,18]: CO— NH— N = H C — | /= \ ỳ —OH OCH3 / Ftivazidỷ, Vanizid^ (Isonicotinoyl hydrazon của 3- metoxy- 4- hydroxy benzandehyd) 10 Năm 2000, các tác giả Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Lê Ngọc Vân, Lê Thị Tập đã nghiên cứu và thử tác dụng chống lao của một số dẫn chất Thiosemicarbazon và isonicotinoyl hydrazon của isatin và 5-halogen isatin Kết ... nhỏ bé vào công việc điều chế Glucose dược dụng tổng hợp số dẫn chất có tác dụng sinh học, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu sau : - Điều chế Glucose từ tinh bột - Tổng hợp số dẫn chất Glucose. .. 0,020N Cho mầu vàng với dd iod KQĐ 1.2 Dẫn chất hydrazon 1.2.1 Tác dụng sinh học dẫn chất hydrazon + Tác dụng kháng khuẩn Đây tác dụng quan trọng dẫn chất hydrazon, đáng ý dẫn chất hydrazon 5-... hành thử tác dụng sinh học chất tổng hợp 2.5.1 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Tại môn Vi sinh truờng Đại học Dược Hà Nội, tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm chất tổng hợp với chủng
Ngày đăng: 07/10/2015, 16:59
Xem thêm: Nghiên cứu điều chế glucose từ tinh bột và tổng hợp một số dẫn chất của glucosed dự đoán có tác dụng sinh học, Nghiên cứu điều chế glucose từ tinh bột và tổng hợp một số dẫn chất của glucosed dự đoán có tác dụng sinh học