NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT PROTIT MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Hợp chất thiên nhiên (Natural product) là một trong những lĩnh vực rất thú vị trong bộ môn Hóa Hữu cơ. Lĩnh vực này nghiên cứu về thành phần, cấu tạo và tính chất của những hợp chất thiên nhiên và cách trích ly chúng từ nguồn thiên nhiên vô tận. Protit là hợp chất cao phân tử sinh học, có trong cơ thể động vật và thực vật, chủ yếu là trong động vật. Protit bao gồm protein và proteit, là những hợp chất quan trọng và cần thiết trong đời sống của động vật, thực vật và cả con người. Protein là một trong những thành phần quan trọng nhất của động vật và thực vật. Tất cả các enzyme, hầu hết các hoóc môn, một phần lớn hệ thống miễn dịch của chúng ta, tất cả các cơ và rất nhiều các mô khác của cơ thể được tạo nên bởi protein. Protein đóng vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người, nó là thành phần dinh dưỡng cơ bản của người và vật nuôi, là nguồn cung cấp vật liệu như da, lông, tơ phục vụ sản xuất nhằm nâng cao chất lượng cũng như gia tăng thời gian bảo quản. Nhiều năm qua việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protein, đặc biệt là các enzyme, đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Phần lớn enzyme sử dụng trong công nghiệp là các protein ngoại bào từ các cơ thể. Nhiều loại trong số này vẫn còn được sản xuất từ các chủng gốc tự nhiên của vi sinh vật. Tuy nhiên, trong sản xuất protein/enzyme để sử dụng trong các lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng và cho các ứng dụng trị liệu, công nghệ 1 protein/enzyme và công nghệ DNA tái tổ hợp đã thể hiện một vai trò ngày càng quan trọng. Nhiều loại loại protein/enzyme được sản xuất trong các hỗn hợp nội bào phức tạp đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình tinh sạch chúng. Những protein/enzyme được tinh sạch này thường được sản xuất để sử dụng trong trị liệu, do đó phải cố gắng hướng tới các tiêu chuẩn tinh sạch rất cao và để có được điều này người ta cần phải phát triển các quy trình tinh sạch phức tạp. Vì những lý do đó tôi chọn đề tài: "Nghiên cứu lý thuyết về phương pháp tách chiết hợp chất protit". 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tìm hiểu về protit, cấu tạo, tính chất và phân loại protit. - Các phương pháp tách chiết, tinh sạch protit. 3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Cơ sở lí thuyết, phương pháp tách chiết protit. - Phạm vi nghiên cứu: Các phương pháp tách chiết protit. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu Trong khóa luận này nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể: - Nghiên cứu tài liệu, giáo trình liên quan đến phương pháp tách chiết protit. - Nghiên cứu ví dụ cho phương pháp tách chiết, tinh sạch protit. 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu lí luận: Đọc các giáo trình, tài liệu tham khảo liên quan đến phương pháp tách chiết protit và ví dụ về phương pháp tách chiết protit. - Phương pháp lấy ý kiến chuyên gia: Lấy ý kiến của giáo viên trực tiếp hướng dẫn và các giáo viên khác trong lĩnh vực đề tài để hoàn thiện nội dung và hình thức của khóa luận này. 2 - Phương pháp học hỏi và tổng kết: Học hỏi kinh nghiệm của các anh, chị khóa trước, sau đó rút ra kinh nghiệm cho bản thân và tổng kết những kiến thức đã tìm hiểu để hoàn thành khóa luận. 6. Đóng góp của khóa luận - Đưa ra được lí thuyết về phương pháp tách chiết, tinh sạch protit, một hợp chất quan trọng đối với con người, động vật và thực vật. - Giới thiệu về protit gồm cấu trúc, tính chất, phân loại. Giúp chúng ta nhận ra được tầm quan trọng của protit trong đời sống. 7. Cấu trúc khóa luận Ngoài phần Mở đầu, Kết luận và Danh mục tài liệu tham khảo, khóa luận gồm 3 chương: Chương 1: Tổng quan sơ lược về protit. Chương 2: Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein. Chương 3: Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng và đầu tôm sú bằng phương pháp sắc kí lọc gel. 3 NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN SƠ LƯỢC VỀ PROTIT 1.1. Giới thiệu về protit Protit là hợp chất cao phân tử sinh học, có trong cơ thể động vật và thực vật, chủ yếu là trong động vật. Thực vật tổng hợp protit từ CO 2 và H2O bằng quang hợp cùng với các nguyên tố khác như N, P, S, Fe, Mg có trong muối tan của đất, còn cơ thể động vật có thể tự tổng hợp được một số aminoaxit, gọi là aminoaxit thế, còn đại đa số aminoaxit là đưa từ ngoài vào cơ thể, từ đó có thể tổng hợp ra protit. Khi thủy phân đến cùng sẽ tạo thành các α-aminoaxit, thường protit có khối lượng phân tử khoảng 104 đến 107. 1.2. Phân loại protit Protit được chia ra làm hai loại chính: protein và proteit: 1.2.1. Protein Protein là loại protit đơn giản, cấu trúc chỉ từ những α-aminoaxit khác nhau. Các α-aminoaxit kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptit (gọi là chuỗi polypeptit). H | (gốc hữu cơ R) R – C – COOH (nhóm cácbôxylic) | NH2 (nhóm amin) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein. Protein bao gồm hai loại chủ yếu: Protein tan trong nước và protein không tan trong nước. 1.2.1.1. Protein tan trong nước Protein tan trong nước thường kết tủa khi đun nóng, khó kết tủa trong dung dịch muối. 4  Albumin là protein đơn giản phổ biến nhất. Nó được tìm thấy ở trong máu, dịch tế bào, dịch tuỷ sống. Anbumin có trong lòng trắng trứng, mô bắp thịt, sữa. Anbumin chứa trong sữa cùng với protit khác gọi là cazein, bọt nổi lên khi đun sôi sữa chủ yếu là anbumin. Albumin hoà tan trong nước và các dung dịch muối. Anbumin trung tính, tương đối khó kết tủa trong dung dịch muối, vón lại khi đun nóng. Albumin đông khi đun nhưng ở các nhiệt độ khác nhau: albumin trứng đông ở nhiệt độ 560ºC, albumin huyết thanh ở 670ºC, albumin sữa ở 720ºC. Albumin của động vật (như albumin huyết thanh của máu) khi thuỷ phân cho 19 axit amin và thành phần các axit amin ít khác nhau ở các động vật (trừ vịt). Albumin thường chứa số lượng lớn các axit amin sau: leucin, axit glutamic, axit aspartic, lysin, còn các axit amin như methionin, tryptophan, glycocol... số lượng ít hơn. Trọng lượng phân tử của albumin khoảng 35.000 - 70.000, điểm đẳng điện nằm trong khoảng 4,6-4,7. Albumin thường tạo thành các phức chất với lipid, axit béo, axit amin, kháng thể...nên có quan điểm cho rằng nó giữ vai trò tích cực trong trao đổi vật chất. 1.2.1.2. Protein không tan trong nước Protein không tan trong nước có tính axit hoặc bazơ yếu, không tan trong dung dịch muối. Loại này có vài nhóm sau:  Globulin không tan trong nước, là axit yếu, tan trong dung dịch muối loãng, kết tủa trong dung dịch muối đặc hơn. Globulin có trong protit của lòng đỏ trứng, trong máu, cơ bắp thịt, thường là chất đầu để hình thành protit thực vật. Globulin hầu như nằm cùng với albumin và rất phổ biến trong tự nhiên. Nó có nhiều trong máu động vật, trong các cơ quan, tế bào, trong các dịch lỏng của cơ thể. Globulin chứa khoảng 14-19 axit amin quan trọng như: leucin, vang, ly sin, axit glutamic, sâm, treo nin. Trọng lượng phân tử của globulin khoảng 90.000 1.500.000 hoặc lớn hơn, điểm đẳng điện nằm trong khoảng 5,0-7,5. 5  Histon là protein có cấu tạo đơn giản là protit có tính bazơ, có trong hồng cầu, trong các nucleoproteit leucocit. Histon dễ tan trong nước, không tan trong dung dịch amoniac loãng. Nó chứa số lượng axit amin quan trọng ít hơn so với albumin và globulin. Trong histon không có cystein, cystin, tryptophan, mà chủ yếu là arginin và lysin (20-30%). Histon được Koccel tìm thấy trong nhân tế bào, trong thành phần của nucleoprotein và các protein phức tạp khác. Điểm đẳng điện của histon nằm trong khoảng 9,0 - 11,0.  Protamin có tính bazơ mạnh, không chứa S, có trong cá nhà táng được coi là chất protit đơn giản nhất trong protit, cho muối kết tinh. Protamin được Miser và Koccel tìm thấy trong thành phần của nucleoprotein của tế bào sinh dục cá. Sau đó còn phát hiện ở lách, tuyến điều và các cơ quan khác. Protamin có trọng lượng phân tử thấp (2.000-8.000), thành phần chứa ít axit amin (6 - 8), trong đó chủ yếu là axit amin điamin (tới 80% arginin). Khi đun protamin không đông và không sa lắng, nó chỉ sa lắng bởi muối kim loại nặng. Điểm đẳng điện của protamin nằm trong khoảng 10,5 - 12,0.  Prolamin có trong ngũ cốc, tan trong rượu 80%. Chất tiêu biểu là glyadin, là thành phần chính của gluten. Gluten (protit dính, tách được khi lọc tinh bột) là hỗn hợp protit, ưu tiên có glyadin tan trong rượu còn các protit khác không tan trong rượu. Prolamin có nhiều ở các hạt thảo. Đặc điểm của prolamin là tính hoà tan trong cồn 70% và không tan trong nước. Khi thuỷ phân prolamin thường cho nhiều thoăn và axit glutamic (43%).  