Đang tải... (xem toàn văn)
Vi sinh vật bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước hiển vi, không thấy rõ được bằng mắt thường mà phải sử dụng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi điện tử để quan sát. Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật... Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinhđịahoá học (biogeochemical cycles) như vòng tuần hoàn C, vòng tuần hoàn n, vòng tuần hoàn P, vòng tuần hoàn S, vòng tuần hoàn Fe... Trong nước, vi sinh vật có nhiều ở vùng duyên hải, vùng nước nông và ngay cả ở vùng nước sâu, vùng đáy ao hồ. Trong không khí, càng lên cao số lượng vi sinh vật càng ít. Số lượng vi sinh vật trong không khí ở các khu dân cư đông đúc cao hơn rất nhiều so với không khí trên mặt biển và nhất là trong không khí ở Bắc cực, Nam cực... Hầu như không có hợp chất carbon nào (trừ kim cương, đá graphít...) mà không là thức ăn của những nhóm vi sinh vật nào đó (kể cả dầu mỏ, khí thiên nhiên, formol. dioxin...). Vi sinh vật có rất phong phú các kiểu dinh dưỡng khác nhau : quang tự dưỡng (photoautotrophy), quang dị dưỡng (photoheterotrophy), hoá tự dưỡng (chemoautotrophy), hoá dị dưỡng (chemoheterotrophy).tự dưỡng chất sinh trưởng (auxoautotroph), dị dưỡng chất sinh trưởng (auxoheterotroph)... Chính vì sự phong phú và đa dạng như vậy nên việc tìm hiểu, nghiên cứu sự có mặt và số lượng của chúng cũng như cấu trúc và chức năng và sự phân bố của chúng là vấn đề vô cùng quan trọng. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp định lượng vi sinh vật trong hệ sinh thái bao gồm các phương pháp truyền thống và các phương pháp hiện đại. Chính vì vậy, tôi thực hiện tiểu luận:“Các phương pháp định lượng vi sinh vật trong hệ sinh thái”
TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy më ®Çu Vi sinh vËt bao gåm tÊt c¶ c¸c sinh vËt cã kÝch thíc hiÓn vi, kh«ng thÊy râ ®îc b»ng m¾t thêng mà ph¶i sö dông kÝnh hiÓn vi thêng hoÆc kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö ®Ó quan s¸t. Vi sinh vËt cã mÆt ë kh¾p mäi n¬i trªn Tr¸i ®Êt, trong kh«ng khÝ, trong ®Êt, trªn nói cao, díi biÓn s©u, trªn c¬ thÓ, ngêi, ®éng vËt, thùc vËt, trong thùc phÈm, trªn mäi ®å vËt... Vi sinh vËt tham gia tÝch cùc vµo viÖc thùc hiÖn c¸c vßng tuÇn hoµn sinh-®Þaho¸ häc (biogeochemical cycles) nh vßng tuÇn hoµn C, vßng tuÇn hoµn n, vßng tuÇn hoµn P, vßng tuÇn hoµn S, vßng tuÇn hoµn Fe... Trong níc, vi sinh vËt cã nhiÒu ë vïng duyªn h¶i, vïng níc n«ng vµ ngay c¶ ë vïng níc s©u, vïng ®¸y ao hå. Trong kh«ng khÝ, cµng lªn cao sè lîng vi sinh vËt cµng Ýt. Sè lîng vi sinh vËt trong kh«ng khÝ ë c¸c khu d©n c ®«ng ®óc cao h¬n rÊt nhiÒu so víi kh«ng khÝ trªn mÆt biÓn vµ nhÊt lµ trong kh«ng khÝ ë B¾c cùc, Nam cùc... HÇu nh kh«ng cã hîp chÊt carbon nµo (trõ kim c¬ng, ®¸ graphÝt...) mµ kh«ng lµ thøc ¨n cña nh÷ng nhãm vi sinh vËt nµo ®ã (kÓ c¶ dÇu má, khÝ thiªn nhiªn, formol. dioxin...). Vi sinh vËt cã rÊt phong phó c¸c kiÓu dinh dìng kh¸c nhau : quang tù dìng (photoautotrophy), quang dÞ dìng (photoheterotrophy), ho¸ tù dìng (chemoautotrophy), ho¸ dÞ dìng (chemoheterotrophy).tù dìng chÊt sinh trëng (auxoautotroph), dÞ dìng chÊt sinh trëng (auxoheterotroph)... ChÝnh v× sù phong phó vµ ®a d¹ng nh vËy nªn viÖc t×m hiÓu, nghiªn cøu sù cã mÆt vµ sè lîng cña chóng còng nh cÊu tróc vµ chøc n¨ng vµ sù ph©n bè cña chóng lµ vÊn ®Ò v« cïng quan träng. HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng vi sinh vËt trong hÖ sinh th¸i bao gåm c¸c ph¬ng ph¸p truyÒn thèng vµ c¸c ph¬ng ph¸p hiÖn ®¹i. ChÝnh v× vËy, t«i thùc hiÖn tiÓu luËn: “C¸c ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng vi sinh vËt trong hÖ sinh th¸i” nh»m cung cÊp nh÷ng sù lùa chän thÝch hîp trong viÖc ph©n tÝch vµ ®Þnh lîng vi sinh vËt cña tõng mÉu sinh th¸i cô thÓ. I. c¸c ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng vi sinh vËt trong mÉu sinh th¸i I.1. Ph¬ng ph¸p ®Õm trùc tiÕp trªn kÝnh hiÓn vi I.1.1. Ph¬ng ph¸p ®Õm trªn c¸c vÕt b«i ®· ®îc cè ®Þnh vµ nhuém mµu (1) CNSH 2006-2008 1 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy Nguyªn lý: Ph¬ng ph¸p nµy nh»m ®Õm sè lîng tÕ bµo vi sinh vËt trong mét thÓ tÝch x¸c ®Þnh cña dÞch huyÒn phï nghiªn cøu trùc tiÕp díi kÝnh hiÓn vi dùa vµo viÖc cè ®Þnh vÕt b«i. ViÖc cè ®Þnh nµy cho phÐp gi÷ ®îc tiªu b¶n l©u dµi vµ kh«ng cÇn ®Õm ngay khi thÝ nghiÖm mµ cã thÓ vµo mét thêi gian kh¸c thuËn tiÖn h¬n. TiÕn hµnh: - LÊy mét lîng x¸c ®Þnh thÓ tÝch dÞch huyÒn phhï nghiªn cøu, thêng tõ 0,02 – 0,05ml, tr¶i lªn mét phiÕn kÝnh, lµm kh« vµ ®Æt lªn giÊy kÎ « ly ®Ó cã ®îc c¸c « cã diÖn tÝch 6 hay 4cm2. - Thªm vµi giät th¹ch 0,03% v« trïng, dïng que cÊy trén nhanh råi ph©n bè ®Òu ra trªn diÖn tÝch ®· v¹ch ra giÊy. - Lµm kh« trong kh«ng khÝ vµ cè ®Þnh trong 20-30 phót b»ng cån 96% vµ nhuém trong thêi gian x¸c ®Þnh b»ng mét thuèc nhuém nµo ®ã. - Röa tiªu b¶n, lµm kh« - TÝnh to¸n sè lîng tÕ bµo vi sinh vËt b»ng vËt kÝnh dÇu qua c¸c « vu«ng cña líi thÞ kÝnh ®îc l¾p vµo trong thÞ kÝnh. TÝnh sè lîng qua 50 – 100 « cña líi. §é chÝnh x¸c tèi ®a theo quan ®iÓm thùc tiÔn sÏ ®¹t ®îc khi tæng sè tÕ bµo ®îc tÝnh lµ 600 – 1000 d¬n vÞ. Tõ sè lîng nµy tÝnh ®îc sè tÕ bµo trung b×nh trong mét «: Xtb = ∑x ⁄n n lµ sè lîng c¸c « vu«ng ®· ®Õm cña líi I.1.2. Ph¬ng ph¸p ®Õm trùc tiÕp trªn kÝnh hiÓn vi sö dông buång ®Õm hång cÇu Nguyªn lý: Dùa vµo sù cã mÆt cña vi sinh vËt trong c¸c « cña líi ®Õm trong buång ®Õm h«ng cÇu. TiÕn hµnh: Dïng b«ng thÊm nhÑ níc cÊt khö trïng lªn 2 kho¶ng bªn cña líi ®Õm. §Æt l¸ kÝnh lªn sao cho l¸ kÝnh dÝnh chÆt vµo phiÕn kÝnh. Cho canh trêng cã chøa vi sinh vËt ®· pha lo·ng ch¶y tõ tõ vµo kho¶ng trèng gi÷a l¸ kÝnh vµ buång ®Õm. - Dïng buång ®Õm 0,1mm 1/25mm2 th× sè tÕ bµo trong canh trêng sÏ lµ: X = a x 0,1 x 1/25 x 1000 x f = 1/4 x a x 106 x f Trong ®ã, a lµ sè tÕ bµo cã trong mét « f lµ hÖ sè pha lo·ng cña canh trêng thÝ nghiÖm - Dïng buång ®Õm 0,1mm deft 1/400mm2 th× sè tÕ bµo trong canh trêng sÏ lµ: X = 4 x a x f x 106 Trong ®ã, X lµ sè tÕ bµo/ml canh trêng a lµ sè tÕ bµo trong mét « CNSH 2006-2008 2 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy f lµ hÖ sè pha lo·ng canh trêng ¦u nhîc ®iÓm vµ ph¹m vi øng dông: ¦u ®iÓm: Ph¬ng ph¸p nµy cho kÕt qu¶ t¬ng ®èi nhanh. Thùc hiÖn ®¬n gi¶n Nhîc ®iÓm: §é chÝnh x¸c thÊp Tèn søc lao ®éng khi sö dông kÝnh hiÓn vi Kh«ng cã kh¶ n¨ng ph©n biÖt vµ ®Þnh lîng ®îc tÕ bµo sèng vµ tÕ bµo chÕt Kh«ng thÝch hîp ®Ó ®Þnh lîng vi sinh vËt trong mÉu sinh th¸i do trong mÉu sinh th¸i cã chøa nhiÒu lo¹i quÇn thÓ kh¸c nhau ngoµi ra cßn cã rÊt nhiÒu cÆn bÈn nªn cã thÓ kh«ng ph©n biÖt ®îc víi vi sinh vËt. øng dông: Ph¬ng ph¸p ®Õm trùc tiÕp hiÖn nay vÉn ®îc sö dông trong viÖc x¸c ®Þnh t¹p nhiÔm trong qua tr×nh lªn men bia do nã ®a ra kÕt qu¶ ngay vµ kh¸ ®¬n gi¶n ®Ó thùc hiÖn. Nã thÝch hîp ®Ó ®Þnh lîng c¸c vi sinh vËt trong mét canh trêng thuÊt khiÕt víi quÇn thÓ ®· biÕt. I.1.3. Nhuém huúnh quang b»ng thuèc nhuém DEFT (Direct Epifluorescent) Nguyªn lý: DEFT lµ mét ph¬ng ph¸p ph©n tÝch vi sinh vËt trong ®ã c¸c vi sinh vËt ®îc b¾t gi÷ vµo trong mét mµng läc, ë ®ã chóng ®îc nhuém thuèc nhuém ®Æc hiÖu (®Æc hiÖu DNA, RNA...) cã kh¶ n¨ng ph¸t huúnh quang nh arine orange. Quan s¸t díi kÝnh hiÓn vi cho phÐp ®Þnh lîng nhanh c¸c vi sinh vËt cã trong mÉu (bai DEFT). Acridine Orange: Acridine orange lµ 1 lo¹i thuèc nhuém huúnh quang chän läc acid nucleic sö dông ®Ó ph¸t hiÖn tÕ bµo. Acridine orange cã tÝnh thÊm tÕ bµo vµ t¬ng t¸c víi DNA vµ RNA b»ng viÖc cµi vµo hoÆc b»ng lùc hót tÜnh ®iÖn. Khi liªn kÕt víi DNA, nã rÊt gièng víi fluorescein víi sù kÝch thÝch lín nhÊt ë bíc sãng 520nm vµ ph¸t x¹ lín nhÊt ë 525nm (mµu xanh l¸ c©y). Khi liªn kÕt víi RNA, nã thay ®æi bíc sãng kÝch thÝch thµnh 460 (mµu xanh da trêi) vµ bíc sãng ph¸t x¹ lín nhÊt lµ 650nm (mµu ®á). Acridine orange cã thÓ ®îc sö dông liªn kÕt víi ethidium bromide ®Ó ph©n biÖt sù kh¸c nhau gi÷a tÕ bµo ho¹t ®éng vµ kh«ng CNSH 2006-2008 3 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy ho¹t ®éng, tÕ bµo ®ang sinh s«i n¶y në. Acridine orange còng ®îc sö dông ®Ó ®o apoptosis vµ ph¸t hiÖn sù thay ®æi pH néi bµo, ho¹t ®éng cña b¬m proton (13). H×nh I.1. CÊu tróc Acridine Orange H×nh I.2. TÕ bµo Bacillus subtilis tríc vµ sau khi xö lý nhiÖt vµ nhuém Acridine Orange TÕ bµo sèng: xanh TÕ bµo chÕt: vµng Baclight: Baclight lµ mét lo¹i thuèc nhuém 2 thµnh phÇn phæ biÕn dùa trªn sù ph¸t huúnh quang ®Ó x¸c ®Þnh sù sèng cña tÕ bµo. Hai thµnh phÇn bao gåm: hexidium iodide (HI) mµu vµng vµ SYTO9 mµu xanh l¸ c©y. C¶ 2 thµnh phÇn nµy thuèc nhuém DNA vµ cã kh¶ n¨ng ph¸t huúnh quang khi liªn kÕt víi DNA sîi kÐp vµ kh«ng ph¸t quang trong dung dÞch. C¸c 2 thµnh phÇn ®Òu bÞ kÝch thÝch bëi ¸nh s¸ng xanh da trêi gÇn 490nm. SYTO9 cã tÝnh thÊm cao víi mµng tÕ bµo vi khuÈn vµ ®¸nh dÊu DNA vi khuÈn b»ng sù ph¸t huúnh quang mµu xanh l¸ c©y s¸ng. HI chØ thÊm vµo mµng tÕ bµo vi khuÈn Gram d¬ng vµ liªn kÕt DNA víi ¸i lùc lín h¬n so víi SYTO9. Do ®ã, HI thÝch hîp ®Ó ®¸nh dÊu DNA vi khuÈn Gram d¬ng víi huúnh quang mµu vµng s¸ng. HÖ thèng Baclight ®ßi hßi ph¶i cã mµng tÕ bµo sèng vµ cßn nguyªn ®Ó ®¶m b¶o tÝnh thÊm mµng vi khuÈn Gram d¬ng vµ Gram ©m (3). CNSH 2006-2008 4 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh I.3 . TÕ bµo S. epidermidis sau khi xö lý víi kh¸ng sinh vµ nhuém Baclight A. Mµng sinh häc cßn nguyªn B. Mµng sinh häc ®· bÞ ph¸ hñy C. C¸c tÕ bµo phï du Dapi: DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole) lµ mét chÊt ph¸t huúnh quang khi t¬ng t¸c víi DNA sîi kÐp, nã cã tÝnh ®Æc hiÖu huúnh quang víi AT, AU vµ IC. Do ®Æc tÝnh nµy nªn DAPI lµ mét c«ng cô h÷u Ých trong c¸c kh¶o s¸t mËt ®é. Khi DAPI liªn kÕt víi DNA, sù ph¸t huúnh quang cña nã t¨ng m¹nh, nhng cã banõg chøng cho r»ng DAPI liªn kÕt nh÷ng r·nh nhá vµ æn ®Þnh bëi liªn kÕt hydro gi÷a DAPI vµ nhãm nhËn cña cÆp base AT, AU,IC (14). H×nh I.3. Vi khuÈn dÞ dìng nhuém DAPI ¦u nhîc ®iÓm vµ ph¹m vi øng dông: ¦u ®iÓm: CNSH 2006-2008 5 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy Cã thÓ ph©n biÖt ®îc tÕ bµo sèng vµ tÕ bµo chÕt. Riªng DAPI kh«ng ph©n biÖt ®îc tÕ b¸o sèng, tÕ bµo chÕt do chóng chØ ®Æc hiÖu DNA mµ tÕ bµo chÕt vÉn chøa DNA. Kh«ng thÓ ®Þnh lîng chÝnh x¸c tõng loµi. Nhîc ®iÓm: Khã ®Þnh lîng ®îc chÝnh x¸c trogn mÉu sinh th¸i do cã qu¸ nhiÒu quÇn thÓ. ViÖc ®Õm trªn kÝnh cã thÓ dÉn ®Õn sai sè do thao t¸c lµm tiªu b¶n. øng dông: Ph¬ng ph¸p nµy ®· ®îc sö dông réng r·i trong c¸c nghiªn cøu ®Þnh lîng trùc tiÕp vi sinh vËt nh nghiªn cøu m«i trêng, s¶n xuÊt thuèc, dù ®o¸n nguy c¬ cña thùc phÈm. VÝ dô, DEFT ®îc sö dông trong ph¸t hiÖn c¸c vi sinh vËt cã trong s÷a nguyªn liÖu trong thêi gian 20 phót. I.1.4. Ph¬ng ph¸p kh¸ng thÓ huúnh quang trùc tiÕp (Direct Fluorescent Antibody Test) Ph¬ng ph¸p sö dông ®Ó ph¸t hiÖn sù cã mÆt cña mét ph©n tö kh¸ng nguyªn (protein ®Æc hiÖu ®iÓn h×nh trªn bÒ mÆt cña virus, vi khuÈn hoÆc c¸c vi sinh vËt kh¸c). C¸c chÊt ph¸t huúnh quang ®îc g¾n vµo vïng b¶o thñ cña kh¸ng thÓ. NÕu kh¸ng nguyªn cã mÆt, kh¸ng thÓ sÏ liªn kÕt ®Ó t¹o thµnh nh÷ng protein phøc ®Æc hiÖu vµ rÊt nh¹y. individual Legionells cells labeled CNSH 2006-2008 Cryptosporidium oocysts (smaller 6 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt with FITC-tagged antibody Ph¹m KiÒu Thóy green spheres) labeled with FITCtagged antibody H×nh I.4. M« t¶ ph¬ng ph¸p kh¸ng thÓ huúnh quang trùc tiÕp ¦u ®iÓm: Nh¹y vµ ®Æc hiÖu khi sö dông kh¸ng thÓ ®¬n dßng còng nh kh¸ng thÓ ®a dßng. Cã thÓ sö dông ®èi víi c¸c vi sinh vËt kh«ng thÓ nu«i cÊy dÔ dµng Cã thÓ ®¸nh dÊu, ph¸t hiÖn ®îc tõng tÕ bµo Cã thÓ quan s¸t ®îc c¸c tÕ bµo trong m«i trêng tù nhiªn Cã thÓ sö dông nhiÒu d¹ng nhiÒu lo¹i kh¸ng thÓ ®¸nh dÊu huúnh quang víi c¸c mµu kh¸c nhau ®Ó quan s¸t ®îc nhiÒu lo¹i tÕ bµo trong mét mÉu. Nhîc ®iÓm: Cã thÓ x¶y ra sù liªn kÕt chÐo, ®iÒu nµy cã thÓ kh¾c phô b»ng c¸ch sö dông kh¸ng thÓ ®¬n dßng song l¹i rÊt khã kh¨n trong viÖc t¹o kh¸ng thÓ ®¬n dßng. Qu¸ tr×nh thao t¸c ph¶i thùc hiÖn cÈn thËn ®Ó tr¸nh d¬ng tÝnh gi¶ vµ ©m tÝnh gi¶. Ph¬ng ph¸p nµy chØ ®îc sö dông víi môc ®Ých ®Þnh lîng nh÷ng quÇn thÓ ®· biÕt. øng dông: KÜ thuËt nµy ®· ®îc ¸p dông réng r·i, vÝ dô ®Þnh lîng nhanh vi khuÈn E. coli O157: H7 trong thÞt bß. MÉu ®îc nhuém kh¸ng thÓ ®a dßng kh¸ng O157 ®îc ®¸nh d¸u hïynh quang vµ kiÓm tra trªn kÝnh hiÓn vi huúnh quang. §é nh¹y ®îc so s¸nh víi c¸c ph¬ng ph¸p chuÈn vµ cho thÊy nã cã kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn ®îc sù cã mÆt cña mÇm bÖnh ë møc 16 CFU/g vµ thêi gian cho kÕt qu¶ lµ 1h (DEFT). I.2. Ph¬ng ph¸p ®Õm trùc tiÕp trªn ®Üa (1) Nguyªn lý: Ph¬ng ph¸p ®Þnh lîng tÕ bµo dùa trªn sù h×nh thµnh khuÈn l¹c trªn m«i trêng ®Æc trng. Khi ®ã, coi mçi khuÈn l¹c lµ kÕt qu¶ c¶u sù ph¸t triÓn tõ mét tÕ bµo. CNSH 2006-2008 7 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh I.5. X¸c ®Þnh vi sinh vËt tæng sè b»ng ph¬ng ph¸p ®Üa th¹ch TiÕn hµnh: Tïy tõng lo¹i mÉu sinh th¸i vµ tïy môc ®Ých nghiªn cøu mµ cã ph¬ng ph¸p còng nh m«i trêng ®Æc hiÖu riªng. - C¸c mÉu ®îc pha lo·ng ë nång ®é thÝch hîp sau ®ã cÊy tr¶i lªn ®Üa m«i trêng. - Nu«i cÊy ë c¸c ®iÒu kiÖn hiÕu khÝ, kÞ khÝ, nhiÖt ®é vµ thêi gian kh¸c nhau tïy thuéc ®iÒu kiÖn sinh trëngvµ ph¸t triÓn cña tõng lo¹i vi sinh vËt vµ tïy môc ®Ých. - X¸c ®Þnh mËt ®é vi sinh