Đang tải... (xem toàn văn)
Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào Giáo trình công nghệ tế bào
LỜI NÓI ĐẦU Hiện nay, Công nghệ sinh học là một trong những ngành khoa học mũi nhọn. Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở quy mô công nghiệp có sự tham gia của các tác nhân sinh học dựa trên các thành tựu tổng hợp của nhiều ngành khoa học, phục vụ cho việc tăng của cải vật chất của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người. Nuôi cấy mô thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Giáo trình Công nghệ tế bào thực vật này cung cấp những kiến thức cơ bản cho sinh viên với các nội dung chính sau: - Tính toàn thể của tế bào - Môi trường dinh dưỡng - Nhân giống in vitro thực vật - Thụ phấn in vitro và nuôi cấy phôi hữu tính - Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn - Protoplast thực vật - Biến dị dòng soma - Biến nạp di truyền ở thực vật - Sản xuất các cây sạch bệnh virus - Sản xuất các hợp chất thứ cấp Chúng tôi là những giảng viên trẻ khả năng còn hạn chế, chưa có kinh nghiệm nhiều nên giáo trình sẽ có nhiều thiếu sót . Vì thế, chúng tôi mong nhận được nhiều ý kiến đóng góp của các đồng nghiệp và bạn đọc để chúng tôi có bản giáo trình hoàn thiện hơn. Chúng tôi xin chân thành PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã cho chúng tôi tham khảo giáo trình và sử dụng làm tài liệu chính cho phần viết giáo trình. Chúng tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Lương Thực Thực phẩm cùng phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế đã tạo điều kiện để chúng tôi hoàn thành giáo trình này. Các tác giả 1 Chương 1. GIỚI THIỆU VỀ TÍNH TOÀN THỂ CỦA TẾ BÀO 1. HỌC THUYẾT TẾ BÀO Tất cả các cơ thể sống (ngoại trừ virus) đều được cấu tạo từ những đơn vị cơ bản rất bé được gọi là tế bào . Tế bào đầu tiên được phát hiện bởi R .Hooke từ năm 1665 khi ông quan sát cấu trúc của miếng bấc bần của thực vật với kính hiển vi có độ phóng đại gấp 30 lần. Ông thấy có nhiều hạt nhỏ, ông gọi các hạt nhỏ đó là tế bào (cells). Năm 1675, Anton Van Leeuwenhoek xác nhận cơ thể động vật cũng bao gồm các tế bào. Ông quan sát dưới kính hiển vi thấy máu động vật có chứa các hồng cầu và ông gọi đó là các tế bào máu . Nhưng mãi đến năm 1838, Matthias Jacob Schleiden (nhà thực vật học ) và 1839, Theodor Schwann (nhà động vật học ) mới chính thức xây dựng học thuyết tế bào. Schleiden và Schwann khẳng định rằng : Mỗi cơ thể động thực vật đều bao gồm những thể tồn tại hoàn toàn độc lập , riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào . Có thể nói Schleiden và Schwann là hai ông tổ của học thuyết tế bào . Tuy nhiên, cả hai ông không phải là các tác giả đầu tiên phát biểu một nguyên tắc nào đó , mà chỉ là diễn đạt nguyên tắc ấy rõ ràng và hiển nhiên tới mức nó được phổ biến rộng rãi và cuối cùng đã được đa số các nhà sinh học thời ấy thừa nhận. Ngày nay, các nhà sinh học quan niệm rằng, tế bào là đơn vị tổ chức cơ bản của sự sống cả về cấu trúc, chức năng và di truyền, có nghĩa là sự sống chỉ thể hiện trong tổ chức tế bào và trong các cấp độ có cấu tạo tế bào. Những cơ thể đơn bào như vi khuẩn, amip hay trùng lông Paramecium thì cơ thể chúng chỉ gồm một tế bào nhưng chúng có đầy đủ đặc tính của cơ thể sống giống như chuột gồm hàng tỷ tế bào. Có thể nói tất cả các hoạt động sống của cơ thể như trao đổi chất, trao đổi năng lượng, dinh dưỡng, tiêu hóa, bài tiết, phản ứng thích nghi với môi trường sinh trưởng, sinh sản, di truyền,… đều có sơ sở tế bào. 2. TÍNH TOÀN THỂ CỦA TẾ BÀO 2.1. Tính toàn thể của tế bào Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thể của tế bào . Theo ông mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều đó theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là : Mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Từ năm 1898, Haberlandt đã bắt đầu những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn tách từ nhu mô lá , tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật nhưng không thu được kết quả nào cả . Ông viết : "Trong các thí nghiệm nuôi cấy của tôi chẳng bao giờ quan sát được tế bào phân chia . Vấn đề đặt ra cho các thí nghiệm nuôi cấy trong tương lai là phải xác đị nh cho được các điều kiện thích hợp mà ở đó tế bào riêng rẽ sẽ phải phân chia ". Hơn 50 năm sau các nhà thực nghiệm về nuôi cấy mô và tế bào thực vật mới chứng minh khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Tính toàn thể của tế bào thực vật đã được từng bước chứng minh . Nổi bật là các công trình theo thứ tự thời gian sau : Miller và Skoog (1953) tạo được rễ từ mảnh mô cắt từ thân cây thuốc lá, Reinert và Steward (1958) đã tạo được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch , Cocking (1960) tách được tế bào trần và Takebe (1971) tái sinh được cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần của lá cây thuốc lá. 2 Kỹ thuật tạo dòng (cloning) các tế bào đơn được phân lập trong điều kiện in vitro đã chứng minh một các tế bào soma , dưới các điều kiện thích hợp , có thể phân hóa để phát triển thành một cơ thể thực vật hoàn chỉnh . Sự phát triển của một cơ th ể trưởng thành từ tế bào đơn (hợp tử) là kết quả của sự hợp nhất sự phân chia và phân hóa tế bào. Để biểu hiện tính toàn thể, các tế bào phân hóa đầu tiên trải qua giai đoạn phản phân hóa (dedifferentiation) và sau đó l à giai đoạn tái phân hóa (redifferentiation). Hiện tượng tế bào trưởng thành trở lại trạng thái phân sinh và tạo ra mô callus không phân hóa (undifferentiation) được gọi là phản phân hóa , trong khi khả năng để các tế bào phản p hân hóa tạo thành cây hoàn chỉnh (whole plant ) hoặc các cơ quan thực vật được gọi là tái phân hóa . ở động vật , sự phân hóa (cytodifferentiation) là không thể đảo ngược trở lại. Như vậy, sự phân hóa tế bào là kết quả cơ bản của sự phát triển ở những cơ thể bậc cao. Sự tạo phôi dinh dưỡng cho thấy tính toàn thể của tế bào thực vật, đơn bội hoặc lưỡng bội. Sự khởi tạo phôi sinh dưỡng bao gồm sự tác động vết thương, kim loại nặng, sự thay pH, nguồn carbon, nồng độ carbon và nhiệt độ cao. Các công trình nghiên cứu trên đối tượng Cichorium và cà rốt chỉ ra rằng việc đạt được tính toàn năng và khả năng tạo phôi của các tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào sự thay đổi về phía thể đơn bội, là kết quả sự phản ứng của cơ thể với chất điều hòa sinh trưởng. 2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn có chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng. Quá trình phân hóa có thể biểu thị như sau: Tế bào phôi sinh →Tế bào dãn →Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Ví dụ: khi nuôi cấy mô thuốc lá, các tế bào đã phân hóa của lá gặp điều kiện thích hợp của môi trường sẽ phản phân hóa và phân chia liên tục tạo nên các mô sẹo (callus). Các tế bào mô sẹo không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá nữa. Nếu chuyển các callus này sang môi trường khác, tùy theo thành phần môi trường mà callus lại phân hóa theo hướng hình thành chồi, rễ và có thể hình thành nên cây hoàn chỉnh. Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước đây bị ức chế) để cho tính trạng mới, còn một số gen 3 khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào. Hầu hết các tế bào thực vật đã biệt hóa có thể phát triển thành callus hoặc huyền phù tế bào không biệt hóa dưới sự cảm ứng của một chế độ hormone nhất định, dẫn đến sự bất tử của tế bào thực vật. Các tế bào thực vật có khả năng phát triển đến một cấu trúc có biệt hóa bằng cách thay đổi chương trình phát sinh hình thái của nó. Tế bào mầm (tế bào có khả năng tự sinh sản và biệt hóa thành những loại mô khác nhau) có thể tồn tại trong trạng thái không biệt hóa và tùy theo sự phân chia có thể biệt hóa thành một hay nhiều loại tế bào phụ thuộc vào những tế bào cơ bản, từ đó các cơ quan bên sẽ được hình thành. Tế bào mầm được tìm thấy với lượng nhỏ trong mô phân sinh đỉnh chồi và mô phân sinh đỉnh rễ, tại đó những tế bào mầm này vẫn tồn tại trong trạng thái không biệt hóa trước khi trải qua quá trình biệt hóa tạo nên nhiều loại mô khác nhau. Những tế bào khối u hoặc những tế bào mô sẹo phát triển một con đường khác sự biệt hóa bình thường và có khả năng tăng sinh không giới hạn, mặc dù việc trở về trạng thái biệt hóa bình thường có thể được thực hiện bằng cách điều khiển các điều kiện của môi trường nuôi cấy. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và sự phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hai nhóm này sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau. Khi môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ auxin thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ, còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo. 2.3. Tế bào thực vật và sự phân bào Cơ thể sống cấu tạo từ một tế bào đơn độc hoặc một phức hợp các tế bào. Tế bào rất đa dạng, khác nhau về hình thái, kích thước, cấu trúc và chức năng. Tế bào động vật và tế bào thực vật là những biến đổi của cùng một kiểu cơ sở của đơn vị cấu trúc. Mỗi tế bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất: tế bào có thể thu nhận chất dinh dưỡng, chuyển hóa các chất này thành năng lượng, tiến hành các chức năng chuyên biệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết. Mọi tế bào đều có một số khả năng sau: - Sinh sản thông qua phân bào; - Trao đổi chất tế bào bao gồm thu nhận các vật liệu thô, chế biến thành các thành phần cần thiết cho tế bào, sản xuất các phân tử sinh năng lượng và sản xuất các sản phẩm phụ. Để thực hiện được các chức năng của mình, tế bào cần phải hấp thu và 4 sử dụng được nguồn năng lượng hóa học dự trữ trong các phân tử hữu cơ. Năng lượng này được giải phóng qua các con đường trao đổi chất; - Tổng hợp protein - Đáp ứng với các kích thích, hoặc thay đổi của môi trường bên trong và bên ngoài như những thay đổi về nhiệt độ, pH hoặc nguồn dinh dưỡng; - Di chuyển các túi tiết. 2.3.1. Tế bào thực vật Một tế bào thực vật đơn thường có đường kính khoảng 20-40µm và chiều dài khoảng 100-200 µm. Cấu trúc chính của tế bào thực vật tương tự các tế bào đặc trưng của eukaryote. Tuy nhiên, tế bào thực vật có những đặc điểm riêng biệt như thành tế bào dày, không bào lớn và có lục lạp. Cấu tạo tế bào thực vật được mô tả ở hình 1.1. Hình 1.1. Cấu tạo tế bào thực vật Tế bào thực vật được bọc chung quanh bởi thành tế bào. Lớp ngoài của thành tế bào có chứa pectin để giúp nó liên kết với tế bào bên cạnh. Lớp trong của thành tế bào là màng tế bào. Màng tế bào khác hoàn toàn với thành tế bào về hình dạng, thành phần và chức năng. Trong khi thành tế bào cứng rắn, có cấu trúc tương đối dày thì màng tế bào lại mỏng (khoảng 750A) và mềm dẻo. Màng tế bào bao gồm protein và lipid trong khi thành tế bào là carbonhydrate tự nhiên. Thành tế bào có chức năng nâng đỡ cho cây trong khi màng tế bào điều hòa sự vận chuyển các chất đi vào và ra khỏi tế bào. Không bào (vacuole) có vai trò tiếp nhận các chất thải của sự trao đổi chất hoặc các chất thứ cấp của thực vật. Ở các tế bào non không bào nhỏ và nhiều. Khi tế bào lớn dần và già đi thì không bào mở rộng thêm và kết nối thành một khối. Ở các tế bào thực vật trưởng thành không bào có thể chiếm đến 90% thể tích tế bào. Không bào được bọc chung quanh bởi màng nguyên sinh chất (plasma). Thành phần chính của các 5 không bào lớn là nước chứa các chất hòa tan như các ion vô cơ, các amino acid, các acid hữu cơ, các sắc tố hòa tan trong nước và các chất không hòa tan ở dạng tinh thể và hình kim. Ngoài ra, không bào cũng chứa các protein như các hydrolyse, catalase, photphotase. Lục lạp (chloroplast) là bào quan thực hiện quang hợp trong tế bào thực vật, nó chứa sắc tố lục (chlorophyll) phản ứng với ánh sáng để sản xuất các carbonhydrate. Nhân (nuclear) là trung tâm điều khiển các tế bào chứa DNA để phiên mã và dịch mã thành protein. Các protein tổng hợp được sắp xếp đóng gói trong các túi của bộ máy golgi. Nội sinh chất (endoplasmic reticulum) là mạng lưới của các ống nhỏ nối liền các phần khác nhau của tế bào. Ribosom được tập trung trên bề mặt của mạng lưới nội sinh chất và tham gia vào hoạt động sinh tổng hợp protein. Ty thể (mitochondria) chứa vật liệu di truyền và nhiều enzyme quan trọng trong sự trao đổi chất của tế bào. Cơ thể thực vật được cấu tạo từ những tế bào, mỗi tế bào được liên kết với những tế bào khác bởi chất kết dính gian bào bao quanh. Trong khối liên kết đó có những nhóm tế bào khác biệt về hình thái hoặc chức năng hoặc cả hai với những nhóm khác. Những nhóm như vậy gọi là mô. Một số mô có cấu tạo đơn giản, chỉ gồm một loại tế bào, những mô khác phức tạp hơn nhiều hơn một kiểu tế bào. Các mô tế bào trong cơ thể thực vật đều có nguồn gốc từ hợp tử (từ tế bào trứng đã thụ tinh qua các giai đoạn phát triển của phôi và sau đó phát triển thành cơ thể trưởng thành). Cơ thể thực vật sinh trưởng nhờ có mô phân sinh. Mô phân sinh ngọn phân chia và phân hóa thành các phần mới của chồi và rễ. Đó là sự sinh trưởng sơ cấp. Sự sinh trưởng thứ cấp ở thực vật hai lá mầm và hạt trần là do hoạt động của mô phân sinh thứ cấp được gọi là tầng phát sinh. Trong sinh trưởng thứ cấp còn có tầng phân sinh bần là mô phân sinh thứ cấp hình thành nên chu bì. Tầng phát sinh và tầng sinh bần được gọi là mô phân sinh bên vì nó ở vị trí bên của thân và rễ để phân biệt với mô phân sinh sơ cấp là mô phân sinh ngọn. Cơ thể thực vật có phôi phát triển từ khi hạt nẩy mầm gồm rễ phát triển xuống đất và chồi gồm thân mang lá phát triển trong khí quyển. Sự phát triển của chồi và rễ là từ các tế bào của mô phân sinh ngọn. Thân, lá, rễ được gọi là cơ quan dinh dưỡng. Khi trưởng thành thì hoa được hình thành. Sau khi thụ phấn là sự thụ tinh và sự hình thành phôi, hạt và quả. Những cơ quan đó gọi là cơ quan sinh sản. Chu trình phát triển của cơ thể thực vật có thể kể từ khi hợp tử hình thành và kết thúc trước khi xảy ra sự thụ tinh của các giao tử để tạo nên thế hệ sau. 2.3.2. Sự phân bào Thực vật có thể sinh trưởng, phát triển được nhờ ở sự phân bào. Có hai kiểu phân bào: gián phân (mitose) còn gọi là phân bào nguyên phân và giảm phân (meiose) còn gọi là phân bào giảm nhiễm. Trong nguyên phân các cơ quan tử (lục lạp, ty thể…) của tế bào được chia ra hai phần khá đều ở hai tế bào mới được hình thành. Riêng đối với nhân thì sự phân chia làm đôi được thực hiện rất chính xác nhờ sự phân đôi chính xác ở mức độ phân tử của các thể nhiễm sắc (NST). Ở thực vật, sự nguyên phân (hình 1.2) xảy ra ở các mô phân sinh. Quá trình nguyên nhiễm là quá trình phức tạp, gồm nhiều thời kỳ nối tiếp nhau: Kỳ trung gian, kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau và kỳ cuối. Mỗi kỳ có đặc trưng về cấu trúc và tập tính về NST, bộ máy phân bào. 6 Hình 1.2. Sự nguyên phân - Kỳ trung gian (interphage): Trong kỳ này, DNA của tế bào được nhân đôi nhờ enzyme DNA polymerase. Kỳ trung gian chia ra ba giai đoạn: G1, S, G2. Sinh tổng hợp DNA xảy ra trong giai đoạn S. - Kỳ đầu (Prophase): Kỳ đầu được tiếp theo sau pha G2 của kỳ trung gian, thường kéo dài từ 10 đến 15 phút. Các hiện tượng đặc trưng cho kỳ đầu là: + Hình thành NST: NST xuất hiện ở dạng các sợi xoắn dọc, mảnh, sắp xếp trong nhân. Về sau, NST thấy rõ hơn, nó gồm 2 sợi xoắn kép có tên là nhiễm sắc tử (chromatide). Hai nhiễm sắc tử trong 1 NST được đính lại với nhau bởi tâm động chung. Số nhiễm sắc tử trong một NST là gấp đôi số 2n (2n x 2). Đây là kết quả của sự nhân đôi NST qua giai đoạn S. Dần dần các NST xoắn lại và co ngắn lại, dày lên. + Màng nhân và hạch nhân có nhiều thay đổi: Hạch nhân giảm thể tích phân rã và biến mất. Màng nhân đứt ra thành nhiều đoạn và biến thành các bóng không bào bé phân tán trong tế bào chất, tạo điều kiện cho NST di chuyển ra ngoại vi tế bào. + Hình thành bộ máy phân bào: Các vi ống xếp phóng xạ quanh trung tử mới tạo thành sao phân bào. Hai sao di chuyển về 2 cực của tế bào. Giữa hai sao các vi ống phát triển sắp xếp thành hệ thống sợi có dạng hình thoi được gọi là thoi phân bào. - Kỳ giữa (Metaphase): Các NST tập trung vào giữa tế bào, các tâm động cùng nằm trên một mặt phẳng xích đạo. Thoi vô sắc được hình thành đầy đủ và có thể thấy 2 dạng sợi của nó. Một dạng sợi kéo dài qua suốt tế bào, nối với 2 cực của tế bào. Dạng sợi thứ 2 dính một đầu mút vào cực của tế bào và đầu mút kia vào tâm động của thể nhiễm sắc. Ở cuối trung kỳ, các nhiễm sắc tử phân tách nhau ra ở vùng giữa của nó. Kỳ giữa thường kéo dài từ từ 25 đến 30 phút. - Kỳ sau (Anaphase): Hậu kỳ bắt đầu từ lúc các NST phân tách nhau ra và di chuyển về các cực khác nhau. Bắt đầu tâm động phân đôi, các tâm động con tách nhau 7 ra mang theo các nhiễm sắc tử. Như vậy 2 nhiễm sắc tử trong 1 NST tách nhau ra và nhờ tâm động sẽ di chuyển về hai cực của tế bào theo sợi của thoi phân bào. Các nhiễm sắc thể đã trở thành NST con. Ở thời kỳ này bắt đầu hình thành nhân con, các màng nhân xuất hiện màng ngăn cách các tế bào chị em, các bào quan tử phân phối đều giữa các tế bào mới. Thời gian diễn ra kỳ sau là ngắn nhất, chỉ kéo dài từ 5 đến 8 phút. - Kỳ cuối (Telophase): Ở giai đoạn này, các NST con đã chuyển đến 2 cực, chúng dần mở xoắn và ẩn vào dịch tế bào giống như lúc bắt đầu tiền kỳ. Màng nhân được tái tạo hoàn toàn, hạch nhân xuất hiện. Đồng thời xảy ra quá trình phân chia tế bào chất. Quá trình phân chia tế bào chất xảy ra ở động vật và thực vật khác nhau. Sự giảm phân (Hình 1.3) là đặc trưng cho sự phân chia của các tế bào sinh dục. Do phân bào giảm nhiễm mà các giao tử có bộ NST đơn bội 1n và qua quá trình thụ tinh hợp tử lại có bộ NST lưỡng bội 2n. Giảm phân gồm có hai giai đoạn: Giảm phân I và giảm phân II. Hình1.3. Sự giảm phân Giảm phân I có thời gian kéo dài và rất phức tạp, đặc biệt là kỳ đầu I có thể kéo dài tới hàng ngày, hàng tháng thậm chí hàng năm. - Kỳ đầu I : Được phân thành 5 giai đoạn tuỳ theo tập tính của NST + Giai đoạn Leptonema (giai đoạn bó hoa): Xuất hiện các sợi NST xoắn đôi, co ngắn, có mang tâm động, rất khó nhận biết các NST trong giai đoạn này. 8 + Giai đoạn Zygonema (giai đoạn tiếp hợp): Giai đoạn này bắt đầu khi các NST tương đồng liên kết với nhau từng đôi một. Một chiếc trong cặp NST tương đồng có nguồn gốc từ bố, chiếc kia có nguồn gốc từ mẹ (từ giao tử đực và giao tử cái). Sự tiếp hợp của các NST tương đồng xảy ra một cách chính xác. Có thể đính với nhau từ đầu mút, sau đó, kéo dài dọc NST, cũng có thể đính với nhau ở nhiều đoạn cùng một lúc. Nhờ sự tiếp hợp mà các hạt nhiễm sắc, các điểm của sợi nhiễm sắc tương đồng này có thể tiếp cận với các hạt, các điểm của sợi tương đồng kia. Trong suốt quá trình tiếp hợp, NST vẫn giữ nguyên là một thể toàn vẹn. Điểm đặc trưng để nhận biết giai đoạn zigonem là sự tiếp hợp của các cặp NST tương đồng. + Giai đoạn Pachinema (giai đoạn trao đổi chéo): giai đoạn này tương đối dài, có thể kéo dài hằng ngày. Trong giai đoạn này sự tiếp hợp của các NST tương đồng kết thúc. Các NST tương đồng vẫn nằm tiếp cận nhau, chúng dày lên và co ngắn lại. Các NST ở đây đều là sợi đôi do 2 NST tương đồng dính sát vào nhau theo chiều dọc và được gọi là thể lưỡng trị (bivalent) gồm 2 đơn trị (mỗi NST tương đồng). Chúng có cặp tâm động riêng. Mỗi lưỡng trị có hai tâm động và gồm 4 sợi NST (chromatid). Trong giai đoạn này xảy ra hiện tượng trao đổi chéo giữa các cặp NST tương đồng. Sự trao đổi chéo biểu hiện 2 NST tương đồng trao đổi các cấu thành có chứa gen cho nhau. Hiện tượng trao đổi chéo có ý nghĩa hết sức quan trọng về mặt di truyền, vì nó dẫn đến sự tái tổ hợp của gen. + Giai đoạn Diplonema: Đặc trưng của diplonem là xuất hiện các lực đẩy giữa các thành viên tiếp hợp mà bắt đầu là từ tâm động, kết quả là các NST tương đồng tách nhau ra (các đơn vị tách ra). Nhưng sự tách ra không xảy ra toàn bộ chiều dọc, mà chúng vẫn dính với nhau ở một vài điểm, điểm đó gọi là hình chéo. Thường người ta xem hình chéo là dẫn chứng tế bào của hiện tượng trao đổi chéo đã xảy ra ở diplonem. + Giai đoạn Diakinese (giai đoạn sợi xoắn): Ở giai đoạn này, NST càng co ngắn lại. Các đơn trị tách nhau ra và thường nằm ở ngoại vi của nhân. Quá trình mút hóa của hình chéo tiếp tục, số hình chéo giữa NST mất dần vào đầu trung kỳ I, các NST chỉ dính với nhau ở chéo tận cùng. Màng nhân và hạch nhân biến mất, xuất hiện sao và thoi phân bào. Khi kỳ đầu kết thúc, tế bào chuyển vào kỳ giữa I, kỳ sau I, kỳ cuối I để hoàn thành phân chia tạo ra 2 tế bào đơn bội. - Kỳ giữa I: Các lưỡng trị xếp ở xích đạo theo kiểu cả 2 nhiễm sắc tử của mỗi cặp tương đồng đều hướng tâm động của mình về các cực đối diện. Các tâm động càng đẩy nhau mạnh hơn và các nhiễm sắc tử chuẩn bị để phân ly về 2 cực. - Kỳ sau I: Trong bộ 4 (lưỡng trị), mỗi đôi nhiễm sắc tử (đơn trị) vẫn dính nhau tâm động tách khỏi đôi kia và lập thành 2 bộ 2 và mỗi bộ 2 đi về một cực của tế bào. - Kỳ cuối I: Các bộ 2 gồm 2 nhiễm sắc tử đã đến các cực. Màng nhân và hạch nhân được tái tạo. Cuối kỳ sau thì tế bào chất phân chia để hình thành nên 2 tế bào con: Trong đó mỗi tế bào con chứa thành viên hoặc chỉ là của bố, hoặc chỉ là của mẹ (mang bộ NST đơn bội) nhưng mỗi thành viên vẫn có 2 nhiễm sắc tử (đơn bội kép), do đó cần có lần phân chia II để phân chia nhiễm sắc tử kép về 2 tế bào cháu mang số nhiễm sắc thể đơn bội. - Kỳ chuyển tiếp (interkinez): Kì trung gian là kì nằm giữa lần phân chia I và II của giảm phân. Kỳ chuyển tiếp không xảy ra hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể cũng như không có nhân đôi ADN như ở kỳ trung gian , kì chuyển tiếp nói chung rất ngắn. Giảm phân II: Lần phân chia II của giảm phân xảy ra giống như nguyên phân: 9 - Kỳ trước II: Nói chung rất ngắn, có khi không có, các bộ hai vẫn còn dính với nhau ở tâm động, nhưng các vai đã bắt đầu đẩy nhau ra. - Kỳ giữa II: Các NST xếp ở mặt xích đạo. - Kỳ sau II: Tâm động của mỗi bộ 2 chia đôi, các NST con (nhiễm sắc tử) trượt trên thoi, phân ly về hai cực và mỗi nhiễm sắc tử = 1 NST. - Kỳ cuối II: Ở kỳ cuối II xảy ra sự phân chia tế bào chất. Ở lần phân chia hai, yếu tố phân chia về hai cực là các NST con (nhiễm sắc tử) nên được gọi là phân chia cân bằng. Kết quả ta có các tế bào con với bộ NST đơn bội. 2.4. Thể bội và gen Gen quyết định các tính trạng của thực vật. Có tính trạng tương ứng với một gen gọi là tính trạng đơn gen, ngược với các tính trạng có liên quan đến nhiều gen gọi là tính trạng đa gen. Hai gen nằm trên cùng một vị trí nhất định (locus) trên hai nhiễm sắc thể tương đồng gọi là allele (gen đồng đẳng). Tuy cùng tham gia quyết định một tính trạng thí dụ màu hoa, một allen có thể mang các thông tin di truyền của màu đỏ, allele kia mang thông tin di truyền cho việc tạo nên màu trắng. Trường hợp này ta có các cá thể dị hợp về tính trạng màu hoa. Nếu cả hai allel đều mang thông tin di truyền cho màu đỏ (hoặc màu trắng) ta có các cá thể đồng hợp về tính trạng màu hoa. Đối với trường hợp dị hợp, một trong hai allele có thể là alen trội (dominant), alen còn lại là allele lặn (recessive). Màu hoa của cây do allel trội quyết định. Trong ví dụ trên, nếu trên thực tế ta thu được các hoa hồng thì đó là trường hợp các allele trội không hoàn toàn (incomplete dominance). Các tế bào, mô, hay cá thể đơn bội (haploids) gọi là bán hợp (hemizygous), vì với mỗi tính trạng chỉ có một allele. Ở các cá thể đơn bội kép các gen đều là đồng hợp hoàn toàn. Thể bội là danh từ dùng để chỉ số bộ nhiễm sắc thể có trong tế bào, mô, cá thể thực vật với quy định chung là ở các tế bào sinh sản có một bộ nhiễm sắc thể (với số nhiễm sắc thể n được gọi là thể đơn bội). Hợp tử, sản phẩm dung hợp của hai giao tử đơn bội, có thể bội là nhị bội với số nhiễm sắc thể là 2n. Tất cả các tế bào soma hình thành do sự phân chia hợp tử đều là nhị bội. Trên thực tế cùng một lúc có thể tìm thấy nhiều mức bội thể khác nhau ở các mô khác nhau của cơ thể thực vật (4n, 8n…). Đó là hiện tượng đa bội hóa do nội gián phân. Trong cùng một loài có thể gặp nhiều mức bội thể. Các thể bội lớn hơn nhị bội được gọi là đa bội. Khoảng một nửa thực vật bậc cao ở mức đa bội. Để dễ dàng hơn cho sự tìm hiểu tế bào học của các loài ở mức đa bội này, người ta sử dùng khái niệm số nhiễm sắc thể cơ bản của các loài x (là số đơn bội nhỏ nhất trong dãy đa bội). Các cá thể có x nhiễm sắc thể được gọi là thể nhất bội (monoploids) để phân biệt với thể đơn bội (haploids). Ví dụ cây lúa mì có hợp tử 2n=42. Trên thực tế lúa mì là một thể lục bội (hexaploids) 6x trong đó có số nhiễm sắc thể cơ bản của loài là x=7. Thể đơn bội của cây lúa mì lục bội có n=3x=21 thể nhiễm sắc. Cây thuốc lá trồng (Nicotiana tabacum) là một thể tứ bội 4x có 48 nhiễm sắc thể, số nhiễm sắc thể cơ bản x bằng 12. Thể đơn bội của loài thuốc lá này vì vậy có n =2x=24 thể nhiễm sắc. Một loài thuốc lá khác Nicotiana sylvestris có cùng số x=12, nhưng vì là một cây nhị bội trong tự nhiên nên tế bào hợp tử chứa 2n=2x=24 nhiễm sắc thể và các tế bào sinh sản chứa n=x=12 nhiễm sắc thể. trường hợp này thuật ngữ đơn bội đồng nghĩa với nhất bội. 10 2.5. Thể bào tử và thể giao tử ở thực vật bậc cao Thể bào tử (sporophyte) gồm có hợp tử và tất cả các tế bào sản sinh từ hợp tử kể cả hạt phấn trong túi phấn và noãn. Thể giao tử (gametophyte) gồm có hạt phấn đã nảy mầm và tất cả các tế bào do nó sinh ra, bao gồm các giao tử. Khi hai giao tử khác giới dung hợp, thể bào tử 2n được tái lập. ở thực vật bậc cao thể giao tử thường có không quá 3 tế bào, trong đó 2 tế bào là các giao tử. Ở tất cả các loài thực vật mức thể bội dao động theo chu trình được trình bày tại hình 1.4. Hình 1.4. Chu trình dao động của thể bội ở thực vật Ở thực vật bậc cao, thể giao tử (trong các trường hợp đặc biệt, có thể phát triển thành thể bào tử đơn bội (haploid sporophyte) chứa n nhiễm sắc thể. Thể bào tử đơn bội bề ngoài giống như thể bào tử 2n, tuy kích thước nhỏ hơn và cũng có thể ra hoa, nhưng các bào tử hình thành không có sức sống. Tạo thể bào tử đơn bội và những cây đơn bội kép là mục đích của nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. TÓM TẮT CHƯƠNG Thực vật là cơ thể đa bào. Mỗi tế bào thực vật đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cơ thể hay tế bào có tính toàn thể. Vì vậy, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp tế bào soma thực vật có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Để thể hiện tính toàn thể, các tế bào phân hóa đầu tiên phải trải qua sự phản phân hóa và sau đó là sự tái phân hóa. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. Sự phản phân hóa là sự trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ của các tế bào mô chuyên hóa. Sự sinh trưởng của tế bào là nhờ vào sự phân bào. 11 CÂU HỎI Câu 1: Vì sao từ một bộ phận bất kỳ của thực vật khi đưa vào môi trường dinh dưỡng thích hợp thì có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh? Câu 2: Hãy so sánh quá trình phân hóa và phản phân hóa? Câu 3: Vì sao nói sự phân bào là một quá trình không thể thiếu được trong đời sống của thực vật? 12 Chương 2. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan tách rời khỏi cơ thể. Để chúng có thể tồn tại, phản phân hóa và phát sinh hình thái theo định hướng, chúng nhất thiết phải được đặt trong điều kiện đảm bảo về dinh dưỡng, nước, các chất cảm ứng quá trình phản phân hóa và phân hóa định hướng. Vì vậy, cần có các môi trường nuôi cấy đảm bảo được các điều kiện nêu trên. Sở dĩ Haberlandt, người đầu tiên đề xướng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật (1902), không thành công trong các thí nghiệm của mình vì lúc bấy giờ những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng của tế bào thực vật còn hạn chế và đặc biệt là vai trò của các chất điều khiển sinh trưởng đối với quá trình phân chia và phân hóa của tế bào còn chưa được biết nhiều. Bên cạnh đó, các mẫu nuôi cấy cần đặt trong các điều kiện ngoại cảnh nhân tạo thích hợp (ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm…). Các loại thực vật, tế bào, mô và các cơ quan khác nhau, các giai đoạn nuôi cấy khác nhau đòi hỏi các môi trường phù hợp khác nhau. Mặt dù có sự khác biệt về thành phần , nồng độ các chất trong môi trường nhưng hiện nay, hầu hết các môi trường dinh dưỡng nhân tạo được sử dụng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm những thành phần sau: 1. NGUỒN DINH DƯỠNG KHOÁNG VÀ CARBON Có nhiều loại nguyên tố muối khoáng khác nhau cần thiết cho đời sống thực vật được cung cấp dưới dạng đa lượng và vi lượng . Theo thống nhất của Hội sinh lý học thực vật quốc tế , các nguyên tố đa lượng là các nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn hơn 0,5 mM, các nguyên tố vi lượng là các nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ nhỏ hơn 0,05 mM. Khi các muối khoáng được hòa ta n trong nước , chúng trải qua quá trình phân ly (dissociation) và ion hóa (ionisation). Trong môi trường dinh dưỡng , một loại ion có thể được kết hợp bởi một hoặc nhiều loại muối khác nhau. Ví dụ: trong môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), ion ΝΟ 3− được kết hợp bởi KNO 3 và NH 4NO3, ion K+ bởi KNO 3 và KH 2PO4. Do đó, đây là điều quan trọng để so sánh các môi trường khác nhau bằng cách đánh giá nồng độ tổng số của các ion hiện diện t rong chúng nhằm có được một ý tưởng về sự thích hợp của môi trường cho các mô hoặc các hệ thống nuôi cấy đặc biệt. Trong tự nhiên, cây trồng muốn sinh trưởng phát triển khỏe mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau: - Các nguyên tố đa lượng : bao gồm sáu nguyên tố : nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) và sulphur (S) tồn tại dưới dạng muối khoáng. - Các nguyên tố vi lượng: bao gồm iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), molybdenum (Mo) và nickel (Ni). Mười bốn nguyên tố trên cùng với carbon (C), oxygen (O), hydrogen (H) được xem là 17 nguyên tố thiết yếu của thực vật. Các nguyên tố khác như cobalt (Co), aluminum (Al), sodium (Na), silica (Si) và iodine (I) cũng cần thiết hay có lợi cho một số loài nhưng vai trò của chúng vẫn đang được nghiên cứu. Theo Epstein (1971), một nguyên tố được xem là thiết yếu cho sự phát triển của thực vật nếu: - Cây trồng không thể hoàn thành chu kỳ sống của nó nếu thiếu nguyên tố này. 13 - Hoạt động của nguyên tố này là chuyên biệt và không thể thay thế hoàn toàn bằng bất kỳ nguyên tố nào khác. - Có tác động trực tiếp đến hoạt động sinh lý của cây. - Là thành phần của một hợp chất được biết là cần thiết. 1.1. Các nguyên tố đa lượng Bảng 2.1 trình bày các nguyên tố đa lượng và nồng độ sử dụng. Bảng 2.1. Các nguyên tố đa lượng và nồng độ sử dụng tt Nguyên tố đa lượng Nồng độ (mM) 1 N ∑[ NO −3 , NH +4 ] ( NO −3 , NH +4 ) khoảng 20 khoảng 1 khoảng 10 khoảng 2 0,5-3 2-5 2 3 4 5 6 P K Ca Mg S 1.1.1. Nitrogen (N) Nitrogen ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của thực vật, là nguyên tố thiết yếu cấu tạo nên các nucleic acid, protein, chlorophyll, acid amin, alkaloid và một vài hormon thực vật. Vì vậy nên N là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng hàng đầu trong môi trường nuôi cấy. Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng N khoáng dưới dạng nitrate − ( ΝΟ 3 ) và ammonium (NH4+), đồng thời cũng sử dụng các dạng N hữu cơ như acid amin. N dạng ammonium là N trạng thái khử, N dạng nitrate là N trạng thái oxy hóa. Ion nitrat là là một nguồn N quan trọng đối với hầu hết cây trồng. Tuy nhiên, trong tế bào, nitrate lại bị khử thành ammonium trước khi tham gia vào quá trình sinh tổng hợp acid amin. Phần lớn cơ thể thực vật hoàn chỉnh , mô, cơ quan hấp thu N tốt hơn trên môi trường chứa cả hai ion nitrate và ammonium , trong trường hợp chỉ dùng ammonium , thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch vòng (cycle acids), tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa (dạng muối ), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưởng độc do nồng độ của ammonium vượt quá 8 mM trong môi trường được giảm bớt. Khi các ion nitrate và ammonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn , và mặc dù trong môi trường không có chất đệm, nhưng nhờ sự hấp thu hài hòa giữa ammonium và nitrate giúp điều chỉnh pH của môi trường nuôi cấy. Để xây dựng công thức môi trường thích hợp cho các đối tượng nghiên cứu khác nhau và mục đích nghiên cứu khác nhau, cần phải quan tâm đến: - Hàm lượng N tổng số trong môi trường. - Tỷ lệ ion nitrate/ammonium. Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3. 14 Ammonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4, NH4NO3 hoặc NH4Cl. Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. 1.1.2. Phosphorus (P) Phosphorus là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật, có tác dụng rất quan trọng đối với việc phân chia tế bào, tích lũy và chuyển hóa năng lượng trong quá trình quang hợp, hô hấp, đồng thời là thành phần cấu tạo nên nucleic acid, protein, diệp lục, tham gia vào cấu trúc màng và nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác. Trong môi trường nuôi cấy, P được cung cấp dưới dạng mono hay di hydrogenphosphate như: NaH2PO4.H2O, KH2PO4, NH4H2PO4..., ion phosphate hóa trị I và II có thể chuyển đổi lẫn nhau tùy thuộc vào độ pH. Nồng độ ion phosphate được cho vào môi trường nuôi cấy cao nhất là 18,9 mM, trung bình là 1,7 mM. Nồng độ phosphate cao có thể gây kết tủa các nguyên tố vi lượng khác, giảm sự hấp thu nguyên tố khoáng, ức chế sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. 1.1.3. Potassium (K) Trong quá trình hoạt động sống, K rất cần thiết cho sự phân chia bình thường của tế bào và thúc đẩy sự phát triển của mô phân sinh, tham gia vào việc tổng hợp protein, diệp lục và oxy hóa khử nitrate. Ion K+ là một cation chủ yếu trong cây, giúp cho cây cân bằng các anion vô cơ và hữu cơ. Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai tác dụng sinh lý chủ yếu là điều hòa pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào, qua đó gây đóng mở khí khổng, vận động của cây và sinh trưởng tế bào. Thiếu K trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước, tế bào không dãn được, tính đề kháng giảm và giảm tốc độ hấp thu phosphate. K được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng KNO3, KH2PO4, KCl, K2SO4. 1.1.4. Calcium (Ca) Trong nuôi cấy tế bào, ion Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là cytokinin và auxin. Calcium còn có khả năng liên kết các phân tử sinh học lại với nhau (dưới dạng calcium pectate) do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lý của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào, sự tạo thành vách cellulose trong nuôi cấy tế bào chỉ xảy ra khi trong môi trường có ít nhất vài µM Ca2+. Sự hoạt động của nhiều loại enzyme khác của thực vật cũng phụ thuộc vào ion Ca2+ vì calcium là đồng yếu tố với những enzyme phân giải ATP. Trong môi trường nuôi cấy thường dùng CaCl2.2H2O, Ca(NO3)2.4H2O, đôi khi còn sử dụng Ca10(PO4)6(OH)2, nồng độ trung bình khi sử dụng Ca2+ là 2,57 mM/L. 1.1.5. Magnesium (Mg) Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục và tham gia vào cấu trúc của một số enzyme như enzyme vận chuyển phosphate. Mg còn hoạt hóa cho nhiều enzyme trong các phản ứng trao đổi glucid liên quan đến quá trình quang hợp, hô hấp và trao đổi nucleic acid, các phản ứng đó có liên quan đến ATP. Ngoài ra Mg tham gia vào quá trình hình thành thành tế bào, quá trình tổng hợp protein, điều chỉnh sự hút của các cation, trung hòa các anion và các acid hữu cơ… Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường chứa Mg với nồng độ trung bình từ 5,3-6,8 mM, MgSO4.7H2O là nguồn bổ sung ion Mg2+ cho mô nuôi cấy, ngoài ra MgCl2.6H2O đôi khi cũng được sử dụng. Độ pH thấp sẽ ức chế sự hấp thu ion Mg2+. 