Keratin là chất chủ yếu của tóc, lông, sừng, móng, lớp thượng bì...hoàn toàn không tan, kể cả trong dung dịch axit, kiềm. Khi thuỷ phân cho nhiều cystin (7 - 12%) và axit glutamic (4 - 17%).  Colagen (và procolagen) là protein của sợi mô liên kết ở gân, ở da, ở dưới da, có trong cơ bắp, xương, … Nó không hoà tan trong nước, nhưng khi tác động lâu của nhiệt sẽ trở thành dạng hoà tan là gelatin. Keo dán chế ở da trâu chính là colagen. Hàm lượng glycin của colagen khá cao (25%), nhưng về nhiều axit amin không thay thế được thì lại thiếu. 6 1.2.2. Proteit Proteit là loại protit phức tạp, ngoài thành phần protein còn có các thành phần khác gọi phi protein.  Photphoproteit: là proteit chứa axit photphoric, có tính axit. Chất phổ biến là cazein có trong sữa, vitelin có trong lòng đỏ trứng.  Nucleoproteit có trong nhân tế bào, khi thủy phân cho protein và axit nucleic.  Chromoproteit là proteit bao gồm protein và chất có màu, chẳng hạn như hemoglobin.  Glucoproteit có nhiều trong tuyến thận, gan, khi thủy phân cho protein và các chất đường olyosaccarit hay polysaccarit.  Lipoproteit khi thủy phân cho protein và chất béo.  Về mặt cấu trúc, protit được chia ra làm hai loại: prrotit sợi và protit dạng hạt cầu. 1.3. Cấu trúc của protit Cấu trúc của protit rất phức tạp, nhất là các proteit, song về cơ bản gồm các loại khác nhau phụ thuộc vào mạch phân tử và tương tác giữa các phân tử. Cấu trúc không gian: có 4 bậc cấu trúc cơ bản Cấu trúc bậc 1: Là trình tự sắp xếp các amino axit trong chuỗi polipeptit, là chuỗi axit amin ở dạng mạch thẳng, có tính đặc thù bởi số lượng, thành phần, trật tự sắp xếp các axit amin. Cấu trúc bậc 2: Được tạo thành từ các chuỗi protein bậc 1 xoắn cuộn vào nhau một cách đều đặn. Các protein có thể xoắn tạo nên cấu trúc xoắn α hoặc gấp khúc tạo nên cấu trúc gấp β. Cấu trúc bậc 3: Là hình dạng không gian ba chiều của protein do kiểu bậc 2 cuộc xếp theo kiểu đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc bậc 4: Do các cấu trúc bậc 3 kết hợp với nhau tạo thành khối protein có dạng hình cầu. 7 Hình 1.1. Cấu trúc không gian của protein 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất Protit là một chuỗi aminoaxit kết hợp với nhau bằng liên kết peptit tạo nên một chuỗi mạch dài polypeptit gọi là cấu trúc bậc nhất. Cấu trúc bậc nhất được thiết lập bằng phương pháp phân tích nhóm cuối. Trong mạch peptit, ngoài liên kết bình thường trong mạch còn có liên kết sunfua giữa các phần của mạch, gọi là liên kết sunfua nội phân tử, thường là giữa hai gốc cystein trong cùng mạch. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các axit amin trên chuỗi polypeptit sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptit, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính 8 chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein. 1.3.2. Cấu trúc bậc hai Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptit trong không gian. Chuỗi polypeptit thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau. Các protein sợi như keratin, Collagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có nhiều nếp gấp β hơn. Tính cứng của mạch peptit do hạn chế khả năng quay của liên kết như trên đã nói, ngoài ra cấu trúc ba chiều của phân tử peptit còn do hai nhân tốt khác: liên kết giữa các mạch và tương tác van der Waals hay tương tác Coulomb. Liên kết giữa các mạch là liên kết đisunfua, chẳng hạn giữa hai đơn vị cystein của hai mạch như trong insulin, đã hạn chế sự quay của phân tử. Liên kết hiđro giữa hai phân tử hay trong nội bộ phân tử do mạch peptit có chứa nhóm CO và NH. Liên kết hidro giữa oxi của CO với H của NH. Liên kết sunfua và hiđro làm cho peptit có cấu dạng gọi là cấu trúc bậc hai (có tài liệu gộp cấu trúc bậc một và hai thành cấu trúc chung bậc nhất). Hình 1.2. Cấu trúc bậc 2 của protein 9 1.3.2.1. Cấu trúc vòng xoắn α Cấu trúc này tự quay quanh nó mỗi vòng có chiều cao là 5.4 A º có chiều cao là 5.4 A. Nên chúng ta nói rằng chuỗi xoắn α tương ứng khoảng 3.6 amino axit mỗi vòng. Cấu trúc này được bền vững hóa nhờ liên kết hiđro gắn với nguyên tử nitơ tích điện âm của liên kết peptit và nhóm nguyên tử -CO- tích điện âm của amino axit thứ 4 trên vùng tận cùng của amino axit của liên kết peptit. Bên trong chuỗi helix, mỗi liên kết peptit (trừ liên kết kề với 2 đầu của chuỗi) tham gia vào liên kết peptit đó. Mỗi vòng liên tiếp của chuỗi helix chứa 3 đến 4 liên kết hiđro. Tất cả liên kết hiđro đó tạo nên tính ổn định cho cấu trúc chuỗi xoắn helix. Hình 1.3. Cấu trúc vòng xoắn α 1.2.3.2. Cấu trúc nếp gấp β Trong dạng cấu trúc polypeptit này không có dạng xoắn ốc, thay vì thế, nó có dạng zigzag hơn là xoắn α. 10 Các chuỗi polypeptit zigzag có thể được sắp xếp kế tiếp nhau tạo thành cấu trúc một loạt các nếp gấp gọi là phiến (sheet); liên kết hiđro được tạo bởi các đoạn kề nhau của chuỗi polypeptit. Các chuỗi polypeptit trong một phiến có thể song song hoặc đối song (cùng hoặc ngược hướng amino – carboxyl tương ứng). Cấu trúc này khá giống nhau, mặc dù đoạn lặp lại ở cấu trúc song song là ngắn o o hơn (6.5 A , ở cấu trúc đối song là 7 A ) và kiểu liên kết hiđro khác nhau. Phiến β song song ít xoắn hơn dạng đối song và luôn bị chôn vùi. Ngược lại, phiến đối song có thể thấy sự xoắn rõ rệt hơn và dễ hòa tan hơn. Hình 1.4. Cấu trúc nếp gấp β 1.3.3. Cấu trúc bậc ba Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R trong các mạch polypeptit. Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfua (-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các 11 nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu. Hình 1.5. Cấu trúc bậc ba của protein 1.3.4. Cấu trúc bậc bốn Khi protein có nhiều chuỗi polypeptit phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptit liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hyđro. Chuỗi polypeptit (có cấu trúc bậc một) được xoắn lại thành ống trụ (cấu trúc bậc hai), ống trụ cuộn tròn lại thành trụ (cấu trúc bậc ba), các thành trụ kết hợp lại với nhau thành một tổ hợp các phân tử protein (cấu trúc bậc bốn). Hình 1.6. Cấu trúc bậc bốn của protein 12 1.4. Tính chất của protit 1.4.1. Tính chất lưỡng tính Do thành phần protit là các phân tử axit amin, mà axit amin là chất lưỡng tính nên protit cũng là phân tử lưỡng tính, có điểm đẳng điện đặc trưng cho từng loại protit. Nói chung, điểm đẳng điện nằm trong vùng axit pH = 4,6 - 6,3. Đặc tính của protit là tính chất của dung dịch đệm. Ngoài ra, do trong thành phần amino axit của protein có 2 nhóm: - Các amino axit: trong cấu tạo có 2 nhóm COOH, trong đó 1 nhóm dùng để tạo liên kết peptit còn một nhóm hình thành ion COO-. - Các amino axit kiềm: trong cấu trúc có 2 nhóm NH2, trong đó một nhóm tạo liên kết peptit còn một nhóm hình thành NH 3 . Như vậy, phân tử protein vừa có khả năng phân ly như một axit tạo COOvừa có khả năng phân ly như một chất kiềm tạo NH 3 nên mang tính lưỡng tính. 1.4.2. Phản ứng màu Protit cũng có phản ứng màu, như phản ứng biure, milon, xangtoproteit, ninhidrin.  Phản ứng biure: protein phản ứng với CuSO 4 trong môi trường kiềm cho dung dịch màu xanh tím. Phản ứng Biure giúp nhận ra liên kết peptit.  Phản ứng xangtoproteit: Protein phản ứng với HNO 3 đặc tạo ra kết tủa màu vàng. Thực chất đây là phản ứng nitro hóa nhân thơm có trong protein như phenylalanin, tyrosin, tryptophan.  Phản ứng ninhidrin: protein tác dụng với dung dịch ninhidrin trong nước cho dung dịch màu xanh. Phản ứng này đặc trung cho α-amino axit có trong phân tử protein. 