vËt tæng sè trong mÉu: Chän c¸c ®Üa khuÈn l¹c cã sè khuÈn l¹c n»m trong ph¹m vi ®¸ng tin cËy 25-250 khuÈn l¹c. Sè lîng vi sinh vËt sÏ ®îc x¸c ®Þnh b»ng c«ng thøc: N = C / [ (1 * n1) + (0.1 * n2) ] * (d) N lµ sè khuÈn l¹c trªn mét ®Üa C = Tæng sè khuÈn l¹c trªn tÊt c¶ c¸c ®Üa n1 = Sè ®Üa ë nång ®é pha lo·ng ®Çu tiªn n2 = Sè ®Üa ë nång ®é pha lo·ng thø 2 d = Nång ®é pha lo·ng ®Çu tiªn xuÊt hiÖn khuÈn l¹c ¦u nhîc ®iÓm vµ ph¹m vi øng dông: ¦u ®iÓm: Ph¬ng ph¸p nµy t¬ng ®èi ®¬n gi¶n, dÔ thao t¸c. Chi phÝ m¸y mãc, thiÕt bÞ thÊp. Nhîc ®iÓm: Ph¬ng ph¸p nµy kh«ng thÝch hîp cho viÖc ®Þnh lîng vi sinh vËt trong mÉu sinh th¸i v×: ChØ cã kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn vµ ®Þnh lîng nh÷ng vi sinh vËt sèng cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy ®îc mµ kh«ng x¸c ®Þnh ®îc nh÷ng vi sinh vËt sèng kh«ng cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy ®îc. CNSH 2006-2008 8 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy CÇn cã m«i trêng chän läc ®èi víi tõng lo¹i vi sinh vËt ®Ó ph©n lËp. CÇn kÕt hîp sö dông c¸c ph¬ng ph¸p lµm giµu, c¸c thö nghiÖm sinh lý sinh hãa ®Ó ph¸t hiÖn tõng lo¹i vi sinh vËt. Tèn thêi gian vµ c«ng søc. øng dông: Ph¬ng ph¸p nµy hiÖn nay vÉn ®îc ¸p dông ®Ó ®Þnh lîng c¸c vi sinh vËt trong c¸c mÉu níc, mü phÈm, thùc phÈm. Tuy nhiªn, ph¬ng ph¸p thÝch hîp nhÊt ®èi víi viÖc ®inh lîng nh÷ng canh trêng thuÇn khiÕt 1 lo¹i vi sinh vËt cô thÓ ®· biÕt vµ cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy. VÝ dô, ®Þnh lîng coliform. I.3. Ph¬ng ph¸p FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) (15,16). ë c¸c sinh vËt ®a bµo, tÊt c¶ tÕ bµo ®Òu gièng nhau vÒ DNA nhng protein th× l¹i rÊt kh¸c nhau. Do ®ã, sÏ rÊt h÷u Ých nÕu chóng ta cã thÓ t¸ch nh÷ng tÕ bµo cã kiÓu h×nh kh¸c nhau ra. Ngoµi ra, viÖc biÕt cã bao nhiªu tÕ bµo biÓu hiÖn protein vµ møc ®é biÓu hiÖn protein cña tÕ bµo còng ®îc quan t©m. FACS lµ mét ph¬ng ph¸p cã thÓ ®¹t ®îc tÊt c¶ nh÷ng môc ®Ých trªn. Nguyªn lý: FACS lµ ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh ®Æc tÝnh vµ ph©n biÖt c¸c tÕ bµo trong quÇn thÓ kh«ng ®ång nhÊt dùa trªn sù ph¸t x¹ ¸nh s¸ng ®Æc hiÖu vµ nh÷ng ®Æc tÝnh ph¸t quang cña mçi tÕ bµo) TiÕn hµnh: - §Çu tiªn, c¸c tÕ bµo ®îc ®a vµo khu«n vµ ®Èy ®Ó cho 1 tÕ bµo cã thÓ ®i qua mét lç nhá. TÕ bµo di chuyÓn xuèng díi lç trong tr¹ng th¸i ®îc lµm rung ë ®iÒu kiÖn tèi u ®Ó t¹o thµnh c¸c giät ë mét kho¶ng c¸ch cè ®Þnh so víi lç. Khi c¸c tÕ bµo ch¶y xuèng theo dßng cña chÊt láng, chóng ®îc quÐt tia lase (¸nh s¸ng xanh). Mét vµi tia lase bÞ ph©n t¸n bëi tÕ bµo (t¹o thµnh h×nh nãn ®á tõ tÕ bµo ®á) vµ nã ®îc sö dông ®Ó ®Õm tÕ bµo. Nh÷ng tia bÞ ph©n t¸n nµy cßn cã thÓ ®îc sö dông ®Ó ®o kÝch thíc cña tÕ bµo. - NÕu muèn t¸ch c¸c tÕ bµo cña tõng quÇn thÓ, th× cã thÓ thùc hiÖn b»ng c¸ch g¾n nh÷ng tÕ bµo quan t©m vµo kh¸ng thÓ g¾n huúnh quang. Kh¸ng thÓ chØ ®îc liªn kÕt víi nh÷ng protein ®îc biÓu hiÖn trong tÕ bµo cÇn t¸ch. Tia lase kÝch thÝch thuèc nhuém ph¸t ra mµu cña ¸nh s¸ng ®îc ph¸t hiÖn bëi bé thu quang, hoÆc thiÕt bÞ dß ¸nh s¸ng (dectector). B»ng c¸ch thu thËp th«ng tin tõ ¸nh s¸ng (bÞ t¸n s¾c vµ ph¸t huúnh quang), m¸y tÝnh cã thÓ x¸c ®Þnh nh÷ng tÕ bµo nµo cÇn ph¶i t¸ch rêi vµ thu thËp. CNSH 2006-2008 9 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh I.6. S¬ ®å m¸y FACS (C¸c tÕ bµo ®îc ®¸nh dÊu víi kh¸ng thÓ huúnh quang mµu ®á hoÆc xanh) - Bíc cuèi cïng lµ ph©n lo¹i c¸c tÕ bµo ®· ®îc tÝch ®iÖn. M¸y tÝnh x¸c ®Þnh lµm thÕ nµo mµ c¸c tÕ bµo sÏ ®îc ph©n lo¹i tríc khi h×nh thµnh giät ë cuèi dßng ch¶y. Khi ®· giät h×nh thµnh, mét dßng ®iÖn sÏ ®îc ®a vµo dßng ch¶y vµ giät míi mang ®iÖn sÏ ®îc h×nh thµnh. C¸c giät mang ®iÖn nµy ®îc cho di chuyÓn lÖch sang ph¶i hoÆc tr¸i bëi ®iÖn cùc tÝch ®iÖn vµ ®i vµo trong c¸c èng thu mÉu. C¸c giät kh«ng chøa tÕ bµo ®îc chuyÓn ®Õn èng chøa dÞch th¶i. KÕt qu¶ cuèi cïng cã 3 èng víi nh÷ng tÕ bµo díi quÇn thÓ (loµi) thuÇn khiÕt. Sè lîng tÕ bµo trong mçi CNSH 2006-2008 10 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy èng cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc vµ møc ®é ph¸t huúnh quang còng ®îc ghi l¹i cho mçi lo¹i tÕ bµo. - Sè liÖu FACS ®îc ghi l¹i bëi m¸y tÝnh cã thÓ ®îc hiÓn thÞ b»ng 2 c¸ch: C¸ch 1 (H×nh I.7.A): Cã thÓ thÊy cêng ®é huúnh quang xanh hoÆc ®á ®îc thÓ hiÖn trªn trôc X vµ sè lîng tÕ bµo cña mçi mét møc ®é huúnh quang ®îc thÓ hiÖn trªn trôc Y. Trong VD nµy, c¸c tÕ bµo mµu ®á ®îc ph©n lo¹i gÊp 2 lÇn tÕ bµo mµu xanh hoÆc tÕ bµo kh«ng mµu nhng cêng ®é ¸nh s¸ng cña tÕ bµo xanh l¹i lín h¬n cña tÕ bµo ®á. Ph¬ng ph¸p nµy lµ tèt nhÊt khi tÊt c¶ c¸c tÕ bµo ®Òu mµu xanh, ®á hoÆc kh«ng mµu vµ kh«ng tÕ bµo nµo cã c¶ 2 mµu. C¸ch 2 (H×nh I.7.B): Ngoµi c¸ch biÓu diÔn sè liÖu nh trªn, cã mét c¸ch kh¸c nhau ®Ó xö lý sè liÖu thu ®îc. Trôc X biÓu thÞ cêng ®é cña huúnh quang xanh trong khi trôc Y l¹i biÓu hiÖn cêng ®é cña huúnh quang ®á. Nh÷ng chÊm ®en nhá miªu t¶ c¸c c¸ thÓ tÕ bµo vµ chóng ta kh«ng thÓ ®Õm ®îc hÕt nh÷ng chÊm ®en ®ã nhng cã thÓ quan s¸t møc mËt ®é t¬ng ®èi cña chÊm ®en ë c¸c gãc kh¸c. Tõ ®å thÞ nµy, cã thÓ thÊy kh«ng tÕ bµo nµo cã c¶ mµu xanh vµ ®á (trªn cïng bªn ph¶i) vµ rÊt nhiÒu tÕ bµo kh«ng mµu (díi cïng bªn tr¸i). Sè lîng tÕ bµo mµu xanh (díi cïng bªn ph¶i) t¬ng ®¬ng víi sè lîng tÕ bµo kh«ng mµu nhng sè lîng cña tÕ bµo mµu ®á (trªn cïng bªn tr¸i) gÊp 2 lÇn hai tÕ bµo mµu xanh vµ kh«ng mµu. MÆt kh¸c, chóng ta cã thÓ thÊy møc ®é ph¸t huúnh quang cña tÕ bµo mµu xanh cao h¬n so víi tÕ bµo mµu ®á. Ph¬ng ph¸p vÏ ®å thÞ sè liÖu nµy ®îc sö dông khi c¸c tÕ bµo cã mÆt cã c¶ mµu ®á vµ xanh. A CNSH 2006-2008 11 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy B H×nh I.7. BiÓu ®å biÓu diÔn sè liÖu FACS thu ®îc (Cêng ®é ¸nh s¸ng ph¸t ra t»ng theo chiÒu mòi tªn) ¦u nhîc ®iÓm vµ ph¹m vi øng dông: FACS ®îc sö dông ®Ó ph©n biÖt tÕ bµo sèng víi tÕ bµo chÕt, ph©n biÖt c¸c d¹ng kh¸c nhau cña tÕ bµo, ph©n lËp c¸c tÕ bµo sö dông cho t¸ch dßng hoÆc PCR, t¸ch c¸ tÕ bµo tinh trïng phôc vô cho ph©n lo¹i hoÆc cho viÖc nhËn d¹ng c¸c tÕ bµo apopototic. Ngoµi ra, cã thÓ t¸ch ®îc tÕ bµo sèng ra khái tÕ bµo chÕt b»ng FACS. C¸c tÕ bµo chÕt cã kh¶ n¨ng thÊm ethidium monoazide (EMA), 1 lo¹i hãa chÊt cã thÓ x©m nhËp vµo tÕ bµo vµ liªn kÕt víi DNA díi ®Ìn huúnh quang. Khi FACS ho¹t ®éng, c¸c tÕ bµo cã chøa EMA (c¸c tÕ bµo chÕt) ®îc t¸ch riªng (15). I.4. Ph¬ng ph¸p FCM (Flow Cytometry) (17,20,21) Cytometry lµ viÖc x¸c ®Þnh c¸c ®Æc tÝnh lý häc vµ/ hoÆc hãa häc cña tÕ bµo hoÆc cña c¸c h¹t sinh häc kh¸c. Flow cytometry (FCM) lµ mét qu¸ tr×nh trong ®ã viÖc x¸c ®Þnh ®ã ®îc thùc hiÖn trong khi c¸c tÕ bµo vµ c¸c h¹t tr¶i qua