15 1.1.6. Sulphur (S) Sulphur là thành phần của ba acid amin quan trọng trong cây là cystine, cysteine và methionine, các acid amin này là thành phần bắt buộc của các protein. Trong các phân tử protein, S tạo nên các cầu nối disulfit (-S-S-) bảo đảm tính ổn định về cấu trúc của phân tử protein. Sulphur tham gia vào hợp chất quan trọng có ý nghĩa trong trao đổi chất và năng lượng trong tế bào là cofecment A (CoA-SH), nhóm –SH của nó khi kết hợp với gốc acetyl tạo nên hợp chất actyl-CoA (CH3-CO~S.CoA). Actyl-CoA đóng vai trò quan trọng trong hô hấp và trao đổi lipid trong cây. S còn có mặt trong một số vitamin quan trọng trong quá trình trao đổi chất là biotine, thiamine. Sulphur được thực vật hấp thu dưới dạng ion sulfate (SO42-), và đây cũng là nguồn cung cấp S trong nuôi cấy mô thực vật. Các muối cung cấp gốc (SO42-) phổ biến là: MgSO4.7H2O4, (NH4)2SO4, K2SO4 và NaSO4… Nồng độ (SO42-) trong môi trường nuôi cấy tương đối thấp, trung bình 2,33 mM. 1.2. Các nguyên tố vi lượng Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật được gọi là các nguyên tố vi lượng . Vai trò quyết định nhất của các nguyên tố vi lượng đối với cây là hoạt hóa hệ thống enzyme. Có những trường hợp, một số khoáng vi lượng có thể là không cần thiết, do đó, để an toàn, các tác giả đã cung cấp hầu hết các nguyên tố vi lượng đối với cây cho mô trong môi trường nuôi cấy. Đó là các ion : iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), boron (B), copper (Cu), và molybdenum (Mo). Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme và có thể có ảnh hưởng đến sự phân hóa tế bào khi kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Beasley và cộng sự, 1974). Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, các nhà khoa học chưa nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào trong môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và các hóa chất dùng để pha chế môi trường không tinh khiết, trong đó có lẫn một số nguyên tố vi lượng nên đã cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy. Bảng 2.2 trình bày các nguyên tố vi lượng và nồng độ sử dụng. Bảng 2.2. Các nguyên tố vi lượng và nồng độ sử dụng Stt Nguyên tố vi lượng Nồng độ (µM) 1 2 3 4 5 6 7 8 Mn B Zn Cu Mo Co I Fe 15-100 6-100 15-30 0,1-10 0,007-1 0,1-0,4 2,5-20 1 1.2.1. Iron (Fe) Vai trò quan trọng nhất của Fe là hoạt hóa các enzyme. Nó có mặt trong nhóm hoạt động của một số enzyme oxi hóa khử như catalase, peroxydase. Nó có mặt trong các cytocrom, feredoxin trong chuổi chuyển vận điện tử của quang hợp và hô hấp. 16 Fe không tham gia vào thành phần của diệp lục nhưng lại có ảnh hưởng quyết định đến sự tổng hợp diệp lục trong cây. Hàm lượng Fe trong lá cây có quan hệ mật thiết đến hàm lượng diệp lục trong chúng… Những môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2, FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe (C4H4O6), nhưng Fe thường tạo phức với các thành phần khác nên , hiện nay , hầu hết các phòng thí nghiệm Fe dường n hư thích hợp hơn khi được cung cấp dưới dạng chelate : Fe-NaEDTA (Na2-Ethylene Diamine Tetra Acetate ) đặc biệt đối với quá trình tạo phôi. Ở dạng này, Fe không bị kết tủa và giải phóng từ từ ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật ở một phạm vi pH rộng . Tuy nhiên, các dạng chelate EDTA không hoàn toàn ổn định trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng . 1.2.2. Manganese (Mn) Manganese là một trong những nguyên tố vi lượng quan trọng nhất, gần như luôn luôn có mặt trong môi trường nuôi cấy. Mn có tác động hóa học tương tự Mg2+ nên có thể thay thế cho Mg2+ trong một số hệ thống enzyme (Hewitt, 1948). Một số nhà khoa học cho rằng khi có sự hiện diện của Mn trong môi trường nuôi cấy thì hàm lượng IAA tự nhiên trong mô sẽ giảm xuống do hoạt động của IAA oxydase tăng lên. Điều này có thể là do Mn hay Mn2+ có mặt trong những enzyme làm bất hoạt các yếu tố cản trở sự hoạt động của IAA oxydase hoặc Mn2+ là đồng yếu tố của IAA oxydase trong tế bào thực vật (Galston và Hillman, 1961). Mn phối hợp với EDTA làm tăng sự oxid hóa IAA tự nhiên nhưng không ảnh hưởng gì đến auxin tổng hợp như NAA hay 2,4-D (MacLachlan và Waygood, 1956). Tuy nhiên, Chée (1986) lại cho rằng: dưới ánh sáng xanh thì Mn2+ làm gia tăng lượng IAA tự nhiên trong mô do nó bất hoạt một đồng yếu tố của IAA oxydase. 1.2.3. Zinc (Zn) Thiếu Zn thì sự tổng hợp protein, nucleic acid và diệp lục sẽ bị giảm đi, thực vật có đốt thân ngắn và lá nhỏ, đồng thời tế bào trần cũng kém phát triển. Giữa Zn và nồng độ IAA có mối liên hệ rất gần gũi (Skoog, 1940), người ta cho rằng Zn là một thành phần trong enzyme có liên quan đến sự tổng hợp tiền chất của IAA đó là tryptophan (Tsui, 1948). 1.2.4. Boron (B) Vai trò của nguyên tố B trong sinh hóa học và sinh lý học thực vật chưa được biết nhiều. B cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh trưởng vì nó có mặt trong sự sinh tổng hợp các base chứa nitrogen đặc biệt là uracil, cũng như cần thiết cho sự sinh tổng hợp lignin và phenolic acid. Trong đất, nguồn cung cấp B cho cây là boric acid vì vậy hợp chất này cũng được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô. Sự hấp thu boric acid (H3BO3) ở dạng không phân ly khi pH môi trường có tính acid (Oertli và Gregurevic, 1974) hoặc dạng H2BO3- (Devlin, 1975). B ở nồng độ cao có vai trò như chất điều hòa sinh trưởng kích thích sự nảy mầm của hạt phấn, thiếu B sẽ làm giảm sự sinh tổng hợp cytokinin. Tuy nhiên, ở một số đối tượng, nồng độ B cao trong môi trường nuôi cấy sẽ cản sự tăng trưởng của rễ bất định và giảm số lượng rễ được tạo thành (Javis, 1986). 1.2.5. Copper (Cu) Cu hiện diện trong hệ thống enzyme cytochrome oxydase của chuỗi vận chuyển điện tử hô hấp. Trong thực vật, Cu tồn tại dưới dạng ion hóa trị I và II. Nồng độ Cu cao sẽ gây độc cho mô. Các ion Cu2+ được bổ sung vào môi trường dưới dạng sulfate, và đôi khi người ta cũng bổ sung Cu dưới dạng CuCl2 hoặc CuNO3. 17 1.2.6. Molypdenum (Mo) Thực vật hấp thu Mo dưới dạng MoO42-. Molypdate thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ đến 1 µM. Cũng có những thí nghiệm người ta sử dụng Mo với nồng độ cao hơn nhiều như trong môi trường của Abou-Mandour (1977) hoặc Asahira và Kano (1977) mà không có ảnh hưởng có hại đến mô cấy. Nhưng Teasdale (1987) ghi nhận rằng huyền phù tế bào cây thông bị ảnh hưởng bất lợi khi nồng độ Mo6+ trong môi trường ở mức 50 µM. 1.2.7. Cobalt (Co) Cobalt là thành phần kim loại trong vitamin B12 có liên quan đến sự sinh tổng hợp nucleic acid nhưng chưa có bằng chứng nào về tác động của nó đến sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của mô trên môi trường nuôi cấy. Bổ sung Co vào môi trường nuôi cấy nhằm đáp ứng nhu cầu cho các loại thực vật bậc thấp và trong sự phát sinh hình thái ở thực vật bậc cao, đồng thời cũng có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo ở một số cây một lá mầm. Ngoài ra, một mục đích khác của việc bổ sung Co vào môi trường nuôi cấy là chống lại sự gây độc của các chelat kim loại và nó có thể ngăn cản phản ứng oxid hóa gây ra bởi Cu và Fe. Ngưỡng gây độc cho mô của Co là 160 µM. 1.2.8. Iodine (I) Ion I- không được cho là nguyên tố cần thiết cho sự dinh dưỡng của thực vật bậc cao (Rains, 1976), mặc dù nó là thành phần của một vài acid amin và có rất nhiều trong các loại rong tảo. Hannay (1956) đã nhận thấy rằng sự tăng trưởng của rễ sẽ giảm đi khi trong môi trường không có mặt của ion I- và ion I- không chỉ được cung cấp bởi KI mà nó còn được cung cấp bởi idoacetate hoặc methylene iodide. Các hợp chất này sẽ cung cấp I- rất chậm nhờ sự thủy phân. 1.2.9. Một số nguyên tố vi lượng khác Ion chlorine (Cl-) cần thiết cho sự tăng trưởng của thực vật nhưng dường như nó ít có mặt trong các phản ứng sinh học và có vai trò với một lượng rất nhỏ. Một số thực vật nhạy cảm với ion Cl-, nồng độ Cl- cao sẽ làm cho các loại cây thân gỗ bị vàng lá và thân yếu, đôi khi mô bị nhũn ra và chết. Một số tác giả có bổ sung aluminium (Al) và nickel (Ni) vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên lợi ích của các kim loại này chưa được chứng minh một cách rõ ràng. Ở hầu hết thực vật, Ni+ không nhất thiết cần cho sự tăng trưởng và phát triển của thực vật, nhưng ion này cũng là một thành phần của một số enzyme urease. Sự tăng trưởng của tế bào trên môi trường chỉ có urea diễn ra chậm khi không bổ sung Ni với nồng độ thích hợp, và sự tăng trưởng này có lẽ nhờ vào các nguyên tố vi lượng dạng vết còn lại trong tế bào (Polacco, 1977). Ni cũng nên được cân nhắc khi sử dụng trong môi trường nuôi cấy vì urea thoát ra từ mẫu cấy sẽ khuyếch tán vào trong môi trường nên không gây độc cho mô (Teasdale, 1987). 1.3. Carbon và nguồn năng lượng Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phươ ng thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp . Mặt khác, quá trình quang hợp cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy. Trên thực tế, việc bổ sung CO2 là rất khó khăn và tốn kém . Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là s accharose, nồng 18 độ thích hợp phổ biến là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước- gây hạn sinh lý). Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy v à cho hiệu quả tương đương saccharose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast ), còn fructose cho hiệu quả kém hơn . saccharose, trong khi khử trùng môi trường , bị biến đổi thành glucose và fructose . Trong tiến trình này , đầu tiên glucose sẽ được sử dụng và sau đó là fructose . Các carbohydrate khác , như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm , nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt. Các dạng polysaccharide như tinh bột , pectine, dextrine cũng có thể dùng cho nuôi cấy, tuy nhiên những loại tế bào được nuôi trên môi trường có chứa một trong các polysaccharide trên nhất định phải thể hiện khả năng thủy phân thông qua các enzyme chẳng hạn như amylase . Có những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trường chứa tinh bột khá nhiều amylase . Chuyển chúng lên môi trường chỉ chứa saccharose lượng amylase thải ra sẽ giảm ngay. Glycerin cũng có thể được tế bào sử dụng . Mannitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào , nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năn g là chất ổn định áp suất thẩm thấu , hoặc tương tự saccharose chúng cũng được dùng để cảm ứng stress nước. Các loại rượu như ethanol, methanol ít hiệu quả, còn propanol và butanol thì rất độc. Acid hữu cơ thường không phải là nguồn carbon thích hợp cho tế bào nuôi cấy. Thí nghiệm với các acid : folic, succinic, pyruvic và keto -glutaric chỉ đạt 15% sinh trưởng so với saccharose. Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡ ng và vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng . Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡn g carbon . Việc bổ sung nguồn carbon bên ngoài vào môi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi xanh. Sự thủy phân từng phần saccharose xuất hiện khi môi trường được khử trùng . Các tế bào và mô nuôi cấy đã sinh trưở ng trên môi trường có saccharose được khử trùng bằng nồi khử trùng (autoclave) tốt hơn trên môi trường có saccharose được khử trùng bằng màng lọc (filter). Điều này cho thấy các tế bào thích hợp với nguồn dự trữ có sẳn của gluc ose và fructose do thủy phân saccharose khi khử trùng bằng autoclave . Sử dụng fructose được khử trùng bằng autoclave không được đề cập đến vì nó có thể gây bất lợi cho sinh trưởng của mô. Tuy nhiên, một số tác giả đã thành công trong việc nuôi cấy tế bào đơn chứa diệp lục tố nên có khả năng quang hợp. Nhờ vậy, nồng độ đường trong môi trường giảm xuống rất thấp và đôi khi được bỏ hẳn. Nuôi cấy tế bào thực vật tự dưỡng là một hướng quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn. 2. CÁC PHỤ GIA HỮU CƠ 2.1. Các vitamin Thực vật tự tổng hợp các vitamin và chúng được sử dụng như những chất xúc tác trong các quá trình trao đổi chất khác nhau . Khi các tế bào và mô thực vật sinh trưởng trong điều kiện in vitro, một số vitami n không thể thay thế được tổng hợp 19 nhưng thường không đủ về lượng , do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào , đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B . Nhiều nghiên cứu cho rằng, chỉ cần vitamin B1 và myoinositol là có thể duy trì được sự sinh trưởng của mô nuôi cấy mà không cần đến các loại vitamin khác. Các loại vitamin đều hòa tan trong nước, chỉ có folic acid tan trong môi trường kiềm. Bảng 2.3 trình bày các vitamin và nồng độ sử dụng. Bảng 2.3. Các vitamin và nồng độ sử dụng Stt 1 2 3 4 5 6 7 Tên vitamin Nồng độ (mg/l) Myo-inositol Pyridoxine. HCl (Vit B6) Thiamine.HCl (Vit B1) Acid nicotinic Riboflavine (Vit B2) Biotin Acid folic 100 0,05-0,5 10-50 0,5-10 1-5 0,001-0,01 0,1-10 2.1.1. Vitamin B1 (Thiamine.HCl, Aneurin) Căn cứ vào tần suất suất hiện trong các loại môi trường nuôi cấy có thể nói B1 là vitamin quan trọng nhất trong nuôi cấy mô thực vật . Là một chất bổ sung rất cần cho môi trường nuôi cấy , vitamin B1 cùng với các chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng tương hỗ, duy trì sự sinh trưởng và phát sinh hình thái mẫu nuôi cấy . Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao vitamin B 1 bị nhiệt phân thành pyrimidin e và thiazol là hai cấu tử của vitamin B 1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp lại chúng thành phân tử vitamin B 1. Vì vậy không nhất thiết phải khử trùng bằng phương thức khác như lọc chẳng hạn. 2.1.2. Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin) Có thể khử trùng bằng nhiệt , nhưng lại dễ bị ánh sáng phân huỷ . Đối với nuôi cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng đối với nuôi cấy trong tối có thể tăng lên 10-50 ppm. 2.1.3. Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin) Là tiền chất của pyridoxal -phosphate-cofactor của các nhóm enzyme như carboxylase và transaminase. Khi khử trùng ở nhiệt độ cao phản ứng xảy ra như sau: Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphate 2.1.4. Myo-Inositol (Bios I) Trong môi trường nuôi cấy mô thực vật myo-inositol được xếp vào nhóm vitamin, nhưng cũng có tác giả cho rằng đây là một carbonhydrate chứ không phải vitamin. Người ta cho rằng myo-inositol được phân tách ra thành ascobic acid và peptine, sau đó được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào và thúc đẩy sự sinh trưởng và phân hóa tế bào. Myo-inositol tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất , đặc biệt trong sinh tổng hợp thành tế bào , cụ thể là sinh tổng hợp acid polygalacturonic , hemicellulose và pectine . Nó còn có thể là một trong những chất nhận tín hiệu thứ cấp trong điều hòa sự tổng hợp auxin , nuôi cấy callus và môi trường phân hóa callus nhất thiết phải có myo inositol. Myo-inositol là chất bền vững khi khử trùng . Thường được sử dụng ở nồng 20 độ cao 100 ppm. Khi phân tích thành phần của nướ c dừa người ta thu được myo inositol trong một phân đoạn trung tính. 2.1.5. Biotin (Bios II) Cần thiết cho sự phân bào của một số loại mô . Chỉ sử dụng ở nồng độ rất thấp từ 0,001-0,01 ppm. 2.1.6. Acid pantothenic (Bios III, Vit B5) Được sử dụng để làm thành phần của coenzyme A . 2.1.7. Nicotinic acid và pyridoxine Thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng có thể thay thế bằng các vitamin khác cho sự sinh trưởng của tế bào ở nhiều loài . Các vitami n khác như folic acid, ascorbic acid , vitamin E (tocophenol), và ρ-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào, đặc biệt khi tế bào sinh trưởng ở mật độ quần thể rất thấp. Nói chung, các vitamin này được bổ sung trong khoảng 0,1-10,0 ppm. 2.2. Các acid amin Các mô được nuôi cấy vẫn có khả năng tổng hợp các acid amin cần thiết cho các quá trình trao đổi chất khác nhau . Mặc dù thế, việc bổ sung các acid amin vào môi trường vẫn cần thiế t để kích thích sinh trưởng tế bào trong nuôi cấy protoplast và để hình thành các dòng tế bào. Không giống như các N vô cơ , các acid amin được các tế bào thực vật hấp thụ nhanh hơn. Casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine, L-glycine, L-arginine và L-cystein là nguồn N hữu cơ thích hợp được dùng trong các môi trường nuôi cấy . Tyrosine chỉ được dùng khi có bổ sung agar vào môi trường . Các acid amin được bổ sung riêng lẻ thường hạn chế sự sinh trưởng của tế bào trong khi hỗn hợp của chúng lại có hiệu quả hơn . Bổ sung vào môi trường adenine sulphate có thể kích thích sinh trưởng của tế bào hoặc làm tăng khả năng tạo c hồi. Bảng 2.4 thể hiện nồng độ sử dụng của các acis amin. Bảng 2.4. Các acid amin và nồng độ sử dụng Stt 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ (mM) Tên acid amin L-glutamine L-asparagine L-glycine L-arginine L-cystein Tyrosine Casein hydrolysate 8 100 2 10 10 100 0,05-0,1% 2.3. Các phụ gia hữu cơ khác Trước đây, các nhà khoa học sáng lập ra các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường sử dụng môi trường dinh dưỡng rất đơn giản gồm muối khoáng và đường. Ngày nay, người ta khẳng định rằng loại môi trường đơn giản như vậy không đủ để cho tế bào sinh trưởng bình thường. Vì vậy, thành phần môi trường ngày càng phong phú và phức tạp hơn , một số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên đã được sử dụng như: 21 2.3.1. Nước dừa Từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi phôi Datura và sau đó năm 1949, nuôi mô Daucus. Phân tích thành phần của nước dừa từ non đến già cho thấy trong nước dừa có: - Acid amin tự do từ 190,5-685,0 ppm trong nước dừa từ non đến già . Khi khử trùng ở nhiệt độ cao còn lại khoảng 70 ppm. - Acid amin trong protein. - Acid hữu cơ. - Đường. - RNA và DNA . Ngoài ra, nước dừa còn chứa các hợp chất quan trọng đối với tế bào nuôi phân lập như: - Myo-inositol. - Các hợp chất có hoạt tính auxin. - Các cytokinin dạng glycoside. Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá cao từ 10-20% (v/v) thể tích môi trường. 2.3.2. Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE) Với dịch nấm men , White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn . Thành phần hóa học của dịch nấm men ít được chú ý phân tích. Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, acid amin, vitamin, auxin, muối khoáng. Tác dụng của YE với rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng. 2.3.3. Dịch thủy phân casein (casein hydrolysate-CH) Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật , ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung acid amin. Casein thủy phân chứa Ca và P tương đối phong phú, trong 1g casein có chứa 13 mmol muối phosphat và 15% NH4+. 2.3.4. Hỗn hợp acid amin nhân tạo Dựa vào những kết quả phân tích các hỗn hợp chấ t tự nhiên nói trên nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợp acid amin nhân tạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng. Kết quả sử dụng các hỗn hợp này còn rất khác nhau , có thể do yêu cầu acid amin của từng lo ại tế bào là không giống nhau . Trong môi trường lỏng để nuôi callus lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ callus thì proline là một thành phần quan trọng. 2.4. Than hoạt tính (activated charcoal-AC) Bổ sung than hoạt tính vào môi tr ường nuôi cấy đã kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan , cà rốt, dây thường xuân và cà chua . Ngược lại, nó gây ức chế ở thuốc lá, đậu tương và các loài thuộc chi Camellia. Nói chung than hoạt tính có ảnh hưởng trên 3 mặt: giúp làm giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc (ví dụ: phenol) được tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì , hấp phụ các chất điều hòa sinh trưởng hoặc làm đen môi trường. than hoạt tính được rửa acid và trung hòa trước khi bổ sung nó ở nồng độ 0,5-3% vào môi trường nuôi cấy. 22 2.5. Các kháng sinh (antibiotics) Bổ sung các kháng sinh vào môi trường nuôi cấy nói chung thường được tránh do sự hiện diện của chúng trong môi trường làm chậm sinh trưởng của mô và tế bào . Tuy nhiên, một số tế bào thực vật bị nhiễm một cách hệ thống các vi sinh vật . Để ngăn chặn sinh trưởng của bọn vi sinh vật này , điều không thể t hay thế là làm giàu môi trường bằng kháng sinh . streptomycin hoặc kanamycin ở nồng độ thấp kiểm soát hiệu quả hiện tượng nhiễm có tính hệ thống và môi trường được bổ sung các kháng sinh này không gây bất lợi cho sự sinh trưởng của tế bào nuôi cấy. Kháng sinh được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có vai trò: - Ngăn chặn sự lây nhiễm của các vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy. - Ngăn chặn nấm mốc và nấm men lây nhiễm vào mô, tế bào nuôi cấy. - Loại trừ các chủng vi khuẩn Agrobacterium dùng trong chuyển gen ra khỏi môi trường và mô nuôi cấy. 3. CÁC CHẤT ĐIỀU KHIỂN SINH TRƯỞNG THỰC VẬT Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều khiển sinh trưởng . Có bốn nhóm chất điều khiển sinh trưởng chung đó là auxin , cytokinin, gibberellin và abscisic acid, những chất này có vai trò quan trọng trong nuôi cấy mô . Sự sinh trưởng , phân hóa và phát sinh cơ quan của mô nuôi cấy trở nên thuận lợi chỉ khi bổ sung một hoặc một số chất thuộc bốn nhóm trên vào môi trường nuôi cấy . Tỷ lệ của các loại hormone cần cho sự tạo rễ và chồi rất khác nhau , và mô là nơi liên quan trực tiếp với lượn g hormone được tổng hợp nội sinh ở các tế bào của mẫu vật nuôi cấy. Bảng 2.5 trình bày các chất điều khiển sinh trưởng thường dùng và nồng độ sử dụng. Bảng 2.5. Các chất điều khiển sinh trưởng thường dùng và nồng độ sử dụng Stt Tên chất sinh trưởng Nồng độ (mg/l) 1 2 3 4 5 6 7 2,4-D NAA IAA IBA KIN BAP GA3 0,2-5,0 0,1-5,0 5,0-20,0 1,0-5,0 0,1-2,0 0,1-2,0 0,1-2,0 3.1. Auxin (hormone sinh trưởng) Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như : 1H- indole-3acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA). IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật ; còn lại NAA , IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) không có tác dụng . Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) hoặc p -chlorophenoxyacetic acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6trichloropicolinic acid (picloram), và 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba). 23 Đặc tính c ủa các auxin là khởi đầu sự phân chia tế bào . Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như : tăng trưởng chiều dài thân , lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn. Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng. Mặc dù, những chi tiết ở mức độ phân tử về hoạt động của auxin vẫn chưa được biết nhiều, nhưng một số nghiên cứu về di truyền và phân tử đã cung cấp những kết quả mới thú vị . Trong những năm qua , một số gen mã hóa cho các protein liên kết auxin (auxin binding proteins ) đã được tạo dòng (cloning) và khảo sát các đặc điểm của chúng, và thông tin mới về gen cảm ứng auxin (auxin-induced gene) cũng đã thu được. Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất t rương. Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu - Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy - Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy - Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. 3.2. Cytokinin (hormone phân bào) Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân c hia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô . Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-Hpurine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên , còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin là N ,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea . Hiệu quả đặc biệt của các hợp chất gốc urea lên sự sinh trưởng của mô thực vật cần phải được nghiên cứu thêm. Tỷ lệ auxin /cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy . Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin /cytokinin cao , trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách . Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này . Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1. Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển (transfer RNA ). Các cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định. - Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi . Trong cơ thể sống không có kinetin tồn tại , sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy , nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa. 24 Trong tự nhiên cũng tồn tại một hormone phân bào khác , Letham là người đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho kết tinh thành công hormone phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô . Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea: ngô). - Tương tự các cytokinin khác , zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin . Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt , thường thay thế zeatin bằng kinet in hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là: - 6-Benzylaminopurine (BAP): Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao . BAP có khả năng làm tăng hình th ành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất. 3.3. Gibberellin Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30, mới phân lập và tinh chế được hoạt chất , được gọi là gibberellin . Sau chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật . Tới nay, người ta đã phát hiện được khoảng 126 loại thuộc nhóm gibberellic acid . Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3. Trong đời sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi , sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật. Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó. Khi bổ sung GA3 vào môi trường nuôi cấy thường chúng có vai trò như các auxin tự nhiên. GA3 nồng độ cao (1-8 mg/l) có thể cảm ứng sự tăng trưởng của những tế bào callus không phân hóa và có thể kích thích sự tăng trưởng của callus khi phối hợp với auxin và cytokinin nồng độ thấp, nhưng nó lại làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi soma… 3.4. Abscisic acid (ABA) ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên , được tạo ra trực tiếp từ mevalonic acid hoặc do sự phân giải carotenoid. Vai trò của ABA là gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa , đóng khí khổng, sự lão suy và rụng lá. ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định. 4. CÁC NHÂN TỐ KHÁC 4.1. Các nhân tố làm rắn môi trường Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel được sử dụng phổ biến để chuẩn bị cá c môi trường nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid). Trong nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trường và chết do thiếu oxy , môi trường ở trạng thái lỏng này thích hợp cho việc nuôi cấy protoplas, huyền phù tế bào, nuôi cấy thể phôi. Khi sử dụng môi trường lỏng để nuôi cấy thì dung dịch phải được lắc hoặc khuấy. 25 Môi trường ở trạng thái gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh (static conditions), với các mục đích phát sinh callus, phân hóa và phát sinh cơ quan hình thái. Những thuận lợi trong việc sử dụng môi trường dạng gel là: - Dễ quan sát các mô nuôi cấy - Tính định hướng của các mô nuôi cấy được lưu giữ - Mô nuôi cấy được đặt trên bề mặt môi trường nên không cần các biện pháp thông khí - Chồi và rễ phát triển ổn định. So với mô nuôi cấy trong môi trường lỏng chồi và rễ có thể bị mất phương hướng - Trong môi trường lỏng lắc callus có thể bị vỡ hoặc tạo thành các tế bào đơn. Tuy nhiên, môi trường dạng gel có nhiều bất lợi: các chất độc tiết ra từ mô nuôi cấy không được khuếch tán nhanh, tình trạng thông khí kém sẽ tác động đến sự phát triển và chức năng của rễ. Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ Rhodophyta), chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác . Trước tiên , gel của agar không phản ứng với các thành phần của môi trường . Thứ hai , chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành. Bình thường, từ 0,5-1% agar được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật . Trong những nghiên cứu về dinh dưỡng , việc sử dụng agar được tránh bởi vì ag ar thương phẩm không sạch do có chứa một số ion Ca , Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60oC trong 24 giờ. Nói chung, ở 80oC agar ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 40oC trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của agar cao từ 6-12 g/L nước. Gelatin ở nồng độ cao (10%) cũng có hiệu quả tạo gel nhưng bị hạn chế sử dụng bởi vì nó nóng chảy ở nhiệt độ thấp (25oC). Các hợp chất khác đã được thử nghiệm thành công bao gồm methacel , alginate, phytagel và gel -rite. Công ty FMC Corp. gần đây đã phát triển một l oại agarose được tinh sạch cao gọi là Sea Plaque (k), loại này có thể được dùng để phục hồi các protoplast đơn (single protoplast) trong nuôi cấy. Cellophane đục lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lọc (filter paper bridge ), bấc giấy lọc (filter paper wick ), bọt polyurethane (polyurethane foam ) và xốp polyester (polyester fleece ) là các phương thức thay đổi giá thể được dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoặc tế bào. Điều thuận lợi khi làm việc với các hợp chấ t tạo gel nhân tạo là chúng tạo ra các gel sạch ở các nồng độ tương đối thấp (1,25-2,5 g/L) và nó có thể giúp phát hiện sự nhiễm bẩn được phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy . Các mẫu vật sinh trưởng tốt hơn trên agar hoặc các tác nhân tạo giá thể khác phụ thuộc vào loại mô và từng loài khác nhau. 4.2. pH môi trường Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường , pH có t hể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm . Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,0-6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu. Độ pH cao hơn sẽ làm ch o môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar. Hầu hết các môi trường nuôi cấy nghèo đệm , vì thế chúng làm dao động giá 26 trị pH, sự giao động này có thể gây bất lợi cho thí nghiệm nuôi cấy dài n gày và sự sinh trưởng của các tế bào đơn hoặc các quần thể tế bào ở mật độ thấp. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào . Vì vậy, đối với từng môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu . Nuôi cấy callus của nhiều loài cây , pH ban đầu thường là 5,56,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt đ ược giá trị từ 6,0-6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính acid cao như acid amin, vitamin thì nhất định phải phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5-6,5. Những thí nghiệm nu ôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc. 5. MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN Ngay từ những giai đoạn đầu của sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, Gau theret (1939) và White (1943) đã đề xuất các môi trường nuôi cấy callus và nuôi cấy rễ. Do đối tượng nghiên cứu, mục đích nghiên cứu rất khác biệt đòi hỏi phải có những môi trường dinh dưỡng thích hợp khác nhau, vì vậy hiện nay đã có khoảng 685 loại môi trường nuôi cấy mô thực vật đã được công bố (Georgen và cộng sự , 1987). Thành phần cơ bản của một số loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật được trình bày trong bảng 2.6. Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm: - Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng : Đại diện là môi trường Murashige -Skoog (MS, 1962), Erksson (ER, 1965). Nhóm môi trường này có hàm lượng muối khoáng cao, nhất là muối nitrate , ammonium, potassium, các nguyên tố vi lượng đầy đủ . Môi trường (MS) là một trong nhữ ng loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật . Môi trường MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm . Vì vậy, những người mới bắt đầu làm quen với nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra môi trường của riêng mình . Tới nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962. - Nhóm môi trường đủ dinh dưỡng: Đại diện là môi trường Chu (N6), B5, SH. Nhóm này có hàm lượng dinh dưỡng đa lượng và vi lượng thấp hơn môi trường MS, nhưng đặc biệt có hàm lượng muối nitrate potassium cao. Nhóm môi trường này thích hợp cho các mục đích nuôi cấy tăng cường cảm ứng hình thành callus và phân hóa chồi. Môi trường B 5 được thiết kế đầu tiên cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó được cải tiến và trở thành môi trường thích hợp cho nuôi cấy protoplast. Môi trường này cũng được sử dụng để tái sinh cây từ p rotoplast. Môi trường Chu (N6) là loại môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa , được phát triển đặc biệt cho nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo , mặc dù trong các thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi trường được p hát minh bởi Nitsch (1969) vẫn được dùng phổ biến hơn. - Nhóm môi trường nghèo dinh dưỡng: Đại diện cho nhóm này là môi trường Nitsch và Nitsch. Môi trường này có hàm lượng muối đa lượng chỉ bằng ½ môi trường MS, nhưng hàm lượng các muối vi lượng và vitamin thì phong phú hơn so với MS . Môi trường Nitsch ngày càng thích hợp và phổ biến trong nuôi cấy cây đậu tương , cỏ ba lá đỏ (red clover) và các loài legume khác . Thành phần dinh dưỡng của môi trường 27 này đã giúp tăng sinh trư ởng của tế bào trong quá trình phát sinh phôi và nuôi cấy protoplast. - Nhóm thứ tư là nhóm môi trường thích hợp để nuôi cấy các cây thân gỗ: Môi trường WPM (Woody Plant Medium-Lloyd G, Mc Cown B, 1980), DKW (DriverKuniyuki Walnut, 1984) Bảng 2.6. Thà̀nh phần dinh dưỡng của một số môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật(a) Nồng độ (mg/l)(b) Thành phần Các nguyên tố đa lượng MgSO4.7H2O KH2PO4 NaH2PO4.H2O KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O (NH4)2SO4 Các nguyên tố vi lượng H3BO3 MnSO4.4H2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O KI FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O EDTA Na ferric salt Nguồn carbon Saccharose (g) Các phụ gia hữu cơ - Các vitamin White MS B5 Nitsch N6 E1 750 19 80 - 370 170 1900 1650 440 - 250 150 2500 150 134 185 68 950 720 - 185 400 2830 166 463 400 250 2100 600 450 - 1,5 5 3 0,01 0,75 - 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 0,83 27,8 37,3 - 3 10 2 0,25 0,025 0,025 0,75 43 25 10 0,25 0,025 0,025 27,8 37,3 - 1,6 4,4 3,3 1,5 0,8 27,8 37,3 - 3 10 2 0,25 0,025 0,025 0,8 43 20 30 20 20 50 25 28 Nồng độ (mg/l)(b) Thành phần White MS B5 Nitsch N6 E1 Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl Nicotinic acid myo-Inositol - Các chất khác Glycine Folic acid Biotin 0,01 0,01 0,05 - 0,5 0,5 0,5 100 10 1 1 100 0,5 0,5 5 100 1 0,5 0,5 - 10 1 1 250 3 - 2 - - 2 0,5 0,05 - - pH môi trường 5,8 5,8 5,5 5,8 5,8 5,5 Chú thích: (a). Các chất điều khiển sinh trưởng và các hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp được sử dụng bởi các tác giả khác nhau không trình bày ở bảng này . Hàm lượng và thành phần của các hỗn hợp này cũng rất khác nhau tùy thuộc vào các mô và cơ quan đặc trưng được sử dụng để nuôi cấy. (b). Chữ viết tắt: - White (White 1953) - MS (Murashige and Skoog 1962) - B5 (Gamborg et al. 1968) - Nitsch (Nitsch and Nitsch 1969) - N6 (Chu 1978) - E1 (Gamborg et al) TÓM TẮT CHƯƠNG Môi trường dinh dưỡng được sử dụng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm các thành phần sau: + Các nguyên tố đa lượng (nồng độ > 0,5mM): được sử dạng dưới dạng muối khoáng; sáu nguyên tố đa lượng cần thiết là N, B, K, Ca, Mg, S. + Các nguyên tố vi lượng (nồng độ > 0,5mM): được sử dụng dưới dạng muối hoặc acid; sáu nguyên tố đa lượng cần thiết là Fe, Mn, Zn, B, Cu, Mo. + Nguồn carbon được sử dụng dưới dạng các loại đường như: saccharose, glucose; các loại đường khác sử dụng kém hiệu quả hơn. + Các phụ gia hữu cơ: các vitamin (B), các acid amin (dạng L); các phụ gia khác (nước dừa, các dịch chiết nấm men,…); than hoạt tính; các kháng sinh. + Các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,gibberellins, abcisic acid): tùy theo nhu cầu tạo cơ quan từ mô hay tế bào mà sử dụng thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp. + Các nhân tố khác: Các nhân tố làm rắn môi trường (agar); pH môi trường (56) phù hợp cho sự sinh trưởng của thực vật. 29 Một số loại môi tường cơ bản: tùy theo nhu cầu dinh dưỡng của mỗi loại thực vật mà chọn lựa môi trường nuôi cấy cho thích hợp. Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm như sau: + Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng: Đại diện là môi trường MS (1962), ER (1965); môi trường MS được sử dụng rộng rãi thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm. + Nhóm môi trường đủ dinh dưỡng: Đại diện là môi trường Chu (N6), B5, SH; B5 là môi trường thích hợp để nuôi cấy protoplast; N6 là môi trường thích hợp nuôi cấy bao phấn của lúa, nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo. + Nhóm môi trường nghèo dinh dưỡng: Đại diện là môi trường Nitsch; môi trường này thích hợp nuôi cấy đậu tương, cỏ ba lá đỏ và các loài legume khác. + Nhóm môi trường thích hợp nuôi cấy các cây thân gỗ: WPM, DKW. CÂU HỎI Câu 1: Hãy trình bày vai trò của môi trường trong kỹ thuật nuôi cấy mô? Câu 2: Hãy nhận xét sự khác nhau giữa các môi trường cơ bản: MS, B5, Nitsh, N6, E1? Câu 3: Hãy phân tích vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy mô? Câu 4: Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, pH của môi trường nuôi cấy là một yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy. Vì sao? 30 Chương 3. NHÂN GIỐNG IN VITRO THỰC VẬT 1. MỘT SỐ THUẬT NGỮ DÙNG TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO THỰC VẬT Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (ví dụ: giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý… Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học (biotechnology). Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác. Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa (synonymous) là nuôi cấy in vitro (in vitro culture). Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống khác là cành giâm (cutting), cành chiết (layer), cành ghép (scion) hoặc hạt (seed). Năm thuật ngữ khác được dùng để chỉ các loại tái sinh sinh dưỡng (vegetative or somatic regeneration) cơ bản trong nhân giống in vitro và nuôi cấy mô: 1.1. Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem-tip culture) Phương thức nhân giống bằng cách dùng các phận rất nhỏ của đỉnh chồi (shoottip) bao gồm mô phân sinh đỉnh riêng rẽ (single apical meristem) và mầm lá non (young leaf primordia) để kéo dài chồi (shoot elongation) ngay sau đó. Kiểu nuôi cấy này được dùng lần đầu tiên để làm sạch virus (virus-free) ở thực vật. Nếu dùng đỉnh phân sinh không thể sống sót và tạo rễ một cách độc lập, thì có thể thay thế bằng phương thức vi ghép (micrografting). 1.2. Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation) Kiểu nuôi cấy này sử dụng chồi của các điểm sinh trưởng bên và ngọn nơi mà sự kéo dài của chồi ngọn (elongation of terminal shoot) bị kìm hãm và sự sinh sản chồi nách được đẩy mạnh. Sự điều khiển này cho phép nhân nhanh được các chồi in vitro (microshoots), là các chồi có thể tách ra và tạo rễ in vitro để hình thành cây trong ống nghiệm (microplants), hoặc nó có thể được cắt ra riêng biệt tạo thành các cành giâm in vitro (microcuttings) để tạo rễ bên ngoài in vitro. 1.3. Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction) Loại nuôi cấy này cho phép hình thành các chồi bất định hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. 31 1.4. Phát sinh cơ quan (organogenesis) Thuật ngữ này dùng để mô tả quá trình phát triển các chồi hoặc rễ bất định (cả chồi và rễ bất định) từ các khối tế bào callus. Quá trình này xảy ra sau thời điểm mà mẫu vật được đặt vào môi trường nuôi cấy và sự bắt đầu cảm ứng tạo callus. 1.5. Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis) Thuật ngữ này dùng cho sự phát triển của các phôi hoàn chỉnh từ các tế bào sinh dưỡng được sản xuất từ các nguồn mẫu vật khác nhau sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro. Thuật ngữ tương đương đối với sự phát triển phôi ở thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên là phát sinh phôi hữu tính (zygotic embryogenesis) và phát sinh phôi vô tính (apomitic embryogenesis). Một số thuật ngữ khác Biến nạp (transformation): Quá trình đưa vào và dung nạp một cách chắc chắn DNA lạ vào trong tế bào bất luận bằng cách gì để có được một biến đổi di truyền Biến nạp in vitro (in vitro transformation): Biến đổi di truyền ở tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro dưới tác động của các tác nhân khác nhau như chất gây ung thư, chiếu xạ, virus, vi khuẩn gây biến đổi di truyền. Biến nạp bằng điện (electroporation): Kỹ thuật dùng dòng điện tạo những lỗ thủng trên màng tế bào để chuyển nạp những vật lạ, đặc biệt là DNA từ ngoài vào trong tế bào. Cảm ứng (inducion): Hormon gây tạo một loại cấu trúc, bộ phận hay một quá trình nào đó trong điều kiện in vitro. Cấy chuyền (passage hoặc subculture): Chuyển tế bào, mô hay mẫu vật nuôi cấy sang bình nuôi có chứa môi trường mới pha với tách nhỏ hoặc làm loãng mật độ để nhân số lượng. Chồi hoặc rễ bất định (adventitious roots or shoots): Là những chồi hoặc rễ phát sinh từ những vùng khác thường, không phải là hợp tử. Chủng tế bào (cell strain): Chủng tế bào gồm những tế bào có đặc điểm riêng biệt được chọn từ nuôi cấy khởi sinh hay dòng tế bào có trước. Thường phải nêu rõ nguồn gốc của chủng tế bào trong các công bố khoa học nhất là khi các chủng đó có nguồn gốc từ các phòng thí nghiệm khác. Con lai tế bào soma (somatic cell hybrid): Tế bào hoặc cây hoàn chỉnh tạo được do lai tế bào trần với đặc tính di truyền khác nhau. Dị bội (heteroploid): Tình trạng các tế bào trong phòng thí nghiệm nuôi cấy có bộ nhiễm sắc thể ở nhiều mức bội thể khác nhau. Khái niệm này dùng như một cơ thể đa bào hay nuôi cấy gồm nhiều tế bào. Dị nhân (heterkaryon): Một tế bào có hai hay nhiều nhân khác nhau ở trong một tế bào chung, thông thường là do dung hợp tế bào tạo thành. Đỉnh sinh trưởng chồi ngọn (shoot apical meristem): Mô chưa phân hóa hình chóp nằm trong các mầm lá của chồi ngọn, khi tách không lớn quá 1mm. Độ xốp lỏng (friability): Tình trạng không liên kết của các tế bào thực vật trong khối mô sẹo. Mô sẹo xốp lỏng rất khó tái sinh cây hoàn chỉnh. Dòng (clone): Tập hợp các thể nhân được bằng phương thức nhân giống vô tính từ một cá thể duy nhất. 32 Dòng tế bào (cell line): Khái niệm để chỉ sự nuôi cấy của những tế bào có nguồn gốc chung từ lần cấy chuyển đầu tiên. Già hóa (senesemce): Biểu hiện mất khả năng phân chia của tế bào và mô trong nuôi cấy. Hiệu suất tạo dòng (cloning efficiency): Phần trăm số tế bào đã tạo được dòng khi nuôi trải trên bề mặt môi trường. Kỹ thuật vô trùng (aseptic technique): Quy trình ngăn ngừa sự nhiễm nấm, vi khuẩn, siêu vi khuẩn, hoặc các loại vi sinh vật khác đối với nuôi cấy mô và tế bào. Lai tế bào (cell hybridization): Sự dung hợp hai hay nhiều tế bào không giống nhau để tạo một thể tế bào hỗn hợp. Lai tế bào soma (somatic cell hybridization): Quá trình dung hợp protoplast của tế bào soma động vật hay thực vật đặc tính di truyền khác nhau. Lần cấy chuyển (passage number): Số lần tế bào, mô hay mẫu vật nuôi cấy được cấy chuyển, qua đó có thể tính tuổi và hệ số đẳng trương của chúng. Mật độ quần thể (population density): Số lượng tế bào trên đơn vị diện tích nuôi cấy hay trên đơn vị thể tích nuôi cấy. Mẫu vật (expant): Mô được tách từ nguyên liệu ban đầu dùng để duy trì hoặc nuôi cấy. Môi trường nhân tạo (chemically difined medium): Dung dịch dinh dưỡng dùng để nuôi cấy chỉ chứa những thành phần mà cấu trúc hóa học đã được biết. Mô sẹo (callus): Khối mô thực vật gồm những tế bào không phân hóa, có khả năng phân chia, được phát sinh từ các tế bào đã phân hóa ít nhiều. Khi thực vật bị tổn thương tạo loại mô này trên vết sẹo, vì thế có tên gọi là mô sẹo. Nhân dòng (clonal propagation): Nhân giống vô tính những dòng thực vật có nguồn gốc từ một cá thể hay một mảnh cắt duy nhất, đảm bảo hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. Nhân giống vô tính (vegatative propagation): Nhân giống không thông qua quá trình sinh sản hữu tính, bao gồm các kỹ thuật như: nhân giống in vitro, giâm các bộ phận cành, mảnh lá, đoạn rễ,.. Nuôi cấy đỉnh ngọn (shoot tip culture): Sử dụng đỉnh sinh trưởng chồi ngọn cùng với hai mầm lá với tổng kích thước từ 0,1 – 1mm. Nuôi cấy cơ quan (organ culture): Duy trì và phát triển toàn bộ hay một phần cơ quan động vật hay thực vật trong điều kiện in vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem culture): Nuôi cấy mẫu mô hình chóp không lớn hơn 0,1mm. Thường được tách từ rễ ngọn dưới kính hiển vi. Nuôi cấy huyền phù (suspension culture): Phương thức nuôi tế bào đơn hay cụm tế bào ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng. Nuôi cấy khởi đầu, nuôi cấy sơ cấp (primary culture): Nuôi cấy đầu tiên khi tách tế bào, mô hoặc mẫu vật từ cơ thể ban đầu tính đến khi cấy chuyển hữu hiệu lần đầu, từ đó sẽ thu dòng tế bào. Nuôi cấy phôi (embryo culture): Duy trì và phát triển phôi non hoặc đã trưởng thành được phân lập từ hạt. Nuôi cấy tế bào (cell culture): Khái niệm chỉ những nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) của những tế bào kể cả tế bào đơn không phân hóa thành mô. 33 Phân hóa (differentiation): Quá trình chuyên môn hóa các tế bào về chức năng và hình thái, để tạo ra các loại mô, cơ quan và cơ thể hoàn chỉnh. Phân hóa hình thái (morphogenetic differentiation): Phân hóa riêng về mặt hình thái, chủ yếu nói đến sự hình thành chồi và rễ từ mô sẹo. Đồng nghĩa với phát sinh hình thái. Phát sinh hình thái (morphogenensis): Hiện tượng phát sinh và phát triển các cấu trúc giống hay không giống các cơ quan như chồi, lá, rễ từ tế bào, mô sẹo hay mẫu vật nuôi cấy. Sạch bệnh (pathogen free): Được kiểm định là không mang mầm bệnh. Sạch virus (virus free): Được kiểm tra bằng phép thử đặc hiệu chứng tỏ không mang virus đặc trưng cần phát hiện. Tái sinh (regeneration): Hiện tượng tế bào hoặc mô nuôi cấy chịu tác động kích thích phân hóa thành mô, cơ quan hoặc cây hoàn chỉnh. Tế bào trần (protoplast): Tế bào bị làm mất toàn bộ thành tế bào. Khái niệm dùng cho cả thực vật, vi khuẩn, nấm. Vô trùng (asepsis): Không bị tạp nhiễm các loại vi khuẩn khác. 2. MỤC ĐÍCH CHUNG CỦA NUÔI CẤY MÔ Nếu đứng trên quan điểm ứng dụng mà nhìn nhận thì nuôi cấy mô và tế bào thực vật có bốn lĩnh vực ứng dụng lớn: - Sản xuất và chuyển hóa sinh học các dược liệu tự nhiên. - Cải thiện về mặt di truyền các giống cây trồng nông-lâm nghiệp và dược liệu. - Nhân giống in vitro các cây trồng quý. - Làm sạch bệnh virus. Lần lượt các chương sau sẽ đề cập đến các khía cạnh ứng dụng đó. Chương này chủ yếu nói về lĩnh vực thứ 3 là nhân giống in vitro các cây trồng quý đã được chọn lọc. Đây là một lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế thực sự. Trong đó, kỹ thuật nhân giống in vitro được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen hiếm làm vật liệu cho công tác tạo giống. - Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao các loài hoa và cây cảnh không trồng bằng hạt. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loài rau, cây cảnh và các cây trồng khác. - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lấy gỗ trong lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh. - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch bệnh virus. - Bảo quản các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen. 3. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY MÔ Phương pháp nhân giống in vitro thực chất là một bước tiến bộ vượt bậc của các phương pháp nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, giâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… 34 Ở đây giá trị thực tiễn của các tiến bộ khoa học kỹ thuật là đã biến những phương thức cổ điển đó thành những phương thức hoàn toàn mới về chất cho phép giải quyết những khó khăn mà phương pháp cổ điển không thể vượt qua. Ví dụ: kỹ thuật giâm cành chỉ có thể ứng dụng thành công ở một số cây trồng nhất định, vì rằng với kích thước 5-20 cm khả năng tạo rễ phụ của vùng mô thượng tầng gần vết cắt hoặc khả năng đánh thức chồi phụ vẫn bị các vùng tế bào lân cận và toàn bộ phần còn lại của đoạn giâm khống chế. Nếu tiến hành nuôi cấy mẫu mô với kích thước 5-10 mm, tức là làm giảm thể tích khối mô xuống 103 lần thì rõ ràng mối tương tác giữa các tế bào và các loại mô sẽ đơn giản đi rất nhiều, hiệu quả tác động của các biện pháp nuôi cấy sẽ phải cao hơn. Sau đây là một số phương thức nhân giống in vitro: 3.1. Tái sinh cây mới từ các cấu trúc sinh dưỡng Sự tái sinh cơ quan không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp vì: - Có những mối tương quan cần phải phá vỡ để lập lại những mối tương quan khác có thể đưa đến việc tái sinh cơ quan: - Gồm có các quá trình sau: + Sự phản phân hóa của những tế bào đã phân hóa, có thể dẫn đến sự trẻ hóa của tế bào. + Sự phân chia tế bào, đôi khi tạo thành mô sẹo; khi tế bào phân chia thì bắt đầu xảy ra sự hình thành cơ quan. + Sự hình thành cơ quan + Sự phát triển cơ quan. - Có một số hạn chế về mặt số lượng lẫn chất lượng do nhiều yếu tố: + Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy + Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoài thiên nhiên + Vị trí của mẫu cấy trên cây + Thời gian nuôi mẫu trong năm + Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh + Kích thước của mẫu cấy, phương pháp nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố vật lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,... 3.1.1. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh hay đỉnh phân sinh Phương thức này sử dụng các bộ phận nhỏ nhất của đỉnh chồi (shoot-tip) hay đỉnh sinh trưởng (apex) làm mẫu vật nuôi cấy. Nó bao gồm mô phân sinh đỉnh (apical meristem) và các mầm lá non (young leaf primordia). Khái niệm mô phân sinh đỉnh (ngọn) chỉ đúng khi mẫu vật được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1-0,15 mm tính từ chóp sinh trưởng. Trong thực tế mẫu vật được tách với kích thước như vậy chỉ khi nào người ta tiến hành nuôi cấy với mục đích làm sạch virus cho cây trồng. Thường sẽ gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công các mô phân sinh đỉnh riêng rẽ có kích thước nhỏ như vậy. Do đó, trong khuôn khổ nhân giống in vitro người ta thường nuôi cấy cả đỉnh chồi hoặc đỉnh sinh trưởng. Phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía, chuối… đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10 mm, nghĩa là toàn bộ mô phân sinh đỉnh và một phần mô xung quanh. Tương quan giữa độ lớn của chồi nuôi cấy, tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Nếu độ lớn tăng thì tỷ lệ sống và tính ổn 35 định tăng, nếu độ lớn giảm thì tỷ lệ sống và tính ổn định giảm. Nhưng xét về hiệu quả kinh tế nuôi cấy (thể tích bình nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng): Nếu độ lớn tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng. Do đó, phải kết hợp hài hòa được các yếu tố trên để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu. Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. Xét về nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng: - Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn). - Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ. - Cây phát triển từ chồi mới phát sinh, ví dụ: nuôi cấy đoạn trụ dưới mầm (hypocotyl) của cây mãng cầu (Annona squamosa) sẽ cho xuất hiện rất nhiều mầm (buds) trên mô nuôi cấy, một số mầm sau đó sẽ phát triển thành chồi (shoots) và trở thành cây in vitro hoàn chỉnh (plantlet). Tuy nhiên, thông thường khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi phát sinh mới. Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy như sau: - Phát triển cây trực tiếp Chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm (dicotyledon) như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc… Ví dụ: Khoai tây (Solanum tuberosum): Mầm (đỉnh sinh trưởng) → Chồi nách → Cây - Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm Chủ yếu gặp ở các dối tượng một lá mầm (monocotyledon) như phong lan, dứa, huệ… Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm (proembryo-tiền chồi) và các protocorm này có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương thức này trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể, ví dụ: Hoa lan (Orchidaceae): Đỉnh sinh trưởng → Protocorm → Cây Các đối tượng hoa lan đã mang lại hiệu quả kinh tế đặc biệt cao. Sau những kết quả đầu tiên ở chi Cymbidium của Morel (1966) người ta đã thu được kết quả rất tốt ở 22 chi khác nhau của họ này. Sở dĩ nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi như vậy là vì hoa lan có phương thức sinh sản qua protocorm (Hình 3.1). Hình 3.1. Protocom hoa lan Nhờ có phương thức nhân giống nhanh và rẻ tiền mà hoa lan vốn đắt trở nên có giả phải chăng và được nhiều người ưa chuộng. Những thành công ở họ lan không 36 những chỉ là bằng chứng mà còn mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác. Lĩnh vực ứng dụng mới đây nhất cũng đã bắt đầu có kết quả là các cây ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có các cây quý như cà phê, táo, lê, thông, bồ đề… Tổng số có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công. Vì rằng, các cây trồng rừng và các cây ăn quả là những cây trồng lâu năm nên mọi chi phí ban đầu trong nhân giống in vitro đều có thể chấp nhận được. - Ghép đỉnh chồi (shoot apex grafting) hay vi ghép Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng thông qua dinh dưỡng tự nhiên của gốc ghép. Đỉnh sinh trưởng dùng làm mắc ghép có kích thước khoảng từ 0,2-0,5 mm, được tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ trưởng thành, gốc ghép là mầm giá mới nảy mầm từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây ghép được nuôi dưỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng. Phương thức này thường dùng để tạo ra các giống cây ăn quả sạch bệnh virus nhằm cung cấp mắt ghép và cành chiết đầu dòng làm nguyên liệu nhân giống cho sản xuất đại trà. Phương thức này cho phép thu được cây hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép. Có nhiều cách ghép khác nhau, chẳng hạn: (1) Ghép lên mặt cắt: đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt lát cắt, trên vùng tượng tầng. (2) Ghép chữ T-ngược: dùng đầu nhọn của lưỡi dao cắt lỗ ghép hình chữ T-ngược, chân chữ T là mặt cắt để dễ bộc lộ vùng tượng tầng. (3) Ghép hàm ếch: khoét trên thân mầm cách mặt cắt 5 mm một vết lõm hình hàm ếch, chiều sâu vết lõm bằng chiều dày lớp vỏ. Đặt mặt ghép vào đáy hàm ếch (Hình 3.2). Hình 3.2. Vị trí mắt ghép trong ba kiểu vi ghép khác nhau 3.1.2. Nuôi cấy chồi bất định (adventitious shoot culture) Hệ thống nuôi cấy này có những yêu cầu tương tự với nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, nó chỉ khác về nguồn mẫu vật và nguồn gốc bất định của các chồi mới. Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. Một số loại mẫu vật được dùng như sau: - Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải… - Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao… - Cuống lá: thủy tiên… 37 - Các bộ phận của hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá… - Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên… - Đoạn mầm: măng tây. Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô (parenchyma cells) nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh (meristemoids) phát triển. Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn gốc từ các tế bào đơn. Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormone. Nghiên cứu sự tạo chồi ở mô nuôi cấy của cây linh sam Douglas cho thấy cytokinin (BAP 5 µM) cần thiết cho sự phát sinh chồi bất định, nhưng có ba kiểu phản ứng khác nhau có kết quả tùy thuộc vào nồng độ của auxin được cung cấp. Nồng độ auxin thấp (NAA < 5 µM) chỉ có chồi phát triển. Khi nồng độ auxin cao hơn (NAA > 5 µM) lá mầm tạo ra cả callus và nhiều chồi. Khi cung cấp chỉ riêng auxin (NAA = 5 µM) thì chỉ có callus được tạo thành. Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành callus cơ sở (basal callus) từ các chồi được tách trong nuôi cấy. Các chồi sau đó phát triển từ ngoại vi mô callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn (vascular tissue) của mẫu vật. 3.2. Nhân giống thông qua giai đoạn callus Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus. Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông qua giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus như trường hợp của Kehr và Sehaffer (1976) thu được ở tỏi. Sự phát sinh cơ quan từ callus tương tự như sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu cấy. Tế bào của mẫu cấy sẽ phản phân hóa dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật để phân chia hỗn loạn tạo thành callus. Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thì tế bào callus được cảm ứng để phân hóa tạo cơ quan. Vị trí của vùng mô phân sinh trong callus có liên quan đến tổ chức của cơ quan vừa mới hình thành trong callus, sau đó chồi và rễ phát sinh từ bên trong callus và phát triển ra ngoài. Ở một vài loài thực vật (Convolvulus), hai loại cơ quan khác nhau hình thành từ những phần khác nhau của callus, rễ thường hình thành từ những tế bào ở trên callus, còn chồi thì xuất phát từ những tế bào tiếp xúc với môi trường nuôi cấy. 3.3. Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính-công nghệ phôi vô tính 3.3.1. Phôi vô tính Một phương thức nhân giống vô tính nữa là tạo phôi vô tính từ tế bào callus. Năm 1958, Street và Reinert là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota). Đến năm 1977, Murashige cho rằng phôi vô tính có thể trở thành một biện pháp nhân giống in vitro. Ở một số loài, sự phát sinh phôi vô tính hình thành trực tiếp từ những phôi bất định (adventitious embryos) nằm 38 trong phôi tâm (nucellar embryos). Đến nay, công nghệ phôi vô tính được coi là công nghệ rất có triển vọng cho nông nghiệp trong thế kỷ 21. Phôi vô tính là các cá thể nhân giống (propagules) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào soma. Chúng rất giống phôi hữu tính (zygotic embryo) ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý, nhưng do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền (genetic recombination), các phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng. Ở trường hợp phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử (zygote). Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực: rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trưởng rễ và miền sinh trưởng ngọn cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi học như sau: - Trường hợp cây hai lá mầm: Dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm - Trường hợp cây một lá mầm: Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu Ở rất nhiều cây, người ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo nên callus khi nuôi cấy. Có thể thay đổi hướng phát triển của chúng để tạo ra các phôi vô tính với các bước phát sinh hình thái rất giống với trường hợp phôi hữu tính. Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lượng và chất dinh dưỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn không có nội nhũ. Sự khác nhau này không chỉ đáng chú ý về mặt khoa học mà còn là một yếu tố rất quan trọng trong công nghệ phôi vô tính. Tính toàn năng của các tế bào thực vật là một trong các chức năng đặc trưng nhất của tế bào và sự sinh phôi từ tế bào soma được xem là một kiểu của tính toàn năng. Sự sinh phôi từ tế bào soma giúp cho việc nghiên cứu toàn bộ quá trình phân hóa của thực vật cũng như những cơ chế biểu hiện của tính toàn năng tế bào thực vật. Có nhiều công trình nghiên cứu thành công đã thừa nhận rằng phần lớn các tế bào thực vật dù ở mức độ chuyên hóa nào đều có khả năng phản phân hóa để trở về trạng thái phôi. Ở trạng thái này một tế bào được gọi là có khả năng sinh phôi hay tế bào sinh phôi, có thể nuôi cấy trong điều kiện thích hợp để cho một phôi theo một quá trình gọi là sự phát sinh phôi vô tính.Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào đẳng kính, nhân to, nguyên sinh chất đậm đặc, và có nhiều hạt tinh bột. Những tế bào này có hàm lượng protein và RNA cao. Sự hình thành phôi gồm các bước: - Sự biệt hóa các tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi - Sự phát triển của các tế bào phôi mới hình thành thông qua giai đoạn sau: phôi hình cầu, phôi hình trái tim và phôi hình cá đuối Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống (cultivars), dòng (strains) trong cùng một loài. Khả năng này được chứng minh là do một hoặc một vài gen phụ trách. Vì vậy, bằng biện pháp lai tạo có thể chuyển khả năng tạo phôi vô tính cao từ cây này qua cây khác. Trải qua quá trình nghiên cứu lâu dài về sự hình thành và phát triển phôi soma, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng tế bào phôi phát triển tốt trong huyền phù tế bào, đồng thời thu nhận được một lượng lớn phôi từ huyền phù tế bào nói trên. Việc thu 39 nhận phôi cà rốt từ huyền phù tế bào đã được Fujimura và Komamine (1975) thực hiện bằng cách lọc để thu nhận những cụm tế bào có cùng kích thước. Năm 1979, hai ông đã sử dụng phương pháp ly tâm trong dung dịch ficoll để tách các cụm tế bào phôi dinh dưỡng thành những tế bào đơn. Các giai đoạn phát triển phôi cũng có thể phân biệt nhờ phương pháp lọc. Từ đó các nhà khoa phát triển hệ thống nuôi cấy phôi và phôi soma trong môi trường lỏng. 3.3.2. Công nghệ hạt nhân tạo Hầu hết các loài thực vật được nhân giống bằng hạt, chẳng hạn như : Hạt lúa, hạt bắp, hạt hoa, hạt rau…. Nhưng đó chỉ là hạt giống hữu tính, được tạo ra từ quá trình thụ phấn ở cây trồng. Như một thể nhân giống, hạt giống có thể được trồng trọt nhanh với những thiết bị cơ giới. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống từ hạt không hiệu quả do tỷ lệ hạt nảy mầm thấp, không đảm bảo độ đồng đều và không đảm bảo về mặt di truyền. Vì vậy, nhân giống vô tính hiện được xem là một phương pháp hiệu quả để tạo ra một số lượng lớn cây giống đạt chất lượng. Phương pháp này đã tạo ra hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo (artificial seeds or synthetic seeds) về cơ bản giống như hạt giống tự nhiên, có cấu tạo là phôi được bao bọc bởi lớp áo bên ngoài. Có sự khác biệt so với hạt giống tự nhiên là hạt giống nhân tạo không có nội nhũ. Hạt nhân tạo là phôi vô tính bọc trong một hạt polymer như: agar, agarose, alginate… Trong cấu trúc lưới của các hạt đó, nước, chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng được cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở thành cây hoàn chỉnh. Ý nghĩa khoa học của hạt vô tính là nó tạo nên những cá thể đồng nhất về mặt di truyền, tính ổn định cũng như chất lượng cây giống. Các công trình thành công trên đối tượng hạt nhân tạo mà có thể chuyển hạt đó ra bên ngoài trong những điều kiện đặc biệt có thể nảy mầm như những hạt tự nhiên, như là hạt nhân tạo của cây mía, cây dâu, địa lan… Trong việc sản xuất các hạt nhân tạo thông qua phôi vô tính từ nuôi cấy dịch lỏng, thì nồi phản ứng sinh học (bioreactor) là thiết bị không thể thay thế được. Do phôi vô tính cũng có thể nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh, nên kỹ thuật hạt nhân tạo đã được nghiên cứu và ứng dụng thành công ở nhiều nước. Hạt nhân tạo gồm có 3 phần: - Phôi vô tính - Vỏ bọc polymer (alginate) - Màng ngoài (calcium alginate) Gel bọc phôi vô tính phải có đặc điểm là có thể cung cấp chất dinh dưỡng khoáng, chất điều hòa sinh trưởng thực vật và carbohydrate thức đẩy sự tăng trưởng của phôi trong quá trình nảy mầm và giúp phôi có tỷ lệ sống cao. Có nhiều loại polymer tự nhiên đã được thử nghiệm dùng cho công nghệ phôi vô tính, trong đó alginate được coi là tốt nhất. Alginate là một polymer sinh học, được chiết từ rong biển mà chủ yếu là các loài thuộc chi Sargassum. Aliginate do các phân tử manuronic acid gắn với nhau tạo thành, giống như các phân tử glucose tạo nên cellulose. Đặc điểm quan trọng nhất của alginate là chúng ở dạng hòa tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị một (monovalent) như: Na+, K+, NH +4 … và lập tức chuyển sang dạng không tan trong nước khi kết hợp với các ion hóa trị hai (divalent) hoặc đa hóa trị (polyvalent) như: Ca2+, Mg2+, Al3+,… Nếu nhỏ một giọt dung dịch sodium alginate vào dung dịch CaCl2 thì sodium alginate ở phần diện tích ngoài của giọt sẽ chuyển hóa 40 ngay thành calcium alginate và tạo nên một màng không thấm nước. Các viên alginate được hình thành. Việc bọc vỏ cho phôi không phải là một việc dễ thực hiện vì: - Để cho phôi có thể ổn định và ngừng tăng trưởng trong vài tháng cần phải xử lý với những hóa chất và các điều kiện vật lý chuyên biệt còn đang được nghiên cứu. - Cần phải bảo vệ hạt không bị khô trong quá trình bảo quản trong điều kiện độ ẩm thấp. Nếu bị khô, hạt có thể sẽ đi vào trạng thái ngủ nghỉ lâu. Phôi cần phải được giữ nguyên vẹn và ổn định trong các quá trình vận chuyển, bảo quản và gieo hạt. - Tỷ lệ tái sinh cây từ phôi được bọc vỏ thường thấp là do: Sự tạo phôi chưa hoàn chỉnh, việc kìm hãm sự tăng trưởng của phôi khó thực hiện, chưa tạo được nội nhũ để cung cấp dưỡng chất cho phôi của hạt nhân tạo. - Cần phải bảo vệ phôi khỏi sự tấn công của các vi sinh vật bằng cách sử dụng kháng sinh và thuốc trừ nấm. Việc chọn lựa cơ chất thích hợp để gieo hạt nhân tạo cũng đã được nghiên cứu. Baker (1985) xác định rằng nên phối hợp than bùn và vermiculite để làm cơ chất gieo hạt nhân tạo cà rốt ví tránh được stress của nước. Dùng một mình vermiculite sẽ không tốt bằng. Tuy nhiên, vermiculite là cơ chất tốt vì nó không dễ vụn hay ức chế sự nảy mầm. Polyacrylamide cũng được nghiên cứu sử dụng trên vườn ươm như cơ chất để gieo hạt. Hình 3.3. Hạt nhân tạo địa lan 3.3.3. Nhân giống trong các nồi phản ứng sinh học Trước đây, các nồi phản ứng sinh học hay còn gọi là nồi lên men (fermentor) chủ yếu được dùng cho công nghệ vi sinh. Trên cơ sở các thiết bị đó, với một số cải tiến, nhiều tác giả đã nhân giống thành công nhiều loại phôi vô tính và các thể chồi, cụm chồi hoặc củ nhỏ. Phôi vô tính cà phê được sản xuất thành công ở Brasil trên các nồi phản ứng sinh học dung tích từ 2-4 lít. Nồi vận hành theo các nguyên tắc của một nồi lên men (có thể không dùng cánh khuấy mà chỉ dùng bọt khí để thực hiện việc truyền khí và truyền nhiệt). Mỗi mẻ có thể thu được 4-5 triệu phôi vô tính cà phê. Ở Indonesia, cụm chồi dứa được đưa vào sản xuất thành công với nồi lên men 10 lít. Điểm đáng chú ý trong công nghệ này là thay vì bơm khí vào nồi phản ứng, dịch lỏng nuôi cấy (môi trường mới) được bơm vào nồi và hút ra (môi trường cũ) theo chu kỳ ngắn, nhờ vậy mô và tế bào thực vật có đủ oxy và chất dinh dưỡng để phát triển mạnh. Phương thức nuôi cấy này được gọi là nuôi cấy thể ổn định hóa tính (chemostat culture). 41 Củ siêu bi (microtuber) được thị trường quốc tế công nhận là dạng khoai tây giống của thế kỷ 21. Củ khoai tây siêu bi có kích thước bằng hoặc nhỏ hơn hạt ngô, hoàn toàn sạch bệnh virus được công ty Microtuber Inc. (Mỹ) sản xuất trong các nồi phản ứng là các đoạn thân khoai tây nhân giống bằng cấy mô theo phương pháp cổ điển. Trong nồi phản ứng, các đoạn thân được kích thích ra rễ và tạo củ nhỏ. Hiện nay, Microtuber Inc. có thị trường ở Bắc Mỹ và Hà Lan. Nồi phản ứng ở hãng Microtuber Inc. là các ống nhựa kín chịu nhiệt, đường kính 15 cm, dài 50 cm, quá trình tạo củ hoàn toàn không cần chiếu sáng. Tóm lại, có 3 phương thức tạo cây con trong nhân giống in vitro: - Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (Hình 3.4). - Mẫu mô phát sinh callus và callus tạo chồi (Hình 3.5). - Mẫu mô phát sinh callus, callus phát triển phôi (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi) và từ phôi thu được cây hoàn chỉnh (Hình 3.6) Bảng 3.1. Các cây trồng có giá trị kinh tế được nhân giống bằng phương thức phát sinh phôi vô tính in vitro 42 STT Tên khoa học Tác giả 1 Citrus Stevenson (1966), Rangan et al. (1968), Jumin et al. (1996) 2 Theobroma cacao Coffea arabica Litz (1986), Alemanno et al. (1996) 4 Coffea canephora Berthouly et al. (1996), Boxtel et al. (1996) 5 Hevea brasiliensis 6 C. cogiensis × C. Canephora Eugenia Boxtel et al. (1996) Camellia sinensis Medicago suffructicosa Saccharum officinarum Docynia indica Ponsamuel et al. (1996) 3 7 8 9 10 11 12 13 14 Malus domestica Picea sitchensis Mangifera indica Sondahl and Sharp (1977), Boxtel et al. (1996) Carron and Enjalsic (1985) Litz (1984) Li et al. (1996) Aftab et al. (1996) Litz (1985) Eichholtz (1979) Moorhouse et al. (1996) Litz (1982), Pliego-Alfaro et al. (1996) Hình 3.4. Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông qua phương thức tăng khả năng phát sinh chồi nách) 43 Hình 3.5. Mẫu mô phát sinh callus, callus tạo chồi và phát triển cây hoàn chỉnh (thông qua phương thức phát sinh chồi bất định) Hình 3.6. Mẫu mô phát sinh callus, callus phát sinh phôi soma (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi soma) và từ phôi thu được cây hoàn chỉnh A B Hình 3.7. Sản phẩm invitro A: Cây cát tường in vitro; B: cây cỏ vetiver in vitro 44 A B C D E F Hình 3.8. Một số cây nuôi cấy in vitro A: hoa loa kèn; B: torien; C: qua lâu; D: sưa; E: măng tây; F: sâm ngọc linh 4. CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO Quy trình nhân giống vô tính in vitro được thực hiện theo 3 (hoặc 4) giai đoạn tùy theo phân chia của từng tác giả: - Cấy gây - Nhân nhanh - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất 4.1. Giai đoạn I-cấy gây Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau: - Tỷ lệ nhiễm thấp. - Tỷ lệ sống cao. - Tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc rất nhiều vào cách chọn cây mẹ, cách lấy mẫu. Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, 45 đoạn thân, mảnh lá, rễ… Thời gian tăng trưởng của cây trong năm có ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy. Các thay đổi về nhiệt độ, chiều dài ngày, cường độ ánh sáng và lượng nước tưới trong năm sẽ ảnh hưởng đến lượng carbohydrate, protein và các cơ chất tăng trưởng trong cây mẹ và như thế sẽ ảnh hưởng đến sự đáp ứng của mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy. Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ. Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật đều có thể được sử dụng để nuôi cấy nhưng mức độ thành công phụ thuộc vào hệ thống môi trường sử dụng, loài thực vật được nuôi cấy và sự khử trùng mẫu cấy thành công. Vì vậy, chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: - Muối khoáng: Theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962). - Chất hữu cơ: + Đường saccharose 1-6 %. + Vitamin: B1, B6, myo-inositol, nicotinic acid. + Acid amin: Arg, Asp, Asp-NH2, Glu, Glu-NH2, Tyr. + Phytohormone: Nhóm auxin: IAA, IBA, NAA, 2,4-D. Nhóm cytokinin: BAP, Kinetin, 2-iP, Zeatin. Nhóm gibberellin: GA3. Tùy theo từng loài, từng bộ phận nuôi cấy và từng mục đích nuôi cấy mà bổ sung các hàm lượng và thành phần phytohormone khác nhau. 4.2. Giai đoạn II-nhân nhanh Ở giai đoạn này người ta mới kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là: - Tạo phôi vô tính: Việc tạo ra tế bào có khả năng sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực hiện một cách nhanh chóng. Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể được cảm ứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành một cây nguyên vẹn. Các phôi vô tính là những tổ chức đơn giản được tạo ra từ tế bào soma nhưng sự phát sinh hình thái lại tương tự như phôi hữu tính. - Phát triển chồi nách: Chồi nách có thể được cảm ứng phát triển in vitro bằng làm tăng sự phát triển của những chồi đang hiện có. Một mẫu cấy mang một chồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay một cụm chồi tùy thuộc vào loài và môi trường nuôi cấy. Chồi nách sẽ được hình thành trên chồi ban đầu, qua những lần cấy chuyển quá trình này sẽ được lặp lại một cách chính xác. - Sự phát triển chồi bất định: Chồi bất định và những chồi có liên quan là những cấu trúc có nguồn gốc từ những vùng không phải là trục lá và hoặc chồi ngọn. Chồi bất định có thể có nguồn gốc từ thân, rễ, lá. Chồi bất định có thể có nguồn gốc từ callus và callus được coi là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con. Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như: 46 - Bổ sung tổ hợp phytohormone mới (tăng cytokinin giảm auxin). Tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi. - Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux. Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng. Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hóa mạnh. Ánh sáng đỏ có ảnh hưởng giống cytokinin (cytokinin-like effect), nó tạo nên sự tích lũy cytokinin trong mô của một số loài, chính lượng cytokinin này đã góp phần kích thích quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in vitro. - Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-30oC. Trường hợp những loài có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào khoảng từ 32-35oC. Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi phải < 30oC. Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích. 4.3. Giai đoạn III-chuẩn bị và đưa ra ngoài đất Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Giai đoạn này thường bị bỏ qua một cách thiếu căn cứ. Các nghiên cứu về cấu trúc của lá khoai tây nuôi cấy in vitro và so sánh với lá cây khoai tây trồng bên ngoài cho thấy chúng rất khác nhau. Điều đó chứng tỏ phải tiến hành thích nghi dần dần cây nhân giống in vitro với điều kiện tự nhiên. Quá trình thích nghi ở đây phải được hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẩu của bản thân cây non đó. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi sau: - Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô. - Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn. - Cháy lá do nắng. 5. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ VIỆC SỬ DỤNG ƯU THẾ LAI Trong chăn nuôi, việc sử dụng giống vật nuôi mang ưu thế lai ở thế hệ F1 đã trở thành biện pháp tăng năng suất quan trọng bậc nhất. Ở ngành trồng trọt, giống ưu thế lai mới chỉ được ứng dụng ở một số đối tượng như: ngô, cà chua, lúa, cải đầu, bắp cải, hành tây, măng tây, đặc biệt là các giống hoa… Sử dụng ưu thế lai không những làm tăng năng suất từ 20-40%, mà giống lai còn có đặc điểm là rất đồng đều so với giống bố mẹ. Tính đồng đều của giống là tiền đề quan trọng cho sản xuất theo phương thức công nghiệp. Ở súp-lơ chẳng hạn, phương thức sản xuất công nghiệp đòi hỏi phải thu hoạch toàn bộ diện tích bằng cơ giới vào một thời điểm. Điều này chỉ được thực hiện khi sử dụng giống ưu thế lai F1. Nếu dùng giống thuần chủng theo phương thức tự phối thì không đảm bảo, vì ở các giống rau họ cải (Brassicaceae) thường xuất hiện hiện tượng bất tự thụ. Vì vậy, 47 phương pháp nhân giống và bảo quản giống trong ống nghiệm đối với một số giống rau và giống hoa có một ý nghĩa kinh tế cao. Vấn đề đặt ra hiện nay là phải nghiên cứu các quy trình nhân giống in vitro tối ưu cho từng loài cây trồng và cải tiến quy trình đó để giảm tới mức đối đa các tốn kém về nhân công lao động trong các công đoạn nuôi cấy và đưa cây con ra ngoài đất. 6. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM KHÔNG DI TRUYỀN Bên cạnh những đặc điểm di truyền ở thực vật người ta còn phát hiện được hàng loạt đặc điểm (hình thái và sinh lý) không di truyền, đó là các đặc điểm epigenetic. Quá trình nhân giống in vitro có ảnh hưởng tới các đặc điểm không di truyền này. 6.1. Hiện tượng các đặc điểm epigenetic không lưu lại Nhân giống vô tính in vitro giống dứa Cayen không gai thông qua phân chia protocorm người ta thu được một tỷ lệ đáng kể các cá thể có gai. Bình thường trong kỹ thuật trồng dứa người ta sử dụng hom dứa có kích thước khá lớn 15-30 cm. Đặc điểm không gai đã được chương trình hóa trong các đọt có kích thước lớn như vậy và vườn dứa trồng như vậy đều không có gai. Vì sao khi tách đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy thành protocorm và cây dứa non thì gai lại xuất hiện. Có thể ở giai đoạn sinh lý sớm của protocorm và quá trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phân lập mô phân sinh của những cây dứa non tương lai đã được giải phóng một phần khỏi ảnh hưởng của tổ chức điều khiển và vì thế chúng phát triển tự do theo đặc điểm có gai của thế hệ xa xưa. Hiện tượng tương tự chúng ta cũng bắt gặp ở trường hợp cây cam không gai. Khi gieo hạt hoặc nuôi cấy phôi vô tính từ mô phôi tâm sẽ thu được những cá thể có gai. Vấn đề này hiện nay đang được quan tâm vì một số đặc tính chống chịu như chịu mặn, chịu bệnh, chịu lạnh vẫn thường là những đặc tính epigenetic và liệu thông qua nhân giống in vitro các đặc tính đó có còn được giữ lại hay không. 6.2. Hiện tượng các đặc điểm epigenetic được lưu lại Nghiên cứu nhân giống vô tính về cây cây chó đẻ (Phyllanthus amarys) cho thấy: Phyllanthus là một loại cây cỏ có thân thẳng đứng và cành ngang giống lá kép nhưng ở nách lá và có hoa cho nên vẫn tạm coi như cành ngang. Lá ở thân đứng xếp theo kiểu xoắn ốc, nhưng ở cành ngang là tương đối so le. Ở nách có cành ngang, chồi nách phát triển mạnh thành cành thẳng đứng như thân. Nếu cắt cành ngang để ươm thì sẽ thu được cành ngang dài hàng mét. Cành ngang phát triển vô hạn theo một chương trình “ngang” định trước. Nếu ươm cành thẳng thì sẽ thu được cây thẳng đứng. Như vậy, mô phân sinh của cành khác mô phân sinh của thân và khi nhân giống vô tính các bộ phận khác nhau sẽ thu được các dạng cây khác nhau. Ở đây mô phân sinh đỉnh điều khiển mô phân sinh cành phát triển theo hướng ngang. Nếu cắt bỏ mô phân sinh đỉnh sớm thì cành ngang sẽ phát triển thành cành đứng. Tế bào sinh trưởng đỉnh (organisator) điều khiển sự hoạt động của các tế bào khác (tương tự như ở động vật). Hiện tượng điều khiển hướng phát triển này có một ý nghĩa thực tiễn lớn lao. 48 Các cây cà phê và ca cao cùng có đặc điểm xếp cành tương tự như vậy, vì vậy khi tiến hành nhân giống vô tính các loài cây này phải chú ý đến hiện tượng điều khiển hướng phát triển như ở Phyllanthus. TÓM TẮT CHƯƠNG - Sự tái sinh cơ quan bao gồm các quá trình: Sự phản phân hóa của những tế bào đã phân hóa, sự phân chia tế bào, sự hình thành cơ quan, sự phát triển cơ quan. - Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh (nhờ vào mô phân sinh). Như vậy, chồi đỉnh, chồi bên (chồi nách, chồi ngủ), chồi mới phát sinh đều có thể được sử dụng trong nuôi cấy để tạo thành cây hoàn chỉnh. Ở cây một lá mầm, cây được hình thành phải thông qua giai đoạn callus. Ở cây hai lá mầm, cây được hình thành trực tiếp. - Cây có thể được tái sinh từ các mẫu vật như đoạn thân, mảnh lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ,.... Trong quá trình nuôi cấy các mẫu vật này hình thành chồi bất định trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn callus. - Mô nuôi cấy có trường hợp không tái sinh ngay mà phát triển thành khối callus, callus này sẽ tiếp tục phân hóa để phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. - Trong quá trình nuôi cấy một số tế bào hình thành phôi vô tính. Phôi vô tính khác với phôi hữu tính là không có nội nhũ. Cây có thể được hình thành từ phôi vô tính. - Hạt nhân tạo là phôi vô tính được bọc phía ngoài là chất liệu như: agar, agarose, alginate. Lớp vỏ đó cung cấp chất dinh dưỡng, chất sinh trưởng, nước và giúp cho phôi vô tính nảy mầm tạo thành cây hoàn chỉnh. - Quá trình nhân giống in vitro gồm các giai đoạn: cấy gây, nhân nhanh, chuẩn bị và đưa ra ngoài đất. + Giai đoạn cấy gây: Mẫu vật được khử trùng và đưa vào môi trường dinh dưỡng. + Giai đoạn nhân nhanh: Mẫu vật tạo cơ cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác nhau mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể được tái sinh. + Giai đoạn chuẩn bị và đưa ra ngoài đất: tạo rế, huấn luyện cây và đưa cây ra trồng ngoài đất. 49 CÂU HỎI Câu 1: Hãy trình bày kỹ thuật nhân giống phôi tính in vitro Câu 2: So sánh sự tái sinh từ cơ quan sinh dưỡng và sự tái sinh từ callus? Câu 3: So sánh hạt nhân tạo và hạt tự nhiên? Câu 4: Hãy giải thích những khó khăn trong quá trình tạo hạt nhân tạo? Câu 5: Trong quá trình nhân giống in vitro giai đoạn nào là quan trọng nhất? Vì sao? 50 Chương 4. THỤ PHẤN IN VITRO VÀ NUÔI CẤY PHÔI HỮU TÍNH 1. TÍNH BẤT HỢP CỦA GIAO TỬ TRƯỚC VÀ SAU KHI THỤ TINH Khi lai xa hai loài cây khác nhau thường xảy ra hiện tượng bất hợp của giao tử thể hiện ở hai khâu: Bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh và bất hợp của giao tử sau khi thụ tinh. 1.1. Tính bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh - Thụ phấn (pollination): Là sự tiếp nhận các hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy để thực hiện thụ tinh ở hoa . Ở thực vật hạt kín có hai phương thức thụ phấn là thụ phấn chéo và tự thụ phấn. - Thụ tinh (fertilization): Ở thực vật , thụ tinh là sự kết hợp của hai giao tử đực và cái (tinh trùng và noãn) thành hợp tử (phôi, bào tử hoặc hạt) là đặc trưng cơ bản của sinh sản hữu tính, sinh sản lưỡng tính. Ở thực vật hạt kín có phương thức thụ tinh kép. Trong tự nhiên quá trình thụ phấn của thực vật thường xảy ra theo trình tự sau : hạt phấn chín rơi lên núm nhụy , nảy mầm và tạo ra ống phấn. Ống phấn xuyên dọc theo nhụy và tiếp cận tới noãn . Lúc này hai tinh tử đơn bội (1n) của hạt phấn vào tới noãn và thực hiện quá trình thụ tinh kép : Một tinh tử kết hợp với tế bào noãn đơn bội tạo thành hợp tử nhị bội (2n) sau phát triển thành phôi , tinh tử còn lại kết hợp với tế bào nội nhũ nhị bội tạo ra hợp bào nội nhũ tam bội (3n) để nuôi phôi. Nếu một hạt phấn lạ (khác loài) rơi lên núm nhụy thì lập tức nhụy sẽ tạo ra mộ t chất ức chế sự phát triển của ống phấn hoặc làm biến dạng ống phấn ngăn cản sự thụ tinh. Đó chính là tính bất hợp giao tử trước khi thụ tinh. 1.2. Tính bất hợp giao tử sau khi thụ tinh Trong một số trường hợp khác , khi hạt phấn của loài lạ rơi lên núm nhụy , ống phấn vẫn mọc bình thường và quá trình thụ tinh xảy ra , nhưng hạt không phát triển được. Nguyên nhân chủ yếu là giữa nội nhũ và phôi đã hình thành một cơ chế ức chế sự phát triển của phôi . Đây là trường hợp hay gặp khi tiến hành lai xa khác loài hay khác chi. 2. THỤ PHẤN IN VITRO Để khắc phục hiện tượng bất hợp của giao tử khi lai xa , người ta áp dụng kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm (in vitro). Quá trình thụ phấn bao gồm tách bầu quả chứa noãn và nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Hạt phấn được đặt cẩn thận vào đầu nhụy. Khi thụ phấn thành công thì phôi sẽ phát triển trong môi trường nuôi cấy. Biện pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với trường hợp phôi phát triển không bình thường, hoặc cây cho ít hạt phấn, ống phấn phát triển chậm, tỷ lệ hạt nảy mầm thấp,… Điều kiện cơ bản là phải nuôi cấy thành công bầu quả hay noãn phân lập và chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn trong môi trường nuôi cấy vô trùng . Như vậy sau khi thụ phấn thành công phôi sẽ được nuôi ngay trên môi trường vô trùng. Thụ phấn và thụ tinh ở điều kiện in vitro tạo ra cơ hội sản xuất các phôi lai giữa các loài thực vật không thể lai bằng các phương pháp gây giống cây trồng truyền thống. Trong tự nhiên, lai khác chi (intergeneric) và lai khác loài (interspecific) rất khó thành công do có các hàng rào (barrier) gây trở ngại cho sự sinh trưởng của ống phấ n trên núm nhụy hoặc vòi nhụy . Trong những trường hợp như thế cả vòi nhụy hoặc một phần của nó có thể được tách ra và hạt phấn hoặc được đặt trên bề mặt vết cắt bầu quả hoặc chuyển qua lỗ trên thành vòi nhụy đến bầ u quả . Kỹ thuật này được gọi là thụ 51 phấn bên trong bầu (intraovarian pollination ) và được ứng dụng thành công ở nhiều loài như Papaver somniferum, Eschscholtzia californica, Argemone mexicana và A. ochroleuca. Một hướng khác nhằm vư ợt qua các hàng rào để ống phấn sinh trưởng là thụ phấn trực tiếp các noãn in vitro (in vitro ovular pollination) hoặc các noãn được tách cùng giá noãn (placenta) gọi là thụ phấn giá noãn in vitro (in vitro placental pollination). Kỹ thuật thụ phấn in vitro này được phát triển ở University of Dehli (Ấn Độ) và đã sản xuất ra nhiều thể lai giữa các loài của họ Papaveraceae và Solanaceae . Thụ phấn giá noãn cũng đã được ứng dụng thành công để vượt qua tính tự bất hợp (self-incompatibility) ở Petunia axillaris. Các kỹ thuật khác được phát triển nhằm loại bỏ các hàng rào của giai đoạn tiền hợp tử để thụ tinh , bao gồm: (a) thụ phấn nụ (bud pollination), (b) thụ phấn gốc (stub pollination), (c) xử lý nhiệt vòi nhụy , (d) chiếu xạ và (e) thụ phấn tổ hợp. Phát triển hạt thông qua thụ phấn in vitro các noãn trần được mô tả như là “thụ tinh trong ống nghiệm” (test-tube fertilisation ), trong khi quá trình tạo hạt nhờ thụ phấn núm nhụy của nhụy hoa hoàn chỉnh nuôi cấy in vitro được xem như là “thụ phấn in vitro” (in vitro pollination). Ở hai quá trình này, sự thụ tinh của trứng xuất hiện bên trong noãn bởi các giao tử được phân phối nhờ ống phấn. Ngược lại, hiện tượng “thụ tinh trong ống nghiệm” ở các hệ thống động vật đòi hỏi sự dung hợp in vitro của các trứng tách rời nhờ các tinh tử bơi tự do (free floating sperms ) còn gọi là giao tử đực . Thực tế, các giao tử đực ở thực vật không bơi tự do mà được phân phối nhờ ống phấn . Thuật ngữ chung “thụ phấn in vitro” được dùng cho thụ phấn noãn (ovular pollination-gắn hạt phấn vào các noãn tách rời ), thụ phấn bầu quả (ovarian pollination -gắn hạt phấn vào các bầu tách rời), thụ phấn giá noãn (placental pollination-gắn hạt phấn vào các noãn đính trên giá noãn) và thụ phấn núm nhụy (stigmatic pollination -gắn hạt phấn vào núm nhụy ) dưới các điều kiện in vitro. Nói chung, thụ phấn trong ống nghiệm nghĩa là thực hiện quá trình tạo hợp tử không phụ thuộc vào cơ thể mẹ. Công việc này bao gồm các bước sau: - Kích thích hạt phấn nảy mầm. - Kích thích sinh trưởng ống phấn. - Nuôi noãn và thụ tinh noãn. - Nuôi hợp tử thành hạt. Một thời gian dài phương pháp thụ phấn in vitro chỉ thành công ở một số đối tượng thuộc họ thuốc phiện (Papaveraceae), họ cẩm chướng (Caryophyllaceae) và họ cà (Solanaceae). Ở các họ này do bầu quả chứa nhiều noãn nên tương đối dễ nuôi cấy. Ở họ Hòa thảo (Poaceae) bầu quả chỉ có một noãn rất khó nuôi cấy , đồng thời hạt phấn cũng khó kích thích nảy mầm. Tuy nhiên, sau gần mười năm tập trung nghiên cứu người ta cũng đã thu được một số kết quả trên các đối tượng hòa thảo, chẳng hạn: - Sladkas và Havel (1976) bước đầu nghiên cứu trên cây ngô (Zea mays). - Nitzsche và Hennig (1976) nuôi thành công bầu quả của Lobium thụ phấn với Festuca. - Glunewald (1976) thụ phấn in vitro thành công noãn đại mạch bằng hạt phấn của mạch đen (Hordeum) và lúa mì (Triticum). 52 2.1. Phương pháp học 2.1.1. Nguyên liệu Các bầu quả (ovaries) có nhiều n oãn (ovules) là nguyên liệu thực nghiệm tốt nhất. Ở các loài thuộc họ Solanaceae (Nicotiana tabcum, N. alata, N. rustica, Petunia hybrida), họ Papaveraceae (Papaver somniferum, Eschscholtzia californica, Argemone mexicana) và họ Caryophyllace ae (Melandrium album, M. rubrum, Agrostemma githago, Dianthus caryophyllus), giá noãn được bao phủ bởi hàng trăm noãn . Do có một số lượng lớn noãn không bị tổn thương khi phân lập giá noãn , nên đã góp phần vào thành công trong thụ phấn in vitro của chúng và sự phát triển cơ bản của hạt. Một nguyên liệu không thể thay thế khác là hạt phấn (pollen), cần phải tạo ra sự sinh trưởng tốt của ống phấn trong nuôi cấy , sự nảy mầm của hạt phấn in vitro có thể gặp khó khăn ở một số họ nhưng có thể khắc phục bằng cách ngâm noãn (ví dụ : Brassica oleracea) một ngày trước khi thụ phấn trong CaCl 2 1% là nhân tố thích hợp cho sinh trưởng của ống phấn. Để bắt đầu thụ phấn trong ống ngh iệm, một số vấn đề quan trọng không thể bỏ qua là: tuổi bao phấn, cách giải phẫu bao phấn, sự nảy mầm của ống phấn trong noãn , khả năng sống sót của noãn và sự thụ tinh bên trong túi phôi . Sự xâm nhập hoàn toàn của ống phấn vào lỗ noãn có thể quan sát được bằng kính hiển vi. 2.1.2. Khử trùng nguyên liệu Các nụ hoa chỉ sử dụng cho nuôi cấy trước khi bao phấn ở giai đoạn nứt ra (dehiscence). Các nhụy hoa (pistils) sau khi loại bỏ đài và trà ng hoa, hoặc các bầu quả riêng rẽ, được khử trùng sơ bộ bằng cách rửa nhanh với Ethanol 70%, khử trùng bề mặt bằng các tác nhân thích hợp , và cuối cùng rửa sạch bằng nước cất vô trùng . Bầu quả sau đó được bóc vỏ cẩn thận bằng dao mổ, kẹp, hoặc kim để lộ phần noãn gắn vào giá noãn. Giá noãn hoàn toàn , hoặc một phần của nó có mang noãn , được dùng trong thụ phấn giá noãn. Để thực hiện thụ phấn núm nhụy in vitro, các nhụy được tách rời và khử trùng cẩn thận bề mặt bằng dung dịch khử trùng và sau đó thấm khô núm nhụy . Phân lập hạt phấn ở điều kiện vô trùng, bao phấn được loại bỏ khỏi nụ hoa hoặc các hoa đã mở được giữ trong các đĩa petri có giấy lọc vô trùng cho tới khi nứt ra , các hạt phấn sau đó được đặt trong các noãn nuôi cấy , giá noãn hoặc núm nhụy tùy thuộc vào bản chất thí nghiệm. Nói chung, hạt phấn được đặt trực tiếp lên bộ phận nhụy nuôi cấy tốt hơn khi dàn trải trên môi trường chung quanh noãn. 2.1.3. Nuôi cấy noãn và bầu quả - Noãn. Sinh trưởng của ống phấn gắn trên noãn trần (bare ovules) thường bị ức chế bởi sự có mặt của nước trên bề mặt của noãn . Màng nước này phải được làm khô bằng giấy lọc và sau đó , noãn khô ráo được phủ bằng hạt phấn . Các hạt phát triển từ các noãn có phôi hình cầu hoặc phôi già có thể dễ dàng phân biệt , một số kết quả đã đạt được ở Gynandropsis gynandra, Impatiens balsamina, Nicotiana tabacum và Allium cepa. Tuy nhiên , các noãn sau khi thụ phấn in vitro mang hợp tử đơn bào (singlecelled zygote) cần các điều kiện sinh trưởng phức tạp hơn . Kỹ thuật cho các noãn tự thụ phấn hoặc th ụ phấn chéo là giống nhau . Trong sự phát triển ở các giai đoạn phát sinh phôi tiếp theo thì noãn tự thụ phấn thường được giữ trên giá noãn cho tới khi tạo thành hạt, trong khi ngược lại noãn thụ phấn chéo cần giá noãn ch ỉ từ 6-8 ngày nuôi cấy đầu tiên . Sau đó , chúng có thể được chuyển tới môi trường nuôi không có giá noãn. Kỹ thuật nuôi cấy noãn quan trọng không những phục vụ cho sự thụ phấn in 53 vitro mà còn cho nhiều thí nghiệm nghiên cứu phản ứng in vitro của giao tử và phôi non. - Bầu quả. Kỹ thuật nuôi cấy bầu quả được phát triển bởi Nitsch (1951), ông đã nuôi thành công bầu quả tách từ các hoa thụ phấn in vitro để phát triển thành quả chín (Cucumis và Lycopersicum). Các quả này mang hạt có thể nảy mầm được nhưng chúng có kích thước nhỏ hơn các quả phát triển ở điều kiện tự nhiên . Các tác giả khác cũng đã nuôi cấy thành công các noãn tách rời từ một số loài (Linaria macroccana, Tropaeolum majus, Iberis amara, Hyoscyamus niger) trên môi trường chứa muối khoáng và saccharose. Bổ sung vitamin B vào môi trường giúp quả đạt kích thước bình thường và các hạt có thể nảy mầm được. Các môi trường nuôi cấy ngày càng giàu dinh dưỡng hơn do bổ sung IAA hoặc nước dừa , thậm chí cho quả có kích thước lớn hơn các quả hình thành trong điều kiện in vivo (Anethum graveolens). Thành phần bao hoa như mày hoa và lá bắc có vai trò quan trọng trong sự phát triển của quả và phôi ở cây một lá mầm . Các bầu quả tách rời sớm sau khi đã thụ phấn của Triticum aestivum và T. spelta chỉ phát triển trong quá trình nuôi cấy khi bao hoa được duy trì nguyên vẹn . Nếu thiếu nhân tố này , sự tổng hợp DNA và kéo dài tế bào của các tế bào phôi lúa mạch có thể xảy ra nhưng sự phân chia tế bào không xuất hiện. 2.2. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro 2.2.1. Trạng thái sinh lý của mẫu vật Trạng thái sinh lý của nhụy ở thời điểm tách rời noãn ảnh hưởng đến sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro. Bề mặt noãn hoặc núm nhụy (trong thụ phấn núm nhụy) ẩm ướt có thể ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt phấn hoặc phát triển của ống phấn và tiếp theo đó là hình thành hạt kém . Sự nảy mầm của hạt phấn trên núm nhụy và sự sinh trưởng của ống phấn dọc theo vòi nhụy có ảnh hưởng đến sự tổng hợp các protein, là các nhân tố đôi khi có thể ức chế hoàn toàn ống phấn trong bầu quả . Do đó, cần phải xác định bộ phận nào của nhụy tồn tại hàng rào ngăn cản. Để cải thiện khả năng thụ phấn in vitro, mức độ bất hợp phải được giảm xuống bằng cách tách bộ phận tổng hợp các protein ức chế và thụ phấn trực tiếp phần còn lại của nhụy dưới các điều kiện thí nghiệm. Thời gian tách noãn khỏi nhụy ảnh hưởng đến sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro. Các noãn được tách ra sau khi nở hoa từ 1-2 ngày cho khả năng hình thành hạt cao hơn khi tách noãn vào ngày ra hoa . Ở ngô và bông, thụ phấn in vitro sau khi xuất hiện râu tơ từ 3-4 ngày cho kết quả tạo hạt tốt hơn. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường dinh dưỡng có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển bình thường của bầu quả và noãn trong nuôi cấy cho tới khi tạo hạt . Maheshwari (1958) đã nuôi cấy thành công noãn trên môi trường dinh dưỡng bao gồm muối khoáng theo Nitsch, vitamin theo White (xem bảng 4.1), và 5% saccharose. Noãn của Papaver rhoeas và P. somniferum được tách 6 ngày sau khi thụ phấn (DAP- days after pollination) và thu được hợp tử hoặc tiền phôi có hai tế bà o (two-celled proembryo ) chứa một vài nhân nội nhũ (endosperm nuclei). Sinh trưởng của phôi ở giai đoạn đầu thấp hơn nhưng ngay sau đó ở giai đoạn hình cầu sinh trưởng nhanh hơn và đạt kích thước 0,93 mm so với 0,65 mm của phôi in vivo. Bổ sung kinetin và CH là cần thiết để kích thích sinh trưởng ban đầu của phôi . Một số noãn của hoa lan (orchids) được phân lập từ các bầu quả đã thụ phấn sinh trưởng tốt trên dung dịch đơn giản có saccharose 10%, nhưng noãn của Zephyranthes 54 (mang một hợp tử và một nhân nội nhũ sơ cấp ) cần bổ sung nước dừa hoặc casamino acid vào môi trường Nitsch . Ở Trifolium repens, noãn (1-2 DAP) phát triển thành hạt trưởng thành chỉ khi môi trường nuôi cấy được b ổ sung dịch chiết các loại quả non như dưa chuột hoặc dưa hấu. Trong nuôi cấy in vitro các noãn đã được thụ phấn ở hầu hết các loài thì môi trường Nit sch có cải biến (Bảng 4.1) được sử dụng rộng rãi . Tuy nhiên , môi trường Steward và Hsu (S-H) thích hợp hơn cho nuôi cấy các thể lai cùng loài hoặc khác loài sau khi thụ tinh các noãn non (Bảng 4.2). Môi trường nuôi cấy chứa IAA 10 µg/L hoặc kinetin 0,1 µg/L làm tăng số lượng hạt được tạo thành từ noã n. Nồng độ cao hơn của kinetin thường gây ức chế . Nguồn nitrogen (hỗn hợp các amino acid hoàn chỉnh ) không ảnh hưởng đến tần số thụ tinh của các bầu quả của ngô được thụ phấn in vitro, nhưng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển tối thích của hạt (Bảng 4.3). Áp lực thẩm thấu của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của noãn tách rời. Nói chung, noãn chứa các phôi hình cầu phát triển thành hạt trưởng thành trên môi trường chứa saccharose từ 4-10%, nhưng các noãn non đã được thụ tinh có một hợp tử và một vài nhân nội nhũ , hoặc các noãn vừa mới thụ tinh cần 6% và 8% saccharose, tương ứng. 2.2.3. Điều kiện nuôi cấy Nói chung, nhiệt độ và ánh sáng có ản h hưởng đến quá trình thụ tinh trong ống nghiệm. Thông thường bước một của quá trình này xảy ra ở nhiệt độ phòng và không cần sự chiếu sáng đặc biệt . Chỉ ở giai đoạn sau , nuôi cấy bầu quả cần được duy trì ở 22-26oC và các điều kiện thích hợp khác có lợi cho phát sinh phôi. Sau khi thụ phấn trong ống nghiệm một vài ngày , một số noãn mở rộng, và ống phấn chui hoàn toàn vào trong túi phôi , cả phôi lẫn nội nhũ đều phát triển . Hiện tượng này có thể xác minh bằng các thí nghiệm tế bào-phôi học (cytoembryology). 2.2.4. Kiểu gen Phản ứng của bầu quả in vitro trong mối liên quan với sự hình thành hạt tùy thuộc vào từng loài . Hạt phấn của các loài họ cải khó nảy mầm trong nuôi cấy và người ta phải cải tiến kỹ thuật nuôi cấy cho phù hợp bằng cách nhúng noãn của Brassica oleracea trong dung dịch CaCl 2 1%, sau đó gieo chúng trên một lớp gelatin 10% mỏng (10 µm) rồi thụ phấn với hạt phấn. Lớp gelatin mỏng được bảo quản trong đĩa petri có phủ giấy lọc gắn vào nắp hộp. Sau 24 giờ nuôi, noãn được thụ tinh và chuyển lên môi trường Nitsch có agar cho tới khi tạo hạt. Bảng 4.1. Môi trường Nitsch-sử dụng phổ biến trong nuôi cấy các noãn thụ phấn in vitro Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) CaNO3 500 FeC6O5H7.5H2 O 10 KNO3 125 Glycine 7,5 KH2PO4 125 Capantothenate 0,25 55 Thành phần Nồng độ (mg/L) MgSO4.7H2O 125 Pyridoxine HCl 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 Thiamine HCl 0,25 Na2MoO4 0,025 Niacin 1,25 ZnSO4.7H2O 0,5 MnSO4.4H2O 3 H3BO3 Thành phần Nồng độ (mg/L) Saccharose 50000 Agar 7000 0,5 Bảng 4.2. Môi trường Steward và Hsu (S-H)-nuôi cấy các thể lai cùng loài và khác loài từ các noãn non được thụ tinh Thành phần Nồng độ (mg/L) Thành phần Nồng độ (mg/L) 8,6 KNO3 5055 KI NH4NO3 1200 MnSO4.4H2O 0,83 KH2PO4 272 H3BO3 16,9 MgSO4.7H2O 493 Acid nicotinic 6,18 CaCl2.2H2O 441 Pyridoxine HCl 0,49 FeSO4.7H2O 8,3 Thiamine HCl 0,82 Na2-EDTA 11 Inositol 1,35 CuSO4.5H2O 0,025 D-Fructose 180 CoCl2.6H2O 0,024 Saccharose 3600 Na2MoO4.2H2O 0,24 IAA 40000 5 × 10-5 mol/L ZnSO4.7H2O Bảng 4.3. Môi trường Gengenbach có hỗn hợp các amino acid hoàn chỉnh-cần thiết cho sinh trưởng và phát triển tối thích của hạt ngô Thành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ KH2PO4 3750* Threonine 198** MgCl2.6H2O 1500* Serine 347** CaCl2.2H2O 1200* Glutamate 1761** CuSO4.5H2O 0,1* Proline 621** CoCl2.6H2O 0,1* Alanine 476** Fe-EDTA 50* Cystein 160** Na2MoO4.2H2O 1* Valine 330** 56 Thành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ ZnSO4.7H2O 10* Methionine 117** KI 5* Isoleucine 237** MnSO4.4H2O 100* Leucine 1009** H3BO3 100* Tyrosine 262** Glycine 168** Phenylalanine 387** Thiamine HCl 0,4** Lysine 88** 0,044** Histidine 164** 1,2** Arginine 150** Asparagine 300** Glutamine 292** Tryptophan 204** Acid folic Niacin Saccharose 150*** IAA Agar 5,5*** Aspartate 500** Chú thích: * : µM, ** : mg/L, *** : g/L 2.3. Ứng dụng của thụ phấn in vitro Được ứng dụng ít nhất ở 3 lĩnh vực : ( a) vượt qua sự tự bất hợp (selfincompability), (b) vượt qua sự bất hợp khi lai (cross-incompability) của các giao tử và (c) sản xuất thể đơn bội thông qua trinh sản (parthenogenesis). Các loài Petunia axillaris và P. hybrida là tự bất hợp . Hạt phấn nảy mầm tốt trên nhụy được tự thụ phấn nhưng tồn tại một hàng rào ngăn cản ở trong bầu quả đã cản trở sự phát triển của ống phấn , làm cho ống phấn không thể thụ tinh với noãn . Các hàng rào trong các taxon này có thể được vượt qua bằng sự th ụ phấn in vitro và sự hình thành hạt xuất hiện bình thường . Ở loài P. axillaris tính bất hợp cũng có thể vượt qua nhờ sự thụ phấn nụ hoa in vivo (in vivo bud pollination). Nuôi cấy thành công các noãn được thụ phấn in vitro đã tăng khả năng sản xuất các thể lai. Lai cùng loài (intraspecific), khác loài (interspecific), khác chi (intergeneric) và khác họ (interfamilia) cũng đã được tiến hành thông qua sự thụ phấn giá noãn và noãn in vitro. Một ứng d ụng khác của thụ phấn in vitro là sản xuất các thể đơn bội của Mimulus luteus cv. Tigrinus grandiflorus bằng cách thụ phấn các noãn tách tời của nó với Torenia fournieri. Thể đơn bội của M. luteus phát triển bằng trinh sản . Sự phát triển bằng trinh sản như thế của các thể đơn bội trong nuôi cấy từ các noãn được thụ phấn nhưng không thụ tinh đã được thông báo ở các loài Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum và Triticum aestivum. 3. NUÔI CẤY PHÔI HỮU TÍNH Trong thực vật có hoa, phôi là những thực thể có hình thái rõ rệt và đảm nhiệm chức năng như giai đoạn trung gian trong thời kỳ chuyển tiếp giữa pha giao tử thể và pha bào tử thể. Ở thực vật bậc cao, các phôi trong hạt phát triển từ sản phẩm kết hợp giữa các loại giao tử khác nhau và được gọi là phôi hữu tính. Nuôi cấy phôi hữu tính là một hướng nghiên cứu in vitro được sử dụng trong nhân giống và chọn giống thực vật. 57 Nuôi cấy phôi hữu tính là sự phân lập và sinh trưởng vô trùng trong điều kiện in vitro của các phôi được sản xuất bằng phương thức hữu tính với mục đích là thu các cây con. Thông qua kỹ thuật này người ta có khả năng giải phóng các phôi lai mà các phôi này không thể phát triển một cách bình thường khi còn non. Kỹ thuật nuôi cấy phôi hữu tính cũng được ứng dụng để nghiên cứu các điều kiện vật lý và dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển phôi , phá ngủ nghỉ của hạt để rút ngắn chu kỳ sinh trưởng của cây trồng, xác định khả năng nảy mầm của hạt và vi tạo dòng (microcloning) các nguyên liệu nguồn (source material ). Thông thường thuật ngữ “phôi” (embryo) được dùng cho các phôi hữu tính . Vì thế, khái niệm “nuôi cấy phôi” (embryo culture) trong chương này được xem là nuôi cấy phôi hữu tính Một vấn đề khác là muốn thành công trong lai xa , tức là lai khác loài và khác chi không có con đường nào khác là tìm ra kỹ thuật vượt qua được sự bất hòa hợp giữa phôi và nội nhũ sau khi lai. Kỹ thuật nuôi cấy phôi phân lập có khả năng giải quyết tốt khó khăn này. Laibach (1925) là người đầu tiên nuôi được phôi non của cây lai bất dục thành cây non khỏe mạnh: Hình 4.1. Nuôi cấy phôi non của cây lai bất dục Linum perenna × L. austriacum Một số cặp lai khác loài và khác chi đã thành công nhờ phương pháp nuôi cấy phôi: - Hordeum × Secale (Brink và cs. 1944). - Elyms × Triticum (Ivanovskaja 1946). - Trisacum × Zea (Farquarharson 1957). - Cây lai hữu thụ nổi tiếng Hordecale : Hordeum maritinum × Secale cereale (Dehue và cs. 1977). 3.1. Các kiểu nuôi cấy phôi 3.1.1. Nuôi cấy phôi non Kiểu nuôi cấy này được dùng chủ yếu cho các phôi non có nguồn gốc từ các hạt lai hoặc hạt non không thể nảy mầm . Tách các phôi như thế là rất khó khăn và môi trường nuôi cấy chúng rất phức tạp . Cơ hội thành công của loại nuôi cấy này phụ thuộc rất lớn vào giai đoạn phát triển của phôi phân lập. 3.1.2. Nuôi cấy phôi trưởng thành Các phôi trưởng thành được tách ra từ các hạt chín và nuôi cấy , chủ yếu để tránh sự ức chế trong hạt đối với sự nảy mầm . Kiểu nuôi cấy này tương đối dễ dàng vì 58 phôi chỉ cầ n môi trường dinh dưỡng đơn giản chứa muối khoáng , đường và agar để sinh trưởng và phát triển. Để thu được phôi ở tuổi đặc biệt , thì sự thụ phấn nhân tạo các hoa là rất cần thiết và người ta có khả năng xây dựng mối quan hệ giữa các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của sự phát triển phôi với DAP. 3.2. Kỹ thuật nuôi cấy 3.2.1. Khử trùng bề mặt Phôi của thực vật có hạt thường phát triển bên trong noãn được bao bọc bởi bầu quả. Vốn ở chúng đã tồn tại sẵn một môi trường vô trùng do đó khử trùng bề mặt phôi là không cần thiết trừ khi vỏ hạt bị tổn thương hoặc xuất hiện sự nhiễm hệ thống . Vì thế các hạt trưởng thành , noãn nguyên vẹn , hoặc quả được khử trùn g bề mặt và các phôi vô trùng tách khỏi các mô chung quanh . Khử trùng bề mặt được tiến hành bằng cách ngâm nguyên liệu vào trong dung dịch khử trùng thương mại có hypochlorite (Clorox 5-10%, sodium hoặc calcium hypochlorite 0,45%) trong 5-10 phút hoặc Ethanol (70-75%) trong 5 phút. Nồng độ thấp của các chất hoạt dịch (surfactant) như Tween 20, Tween 80, Teepol, hoặc Mannoxol được bổ sung vào dung dịch khử trùng làm tăng tính thấm của mô . Đối với hạt ngô , và các phôi tách rời: ngâm trong Ethanol 70% cộng với 5-10 phút khử trùng bằng sodium hypochlorite 2,6%. 3.2.2. Phân lập phôi Phân lập phôi phải thực hiện ở điều kiện vô trùng dưới laminar (laminar air flow hood). Phôi trưởng thành phâ n lập tương đối dễ bằng cách giải phẫ u hạt. Ngâm hạt có vỏ cứng (Iris, Cyclamen) trong nước từ một vài giờ đến một vài ngày trướ c khi khử trùng để giải phẫu nó được dễ dàng hơn. Phân lập các phôi nhỏ hơn hoặc phôi non đòi hỏi giải phẫu phải đặc biệt cẩn thận nếu chúng được bọc trong nội nhũ dạng lỏng . Trong trường hợp như thế cần mở rãnh ở đầu lỗ noãn của noãn non và gây áp lực gây ở đầu đối diện để thu được phôi thông qua rãnh nứt . Ở những loài họ đậu, phôi thường có kích thước lớn, rất thuận lợi cho quá trình phân lập phôi. Tuy nhiên, trong một số trường hợp nuôi cấy, cần phải có một số lượng đủ các phôi và ở cùng giai đoạn phát triển. Ở những thực vật có hoa dạng chùm, phôi được hình thành ở các độ tuổi khác nhau và những phôi non thường được sắp xếp ở đỉnh của chùm hoa. Các phôi hữu tính được hình thành trong môi trường vô trùng của mô noãn và mô bầu hoa. Do đó, trong nhiều trường hợp có thể tách phôi ngay và đưa vào nuôi cấy ở điều kiện vô trùng. Ở các loài lan thường hạt có kích thước nhỏ, vỏ hạt tiêu giảm nhiều và thiếu mô nội nhũ. Vì vậy, phải tiến hành vô trùng hạt trước khi tách phôi cho nuôi cấy (Raghavan, 1977). Trong quá trình phân lập phôi, cần hạn chế đến mức thấp nhất sự tổn thương của dây treo phôi. Dây treo phôi sẽ phát triển đến kích cỡ lớn nhất của nó khi phôi hình thành giai đoạn phát triển hình cầu và bắt đầu chuyển sang giai đoạn hình tim. Do đó, kích thước nhỏ và cấu trúc mỏng manh cho nên khó phân lập được dây treo phôi còn nguyên vẹn cùng với phôi để nuôi cấy. Một số nghiên cứu đã cho thấy dây treo phôi có vai trò rất quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của phôi non. Khi loại bỏ dây treo phôi đã làm giảm đáng kể tỷ lệ hình thành cây con từ phôi non. 3.3. Môi trường dinh dưỡng Nhu cầu dinh dưỡng của phôi trong quá trình phát triển in vivo chia làm hai pha: (a) pha dị dưỡng (phase)-pha sớm, ở pha này phôi nhận chất dinh dưỡng từ nội 59 nhũ và (b) pha tự dưỡng (autotrophic phase)-pha muộn, ở pha này phôi có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho sinh trưởng của chúng . Giai đoạn phôi chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng khác nhau tùy loài. Thành phần môi trường cho sinh trưởng của phô i non hoặc chưa trưởng thành khác với phôi trưởng thành . Monnier (1976), đã xây dựng phương pháp cho phép phát triển hoàn chỉnh phôi non ở Capsella (giai đoạn hình cầu sớm ) cho đến khi nảy mầm mà không cần chuyển chúng khỏi vị trí nuôi cấy đầu tiên trong đĩa petri (Hình 4.2). Theo hướng này , Ko và cs (1983) cũng thu được sự sinh trưởng liên tục của các phôi chưa trưởng thành ở lúa. Hình 4.2. Phương pháp nuôi cấy phôi non cho đến khi nảy mầm mà không cần chuyển chúng khỏi vị trí nuôi cấy đầu tiên trong đĩa petri. 3.3.1. Muối khoáng Các chất dinh dưỡng của môi trường MS , B5 và White có cải biến nhất định được sử dụng cho hầu hết các thí nghiệm n uôi cấy phôi . Chẳng hạn, môi trường nuôi cấy phôi của Capsella có nồng độ potassium cao hơn (bổ sung 350 mg/L KCl) và nồng độ calcium (CaCl2) gấp đôi , nồng độ của NH 4NO3 và Fe -EDTA giảm gần một nửa , còn nồng các muối vi lượng theo MS là gấp đôi. 3.3.2. Nguồn carbon Saccharose là nguồn carbon chủ yếu được sử dụng để cung cấp năng lượng cho phôi nuôi cấy in vitro. Trong nuôi cấy phôi của một số loài (ví dụ: ngô) có thể cần bổ sung maltose, lactose, raffinose, hoặc mannitol. Một số loài thuộc họ Rosaceae và các loài lai thuộc chi Lilium bổ sung glucose tỏ ra có ưu thế hơn saccharose. Phôi của Heracleum spondylum sinh trưởng hiệu quả trên môi trường chứa glucose , fructose, galactose, mannose, hoặc mannitol . Glucose cũng cần thiết cho sinh trưởng của rễ ở phôi Ginkgo trưởng thành. Glucose và saccharose ngoài vai trò dinh dưỡng , còn có khả năng duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường (phải lưu ý đến tuổi phôi ). Phôi trưởng thành sinh trưởng khá tốt ở nồng độ saccharose thấp nhưng các phôi non hơn thường đòi hỏi nồng độ của carbonhydrate cao hơn. Nói chung, các nồng độ khác nhau của saccharose dùng trong nuôi cấy phôi phụ thuộc vào loài và kích thước/tuổi của phôi. 3.3.3. Nguồn nitrogen Phôi có một hệ thống enzyme rất tốt có thể biến đổi nitrite thành nitrate và sau đó thành ammonium . Ammonium nitrate có ưu thế quan trọng hơn so với KNO 3, 60 NaNO3 và (NH4)2HPO4. Sự có mặt của ion NH 4+ rất cần thiết cho sinh trưởng và phân hóa của phôi. Các amino acid khác nhau và các amide của chúng đã được thử nghiệm cho nuôi cấy phôi. Một số tác giả cho rằng asparagine tăng khả năng sinh trưởng của phôi , nhưng những tác giả khác lại thấy glutamine là nguồn nitrogen có ưu thế sinh trưởng cho phôi của một số loài (ví dụ: Capsella bursa-pastoris, Arabidopsis thaliana, Reseda odorata) còn asparagine lại ức chế mạnh sự sinh trưởng của chúng . Các amino acid khác có tác dụng kích thích hoặc ức chế. Dịch thủy phân casein (CH), một phức hợp amino acid , được sử dụng rộng rãi để bổ sung vào các môi trường nuôi cấy phôi . Nồng độ CH tối ưu cho Hoderum vulgare khoảng 500 mg/L, trong khi phôi Datura tatula sinh trưởng ở nồng độ CH 50 mg/L. Các amino acid, CH và các amide có thể được khử trùng bằng nồi khử trùng áp suất hơi và cùng với các chất dinh dưỡng của môi trường. 