13 1.4.3. Tính tan Tính tan của protit thay đổi phụ thuộc vào khối lượng phân tử, trật tự kết hợp giữa các phân tử, tương tác giữa các phân tử, nhất là sự hình thành liên kết hiđro và đisunfua và còn phụ thuộc vào dung môi, môi trường, nhiệt độ... Các protein hình sợi như keratin (của móng, tóc, sừng), fibroin (của tơ tằm) hoàn toàn không tan trong nước. Protein hình cầu của anbumin, globulin của sữa và của máu có thể tan trong nước tạo thành dung dịch keo vì trên bề mặt phân tử có nhiều nhóm nguyên tử phân cực tích điện, các phân tử lưỡng cực của nước bị hấp thụ bởi các nhóm nguyên tử nêu trên, tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hiđrat hóa. Tại điểm đẳng nhiệt protein tan kém nhất, nếu thêm axit hoặc kiềm có thể làm tăng độ tan. Một số muối trung tính có thể làm ảnh hưởng đến độ tan của protein. Tính tan của protein tan khi nồng độ muối thấp, khi nồng độ muối cao gây ra sự kết tủa protein. Ở nhiệt độ thấp tính tan của protein giảm. 1.4.4. Sự biến tính của protit Tính chất của protit thay đổi dưới tác động của các tác nhân vật lý hoặc hóa học gọi là sự biến tính protit, như:  Nhiệt  Các bức xạ tử ngoại  Sự biến đổi độ pH  Các chất tẩy rửa  Các dung môi hữu cơ (trừ nhiệt độ dưới 0oC)  Dung dịch ure hay guanidin  Sự pha loãng đơn giản hay sự khuấy đơn giản cũng có thể là nguyên nhân gây sự biến tính của protit, điều này rất cản trở khi ta muốn tinh chế một protein. Quá trình biến tính đã gây ra sự thay đổi cấu trúc của phân tử protit, làm thay đổi liên kết. 14 Sự biến tính có thể là quá trình thuận nghịch hay không thuận nghịch. Điều này xảy ra khi có sự chuyển từ trạng thái trật tự cao xuống trạng thái ít trật tự. Ở trạng thái tự nhiên, protein có cấu dạng bền nhất theo quan điểm năng lượng ở những điều kiện trong tế bào; nếu ta thay những điều kiện này, các cấu dạng của protein sẽ bị biến tính, các liên kết hyđro và các liên kết khác cũng sẽ đứt và gây nên sự xáo trộn cấu trúc bậc hai và bậc ba. 1.4.5. Sự kết tủa protit Rất nhiều hợp chất phản ứng với protein tạo thành dạng kết tủa không màu, bao gồm các hợp chất: - Các muối của kim loại nặng: HgCl2, CuSO4, (CH3COO)2Pb, (CH3COO)2Zn. - Các axit: HNO 3 , axit axetic, axit tricloaxetic. - Các dung môi hữu cơ: Ancol etylic, axeton, ancol metylic. Có hai loại kết tủa: Kết tủa thuận nghịch và kết tủa bất thuận nghịch. Kết tủa thuận nghịch: Sau khi protein kết tủa, nếu loại bỏ tác nhân gây ra kết tủa, protein lại tan trong nước tạo thành dung dịch keo như trước và vẫn giữ nguyên tính chất của chúng. Kết tủa thuận nghịch không làm thay đổi tính chất của protein. Ví dụ như cho dung dịch (NH4)2SO4 vào dung dịch lòng trắng trứng sẽ xuất hiện kết tủa bông của globulin. Khi loại bỏ (NH4)2SO4, kết tủa globulin lại tan trở lại trong nước tạo thành dung dịch keo. Kết tủa bất thuận nghịch: Sau khi protein kết tủa, nếu loại bỏ tác nhân gây kết tủa, protein mất khả năng tạo dung dịch keo bền. Kết tủa bất thuận nghịch làm thay đổi tính chất của protein. Khi đun nóng trứng hoặc sữa, thì sau khi đun chúng không thể trở về dạng đồng thể như ban đầu. Kết tủa bất thuận nghịch cũng xảy ra trong trường hợp có mặt của muối kim loại nặng như Fe, Cu, Hg, Pb. Các tác nhân này thường làm thay đổi lớp vỏ hiđrat hóa và lớp vỏ điện tích. 15 1.4.6. Hoạt tính sinh lý Protein cũng như polypeptit có vai trò rất quan trọng và rất đa dạng trong sự sống của sinh vật. Để đơn giản và vắn tắt, có thể nói vai trò chủ yếu của protein là vai trò cấu trúc hóa. Chẳng hạn; α-keratin là cấu tử cấu trúc nên tóc, da lông, móng. Collagen là nguyên liệu cấu thành các mô liên kết như xương, sụn, gân. Fibroin là tơ của các mạng nhện và của kén… Một số protein là nguồn dự trữ. Ovalbumin có bản chất làm nguồn thức ăn trong lòng trắng trứng. Cazein có vai trò quan trọng trong sữa. Một số protein làm vai trò của hoocmon như insulin điều hòa quá trình trao đổi chất của glucozơ, β-endorphin, giống như morphin, gây ra sự đau tự nhiên cho cơ thể. Một polypeptit khác là mellitin có 26 aminoaxit, là chất độc của ong, có chức năng sinh học bao gồm các khả năng thấm sâu vào màng tế bào và phân hủy erythrocyt (tế bào máu đỏ). Protit còn đóng vai trò của enzym, có liên quan tới cấu trúc phân tử, lực tương tác nội và giữa các phân tử, liên quan tới tính chất hóa học của nhóm chức, tính axit và tính bazơ, tính oxi hóa và khử, cũng liên quan tới sự thay đổi năng lượng và tốc độ phản ứng. 16 CHƯƠNG 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG QUÁ TRÌNH TINH SẠCH PROTEIN 2.1. Chuẩn bị dịch protein thô Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa protein về dạng dịch. Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu, nghiền bằng thiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng siêu âm. Các phương pháp kể trên thích hợp để xử lý các mô mềm, mô động vật, thực vật. Đối với vi khuẩn có vỏ bảo vệ chắc chắn thì tốt nhất là nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật liệu chà xát như cát hay bột nhôm, hoặc xử lý với lysozyme (enzyme phá vách tế bào). Đối với những loại tế bào có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một số trường hợp phải sử dụng máy ép tạo áp suất cao để phá vỡ tế bào. Một số trường hợp có thể sử dụng máy nghiền để phá mẫu. 2.2. Ổn định protein trong dịch chiết thô Sau khi giải phóng khỏi vách tế bào, protein bắt đầu chịu tác động phá hoại của nhiều yếu tố khác nhau. Do vậy việc đầu tiên là phải tạo điều kiện ổn định cho protein. Sự ổn định của protein phụ thuộc vào độ phân cực hay lực ion, pH, sự có mặt hay vắng mặt của ion kim loại, sự oxy hóa, protease nội bào và nhiệt độ. Thông dụng nhất là sử dụng giá trị pH sinh lý hoặc đệm Tris và phosphate. Các ion Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ thường làm tăng sự ổn định của protein, trong khi các ion kim loại nặng Ag  , Cu 2 , Pb 2 , Hg 2 thường làm biến tính protein, đặc biệt protein chứa nhóm -SH. Để tránh nhiễm bẩn bởi ion kim loại nặng, nên chuẩn bị đệm từ hóa chất sạch trong dụng cụ thủy tinh hoặc dùng tác nhân EDTA 10 -4 M bổ sung vào đệm. Để giảm thiểu tác động của quá trình oxy hóa (đặc biệt với các phân tử protein chứa nhóm –SH) cần bổ sung thêm mecaptoetanol, cystein và dithiotheitol 10-3 M vào đệm. 17 Để giảm thiểu tác động của protease nội bào cùng giải phóng cần bổ sung chất ức chế protease như phenyl metyl sufonyl florua. Tốt nhất là dịch thô được bảo quản ở nhiệt độ thấp. 2.3. Các phương pháp tủa protein Có 5 phương pháp lắng tủa protein: tủa bằng muối, lắng tủa bằng dung môi hữu cơ, lắng tủa điểm đẳng điện, lắng tủa bằng polyme không mang điện và lắng tủa bằng các chất đa điện phân. 2.3.1. Tủa bằng muối Sunfat ở các nồng độ khác nhau. Để tinh sạch protein ở mức độ phòng thí nghiệm, tủa bằng amonium sulfat thường được sử dụng bước đầu trong quy trính tách chiết và tinh sạch protein. Ở các nồng độ muối cao protein sẽ tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính. Khi cho thêm muối vào protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại. Khi đủ một lượng muối vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính. Sau đó thu tủa protein bằng cách ly tâm và hòa tan trở lại trong dung dịch đệm có nồng độ muối thấp. Dung dịch lúc này vẫn chứa nhiều muối còn lại trong tủa. Có nhiều phương pháp để rửa muối khỏi protein nhưng người ta thường loại muối bằng phương pháp thẩm tích hay phương pháp lọc gel. Dung dịch sau khi rửa sạch muối được giữ để sử dụng cho các quá trình tinh sạch và phân tích tiếp theo. 2.3.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ Các dung môi hữu cơ như: acetone, isopropanol, ethanol (được dùng nhiều nhất). Ưu điểm của phương pháp là cho kết quả tủa tốt hơn so với tủa bằng muối, không cần loại muối trước khi chạy sắc ký, cách tiến hành đơn giản. Nhưng khi tủa bằng dung môi hữu cơ phải thực hiện trong điều kiện lạnh vì nếu tủa ở nhiệt độ thường sẽ làm biến tính protein, lượng dung môi cần dùng tương đối nhiều. 18 2.3.3. Tủa bằng điểm đẳng điện Tại điểm đẳng điện, protein bị mất điện tích nên gây tủa. Phương pháp này cho kết quả rất cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ. 2.3.4. Tủa bằng các loại polyme Bao gồm: polyacrylic axit, polysaccarit, polyphotphat. Ưu điểm của phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễ thu hồi polyme, hiệu suất tạo kết tủa cao. Chi phí cho phương pháp này cao. 2.3.5. Tủa bằng chất đa điện phân Thường dùng polyetylen glycol có phân tử lượng 6.000 và 20.000. Có thể sử dụng với lượng chất này rất nhỏ, hiệu suất tạo kết tủa cao. Nhược điểm của phương pháp là rất đắt tiền và dễ gây biến tính protein. 2.4. Phương pháp tách chiết, tinh sạch protein Sau khi nhận được dịch tủa protein, công việc tiếp theo sẽ là chiết tách, tinh sạch để nhận được các phân đoạn protein khác nhau. 2.4.1. Mục tiêu Mục tiêu của quy trình tinh sạch là nhằm thu được một lượng protein tối đa dựa trên lượng hoạt tính thu được so với hoạt tính tổng của protein trong dịch chiết ban đầu. Hơn nữa sản phẩm protein nhận được cũng phải đạt hoạt tính tối đa, có nghĩa là protein không bị mất hoạt tính trong quá trình bảo quản, không bị phân giải, và độ tinh sạch cũng phải đạt tối đa, nghĩa là không có sự hiện diện của các protein hay các đại phân tử sinh học khác. Không có cách nào để dự đoán hoạt tính của một protein đã được tinh sạch trong một số điều kiện nhất định nào đó, vì vậy quá trình tinh sạch được tiến hành cho đến khi nào hoạt tính đặc hiệu của protein (Unit/mg) tăng đến một giá trị không đổi sau một vài công đoạn của quy trình tinh sạch. 19 2.4.2. Sơ đồ tinh sạch protein Sơ đồ chung cho quá trình tinh sạch protein có thể được biểu diễn như sau: Nguồn (nguyên liệu) a) Nghiền sơ bộ, tách các bào quan Nghiền b) Các bào quan Trích ly Phân tách bằng phương pháp ái lực hấp phụ Dịch chiết Quy trình tinh sạch (quy mô lớn) c) Enzyme tinh sạch Sản phẩm thô Tinh sạch (quy mô nhỏ) Sơ đồ 2.1. Quá trình tinh sạch protein Trong sơ đồ tổng quát này, quy trình tinh sạch cho một protein nào đó bao gồm: (a) Nguồn nguyên liệu, (b) Phương pháp nghiền, (c) Phương pháp tinh sạch. 20 2.4.2. Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein. Bảng 2.1. Các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein Đặc tính Phương pháp Kích thước hay khối  Ly tâm lượng  Sắc ký lọc gel  Thẩm tích, siêu ly tâm Độ phân cực (a) Điện tích  Sắc ký trao đổi ion  Sắc ký tập trung  Điện di  Điện di điểm đẳng điện (b) Tính kỵ nước  Sắc ký tương tác kỵ nước Tính tan  Thay đổi pH  Thay đổi lực ion  Thay đổi hằng số điện môi Tâm bám đặc hiệu  Sắc ký ái lực hấp phụ hay các tương tác  Sắc ký với ion kim loại cố định cấu trúc đặc hiệu trên giá thể  Giải ái lực hấp phụ  Sắc ký ái lực hấp phụ với các chất nhuộm màu.  Hấp phụ miễn dịch  Sắc ký đồng hóa trị Qui mô  Lớn và nhỏ  Nhỏ  Nhỏ         Lớn và nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Lớn Lớn và nhỏ Lớn 2.4.3. Sự lựa chọn phương pháp chiết tách và tinh sạch protein Sau khi đánh giá về những ưu và khuyết điểm của các phương pháp tinh sạch khác nhau, cần phải xác định một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các phương pháp tinh sạch và trình tự của các phương pháp này trong quy trình tinh sạch. Trong thực tế cần phải nhấn mạnh rằng rất ít khi chỉ cần một hay phối hợp của hai phương pháp mà có thể tinh sạch được protein. Quy trình tinh sạch cụ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố:  Qui mô và hiệu suất tinh sạch.  Thời gian cần thiết cho quá trình tinh sạch.  Trang thiết bị hiện có. Ngày nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thực sự có hiệu quả trong việc làm sạch protein. Do đó, việc làm sạch protein thật sự chỉ có hiệu quả khi ta 21 biết lựa chọn các phương pháp riêng kết hợp với nhau, tạo ra phương pháp nối tiếp nhau một cách hài hòa nhất. 2.4.4. Tinh sạch protein Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein còn có chất cao phân tử khác như polysaccharid, axit nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng,... Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký, điện di. Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh. Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động. Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử, sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử, sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất. Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein. Phương pháp chiết tách và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột. Trong trường hợp này, các phân đoạn protein được cho chạy qua cột nhồi bằng các hạt agarose hoặc polyacrylamit nhỏ được cải biến cho phù hợp. Có một số phương án khác nhau trong việc sử dụng cột tách chiết và tinh sạch protein. Các quy trình khác nhau được thiết lập có thể 22 khác nhau do đặc tính khác nhau của các loại protein. Ở đây mô tả một số phương pháp, trong các phương pháp này, protein được phân lập dựa vào kích thước và tính tích điện của chúng. 2.4.4.1. Sắc ký trao đổi ion - - - - - -+ ++ + + + -+ + + -+ +- + + ++ + + + +-+ + - + + +- +- + + + + + + ++ + + + + ++ + + + + ++ + + + - + ++ + + + + ++ + + + + + +- ++ + + ++ + + + - + ++ + + + + + -+ + + + + ++ + + + - + ++ + + + + ++ + + + + ++ + + + - Caân baèng Naïp maãu Haáp thu maãu - - + ++ + + + + ++ + + + -+ ++ + + + -+ + + -+ +- + + ++ + + + ++ - + + + + - +- + + + + + - - Taùch, röûa Taùi taïo coät Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân lập dựa trên điện tích ion hóa bề mặt của chúng bằng việc sử dụng các vật liệu làm cột là các hạt mang các nhóm chức tích điện âm hoặc dương (đây còn được gọi là pha tĩnh). Các phân tử protein tương tác yếu với các hạt (chẳng hạn như một phân tử protein tích điện dương được cho chạy qua cột mang các hạt tích điện âm) sẽ được hồi lưu khi sử dụng một dung dịch muối loãng chảy qua cột sau đó (dung dịch chạy mẫu được gọi là pha động). Các phân tử tương tác với pha động càng mạnh, càng cần dung dịch hàm lượng muối cao để hồi lưu mẫu (bởi muối làm "trung hòa" các vùng mang điện tích) và vì vậy cho phép các phân tử protein được giải phóng khỏi cột. Bằng việc tăng dần nồng độ muối trong các dung dịch đệm thu hồi mẫu, các phân tử protein khác nhau, kể cả các phân tử có đặc tính tích điện gần giống nhau cũng được phân tách thành các phân đoạn khác nhau khi chúng được hồi lưu từ cột. 23 2.4.4.1.1. Kỹ thuật trong sắc ký trao đổi ion  Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột - Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột. - Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra những bọt khí nằm giữa các hạt nhựa. - Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống. - Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân bằng cột bằng cách cho dung dịch đệm chảy qua cột, cuối cùng kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột.  Nạp mẫu chất lên đầu cột - Dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp vào cột, lọc bằng tờ giấy lọc hay ngang qua một lớp celite. - Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa. Điều quan trọng nhất là làm sao để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất được hấp thu hết vào nhựa, tức là chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu. - Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại, dùng pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột. - Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa 2.4.4.2. Sắc ký lọc gel Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cơ sở đặc điểm khác nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước. Khác với trong kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, các hạt được sử dụng để nhồi cột trong kỹ thuật này không mang các nhóm tích điện mà thay vào đó là mang các lỗ có kích thước khác nhau. Các phân tử protein càng nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất cả các lỗ; vì vậy, thời gian chạy qua cột dài hơn và thời gian hồi lưu muộn hơn. Ngược lại, các phân tử protein kích thước càng lớn càng có thời gian hồi lưu (chạy qua toàn bộ cột) sớm hơn. 24 Đối với mỗi loại cột, các phân đoạn sắc ký được thu ở các nồng độ muối khác nhau hoặc ở các thời gian hồi lưu khác nhau để thu được từng loại protein được quan tâm nghiên cứu. Các phân đoạn có hoạt tính protein được quan tâm cao nhất sẽ được tích lũy và tiến hành tinh sạch bổ sung. Độ tinh sạch của sản phẩm protein sẽ tăng lên khi các phân đoạn protein được chạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau. Thông thường một cột sắc ký đơn lẻ không đủ để tinh sạch được một loại phân tử protein mong muốn nào đó dù quá trình sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, thay vào đó người ta thường phải áp dụng một chuỗi các bước kỹ thuật để có thể thu được một phân đoạn chứa một lượng lớn loại protein cần quan tâm nghiên cứu. Chẳng hạn như, có rất nhiều phân tử protein được hồi lưu trong dung dịch muối đậm đặc từ cột tích điện dương (đối với protein tích điện âm) hoặc được hồi lưu trong sắc ký lọc gel (đối với các protein kích thước tương đối nhỏ), các kỹ thuật này đơn lẻ thường không đủ để thu được một sản phẩm protein được tinh sạch hoàn toàn. 2.4.4.2.1. Kỹ thuật tách chiết bằng phương pháp sắc ký lọc gel  Chọn lựa và chuẩn bị gel  Chọn lựa gel Chủ yếu người ta sử dụng gel trong 2 trường hợp: Loại bỏ phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (thí dụ là quá trình loại muối (desalting) ra khỏi dịch chứa protein và nucleic axit. Cỡ hạt hay sử dụng 100-200 mesh (10-40 m) hay 200-400 mesh (20-80 m). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện lại rất dài.  Chuẩn bị gel và bảo quản 25 Gel dextran và acrylamit thương mại ở dạng bột không ngậm nước do vậy phải cho chúng ngậm nước (cho nở) trước khi sử dụng. Quá trình này thường khoảng 3-4 giờ ở 20ºC đối với loại gel có liên kết nhiều, riêng P-300 và G-200 nên kéo dài thời gian trên tới khoảng 72 giờ (3 ngày đêm). Có thể rút ngắn thời gian nở trong nước ở nhiệt độ cao (có thể đun). Gel agarose và gel polyacrylamide agarose thương mại ở dạng ngậm nước, do vậy không cần cho nở. Trước khi nhồi gel mới vào cột phải loại bỏ những hạt siêu mịn bằng cách lắng – nghiêng (2-3 lần là đủ) và loại bọt khí bằng cách vừa khuấy vừa hút khí (bơm nước) trong khoảng 1-2 giờ. Sau đó bổ sung chất bảo quản natri azua (0,02%)  Dựng cột và chuẩn bị mẫu  Dựng cột lọc gel Để tách phân đoạn, tốt nhất nên sử dụng cột dài hơn 100 cm có tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng nằm trong khoảng từ 25-100cm. Để tách nhóm chất chỉ cần sử dụng cột dài khoảng 50 cm với tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng trong khoảng 510cm. Đối với gel dextran và polyacrylamide sử dụng đệm có pH từ 1,0-10,0, trong khi gel agarose chỉ ổn định trong khoảng pH 10,0 và pH chọn lựa phải đảm bảo không làm mất hoạt tính của chất cần tách.  