mét lo¹t c¸c thiÕt bÞ ®o trong mét dßng ch¶y. Sù ph©n lo¹i dßng b»ng c¸ch sö dông c¸c c«ng cô ®iÖn vµ c¬ häc ®Ó chuyÓn vµ thu nhËn nh÷ng tÕ bµo víi mét hoÆc nhiÒu ®Æc tÝnh ®o ®îc t¹o thµnh mét hoÆc mét lo¹t c¸c gi¸ trÞ do ngêi sö dông cµi ®Æt (21). Nguyªn lý: FCM dùa trªn nguyªn lý t¸n s¾c ¸nh s¸ng, kÝch thÝch ¸nh s¸ng, vµ ph¸t x¹ ¸nh s¸ng cña c¸c ph©n tö thuèc nhuém fluorochrome ph¸t huúnh quang ®Ó t¹o ra nh÷ng th«ng sè ®Æc hiÖu tõ nh÷ng h¹t vµ nh÷ng tÕ bµo cã kÝch thíc tõ 0,5 ®Õn 40μm. C¸c tÕ bµo ®îc tËp trung thñy ®éng häc trong mét èng chøa PBS tríc khi bÞ chÆn bëi mét nguån s¸ng thÝch hîp. ¸nh s¸ng lase thêng ®îc sö dông lµm nguån s¸ng trong FCM (17). CNSH 2006-2008 12 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh I.8. S¬ ®å thiÕt bÞ FCM. ThiÕt bÞ sö dông nguyªn lý thñy ®éng häc tËp trung vµo viÖc tr×nh diÖn c¸c tÕ bµo tríc tia lase (hoÆc bÊt cø mét nguån s¸ng kÝch thÝch nµo). MÉu ®îc ®a vµo gi÷a èng. Dßng kÕt hîp nµy sÏ ®îc thu nhá vµ ®Èy tÕ bµo vµo trung t©m cña dßng ch¶y. Khi tÕ bµo hoÆc c¸c h¹t quan t©m chÆn nguån s¸ng, chóng t¸n s¾c ¸nh s¸ng vµ thuèc nhuém fluorochrome ph¸t huúnh quang sÏ ph©n c¾t chóng t¹o thµnh c¸c tr¹ng th¸i n¨ng lîng cao h¬n. N¨ng lîng nµy ®îc gi¶i phãng lµ mét photon ¸nh s¸ng víi ®Æc tÝnh quang phæ ®Æc hiÖu duy nhÊt víi nh÷ng thuèc nhuém fluorochrome ph¸t huúnh quang kh¸c nhau (B¶ng I.1). CNSH 2006-2008 13 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy B¶ng I.1. Phæ huúnh quang cña nh÷ng fluorochromes thêng ®îc sö dông Phæ kÝch thÝch ®îc biÓu diÔn b»ng mµu x¸m trong khi phæ ph¸t x¹ ®îc biÓu diÔn b»ng mµu ®en. PhÇn cuèi cña b¶ng tãm t¾t bíc sãng ph¸t x¹ cña nh÷ng nguån s¸ng kh¸c nhau sö dông trong Flow cytometry. Bíc sãng 488nm cña tia ion argon xuÊt hiÖn ë c¸c phæ (From Practical Flow Cytometry, Third Edition, Howard M. Shapiro. P. 245. ¸nh s¸ng ®îc t¸n s¾c vµ ph¸t ra tõ c¸c tÕ bµo vµ c¸c h¹t ®îc chuyÓn thµnh xung ®iÖn b»ng c¸c detector thÝch hîp. ¸nh s¸ng ®îc thu l¹i b»ng thÊu kÝnh cïng tiªu ®iÓm tËp trung ë ®iÓm giao gi÷a tÕ bµo vµ nguån s¸ng. ¸nh s¸ng ®îc chuyÓn ®Õn CNSH 2006-2008 14 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy nh÷ng detector kh¸c nhau sö dông nh÷ng tÊm läc ¸nh s¸ng quang häc. VÝ dô, d¶i ¸nh s¸ng 525nm qua tÊm läc ®Æt trong luång s¸ng tríc detector sÏ cho phÐp ¸nh s¸ng xanh ®i vµo detector. Detector sö dông phæ biÕn nhÊt trong FCM lµ bé nh©n quang (PMT). H×nh I.9. M« h×nh s¾p xÕp c¸c bé phËn quang häc trong FCM C¸c xung ®iÖn xuÊt ph¸t tõ ¸nh s¸ng ®îc ph¸t hiÖn bëi PMT ®i qua mét lo¹t c¸c bé khuÕch ®¹i. Sù khuÕch ®¹i loga thêng ®îc sö dông ®Ó ®o sù ph¸t quang trong tÕ bµo. Lo¹i khuÕch ®¹i nµy më réng ph¹m vi ®èi víi c¸c tÝn hiÖu yÕu vµ thu hÑp ph¹m vi ®èi víi nh÷ng tÝn hiÖu ph¸t huúnh quang ®Æc hiÖu vµ m¹nh. Sau khi c¸c tÝn hiÖu kh¸c nhau hoÆc c¸c xung kh¸c nhau ®îc khuÕch ®¹i, chóng tiÕp tôc ®îc chuyÓn ®æi thµnh tÝn hiÖu ®iÖn tö cho phÐp vÏ ®îc ®å thÞ sè liÖu vµ ®îc lu gi÷ trong m¸y tÝnh. X©y dùng biÓu ®å: BiÓu ®å cã thÓ t¹o thµnh bëi mét th«ng sè hoÆc 2 th«ng sè. BiÓu ®å mét th«ng sè: BiÓu ®å mét th«ng sè lµ biÓu ®å ®Õm tÕ bµo trªn trôc Y vµ th«ng sè ®o trªn trôc X. TÊt c¶ c¸c biÓu ®å mét th«ng sè ®Òu cã 1024 v¹ch. Nh÷ng v¹ch nµy t¬ng øng víi hiÖu ®iÖn thÕ ph¸t sinh tõ luång ¸nh s¸ng ®Æc hiÖu ph¸t hiÖn bëi PMT detector. Bªn c¹nh ®ã, ADC chia v¹ch dùa trªn kÝch thíc xung trong mçi trêng CNSH 2006-2008 15 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy hîp. Do ®ã, sù ph¸t mµu huúnh quang s¸ng h¬n sÏ thu ®îc xung lín h¬n vµ do ®ã sè kªnh sÏ lín h¬n khi biÓu hiÖn trªn biÓu ®å. BiÓu ®å hai th«ng sè: §©y lµ lo¹i biÓu ®å biÓu diÔn 2 th«ng sè cÇn ®o trªn trôc X vµ trôc Y vµ sè lîng tÕ bµo ®Õm ®îc víi mËt ®é kh¸c nhau. Nã t¬ng tù nh b¶n ®å ®Þa h×nh. Cã thÓ lùa chän 64 hoÆc 256 v¹ch trªn mçi trôc cña biÓu ®å 2 th«ng sè. Sè lîng h¹t ®Õm ®îc ®îc thÓ hiÖn b»ng mËt ®é chÊm hoÆc b»ng ®êng viÒn biÓu diÔn. H×nh I.10. BiÓu diÔn sè liÖu FCM BiÓu ®å 1 th«ng sè (A) BiÓu ®å 2 th«ng sè (B) ( FL1-FITC trªn trôc X vµ FL2-PE trªn trôc Y) Ph©n tÝch vµ ph©n lo¹i b»ng FCM: Ph©n tÝch dÞch huyÒn phï tÕ bµo thu ®îc nhiÒu th«ng sè liªn quan tíi Forward Light Scatter (FLS), 90° Light Scatter (90LS), vµ FL1-FL4. Nh÷ng th«ng tin nµy cho phÐp nhËn d¹ng vµ x¸c ®Þnh tÝnh chÊt cña nhiÒu díi quÇn thÓ kh¸c nhau cña tÕ bµo. Qu¸ tr×nh ph©n t¸ch c¸c tÕ bµo sö dông c¸c sè liÖu FCM lµ qu¸ tr×nh ph©n lo¹i. CNSH 2006-2008 16 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh I.11. S¬ ®å thiÕt bÞ ph©n lo¹i ¦u nhîc ®iÓm vµ ph¹m vi øng dông: ¦u ®iÓm: FCM cã thÓ ®o ®îc sù ph¸t huúnh quang trªn mçi tÕ bµo vµ mçi h¹t. §iÒu nµy ngîc víi ph¬ng ph¸p ®o quang phæ v× ë ®ã, sù hÊp thô vµ truyÒn nh÷ng bíc sãng ®Æc hiÖu cña ¸nh s¸ng ®îc ®o cho mét thÓ tÝch lín mÉu. Cã thÓ ph©n biÖt ®îc tÕ bµo sèng vµ tÕ bµo chÕt. FCM cã thÓ tinh s¹ch mét lîng díi quÇn thÓ rÊt nhá (1 tÕ bµo trong 10 5), hoÆc 1 díi quÇn thÓ ®îc x¸c ®Þnh bëi kÝch cì chuÈn vµ ®Æc tÝnh ph¸t huúnh quang. Khi nghiªn cøu c¸c quÇn thÓ tÕ bµo kh«ng ®ång nhÊt, FCM thùc sù rÊt hiÖu qu¶. Trong mét vµi phót, FCM cã thÓ ®a ra c¸c sè liÖu vÒ c¸c díi quÇn thÓ trong mét mÉu. Nã kh«ng chØ ®a ra phÇn tr¨m c¸c tÐ bµo ®á vµ xanh mµ cßn c¶ phÇn tr¨m c¸c tÕ bµo mang 2 mµu ®á vµ xanh vµ c¸c tÕ bµo kh«ng ph¶i ®á còng kh«ng ph¶i xanh. Tuy nhiªn, díi quÇn thÓ cã mµu xanh s¸ng vµ mµu xanh mê... Kh«ng mét ph¬ng ph¸p nµo cã thÓ cho phÐp ph©n tÝch nhanh, ®Þnh lîng ®îc c¸c díi quÇn thÓ ®ã. Nhîc ®iÓm: CNSH 2006-2008 17 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy §èi víi 1 díi quÇn thÓ chiÕm 20% quÇn thÓ ban ®Çu, m¸y ph©n lo¹i tèc ®é cao sÏ thu ®îc Ýt h¬n 106 tÕ bµo/h. NhiÒu thÝ nghiÖm cÇn nhiÒu tÕ bµo h¬n thÕ. NÕu cã 2 tÕ bµo qu¸ gÇn nhau th× chóng cã thÓ bÞ cïng lo¹i bá. Ngoµi ra, mét vÊn ®Ò ph¸t sinh khi c¸c tÕ bµo ®· ®îc ph©n lo¹i cÇn ph¶i gi÷ trong ®iÒu kiÖn v« trïng. C¸c m¸y ph©n lo¹i cã thÓ ®îc gi÷ trong ®iÒu kiÖn v« trïng nhng sÏ lµm phøc t¹p thªm qu¸ tr×nh. ViÖc gi÷ s¹ch tÕ bµo sÏ thùc hiÖn dÔ dµng h¬n khi sö dông lo¹i m¸y ph©n lo¹i chËm, tuy nhiªn tèc ®é chØ b»ng 1/10. øng dông (17): øng dông trong y häc l©m sµng: FCM ®îc sö dông réng r·i trong c¸c bÖnh viÖn ®Ó nghiªn cøu l©m sµng vµ chÈn ®o¸n. FCM cã kh¶ n¨ng ph©n biÖt c¸c d¹ng tÕ bµo trong m¸u vµ ph©n biÖt ®îc nhiÒu lo¹i tÕ bµo ung th m¸u (leukemias vµ lymphomas). FCM cã thÓ ®Þnh lîng sù mÊt lympho T trong qu¸ tr×nh ®µn ¸p miÔn dÞch ®Ó ng¨n chÆn sù ®µo th¶i c¸c m« ghÐp hoÆc sù mÊt tÕ bµo T hç trî CD4 ë ngêi bÞ AIDS. FCM cã thÓ øng dông ®îc trong viÖc nghiªn cøu c¸c tÕ bµo ung th lÊy ra trong phÉu thuËt vµ mÉu sinh thiÕt v× sù ph©n bè cña tÕ bµo/ DNA thÓ hiÖn giai ®o¹n cña tiÕn tr×nh bÖnh. C¸c kÕt qu¶ FCM rÊt quan träng cho viÖc chÈn ®o¸n, dù ®o¸n vµ tèi u liÖu ph¸p ®iÒu trÞ. øng dông trong nghiªn cøu vi sinh vËt häc: FCM rÊt thÝch hîp ®Ó nghiªn cøu vÒ vi sinh vËt. Ngêi ta cã thÓ võa ph©n lo¹i vi sinh vËt võa ph¸t hiÖn tÝnh kh¸ng kh¸ng sinh cña chóng trong mét vµi giê ë trong cïng mét thiÕt bÞ FCM. Tuy nhiªn, FCM kh«ng ®îc øng dông réng r·i v× nã ®îc cho lµ kh«ng kinh tÕ. Ngoµi ra, nhiÒu nghiªn cøu vÒ ®éng häc vi sinh vËt ®· ®îc thùc hiÖn sö dông FCM, bao gåm lËp ®êng cong sinh trëng, c¸c nghiªn cøu t¸i s¶n xuÊt vµ nhu cÇu trao ®æi chÊt. øng dông trong nghiªn cøu tÕ bµo: øng dông sím nhÊt cña FCM trong nghiªn cøu tÕ bµo lµ kh¶o s¸t chøc n¨ng cña b¹ch cÇu trung tÝnh b»ng c¸ch ®o sù thùc bµo cña vi sinh vËt. Cã nhiÒu nghiªn cøu sö dông FCM ®Ó nghiªn cøu ®Æc tÝnh cña tÕ bµo mµ kh«ng mét c«ng nghÖ nµo cã thÓ thùc hiÖn ®îc. VÝ dô, nghiªn cøu sù s¶n xuÊt oxy cña sinh vËt ®¬n bµo. Ngoµi ra, FCM cßn ®îc sö dông ®Ó x¸c ®Þnh kÝch cì, cÊu tróc vµ c¸c thô thÓ ®Æc hiÖu cña c¸c tÕ bµo riªng lÎ. øng dông trong nghiªn cøu thùc vËt: CNSH 2006-2008 18 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy FCM ®îc sö dông hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c ®Þnh c¸c gen biÓu hiÖn ë c©y thuèc l¸ chuyÓn gen. I.5. Ph¬ng ph¸p ph©n tÝch dùa trªn c¸c ®Æc tÝnh sinh hãa (17) I.5.1. KÜ thuËt ®o ph¸t x¹ huúnh quang ATP (Adenosine Triphosphat) Nguyªn lý: TÊt c¶ c¸c vi sinh vËt sèng vµ chØ cã nh÷ng sinh vËt sèng míi cã chøa hîp chÊt ATP nh 1 phÇn trong qu¸ tr×nh trao ®æi n¨ng lîng cho sù sèng. ATP ®îc gi¶i phãng vµ ph¸t hiÖn ®îc b»ng ph¶n øng ph¸t huúnh quang chuÈn. ATP ph¶n øng nhanh khi cã mÆt enzym luciferase, lucifin vµ oxy ®Ó t¹o ra c¸c photon ¸nh s¸ng mµu vµng xanh vµng. H×nh 1.12. C¬ chÕ ph¶n øng ph¸t huúnh quang ATP Mét thiÕt bÞ ®o ¸nh s¸ng tù ®éng ®a nh÷ng t¸c nh©n cÇn thiÕt vµo mÉu vµ ph¸t hiÖn ¸nh s¸ng ph¸t ra víi ®é nh¹y cao. ¦u ®iÓm: Cã kh¶ n¨ng øng dông réng r·i trong nhiÒu lo¹i mÉu kh¸c nhau ®Ó sµng läc c¸c vi sinh vËt. RÊt nh¹y. Nhîc ®iÓm: MÆc dï kÜ thuËt ®o sù ph¸t quang sinh häc ATP rÊt nh¹y nhng trªn thùc tÕ nã còng h¹n chÕ bëi v× nã ph¸t hiÖn nh÷ng s¶n phÈm trao ®æi chÊt (ATP) mµ mét vi sinh vËt th× chØ chøa mét lîng ATP cã h¹n. øng dông (18): §©y lµ ph¬ng ph¸p ®îc ¸p dông tõ l©u vµ hiÖn vÉn cßn co gi¸ trÞ. Ngêi ta ®· ¸p dông ph¬ng ph¸p nµy ®Ó ®Þnh lîng vi khuÈn trong mÉu níc biÓn. ViÖc ®Þnh lîng sinh khèi cña c¸c tÕ bµo ph¸t triÓn dÞ dìng cã ý nghÜa v× nã cã liªn quan ®Õn sù ph©n bè cña vËt chÊt h÷u c¬ trong biÓn. X¸c ®Þnh sinh khèi b»ng ®Þnh lîng ATP phô thuéc vµo nguyªn t¾c r»ng tÊt c¶ c¸c tÕ bµo, kÓ c¶ ®éng vËt hoÆc thùc vËt ®Òu CNSH 2006-2008 19 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy cã chøa ATP vµ gi¶ ®Þnh r»ng 1) kh«ng cã ATP liªn kÕt víi vËt chÊt kh«ng sèng 2) tØ lÖ ATP trªn tÕ bµo C sÏ kh¸ æn ®Þnh. X¸c ®Þnh lîng ATP trong c¸c mÉu tõ níc biÓn kÕt hîp víi tµi liÖu kh¸c cho thÊy lîng ATP chøa trong nhiÒu VSV biÓn, vµ do ®ã cho phÐp íc lîng sù ph©n bè cña tÕ bµo sèng t¹i bÊt k× mét vïng biÓn s©u nµo. Nghiªn cøu nµy ®a ra kÕt luËn vÒ viÖc x¸c ®Þnh ATP díi ®é s©u 1025m t¹i bê biÓn califonia vµ cßn cung cÊp t liÖu thÝ nghiÖm vÒ nång ®é ATP trong nhiÒu lo¹i VK vµ t¶o biÓn kh¸c nhau. VÝ dô, hµm lîng ATP ë Vibrio sp. lµ 0,5-4,0.10-9μg/tÕ bµo, lîng ATP tÊt c¶ c¸c loµi vi khuÈn biÓn kho¶ng 1,5. 4,0.10-9μg/tÕ bµo. I.5.2. KÜ thuËt ®o ph¸t x¹ huúnh quang AK (Adenylate Kinase) Nguyªn lý: TÊt c¶ c¸c vi sinh vËt ®Òu cã chøa (AK) ®©y lµ mét phÇn trong qu¸ tr×nh trao ®æi n¨ng lîng cña sù sèng. Bëi v× ®©y lµ 1 enzym nªn cã thÓ sö dông AK ®Ó t¹o ra nh÷ng lîng s¶n phÈm kh«ng h¹n chÕ, trong ®ã cã ATP. Do ®ã cã thÓ ®Þnh lîng ®îc b»ng ph¶n øng ph¸t quang sinh häc. Ph¶n øng trªn cµng kÐo dµi th× cµng nhiÒu ATP ®îc t¹o thµnh vµ thu ®îc cµng nhiÒu tÝn hiÖu ph¸t quang sinh häc. Ph¶n øng xóc t¸c bëi AK diÔn ra nh sau: H×nh 1.13. C¬ chÕ ph¶n øng ph¸t huúnh quang AK Lîng AK trong tÕ bµo vi sinh vËt còng gièng nh ATP, rÊt kh¸c nhau ë mçi loµi vµ bÞ khèng chÕ chñ yÕu do kÝch thíc tÕ bµo. C¸c vi sinh vËt cã kÝch thíc cµng lín th× cµng chøa nhiÒu AK. Enzym AK trong vi khuÈn cã kh¶ n¨ng xóc t¸c tæng hîp ATP gÊp 40 lÇn so víi lîng ATP cña b¶n th©n vi khuÈn ®ã trong 1 phót. NÕu CNSH 2006-2008 20 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy ph¶n øng vÉn diÔn ra trong 25 phót, lîng ATP cã thÓ ®¹t gÊp 1000 lÇn so víi lîng ATP cña vi khuÈn ban ®Çu. Trong thùc tÕ hiÖn nay, c«ng nghÖ AK dùa trªn sù khuÕch ®¹i ATP vi sinh vËt. Tõ khi cã c«ng nghÖ AK, ph¬ng ph¸p nµy ®· ®îc sö dông ®Ó ph¸t hiÖn nh¹y h¬n trong viÖc kiÓm tra sù nhiÔm t¹p nhiÒu h¬n lµ ®o sù ph¸t quang sinh häc (18). ¦u nhîc ®iÓm vµ ph¹m vi øng dông: ¦u ®iÓm: RÊt nhanh. RÊt nh¹y. Rót ng¾n thêi gian chi kÕt qu¶. Nhîc ®iÓm: ThiÕu tÝnh ®Æc hiÖu tuyÖt ®èi I.6. Ph¬ng ph¸p ELISA b¾t gi÷ kh¸ng nguyªn Nguyªn lý: KÜ thuËt ELISA b¾t gi÷ kh¸ng nguyªn dùa vµo ph¶n øng ®Æc hiÖu kh¸ng nguyªn vµ kh¸ng thÓ. §©y lµ kÜ thuËt ELISA sö dông ®Ó ph¸t hiÖn vµ ®Þnh lîng kh¸ng nguyªn cÇn nghiªn cøu. §Çu tiªn, vi giÕng ®îc phñ b»ng kh¸ng thÓ kh¸ng thÓ ®¬n dßng kh¸ng kh¸ng nguyªn. Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu kháng nguyên này sẽ ®ược trong giÕng. Các kháng nguyên này sẽ ®îc ph¸t hiÖn b»ng c¸ch sö dông kh¸ng thÓ 2 gắn với enzym như horseradish peroxydase hay ankaline phosphatase. TiÕn hµnh: Tríc tiªn, kh¸ng thÓ 1 kh¸ng ®îc g¾n vµo gi¸ r¾n. TiÕp theo, thªm dung dÞch nghiªn cøu (cã thÓ chøa kh¸ng nguyªn ®Ó liªn kÕt víi kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu). Sau ®ã, kh¸ng thÓ 2 ®Æc hiÖu kh¸ng kh¸ng nguyªn, cã g¾n enzym ®îc bæ sung vµo kh¸ng nguyªn võa ®îc b¾t gi÷. Sau khi bæ sung c¬ chÊt ®Æc hiÖu víi enzym, enzym thñy ph©n c¬ chÊt lµm thay ®æi mµu dung dÞch vµ ®îc ®o ë bíc sãng thÝch hîp. Tèc ®é thñy ph©n cña enzym tû lÖ thuËn víi lîng kh¸ng thÓ ®· g¾n enzym, còng cã nghÜa lµ tû lÖ thuËn víi lîng kh¸ng nguyªn cÇn nghiªn cøu. CNSH 2006-2008 21 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh 1.14. M« h×nh ELISA ®Þnh lîng kh¸ng nguyªn ¦u ®iÓm: Ph¬ng ph¸p nµy cã ®é nh¹y vµ ®é ®Æc hiÖu cao. Nhîc ®iÓm: Ph¶i t¨ng sinh tríc khi ¸p dông §é nh¹y ph¸t hiÖn cña ph¬ng ph¸p nµy thÊp, kho¶ng 106 CFU/ml. Sö dông ph¬ng ph¸p nµy khi ®· biÕt tríc quÇn thÓ cÇn nghiªn cøu. øng dông: HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu øng dông cña kÜ thuËt nµy ë ViÖt Nam. VÝ dô, kÜ thuËt nµy ®îc sö dông trong chÈn ®o¸n vµ ®Þnh lîng virus rota g©y bÖnh tiªu ch¶y. KÜ thuËt dùa trªn sù ph¶n øng ®Æc hiÖu gi÷a kh¸ng nguyªn vá virus rota vµ kh¸ng thÓ kh¸ng virus rota. Sö dông 2 lo¹i kh¸ng thÓ lµ céng hîp kh¸ng thÓ kh¸ng virus rota g¾n peroxidase vµ kh¸ng thÓ dª kh¸ng virus rota. C¸c mÉu m¸u nghiªn cøu ®îc ph¸t hiÖn cã sù xuÊt hiÖn cña virus rota nhê sù thay ®æi do ph¶n øng enzyme t¹o ra. §o mµu ë bíc sãng thÝch hîp sÏ x¸c ®Þnh ®îc lîng kh¸ng nguyªn virus rota cã mÆt trong mÉu nghiªn cøu. II. ph¸t hiÖn vµ ®Þnh lîng vi khuÈn tæng sè trong s÷a b»ng Ph¬ng ph¸p flow cytometry (FCM) CNSH 2006-2008 22 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy Thµnh phÇn vi sinh vËt trong s÷a nguyªn liÖu ¶nh hëng ®Õn chÊt lîng s÷a thµnh phÈm vµ c¸c s¶n phÈm s÷a kh¸c. Cã mét vµi ph¬ng ph¸p ®· ®îc ®a ra ®Ó ph¸t hiÖn vµ ®Þnh lîng ®îc c¸c vi sinh vËt trong s÷a nguyªn liÖu vµ s÷a ®· qua chÕ biÕn. Ph¬ng ph¸p nu«i cÊy lµ ph¬ng ph¸p phæ biÕn nhÊt, nhng bÊt lîi lín nhÊt cña ph¬ng ph¸p nµy lµ cÇn nhiÒu thêi gian ®Ó ®a ra kÕt qu¶ (11). Mét bÊt lîi kh¸c cña ph¬ng ph¸p nu«i cÊy truyÒn thèng lµ cã thÓ ph¸t hiÖn ra nh÷ng vi sinh vËt sèng nhng kh«ng cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy ®îc (2). MÆt kh¸c, ph¬ng ph¸p ®Õm trªn kÝnh hiÓn vi lµ ph¬ng ph¸p t¬ng ®èi nhanh nhng sù h¹n chÕ cña ph¬ng ph¸p nµy lµ tèn søc lao ®éng vµ kh«ng cã kh¶ n¨ng ph©n biÖt ®îc tÕ bµo sèng vµ tÕ bµo chÕt. §Ó gi¶m bít nh÷ng h¹n chÕ dùa trªn viÖc nu«i cÊy vµ sö dông kÝnh hiÓn vi, c¸c ph¬ng ph¸p kh¸c ®· ra ®êi. C¸c ph¬ng ph¸p nµy bao gåm: Ph¬ng ph¸p ®o mµu dùa trªn sù gi¶i phãng cña thuèc nhuém khái c¬ chÊt bëi enzym, test khö thuèc nhuém vµ sù ph¸t huúnh quang ATP (5, 7, 12). MÆc dï c¸c ph¬ng ph¸p dùa trªn ®Æc tÝnh sinh hãa vµ sinh lý häc rÊt nhanh nhng chóng thiÕu tÝnh ®Æc hiÖu tuyÖt ®èi. Do ®ã, ngêi ta nghi ngê liÖu ph¬ng ph¸p kh«ng nu«i cÊy nµy cã ®em l¹i nh÷ng ®¶m b¶o vÒ chÊt lîng vµ tÝnh an toµn kh«ng. Cã nhiÒu ph¬ng ph¸p nhanh vµ tù ®éng hãa ®· ®îc øng dông trong nghiªn cøu vi sinh vËt trong thùc phÈm trong thêi gian võa qua. Tuy nhiªn, c¸c ph¬ng ph¸p nµy cha ®em l¹i hiÖu qu¶. Flow cytometry lµ mét ph¬ng ph¸p thÝch hîp, ®¸p øng yªu cÇu ®a d¹ng vµ ®Æc hiÖu trong viÖc ph©n tÝch vi sinh vËt trong s÷a vµ c¸c s¶n phÈm s÷a trong cïng mét thiÕt bÞ (6,7). FCM cã ®é ®Æc hiÖu rÊt cao, tr¸nh ®îc viÖc nu«i cÊy hoÆc viÖc lµm giµu vµ cã thÓ võa ®Þnh tÝnh l¹i võa ®Þnh lîng ®îc c¸c vi sinh vËt cã trong s÷a. Sö dông kÕt hîp thuèc nhuém huúnh quang hoÆc c¬ chÊt flogenic kÕt hîp víi FCM sÏ cho phÐp ph¸t hiÖn vµ ph©n biÖt c¸c vi sinh vËt cã vµ kh«ng cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy, c¸c vi sinh vËt kh«ng sèng. H¬n n÷a, cã nh÷ng tÕ bµo vi sinh vËt dï chiÕm sè lîng rÊt lín hoÆc rÊt Ýt còng cã thÓ ph¸t hiÖn vµ ph©n biÖt ®îc víi c¸c loµi tÕ bµo vi khuÈn hoÆc c¸c h¹t kh«ng ph¶i vi khuÈn kh¸c b»ng c¸ch kÕt hîp víi FCM vµ c¸c kh¸ng thÓ ®¸nh dÊu huúnh quang ®Æc hiÖu hoÆc c¸c mÉu dß oligonucleotide. II.1. §Æc ®iÓm cña hÖ vi sinh vËt nhiÔm t¹p trong s÷a b»ng FCM ( Th«ng thêng víi ®iÒu kiÖn vÖ sinh tèt th× trong s÷a vÉn lu«n chøa mét lîng lín tÕ bµo (kho¶ng tõ 100.000 – 200.000 tÕ bµo/ml s÷a) vµ cã mét hÖ vi sinh vËt ®a d¹ng gåm nÊm men, nÊm mèc, x¹ khuÈn, vi khuÈn. Trong c¸c ®èi tîng trªn, th× vi khuÈn ®îc quan t©m nhiÒu h¬n c¶ v× trong s÷a chóng thêng ph¸t triÓn vît tréi. Vi khuÈn trong s÷a hay gÆp nhÊt lµ nhãm vi khuÈn lactic nh Streptococus lactic, S. diaxetylatic, S. paracitrovorus, lactobacillus bulgariym, L. lactic, L. acidophilum, L. hevelticum. CNSH 2006-2008 23 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy NÕu loµi nhiÔm t¹p lµ nh÷ng vi sinh vËt g©y bÖnh hoÆc g©y ngé ®éc th× chóng kh«ng nh÷ng lµm gi¶m chÊt lîng s÷a mµ cßn rÊt nguy hiÓm cho ngêi sö dông. Mét sè loµi vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng l©y nhiÔm vµo s÷a nh: Bacillus cereus, Brucella abortus, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Salmonella, Mycobacterium bovis, Shigella, Sataphylococus aureus, Streptococus, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica. II.2. Nghiªn cøu ph¸t hiÖn vµ ®Þnh lîng vi khuÈn trong s÷a II.2.1. Ph¸t hiÖn vi khuÈn trong s÷a b»ng FCM ThÝ nghiÖm ®îc tiÕn hµnh víi 6 mÉu: A. E. coli trong PBS B. S. aureus trong PBS C. S÷a tiÖt trïng kh«ng bæ sung E. coli D. S÷a bæ sung E. coli vµ lo¹i chÊt bÐo E. S÷a bæ sung E. coli, lo¹i bÐo vµ xö lý protease F. S÷a bæ sung S. aureus, lo¹i bÐo vµ xö lý protease Trong ®ã, quÇn thÓ E. coli vµ S. areus lµ hai quÇn thÓ ®¹i diÖn cho 2 nhãm: H×nh que, gram d¬ng vµ h×nh cÇu, Gram ©m. Sau khi nu«i l¾c ë 28 0C trong 16h, chóng ®îc nhiÔm nh©n t¹o vµo s÷a nh»m nghiªn cøu sö dông FCM. KÕt qu¶ cho thÊy, FCM cã thÓ dÔ dµng ph¸t hiÖn ra 2 quÇn thÓ E. coli vµ S. areus trong mÉu A, B (H×nh II.1.A, B). ë mÉu C, khi s÷a ®· tiÖt trïng vµ kh«ng nhiÔm E. coli, FCM kh«ng ph¸t hiÖn ra ®îc bÊt cø quÇn thÓ nµo. §iÒu nµy cã thÓ lµ do sù xuÊt hiÖn cña c¸c h¹t protein vµ lipid kh«ng cã kh¶ n¨ng b¸m ®Æc hiÖu vµo thuèc nhuém huúnh quang vµ g©y c¶n trë cho viÖc nhuém vµ ph¸t hiÖn vi khuÈn (H×nh II.1.C). Trong mÉu D (H×nh II.1.D), s÷a ®· ®îc ly t©m lo¹i bá lipid mµ kh«ng xö lý víi protease còng kh«ng thÝch hîp ®Ó ph¸t hiÖn ra vi khuÈn. Do ®ã, c¶n trá chÝnh ®èi víi viÖc ph©n tÝch FCM cña s÷a lµ do sù xuÊt hiÖn cña c¸c ph©n tö protein. Do ®ã, nghiªn cøu ®· xö dông enzyme protease ®Ó xö lý lo¹i bá protein vµ do ®ã cho phÐp ph©n biÖt ®îc c¸c vi khuÈn b»ng FCM (H×nh II.1.E, F). II.2.2. Nhuém nhuém huúnh quang vµ FCM C¸c tÕ bµo vi khuÈn trong c¸c mÉu s÷a ®· ®îc xö lý ®îc nhuém víi SYTO BC (kÝch thÝch vµ ph¸t x¹ ë bíc sãng 480 – 500nm). SYTO BC lµ lo¹i thuèc nhuém cã ¸i lùc cao víi acid nucleic. Nã thÊm qua c¶ thµnh tÕ bµo vi khuÈn Gram d¬ng vµ Gram ©m vµ t¹o tÝn hiÖu huúnh quang mµu xanh l¸ c©y. SYTO BC ®îc pha lo·ng 1 : 20 lÇn trong dimethylsulfoxide vµ ®îc trén víi dÞch chøa tÕ bµo (1 : 50), sau ®ã ñ ë 37 0C trong 5 – 10 phót. Kh¶ n¨ng sèng sãt cña CNSH 2006-2008 24 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy canh trêng vi khuÈn ®îcx¸c ®Þnh b»ng c¸ch nhuém mÉu víi propidium iodide (PI) (1mg/ml trong dimethyl sulfoxide) and SYTO BC. PI bÞ ng¨n bëi mµng plasma, do ®ã chØ cã nh÷ng tÕ bµo chÕt míi hÊp thô PI (húnh quang mµu vµng hoÆc ®á) C¸c mÉu ®· nhuém ®îc ph©n tÝch sö dông FACScan flow cytometer (chØ ph©n tÝch) hoÆc FACSCalibur flow cytometer (Ph©n lo¹i tÕ bµo) (BectonDickinson, Sydney, Australia). C¶ 2 thiÕt bÞ ®Òu ®îc trang bÞ ®Ìn argon 15mV ph¸t x¹ ¸nh s¸ng ë bíc sãng 488nm. dÞch trong thiÕt bÞ lµ Osmosol (LabAids Pty. Ltd., Sydney, Australia). Ngoµi ra cßn cã thiÕt bÞ khóc x¹ ¸nh s¸ng tríc (>150), thiÕt bÞ khóc x¹ ¸nh s¸ng bªn (605nm). Ngìng ph¸t hiÖn ®îc ®iÒu chØnh cho FL1 ®Ó lo¹i bá c¸c ph©n tö ph¸t x¹ huúnh quang mµu xanh ë díi tin cËy mµ vi khuÈn hßa trong PBS