3.3.4. Dịch chiết thực vật tự nhiên Nếu môi trường được bổ sung thêm nước dừa không khử trùng bằng autoclave , các phôi này sẽ tăng chiều dài nhưng không có dấu hiệu nảy mầm sớm . Nhiều tác giả gợi ý rằng sự có mặt của “nhân tố phôi” (embryo factor) trong nội nhũ dạng lỏng của nước dừa có thể thay thế cho sự thiếu hụt đường, amino acid, các hormone sinh trưởng và các chất khác trong môi trường nuôi cấy . Nước dừa có hiệu quả kích thích sinh trưởng của phôi non tách rời của mía đường, lúa mạch , cà chua , cà rốt và các loài dương xỉ. Các dịch chiết tự nhiên từ các phần của mô ở các loài thực vật có thể kích thích sinh trưởng phôi và ức chế nảy mầm sớm của phôi lúa mạch chưa trưởng thành bằn g cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy dịch chiết chuối , dịch chiết quả chà là , dịch thủy phân lúa mì-gluten và dịch chiết cà chua. Các dịch chiết này có hiệu quả tương tự nước dừa. Dịch chiết của Datura và Sechium cũng có hiệu quả như nước dừa , nhưng dịch chiết từ hạt Lupinus lại có hiệu quả gấp đôi. Người ta đã cố gắng thay thế các “nhân tố phôi” của nước dừa bằng các hóa chất xác định . Để kích thích sự sinh trưởng của tiền phôi lúa mạch, nước dừa có thể được thay thế bằng môi trường White giàu phosphate bổ sung thêm hai amino acid chính là glutamine và alanine và năm amino acid khác có vai trò như là nguồn cung cấp nitrogen, ở pH 4,5. Tỷ lệ sống sót của phôi tăng lên khi nồng độ của KCl , KNO3 và các thành phần hữu cơ nhất định tăng lên từ 5-10 lần. 3.3.5. Các chất điều khiển sinh trưởng Auxin và cytokinin không được sử dụng nhiều trong nuôi cấy phôi do chúng cảm ứng tạo callus . Ở nồng độ rất thấp (0,01 mg/L) GA kích thích phát sinh phôi của phôi non lúa mạch mà không cần cảm ứng nảy mầm sớm , và kích thích sinh trưởng ở các phôi tách rời dạng hình tim của Phaseolus. Cũng có một số kết quả cho rằn g ABA có hiệu quả tương tự trên phôi lúa mạch và Phaseolus. 3.3.6. pH môi trường Các phôi tách rời sinh trưởng tốt trên môi trường có pH 5,0-7,5. Đây là phạm vi pH của dịch noãn (6,0). Nói chung pH môi trường được điều chỉnh 0,5 đơn vị cao hơn giá trị pH mong muốn để bù đắp cho sự thay đổi không thể điều chỉnh trong quá trình khử trùng. 61 3.3.7. Điều kiện nuôi cấy Nói chung nhiệt độ 25 ± 2oC thích hợp cho sinh trưởn g và nảy mầm của phôi . Đôi khi nhiệt độ tối ưu cho nuôi cấy phôi có thể khác nhau giữa các genotype trong cùng một loài . Các loài Zamia, Phaseolus, bông thích hợp với nhiệt độ ấm (27-30oC), trong khi nhiệt độ nuôi cấy phôi của các loài lai ở Brassica, lúa, lúa mạch thích hợp từ 17-22oC. Trước đây , nhiều tác giả cho rằng ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng của phôi in vitro, nhưng những nghiên cứu gần đây khi nuôi cấy phôi chưa trưởng thành của lúa mạch , lanh, loài lai Aegilops × Hordeum, và các cá thể lai khác loài của Allium lại tiến hành trong tối trước khi chuyển chúng sang điều kiện sáng để nảy mầm. Các phôi sơ cấp dạng hình tim của các loài Ilex mẫn cảm với ánh sáng . Các phôi thứ cấp rất kh ó sinh trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng trong suốt 4 ngày nuôi đầu tiên. Nhiều tác giả cho rằng nuôi trong tối ở giai đoạn ban đầu (bốn ngày) là rất cần thiết theo đó chúng có thể sinh trưởng tới giai đoạn trưởng thành thậm chí dưới điều kiện chiếu sáng liên tục. 3.4. Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi 3.4.1. Môi trường dinh dưỡng Các môi trường dinh dưỡng đang sử dụng hiện nay thường có áp suất thẩm thấu thấp hơn dịch noãn được nuôi cấy trên môi trường đó . Rất có thể môi trường không hoàn toàn thích hợp . Vì vậy, người ta đã tìm cách sử dụng dịch chiết xuất từ nội nhũ để đưa ra một công thức môi trường thích hợp hơn, chẳng hạn: - Môi trường dinh dưỡng. - Nội nhũ khoẻ. - Phôi lai. Nội nhũ khỏe có thể cung cấp cho phôi lai những chất cần thiết . Cây cho nội nhũ có thể là những loài khác nhau của cùng một chi. 3.4.2. Phát sinh callus Khi nuôi phôi non của tổ hợp lai : Hordedum vulgare × Secale cerale, người ta đã thấy phôi phát triển thành khối callus . Điều này chỉ có thể giải thích được rằng mối tương tác giữa phôi và môi trường din h dưỡng không bình thường như giữa phôi và nội nhũ. Dù sau đó có thể tái sinh được cây hoàn chỉnh từ khối callus thì cây tái sinh cũng sẽ mang nhiều thay đổi vì callus thường không ổn định về mặt di truyền . Ternovsky và cs (1976) đạt được một kết quả lý thú là thu được cây thuốc lá có tính chống chịu mới khi nuôi phôi từ hạt lai không nảy mầm. 3.5. Ứng dụng của nuôi cây phôi hữu tính 3.5.1. Thu nhận thể đơn bội Nuôi cấy phôi hữu tính được sử dụng để thu nhận các thể đơn bội thông qua quá trình loại bỏ trực tiếp nhiễm sắc thể (NST) sau khi lai xa. Trong tổ hợp lai Hordedum vulgare × H.bulbosum sự thụ tinh đã xảy ra nhưng NST H.bulbosum bị đào thải ưu tiên trong những lần phân bào sớm của quá trình phát sinh phôi. Tiếp theo là sự phân hủy nội nhũ khoảng 2-5 ngày sau thụ tinh và chỉ còn lại cấu trúc phôi đơn bội. Cấu trúc này khi được nuôi sẽ phát triển thành cây đơn bội H.vulgare. Tổ hợp lai giữa hai loài càng khác xa nhau thì sự đào thải hoàn toàn bộ NST đơn bội của một loài càng dễ xảy ra. 62 3.5.2. Kiểm tra sức nảy mầm của hạt Nuôi cấy phôi hữu tính được dùng để kiểm tra khả năng nảy mầm của hạt, đặc biệt là các hạt giống có sức sống kém và hạt sau thời gian bảo quản. Đánh giá sự nảy mầm của các phôi hữu tính tách rời được xem như một phương pháp kiểm tra chính xác và tin cậy hơn các phương pháp nhuộm phôi hạt truyền thống. 3.5.3. Nhân giống các cây hiếm Hạt một số loài thực vật rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên đã làm giảm khả năng sinh sản hữu tính của chúng. Giống dừa quả Makapuno ở Philipin có giá trị kinh tế cao nhưng rất khó nhân giống từ hạt. Bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi tách rời, người ta thu được các cây dừa con với tỷ lệ thành công là 85% (De Guzman và cộng sự, 1976). 3.5.4. Thụ phấn trong ống nghiệm Trong tự nhiên, núm nhụy có thể nhận hạt phấn nhưng không phải tất cả chúng đều thành công trong quá trình thụ phấn. Núm nhụy và vòi nhị chỉ cho phép một hạt phấn thực hiện chức năng của nó, các hạt phấn khác sẽ bị loại bỏ. Vì vậy, khi hạt phấn của một loài nào đó rơi vào núm nhụy của một loài khác sẽ không thể tiếp tục phát triển được do có một số rào cản trong quá trình thụ tinh. Xảy ra sự bất hợp trước khi thụ tinh và sự bất hợp sau khi thụ tinh. Những rào cản đó có thể vượt qua được bằng kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm. Nhưng trước tiên phải nuôi cấy được noãn hoặc bầu hoa trong điều kiện vô trùng. Thụ phấn trong ống nghiệm là tiến hành toàn bộ quá trình nảy mầm của hạt phấn, sinh trưởng của ống phấn, thụ tinh và phát triển phôi hạt trong điều kiện in vitro. Phôi được hình thành là phôi hữu tính và được nuôi cấy tiếp trong điều kiện in vitro. TÓM TẮT CHƯƠNG Khi lai các loài hay các chi khác nhau thường xảy ra hiện tượng bất hợp giao tử: Phôi không được hình thành hay phôi có sức sống kém. Thụ phấn in vitro là quá trình bao gồm tách bầu quả chứa noãn và nuôi cấy trong điều kiện in vitro; hạt phấn được đặt cẩn thẩn vào đầu nhụy; phôi sẽ được phát triển trong môi trường nuôi cấy. Thụ phấn in vitro sẽ khắc phục được hiện tượng trên. Nuôi cấy phôi hữu tính: là sự phân lập phôi hữu tính và phôi sinh trưởng trong điều kiện vô trùng in vitro tạo thành cây hoàn chỉnh. Phương pháp này được sử dụng để nuôi cấy các phôi có sức sống kém được tạo ra từ lai xa giữa các loài hay các chi. 63 CÂU HỎI Câu 1: Vì sao thụ phấn in vitro được sử dụng để lai xa các loài? Câu 2: Hãy trình bày các bước của quá trình thụ phấn in vitro? Câu 3: Hãy phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ phấn in vitro? Câu 4: Hãy trình bày và giải thích ý nghĩa của việc nuôi cấy phôi hữu tính? Câu 5: Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy phôi hữu tính? 64 Chương 5. NUÔI CẤY BAO PHẤN VÀ HẠT PHẤN 1. TÍNH ĐƠN BỘI CỦA THỰC VẬT Hầu hết các loài cây trồng của chúng ta đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội (2n) và tứ bội (4n). Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai hay nhiều allen của một gen chi phối . Nếu đó là những cá thể dị hợp tử , tức là các gen trong mỗi hệ gen nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng (phenotype) của gen đó hoàn toàn tùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định. Vì vậy, mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng phải là mức đơn bội (1n) hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng phải đồng nhất tuyệt đối. Các đồng hợp tử tuyệt đối này là nguyên liệu quý cho công tác chọn giống vì tất cả gen lặn trong đó có tính trạng quý cũng được biểu hiện ra kiểu hình. Từ lâu, các nhà di truyền và chọn giống cây trồng đã sử dụng trạng thái đơn bội của cây trồng để tiến hành nghiên cứu và thông qua đa bội hóa thể đơn bội đó để thu được các dạng đồng hợp tử tuyệt đối. Tuy nhiên, các phương pháp kinh điển để thu nhận cây đơn bội cho hiệu quả rất thấp. Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây đơn bội đã là một biện pháp hữu hiệu đối với lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào nghiê n cứu di truyền và tạo giống cây trồng. Việc tạo cây đơn bội rồi sau đó nhân đôi NST của thể đơn bội này để tạo ra các cá thể lưỡng bội đồng hợp tử là con đường ngắn nhất giúp cho nghiên cứu di truyền và chọn giống được nhanh hơn. Sự phân ly kiểu gen của các cá thể đồng hợp tử đơn giản hơn, kiểu hình biểu hiện chính xác kiểu gen. Sự tạo ra các cá thể đồng hợp tử đặc biệt quan trọng trong nhân giống cây trồng vì đã giúp rút ngắn thời gian rất nhiều so với việc tạo ra các cá thể này bằng phương pháp tự thụ phấn. Các thể dị hợp tử có thể tăng lên rất nhiều khi xảy ra sự thụ phấn chéo. Nếu sự tự thụ phấn có thể xảy ra với những thực vật thụ phấn chéo thì sau đó rất khó thu được các thể đồng hợp tử do hiện tượng lai giống cận huyết. Để thu được các thể đồng hợp tử bằng cách tự thụ phấn thì phải mất 5-7 thế hệ. Việc sử dụng các thể đơn bội trong nhân giống các thể đột biến rất thuận tiện vì các đột biến lặn (ví dụ đột biến A thành a) có thể phân biệt được ngay. Đây không phải là trường hợp thể nhị bội AA bị độ biến thành Aa; sự tự thụ phấn của thể đột biến Aa chỉ làm tăng một trong số 4 cặp đột biến lặn. Nếu như có sẵn thật nhiều các tế bào đơn bội thì việc gây đột biến sẽ đạt được tỷ lệ cao. Hơn nữa, tế bào đơn bội khi đột biến sẽ không tạo ra thể khảm. Bằng kỹ thuật gây đột biến các dạng đơn bội, có thể chọn các dòng tế bào và cây chống chịu độc tố do nấm và vi khuẩn gây bệnh tiết ra, các dòng tế bào có khả năng sản xuất một lượng lớn sản phẩm thứ cấp quan trọng như chất thơm, các loại nhựa và enzyme sử dụng trong công nghiệp, y học. Với các thể đơn bội c ủa thực vật bậc cao người ta có thể sử dụng vào các mục đích khác nhau như: 65 - Nghiên cứu di truyền của các gen, cả gen trội và gen lặn cũng như nghiên cứu về mối tương tác của các gen. - Tạo đột biến ở mức độ đơn bội. - Tạo dạng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cho công tác tạo giống. 2. PHƯƠNG PHÁP TẠO THỂ ĐƠN BỘI IN VIVO Kể từ khi Bergner phát hiện ra cây đơn bội ở Datura stramonium vào năm 1921, các nhà tạo giống thực vật đã tập trung nghiên cứu và thu được nhiều cây đơn bội hoặc trong điều kiện in vitro hoặc trong điều kiện in vivo. Trong số các loài thực vật đã biết cho đến bây giờ thì các thể đơn bội tự nhiên được biết đến chỉ khoảng hơn 100 loài nhưng tần số rất thấp. Nguồn quan trọng nhất để có thể tìm được những cá thể đơn bội tự nhiên là nhóm “một hạt hai phôi”. Trong hạt này có thể có một cặp n-n (là kết quả của sự tăng trưởng của một trứng không thụ tinh và một tế bào kèm) hoặc một cặp 2n-n (từ sự tăng trưởng của một trứng thụ tinh và một trứng không thụ tinh). Trong tự nhiên, các dạng đơn bội tăng lên do kết quả của sự trinh sản và các cây này hiếm khi mang các đặc điểm của cây bố . Các kỹ thuật in vivo được ứng dụng để sản xuất cây đơn bội như sau: 2.1. Sinh sản đơn tính cái (gynogenesis) Sản xuất các thể đơn bội riêng rẽ bằng cách phát triển các tế bào noãn bất thụ (unfertilised egg-cell) trong trường hợp sự thụ phấn xảy ra chậm hoặc dùng những hạt phấn khác xa loài để thụ tinh. Sự sinh sản đơn tính cái này đặc biệt xảy ra trong trường hợp lai giữa Solanum tuberosum (2n = 4x) × S. phureja (2n = 2x) kết quả tạo ra dạng song đơn bội (dihaploid) là khoai tây (2n = 2x) có nguồn gốc từ thể tứ bội. Ngoài tự nhiên, trong sự sinh sản đơn tính cái thì phôi nhũ phát triển nhưng phôi thì bị thui đi. 2.2. Sinh sản đơn tính đực (androgenesis) Sản xuất các thể đơn bội riêng rẽ bởi sự phát triển của tế bào noãn man g nhân của bố. Trong trường hợp này thì nhân của tế bào noãn (egg-nucleus) bị loại đi hoặc bị bất hoạt trước khi thụ tinh. 2.3. Sự đào thải hệ gen bằng lai xa Hiện tượng này xảy ra khi lai giữa hai loài khác nhau hay hai giống khác nhau. Khi xảy ra quá trình lai, hiện tượng thụ tinh xảy ra và ngay sau đó một trong hai bộ gen bị loại bỏ và phôi phát triển chỉ mang một bộ gen vì vậy tạo ra thể đơn bội. Một ví dụ quan trọng trong trường hợp này là sự lai khác loài giữa Hordeum vulgare và H. bulbosum cho ra cây đơn bội H. vulgare. 2.4. Sự giao phối không hoàn toàn (semigamy) Trong trường hợp này là nhân của tế bào noãn và nhân sinh sản (generative nucleus) của hạt phấn nả y mầm phân chia độc lập và kết quả là tạo ra thể khảm đơn bội (haploid chimera). 2.5. Xử lý hóa chất Một số hóa chất , như chloramphenicol và parafluorophenylalanine có thể cảm ứng đào thải một bộ nhiễm sắc thể ở các tế bào hoặc mô soma , làm tăng các thể đơn bội. Xử lý bằng toluene blue , maleic hydrazide , nitrous oxide và colchicine cũng có thể cho các kết quả tương tự. 66 2.6. Shock nhiệt Xử lý nhiệt độ cao hoặc nhiệt độ thấp có thể có tác dụng trong việc ngăn cản sinh sản hữu tính (syngamy) và cảm ứng thể đơn bội. 2.7. Ảnh hưởng của chiếu xạ Tia X hoặc ánh sáng UV gián tiếp cảm ứng làm đứt gãy nhiễm sắc thể và đào thải chúng, tạo ra các thể đơn bội. 3. PHƯƠNG PHÁP TẠO THỂ ĐƠN BỘI IN VITRO Thể đơn bội trong tự nhiên không có ý nghĩa trong nhân giống vì bản thân nó bất thụ. Muốn sinh sản được thì đơn bội này phải được nhân đôi số lượng nhiễm sắc thể để trở thành thể nhị bội hữu thụ. Sự nhân đôi tự nhiên xảy ra do sự gián phân trong quá trình hình thành phôi hoặc chồi bất định; hoặc do xử lý colchicine. Thường thể nhị bội đồng hợp tử được thu nhận sau quá trình nhân đôi nhiễm sắc thể nhưng thể nhị bội này không phải là mục đích cuối cùng của các nhà chọn giống thực vật mà họ sử dụng chúng làm vật liệu cho quá trình lai sau đó để thu sản phẩm có giá trị hơn về chất lượng lẫn số lượng. Nhìn chung, các phương pháp in vivo có hiệu suất sản xuất cây đơn bội thấp . Các phương pháp in vitro cho hiệu quả cao hơn nhờ kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn (pollen culture) hoặc nuôi cấy bao phấn (anther culture) ở khoảng 250 loài và loài lai. Các loài đặc trưng của họ Solanaceae cho kết quả tốt hơn cả , mặc dù ở các họ Cruciferae, Poaceae, Ranunculaceae và một số họ khác cũng có khả năng cảm ứng tạo cây đơn bội bằng sinh sản đơn tính bao phấn hoặc từ nuôi cấy hạt phấn phân lập. Đơn bội xuất hiện trong nuôi cấy in vitro vào giữa những năm 60. Guha và Maheshawari (1964-1966) đã phát hiện được những cấu trúc giống phôi trong nuôi cấy bao phấn của cà độc dược (Datura) và chứng minh được rằng cây đơn bội này xuất hiện từ hạt phấn đơn bội . Năm 1967, Bourgin và Nitsch đã nuôi thành công cây thuốc lá Nicotiana đơn bội từ bao phấn tới lúc ra h oa. Cho đến nay , người ta đã thành công trong nuôi cấy bao phấn của nhiều loài như: lúa, lúa mì, ngô, cải, tiêu... 3.1. Phương thức phát sinh cây đơn bội 3.1.1. Phương thức tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn Kỹ thuật tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn độc lập rất khó thực hiện so với nuôi cấy túi phấn. Tuy nhiên, phương pháp này có một số ưu điểm so với nuôi cấy túi phấn: + Cơ hội tái sinh của thể nhị bội từ túi phấn bị hạn chế mạnh do sự đào thải những phần mang bộ NST nhị bội trên túi phấn như vách ngăn, vách túi phấn, tế bào sắc tố. + Túi phấn không còn hoạt động như rào cản sự vận chuyển các chất khoáng từ môi trường nuôi đến hạt phấn. + Do sự đào thải các phần khác mà các chất ức chế như acid abscisic, các chất độc từ cơ chất không còn là vấn đề quan trọng. + Có thể tránh được sự tạo callus từ túi phấn, kết quả là ít tạo ra thể khảm hơn. Nếu như callus phát triển từ một hạt phấn thì các tế bào của callus có dùng kiểu gen, còn nếu callus phát triển từ nhiều hạt phấn thì ta sẽ có callus khảm về mặt di truyền. + Sự biến nạp trực tiếp thường xảy ra từ giai đoạn hạt phấn cho đến khi phôi được hình thành. 67 + Các thao tác trên bộ gen và các nghiên cứu về đột biến trên hạt phấn thuận tiện hơn là trên túi phấn. + Sự hình thành phôi từ hạt phấn dễ quan sát thấy hơn trong túi phấn. Bên cạnh những thuận lợi trên thì thực tế vẫn khó có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của hạt phấn độc lập để tạo thể đơn bội. Môi trường sử dụng nuôi cấy hạt phấn phức tạp hơn môi trường nuôi cấy túi phấn nhiều nhưng số lượng cá thể đơn bội được tạo ra ít hơn rất nhiều. Tuy nhiên, hiện nay các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy thành công hạt phấn của các loài: Brassica napu, Lycopersicon , Datura innoxia,… - Nguyên lý: Nuôi cấy hạt phấn đơn bội (tiểu bào tử) tách rời, hoặc bao phấn có chứa hạt phấn đơn bội trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội. - Có hai phương pháp cơ bản được sử dụng để nuôi cấy bao phấn, hạt phấn: + Các bao phấn được nuôi trên môi trường đặc hoặc môi trường lỏng. Sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn, từ đó hình thành cây đơn bội. + Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn bằng phương pháp cơ học hoặc do sự tách rời tự nhiên từ bao phấn, được nuôi trong môi trường lỏng, từ đó tạo cây đơn bội. Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực. Người ta phân biệt 3 phương thức sinh sản đơn tính đực: a. Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử Tiểu bào tử trong bao phấn → Phôi → Cây đơn bội (n = 1) Cấu trúc dạng phôi (embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn . Quá trình này thường xảy ra trong bao phấn, điển hình là: Datura, Nicotiana, Atroppa. b. Sinh sản vô tính qua callus Tiểu bào tử trong bao phấn → Callus → Chồi → Cây đơn bội (n = 1) Cây hoàn chỉnh phát triển từ khối callus , khối mô này thường phát triển ra ngoài bao phấn, ví dụ: Oryza, Brassica, Lolium, Hordeum. Kiểu phát triển này không thuận lợi vì có nhiều thể có mức độ bội thể khác nhau được tạo thành do: sự dị hợp tử tự nhiên của vật liệu khởi đầu (đơn bội, nhị bội), sự bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, sự biến đổi tự nhiên từ dạng đơn bội sang nhị bội. Các mô đơn bội thường không cạnh tranh được với các mô độ bội thể cao hơn. c. Sinh sản đơn tính hỗn hợp Giai đoạn phát triển callus xảy ra rất ngắn và khó nhận biết , ví dụ : Datura, Lycopersicum (chưa chắc chắn). - Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn: Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội là kỹ thuật khá phức tạp, phụ thuộc vào yếu tố như: Kiểu gen của cây cho bao phấn, trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn, nhân tố thành bao phấn,…Tuy nhiên, nuôi cấy bao phấn có một số bước cơ bản như sau: + Chọn bao phấn: Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định trong việc tạo cây đơn bội, thích hợp nhất là bao phấn chứa hạt phấn bắt đầu từ thể 4 nhân đến ngay sau khi 68 nguyên phân lần thứ nhất. Bao phấn của những hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của các hoa muộn. + Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy nhằm kích thích sự phân chia của tiểu bào tử và từ đó tạo thành cây đơn bội. Chế độ xử lý nhiệt phụ thuộc vào loài cây. Hạt phấn của cây chè (Camellia sinensis) thì xử lý ở nhiệt độ 30-350C trong khoảng thời gian từ 2 đến 5h trước khi nuôi cấy ở nhiệt ở 250C sẽ cho tỷ lệ hình thành callus và cho các thể phân sinh cao (Saher và Bhattacharya, 1988). Một số tác giả khác cho rằng, xử lý nụ hoa lúa nước (Oryza sativa) loài phụ Japonica ở nhiệt độ 100C trong 2-3 tuần, còn loài phụ Indica thì ở 70C trong 1 tuần; xử lý hoa thuốc lá (Nicotinia tabacum) ở 2-50C trong khoảng 2-3 ngày sẽ thuận lợi cho việc nuôi cấy bao phấn để tạo cây đơn bội. - Chọn môi trường tái sinh thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy hạt phấn, bao phấn mà ta chọn lựa môi trường thích hợp tương ứng để tạo ra cây đơn bội. Tuy nhiên, cũng có một số nguyên tắc chung. + Các cây thuộc họ hòa thảo cần hàm lượng auxin cao, đặc biệt là 2,4 D để kích thích sự phân bào. + Các cây họ cà thì cần hàm lượng auxin ít hơn + Hàm lượng đường trong môi trường nuôi cấy cao. Tùy theo đối tượng nuôi cấy mà môi trường có hàm lượng đường khác nhau. Đối với ngô cần 60-120g g/L, lúa nước cần 50-60 g/L, còn đối với cây cà lại cần 20-40 g/L,… + Các nguồn chất hữu cơ bổ sung và chất phụ gia: Các nguồn chất hữu cơ bổ sung không xác định được như dịch chiết khoai tây, nước dừa, dịch chiết nấm men,… có tác dụng đối với việc nuôi cấy bao phấn của nhiều loại thực vật. Môi trường nuôi cấy cho thêm 100 g dịch chiết khoai tây cho kết quả khá tốt khi nuôi cấy bao phấn các cây thuốc lá, lúa nước và lúa mỳ (Anonymuos, 1966,1967). Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi khi nuôi cấy bao phấn đơn bội. Ví dụ: Than hoạt tính có hiệu quả tích cực khi nuôi cấy bao phấn cây thuốc lá (Anagnostakis, 1974; Bajaj và Heberle1977); nuôi cấy bao phấn lúa mạch đen (Wenzel, Holfmann và Thomas, 1977)… + Các nguyên tố vi lượng ít ảnh hưởng trong việc nuôi cấy bao phấn. - Chọn lọc cây đơn bội: Không phải tất cả các cây được hình thành từ nuôi cấy bao phấn là cây đơn bội. Do vậy vẫn phải xác định chính xác cây đơn bội. Có nhiều cách khác nhau để xác định cây đơn bội như làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái,… 3.1.2. Phương pháp tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh - Nguyên lý: Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh còn được gọi là sinh sản đơn tính cái. Nghiên cứu tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh được White (1932) và Maheshwari (1958) tiến hành trên cây Antirhinum và cây Cooperia pedunculata nhưng vẫn chưa có kết quả rõ rệt. 69 Thành công đầu tiên trong việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh là việc thu nhận được callus đơn bội từ nuôi cấy noãn cây Ginkgo biola (Tulecke,1964). Do hiện tượng một số loài cây như hành, tỏi, củ cải đường,… việc tạo cây đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cho cây đơn bội nhưng cây bị bạch tạng. Vì vậy, người ta giải quyết vấn đề khó khăn trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh để tạo cây đơn bội. Đã có nhiều thành tựu trong lĩnh vực này. - Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh: Về cơ bản kỹ thuật này giống như nuôi cấy bao phấn, hạt phấn. Kết quả nuôi cấy tế bào noãn phụ thuộc vào các yếu tố như kiểu gen của cây mẹ và biến động tùy thuộc loài cây. Những loài cây như hành, tỏi, củ cải đường tỷ lệ nuôi cấy noãn thành công khoảng từ 10-20%, ở lúa nước là 5-12% còn ở dâu tằm là 3-6%. Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh gặp nhiều khó khăn, phức tạp, chủ yếu là do tách tế bào noãn rất khó khăn và khi tách dễ gây tổn thương cho mô. Để tăng hiệu quả của nuôi cấy tế bào noãn chưa thụ tinh tạo cây đơn bội, người ta kết hợp nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt,…Hiện nay, nuôi cấy noãn chưa thụ tinh ở các cây ngũ cốc như lúa, ngô dễ thành công hơn cả. Người ta đã nuôi cấy được nhiều noãn từ một bắp ngô non chưa thụ phấn và tạo ra hạt ngô đơn bội in vitro đạt tỷ lệ 4-5%. 3.2. Các bước phát triển bình thường và phát triển phôi của hạt phấn Bình thường sau khi được giải phóng từ tứ tử hạt phấn chứa một nhân , giai đoạn này được gọi là giai đoạn hạt phấn đơn nhân. Sau đó, nhân chia đôi tạo thành một nhân dinh dưỡng và một nhân sinh sản . Nhân sinh sản lại chia đôi tạo thành hai tinh tử (giai đoạn nảy mầm tạo thành ống phấn ) làm nhiệm vụ thụ tinh kép cho noãn và nội nhũ của túi phôi. Sunderland (1970) cho rằng trong nuôi cấy in vitro, bước phát triển đầu tiên của hạt phấn vẫn xảy ra như bình thường cho tới giai đoạn hai nhân . Quá trình tạo phôi thường bắt đầu từ nhân sinh sản , nhân dinh dưỡng hay cả hai nhân , song chủ yếu là nhân dinh dưỡng, trong khi nhân sinh sản chỉ phân chia một vài lần rồi ngừng hẳn . Có trường hợp ngoại lệ cây đơn bội phát triển từ nhân sinh sản nhưng thường rất yếu. Cũng có ý kiến ngược lại , chẳng hạn Raghav an (1977) cho rằng phần lớn phôi Hyoscyanus niger mà ông thu được bằng nuôi cấy bao phấn có nguồn gốc nhân sinh sản. Về nguyên tắc , thì kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho phép tạo được đơn bội bằng nhiều phương thức khác nhau, nhưng phương thức bắt đầu từ tiểu bào tử vẫn là tiện lợi nhất. 3.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn 3.3.1. Kiểu gen của cây cho bao phấn Tần số tạo cây đơn bội liên quan chặt chẽ đến kiểu gen và thay đổi theo các chi, các loài và giữa các loài phụ, giữa các giống. Ở lúa mì, tần số cảm ứng của callus hạt phấn và sự tạo thành cây xanh tiếp sau đó được điều khiển bởi nhiều gen . Mỗi kiểu gen khác nhau tương ứng với phản ứng sinh sản đơn tính khác nhau trong nuôi cấy bao phấn. Vì thế, đây là vấn đề cần lưu ý để chọn lọc chỉ các kiểu gen có phản ứng cao , còn hơn là tập trung chú ý đến việc cải thiện các điều kiện cho hệ thống nuôi cấy (một vấn đề phức tạp) trong nuôi cấy bao phấn. Kết quả nuôi cấy bao phấn thuốc lá N.langsdorfii thường thấp hơn khi so sánh với những loài khác thuộc cùng một chi (Durr và Fleck, 1980). Tỷ lệ hình thành phôi khác nhau rõ rệt giữa các giống thuốc lá thuộc loài N. tabacum khi chúng được xử lý ở 70 14oC trong 5 ngày. Ở lúa, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn của những giống thuộc loài phụ Indica là dễ dàng hơn các giống của loài phụ Japonica. Sự khác nhau đó có thể do mỗi kiểu gen cần một tập hợp những điều kiện tối ưu cho quá trình tạo mô sẹo và phát sinh phôi. Picard và De Buyser (1977) kết luận rằng, bao phấn của cây lúa mì đơn bội kép cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao gấp 3-10 lần cây lúa mì bình thường. 3.3.2. Nhân tố thành bao phấn Hạt phấn của một giống thuốc lá sẽ phát triển thành phôi ngay cả khi chuyển vào bao phấn của một giống khác . Chính kết quả này đã đưa ra khái niệm “nhân tố thành” (wall factor) và nó giúp đỡ cho nhiều nhà nghiên cứu sử dụng “hiệu ứng bảo mẫu” (nursing effect ) của bao phấn ho àn chỉnh để phát triển sinh sản đơn tính ở các hạt phấn phân lập của nhiều loài . Dịch chiết của bao phấn cũng có tác dụng kích thích sản xuất phôi hạt phấn (pollen-embryo production). Các nghiên cứu về mô học (histology) đã xác định vai trò của nhân tố thành bao phấn trong việc phát triển phôi hạt phấn. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy glutamine riêng rẽ hoặc phối hợp với serine và myo-inositol có thể thay thế nhân tố thành bao phấn trong các thí nghiệm nuôi cấy hạt phấn phân lập. 3.3.3. Môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng . Sinh sản đơn tính tiểu bào tử ở Nicotiana tabacum và Datura innoxia có thể được cảm ứng trên môi trường agar đơn giản chỉ chứa sucrose . Hạt phấn tiếp tục phát triển trên môi trường như thế cho đến giai đoạn hình cầu (globular stage). Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi trường. Tuy nhiên, hầu hết các loài thuộc họ Solanaceae chỉ phát triển sinh sản đơn tính trên môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete nutrient medium) bao gồm các loại muối khoáng , vitamin và sucrose của Nitsch hoặc MS . Muối Fe (40 µmol/L Fe-EDTA hoặc Fe -EDDHA) dường như quyết định chủ yếu cho sự phát triển phôi của hạt phấn 3 hoặc 4 tuần tuổi trong quá trình nuôi cấy. Ở các loài không thuộc họ Solanaceae, thành phần môi trường bao gồm : các chất điều khiển sinh trưởng và các hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp (như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein , nuớc dừa ). Môi trường của một số tác giả Trung Quốc như Chu (N6) và Yu-Pei (Bảng 5.1) dùng cho nuôi cấy bao phấn ngô . Môi trường N6 sau đó cũng được sử dụng cho nuôi cấy bao phấn của các loại ngũ cốc khác như lúa , lúa mạch đen . Trong khi nhiều loà i cần có auxin và /hoặc cytokinin để cảm ứng sinh sản đơn tính thì đa số các loài thuộc họ Solanaceae chỉ cần môi trường cơ bản. Sucrose là một thành phần không thể thay thế của môi trường , thông thường người ta sử dụng ở n ồng độ 2-4% nhưng các loài như Brassica cần nồng độ cao hơn (10%). Thay thế sucrose bằng cách bổ sung glutathione , ascorbic acid và glucose cũng có tác dụng tương tự , kích thích sinh sản đơn tính ở lúa mạch đen . Bổ sung than hoạt tính hoặc 2-chloroethyl-phosphate vào môi trường nuôi cấy cũng có tác dụng kích thích sinh sản đơn tính ở một số hệ thống nuôi cấy. Các nguồn chất hữu cơ không xác định như dịch chiết khoai tây,cà chua, dịch chiết nấm men,… và các amino acid, glutamine có tác động tích cực đối với sinh trưởng trong nuôi cấy bao phấn của nhiều loài thực vật. Môi trường nuôi cấy được đưa 71 vào 100 g dịch chiết khoai tây đã cho kết quả khá tốt trong nuôi cấy bao phấn của thuốc lá, lúa và lúa mì (Anonymuos, 1976,1977). Myo-inosytol (5 g/L) có ảnh hưởng tích cực trong phát sinh phôi hạt phấn ở nhiều thành viên họ cà. Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc đẩy sự khởi đầu của phôi từ mô bao phấn đơn bội. Hiệu quả tích cực của than đã được chứng minh trong nuôi cấy bao phấn của thuốc lá (Anagnostakis, 1974); Bajaj, Reinert và Heberle, 1977), lúa mạch đen (Wenzel, Hoffmann và Thomas, 1977), và các thực vật khác. Bảng 5.1. Môi trường Yu-Pei Thành phần MgSO4.7H2O KH2PO4 KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O KI Nồng độ (mg/L) 370 510 2500 165 176 1,6 4,4 1,5 0,8 Thành phần FeSO4.7H2O Na2EDTA Sucrose Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl Nicotinic acid 2,4-D Agar/agarose Nồng độ (mg/L) 27,8 37,3 50 g 1,0 0,5 0,5 2,0 10 g 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng Gây shock nhiệt sẽ tăng tần số sinh sản đơn tính tiểu bào tử . Các nụ được xử lý lạnh ở 3oC hoặc 5oC/72 giờ kích thích hạt phấn phát triển thành phôi (xấp xỉ 58%) ở một số loài thuộc họ Solanaceae (Datura, Nicotiana), ngược lại bao phấn được duy trì ở 22oC trong cùng thời gian chỉ cho khả năng phát triển phôi khoảng 21%. Nói chung, gây shock nhiệt từ 2-5oC/72 có tác dụng kích thích sự phát triển khô ng bình thường của giao tử đực và tích lũy hạt phấn đơn nhân (ức chế sự phát triển tiếp ở các giai đoạn sau). Cụm hoa hình chùy (panicles) được tách rời của lúa khi xử lý ở 13oC/10-14 ngày cho tần số hạt phấn tạo callus cao nhất. Cảm ứng sinh sản đơn tính sẽ có hiệu quả cao nếu bao phấn của các loại ngũ cốc khác (lúa, ngô, pennisetum) được bảo quản ở nhiệt độ thấp trước khi nuôi cấy . Một số kết quả nghiên cứu cho thấy tiền xử lý bao phấn ở nhiệt độ 35oC đã kích thích sinh sản đơn tính ở một số loài Brassica và Capsicum. Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng , mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối. Tuy nhiên, các hạt phấn phân lập dường như mẫn cảm với ánh sáng hơn so với bao phấn . Ánh sáng trắng cưòng độ thấp (low intensity white light) hoặc ánh sáng 72 huỳnh quang đỏ (red fluorescent light ) kích thích phát triển nhanh hơn của phôi trong nuôi cấy hạt phấn thuốc lá phân lập so với với ánh sáng trắng cường độ cao. 3.3.5. Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn Bao phấn tách từ cây sinh trưởng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ/ngày) và ở vùng có cường độ ánh sáng cao cho phản ứng tương đối tốt hơn so với cây dài ngày (16 giờ/ngày) có cùng cường độ chiếu sáng. Sự phát sinh phôi hạt phấn có thể được cải thiện nhiều hơn nếu nhiệt độ dưới điều kiện ngày ngắn duy trì ở 18oC. Sự thay đổi mùa vụ thích hợp và tuổi cây cho bao phấn ảnh hưởng lớn đến phản ứng của các hạt phấn . Xử lý cây bằng cách b ơm thuốc trừ sâu hoặc các chất độc khác cần phải được tránh. Cây thiếu nitrogen có thể ảnh hưởng xấu đến bao phấn hơn so với cây được cung cấp đủ nitrogen. Vì thế, có thể khuyến cáo rằng chỉ có những nguyên liệu sinh trưở ng ở các điều kiện môi trường được điều chỉnh tốt chẳng hạn như nhà kính (greenhouse) mới có thể dùng cho việc sinh sản đơn tính tiểu bào tử. 4. HIỆN TƯỢNG BẠCH TẠNG TRONG NUÔI CẤY ĐƠN BỘI Ở các đối tượng cây hai lá mầm như Datura, Atroppa, Nicotiana, Brassica... khi nuôi cấy bao phấn cây đơn bội thường phát triển trực tiếp từ tiểu bào tử và ít khi xuất hiện cây bạch tạng . Nhưng ở những đối tượng cây một lá mầm như lúa nước (Oryza), lúa mì (Triticum)... cây hoàn chỉnh phát sinh thông qua giai đoạn callus thì tần số cây bị bạch tạng chiếm khá cao (20-30 % hoặc cao hơn nữa ). Tần số cây bạch tạng phụ thuộc vào các yếu tố sau: - Tuổi callus cấy chuyển từ môi trường tạo mô sẹo sang môi trường tái sinh cây. Càng cấy chuyển muộn tần số bạch tạng càng cao. - Nhiệt độ nuôi cấy. Nhiệt độ cao thường làm tăng số lượng cây bạch tạng. Nghiên cứu về siêu cấu trúc tế bào lá cây bạch tạng cho thấy trong tiền lạp thể của cây bạch tạng không có ribosome , như vậy quá trình sinh tổng hợp các protein hoặc các tiểu phần protein của lạp thể này không hoàn chỉnh , dẫn đến tình trạng lạp vô sắc không phát triển thành lục lạp được. Cũng có giả thuyết giải thích hiện tượng bạch tạng là kết quả của hiệu ứng mẹ : Hiệu ứng mẹ biểu hiện rõ ở một số đặc điểm di truyền tế bào chất . Khi thụ phấn chỉ có nhân của tế bào sinh sản đực được chuyển sang tế bào noãn. Vì vậy, các tính trạng di truyền tế bào chất chỉ di truyền theo đường mẹ . Hạt phấn là tế bào chứa rất ít nguyên sinh chất , tức là số lượng ty thể và tiền lục lạp cũng rất ít. Khi nuôi những tế bào này thành những cá thể thực vật hoàn chỉnh có thể xảy ra hiện tượng mất cân đối trong tương tác di truyền giữa nhân và cơ quan tử , dẫn đến sai lệch trong quá trình phát sinh cơ quan tử, đặc biệt là lục lạp. 5. ỨNG DỤNG CỦA THỂ ĐƠN BỘI 5.1. Nghiên cứu về phôi học thực nghiệm Các thể đơn bội là những đối tượng tiềm năng trong nghiên cứu phát sinh phôi thực nghiệm. Tuy nhiên, chủ yếu trên các đối tượng mà phôi phát triển trực tiếp từ tiểu bào tử trong nuôi cấy bao phấn thông qua quá trình phát sinh phôi đơn tính , còn gọi là sinh sản đơn tính đực (androgensis). 5.2. Nghiên cứu về tế bào học Cây đơn bội có thể sinh trưởng và phát triển tới giai đoạn ra hoa , nhưng bất dục. Khi nghiên cứu quá trình phân bào giảm nhiễm đầu tiên của tế bào mẹ hạt phấn 73 cây đơn bội có thể phát hiện được mối quan hệ tương tác giữa các nhiễm sắc thể , bởi vì bộ nhiễm sắc thể đơn bội không thể giảm nhiễm bình thường được, ví dụ: Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể cây thuốc lá trồng (Nicotiana tabaccum) nhị bội người ta thấy có 48 NST, lúc phân chia giảm nhiễm chúng sắp thành 2 dãy, gọi là dãy S và dãy T . Mỗi dãy gồm 24 NST. Nuôi cấy đơn bội của nó có số lượng NST n = 24 và theo dõi phân chia giảm nhiễm của tế bào mẹ hạt phấn cũng thấy các NST xếp thành cặp: 12S + 12T. Điều này chứng tỏ bộ NST đơn bội của cây thuốc lá có những biểu hiện như một bộ NST lưỡng bội , vì các NST trong dãy S đều tìm thấy NST tương đồng trong dãy T. Đây là kết quả rất phù hợp với lịch sử phát sinh chủng loại của cây thuốc lá trồng (Hình 5.1) Hình 5.1. Nguồn gốc phát sinh cây thuốc lá trồng Như vậy cây thuốc lá trồng là một dạng tứ bội , nhưng không hoàn chỉnh (allotetraploid), biểu hiện là cây đơn bội n = 12S + 12T bất thụ do không phải tất cả NST của bộ S đều có NST tương đồng ở bộ T. Cây khoai tây Solanum tuberosum cũng là một thể tứ bội không chỉnh. 5.3. Nghiên cứu đột biến và di truyền Do chỉ chứa 1 bộ đơn bội các gen chức năng, nên cây đơn bội rất hữu ích trong nghiên cứu di truyền và đột biến. Trong hệ gen (genome) của thể đơn bội không có quan hệ tính trội mà chỉ có quan hệ bổ sung giữa các gen , do đó các thể đơn bội là những nguyên liệu lý tưởng trong chọn dòng đột biến cũng như trong những nghiên cứu về mối tương tác của các gen. 5.4. Cải thiện giống cây trồng 5.4.1. Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối (dòng thuần) Thông thường bằng phương thức tự phối nếu muốn thu được dòng đồng hợp tử của hệ gen 2x thì phải qua 10 thế hệ và bộ gen 4x thì phải qua 30 thế hệ. Bằng nuôi cấy đơn bội và đa bội chỉ cần một thế hệ. So sánh hiệu quả chọn giống bằng các phương pháp khác nhau: 74 - Cây tự thụ : : Aa F1 : 1/4 AA; 1/2 Aa; 1/4 aa F2 - Nuôi cấy đơn bội : F1 : Aa sẽ cho 1/2 A và 1/2 a giao tử đực FĐH : 1/2 AA và 1/2 aa Nếu số locus là 10 thì tự phối cần 410 cá thể mới có một cá thể đồng hợp (ĐH) ở F2. Trong khi đó đơn bội chỉ cần 210 cây đã có một cá thể đồng hợp. Nếu số locus là n thì đơn bội cho phép đồng hợp tử xuất hiện theo tần số (1/2)n và phương pháp cổ điển sẽ là (1/4)n. Đưa thêm các hệ số: P1: tần số tạo đơn bội = NE + EC NA × f P2: tần số nhị bội hóa thành công, ta sẽ có tần số: E= P 1 × P 2 × (1 / 2 ) n (1 / 4 ) n Tỷ số này biểu thị kết quả so sánh giữa phương pháp đơn bội và phương pháp cổ điển. Nếu E ≥ 1 phương pháp đơn bội hiệu lực hơn. Để được như vậy thì: P1 × P2 ≥ (1/ 2)n n càng lớn thì P1 × P2 càng nhỏ và như vậy hiệu lực của phương pháp càng lớn. Nhưng vì giữa các gen có sự liên kết với nhau cho nên phải tính: P1 × P2 ≥ (1/ 2)(n+n') n' : biểu thị sự liên kết. - Có thể thông qua tính toán để chọn phương pháp thích hợp , ví dụ: có 20 gen độc lập hoặc liên kết theo phương thức trội , siêu trội, bằng tính toán cho thấy phương pháp đơn bội có ưu thế khi: - Gen có tương tác di truyền. - Bộ nhiễm sắc thể rất dị hợp. Ở những trường hợp tính di truyền ổn định thì hai phương pháp như nhau. Ở những trường hợp tính di truyền không ổn định thì phương pháp đơn bội có hiệu quả hơn. Chú thích: NA: Tổng số bao phấn được cấy. CE: Tỷ lệ bao phấn có phôi. NE: Số phôi. 5.4.2. Giải phóng các thứ mới (new varieties) thông qua hệ thống đơn bội kép F1 Các kỹ thuật giống cây trồng đơn bội thường bao gồm chỉ một chu kỳ tái tổ hợp giảm nhiễm. Tuy nhiên , nhiều phẩm chất nông học (agronomic traits ) như năng suất được điều khiển bởi đa gen. Một chu kỳ tái tổ hợp thường không đủ cho sự cải thiện các tính trạng chất lượng như thế vì lẽ mối liên kết giữa các đa gen (polygenes) sẽ không giải phóng tất cả biến dị tiềm tàng trong khi lai . Để vượt qua sự bất lợi này, ở Trung Quốc 75 người ta đã phát triển phương pháp nuôi cấy bao phấn tổ hợp bằng cách lai hữu tính giữa các kiểu gen khác nhau của các cây có nguồn gốc bao phấn . Bao phấn của thể lai thế hệ F 1 sẽ là nguyên liệu tạo giố ng lý tưởng để phát triển số lượng các cây đồng hợp tử có nguồn gốc từ hạt phấn (thể đơn bội kép -double haploid) trong đó các đặc điểm bổ sung của bố mẹ được tổ hợp trong một thế hệ. Các thể đơn bội kép cũng rất hữu ích trong nghiên cứu di truyền của các tính trạng thuộc về phẩm chất . Trong các lĩnh vực tạo giống cây trồng , các cá thể song đơn bội có nguồn gốc từ nuôi cấy hạt phấn biểu hiện khả năng biến động di truyền (genetic variability) trong một phạm vi tương đối rộng. Bằng phương thức cảm ứng đơn bội theo cách gấp đôi nhiễm sắc thể , người ta có khả năng thu được các cây đực riêng biệt ở các loài khác gố c (dioecious species) (Hình 5.2). Hình 5.2. Ứng dụng của hệ thống gấp đôi đơn bội F1 trong việc giải phóng các thể tái tổ hợp mới. 5.4.3. Chọn lọc các đột biến kháng bệnh Chọn lọc các đột biến kháng bệnh là một hướng nghiên cứu quan trọng trong cải thiện giống cây trồng . Cây đơn bội cung cấp một hệ thống tương đối dễ dàng cho việc tạo ra các đột biến . Vì thế, chúng được ứng dụng để chọn lọc nhanh các đột biến mang tính kháng bệnh. Người ta đã nuôi cấy bao phấn để chọn đột biến kháng bệnh đen cuống hoa (black shank) ở thuốc lá và kháng bệnh nấm vảy (Fusarium graminearum) ở lúa mì. 5.4.4. Phát triển các dòng vô tính ở các loài cây thân gỗ lâu năm Một số tác giả Trung Quốc đã thu đư ợc cây cao su có nguồn gốc hạt phấn cao hơn 6 m là những cây sau đó có thể nhân bằng phương thức nhân giống vô tính. 76 Ví dụ tương tự là cây bạch dương, cây mầm đơn bội được dùng để chọn lọc các kiểu gen mong muốn , và được gấ p đôi tự nhiên thành cây nhị bội sau 7-8 năm. Các cây đơn bội nguồn gốc hạt phấn cũng đã thu được ở một loài cây thân gỗ lâu năm như Aesculus hippocastatnum, Citrus microcarpa, Vitis vinifera, Malus prunifolia, M. pumila, Litchi chinensis, Euphoria longan, Ponicirus trifoliata, Lycium halinifolium, L. barbarium, L. chinensis và Camellia sinensis. 5.4.5. Chuyển các gen ngoại lai mong muốn Thông qua quá trình lai và nuôi cấy bao phấn , phương thức tạo giống cây trồng hạt phấn tiêu chuẩn có thể được phát triển ở lúa để chuyển các gen cho năng suất cao và kháng bệnh khô héo (blast), ví dụ: giống Zhonghua số 8 và Zhonghua số 9 (Institute of Crop Breeding and Cultivation, China). 5.4.6. Thiết lập các dòng tế bào đơn bội và nhị bội của cây hạt phấn Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn được sử dụng để tạo dòng tế bào soma đơn bội và nhị bội của cây hạt phấn ở lúa mì và ngô. Tương tự , dòng thuốc lá đơn bội kháng methionine sulfox omide (MSO) đã được chọn lọc , dòng này đồng nhất kiểu hình và có hiệu lực đối với độc tố được sản xuất do tác nhân gây bệnh Pseudomonas tabaci. 6. NHỮNG TỒN TẠI TRONG NGHIÊN CỨU ĐƠN BỘI 6.1. Các vấn đề nảy sinh trong quá trình hình thành thể đơn bội Có nhiều vấn đề liên quan đến việc cảm ứng tạo thể đơn bội và tỷ lệ phần trăm túi phấn có thể hình thành phôi đơn bội có thể sống được rất thấp ở nhiều loại cây. Nhiều yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến quá trình này. Những yếu tố quan trọng nhất là: - Thường không có sự tăng trưởng và phát triển xảy ra in vitro hoặc sự tăng trưởng được khởi sự rồi sau đó phôi bị chết non. - Thể nhị bội và tứ bội thường được tái sinh cùng lúc với thể đơn bội. - Sự tái sinh của những thể nhị bội có thể lấn át bởi sự tái sinh của hạt phấn phân lập. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng được với một số loài giới hạn. - Sự phân chia của tế bào chọn lọc phải xảy ra trong các tiểu bào tử đơn bội và không xảy ra ở những mô nhị bội không mong muốn. Sự phân chia của các tế bào chọn lọc thường không xảy ra được. - Sự tái sinh của thể bạch tạng thường khó tránh khỏi ở các loài ngũ cốc. - Sự cảm ứng tạo thể đơn bội in vitro thường không đảm bảo về mặt kinh tế do tỷ lệ thành công thấp. - Sự hình thành callus cho dù tự nhiên hay do ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thường có ảnh hưởng không tốt. - Có một số cải tiến nhỏ trong việc cô lập một thể đơn bội từ một hỗn hợp gồm các cá thể đơn bội và các cá thể có mức độ bội thể cao hơn, bởi vì trong trường hợp này các cá thể đơn bội dễ dàng tăng trưởng mạnh hơn các thể bội khác. - Sự chọn lọc cá thể đơn bội và sự tạo ra các thể đồng hợp tử từ các cá thể này bị tác động bởi yếu tố thời gian vì việc nghiên cứu về di truyền tế bào là cần thiết. Đôi khi sự chọn lọc có thể thực hiện được nhờ các dấu hiệu đánh dấu về mặt di truyền. 77 - Sự nhân đôi nhiễm sắc thể của thể đơn bội không phải luôn luôn tạo ra thể đồng tử. Các thể nhị bội đồng hợp tử đôi khi có sự xuất hiện những khác biệt trong các thể hệ của nó. 6.2. Những vấn đề cụ thể Việc kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội là một đóng góp rất lớn cho công tác cải thiện giống cây trồng. Nuôi cấy bao phấn hiện nay vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu to lớn của công tác giống cây trồng, vì rằng kỹ thuật này mới thành công ở khoảng trên 30 loài của trên 20 chi, chủ yếu ở các chi và loài thuộc họ cà (Solanaceae). Thời gian qua, người ta đã tiến hành các thí nghiệm với qui mô lớn trên các đối tượng cây trồng ngũ cốc thuộc họ hòa thảo (Poaceae), nhưng kết quả mới hạn chế ở lúa mì và lúa nước. Muốn ứng dụng phương pháp đơn bội có hiệu quả đòi hỏi phải có số lượng đơn bội lớn. Nhưng đến nay có thể nói chúng ta chưa nắm được chín h xác yêu cầu dinh dưỡng cần thiết trong môi trường nuôi cấy. Đối với thuốc lá , môi trường dinh dưỡng để nuôi bao phấn rất đơn giản gồm muối khoáng và sucrose , không cần các chất hữu cơ khác cũng như hormone sinh trưởng. Thế nhưng để nuôi cấy bao phấn lúa nước và lúa mì thành công các tác giả Trung Quốc phải dùng thêm dịch chiết khoai tây mà thành phần chưa được biết tới. Mặc dù vậy, bao phấn các loài ngũ cốc được nuôi cấy cũng chỉ tạo cal lus, để có cây hoàn chỉnh phải tiến hành tạo chồi từ callus đó . Và thông thường thì tỷ lệ bạch tạng rất cao , chẳng hạn : Mix và cs (1977) nhận được 3.400 cây bạch tạng trong số 4.000 cây yến mạch tái sinh từ callus bao phấn. Ngoài ra, trong số cá thể thu được thông qua bước tái sinh từ callus một tỷ lệ đáng kể đã là cây nhị bội (~ 60%). Trong nuôi cấy bao phấn , việc xuất hiện những phôi lưỡng bội từ tế bào lưỡng bội của vỏ bao phấn chưa thể loại trừ được. Vì vậy, người ta đang thí nghiệm tạo cây đơn bội từ hạt phấn phân lập . Đương nhiên môi trường nuôi cấy hạt phấn phân lập đòi hỏi phức tạp hơn môi trường dinh dưỡng nuôi cấy bao phấn . Môi trường nuôi hạt phấn Petunia có chứa auxin, cytokinin và boric acid. Thường là người ta phải nuôi cả bao phấn 4-16 ngày trên một môi trường dinh dưỡng rồi sau đó mới tách riêng hạt phấn để nuôi tiếp tục trên môi trường cũ đó . Hiệu quả của phương pháp này rất cao, đã đạt tới 1.000 phôi/ đĩa petri. Thông qua quá trình nuôi trước đó , môi trường dinh dưỡng được bổ sung thêm những chất cần thiết do bao phấn tiết ra . Glutamine là một thành phần quan trọng , nhưng còn nhiều chất khác vẫn chưa được biết tới. 7. QUY TRÌNH TẠO CÂY ĐƠN BỘI THUỐC LÁ TỪ HẠT PHẤN PHÂN LẬP 7.1. Cảm ứng a. Tạo cây đơn bội Nụ hoa được xử lý bằng ly tâm 2.000 vòng/phút trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 5-10oC sau khi cắt để 48 giờ ở 2-5oC. b. Tạo cây nhị bội Nụ hoa được ngâm trong dung dịch colchicine 0,04% và dimethyl sulfoxide o (chất dẫn nạp) 2% trong thời gian 24 giờ ở 2-5 C và hút chân không. 78 Sau đó rửa sạch dung dịch colchicine và xử lý lạnh tiếp 24 giờ. 7.2. Nuôi bao phấn Bao phấn được tách từ nụ, nuôi 3 ngày trong môi trường khoáng Halperin chứa đường sucrose 2% và Fe -EDTA (5mL/L: Na2EDTA 754mg + FeSO4.7H2O 557 mg pha trong 100 mL nước sôi), pH 5,8. Nuôi 50 bao phấn trong 5 mL môi trường lỏng. 7.3. Tách và nuôi hạt phấn Ép bao phấn bằng đũa thủy tinh , lọc hạt phấn bằng lưới có mắt (Φ = 48 µm) và đưa vào ống ly tâm vô trùng có bông ở đáy . Ly tâm 850 vòng/phút và rửa hai lần bằng môi trường mới . Nuôi hạt phấn với nồng độ 104 hạt phấn /mL, mỗi đĩa petri đường kính 5 cm nuôi 2,5 mL dung dịch, dán giấy parafilm và để ở nơi có ánh sáng nhạt . Sau 30 ngày sẽ xuất hiện phôi non. TÓM TẮT CHƯƠNG Cây đơn bội (n) có ưu điểm là: kiểu gen biểu hiện chính xác kiểu hình. Các nhà di truyền và chọn giống cây trồng đã chọn thể đơn bội để nghiên cứu di truyền các tính trạng. Các thể đơn bội thông qua đa bội hóa để thu các thể đồng hợp tử. Trong thể đồng hợp tử tất cả gen lặn đều được biểu hiện ra kiểu hình Có hai phương pháp tạo thể đơn bội in vitro: nuôi cấy bao phấn, hạt phấn; nuôi cấy noãn chưa thụ tinh. Phương pháp nuôi cấy bao phấn được sử dụng phổ biến vì kết quả đem lại cao hơn các phương pháp khác. Trong quá trình nuôi cấy bao phấn chú ý các nhân tố sau: kiểu gen của cây cho bao phấn, nhân tố thành bao phấn, môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và ánh sáng, trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn. Ứng dụng của thể đơn bội: nghiên cứu về phôi học thực nghiệm, nghiên cứu về tế bào học, nghiên cứu đột biến và di truyền, cải thiện giống cây trồng. 79 CÂU HỎI Câu 1: Ý nghĩa của cây đơn bội in vitro? Câu 2: Phân tích những thuận lợi và khó khăn khi nuôi cấy hạt phấn in vitro? Câu 3: Hãy so sánh nuôi cấy bao phấn in vitro và nuôi cấy hạt phấn in vitro? Câu 4: Hãy trình bày phương pháp nuôi cấy hạt phấn của thuốc lá? 80 Chương 6. PROTOPLAST THỰC VẬT 1. GIỚI THIỆU VỀ PROTOPLAST Đặc trưng của tế bào thực vật là có thành cellulose bao quanh (cell wall), sau đó đến màng nguyên sinh (membrane). Thành cellulose giữ cho tế bào thực vật có hình dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô (tissue). Vật chất chính bên trong màng nguyên sinh là thông tin di truyền chứa trong nhân của tế bào, quyết định quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào, mọi hoạt động sống của tế bào được diễn ra bên trong lớp vỏ này. Hình 6.1. Protoplast Protoplast là tế bào được tách bỏ thành tế bào. Lúc này, nguyên sinh chất và các bào quan chỉ được bao bọc bởi màng nguyên sinh chất. Tế bào trần có 2 đặc điểm quan trọng: - Màng nguyên sinh cho phép protoplast có thể hấp thu vào tế bào các đại phân tử (nucleic acid, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp , ty thể, nhân bào theo cơ chế của amip. Nếu để các protoplast cạnh nhau, chúng có thể dễ hòa làm một , đó là hiện tượng dung hợp (fusion) hay còn gọi là lai (hybridization) tế bào. - Khi nuôi cấy trong môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh thành (vách) tế bào. Đây là đặc tính hết sức đặc biệt của protoplast. Nhờ đó protoplast mới phục hồi được toàn bộ chức năng của một tế bào nguyên thủy. Khi protoplast tái tạo được thành tế bào, chúng có khả năng phát triển và phân chia hoàn toàn giống những tế bào bình thường. 2. PHÂN LẬP PROTOPLAST 2.1. Các phương pháp phân lập protoplast 2.1.1. Phương pháp cơ học (không dùng các enzyme) Phương pháp này được đề xuất và sử dụng từ năm 1982 (Nguyễn Quang Thạch, 2009). 81 Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắt nhọn (sharp-edged knife ) và giải phóng các protoplast riêng rẽ , bao gồm các bước sau: - Gây co nguyên sinh làm khối nguyên sinh chất tách khỏi thành tế bào - Dùng dao cắt khối mô đã được gây co nguyên sinh, lúc này các khối nguyên sinh chất dưới tác động cơ giới có thể tách rời khỏi thành tế bào, giải phóng ra ngoài dung dịch chiết tách. Phương pháp này thích hợp để tách protoplast từ các tế bào có không bào của các mô dự trữ như chồi hành và vảy hành (bulbs and scales) của các loài thân hành, rễ củ cải (radish root), vỏ quả giữa của dưa chuột (mesocarp of cucumber ), và rễ củ cải đường (beet root). Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất phân lập protoplast thấp và không thích hợp để tách protoplast từ mô phân sinh cũng như những tế bào không có không bào, và hiện nay phương pháp này gần như không được sử dụng. 2.1.2. Phương pháp sử dụng enzyme Ngày nay phương pháp phân lập protoplast chủ yếu là phương pháp sử dụng enzyme. Phương pháp này cho phép phân lập được protoplast từ nhiều nguồn thực vật khác nhau trừ những tế bào đã bị hóa gỗ. Protoplast được phân lập từ phương pháp này ít bị biến dạng, có sức sống cao, có khả năng phân chia và tái sinh cao. Phương pháp sử dụng enzyme được bắt nguồn từ kết quả nghiên cứu của Cocking (1960) đã tìm được các enzyme phân giải thành tế bào và thu được protoplast. Phương pháp dùng enzyme có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ học , phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Để phá vỡ thành tế bào, người ta thường dùng các loại enzyme chiết xuất từ các sinh vật chứa nhiều enzyme phân giải thành tế bào như: nấm, ốc và mối. Trong các chế phẩm enzyme này đều có chứa enzyme cellulase, là loại enzyme tham gia phân cắt cellulose có rất nhiều ở thành tế bào mà không ảnh hưởng đến màng tế bào và các thành phần khác có trong tế bào thực vật. Ngoài enzyme cellulase ra, trong các chế phẩm enzyme còn chứa nhiều loại enzyme khác như hemicellulase, pectinase, lignase. Các enzyme này có thể được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với nhau. Bảng 6.1. Các enzyme thương phẩm thích hợp cho phân lập protoplast STT 1 Nguồn thu nhận Enzyme Các enzyme cellulase Cellulase Onozuka R-10 Cellulase Onozuka RS Cellulase YC Cellulase CEL Cellulysin Meicelase P-1 Driselase 82 Trichodema viride T. viride T. viride T. viride T. viride T. viride Irpex lacteus STT 2 3 Nguồn thu nhận Enzyme Các enzyme Hemicellulase Helicase Hemicellulase Hemicellulase H-2125 Rhozyme HP 150 Các enzyme Pectinase Macerase Macerozyme R-10 PATE Pectinol Pectolyase Y-23 Zymolyase Helix pomatia Aspergillus niger Rhizopus sp. Aspergillus niger Rhizopus arrhizus R. arrhizus Bacillus polymyxa Aspergillus sp. Aspergillus japonicus Arthrobacter luteus Hình 6.2. Phân lập protoplasts của Echinacea purpurea a. Phương pháp trực tiếp (sử dụng enzyme đồng thời) Phương pháp này sử dụng dung dịch hỗn hợp enzyme chứa đồng thời: pectinase làm nhiệm vụ phân giải pectin - là chất gắn kết các tế bào trong mô, hemicellulase phân giải hemicellulose và cellulose phân giải cellulose của thành tế bào. Thông thường hỗn hợp enzyme chứa 0,5% pectinase và 2% cellulase và hemicellulase trong dung dịch có nồng độ đường cao (11-13% saccharose) hoặc các chất gây thẩm thấu cao (hoặc 13% manitol hay sorbitol). 83 pH của dung dịch enzyme 5,4 – 5,8. b. phương pháp gián tiếp(sử dụng enzyme theo trình tự) Phương pháp này khác với phương pháp trực tiếp ở chỗ quá trình phân lập protoplast được thực hiện từng bước với từng enzyme riêng biệt. Đầu tiên sử dụng pectinase để tách tế bào trong mô thành các tế bào riêng lẻ, sau đó sử dụng enzyme cellulase và hemicellulase để phân lập protoplast. Ngày nay thường sử dụng phương pháp phân lập trực tiếp. Tuy nhiên, protoplast phân lập bằng phương pháp gián tiếp có khả năng phân chia cao hơn khi nuôi cấy. 2.2. Nguyên liệu phân lập protoplast 2.2.1. Phân lập protoplast từ lá cây Hình 6.3 Các bước nuôi cấy tế bào trần cây hồng. 84 Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, nguyên liệu cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất (relatively uniform cells), các protoplast thịt lá có sức sống cao, có độ đồng đều về mặt di truyền. Protoplast phân lập từ lá qua các bước sau: - Khử trùng lá - Loại bỏ lớp tế bào biểu bì (epidermal cell layer) - Xử lý enzyme trong điều kiện áp suất thẩm thấu thích hợp - Phân lập protoplast bằng phương pháp lọc và ly tâm. Mẫu lá được lấy từ cây còn non hoặc lấy mẫu lá từ cây in vitro có độ sinh trưởng mạnh, có diện tích lá lớn. Trong trường hợp lấy mẫu lá từ cây trồng tự nhiên thường lấy lá ở những cây khoảng 10 tuần tuổi. Với lá cây khó tách bỏ lớp biểu bì (lá các cây họ hòa thảo) thì được cắt thành lát dài, mảnh trước khi đưa vào xử lý dung dịch enzyme để phân lập protoplast. Quá trình cắt mẫu lá được thực hiện trong dung dịch gây tiền co nguyên sinh. Ví dụ, trong trường hợp phân lập protoplast lá khoai tây, mẫu lá được cắt nhỏ trong dung dịch 9,1% manitol + 0,01% CaCl2.2H2O, ủ trong dung dịch 15 – 20 phút, sau đó loại dung dịch và bổ sung dung dịch enzyme. 2.2.2. Phân lập protoplast từ callus Callus là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…). Các callus non nuôi cấy in vitro cũng là nguyên liệu lý tưởng để thu được một lượng lớn protoplast. Nuôi cấy các callus già hơn thường cho các tế bào có kích thước lớn hơn và vách tế bào dà y, điều này sẽ gây khó khăn cho sự thủy phân bằng enzyme . Vì thế, người ta thường sử dụng các callus non đang trong giai đoạn tăng trưởng tích cực (sau hai tuần cấy chuyển) để phân lập protoplast. Phương pháp phân lập protoplast từ callus cũng tương tự như đối với lá. Tuy nhiên, nồng độ enzyme đặc biệt là cellulase có thể thấp hơn. Các cây tái sinh từ quần thể tế bào đơn (single cells) có thể duy trì đầy đủ các đặc tính bảo toàn cao của giống hoặc dòng nhưng vẫn c ó thể thay đổi một số tính trạng như mong muốn. Ví dụ: Các cây mía đường có nguồn gốc từ các tế bào callus mang đầy đủ các đặc điểm của bố mẹ , nhưng một vài tính trạng đã được cải thiện như kháng bệnh , tăng sản lượng và hàm lượng đường cao hơn . Gần đây, người ta thường phân lập protoplast từ callus để tạo ra các tế bào đơn , dẫn đến kết quả là thu được các protoclones khác nhau (protoplast propagated clones) ở các loài cây trồng quan trọng trong nông nghiệp. 2.2.3. Phân lập protoplast từ dịch huyền phù tế bào Huyền phù tế bào là một môi trường lỏng được lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của những tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi, có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn (Henshaw và cộng sự, 1965; Torres, 1989). Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào (cell suspension cultures) đang trong trạng thái tăng trưởng mạnh cũng cung cấp nguồn nguyên liệu rất tốt cho phân lập protoplast . 85 Dịch huy ền phù tế bào có mật độ cao được ly tâm , sau đó loại bỏ thể nổi (supernatants). Các tế bào được ủ trong hỗn hợp enzyme (cellulase + pectinase) và lắc từ 6 giờ tới qua đêm tùy thuộc vào nồng độ của các enzyme. Sử dụng nồng độ thấp của các enzyme mục đích ngăn cản sự kết dính trong dịch huyền phù tế bào , làm giảm số lượng cụm tế bào và tăng lượng tế bào đơn để thu được hiệu suất phân lập protoplast cao hơn. Các protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy d ịch huyền phù tế bào có tiềm năng tái sinh cây hơn hẳn ở các loài mà trước đó đã không thành công khi thử tái sinh từ các protoplast có nguồn gốc tế bào thịt lá . Những thành công gần đây khi tái sinh cây in vitro hoàn chỉn h từ protoplast của các loài ngũ cốc (kê, lúa miến , lúa mạch giống Golden Promise) đã chứng minh nuôi cấy dịch huyền phù tế bào là nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp các protoplast toàn vẹn. Hình 6.4. Các bước phân lập, nuôi cấy và tái sinh của protoplast 3. NUÔI CẤY PROTOPLAST 3.1. Môi trường nuôi cấy 3.1.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy Nói chung, môi trường nuôi cấy protoplast tương tự với môi trường nuôi cấy dịch huyền phù tế bào và callus . Tuy nhiên, protoplast không còn thành tế bào, chúng có khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng trực tiếp từ môi trường nuôi cấy, vì vậy nồng độ của Fe, Zn và NH 4+ dùng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật có thể là quá cao 86 đối với nuôi cấy protoplast. Hầu hết muối của môi trường B 5 và MS có cải biến một ít là thích hợp. Tăng nồng độ Ca 2+ trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình thường có lợi cho việc duy trì tính toàn v ẹn của màng tế bào . Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3-5%, nhưng ở một số loài (ví dụ: thuốc lá) sucrose được sử dụng ở nồng độ thấp hơn (1,5%). Môi trường nuô i cấy protoplast sử dụng N hữu cơ dạng CH và N vô cơ dạng NH4NO3 (20 mM). Các vitamin dùng trong nuôi cấy protoplast cũng giống trong môi trường nuôi cấy mô tiêu chuẩn . Auxin và cytokinin sử dụng ở các tổ hợp nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo vách tế bào và kích thích phân chia trong các p rotoplast phân lập . Protoplast của ngũ cốc đòi hỏi cung cấp 2,4-D riêng rẽ hoặc tốt hơn là phải phối hợp với cytokinin. Tuy nhiên 2,4-D cũng như các auxin khác (NAA, IAA) được sử dụng riêng rẽ thường làm mất tiềm năng phát sinh hình thái ở các callus có nguồn gốc protoplast . Các cytokinin thường được sử dụng là BAP, kinetin, 2-iP, hoặc zeatin. Mặc dù , tổ hợp hai loại phytohormone nói trên thay đổi tùy loài , nhưng nói chung trong nuôi cấy protoplast tỷ lệ auxin/kinetin cao thích hợp cho phân chia tế bào , trong khi các protoplast có nguồn gốc từ những tế b ào phân hóa cao lại cần tỷ lệ kinetin/auxin cao để tái sinh cây. Kao và Michayluk (1975) đã xây dựng môi trường nuôi cấy protop last (KM 8p) trong đó các protoplast được nuôi cấy riêng rẽ (ví dụ: Vicia hajastana) có khả năng phân chia cho tới khi tạo thành callus (khử trùng bằng phương pháp lọc). Bảng 6.2. Môi trường KM 8p dùng cho nuôi cấy protoplast Thành phần Muối khoáng NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 KCl Sequestrence 330 Fe KI H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Đường Nồng độ (mg/L) 600 1900 600 300 170 300 28 0,75 3 10 2 0,25 0,025 0,025 Thành phần Các acid hữu cơ (chỉnh pH tới 5,5 bằng NH4OH) Sodium pyruvate Citric acid Malic acid Fumaric acid Nồng độ (mg/L) 5 10 10 10 Các vitamin Inositol Nicotinamide Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl D-Calcium pantothenate Folic acid p-Aminobenzoic acid 100 1 1 10 0,5 0,2 0,01 Biotin 0,005 87 Thành phần Glucose Sucrose Fructose Ribose Xylose Mannose Rhamnose Cellobiose Sorbitol Mannitol Các phytohormone 2,4-D Zeatin NAA Vitamin-free casamino acid Nước dừa (lấy từ quả già xử lý 60oC/30 phút rồi lọc) Nồng độ (mg/L) 68400 125 125 125 125 12 125 125 125 125 Thành phần Choline chloride Riboflavin Ascorbic acid Vitamin A Vitamin D3 Vitamin B12 Đậu tương × lúa mạch 1 0,1 125 10 ml/L Nồng độ (mg/L) 0,5 0,1 1 0,005 0,005 0,01 Đậu tương × đậu Hà Lan hoặc N. glauca 0,2 0,5 1 - 3.1.2. Áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy Sự duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy là yếu tố cần thiết cho sự ổn định, khả năng sống và sự phát triển tiếp theo của protoplast. Trong quá trình phân lập và nuôi cấy , các protoplast cần đ ược duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường và nội bào cho tới khi tái s inh được vách tế bào vững chắc. Trong cả hai t rường hợp chênh lệch áp suất thẩm thấu giữa môi trường và nội bào theo hướng môi trường nhược trương hoặc ưu trương sẽ dẫn đến tình trạng protoplast bị vỡ hoặc teo lại. Các chấ t điề u chỉnh áp suất thẩm thấu (thông thường là để tăng áp lực thẩm thấu) trong môi trường nuôi cấy protoplast và trong hỗn hợp enzyme là sorbitol , mannitol, glucose, hoặc sucrose. Các protoplast sẽ sinh trưởng ổn định hơn trong trong dịch được tăng nhẹ áp suất thẩm thấu. Đối với các protoplast thịt lá của ở ngũ cốc và đậu thì mannitol hoặc sorbitol là các nhân tố ổn định áp suất thẩm thấu thích hợp hơn cả, trong khi sucrose lại thích hợp hơn glucose hoặc mannitol trong nuôi cấy protoplast của khoai tây , đậu hoa (sweet pea) và sắn. 88 Trong nuôi cấy dịch huyền phù thuốc lá , galactose và fructose đã được sử dụng để điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Các chất phân ly ion (KCl 335 mM và MgSO4.7H2O 40 mM) cải thiện tốt khả năng sống sót của protoplast . Thông thường các dung dịch enzyme được bổ sung các muối nhất định (CaCl2 5-100 mM) song song với các nhân tố ổn định áp suất thẩm thấu không phân ly ion. Cocking và Peberdy (1974) đã phát triển dung dịch rửa protoplast (cellprotoplast washing, CPW) chứa muối và các nhân tố ổn định áp suất thẩm thấu thích hợp. Dung dịch CPW có thể được dùng trong suốt quá trình ủ enzyme và rửa protoplast. Thời gian ủ enzyme tùy thuộc vào nồng độ của nó trong dung dịch và loại nguyên liệu được sử dụng. Áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy được giảm dần, bằng cách bổ sung thêm định kỳ một lượng môi trường dinh dưỡng mới vào môi trường nuôi cấy để protoplast tái tạo thành tế bào và phân chia. 3.2. Phương pháp nuôi cấy 3.2.1. Phương pháp nuôi cấy chung a. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng Có nhiều phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng - Protoplast có thể được nuôi trong một lớp mỏng môi trường lỏng bằng đĩa petri. Đĩa này được băng kín miệng bằng parafilm và đặt trong điều kiện ánh sáng yếu hoặc trong tối ở 25 – 28oC. - Protoplast được nuôi trong những giọt môi trường trong một đĩa petri. Đĩa petri này phải được đặc trong một hộp ẩm ở điều kiện ánh sáng yếu với nhiệt độ 25 – 28oC. - Protoplast có thể được nuôi trong bình tam giác thể tích 50 – 100ml, có chứa 5ml môi trường. Bình tam giác này được nuôi trong điều kiện ánh sáng 2500lux ở nhiệt độ 25oC. - Protoplast có thể được nuôi trong các lame lõm, trong điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ 25 – 28oC và điều kiện ánh sáng yếu. b. Phương pháp nuôi trong môi trường đặc Phương pháp này là dàn mỏng các protoplast trên môi trường đặc. Với phương pháp này có thể thao tác thuận lợi trên một lượng lớn protoplast và dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi. Trong phương pháp này, 2ml môi trường lỏng có chứa protoplast (mật độ 105 protoplast/ml) sẽ được ly tâm và protoplast được giữ lại trong môi trường lỏng. Huyền phù protoplast được rót vào đĩa petri nhỏ chứa môi trường dinh dưỡng có 1 – 2% agar. Đĩa petri được dán kín bằng parafilm (để ngăn sự mất nước và agar bị đặc lại) và đặt trong điều kiện nhiệt độ 25 – 28oC. 3.2.2. Các phương pháp nuôi cấy Phương pháp nuôi protoplast sau khi phân lập cũng như nuôi cấy tế bào đơn, nó phụ thuộc vào phương pháp nghiên cứu. Quá trình phát triển phương pháp nuôi cấy protoplast khá phức tạp, đã có nhiều phương pháp nuôi cấy được nhiều tác giả đề xuất. a. Phương pháp nuôi trợ dưỡng Một hướng khác trong nuôi cấy protoplast ở mật độ thấp là phương pháp nuôi trợ dưỡng hay kỹ thuật tầng nuôi dưỡng (feeder layer technique). Raveh và cs (1973) 89 đã chuẫn bị tầng tế bào nuôi dưỡng bằng cách chiếu xạ tia X (2×103 R) lên các protoplast dịch huyền phù tế bào của thuốc lá, khi đó sự phân chia của tế bào bị ức chế nhưng vẫn cho phép chúng duy trì các hoạt động trao đổi chất. Các protoplast bị chiếu xạ sẽ được rửa sạch ba lần và sau đó dàn trải chúng trên môi trường có agar mềm (soft agar) ở mật độ 2,4×104/mL. Nuôi cấy trải (plating) các protoplast không qua chiếu xạ ở mật độ thấp (10-100 protoplast/mL) trên tầng nuôi dưỡng này. b. Phương pháp đồng nuôi cấy Các protoplast của 2 loài khác n hau cũng được đồng nuôi cấy (co-culture) để kích thích sự sinh trưởng của chúng hoặc của tế bào lai . Nói chung, phương pháp đồng nuôi cấy được sử dụng trong những thí nghiệm mà các callus hình thành từ 2 loại protoplast có thể phân biệt hình thái được. Ví dụ: Các tế bào lai phân lập một cách cơ học (mechanically isolated hybrid cells) được đồng nuôi cấy với các protoplast phân lập từ chủng bạch tạng (albino strain) sẽ phát triển thành các khuẩn lạ c màu xanh là loại khuẩn lạc dễ phân biệt với các khuẩn lạc không có màu xanh của dạng bạch tạng. c. Phương pháp nuôi cấy vi giọt Kỹ thuật nuôi cấy vi giọt (microdrop culture) đã thành công ở trường hợp nuôi cấy các tế bào l ai của Nicotiana glauca (+) Glycine max và Arabidopsis thaliana (+) Brassica campestris. Kỹ thuật này cần đĩa nuôi cấy Cuprak được thiết kế đặc biệt gồm có một ngăn bên ngoài nhỏ và một ngăn bên trong lớn hơn. Các protoplast riêng rẽ hoặc các thể dị nhân trong giọt môi trường dinh dưỡng (khoảng 0,25-25 µL) được chuyển bằng pipette Drummond vào mỗi ngăn bên trong của đĩa Cuprak . Ngăn bên ngoài chứa đầy nước vô trùng để duy trì độ ẩm bên trong đĩa. Sau khi đậy nắ p, đĩa được quấn giấy parafilm , giữ ở điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tối thích. Tỷ lệ tế bào /dung tích môi trường nuôi cấy thích hợp tương đương mật độ 23 4×10 /mL. Nếu tăng kích thước giọt (~ 25 µL), tức là giảm mật độ dàn trải sẽ cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn. d. Phương pháp sàng lọc MDA (multiple drop array) Potykus và cộng sự, 1977 đã sử dụng công nghệ nuôi cấy nhỏ giọt - MDA để sàng lọc một cách có hệ thống các đa phức chất của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy protoplast. Kỹ thuật sàng lọc MDA là sử dụng tay để nhỏ các giọt như một đơn vị thí nghiệm. Mỗi giọt đặc trưng cho một phức hợp được kiểm tra. Các giọt này được trải đều trên bề mặt đĩa petri (đường kính 9cm) với mật độ 7 × 7 giọt. Để kiểm tra tổ hợp giữa 7 loại auxin và 4 loại cytokinin khác nhau trong môi trường nuôi cấy, mỗi nhân tố này dùng 7 loại nồng độ khác nhau. Như vậy, cả thí nghiệm này sẽ gồm 7 × 4 đĩa petri, mỗi đĩa có 49 giọt. Tổng tất cả thí nghiệm sẽ gồm 4 × 7 × 49 = 1372 nhân tố tổ hợp. Trong phương pháp này, thể tích mỗi giọt khoảng 50µl chứa 1 × 104 hoặc 1 × 105 protoplast/ml. Jomes và cộng sự, 1960 lần đầu tiên sử dụng công nghệ nuôi cấy MDA để nuôi cấy protoplast. Vasil và Hildebrast, 1965 đã cải tiến công nghệ này như sau, sử dụng 30 - 50µl môi trường nuôi cấy chứa một hoặc một số protoplast, nhỏ lên một tiêu bản, sau đó 90 đậy lam kính lên trên, dán parafilm, nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng bình thường với nhiệt độ 23 – 24oC. e. Phương pháp nuôi cấy theo giai đoạn phát triển Hiện nay đây là phương pháp nuôi cấy phổ biến nhất. Giai đoạn đầu protoplast được nuôi cấy trong môi trường lỏng trong các đĩa petri nhỏ (đường kính 3cm). Sau 24 ngày, protoplast bắt đầu tái tạo thành tế bào và phân chia. Sự phân chia hoàn thành sau 2 – 7 ngày và hình thành microcallus sau 23 tuần. Sau đó, microcallus được chuyển sang môi trường thạch cứng trong các đĩa petri lớn hơn (đường kính 9cm) có thành phần môi trường thích hợp cho việc tạo macrocallus. Giai đoạn này kéo dài từ vài tuần đến vài tháng. Sau cùng, các macrocallus được chuyển sang môi trường tái sinh tạo chồi. 3.3. Tái sinh cây từ protoplast Tính đặc trưng cơ bản của tế bào là tính toàn năng của tế bào, vì vậy protoplast có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp. Sự tái sinh protoplast thành cây có ý nghĩa cao hơn nhiều so với sự tái sinh cây từ mô phân sinh, đoạn thân hay mô lá… trong nuôi cấy mô thông thường. 3.3.1. Tạo vách (thành) tế bào Protoplast sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện tăng thể tích tế bào chất, tăng kích thước và phát sinh hầu hết các bào quan (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân. Quá trình hình thành vách (thành) tế bào có thể hoàn chỉ nh trong vòng 2 đến 7 ngày mặc dù các protoplast trong nuôi cấy thường bắt đầu tái sinh vách tế bào ngay sau khi phân lập một vài giờ . Thành tế bào vừa được tạo thành, sẽ xuất hiện các vi sợi (microfibrils) gắn kết một cách lỏng lẽo các tế bào đứng cạnh nhau, quá trình này đòi hỏi cung cấp nguồn carbon (sucrose) trong môi trường dinh dưỡng. Các chất phân ly ion để ổn định thẩm thấu trong môi trường đã ngăn cản sự phát triển thành tế bào. Các protoplast phát triển thành tế bào kém thường phân chia tế bào cũng rất kém. Tỷ lệ tái tạo và độ thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố sau: - Giai đoạn phân hóa của tế bào dùng làm nguyên liệu phân lập protoplast - Phương pháp phân lập protoplast - Tính đặc thù của loài thực vật. 3.3.2. Phát triển callus và tạo cây hoàn chỉnh Ngay sau khi tạo thành tế bào chung quanh protoplast , các tế bào được tái cấu trúc đã tăng kích thước và sau 35 ngày xuất hiện sự phân chia tế bào đầu tiên. Sau 13 tuần nuôi cấy, các microcallus được tạo thành và có thể cấy chuyển chúng sang môi trường không có sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu (osmotic-free) để tạo macrocallus. Các macrocallus này được cảm ứng để phân hóa cơ quan , hoặc tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình phân chia của protoplast để hình thành callus phụ thuộc vào: - Thành phần môi trường nuôi cấy - Loại, nồng độ và tỷ lệ auxin/cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy - Điều kiện nuôi cấy 91 Hình 6.5. Sự phân chia tiếp theo của protoplasts Echinacea purpurea A. Phân chia protoplast - sau 6 giây B,C. Sự phân chia thứ 2 và thứ 3 của protoplast D. Cụm Protoplast - nhận được sau 6 ngày nuôi cấy Trong quá trình tái sinh protoplast thành khối callus có thể quan sát thấy một số biến dị như các protoplast chứa nhiều nhân. Những thể đa nhân này được hình thành là do sự phân chia không hoàn toàn của tế bào chất trong đó có cả sự dung hợp tự phát. Những protoplast đa nhân này thường không phát triển được. Tuy nhiên, trong rất ít trường hợp nó có thể phát triển thành cây đa nhân. Trong nhiều trường hợp có thể phát sinh phôi và cơ quan phân hóa tạo cây đa bội. Kể từ khi các loài thuộc họ Solanaceae được phân lập và tái sinh cây thành công đầu tiên ở cây thuốc lá (Takebe 1971), đến nay người ta đã thành công ở nhiều họ khác nhau như các loài legume , các cây trồng ăn quả và lấy sợi (fibre and pulp crops), các loài cây gỗ, và thậm chí các loài ngũ cốc như pennisetum, lúa và lúa mì. 92 Hình 6.6. Tạo mô sẹo, Tái sinh cây và sự phát triển của cây con từ protoplasts của Echinacea purpurea. A. Tạo callus từ cụm protoplast thu nhận được B. Sự phát sinh cơ quan từ callus C.Tái sinh chồi từ callus D. Cây con hoàn chỉnh 3.