Chuẩn bị mẫu Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng. Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10-25% tổng thể tích cột. Để phân tích chỉ được phép đưa một lượng mẫu nhỏ vào cột 1-5% tổng thể tích cột ( là thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi). Tốc độ dòng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do. Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm 2 mặt cắt ngang (15-25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/ cm 2 (5-10 ml/h). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén. Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải 26 dùng bơm nén. Thông thường là nén theo chiều trong lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngược từ dưới lên. 2.4.4.2.2. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel  Loại muối.  Tinh sạch phân tử sinh học.  Xác định trọng lượng phân tử. Như đã trình bày ở trên, gel chỉ thích hợp để tách các chất sinh học có tính ưa nước trong dung dịch nước. Tuy nhiên đôi khi cũng sử dụng phương pháp này để tách các chất kỵ nước trong dung môi hữu cơ (etanol, axeton, dimetyl sulfoxide, dimetyl forenemide, axetonitrile,v.v…). 2.4.4.2.3. Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel  Ưu điểm Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehyđroclorit, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37ºC hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối.  Nhược điểm - Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài) - Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu. - Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ. 27 2.4.4.3. Sắc ký ái lực hỗ trợ quá trình tinh chế protein Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt. Các đặc tính đặc trưng của từng loại protein có thể được tận dụng để giúp tinh sạch loại protein tương ứng được thuận tiện và hiệu quả hơn. Giả sử, nếu chúng ta biết một loại protein khi hoạt động liên kết đặc hiệu với ATP, thì có thể dùng cột sắc ký mang vật liệu gắn kết ATP để phân tách protein đó. Chỉ có protein liên kết với ATP mới được cột giữ lại, và cho phép hầu hết các loại protein không liên kết với ATP được chảy trôi qua cột. Kỹ thuật tinh sạch này được gọi là sắc ký ái lực. Có nhiều hợp chất khác nhau có thể được sử dụng để gắn kết với cột và giúp quá trình tinh sạch protein dễ dàng và hiệu quả hơn. Các hợp chất này bao gồm cả các trình tự ADN (để tinh sạch protein liên kết ADN) hoặc thậm chí là một loại protein để tinh sạch một loại protein khác được biết hoặc được mong đợi có tương tác phân tử với loại protein trên. Như vậy, để bắt đầu tinh sạch một loại protein nào đó, cần phải có những hiểu biết cơ bản về loại protein đó và tìm cách khai thác, ứng dụng các đặc tính có nó cho quá trình tách chiết và tinh sạch. Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là sắc ký ái lực miễn dịch. Trong phương pháp này, người ta gắn kháng thể đặc hiệu với protein đích lên vật liệu làm cột sắc ký. Trong trường hợp lý tưởng, loại kháng thể này chỉ liên kết đúng với loại protein cần quan tâm còn cho phép tất cả các loại protein khác chảy trôi qua cột. Loại protein liên kết sau đó sẽ được thu hồi (hồi lưu) bằng cách sử dụng dung dịch muối hoặc đôi khi là các dung dịch chất tẩy nhẹ chảy qua cột. Khó khăn cơ bản gặp phải đối với phương pháp này là đôi khi liên kết giữa kháng thể và protein khá bền vững đến mức phải gây biến tính protein mới thu hồi được sản phẩm. Khác với ADN, protein sau khi biến tính thường không có khả năng hồi tính, vì vậy protein thu được theo cách này nhiều khi ở dạng không hoạt động chức năng và mất đi giá trị sử dụng trong nghiên cứu. 28 2.4.4.4. Phương pháp điện di trên Gel SDS-PAGE Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di. Điện di là một kĩ thuật để phân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích. Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamit) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử. 29 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỌC GEL 3.1. Phương pháp trích ly enzyme Emzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, để phá vỡ tế bào enzyme thường sử dụng các phương pháp như: Phương pháp cơ học: Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa… Phương pháp vật lý trong tế bào: Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào. Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm. Phương pháp hóa học: dùng các loại dung môi, butylic, axeton, glyxerol, etylaxetat.  Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease - Tỷ lệ dung môi với mẫu: mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau, ngoài protein của enzyme còn có các thành phần enzyme khác, đặc biệt là hàm lượng lipit nhiều, ảnh hưởng đến quá trình trích ly, sử dụng dung môi ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích ly được những protein - protease ra ngoài mô nhiều hơn. - Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết protease động vật rất dễ biến tính hay giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ, hay bị phân hủy. Thường nhiệt độ trích ly protease từ mô động vật ở nhiệt độ không quá 5ºC. - Thời gian trích ly: đối với protease từ nguồn động vật dễ bị phân hủy vì hoạt tính protease mạnh và có sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác có trong mô mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hòa tan của enzyme từ mô tế bào mẫu. Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi. - pH là yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình trích ly, có những enzyme axit cần phải trích ly ở môi trường axit và ngược lại các enzyme kiềm thì phải trích ly trong môi trường bazơ. 30 3.2. Phương pháp làm sạch enzyme Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp sau: 3.2.1. Phương pháp gây biến tính chọn lọc Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme axit và bền nhiệt. Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70ºC và pH ≤ 5. Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn. 3.2.2. Phương pháp kết tủa phân đoạn Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thường sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, còn có thể sử dụng một số dung môi hữu cơ như etanol, axeton để kết tủa protein. Dựa vào đặc tính phân cực của protein để lựa chọn các phương pháp như:  Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography).  Sắc ký giấy.  Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography).  Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC). Dựa vào kính thước protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography). 31 3.3. Phương pháp tách chiết enzyme protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel 3.3.1. Chọn lựa và chuẩn bị gel 3.3.1.1. Chọn lựa gel Chủ yếu người ta sử dụng gel trong 2 trường hợp: Loại bỏ phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (thí dụ là quá trình loại muối (desalting) ra khỏi dịch chứa protein và axit nucleic. Cỡ hạt hay sử dụng 100-200 mesh (10-40 m) hay 200 - 400 mesh (20-80 m). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện lại rất dài. 3.3.1.2. Chuẩn bị gel và bảo quản Gel dextran và acrylamit thương mại ở dạng bột không ngậm nước do vậy phải cho chúng ngậm nước (cho nở) trước khi sử dụng. Quá trình này thường khoảng 3-4 giờ ở 20ºC đối với loại gel có liên kết nhiều, riêng P-300 và G-200 nên kéo dài thời gian trên tới khoảng 72 giờ (3 ngày đêm). Có thể rút ngắn thời gian nở trong nước ở nhiệt độ cao (có thể đun). Gel agarose và gel polyacrylamide agarose thương mại ở dạng ngậm nước, do vậy không cần cho nở. Trước khi nhồi gel mới vào cột phải loại bỏ những hạt siêu mịn bằng cách lắng – nghiêng (2-3 lần là đủ) và loại bọt khí bằng cách vừa khuấy vừa hút khí (bơm nước) trong khoảng 1-2 giờ. Sau đó bổ sung chất bảo quản sodium aride (0,02%). 3.3.2. Dựng cột và chuẩn bị mẫu 3.3.2.1. Dựng cột lọc gel Để tách phân đoạn, tốt nhất nên sử dụng cột dài hơn 100 cm có tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng nằm trong khoảng từ 25-100. Để tách nhóm chất chỉ cần sử dụng cột dài khoảng 50 cm với tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng trong khoảng 5-10. Đối với gel dextran và polyacrylamide sử dụng đệm có pH từ 1,0-10,0, trong khi gel agarose chỉ ổn định trong khoảng pH 10,0 và pH chọn lựa phải đảm bảo không làm mất hoạt tính của chất cần tách. 32 3.3.2.2. Chuẩn bị mẫu Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng. Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10-25% tổng thể tích cột. Để phân tích chỉ được phép đưa một lượng mẫu nhỏ vào cột 1-5% tổng thể tích cột ( là thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi). Tốc độ dòng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do. Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm 2 mặt cắt ngang (15-25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/ cm 2 (5-10 ml/h). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén. Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén. Thông thường là nén theo chiều trong lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngược từ dưới lên. 3.4. Phương pháp tinh sạch 3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú Xay đầu tôm trên cối xay thịt, nghiền nhuyễn bằng cối inox với cát thạch anh đã xử lý và làm sạch. Nội tạng chỉ nghiền. Dùng dung môi (nước cất, dung dịch muối sinh lý, đệm phosphate, đệm Tris-HCl) với các tỷ lệ khác nhau, khuấy đảo liên tục ở điều kiện nhiệt độ 0 - 4ºC trong 40 phút để chiết rút enzyme, ly tâm lạnh ở 4ºC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết (DC). Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi và loại dung môi chiết với mẫu. Từ đó chọn dung môi và tỷ lệ thích hợp chiết enzyme. 3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease Sử dụng các tác nhân gây kết tủa thuận nghịch protein trong dịch chiết nội tạng và đầu tôm là: cồn 96º, axeton và muối amoni sunfat. Tiến hành tủa dịch chiết bằng các tác nhân trên với tỷ lệ dịch chiết/dung môi khác nhau ở điều kiện 0 – 4ºC, thời gian tủa 60 phút, ly tâm lạnh ở 4ºC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút – thu cặn là chế phẩm enzyme thô (CPT). 33 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tủa và tác nhân tủa từ đó chọn ra tác nhân và nồng độ thích hợp để tủa dịch chiết thu protease. 3.4.3. Bố trí thí nghiệm Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt động của protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm sú được tiến hành theo sơ đồ bố trí như sau: 34 Tôm sú (đầu hoặc nội tạng) Nghiền mịn Chiết dịch enzyme thô Ly tâm dịch chiết enzyme thô Dịch chiết enzyme thô (DC) Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein Tủa dịch chiết Ly tâm thu chế phẩm thô Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein Chế phẩm thô (CPT) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme CPT: nhiệt độ, pH, % muối ăn. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE Sơ đồ 3.1. Quy trình tách chiết enzyme protease 35 3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp Dung môi chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành chiết tách protease từ mẫu nội tạng và đầu tôm sú bằng các dung môi: nước cất, muối sinh lý, đệm photphat 0,1M pH 7,0 và đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 cùng với các tỷ lệ khối lượng mẫu/dung môi (w/v) khác nhau, được giữ ở ≤ 4ºC bằng đá vụn, khuấy liên tục trên mấy khuấy từ trong 40 phút. Ly tâm lạnh ở 4ºC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết. Nước cất: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5. Nước muối sinh lý: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5. Đệm photphat 0,1M pH 7,0: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10. Đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10. Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng dịch chiết, so sánh, chọn ra tỷ lệ chiết thích hợp và loại dung môi chiết thích hợp. Sơ đồ bố trí TN như sau: Sơ đồ 3.2 Nội tạng và đầu tôm sú (đã nghiền) Hòa với các dung môi Nước cất Tỷ lệ 1/1-5 Muối sinh lý Tỷ lệ 1/1-5(w/v) Đệm photphat Tỷ lệ 1/1-10 (w/v) Xác định hoạt tính proetease của DC Xác định hàm lượng protein của DC Chọn ra dung môi và tỷ lệ chiết thích hợp 36 Tris-HCl Tỷ lệ 1/1-10 3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa protein-enzyme ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết tủa. Tiến hành tủa protein-enzyme từ DC bằng các tác nhân với các nồng độ trong thời gian 60 phút, ở nhiệt độ ≤ 4ºC. Ly tâm lạnh 4ºC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút thu cặn tủa (DCT). Hòa CPT với dung dịch đệ m phosphate 0,1 M pH 7,0 được đưa về cùng thể tích nhất định (một lượng ít nhất có thể). Tủa bằng etanol (cồn 96º) được làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/cồn (v/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8. Tủa bằng axeton được làm lạnh, nồng độ tủa theo nồng độ phần trăm (%):50; 55; 60; 65; 70; 75. Tủa bằng muối (NH4)2SO4, nồng độ tủa theo nồng độ muối bão hòa (%): 50; 55; 60; 65; 70; 75. Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng CPT, so sánh, chọn ra nồng độ tủa thích hợp và loại tác nhân tủa thích hợp. Sơ đồ 3.2: Dịch chiết enzym từ nội tạng và đầu tôm sú (đã nghiền) Kết tủa bằng các tác nhân với nồng độ tủa khác nhau Cồn 96º Tỷ lệ 1/1-8 (v/v) Axeton Nồng độ 50-75% (NH4)2SO4 Nồng độ 50-75% Xác định hoạt tính protease của CPT Xác định hàm lượng protein của CPT Chọn ra tác nhân và nồng độ tủa thích hợp 37 3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel Tách các protein của protease trong CPT mẫu đầu và mẫu nội tạng của tác nhân tủa cồn, axeton và tủa muối (NH4)2SO4 với nồng độ thích hợp bằng phương pháp sắc ký lọc gel áp suất thấp.  Các thông số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp sau: Gel : Bio-Gel P-100 (Giới hạn phân tách 5.000 – 100.000 Da). Cột : 30 x 1,5 cm Flow adaptor (bộ chuyển đổi dòng chạy) : 1,5 cm. Tốc độ dòng : 0,14 ml/phút. Vmẫu : 1ml. Phân đoạn : 2 ml/phân đoạn. A280 : Độ hấp thụ protein ở bước sóng 280 nm. 3.4.4.1. Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel Cân 4g gel Bio-Gel P100, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm photphat 0.1M pH 7.0 đựng trong cốc. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định 12 giờ và 20ºC trong suốt quá trình hyđrat hóa. Sau khi quá trình hyđrat xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng 10-15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình. Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel. Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 đến 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel (packed). Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với 38 thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách dùng xylanh bơm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. Chuẩn bị mẫu: mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn); hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột. Dùng xylanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký, dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector trong hệ thống sắc ký và được thể hiện độ hấp thu dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mền LP-Data View trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml. Thu các fraction chứa dịch protease đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano, pH 7.0 và hàm lượng protein theo phương pháp Bradford. 3.4.5. Thí nghiệm điện di enzyme protease sau tinh sạch Hình 3.1. Thiết bị điện di đứng SDS-PAGE 39 3.4.5.1. Chuẩn bị hộp điện di Khuôn kính để đổ gel, lược cài và hộp điện di phải được rửa sạch và lau khô bằng cồn. Sau đó ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel.  Đổ gel phân tích : Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 10% Dung dịch được trộn bằng máy khuấy từ, sau đó cho 4 μl TEMED vào dung dịch, khuấy đều và nhanh chóng dùng pipette 1000 ml cho vào khung kiếng đổ gel. Gel sẽ được bơm đến vạch cách lược là 0,5 cm. Chú ý không bơm quá nhanh sẽ tạo bọt trong gel. Cẩn thận bơm tiếp một lớp nước cất lên trên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng. Gel sẽ đông lại trong 20-30 phút.  Đổ gel tập trung Gel tập trung thường được pha ở nồng độ 4%. Khuấy đều dung dịch trên máy khuấy từ. Trước khi đổ gel tập trung, ta phải đổ bỏ phần nước phía trên gel phân tích bằng cách nghiêng và dùng giấy thấm. Tương tự gel phân tích, sau khi cho 4 μl TEMED vào, dung dịch phải được đưa nhanh vào khung đổ gel. Dùng giấy thấm để loại hết nước trên bề mặt gel phân tích. Cho gel tập trung vào, đưa lược vào lớp gel. Chú ý, lược được đưa vào cẩn thận để tránh tạo lớp bọt dưới phía chân lược. Gel tập trung sẽ đông tụ lại khoảng sau 20 phút. Đánh dấu lại các vị trí lỗ giếng. 