vµ ®îc nhuém SYTO. Sù bï ®îc thiÕt lËp ®Ó lo¹i sù ph¸t quang FL2 khái kªnh FL1 vµ FL1 khái FL2. ViÖc cµi ®Æt nµy ®îc sö dông thêng xuyªn trong ph©n tÝch E. coli vµ S. aureus b»ng FACScan FCM trong mÉu s÷a UHT vµ vi khuÈn tæng sè trong mÉu s÷a nguyªn liÖu sö dông FACSCalibur ®îc ®a ra ë b¶ng 1. §Õm vi khuÈn b»ng FCM ®· thu ®îc b»ng c¸ch chuÈn hãa sè trêng hîp x¶y ra trong nh÷ng vïng chÊm, nã x¸c ®Þnh nh÷ng quÇn thÓ trong mÉu ®îc ph©n tÝch. D÷ liÖu thu ®îc tõ FCM ®îc chuyÓn ®æi tõ Hewlett Packard thµnh d¹ng PC sö dông ch¬ng tr×nh computer HP Reader vµ ®îc ph©n tÝch b»ng ch¬ng tr×nh Windows Multiple Document Interface FCM application. B¶ng II.1. Cµi ®Æt FCM cho viÖc ph¸t hiÖn quÇn thÓ trong mÉu s÷a MÉu FL1 Cµi ®Æt detector % bï FSC SSC FL1 FL2 FL3 FR1-FL2 FL2-FL1 E. coli 416 E02 326 770 770 770 88.8 24.5 S. aureus 436 E02 333 755 763 777 75.3 24.5 S÷a nliÖu 357 E02 505 638 590 646 78.1 24.7 CNSH 2006-2008 25 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh II.1. BiÓu ®å kÕt qu¶ ph¸t hiÖn vi khuÈn trong s÷a UHT b»ng FCM G. E. coli trong PBS H. S. aureus trong PBS I. S÷a kh«ng bæ sung E. coli J. S÷a bæ sung E. coli vµ lo¹i chÊt bÐo K. S÷a bæ sung E. coli, lo¹i bÐo vµ xö lý protease L. S÷a bæ sung S. aureus, lo¹i bÐo vµ xö lý protease CNSH 2006-2008 26 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy §Ó ph©n lo¹i tÕ bµo, FACSCalibur flow cytometer ®· ®îc sö dông. C¸c vïng ph©n lo¹i ®îc x¸c ®Þnh b»ng ®å thÞ 2 biÕn sè, nã m« t¶ ra 2 quÇn thÓ ph©n biÖt. Nh÷ng giät nhá thu ®îc ®îc ®a vµo mµng läc cã ®êng kÝnh lç 0,02μm (Millipore Pty. Ltd., Sydney, Australia) vµ ®îc kiÓm tra sö dông kÝnh hiÓn vi huúnh quang. C¸c mÉu ®· ®îc ph©n lo¹i ®îc pha lo·ng vµ tr¶i 100μl lªn trªn ®Üa petri ®Ó kh¼ng ®Þnh tÝnh ®ång nhÊt vµ kh¶ n¨ng sèng sãt. II.2.3. Quan s¸t kÝnh hiÓn vi vµ ®Õm trªn ®Üa Sö dông kÝnh hiÓn vi huúnh quang cã vËt kÝnh 10X, 40X, 100X ®Ó kh¼ng ®Þnh vµ ®Õm tÕ bµo. Sù kÝch thÝch cña c¸c tÕ bµo ®· nhuém SYTO BC hoÆc PI ®îc ®Ìn Hg 100W cïng víi mét phiÕn läc chÆn thÝch hîp t¹o ra sù kÝch thÝch ë bíc sãng 450 – 490nm vµ sù kiÓm tra ë bíc sãng 520nm. §Õm trùc tiÕp dÞch huyÒn phï vi khuÈn trªn kÝnh hiÓn vi ®îc thùc hiÖn sö dông kÝnh hiÓn vi bright-field vµ buång ®Õm Thoma. Ph¬ng ph¸p ®Õm trªn ®Üa ®îc sö dông ®Ó x¸c ®Þnh sè tÕ bµo sèng. DÞch huyÒn phï E. coli vµ S. aureus trong s÷a ®îc pha lo·ng vµ cÊy tr¶i 100μl mçi nång ®é lªn 3 ®Üa. §Ó ph©n biÖt sù kh¸c nhau gi÷a E. coli, sö dông ®Ýa th¹ch Chromocult coliform agar (Merck Pty. Ltd., Sydney, Australia), vµ Baird-Parker agar (Merck Pty. Ltd.) bæ sung lßng ®á trøng sö dông cho S. aureus. C¸c khuÈn l¹c ®îc ®Õm sau 24 – 48h nu«i cÊy ë 37 0C. Lîng tÕ bµo sèng trong s÷a nguyªn liÖu ®îc x¸c ®Þnh bëi ph¬ng ph¸p ®Õm chuÈn. Ph©n tÝch sè liÖu ®Ó thÊy ®íc sù kh¸c nhau ý nghÜa gi÷a c¸c ph¬ng ph¸p. Sù t¬ng quan gi÷a ph¬ng ph¸p FCM víi ph¬ng ph¸p ®Õm tæng sè trªn ®Üa vµ ph¬ng ph¸p ®Õm tæng sè trªn kÝnh hiÓn vi. ViÖc nhuém kÐp canh trêng vi khuÈn víi PI vµ SYTO BC cho thÊy r»ng dÞch nu«i vi khuÈn 16h cã 99 % sèng sãt. UHT milk ®îc nhiÔm E. coli vµ S. aureus víi nång ®é kh¸c nhau tõ 103 – 108 /ml lµ ®¸ng tin cËy (P = 0,05), kh¸c víi sè liÖu tõ ph¬ng ph¸p ®Õm ®Üa mÆc dï FCM íc ®o¸n 1 con sè lín h¬n tÕ bµo ë møc 103/ml (h×nhII.2A). §èi víi S. aureus, sè ®o ®îc ë FCM lµ cã ý nghÜa (P = 0,05) kh¸c víi sè liÖu thu ®îc b»ng ph¬ng ph¸p ®Õm ®Üa trong kho¶ng 103 – 108 tÕ bµo/ml (H×nh II.2.B). CNSH 2006-2008 27 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh II.2. So s¸nh sè tÕ bµo thu ®îc tõ FCM b»ng phêng ph¸p ®Õm ®Üa (Vi khuÈn ®îc nhiÔm vµo s÷a UHT ë møc 103-108tÕ bµo/ml) A. E. coli B. S. aureus §Õm b»ng FCM §Õm b»ng ®Üa th¹ch II.2.4. Sè lîng vi khuÈn trong s÷a nguyªn liÖu S÷a nguyªn liÖu ®· ®îc lµm l¹nh 48h ë 40, lÊy tõ nhµ m¸y s÷a vµ ®îc kiÓm tra trong ngµy. Kh«ng nh s÷a UHT, khi protease K vµ savanase ®îc sö dông riÔng rÏ trong s÷a nguyªn liÖu, kh«ng cã vïng quÇn thÓ nµo ®îc quan s¸t b»ng FCM. §iÒu nµy hÇu nh lµ do c¸c protein ®· ®îc xö lý nhiÖt ®· bÞ biÕn tÝnh mét phÇn CNSH 2006-2008 28 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy hoÆc toµn bé th× nh¹y c¶m h¬n protein ho¹t ®éng trong s÷a nguyªn liÖu. Tuy nhiªn, sau khi xö lý protein bæ sung, quÇn thÓ cã thÓ ®îc t¸ch ra khái c¸c h¹t s÷a dùa vµo ®Æc tÝnh t¸n s¸c ¸nh s¸ng (H×nh II.3.A). Xö lý d÷ liÖu thu ®îc cho thÊy cã sù t¬ng quan cã ý nghÜa (P < 0,01) vµ nhÊt qu¸n (r = 0,91) gi÷a FCM vµ ph¬ng ph¸p ®Õm trªn ®Üa (F3). FCM íc lîng sè lîng vi sinh vËt tæng sè trong c¸c mÉu do SYTO BC liªn kÕt víi c¸c tÕ bµo cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy, kh«ng cã kh¶ n¨ng nu«i cÊy vµ tÕ bµo chÕt. MÆt kh¸c sè tÕ bµo ®Õm ®îc trªn ®Üa ®¹i diÖn cho nh÷ng tÕ bµo nu«i cÊy ®îc. Do ®ã, ph¬ng ph¸p ®Õm cã Ýt tÕ bµo h¬n so víi ph¬ng ph¸p FCM. Trong c¶ 2 ph¬ng ph¸p, c¸c côm hoÆc chuçi vi khuÈn ®Òu cã xu híng ®îc coi lµ 1 ®¬n vÞ nªn kÕt qu¶ dÉn tíi sù íc ®ãan kh«ng hoµn toµn ®óng vÒ tæng sè tÕ bµo. CNSH 2006-2008 29 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy H×nh II.3. A. Ph¸t hiÖn vi khuÈn trong s÷a nguyªn liÖu sö dông FCM. (Vïng ®îc bao lµ quÇn thÓ vi khuÈn) B. Sù t¬ng quan gi÷a vi khuÈn tæng sè trong s÷a nguyªn liÖu thu ®îc tõ FCM vµ ph¬ng ph¸p ®Õm ®Üa CNSH 2006-2008 30 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy II.2.5. TiÒm n¨ng cña FCM trong ph©n tÝch vi sinh vËt häc ë s÷a Nghiªn cøu nµy gi¶i thÝch kh¶ n¨ng cña FCM trong viÖc x¸c ®Þnh tæng sè vi khuÈn sau khi lµm s¹ch s÷a vµ nhuém víi thuèc nhuém huúnh quang. §é nh¹y cña FCM ≤ 104 tÕ bµo/ml. Giíi h¹n ph¸t hiÖn nµy thÊp h¬n giíi h¹n an toµn cña nhiÒu níc (14). ThÝ nghiÖm kÐo dµi kho¶ng 45 – 60 phót phô thuéc vµo s÷a nguyªn liÖu hay s÷a ®· qua chÕ biÕn ®îc ph©n tÝch. Thêi gian ph©n tÝch FCM tæng sè kho¶ng 30 – 2 phót phô thuéc sè lîng vi khuÈn trong s÷a. Thêi gian nµy Ýt h¬n nhiÒu so víi thêi gian ¸p dông c¸c ph¬ng ph¸p nu«i cÊy mÊt 72h (8). C«ng viÖc th«ng b¸o ë ®©y lµ bíc ®Çu tiªn trong viÖc ph¸t triÓn FCM trong viÖc kiÓm soat nhanh chÊt lîng vi sinh cña s÷a. Mét vµi vÝ dô trong ®ã c¸c vi khuÈn g©y bÖnh ®îc ph¸t hiÖn b»ng FCM. VÝ dô, kÜ thuËt ®¸nh dÉu huúnh quang ®· ®îc sö dôgn ®Ó ph¸t hiÖn Listeria monocytogenes (9) trong s÷a nguyªn liÖu vµ Salmonella spp. trong s÷a nguyªn liÖu vµ s÷a ®· chÕ biÕn (4,16,17,19). Ngoµi ra, FCM cßn thÝch hîp cho viÖc kiÓm so¸t nh÷ng vi khuÈn trong s÷a nguyªn liÖu lµm l¹nh l¹nh, s÷a thanh trïng vµ s÷a ®ång nhÊt, flavored milk drinks vµ c¸c vi khuÈn cã kh¶ n¨ng sèng. Nh÷ng c«ng viÖc nµy cho thÊy tiÒm n¨ng cña FCM trong nh÷ng øng dông vÒ vi sinh häc c¸c s¶n phÈm s÷a. Nh÷ng øng dông nµy bao gåm viÖc kiÓm tra