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của protoplast a. Độ tinh sạch của protoplast sau khi phân lập Protoplast sau khi phân lập sẽ được nuôi trên môi trường cùng với các mảnh vỡ tế bào và các cặn bã. Để nâng cao hiệu quả nuôi cấy, cần phải thanh lọc protoplast trong hỗn hợp này. Có một số phương pháp thanh lọc được áp dụng, sau đây là 2 phương pháp được sử dụng phổ biến nhất: - Phương pháp kết lắng và rửa sạch: protoplast ngay sau khi phân lập sẽ được ly tâm ở tốc độ thấp trong thời gian ngắn. Phương pháp này làm cho protoplast nguyên vẹn sẽ kết tủa, các mảnh vỡ và các tế bào đứt gãy sẽ lơ lửng ở phần dịch bên trên. Thu lấy phần kết tủa (chứa protoplast) và hòa tan thành dạng huyền phù bằng môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu. - Phương pháp nổi: dung dịch tráng có chứa mannitol, sorbitol, saccharose (0,30,6M) là dung dịch có tác dụng gây nổi protoplast vì chúng tạo ra sự chênh lệch về tỷ trọng giữa protoplast nguyên vẹn và mảnh vỡ tế bào. Có thể ly tâm để tách các phần này ra khỏi nhau. Dùng pipette nhẹ nhàng hút phần dịch nổi phía trên có chứa 93 protoplast. Phương pháp này có hiệu quả hơn phương pháp trên do ít làm vỡ protoplast hơn. b. Sức sống của protoplast Về nguyên lý, để kiểm tra sức sống của protoplast có thể dựa vào các cơ sở sau: - Xác định sự tồn tại của nguyên sinh chất - Các phương pháp nhuộm màu - Xác định khả năng thay đổi kích thước của protoplast khi thay đổi áp suất thẩm thấu môi trường nuôi cấy - Hoạt động quang hợp và hô hấp của protoplast. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng các chất nhuộm màu: - Chất FDA (chất nhuộm huỳnh quang): chất này khi bám vào màng nguyên sinh chất sẽ làm cho các protoplast có màu xanh, nếu protoplast không còn sức sống sẽ có màu trắng. - Chất phenosafranin (0,1%): sau 2 giờ trong dung dịch nhuộm, protoplast còn sống sẽ không bắt màu, protoplast đã chết sẽ có màu đỏ. - Chất CPW (calcofluan white – 0,1%): chất này dùng để kiểm tra sự hình thành vách tế bào. Protoplast còn sống sẽ có một vòng huỳnh quang quanh màng sinh chất, protoplast đã chết không có đặc điểm này. c. Mật độ protoplast Mật độ protoplast là điều kiện đầu tiên rất cần thiết cho quá trình nuôi cấy protoplast vì trong quá trình nuôi cấy, nếu như mật độ không thích hợp sẽ ức chế quá trình tái tạo thành tế bào và sự phân chia tạo callus. Mật độ protoplast tối ưu là từ 1 × 104 đến 1 × 105 protoplast/ml. Ví dụ: đối với protoplast thuốc lá, mật độ nuôi trong hộp petri là 5 × 104 protoplast/ml, dưới 10% số lượng này thì protoplast sẽ không phân chia (Evans và Cocking , 1977) các thí nghiệm lai soma (somatic hybridization ) và phát sinh đột biến (mutagenesis) cần tạo dòng tế bào riêng rẽ , do đó phải dàn trải protoplast ở mật độ thấp hơn (100 - 500 protoplast/ml). Nuôi cấy ở mật độ thấp giúp dễ dàng phân lập và xác định các khuẩn lạc lai khi có mặt của hệ thống chọn lọc . Số lượng protoplast được xác định bằng buồng đếm hồng cầu. Môi trường KM 8p kích thích phân chia nhanh hơn ở các protoplast thịt lá của cỏ linh lăng (alfalfa), đậu (pea), khoai tây và sản phẩm dung hợp potato + tomato được nuôi cấy dàn trải ở mật độ thấp. Các protoplast nuôi cấy trên môi trường này được đặt trong tối vì môi trường KM 8p sẽ trở nên độc đối với tế bào dưới điều kiện ánh sáng mạnh. 4. ỨNG DỤNG CỦA PROTOPLAST THỰC VẬT Protoplast thực vật có thể được sử dụng để nghiên cứu ba vấn đề chính sau đây: - Chọn dòng tế bào (plant cell line selection) - Dung hợp protoplast (protoplast fusion) để lai vô tính (somatic hybridization) tế bào thực vật - Biến nạp di truyền : đưa các cơ quan tử , virus và DNA ngoạ i lai vào tế bào thực vật. 94 4.1. Chọn dòng tế bào Cơ thể thực vật bậc cao thường có kích thước khá lớn cho nên các kỹ thuật xử lý và chọn dòng khó thực hiện với số lượng cơ thể theo tính toán xác suất thống kê , chính vì vậy kỹ thuật chọn dòng thường chỉ được ứng dụng ở đối tượng vi sinh vật và đạt được nhiều kết quả rất khả quan. Bằng biện p háp bỏ thành cellulose và đưa cơ thể thực vật về trạng thái từng tế bào riêng rẽ với kích thước không lớn hơn nhiều so với cơ thể vi sinh vật đã cho phép tiến hành kỹ thuật chọn dòng vi sinh vật đối với thực vật bậc cao . Một đĩa petri đường kính 5-7 cm cho phép nuôi tới 5× 106 protoplast thuốc lá trong khi muốn trồng 5×106 cây thuốc lá cần có 106 m2 tức là 100 ha đất canh tác. Ngoài ra, cơ thể thực vật bậc cao là cơ thể đa bào được phân hóa th ành các tổ chức khác nhau . Nếu tiến hành xử lý đột biến cả tổng thể đó rất khó đạt được tần số cần thiết. Sử dụng tế bào trần riêng rẽ cho phép loại bỏ mối tương tác với các tế bào bên cạnh và những thay đổi di truyền có điều kiện biểu hiện rõ ràng hơn. 4.2. Dung hợp protoplast Dung hợp protoplast hay tạo thể lai là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của nuôi cấy protoplast. Ứng dụng này thật sự quan trọng khi không có sự tương thích trong lai hữu tính vá các phương pháp lai khác bị thất bại. Quá trình dung hợp protoplast là sự kích thích để hòa trộn 2 bộ genom của hai protoplast với nhau, trong đó có thể lai cùng loài, khác loài, thậm chí là khác giới (điều mà không thể thực hiện được với các phương pháp lai thông thường). Các protoplast có thể dung hợp với nhau một cách tự nhiên trong suốt quá trình phân lập hoặc sự dung hợp này xảy ra trong một điều kiện đặc biệt nào đó. 4.2.1. Dung hợp tự phát Sự dung hợp này xảy ra giữa hai hay nhiều tế bào ở gần nhau. Trong quá trình phân lập, các sợi liên bào sẽ bị đứt gãy, từ đó kích thích các protoplast tiến sát lại gần nhau, cầu liên bào giãn ra và kết quả là nhân và tế bào chất của hai protoplast sẽ hòa chung với nhau thành một đơn vị, hình thành nên các tế bào đa nhân. Các tế bào đa nhân này thường ít khi phân chia tạo các microcallus, macrocallus và tái sinh thành cây. Hiện tượng này xảy ra với tần số cao giữa các protoplast phân lập từ callus hay huyền phù tế bào hơn các protoplast phân lập từ lá. Tuy nhiên, kiểu dung hợp tự phát thường hiếm xảy ra, việc gây co nguyên sinh trong quá trình phân lập protoplast cũng có tác dụng ngăn cản nhất định sự dung hợp tự phát. 4.2.2. Dung hợp có kích thích a. Phương pháp cơ học Phương pháp này được thực hiện bằng cách dùng micropipette trộn đều hỗn hợp hai loại protoplast của cùng một loài hay khác loài. Một phần của tip micropipette được chặn lại, các protoplast được hút lên đẩy xuống nhiều lần tạo thành áp lực dòng chảy nén chúng lại để kích thích sự dung hợp. Sự dung hợp này không phụ thuộc vào các yếu tố của quá trình dung hợp, tuy nhiên phương pháp này dễ làm tổn thương protoplast và số lượng tế bào được dung hợp rất thấp nên ít được sử dụng. b. Phương pháp hóa học - Xử lý bằng NaNO3 95 Năm 1970, Power và cs đã dùng NaNO 3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cs (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai soma đầu tiên (Nicotiana glauca × N. langsdorffii). Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO 3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như protoplast từ nhu mô lá. - Xử lý bằng PEG Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylen glycol ). Khoảng 0,6 mL dung dịch PEG (hòa tan 1 g PEG mol. wt. 1500 trong 2 mL glucose 0,1 M, CaCl2 10 mM, và KH 2PO4 0,7 mM) làm thành một giọt protoplast và chuyển lên đĩa petri . Sau khi đậy nắp , protoplast trong dung dịch PEG được nuôi ở nhiệt độ phòng trong 40 phút, pha loãng dung dịch PEG bằng cách bổ sung 0,5-1 mL môi trường nuôi cấy protoplast sau mỗi 10 phút. Rửa protoplast với dung dịch không có tác nhân dung hợp bằng cách ly tâm và các protoplast được treo trở lại trong môi trường nuôi cấy. Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp . PEG có trọng lượng phân tử thấp (~ 100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn , trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH /Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của các protoplast. Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp , các protoplast được nuôi cấy theo phương thức chuẩn (xem phần II ). PEG có 2 tác dụng: hoặc cung cấp một cầu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau hoặc dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt màng trong suốt quá trình rữa giải (elution process). Hình 6.7. Dung hợp tế bào trần bằng xử lí PEG c. Phương pháp dung hợp bằng xung điện Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện (electrofusion) không gây độc đối với tế bào như thường thấy ở các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG. Cũng theo hướng này và gần đây đã được chứng minh , người ta đã dùng các xung điện (electric pulses) để đưa trực tiếp DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật (biến nạp bằng điện-electroporation, xem chương 6), kỹ thuật này đã làm tăng sự quan 96 tâm về việc ứng dụng dung hợp bằng điện vào lĩnh vực di truyền tế bào soma (somatic cell genetics). Senda và cs (1979) là những người đầu tiên nghiên cứu theo hướng dung hợp bằng điện ở Rauwolfia, quá trình dung hợp đã thực hiện thành công khi dùng xung điện 5-12 amp DC. Sau đó, Zimmermann và Scheurich (1981), cũng đã chứng minh rằng các protoplast có thể dung hợp bằng điện trường và đưa ra một quy trình có thể sử dụng rộ ng rãi . Quy trình này bao gồm 2 bước: Đầu tiên, các protoplast được đưa vào trong ngăn dung hợp nhỏ (small fusion chamber ) ( Hình 6.3) có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện cực . Tiếp đó, sử dụng điện áp (voltage) thấp và trường AC dao động nhanh (rapidly oscillating AC field ), kích thích các protoplast sắp thành từng chuỗi tế bào (chuỗi ngọc trai-pearl chains) giữa các điện cực (Hình 6.4). Phương thức này cho phép các tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút . Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh , quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao (high-voltage DC pulses). Xung DC điện áp cao tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất (plasma membrane) ở vị trí tiếp xúc của các tế bào , tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý . Một quá trình hoàn chỉnh bắt đầu từ lúc đưa các protoplast vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trường nuôi cấy , có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc ít hơn. Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma, bao gồm : Nicotiana tabacum (+) N. tabacum, N. plumbaginifolia (+) N. tabacum, N. glauca (+) N. langsdorfii, và Solanum tuberosum (+) S. phureja. Một số tổ hợp lai protoplast đã hình thành callus như: Brassica napus (+) B. napus và Solanum brevidens (+) N. rustica. Hình 6.8. Sơ đồ dung hợp bằng điện Buồng dung hợp có 2 điện cực song song được nối với máy dao động tần số cao (máy phát điện sóng hình sine hoặc trường AC) và máy phát điện xung DC. 97 Hình 6.9. Các protoplast thịt lá của cây thuốc lá xếp thành chuỗi ngọc trai dưới ảnh hưởng của trường AC (100 V/cm, 0,6 MHz) 5. CHỌN LỌC CÁC THỂ LAI SOMA - Phương pháp mẫn cảm dược phẩm Có thể ứng dụn g sự mẫn cảm khác nhau của các protoplast phân lập từ các loài khác nhau. Hình 6.10. Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của các protoplast thịt lá đối với actinomycin D 98 Ví dụ: Petunia hybrida và P. Parodii đối với actinomycin D . Trên môi trường MS, các protoplast tế bào thịt lá của của P. hybrida phát triển mạnh tạo thành khối callus lớn (macroscopic callus) trong khi ở P. parodii các protoplast chỉ tạo thành các khuẩn lạc tế bào nhỏ. Bổ sung actinomycin D vào môi trường nuôi cấy có hiệu quả đối với khả năng tái sinh của protoplast P. parodii, nhưng ở P. hybrida các protoplast lại mất khả năng phân chia . Mặc dù môi trường nuôi có bổ sung dược phẩm , các thể dị nhân vẫn có thể sinh trưởng và sau cùng phân hóa thành các cây lai soma . Chọn lọc thể lai soma giữa N. sylvestris và N. knightiana cũng theo phương pháp tương tự. - Các đột biến khuyết dưỡng Chọn lọc các thể lai soma nhờ sự bổ sung di truyền của các đột biến khuyết dưỡng (auxotrophic mutants ), phương pháp này chỉ thích hợp khi các dòng lai được mong đợi sống sót trên môi trường cơ bản . Mặc dù phương pháp này ứng dụng cho các thực vật bậc cao có gặp một số khó khăn , nhưng người ta cũng đã thành công trong việc chọn lọc một số lượng lớn các thể lai soma bằng cách dùng các protoplast khuyết tật enzyme nitrate-reductase (không sử dụng nitrate) và các dòng đột biến thuốc lá kháng chlorate. Các protoplast của hai đột biến khác nhau này đã được dung hợp và nuôi cấy trên môi trường chứa nitrate (nguồn nitrogen chính ). Trong thí nghiệm đối chứng các pro toplast bố mẹ không sinh trưởng khi có mặt nitrate trong khi các sản phẩm dung hợp đã tái sinh cây. - Chọn lọc bổ sung di truyền Hình 6.11.. Phương thức chọn lọc bổ sung di truyền chỉ có callus lai tái sinh cây 99 Dùng phương thức chọn lọc bằng mắt để phân lập các tế bào lai phát triển trên môi trường nuôi cấy có thành phần gây mẫn cảm đối với các protoplast bố mẹ. Thí nghiệm điển hình là dùng protoplast dạng hoang dại (mô thịt lá ) của Petunia parodii dung hợp với protoplast bạch tạng phân lập từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của P. hybrida, P. inflata và P. parviflora trong các thí nghiệm riêng rẽ. Ở trong tất cả các tổ hợp này protoplast màu xanh của P. parodii bị đào thải ở giai đoạn khuẩn lạc có kích thước nhỏ , trong khi các protoplast của các loại bố mẹ khác phát triển thành các khuẩn lạc không màu. Ngược lại, các thể lai sinh sản thành các callus màu xanh và sau đó thành cây lai soma. Phương thức này cũng dùng để lai soma khác loài ở các chi Daucus, Datura và các chi khác. Tuy nhiên , trong các thí nghiệm lai soma khác chi , người ta đã dùng phương thức trong đó các protoplast bố mẹ và các thể lai dị nhân được phép phát triển callus trong nuôi cấy. Kết quả tạo ra ba loại callus khác nhau về hình thái, và có thể xác định được các mô lai, là các mô sau đó được phân lập ra để tái sinh thành cây lai soma. Hình 6.12. Phương thức dùng cho lai soma khác chi của Atropa belladonna - Sử dụng các đột biến bạch tạng có các gen không allele cho chọn lọc bổ sung di truyền Melchers và Labib (1974) đã tiến hành thí nghiệm bằng cá ch sử dụng protopplast của hai giống thuốc lá Nicotiana tabacum: Giống s (sublethal) không tổng hợp được diệp lục bình thường nên rất mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao . Giống v 100 (virescent) cũng không tạo được lục lạp bình thườ ng lá non trắng hoàn toàn và mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao. Hai giống này là hai dạng đột biến có thể bổ sung cho nhau được khi lai tạo , nghĩa là nuôi cấy ở ánh sáng 800 lux tới giai đoạn ra hoa, sau đó cho thụ phấn chéo sẽ thu được cây lai F1 có lá xanh bình thường và chịu ánh sáng cao (10.000 lux). Melchers đã tiến hành tách protoplast của cây đơn bội thu được từ nuôi cấy bao phấn của cây s và cây v rồi cho dung hợp . Sản phẩm dung hợp được chọn lọc trên m ôi trường chiếu 10.000 lux cho kết quả chỉ những hợp bào sống và phát triển thành khối callus xanh, trong khi các loại tế bào bố mẹ đều chết . Cây tái sinh từ khối callus xanh có lá xanh bình thường và chịu được ánh sáng cường độ cao. Thành công của Melchers là đã sử dụng hai đột biến bổ sung và chứng minh được sản phẩm dung hợp mang gen bổ sung đó. - Cây lai pomato Kết quả nổi bật của Melcher trong lai protoplast giữa cà chua và khoai tây đán h dấu một mốc quan trọng trong lĩnh vực này. Cây lai cà chua và khoai tây đầu tiên ra đời năm 1977, khi lai protoplast của cây cà chua [Lycopersicum esculentum Mill/var. cerasiforme (Dunal) Alef. (đột biến xanh vàng 6 Rick)] với protoplas t tế bào callus nuôi trong dịch lỏng của dòng khoai tây lưỡng bội DH số HH 258. Sản phẩm dung hợp lúc đầu chỉ tái sinh rễ về sau thu được chồi nhưng không phân biệt được chồi cây lai hay chồi khoai tây có màu lá bất thường . Phân tích nhiễm sắc thể không kết quả vì nhiễm sắc thể khoai tây và cà chua rất khó phân biệt hình dạng. Biện pháp của Holdn là giữa cà chua và khoai tây có sai khác nhau về băng protein của enzyme ribulose -1,5-biphosphat carboxylase trên điện di SDS (sodium dodecyl sulfate) từ đó mà Melchers phân biệt được sản phẩm dung hợp với tế bào bố mẹ. Các dạng cây lai được phát hiện: - Dạng 1: Cây lai có plastome (hệ gen lục lạp) khoai tây. - Dạng 2: Cây lai có plastome cà chua. Dạng 1 (potato + tomato) có plastome của potato được gọi là pomatoes. Dạng 2 (potato + tomato) nhưng có plastome của tomato được gọi là topatoes. Trong hai dạng này một số có khả năng tạo bộ phận giống củ nhưng hoa vẫn bất thụ. Vấn đề này đang được nghiên cứu , hy vọng sẽ tạo ra được cây rau có quả cà chua và củ khoai tây. 6. TỒN TẠI CỦA KỸ THUẬT PROTOPLAST 80% thức ăn của nhân loại đều do các cây trồng ngũ cốc tạo ra . Nếu một kỹ thuật mới ra đời phục vụ được công tác cải thiện giống những cây trồng quan trọng này sẽ mang lại hiệu quả vô cùng to lớn. Kỹ thuật protoplast đã thu được thành công ở các loài thuộc họ cà (Solanaceae) và một số họ khá c, nhưng thành công ở họ hòa thảo (Poaceae) là họ của các cây trồng ngũ cốc chính còn rất hạn chế. Potrykus (1980) đã thảo luận rất kỹ về vấn đề này . Theo Potrykus có những chỉ tiêu sau liên quan đến kết quả nuôi cấy và tái sinh từ protoplast tiềm lực in vitro. 101 6.1. Phân lập - Cơ sở di truyền của tế bào (khả năng tiềm tàng của tế bào trong nuôi cấy vitro) - Tương tác tế bào trong cây - Cơ chế phân hóa trong quá trình phát triển cơ thể - Nguồn gốc cơ quan và cây hoàn chỉnh - Trạng thái sinh lý của tế bào - Tác động của quá trình phân lập - Tác động của trạng thái phân lập. 6.2. Điều kiện nuôi cấy - Nhu cầu dinh dưỡng - Nhu cầu về phytohormone - Điều kiện vật lý của nuôi cấy - Các yếu tố ức chế có thể xuất hiện - Tác động của mật độ quần thể tế bào. 6.3. Sự phân bào - Sinh tổng hợp thành tế bào - Điều khiển sinh tổng hợp thành tế bào - Chức năng của thành tế bào đối với phân bào - Điều khiển sự phản phân bào - Điều khiển sự phân chia nhân - Điều khiển phân bào. 6.4. Sự phân hoá - Điều khiển phân hóa tế bào - Tương tác tế bào trong nuôi cấy - Điều khiển và cơ chế tạo kiểu mô - Điều khiển quá trình tạo cơ quan, phôi. trần. in TÓM TẮT CHƯƠNG Protoplast là tế bào thực vật đã được tách bỏ thành tế bào hay còn gọi là tế bào Sử dụng phương pháp cơ học hoặc enzyme để phân lập protoplast từ các nguồn nguyên liệu như: lá cây, callus, dịch huyền phù tế bào,… Có nhiều phương pháp dung hợp và nuôi cấy protoplast để thu các tế bào lai. Các phương pháp chọn lọc thể lai sau khi dung hợp. 102 CÂU HỎI Câu 1: Hãy trình bày các phương pháp phân lập protoplast? Câu 2: Hãy phân tích các yếu tố cần chú ý khi nuôi cấy protoplast? Câu 3: Hãy trình bày các phương pháp nuôi cấy protoplast? Câu 4: Hãy trình bày các phương pháp dung hợp protpplast? 103 Chương 7. BIẾN DỊ DÒNG SOMA 1. KHÁI NIỆM Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô tế bào (Larkin và Scowcropt, 1981). Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính. Trong nhân giống vô tính in vitro, tính di truyền không ổn định của các cây tái sinh sau nuôi cấy được xem là một trong những hạn chế lớn nhất vì quá trình nhân giống yêu cầu tính đồng nhất và ổn định di truyền. Tuy nhiên, trong chọn tạo giống cây trồng, các biến dị dòng vô tính cung cấp một tiềm năng lớn để làm phong phú thêm các kiểu gene mới vào quỹ gene, cũng như giúp ích trong các nghiên cứu di truyền tế bào. Trên thực tế, tỷ lệ các biến dị di truyền có thể là rất lớn và chính vì thế việc hiểu và xác định các cơ chế, nguyên nhân gây ra các biến dị này là hết sức quan trọng. Qua đó, chúng ta có thể điều khiển các biến dị này một cách hiệu quả theo hướng có lợi. 2. PHÂN LOẠI BIẾN DỊ DÒNG SOMA 2.1. Biến dị kiểu gene Những nghiên cứu gần đây cho thấy các thí nghiệm nuôi cấy mô hoặc tế bào thường trải qua những thay đổi di truyền (đa bội-polyploidy, lệch bội-aneuploidy, đứt gãy nhiễm sắc thể -chromosomal breakage , khuyết đoạn -deletion, chuyển đo ạntranslocation, khuếch đại gen -gene amplifications , và đột biến -mutations), và những thay đổi này biểu hiện ở mức độ sinh hóa hoặc phân tử. Như vậy , nuôi cấy mô và tế bào thực vật có khả năng tạo biến dị di truyền tương đối nhanh và không cần phải ứng dụng các kỹ thuật phức tạp khác . Biến dị di truyền trong nuôi cấy mô biểu hiện ở sự thay đổi tính trạng của các cây tái sinh và sau đó truyền sang thế hệ sau bằng phương thức nhân giống hữu t ính (ví dụ : rau diếp , thuốc lá) hoặc dinh dưỡng (ví dụ: mía, khoai tây). Nhìn chung, các biến dị di truyền, xảy ra với tỷ lệ rất thấp và không có tính thuận nghịch. Gồm 3 loại biến dị chính (Larkin và cộng sự, 1989): - Các đột biến bộ gene: là các biến đổi về số lượng nhiễm sắc thể như đa bội, dị bội hay thể khảm. Các loài có độ bội thể cao và số lượng nhiễm sắc thể nhiều dễ bị biến dị hơn những loài có mức bội thể thấp và ít nhiễm sắc thể hơn (Creissen và Karp, 1985). - Các đột biến nhiễm sắc thể: là các biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể. Các thay đổi này có thể bao gồm các hiện tượng như mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn, lặp đoạn hay chuyển đoạn và các biến đổi trong quá trình giảm phân. - Các đột biến gene hay đột biến điểm: là biến đổi ở mức phân tử, gồm sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số lượng bản sao của một trình tự đặc thù, sự thay đổi trong biểu hiện của các nhóm đa gene hay sự thể hiện của các gene nhảy. 2.2. Biến dị kiểu hình Các biến dị kiểu hình thường liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện của một gene nhất định. Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hóa gene. Các biến dị kiểu hình thường xuyên xuất hiện ở các cây tái sinh sau nuôi cấy in vitro như là kết quả của các phản hồi về mặt sinh lý. 104 Các thay đổi về kiểu hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể phục hồi trạng thái ban đầu. Tuy nhiên, chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của cây tái sinh. Các ví dụ về biến dị kiểu hình có thể là hiện tượng tăng mạnh mẽ khả năng sinh trưởng của cây tái sinh khi trồng in vivo, hiện tượng ra hoa sớm, bạch tạng, các thay đổi về hình dạng, màu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao cây… Nhìn chung, nguyên nhân gây ra các biến dị không di truyền này có liên quan đến một vài thay đổi trong quá trình biểu hiện gene (Skirvin và cộng sự, 1994). 2.3. Cơ sở phân tử của biến dị Các biến dị cũng có thể xuất hiện như là kết quả của những thay đổi tinh vi hơn do các đột biến đơn gen xuất hiện trong nuôi cấy, và các đột biến này biểu hiện rõ ràng không có những thay đổi thuộc nhân (karyological changes). Các đột biến lặn không phát hiện được trong những cây R 0 (các cây tái sinh in vitro từ các tế bào hoặc mô bất kỳ ), nhưng biểu hiện ở thế hệ R 1 (thế hệ thu được sau khi tự thụ phấn (selfing) của cây R 0). Thế hệ F 1 phân ly tính trạng quan tâm theo quy luật Mendel với tỷ lệ 3:1. Những phân tích sâu hơn đã xác định bản chất của biến dị . Biến dị dòng soma của các đột biến lặn đơn gen cũng đã được tìm thấy ở ngô , Nicotiana sylvestris, lúa và lúa mì. Trong một số trường hợp đặc biệt , các dòng chỉ thị di truyền (thiếu chlorophyll) đã giúp đánh giá các cây tái sinh từ nuôi cấy tế bào Những tha y đổi trong hệ gen (genome) của tế bào chất cũng được quan sát ở các dòng soma. Ở cây ngô có hai tính trạng thuộc tế bào chất : (a) mẫn cảm với độc tố chiết từ Drechslera maydis nòi T-tác nhân gây bệnh rụi lá (leaf blight ) ở giống ngô Southern, và (b) tế bào chất bất dục đực Texas (cms-T). Cả hai tính trạng này được điều khiển bởi mtDNA (DNA ty thể). Một hướng khác của đột biến đơn gen trong biến dị dòng soma liên quan với các nhân tố gen nhảy (transposable elements). Chourey và Kemble (1982) đã phát hiện sự biến dị như là kết quả của sự xen đoạn của các DNA giống plasmid (plasmid-like DNA) trong hệ gen ty thể của nuôi cấy tế bào ngô cms -s. Những thay đổi cảm ứng bằng gen nhảy được thông báo chi tiết hơn ở các dòng thuốc lá, alfalfa và lúa mì. Biến dị dòng soma xuất hiện cũng có thể do những thay đổi phân tử gây ra do hiện tượng trao đổi chéo nguyên phân (mitotic crossing over-MCO) ở các cây tái sinh. Hiện tượng này bao gồm hai trường hợp biến dị đối xứng và bất đối xứng . Các đột biến đơn gen bởi MCO có thể hình thành một cơ chế thống nhất các biến dị di truyền mới. Những thay đổi nhỏ trong cấu trúc của cá c nhiễm sắc thể có thể dẫn đến những thay đổi về sự biểu hiện và chuyển giao di truyền (sang thế hệ sau ) của các gen đặc trưng, như là khuyết đoạn (deletion) và nhân đoạn (duplication) của một bản sao (hoặc nhiều bản sao) của một gen, hoặc sự biến đổi gen trong các quá trình sửa chữa . Sự tái tổ hợp về sau , hoặc đứt gãy nhiễm sắc thể ở vùng ưu tiên hoặc các “điểm nóng” di truyền (hot spots) của các nhiễm sắc thể đặc biệt ảnh hưởng đến hệ gen dẫn đến thay đổi biểu hiện phenotype. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng những thay đổi trong DNA cơ quan tử, các profiles của protein và isoenzyme liên quan với sự xuất hiện của biến dị dòng soma ở thực vật (lúa mì, lúa, khoai tây, ngô, lúa mạch và lanh). DNA cơ quan tử được tinh sạch tương đối dễ và có chuỗi nucleotide phức tạp . Một số enzyme cắt hạn chế có thể dễ dàng phân biệt giữa các kiểu cytosine -methylation (thay đổi trong các 105 biến dị dòng soma) bên ngoài và bên trong ở vị trí cắt hạn chế . Các dòng soma của lúa mì có những biến đổi ở mặt bên của gliadin . Ở lúa mạch, các biến dị thường có nguồn gốc từ nuôi cấy callus ; những biến dị có liên quan tới các đoạn spacer 1 của rDNA và các hordein cũng đã được tìm thấy. 3. CÁC NGUYÊN NHÂN CHÍNH GÂY RA BIẾN DỊ DÒNG SOMA Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm xác định nguyên nhân các biến dị dòng soma trong nuôi cấy mô. Bất kỳ một yếu tố nào có khả năng dẫn đến các thay đổi di truyền đều được xem như một nguyên nhân gây ra các biến dị di truyền. Chúng ta có thể gộp những yếu tố này thành 3 nhóm nguyên nhân: sinh lý, di truyền và hóa sinh. Các nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma là tính không đồng nhất di truyền của các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu và tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy in vitro. 3.1. Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đơn vô tính, từ hạt hay cây con được xem là đồng nhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có thể có kiểu hình giống nhau. Tuy nhiên, các mẫu cấy này trên thực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào mao mạch, nhu mô và mô vỏ. Những tế bào này có thể có mức đơn bội thể khác nhau hay có sự đa dạng tế bào giữa các loại tế bào trong cùng một mẫu cấy. Sự đa dạng tế bào như thế gọi là đa bội vô tính. Ngoài ra, nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa những lớp tế bào hoặc mô bị đột biến. Hiện tượng này đặc biệt phổ biến ở các cây thân gỗ. Các cây ở dạng thể khảm thường có mức độ biến dị di truyền cao khi nuôi cấy in vitro. 3.2. Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy 3.2.1. Phương thức nhân giống in vitro Các phương thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị vô tính khác nhau. Nếu chồi bất định tái sinh từ một tế bào thì tần số xuất hiện biến dị soma thường lớn hơn rất nhiều so với các chồi được tái sinh từ nhiều tế bào. Các quá trình nuôi cấy callus, huyền phù hoặc protoplast thường có nhiều biến dị soma. 3.2.2. Loại mẫu nuôi cấy Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau. Các loại mẫu cấy có nguồn gốc từ chồi nách, chồi đỉnh hay mô phân sinh thường có mức độ biến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc khác như lá, rễ hay protoplast. Khả năng xảy ra biến dị còn phụ thuộc vào kiểu gene cũng như tuổi cây mẹ. Các dòng già hơn thường tiềm ẩn các biến dị sẵn có ở mức cao hơn các dòng trẻ. Các loài có độ bội thể càng cao và số nhiễm sắc thể càng nhiều thì có tính biến dị càng cao. Kiểu gen ảnh hưởng lên tần số tái sinh cây và tần số biến dị dòng soma . Sun và cs (1983) khi nghiên cứu khả năng tái sinh ở các thể đa bội của 18 thứ (variety) khác nhau của lúa thì chỉ tái sinh được nhiều dạng bội th ể khác nhau ở thứ indica mà không tái sinh được ở thứ japonica. Mẫu vật được sử dụng từ nhiều nguồn mô khác nhau như lá , rễ, lóng (internodes), bầu quả (ovaries) và hoa tự (inflorescenes). Nguồn mẫu vật được xem là rất quan trọng trong việc xuất hiện biến dị dòng soma . Nghiên cứu ở cây phong lữ (geranium) cho thấy các biến dị soma có thể thu được từ cành giâm cuống lá (petiole cuttings) hoặc rễ in vivo, nhưng không thể từ cành giâm của thân (stem cuttings). Cây dứa (Ananas cosmosus) phát triển từ callus của hom giâm (slip), chồi đỉnh và chồi 106 nách (crown and axillary bud ) cho thấy chỉ có sự biến đổi ở đặc điểm của gai (spine), trong khi các cây phát triển từ callus của quả tụ (syncarp) cho thấy có sự biến dị ở màu lá, gai, lớp sáp (wax) và tán lá (foliage) (Wakasa 1979). Van Harten và cs (1981) quan sát thấy có sự thay đổi hình thái ở 12,3% cây khoai tây tái sinh từ mảnh lá (leaf discs), ngược lại có tới 50,3% các cây biến dị có nguồn gốc từ callus của cuống bông (rachis) và cuống lá . Các tác nhân chọn lọc khác nhau được sử dụng dựa vào các nguồn mẫu vật khác nhau trong nuôi cấy, tạo ra một dãy biến dị dòng soma giữa các cây tái sinh. 3.2.3. Loại và nồng độ chất điều khiển sinh trưởng Nuôi cấy các mô tế bào dài ngày trong môi trường chứa các auxin mạnh như 2,4-D hoặc 2,4,5-T sẽ gây ra các sai khác trong cây tái sinh. 2,4-D cảm ứng biến dị nhiễm sắc thể ở các cây tái sinh trong nuôi cấy mô của lúa mạch (Deambrogio and Dale 1980) và khoai tây (Shepard 1981) khi hiện diện ở nồng độ cao trong môi trường. Tương tự, các biến dị dòng soma của các loài Nicotiana cảnh (ornamental nicotiana) thu được từ mẫu lá trên môi trường có cung cấp BAP từ 5-10 mM (Bravo and Evans 1985). Các phytohormone rất cần thiết cho cảm ứng phát sinh cơ quan và phân hóa chồi ; tuy nhiên , nồng độ cao của các chất này không cho phép tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy mô và tỷ lệ phytohormone trong môi trường cần được điều chỉnh cẩn thận trong các hệ thống nuôi cấy nhân giống in vitro cho các biến dị dòng soma. 3.2.4. Thời gian nuôi cấy và số lần cấy chuyền Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện in vitro cũng như tăng số lần cấy chuyền sẽ làm tăng tần số xuất hiện các biến dị soma. Nguyên nhân là do sự thay đổi các kiểu methyl hóa bình thường của DNA genom. Khi quá trình methyl hóa xảy ra trong vùng DNA mã hóa cho một gene hoạt động, nó sẽ làm gene này bất hoạt. Dạng biến đổi về hóa sinh là dạng thường thấy nhất ở các biến dị trong nuôi cấy mô và rất nhiều biến đổi hóa sinh ít khi được nhận thấy trừ khi tiến hành các kiểm tra cụ thể. Cho đến nay một số biến dị sinh hóa đã được xác định trong các cây trồng khác nhau trong nuôi cấy mô tế bào. C Các ví dụ về biến dị hóa sinh bao gồm những thay đổi trong đồng hóa carbon dẫn đến mất khả năng quang hợp, sinh tổng hợp tinh bột, tổng hợp caroten, đồng hóa nitrogen và sự kháng các kháng sinh… 4. CHỌN LỌC BIẾN DỊ DÒNG SOMA Kỹ thuật chọn dòng tế bào đã ra đời rất sớm trong nghiên cứu vi sinh vật . Nhưng ở thực vật bậc cao , kỹ thuật này mới được ứng dụng cách đây khoảng hơn 20 năm. Người ta có thể tiến hành xử lý và chọn lọc tế bào thực vật ở ba mức độ chính: - Mô sẹo (callus). - Tế bào đơn (single cell). - Tế bào trần (protoplast). Mục đích chọn lọc in vitro có thể khái quát ở những điểm sau : - Chọn dòng tế bào chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh , ví dụ : chống chịu nóng, lạnh, phèn, mặn, khô hạn... - Chọn dòng tế bào kháng các độc tố : độc tố do nấm bệnh tiết ra, các loại kháng sinh. - Chọn dòng tế bào sả n xuất dư thừa (over production ) các loại sản phẩm chủ yếu là acid amin. 107 - Chọn các đặc điểm chỉ thị để nghiên cứu di truyền (genetic markers)... Các biến dị chọn lọc được trong nuôi cấy mô có nhiều cách gọi khác nhau như : dòng callus (calliclones-từ nuôi cấy callus ) hoặc dòng protoplast (protoclones-từ nuôi cấy protoplast). Năm 1981, Larkin và Scowcroft dùng một thuật ngữ chung là biến dị dòng vô tính (somaclonal variation ), mặc dù Evans và cs (1984) lại dùng thuật ngữ biến dị dòng giao tử (gameclonal variation ) cho các dòng bị biến đổi di truyền phát triển từ các tế bào giao tử hoặc thể giao tử. Sự đa dạng của biến dị ở các dòng vô tính làm nổi bật một thực tế rằng biến dị dòng vô tính có thể là một công cụ rất hữu hiệu cho việc cải thiện di truyền cây trồng. 