3.4.5.2. Chuẩn bị mẫu protein Pha mẫu tỷ lệ 1:1. Cho vào ống eppendorf 100 μl mẫu protein và 100 μl dung dịch chuẩn bị mẫu như trên. Trong thí nghiệm này các mẫu protein lấy từ dịch protein sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. Lắc đều và đun cách thủy ở 95ºC, 5 phút, để nguội. 3.4.5.3. Đưa mẫu vào các giếng Sau khi gel tập trung đông, lắp bộ khung đổ gel vào khung chạy điện di. Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dưới và bên trên bộ điện di, cẩn thận lấy lược ra và cho mẫu vào các giếng. Lượng mẫu là 10 μl đưa vào các lỗ giếng. 40 Chú ý không để mẫu tràn qua các giếng bên cạnh, ghi chép lại vị trí các mẫu đưa vào giếng. - Chạy điện di: Sau khi hoàn tất việc đưa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại và cho dòng điện đi qua. Dòng điện chạy điện di là 25 mA / 80 V. Thông thường, thời gian để chạy điện di là 3 giờ. Ta có thể quan sát quá trình dịch chuyển của protein nhờ vào dải băng màu xanh của Bromophenol Blue R-250. - Nhuộm gel: Gel được lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch nhuộm đã pha. Để làm nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ được đặt trên máy lắc. Thông thường thời gian nhuộm khoảng 1 giờ. - Tẩy màu: Tẩy gel bằng dung dịch tẩy, ngâm gel trong dung dịch tẩy và đặt trên máy lắc 2 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel đã sạch lớp màu nền và các băng protein hiện rõ trên gel. Sau đó phân tích kết quả, chụp hình gel. 41 KẾT LUẬN Hiện nay việc tách chiết và tinh sạch protit đang gặp nhiều khó khăn, do đó con người đang hướng tới những phương pháp tách chiết đơn giản và hiệu quả hơn. Vì thế việc nghiên cứu tìm hiểu các phương pháp tách chiết protit để phục vụ cho con người là một việc làm hữu ích đối với các ngành công nghệ sản xuất enzyme đem lại lợi ích và góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của con người. Sau một thời gian tìm tòi và nghiên cứu về đề tài “Nghiên cứu lí thuyết về phương pháp tách chiết hợp chất protit” thì em đã thu được một số kết quả sau: Khái quát sơ lược về protit: khái niệm, phân loại, cấu trúc và tính chất. Tìm hiểu và đưa ra một số phương pháp tách chiết hợp chất protit. Đưa ra được phương pháp và sơ đồ tách chiết enzym protease từ nội tạng và đầu tôm sú. Do điều kiện về thời gian cũng như năng lực nghiên cứu của bản thân còn hạn chế nên em chỉ tìm hiểu và đưa ra được một số phương pháp tách chiết protit, nếu có điều kiện thì em sẽ phát triển đề tài của mình hơn ở phần thực nghiệm. Chính vì vậy trong bài khóa luận của em không thể tránh khỏi những thiếu sót. Bản thân em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trịnh Đình Chính- Nguyễn thị Bích Tuyết, 2008. Giáo trình Hợp chất tự nhiên, ĐH Sư phạm. 2. GS. Nguyễn Văn Đàn, DS. Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học TPHCM. 3. Lê Văn Đăng, 2005. Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TPHCM. 4. Nguyễn Văn Nam, 2007. Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú, Luận văn tốt nghiệp ngành công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 5. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP HCM. 6. Kurt Ranredath, 1974. Sắc ký lớp mỏng, NXB Y học. 7. PGS. TS. Đỗ Đình Rãng, 2012. Hóa học hữu cơ 3, NXB Giáo dục Hà Nội. 8. Phạm Trương Thị Thọ, 1997. Giáo trình Hóa học các hợp chất tự nhiên. 9. PGS. TS. Thái Doãn Tĩnh, 2008. Cơ sở Hóa học hữu cơ 3, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 43 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 2 4. Nhiệm vụ nghiên cứu ...................................................................................... 2 5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 2 6. Đóng góp của khóa luận .................................................................................. 3 NỘI DUNG ......................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN SƠ LƯỢC VỀ PROTIT ......................................... 4 1.1. Giới thiệu về protit ....................................................................................... 4 1.2. Phân loại protit ............................................................................................. 4 1.2.1. Protein ....................................................................................................... 4 1.2.1.1. Protein tan trong nước ............................................................................ 4 1.2.1.2. Protein không tan trong nước .................................................................. 5 1.2.2. Proteit ........................................................................................................ 7 1.3. Cấu trúc của protit ........................................................................................ 7 1.3.1. Cấu trúc bậc nhất ....................................................................................... 8 1.3.2. Cấu trúc bậc hai ......................................................................................... 9 1.3.2.1. Cấu trúc vòng xoắn α ............................................................................ 10 1.2.3.2. Cấu trúc nếp gấp β ................................................................................ 10 1.3.3. Cấu trúc bậc ba ........................................................................................ 11 1.3.4. Cấu trúc bậc bốn ...................................................................................... 12 1.4. Tính chất của protit ..................................................................................... 13 1.4.1. Tính chất lưỡng tính ................................................................................ 13 1.4.2. Phản ứng màu .......................................................................................... 13 1.4.3. Tính tan ................................................................................................... 14 1.4.4. Sự biến tính của protit ............................................................................. 14 1.4.5. Sự kết tủa protit ....................................................................................... 15 1.4.6. Hoạt tính sinh lý ...................................................................................... 16 44 CHƯƠNG 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG QUÁ TRÌNH TINH SẠCH PROTEIN.......................................................................................................... 17 2.1. Chuẩn bị dịch protein thô ........................................................................... 17 2.2. Ổn định protein trong dịch chiết thô ........................................................... 17 2.3. Các phương pháp tủa protein ...................................................................... 18 2.3.1. Tủa bằng muối Sunfat ở các nồng độ khác nhau. ..................................... 18 2.3.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ ...................................................................... 18 2.3.3. Tủa bằng điểm đẳng điện ......................................................................... 19 2.3.4. Tủa bằng các loại polyme ........................................................................ 19 2.3.5. Tủa bằng chất đa điện phân ..................................................................... 19 2.4. Phương pháp tách chiết, tinh sạch protein ................................................... 19 2.4.1. Mục tiêu .................................................................................................. 19 2.4.2. Sơ đồ tinh sạch protein ............................................................................ 20 2.4.2. Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein. .... 21 2.4.3. Sự lựa chọn phương pháp chiết tách và tinh sạch protein ......................... 21 2.4.4. Tinh sạch protein ..................................................................................... 22 2.4.4.1. Sắc ký trao đổi ion ................................................................................ 23 2.4.4.1.1. Kỹ thuật trong sắc ký trao đổi ion ...................................................... 24 2.4.4.2. Sắc ký lọc gel ....................................................................................... 24 2.4.4.2.1. Kỹ thuật tách chiết bằng phương pháp sắc ký lọc gel ......................... 25 2.4.4.2.2. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel ........................................ 27 2.4.4.2.3. Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel ................................................. 27 2.4.4.3. Sắc ký ái lực hỗ trợ quá trình tinh chế protein ....................................... 