tiªu chuÈn s÷a nguyªn liÖu, ®Æc ®iÓm kÜ thuËt, kiÓm so¸t hiÖu qu¶ s¶n xuÊt, thùc hµnh c¸c qui ®Þnh vÒ vÖ sinh vµ dù b¸o vÒ b¶n th©n s¶n phÈm s÷a. Kh¶ n¨ng sö dông 1 thiÕt bÞ ®Ó chÈn ®o¸n nhanh vi sinh vËt cã nh÷ng thuËn lîi râ rµng cho c«ng nghÖ s¶n xuÊt s÷a vît qua t×nh h×nh hiÖn t¹i khi mµ viÖc nu«i cÊy, kÝnh hiÓn vi hoÆc 1 vµi thiÕt bÞ chuyªn dông ®Òu cÇn. kÕt luËn Nh vËy, cã rÊt nhiÒu ph¬ng ph¸p ®Ó ®Þnh lîng vi sinh vËt trong hÖ sinh th¸i. Mçi ph¬ng ph¸p ®Òu cã nh÷ng u ®iÓm vµ nhîc ®iÓm riªng. Do ®ã mçi ph¬ng ph¸p cã ph¹m vi øng dông riªng. ChÝnh v× vËy, tïy môc ®Ých nghiªn cøu cô thÓ, víi tõng mÉu sinh th¸i cô thÓ mµ cã sù lùa chän thÝch hîp. CNSH 2006-2008 31 TiÓu luËn Sinh th¸i Vi sinh vËt Ph¹m KiÒu Thóy Ngµy nay, khoa häc kÜ thuËt ngµy cµng ph¸t triÓn, do ®ã ngµy cµng cã nhiÒu kÜ thuËt víi m¸y mãc hiÖn ®¹i ®a vµo nghiªn cøu vµ ®Þnh lîng vi sinh vËt. C¸c ph¬ng ph¸p nµy cã u ®iÓm vît tréi so víi c¸c ph¬ng ph¸p dùa trªn tÝnh chÊt nu«i cÊy truyÒn thèng. Nã kh«ng chØ cã u thÕ vÒ mÆt thêi gian mµ cßn rÊt nhanh vµ chÝnh x¸c. V× vËy, c¸c ph¬ng ph¸p nµy ®îc øng dông nhiÒu trong y häc, chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ bÖnh do vi sinh vËt. §ång thêi, chòng còng ®îc ¸p dông trong s¶n xuÊt thùc phÈm nh»m tèi u chÊt lîng vi sinh cña nguyªn liÖu ®Çu vµo vµ ®Çu ra, dù ®o¸n ®îc nguy c¬ cña b¶n th©n thùc phÈm. Nh÷ng øng dông nµy cã vai trß v« cïng quan träng ®èi víi søc kháe con ngêi. Bªn c¹nh nh÷ng ph¬ng ph¸p míi hiÖn ®¹i, nh÷ng ph¬ng ph¸p truyÒn thèng vÉn gi÷ mét vai trß quan träng kh«ng thÓ thiÕu ®îc trong nghiªn cøu vi sinh vËt. ChÝnh v× vËy, viÖc kÕt hîp sö dông c¸c ph¬ng ph¸p se ®em l¹i hiªu qu¶ cao táng nghiªn cøu vi sinh vËt häc. CNSH 2006-2008 32 [...]... xác định đợc lợng kháng nguyên virus rota có mặt trong mẫu nghiên cứu II phát hiện và định lợng vi khuẩn tổng số trong sữa bằng Phơng pháp flow cytometry (FCM) CNSH 2006-2008 22 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy Thành phần vi sinh vật trong sữa nguyên liệu ảnh hởng đến chất lợng sữa thành phẩm và các sản phẩm sữa khác Có một vài phơng pháp đã đợc đa ra để phát hiện và định lợng đợc các vi. .. này để định lợng vi khuẩn trong mẫu nớc biển Vi c định lợng sinh khối của các tế bào phát triển dị dỡng có ý nghĩa vì nó có liên quan đến sự phân bố của vật chất hữu cơ trong biển Xác định sinh khối bằng định lợng ATP phụ thuộc vào nguyên tắc rằng tất cả các tế bào, kể cả động vật hoặc thực vật đều CNSH 2006-2008 19 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy có chứa ATP và giả định rằng 1) không... sự sản xuất oxy của sinh vật đơn bào Ngoài ra, FCM còn đợc sử dụng để xác định kích cỡ, cấu trúc và các thụ thể đặc hiệu của các tế bào riêng lẻ ứng dụng trong nghiên cứu thực vật: CNSH 2006-2008 18 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy FCM đợc sử dụng hiệu quả trong vi c xác định các gen biểu hiện ở cây thuốc lá chuyển gen I.5 Phơng pháp phân tích dựa trên các đặc tính sinh hóa (17) I.5.1... đa dạng và đặc hiệu trong vi c phân tích vi sinh vật trong sữa và các sản phẩm sữa trong cùng một thiết bị (6,7) FCM có độ đặc hiệu rất cao, tránh đợc vi c nuôi cấy hoặc vi c làm giàu và có thể vừa định tính lại vừa định lợng đợc các vi sinh vật có trong sữa Sử dụng kết hợp thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc cơ chất flogenic kết hợp với FCM sẽ cho phép phát hiện và phân biệt các vi sinh vật có và không có... xuất, thực hành các qui định về vệ sinh và dự báo về bản thân sản phẩm sữa Khả năng sử dụng 1 thiết bị để chẩn đoán nhanh vi sinh vật có những thuận lợi rõ ràng cho công nghệ sản xuất sữa vợt qua tình hình hiện tại khi mà vi c nuôi cấy, kính hiển vi hoặc 1 vài thiết bị chuyên dụng đều cần kết luận Nh vậy, có rất nhiều phơng pháp để định lợng vi sinh vật trong hệ sinh thái Mỗi phơng pháp đều có những... không có khả năng nuôi cấy, các vi sinh vật không sống Hơn nữa, có những tế bào vi sinh vật dù chiếm số lợng rất lớn hoặc rất ít cũng có thể phát hiện và phân biệt đợc với các loài tế bào vi khuẩn hoặc các hạt không phải vi khuẩn khác bằng cách kết hợp với FCM và các kháng thể đánh dấu huỳnh quang đặc hiệu hoặc các mẫu dò oligonucleotide II.1 Đặc điểm của hệ vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa bằng FCM ( Thông... phơng pháp có phạm vi ứng dụng riêng Chính vì vậy, tùy mục đích nghiên cứu cụ thể, với từng mẫu sinh thái cụ thể mà có sự lựa chọn thích hợp CNSH 2006-2008 31 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy Ngày nay, khoa học kĩ thuật ngày càng phát triển, do đó ngày càng có nhiều kĩ thuật với máy móc hiện đại đa vào nghiên cứu và định lợng vi sinh vật Các phơng pháp này có u điểm vợt trội so với các. .. (Vùng đợc bao là quần thể vi khuẩn) B Sự tơng quan giữa vi khuẩn tổng số trong sữa nguyên liệu thu đợc từ FCM và phơng pháp đếm đĩa CNSH 2006-2008 30 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy II.2.5 Tiềm năng của FCM trong phân tích vi sinh vật học ở sữa Nghiên cứu này giải thích khả năng của FCM trong vi c xác định tổng số vi khuẩn sau khi làm sạch sữa và nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang Độ nhạy... bào Các vi sinh vật có kích thớc càng lớn thì càng chứa nhiều AK Enzym AK trong vi khuẩn có khả năng xúc tác tổng hợp ATP gấp 40 lần so với lợng ATP của bản thân vi khuẩn đó trong 1 phút Nếu CNSH 2006-2008 20 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy phản ứng vẫn diễn ra trong 25 phút, lợng ATP có thể đạt gấp 1000 lần so với lợng ATP của vi khuẩn ban đầu Trong thực tế hiện nay, công nghệ AK dựa... phơng pháp đếm có ít tế bào hơn so với phơng pháp FCM Trong cả 2 phơng pháp, các cụm hoặc chuỗi vi khuẩn đều có xu hớng đợc coi là 1 đơn vị nên kết quả dẫn tới sự ớc đóan không hoàn toàn đúng về tổng số tế bào CNSH 2006-2008 29 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy Hình II.3 A Phát hiện vi khuẩn trong sữa nguyên liệu sử dụng FCM (Vùng đợc bao là quần thể vi khuẩn) B Sự tơng quan giữa vi khuẩn ... thái vì: Chỉ có khả phát định lợng vi sinh vật sống có khả nuôi cấy đợc mà không xác định đợc vi sinh vật sống khả nuôi cấy đợc CNSH 200 6-2 008 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy Cần.. .Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy Nguyên lý: Phơng pháp nhằm đếm số lợng tế bào vi sinh vật thể tích xác định dịch huyền phù nghiên cứu trực tiếp dới kính hiển vi dựa vào vi c... hữu biển Xác định sinh khối định lợng ATP phụ thuộc vào nguyên tắc tất tế bào, kể động vật thực vật CNSH 200 6-2 008 19 Tiểu luận Sinh thái Vi sinh vật Phạm Kiều Thúy có chứa ATP giả định 1) ATP