28 2.4.4.4. Phương pháp điện di trên Gel SDS-PAGE ............................................ 29 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ ............................................. 30 3.1. Phương pháp trích ly enzyme ..................................................................... 30 3.2. Phương pháp làm sạch enzyme ................................................................... 31 3.2.1. Phương pháp gây biến tính chọn lọc ........................................................ 31 3.2.2. Phương pháp kết tủa phân đoạn ............................................................... 31 45 3.3. Phương pháp tách chiết enzyme protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel ... 32 3.3.1. Chọn lựa và chuẩn bị gel ......................................................................... 32 3.3.1.1. Chọn lựa gel ......................................................................................... 32 3.3.1.2. Chuẩn bị gel và bảo quản ...................................................................... 32 3.3.2. Dựng cột và chuẩn bị mẫu ....................................................................... 32 3.3.2.1. Dựng cột lọc gel ................................................................................... 32 3.3.2.2. Chuẩn bị mẫu ....................................................................................... 33 3.4. Phương pháp tinh sạch................................................................................ 33 3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú .......................... 33 3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease.................................................................... 33 3.4.3. Bố trí thí nghiệm...................................................................................... 34 3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp ....................................................................................................... 36 3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC ................. 37 3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel ..................................................... 38 3.4.4.1. Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel ................ 38 3.4.5. Thí nghiệm điện di enzyme protease sau tinh sạch .................................. 39 3.4.5.1. Chuẩn bị hộp điện di ............................................................................. 40 3.4.5.2. Chuẩn bị mẫu protein ........................................................................... 40 3.4.5.3. Đưa mẫu vào các giếng ......................................................................... 40 KẾT LUẬN ....................................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 43 46 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT EDTA : Etilen Điamin TetraAxetic ATP: Adenosin TriPhotphat ADN: Axit Deoxyribonucleic ARN: Axit Ribonucleic SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis. HIC: Hyđrophobic Interaction Chromatography DC: dịch chiết CPT: chế phẩm thô TN: thí nghiêm DCT: dịch chiết thô TEMED: N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine 47 DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Hình Trang Hình 1.1. Cấu trúc không gian của protein ......... Error! Bookmark not defined. Hình 1.2. Cấu trúc bậc 2 của protein .................. Error! Bookmark not defined. Hình 1.3. Cấu trúc vòng xoắn α .......................... Error! Bookmark not defined. Hình 1.4. Cấu trúc nếp gấp β .............................. Error! Bookmark not defined. Hình 1.5. Cấu trúc bậc ba của protein ................. Error! Bookmark not defined. Hình 1.6. Cấu trúc bậc bốn của protein ............... Error! Bookmark not defined. Hình 3.1. Thiết bị điện di đứng SDS-PAGE ....... Error! Bookmark not defined. Bảng Bảng 2.1. Các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch proteinError! Bookmark not Sơ đồ Sơ đồ 2.1. Quá trình tinh sạch protein ................ Error! Bookmark not defined. Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết bằng phương pháp sắc ký trao đổi ionError! Bookmark no Sơ đồ 3.1. Quy trình tách chiết enzyme protease Error! Bookmark not defined. Sơ đồ 3.2. Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng DCError! Bookmar Sơ đồ 3.2. Xác định tác nhân tủa ........................ Error! Bookmark not defined. 48 [...]... các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của mơi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung mơi hữu cơ, các phương pháp sắc ký, điện di Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và... các phương pháp riêng kết hợp với nhau, tạo ra phương pháp nối tiếp nhau một cách hài hòa nhất 2.4.4 Tinh sạch protein Trong dịch chiết thơ thu được ngồi protein còn có chất cao phân tử khác như polysaccharid, axit nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khống, Để loại bỏ muối khống và các loại đường là các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp. .. các chất nhuộm màu  Hấp phụ miễn dịch  Sắc ký đồng hóa trị Qui mơ  Lớn và nhỏ  Nhỏ  Nhỏ         Lớn và nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Nhỏ Lớn Lớn và nhỏ Lớn 2.4.3 Sự lựa chọn phương pháp chiết tách và tinh sạch protein Sau khi đánh giá về những ưu và khuyết điểm của các phương pháp tinh sạch khác nhau, cần phải xác định một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các phương pháp tinh sạch và trình tự của các phương. .. enzyme thường sử dụng các phương pháp như: Phương pháp cơ học: Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa… Phương pháp vật lý trong tế bào: Các enzyme này thường khơng có khả năng di chuyển qua màng tế bào Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm Phương pháp hóa học: dùng các... kiềm thì phải trích ly trong mơi trường bazơ 30 3.2 Phương pháp làm sạch enzyme Để loại bỏ những thành phần khơng phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp sau: 3.2.1 Phương pháp gây biến tính chọn lọc Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme axit và bền nhiệt Người ta đưa nhiệt... tách các bào quan Nghiền b) Các bào quan Trích ly Phân tách bằng phương pháp ái lực hấp phụ Dịch chiết Quy trình tinh sạch (quy mơ lớn) c) Enzyme tinh sạch Sản phẩm thơ Tinh sạch (quy mơ nhỏ) Sơ đồ 2.1 Q trình tinh sạch protein Trong sơ đồ tổng qt này, quy trình tinh sạch cho một protein nào đó bao gồm: (a) Nguồn ngun liệu, (b) Phương pháp nghiền, (c) Phương pháp tinh sạch 20 2.4.2 Giới thiệu các phương. .. tích nên gây tủa Phương pháp này cho kết quả rất cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung mơi hữu cơ 2.3.4 Tủa bằng các loại polyme Bao gồm: polyacrylic axit, polysaccarit, polyphotphat Ưu điểm của phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễ thu hồi polyme, hiệu suất tạo kết tủa cao Chi phí cho phương pháp này cao 2.3.5 Tủa bằng chất đa điện... giải cao nhờ vào áp suất Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein Phương pháp chiết tách và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột Trong trường hợp này, các phân đoạn protein được cho chạy qua cột nhồi bằng các hạt agarose hoặc polyacrylamit nhỏ được cải biến cho phù hợp Có một số phương án khác nhau trong việc sử dụng cột tách chiết và tinh sạch protein Các quy trình khác nhau được thiết lập... tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử 29 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TƠM SÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỌC GEL 3.1 Phương pháp trích ly... bốn) Hình 1.6 Cấu trúc bậc bốn của protein 12 1.4 Tính chất của protit 1.4.1 Tính chất lưỡng tính Do thành phần protit là các phân tử axit amin, mà axit amin là chất lưỡng tính nên protit cũng là phân tử lưỡng tính, có điểm đẳng điện đặc trưng cho từng loại protit Nói chung, điểm đẳng điện nằm trong vùng axit pH = 4,6 - 6,3 Đặc tính của protit là tính chất của dung dịch đệm Ngồi ra, do trong thành phần ... thể: - Nghiên cứu tài liệu, giáo trình liên quan đến phương pháp tách chiết protit - Nghiên cứu ví dụ cho phương pháp tách chiết, tinh protit Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu lí... nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Cơ sở lí thuyết, phương pháp tách chiết protit - Phạm vi nghiên cứu: Các phương pháp tách chiết protit Nhiệm vụ nghiên cứu Trong khóa luận nhiệm vụ nghiên cứu. .. đề tài: "Nghiên cứu lý thuyết phương pháp tách chiết hợp chất protit" Mục tiêu nghiên cứu - Tìm hiểu protit, cấu tạo, tính chất phân loại protit - Các phương pháp tách chiết, tinh protit Đối