4.1. Phương pháp chọn dòng 4.1.1. Chọn trực tiếp Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biệt thấy được về màu sắc có thể chọn được dòng tế bào từ quần thể tế bào. Một số dòng có khả năng kháng kháng sinh , kháng các chất đồng đẳng của acid amin hoặc chống chịu muối cũng có thể chọn trực tiếp từ quần thể tế bào. Hệ thống tế bào hay được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù hoặc khối callus. Điều kiện chọn lọc ở đây là các độc tố với nồng độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào . Những tế bào có khả năng phân chia trong môi trường chứa độc tố với nồng độ tăng dần từ lần cấy chuyển này đến lần cấy chuyển khác được sàng lọc dần (chọn lọc kiểu bậc thang). Hoặc có thể đưa cả quần thể tế bào vào điều kiện môi trường ức chế sinh trưởng hoàn toàn để chọn ra những tế bào sống sót , tuy nhiên ngưỡng tối đa của mức độ hoặc nồng độ tác nhân chọn lọc cần phải được thăm dò trước nếu không có thể ức chế sự phát triển của các tế bào đột biến trong quần thể tế bào nuôi cấy. Thông thường, người ta trộn tế bào vào môi trường thạch chứa dược tố và chọn những tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo , cũng có thể cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa độc tố . Dòng chống chịu thường xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy. 4.1.2. Chọn gián tiếp Trong trường hợp này đặc điểm của dòng được chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế bào . Thí dụ điển hình là chọn dòng thiếu enzyme nitrate reductase (NR). Trên môi trường chứa ClO 3- những tế bào có NR sử dụng ClO 3- như NO 3- và khử thành ClO -2 , ClO -2 tác dụng như một độc tố cho nên chỉ có những tế bào không có NR mới sống sót trên môi trường chọn lọc. 4.1.3. Chọn tổng thể Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn bằng phương thức xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến , ví dụ: đột biến lặn chịu được S -2-aminoethyl cysteine xuất hiện sau khi xử lý đột biến phôi nuôi cấy. 4.2. Phân lập biến dị 4.2.1. Không có tác nhân chọn lọc Các tế bào và callus không tổ chức (unorganised), sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro ở các thời kỳ khác nhau trên môi trường không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức chế), được cảm ứng để phân hóa các cây hoàn ch ỉnh. Các cây tái sinh 108 sẽ được trồng trên đồng ruộng để chọn lọc các biến dị. Bằng phương thức này người ta đã thu được các biến dị dòng soma của các loài cây trồng khác nhau. a. Cây mía đường (Saccharum officinarum) Cây biến dị phân lập từ nuôi cấy mô và tế bào được xác nhận đầu tiên ở mía . Công việc bắt đầu ở đảo Fiji (Nhật), phân lập các dòng phụ (subclones) ở giống mía Pindar để kháng bệnh Fiji (do virus aphid -transmitted) và bệnh mốc sương (downey mildew) (do Scelerospora sacchari). Tính kháng được duy trì ở các dòng soma qua một vài thế hệ trồng trên đồng ruộng. Ở Australia, Larkin và Scowcroft (1981), đã khai thác khả năng tạo các biến dị của nuôi cấy mô để cải th iện một số giá trị nông học của giống mía Q101 kháng bệnh đốm mắt (do Helminthosporium sacchari). Tương tự, Liu (1981) đã xác định các dòng callus mía cho cây ưu thế hơn giống (thứ) địa phương tốt nhất (F-160, Taiwan) về năng suấ t, hàm lượng đường và khả năng kháng bệnh than (do Ustilago scitaminea). b. Cây khoai tây (Solanum tuberosum) Shepard và cs (1980) đã tái sinh một số lớn cây từ protoplast tế bào thịt lá của giống “Russet Burbank” và thông báo các biến dị thu được trong quần thể protoclones. Một số trong chúng kháng được bệnh thối sớm (early blight-do Alternaria solani) hoặc thối muộn (late blight-do Phytophtora infestans). Các protoclone kháng virus Y và xoắn lá (leaf-roll) cũng đã xuất hiện trên đồng ruộng (Thomson và cs 1986). Biến dị di truyền ở khoai tây phát triển từ cây tái sinh trong nuôi cấy mô có thể di truyền sang thế hệ sau thông qua sinh sản sinh dưỡng (Sree Ramulu 1986). Các biến dị phân l ập trong các cây tái sinh từ callus giống Bintje , cho các dòng -sản xuất bằng phương thức sinh dưỡng -mang các tính trạng về năng suất , kháng bệnh thối muộn và nấm vảy (scab) trên đồng ruộng tốt hơn. c. Cây cà chua (Lycopersicum esculentum) Evans và cs (1987), đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dị hình thái, là các đột biến lặn của tính bất dục đực kháng nấm Fusarium oxysporium ở mắt của cuống lá, khả năng lục hóa của lá, màu sắc của quả và hoa. Một số biến dị về hình thái nói trên là do những thay đổi về số lượng nhiễm sắc thể. Các nhà khoa học ở DNA Plant Technology Co . (USA) đã phát triển các biến dị dòng soma của cà chua cho quả có vị ngọ t tăng, cấu tạo (texture) quả tốt hơn, màu và hàm lượng chất khô cao (20%). Một trong những biến dị như thế đã được đăng ký bản quyền là giống (thứ) thương mại vào năm 1986 (Marty 1988). d. Cây phong lữ (geranium) Skirvin và J anick (1976) đã phát triển một loài geranium (Pelargonium) từ các biến dị soma có mùi hương được cải thiện và đặt tên là “Velvet Rose” . Điều này cho thấy giống cây trồng thương mại (commercial crop plants ) đầu tiên bắt nguồn từ cá c biến dị dòng soma. Giống mới này có hoa đối xứng mang các nhị hữu thụ lớn , núm nhụy chẻ 5, trồng bằng hạt. Trong khi ở giống bố mẹ thì ngược lại , hoa bất đối xứng mang các bao phấn bé và bất thụ, núm nhụy chẻ 2, và không bao giờ trồng bằng hạt. e. Các loài ngũ cốc và hòa thảo (cereals and grasses) Các cây ngũ cốc và hòa thảo có nguồn gốc callus có thể là nguồn nguyên liệu cung cấp các biến dị dòng soma . Cây của các dòng này khác nhau về chiều cao , kích thước, dạng lá, chiều dài của râu (ở đầu hạt thóc), khả năng hữu thụ của cụm hoa, hoặc màu của hạt . Các biến dị chọn lọc có giá trị thương mại là dòng bất dục đực (male 109 sterility), điều chỉnh p rotein gliadin, kháng bệnh sương giá ở lúa mì (Galiba và Sutka 1988), tăng năng suất ở lúa và chín sớm ở ngô (Evans 1989), kháng bệnh cháy rụi (fireblight) ở cây lê (Pyrus communis) (Viseur 1989). Trong số các loài hòa thảo , các loài thuộc chi Lolium, Panicum và Pennisetum cũng cho nhiều hứa hẹn về tiềm năng biến dị dòng soma. 4.2.2. Có nhân tố chọn lọc (with selection pressure) Theo phương pháp này , các dòng tế bào biến dị được sàng lọc từ nuôi cấy n hờ vào khả năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố /chất ức chế trong môi trường dinh dưỡng, hoặc dưới các điều kiện stress của môi trường. Các biến dị có thể thu được bằng cách chọn lọc trực tiếp , gián tiếp. Sự phân lập được tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền phù hoặc bằng cách dàn trải tế bào đơn/protoplast. a. Kháng acid amin và các đồng đẳng của acid amin Một số acid amin trong đó có valine và threonine ức chế sinh trưởng tế bào khi đưa chúng vào môi trường dùng đường nuôi cấy , vì chúng ức chế tế bào sử dụng NO 3hoặc ngăn cản acid amin cùng nguồn gốc. Ngoài ra, nếu bổ sung các chất đồng đẳng của acid amin vào môi trường nuôi cấy chúng có thể được sử dụng như acid amin vào việc tổng hợp ra các phần tử protein, kết quả các phân tử này bị mất hoạt tính. Hiện tượng ức chế này có thể khắc phục bằng cách cung cấp cho tế bào thêm các acid amin khác hoặc các hợp chất dẫn xuất bình thường khác của chúng. Hình 7.1. Cơ chế ức chế ngược đối với tryptophan 110 Đối với tế bào , chúng có thể tự khắc phục bằng cách tăng cường tổng hợp các acid amin thích ứng . Và đây là nguyên nhân vì sao các dòng tế bào kháng được các chất đồng đẳng của acid amin lại sản xuất dư thừa acid amin. Cơ chế của hiện tượng sả n xuất dư thừa là quá trình ức chế ngược (feed-back inhibition) kém mẫn cảm hơn. Trong dòng tế bào kháng 5-methyl-tryptophan cơ chế ức chế sản phẩm ngược này kém mẫn cảm vì vậy hoạt tính của anthranilat synthetase vẫn cao và lượng Tryp được tạo ra cao gấp năm lần so với bình thường . Ở các dòng kháng p -fluorophenyl alanine cơ chế ức chế sản phẩm ngược hoạt động của enzyme chorismat mutase kém mẫn cảm với phenylalanine và tyrosine. Vì vậy lượng phenyl được tạo ra rất cao. Trong thực tế hiện tượng kiểm tra lỏng lẻo các quá trình sinh tổng hợp acid amin vẫn tồn tại không cần sự có mặt các chất đồng đẳng của acid amin . Các acid amin tự do này (Phe, Tyr, Met, Lys) sẽ được tích lũy lại hoặc chuyển hóa tiếp (ví dụ: thành các hợp chất phenol). Hiện tượng thải acid amin tự do ra môi trường chỉ gặp đối với proline (Pro). Ngoài ra , khả năng kháng các chất đồng đẳng của acid amin còn có thể do những cơ chế khác gây ra, ví dụ như: - Tế bào hạn chế thu nhận các chất đồng đẳng của acid amin . Hoạt động thu nhận các chất đó rất yếu. - Tế bào có khả năng chọn các acid amin bình thường để tổng hợp protein trong khi các chất đồng đẳng của acid amin bị bỏ lại. - Trường hợp kháng threonine thì tế bào có những thay đổi trong hệ thống enzyme sử dụng NO 3- . Nghiên cứu về tính kháng các đồng đẳng của acid amin có ý nghĩa t hực tiễn rất lớn. Người ta hy vọng sẽ tạo được các giống cây có giá trị dinh dưỡng cao . Chẳng hạn: Widholm (1977) đã chọn được một dòng tế bào cà rốt có thể sản xuất 27 lần tryptophan tự do nhiều hơn bình thường và tổng 25% lượng Tryp tổng số (tự do + trong protein). Ở một dòng tế bào cà rốt khác cùng một lúc kháng được 4 chất đồng đẳng của acid amin, và hàm lượng các acid amin tương ứng là Lys , Phe, Met và Tryp tăng từ 634 lần. Tuy nhiên, biểu hiện sự sản xuất dư thừa này có còn giữ được sau khi tái sinh cây hay không đó là điều cho đến nay vẫn chưa được kết luận. Vấn đề tái sinh cây từ dòng tế bào kháng 5-methyltryptophan là vấn đề sinh lý khá lý thú. Kháng 5-methytryptophan sẽ sản xuất dư thừa tryptophan mà tryptophan lại là tiền chất của IAA nên tế bào sẽ sản xuất dư thừa IAA và như vậy tế bào sẽ sinh trưởng tự dưỡng auxin nghĩa là không cần auxin ngoại sinh đưa vào môi tr ường. Lượng IAA tăng cũng làm cho tế bào mất khả năng tạo phôi và tạo chồi. Chỉ có 10-6 tế bào có thể tạo cây, và có thể do một đột biến thứ hai xãy ra trong trao đổi chất Tryp hay IAA. Cho tới nay đã có một số kết quả như sau: - 2 trường hợp cây tái sinh từ mô sẹo -Nicotinana tabacum kháng methionineine sulfoximine và valine. - 1 trường hợp chọn từ nuôi phôi-Hordeum vulgare và Zea mays kháng lysine + threonine, Nicotiana tabacum kháng 5-methyl tryptophan. - 1 trường hợp chọn cả cây-Triticum kháng 5-methyl tryptophan. 111 Những dòng này có khả năng di truyền tính trạng này cho thế hệ sau qua sinh sản hữu tính. Bảng 7.1. Các dòng tế bào kháng các acid amin và các đồng đẳng của nó chọn lọc được trong nuôi cấy in vitro Tác nhân chọn lọc Loài Tác nhân đột biến Tái sinh cây S-(aminoethyl)-Lcysteine Arabidopsis thaliana Daucus carota Hordeum vulgare Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum Nicotiana sylvestris EMS Không Azide EMS UV/EMS Không Có Không Có Không Không Không Aminopterin Oryza sativa Datura innoxia (1n) EMS Không Không Có Azaguanine Acer pseudoplatanus Glycine max Haplopappus gracilis Medicago sativa NTG EMS EMS EMS Không Không Không Không Azauracil Haplopappus gracilis Zea mays EMS EMS Không Không Azetidine-2carboxylic acid Daucus carota Không Không Bromodeoxyuridine Glycine max Medicago sativa Nicotiana tabacum NG EMS Không Không Không Có Ethionine Daucus carota Daucus carota Medicago sativa EMS Không EMS Không Không Không p-Fluorophenyl alanine Acer pseudoplatanus Daucus carota Datura innoxia Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum Không Không Không UV/EMS Không Không Không Không Có Không Không Có NG Không 6-Fluorotryptophan Petunia hybrida 5-Fluorouracil Daucus carota Không Có Glycine Nicotiana tabacum Không Có 112 Tác nhân chọn lọc Loài Tác nhân đột biến Tái sinh cây hydroxamate ∆-Hydroxyproline Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum EMS UV/EMS Không Không Hydroxyproline Daucus carota Hordeum vulgare EMS Azide Không Có Hydroxyurea Nicotiana tabacum Không Có Azide Không Có Có Không Có Không Không UV/EMS Không Không Không Không Không Không Không Có Không Lysine threonine plus Zea mays Zea mays Methionineine sulfoximin Nicotiana tabacum Methyltryptophan Catharanthus roseus Daucus carota Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum Nicotiana sylvestris Seleno-acid amins Nicotiana tabacum Không Không Thienylalanine Nicotiana sylvestris Không Không Threonine Nicotiana tabacum Không Có Valine Nicotiana (1n) Nicotiana (1n) tabacum UV NG hoặc tabacum chiếu xạ Có Không Chú thích NG: N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine. b. Kháng bệnh Các tế bào đơn hoặc protoplast phân lập được nuôi cấy dưới tá c dụng của các tác nhân gây đột biến vật lý hoặc hóa học để cảm ứng cho tính kháng phytotoxin . Carlson (1973) tái sinh cây từ protoplast thuốc lá được xử lý ethylmethane sulphonate (EMS) - chọn lọc cho tính kháng methionineine s ulphoximide (MSO) - nhận thấy tính chống chịu tăng lên đối với Pseudomonas tabacci. Tính kháng được di truyền như một tính trạng đơn nửa trội (single semidominant trait). Gegenbach và Green (1975-1977), chọn lọc tính kháng T -toxin của Helminthosporium (độc tố đặc trưng vật chủ ) ở nuôi cấy in vitro ngô, đã thu được dòng ngô bất dục đực có khả năng kháng bệnh rỉ sắt do nấm Helminthosporium maydis gây ra bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào nuôi cấy bằng phương thức sau: 113 Hình 7.2. Chọn dòng kháng Helminthosporium maydis ở ngô Kháng độc tố của nấm bệnh rỉ sắt và tính bất dục đực di truyền đường mẹ do đột biến trong một gen gây nên , hoặc do trong tế bào chất có cả mộ t quần thể genome của các cơ quan tử , chọn lọc tính chịu bệnh tức là chọn gen thích hợp trong quần thể đó. Tính kháng thường do mtDNA quyết định , và tính bất dục đực trong trường hợp này cũng do mtDNA quyết định. Ở thuốc lá, người ta chọn lọc được đột biến kháng methionineine sulfoximine , độc tố do Pseudomonas tabacci tiết ra (P. tabaci gây bệnh cháy rụi ở thuốc lá). c. Kháng chất diệt cỏ Sinh trưởng của cỏ dại trong quần thể các cây trồn g quan trọng trong nông nghiệp thường được điều chỉnh bằng các chất diệt cỏ . Vì các chất diệt cỏ (herbicide) có thời gian tồn dư ngắn (short residual life ), nên chúng được ứng dụng lặp lại nhiều lần trên cây trồng. Một số cây trồng đã trở nên nhạy cảm với chất diệt cỏ do việc sử dụng lặp lại của nó trên cây. Hơn nữa, phương pháp điều chỉnh cỏ dại như thế này là không kinh tế vì các chất diệt cỏ hầu hết là đắt tiền. Phương pháp nuôi cấy in vitro cho phép thu được các cây biểu hiện tính chống chịu đối với các chất diệt cỏ . Nuôi cấy protoplast trên môi trường có các chất diệt cỏ khác nhau đã cảm ứng đột biến tạo các dòng tế bào chống chịu sau đó có thể tá i sinh thành cây. Các cây kháng các chất diệt cỏ tái sinh từ tế bào nuôi cấy bao gồm Nicotiana tabacum (kháng amitrole , bentazone, chlorosulphon, isopropyl N -carbamate, phenmedifarm, picloram và paraquat ), Corydyllis (kháng glyphosphate ), và Medicago sativa (kháng glufosinate). 114 Một số tính trạng chống chịu được di truyền như là các đơn allen (monogenic allen) trội hoặc lặn. Khả năng chống chịu chất diệt cỏ cũng có thể được biến nạp vào tế bào bằng cách lai soma hoặc thông qua công nghệ chuyển gene. Bảng 7.2. Các dòng tế bào đột biến mang tính trạng hữu ích trong nông nghiệp thu được từ nuôi cấy in vitro. Tác nhân chọn lọc 1. Chịu lạnh 2. Kháng các chất diệt cỏ Asulam Loài Tác nhân đột biến Tái sinh cây Daucus carota Nicotiana sylvestris EMS Không Có(e) Có Apium gravaeolens Không Không Tia γ Có(c) Bentazone Nicotiana (1n) tabacum 2,4-D Lotus corniculatus Không Có 2,4-D; 2,4,5-T; 2,4-DB Trifolium repens Không Không Isopropyl-N-phenylcarbamate Nicotiana tabacum EMS Có(c, d) Paraquat Nicotiana tabacum Tia X Có(c) Phenmedifarm Nicotiana tabacum (1n) Tia γ Có(c) Picloram Nicotiana tabacum Không Có(c) Solanum tuberosum Không Có Zea mays T-cms Không Có(c) Solanum tuberosum Không Có(c) Capsicum annum Datura innoxia Kickxia ramosissima Medicago sativa Oryza sativa Nicotiana sylvestris Nicotiana tabacum Không Không Không Không Không EMS Không Không Có Có Không Không Có Có(c) 3. Kháng các pathotoxins Fusarium oxysporum Helminthosporium maydis Phytophthora infestans 4. Chống chịu muối Chú thích (c) Cây kháng. (d) Cây bất thụ. (e) Không biểu hiện trong cây. d. Chống chịu các stress của môi trường Stress của môi trường do nồ ng độ muối cao ở trong đất là nhân tố chính kìm hãm phát triển nông nghiệp. 115 Từ kết quả đầu tiên là tái sinh cây thuốc (Nabors 1980), đến nay người ta đã phát triển một số lượng lớn các dòng tế bào và cây trồng có thể ch ống chịu nồng độ muối cao (Nguyễn Hoàng Lộc 1992). Dix (1977) đã phát triển các dòng chống chịu lạnh bằng cách nuôi cấy tế bào của Nicotiana sylvestris ở điều kiện nhiệt độ thấp . Tuy nhiên, phenotype của các cây tái sinh từ những dòng này không được chuyển sang thế hệ sau bằng phương thức hữu tính . Lê Trần Bình (1992) cũng đã thu được các dòng lúa chịu nhiệt độ thấp thông qua nuôi cấy mô callus . Các kết quả tương tự theo hướng biến dị dòng soma mang tính trạng chống chịu stress nước được cảm ứng bằng PEG hoặc mannitol (mannitol or PEG-induced water stress) trong nuôi cấy mô callus thuốc lá, mía và lúa cũng đã được thông báo (Nguyễn Hoàng Lộc 1992, 2003; Razdan 1994; Trương Thị Bích Phượng 2004). e. Các dòng khuyết dưỡng Các dạng khuyết dưỡng được sử dụng cho biến nạp DNA , lai soma và nghiên cứu các quá trình trao đổi chất . Sử dụng nuôi cấy tế bào đơn bội và xử lý đột biến gen tiện lợi cho phát triển một số lớn các loại khuyết dưỡng. Các dòng tế bào khuyết dưỡng đầu tiên được Carlson (1970) thông báo là cây thuốc lá đơn - nhị bội (dihaploid) sinh trưởng chậm trên môi trường tối thiểu và đòi hỏi sự trao đổi chấ t đặc biệt để hồi phục lại sự sinh trưởng bình thường . Các dòng khuyết dưỡng phân lập được trong nuôi cấy in vitro các loài thực vật khác nhau bao gồm các yêu cầu : (a) pathotenate, adenin và isoleucine + valine ở Datura innoxia; (b) histidine, tryptophan và nicotinic acid ở Hyoscyanus muticus; và (c) isoleucine, leucine, và uracil ở Nicotiana plumbaginifolia. Các dòng Datura được phân lập trong nuôi cấy dịch huyền phù tế bào . Thông qua dung hợp bổ sung (fusioncomplementation), các dòng khuyết dưỡng của N. plumbaginifolia và H. muticus được xác định là ở trạng thái lặn. Chlorate ( ClO 3- ) - một dạng tương tự nitrate - được biến đổi nhờ enzyme nitrate reductase trở thành chlo rite ( ClO -2 ), một loại độc tố của tế bào . Vì vậy, ở môi trường được bổ sung chlorate các tế bào dạng hoang dại có hoạt tính của enzyme nitrate reductase sẽ bị chết, trong khi các tế bào không có enzyme này sẽ sống sót. Các thể hồi biến (revertants) của dạng hoang dại có thể được kiểm tra bằng khả năng sử dụng NO 3- trong môi trường nuôi cấy của các tế bào này . Các dòng thiếu nitrate reductase được phân lập từ cá c tế bào nuôi cấy của N. tabacum, N. plumbaginifolia, H. muticus, D. innoxia, Rosa damascena và Petunia. Người ta có thể sử dụng các loại dòng tế bào và các đặc tính của chúng như những đặc điểm chỉ thị trong nghiên cứu điều k hiển di truyền và kỹ thuật gen . Hai loại dòng tế bào như thế đã được xác định : một loại là đột biến (nia) không tổng hợp apoenzyme, trong khi loại kia (cnx) không tổng hợp cofactor. Các phenotype này được sử dụng như là các marker bổ sung trong việc chọn lọc các thể lai soma. f. Kháng kháng sinh (antibiotic resistance) Maliga (1973) chọn lọc thành công dòng tế bào thuốc lá kháng streptomycin di truyền đường mẹ . Streptomycin ức chế sinh tổng hợp prote in ở lục lạp , ty thể nhưng không ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protein trong ribosome tế bào chất . Dòng tế bào kháng streptomycin có màu xanh được chọn bằng cách tách những cụm tế bào xanh trên môi trường chứa streptomycin . Dòng tế bào có màu trắng được chọn thông qua khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa streptomycin . Khả năng kháng này có thể do cả lục lạp và ty thể nhưng cũng có thể chỉ do một cơ quan tử quyết định . Ngoài ra, 116 người ta còn ph át hiện được tính kháng tổ hợp nghĩa là chọn lọc tính kháng một loại kháng sinh này nhưng cũng kháng được một số kháng sinh khác . Ví dụ : dòng N. sylvertris kháng kanamycin vẫn có thể kháng được streptomycin và neomycin . Hình 7.3. Dòng cnx và nia về gene NR trong thuốc lá. Bảng 7.3. Các đột biến khuyết dưỡng chọn lọc được trong nuôi cấy in vitro. Nhu cầu dinh dưỡng/ kiểu hình Loài Tác nhân đột biến Tái sinh cây Adenine Datura innoxia (1n) EMS Không p-aminobenzoic acid Nicotiana tabacum (1n) EMS Có Arginine Nicotiana tabacum (1n) EMS Có Biotin Nicotiana tabacum (1n) EMS Có Histidine Hyoscyamus (1n) NTG Có Hypoxanthine Nicotiana tabacum (1n) EMS Có muticus g. Kháng các đồng đẳng base của DNA Trong nuôi cấy mô tế bào động vật người ta dùng : 5-bromodeoxy uridin (BUdR) và 8-azaguanidin (AG) để chọn những dòng tế bào đột biến thiếu 117 thymidinkinase (TK) và hypoxanthin guanidin phosphoribosyl transferase (HGPRT). Cơ chế chọn lọc đó như sau: - Các tế bào có TK và HGPRT bình thường sẽ sử dụng BUdR và AG như các nucleotide cho sinh tổng hợp DNA . DNA mang BUdR và AG sẽ không bình thường và tế bào sẽ chết. - Những tế bào thiếu TK và HGPRT không sử dụng BUdR và AG chúng sẽ sống được. Các nhà nuôi cấy mô thực vật cũng sử dụng mô hình này đối với tế bào thực vật và bước đầu thu được một số kết quả . Ví dụ: chọn được dòng tế bào thuốc lá có hoạ t tính HGPRT giảm 50%, song các dòng kháng BUdR vẫn có hoạt tính enzyme lại phụ thuộc TK khá lớn . Điều đó được giải thích như sau : trong tế bào thực vật có hai loại TK, như vậy phải chọn được hai tế bào đột biến đồng thời mới mất hoàn toàn hoạt tính TK. Mặt khác dòng tế bào đậu tương kháng BUdR của Okyana (1976) lại do tế bào có khả năng sản xuất dư thừa thymidin . Cũng thể có tế bào có cơ chế sửa chữa DNA tốt cho phép chúng sửa được nhữ ng sai lệch do BUdR hay AG gây ra và như vậy chúng có khả năng kháng BUdR và AG . 4.3. Xử lý đột biến Các dạng biến đổi chọn được trong nuôi cấy in vitro thường xuất hiện với tần số -5 10 -10-8 khi không xử lý đột biến. Nếu xử lý sẽ tăng được tần số đó lên 10 lần. Các tác nhân gây đột biến thường được sử dụng là: - Ethylmethane sulphonate (EMS). - N-methyl-N-nitro-N-nitroso guanidine (MNNG). - N-ethyl-nitrosourea (ENU). - Tia X hoặc tia UV. Chưa có số liệu cụ thể về nồng độ , phổ và tần số đối với từng loại tác nhân bởi vì độ lớn của khối tế bào được xử lý , mật độ tế bào gieo trên đĩa petri và số nhiễm sắc thể cũng như karyotype của tế bào bị xử lý . Sử dụng protoplast thực vật bậc cao có thể là phương pháp tốt nhất để tiếp cận vấn đề này. 5. BẢN CHẤT CỦA BIẾN DỊ DÒNG SOMA Nguyên liệu di truyền trong các tế bào và mô soma được phân bố một cách bình thường như nhau thông qua quá trình nguyên phân (mitosis). Ngược lại ở các giao tử , chúng là sản phẩm của quá trình giảm phân (meiosis), nhận một nữa của sự bổ sung di truyền với các allele theo các quy luật phân ly độc lập theo Mendel . Để phân biệt các dòng soma có nguồn gốc soma và các dòng giao tử có nguồn gốc giao tử , người ta dùng 3 thông số khác nhau. Thứ nhất, cả hai loại gen đột biến lặn và trội cảm ứng bởi biến dị dòng giao tử sẽ biểu hiện trực tiếp ở các c ây đơn bội tái sinh từ tiểu bào tử (microspores) của các bao phấn nhị bội (từ đó chúng sẽ có chỉ một bản sao của mỗi gen ). Điều này cho phép phân tích trực tiếp các dòng giao tử (R0) để xác định các thể biến dị mới. Thứ hai, các thể tái tổ hợp phát triển trong các dòng giao tử sẽ là kết quả của tổ hợp chéo giảm phân (meiotic crossing over). Thứ ba, dòng giao tử có thể được dùng chỉ sau khi có được sự ổn định nhờ gấp đôi số lượng nhiễm sắc thể của nó. 118 Giá trị của biến dị dòng giao tử trong cải thiện di truyền rõ ràng từ sự phát triển của các dòng đơn bội kép (double-haploid) bằng cách nuôi cấy bao phấn của các cây lai F1 của lúa mì và lúa. Nuôi cấy bao phấn đã được sử dụng để phát triển các cây tái tổ hợp của thể lai F 1 của lúa mì giữa giống Xian nog 5675 (một thứ có mày trắng , râu ở đầu hạt thóc , cụm hoa hình chùy và cuống hoa ngắn ) và giống Jili (một thứ có mày màu đỏ, có râu, cụm hoa hình thoi và cuống hoa cao). Một số cây đơn bội kép đã được phát triển biểu hiện các đặc điểm hỗn hợp của cả hai bố mẹ. Biến dị ở cây tái sinh từ mô của thể giao tử đã được thông báo ở mộ t số trường hợp do khám phá ra “dị hợp tử dư” (residual heterozygosity, thường có ở vi khuẩn ). Hướng nghiên cứu khám phá các dị hợp tử dư ở thực vật là nuôi cấy bao phấn từ các thể đơn bội kép và kiểm tra biến dị xuất hiện ở các chu trình tiếp theo của sinh sản đơn tính (androgenesis). Kiểm tra các cây có nguồn gốc từ chu trình thứ hai của nuôi cấy bao phấn đơn bội kép cây thuốc lá đã tìm ra được các biến dị về năng suất , chiều cao cây , ngày ra hoa, và hàm lượng alkaloid tổng số . Các biến dị tương tự đã được thông báo ở các cây từ thể đơn bội kép của N. sylvestris phát triển sau một số chu trình sinh sản đơn tính . Các biến dị dòng giao tử là kết quả của cá c nhân tố gây ra sự tái tổ hợp giảm phân và các đột biến trước khi nuôi cấy bao phấn. 6. ỨNG DỤNG BIẾN DỊ DÒNG SOMA TRONG CÔNG TÁC GIỐNG CÂY TRỒNG Các đột biến đơn gen trong hệ gen của nhân hoặc cơ quan tử có thể tạo ra một thứ in vitro (in vitro variety) thích hợp nhất có các đặc tính đặc trưng được cải thiện . Trong khuôn khổ tạo giống cây trồng, biến dị dòng soma có thể được sử dụng để khám phá ra các thể biến dị mới duy trì tất cả các đặc tí nh tốt và có bổ sung tính trạng hữu ích, như kháng các bệnh hoặc chất diệt cỏ. Các biến dị này sau đó có thể được thử nghiệm trên đồng ruộng để xác định chắc chắn sự ổn định di truyền của chúng . Lai thuận nghịch (reciprocal cross) giữa thế hệ F 1 mang tính trạng mong muốn với đối chứng có nguồn gốc từ hạt sẽ ổn định xa hơn (further stabilise) các thể biến dị và giúp đỡ tạo hạt giữa các dòng hứa hẹn. Biến dị dòng giao tử , được cảm ứng hầu hết bởi sự tái tổ hợp giảm phân trong chu trình hữu tính của thể lai F 1, tạo ra sự phân ly vượt quá giới hạn để khám phá ra các tổ hợp gen duy nhất. Các dòng tế bào khác nhau chọn lọc trong điều kiện in vitro có thể chứng minh năng lực ứng dụng cho nông nghiệp và công nghiệp . Các cây tái sinh biểu hiện các tính trạng kháng chất diệt cỏ , pathotoxin, muối hoặc phèn. Hơn nữa, khả năng biến dị trong nuôi cấy tế bào đã thể hiện một vai trò hữu ích trong việc tổng hợp các chất thứ cấp liên quan đếm phạm vi thương mại. Các kỹ thuật ứng dụng cho việc cảm ứng biến dị dòng soma và dòng giao tử dễ dàng hơn công nghệ DNA tái tổ hợp. Đặc biệt, cải thiện cây trồng mang các tính trạng đa gen (polygenic traits) bằng các phương pháp tạo giống cây trồng truyền thống và không truyền thống đã được chứng minh là rất khó khăn . Biến dị dòng soma có thể là một kỹ thuật thích hợp cho công nghệ di truyền các cây trồng này. 119 TÓM TẮT CHƯƠNG Biến dị dòng soma bao gồm biến dị kiểu gen và biến dị kiểu hình thể hiện ở các mô tế bào nuôi cấy. Các biến dị này xuất hiện do sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy hoặc chịu sự tác động của nhiều yếu tố trong quá trình nuôi cấy. Các tế bào biến dị cá thể được phân lập bằng nhiều phương pháp: không có tác nhân chọn lọc và có tác nhân chọn lọc. CÂU HỎI Câu 1: Hãy trình bày cơ sở phân tử của biến dị dòng soma? Câu 2: Hãy phân tích sự tác động của các yếu tố gây ra biến dị dòng soma trong quá trình nuôi cấy? Câu 3: Hãy trình bày các phương pháp phân lập biến dị dòng soma? 120 Chương 8. BIẾN NẠP DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT Một trong những hướng phát triển gần đây nhất của nuôi cấy mô và tế bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gen ngoại lai trong tế bào thực vật . Biến nạp của các tế bào vi khuẩn đ ược thực hiện bằng cách chuyển DNA từ một vi khuẩn khác và sự hợp nhất sau đó của DNA ngoại lai này trong nguyên liệu di truyền của vật chủ đã được thiết lập tốt. Tuy nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằ ng cách đưa DNA ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp . Sử dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases ) để cắt phân tử DNA sợi đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA -DNA và các gen chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào biến nạp có khả năng hợp nhất DNA ngoại lai trong tế bào ở Monera, nấm, động vật, và thực vật bậc cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền lại cho các thế sau của chúng. Chuyển gen vào cây trồng là một công cụ thiết yếu cho cả những thí nghiệm nghiên cứu về chức năng gen và sự cải thiện vụ mùa bằng việc tăng cường những đặc tính có sẵn hoặc gắn những gen mới vào cây trồng. Bây giờ, nó có thể gắn và biểu hiện bền vững DNA trong những loài cây trồng khác nhau mà không cần quan tâm đến nguồn gốc của chúng, và những khía cạnh của sinh lý thực vật và hóa sinh thì không thể dể dàng chú tâm tới bởi những phương tiện thí nghiệm khác có thể được nghiên cứu bằng sự phân tích chức năng gen và điều hòa những cây chuyển gen. Việc chuyển DNA vào cây trồng được nghiên cứu đầu tiên vào những năm 1960, do thiếu marker chọn lọc và công cụ phân tử để xác định sự xâm nhập của gen và sự biểu hiện do đó hiệu quả của những thí nghiệm không rõ ràng. Cuối những năm 1970, đã có bước ngoặt trong việc làm sáng tỏ vi khuẩn A. tumefaciens liên quan đến sự hình thành khối u (Van Larebeke và cs, 1974). Việc khám phá ra sự xâm nhập của A. tumefaciens mang một plasmid lớn có khả năng cảm ứng tạo khối u và một đoạn DNA của plasmid (T-DNA) đã được chuyển đến genome của cây trồng đã cung cấp một công cụ chuyển gen tự nhiên vào cây trồng (Chilton và cs, 1997). Cây khoai tây mang trình tự T-DNA tái tổ hợp được tái sinh đầu tiên vào năm 1982, mặc dù những gen lạ đã hoạt động dưới sự điều khiển của promoter của nó nhưng đã không được biểu hiện ở tế bào thực vật. Cây khoai tây chuyển gen đầu tiên biểu hiện gen tái tổ hợp trong trình tự xâm nhập T-DNA được công bố năm 1983. Kỹ thuật biến nạp gián tiếp thông qua A. tumefaciens đã được phát triển và cải tiến, nó đã trở thành kỹ thuật được sử dụng phổ biến cho việc chuyển gen vào các loại cây trồng khác nhau. Đến nay, các kỹ thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau. Lúc đầu người ta sử dụng các gen chỉ thị để biến nạp , nhưng nay đã thay thế bằng các gen quan trọng có giá trị kinh tế nhằm mục đích cải thiện phẩm chất cây trồng. Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ gen (gene transformation technology ) ở thực vật bậc cao là : các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các loài thực vật khác nhau . Muốn chuyển một gen thành công cần phải chứng minh hiệu quả của phương pháp biến nạp gen , nhưng đôi khi các loài được nghiên cứu hoặc không 121 thể tái sinh được cây từ các mô không phân hóa , hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn chỉnh . Do đó, hai nhân tố nói trên thường được nghiên cứu phát triển song song. Việc tái sinh các cây được chuyển gen chủ yếu phụ thuộc vào các tế bào soma có tính toàn thể (totipotency) mà không phải tế bào soma nào cũng có được khả năng đó. Vì mô là một tập hợp của nhiều tế bào có phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động tới; một số ít tế bào trong cây có khả năng tái sinh và tiếp nhận sự biến nạp; những tế bào khác sẽ chỉ có một trong hai khả năng ấy. Tương quan giữa các quần thể tế bào kiểu như vậy tùy thuộc vào loài, kiểu gen, cơ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ quan. Các thí nghiệm biến nạp gen đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gen kháng kháng sinh . Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng hơn việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế. Trở ngại lớn nhất là tính đặc trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng. Sự phát triển của các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương pháp biến nạp gen trực tiếp . Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gen (particle bombardment )-dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật -việc biến nạp ở các loài cây trồng đã gặp nhiều thuận lợi hơn . Các phương pháp biến nạp khác cũng có hiệu quả đối với từng trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế. Chẳng hạn: các phương pháp biến nạp gen bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng phần , phương pháp xử lý hóa học bằng PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào , phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào , phương pháp biến nạp gen qua ống phấn... Khi thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như: - Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng. - Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai. - Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome. - Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Tuy nhiên, cần xem xét một số vấn đề như: chỉ có số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây. Ở các tế bào khác có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu có điều kiện phù hợp thì sẽ có khả năng, một số khác hoàn toàn không có khả năng biến nạp và tái sinh cây. - Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan. - Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì thế, cho đến nay chỉ có thể chuyển vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng phương pháp xung điện, siêu 122 âm và vi tiêm. - Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ thuận với sự biểu hiện tạm thời của gen. - Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome. - Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở nơi mà nó được đưa vào. - Trong khi đó, DNA của virus khi xâm nhập vào genome cây chủ không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) 1. CÁC KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Thông tin di truyền acid desoxyribonucleic (DNA) tồn tại ở 3 dạng chính: - DNA của cơ thể bậc cao trong đó có DNA nhân và DNA cơ quan tử. - DNA của vi sinh vật. - DNA của plasmid. Biến nạp thông tin di truyền (chuyển gen) là kỹ thuật sử dụng DNA tinh khiết để đưa vào cơ thể hay tế bào khác và theo dõi biểu hiện của thông tin di truyền mới này. Để biến nạp hiệu quả nguyên liệu di truyền vào tế bào vật chủ , các cấu trúc di truyền cần được thiết kế thích hợp cho sự hợp nhất và biểu hiện của các gen ngoại lai . Cấu trúc di truyền phải mang một gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gen: gen mã hóa một protein khử độc của hóa chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy , cho phép sinh trưởng ưu tiên của các tế bào có DNA ngoại lai được hợp nh ất) hoặc sàng lọc (screenable marker gen : gen mã hóa một protein cho kết quả trong sản phẩm sống sót nhờ đó có thể xác định tế bào biến nạp thể hiện gen ) để nhận biết hiệu quả biến nạp gen. Một cấu trúc di truyền đặc trưng bao gồm: gen khởi đầu (promoter), gen mã hóa (coding gen ) và gen kết thúc (terminator). Các gen mã hóa có thể được đưa vào mô thực vật nhờ vào các vector plasmid . Hai promoter chủ yếu thường được sử dụng cho biến nạp gen ở thực vật là : promoter CaMV 35S (cauliflower mosaic virus ) thích hợp cho sự biểu hiện của DNA ngoại lai ở cây hai lá mầm và promoter ubiquitin của ngô thích hợp cho sự biểu hiện mạnh của DNA ngoại lai ở cây một lá mầm. Các mẫu vậ t (các bộ phận của cây hoặc mô dùng để biến nạp ) thích hợp nhất cho biến nạp gen là những mẫu vật đòi hỏi thời gian nuôi cấy trước và sau khi biến nạp ngắn nhất. Nhiều nghiên cứu cho thấy thời gian kéo dài của mô nuôi cấ y thường tạo ra các đột biến di truyền làm mất khả năng tái sinh của các cây được biến nạp gen. Các mẫu vật được sử dụng trong chuyển gen thường là : protoplast, phôi non hoặc callus có nguồn gốc từ hạt (lúa mì), các mô nuô i cấy phát sinh cụm chồi , và trụ phôi (có nguồn gốc từ các hạt non hoặc hạt già ) dùng để biến nạp trực tiếp DNA ngoại lai vào mô phân sinh ở cây hai lá mầm (legumes, bông...). Trong một số trường hợp , biến nạp thông qua nuôi cấy phát sinh phôi (embryogenic culture ) cũng có thể thực hiện được, chẳng hạn ở các loài tùng bách, các loài cây ăn quả và một số loài khác. Các phương pháp chuyển gen có thể bị hoặc không bị giới hạn bởi các genotype khác nhau của thực vật. Tùy thuộc vào mục đích ứng dụng, có thể thiết kế một phương thức biến nạp thích hợp cho từng genotype khác nhau . Trong những nghiên cứu cơ 123 bản, người ta thường tập trung tìm hiểu về cấu trúc và chức n ăng của các gen biến nạp, khảo sát các promoter và các cơ chế phân tử ở thực vật để có thể chuyển gen thành công vào các loài khác nhau. Một trong những cơ chế có thể chuyển các tế bào từ trạng thái tiềm ẩn sang trạng thái thực sự có khả năng tái sinh là sự xuất hiện thương tổn trên cơ thể. Phản ứng với sự thương tổn có lẽ là cơ sở sinh học cho sự tăng sinh và tái sinh của tế bào soma. Tuy nhiên, phản ứng này khác nhau giữa các loài cây, cũng như giữa các nhóm tế bào trong cùng một cây. Nói chung các cây hòa thảo phản ứng này rất yếu . Ngoài ra, thành tế bào thực vật là một hàng rào ngăn cản hiệu quả đối với sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì thế, gen chỉ có thể được đưa vào trong tế bào thông qua Agrobacterium, virus, bằng phương pháp vi tiêm hay sử dụng súng bắn gen… Việc chuyển gen chỉ thành công khi đưa được gen ngoại lai vào nhóm tế bào có khả năng tái sinh và tiếp nhận gen lạ. Tuy nhiên, khả năng biến nạp không có liên quan chặt chẽ đến khả năng biểu hiện của gen được biến nạp. Công nghệ chuyển gen (biến nạp gen ) thực hiện việc chuyển các gen ngoại lai vào tế bào và mô thực vật . Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp. Phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian thường là vi sinh vật hoặc virus. Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định mà không cần phải nhờ các sinh vật trung gian. 1.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium Một phương pháp hữu hiệu nhất và hiện đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm là biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens. Phương pháp này có nhiều thuận lợi hơn các phương pháp biến nạp trực tiếp: làm giảm số lượng bản sao của gen cần chuyển, do đó sẽ làm giảm tính không ổn định của gen biến nạp (Koncz và cs 1994, Hansen và cs 1997); là hệ thống biến nạp tế bào đơn nên không hình thành thể khảm (Enríquez-Obregón và cs 1997, 1998) 1.1.1. Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là hai loài vi khuẩn gây bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật . Năm 1907, Smith và Townsend đã chứng minh rằng vi khuẩn đất Gram âm Agrobacterium tumerfaciens, thuộc họ Rhizobiaceae, là sinh vật tạo khối u trong cây trồng; sự hình thành những khối u này xuất hiện như là một kết quả sự xâm nhiễm của vi khuẩn tại những vết thương trên cây (hầu hết là cây hai lá mầm). Sau đó, Armin Braun chứng minh rằng sự hình thành khối u có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện của vi khuẩn này. Agrobacterium tumefaciens-loài vi khuẩn đất gây bệnh cho thực vật-ngày nay được sử dụng như một vector tự nhiên để biến nạp gen vào thực vật là phổ biến nhất và ngày càng có nhiều loài cây có giá trị kinh tế được chuyển gen theo phương pháp này như: ngô, đậu tương, bông, khoai tây, 124 cà chua,… A. tumefaciens có chứa một plasmid lớn kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid ) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây . Khi xâm nhiễm tại vết thương của thực vật A. tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti plasmid (T-DNA) xâm nhập vào hệ gen của cây bị bệnh. 1.1.2. Ti-Plasmid Trong thế giới động -thực vật đều tồn tại các thể plasmid , đó là các vòng DNA tự sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào , đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh ... Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập. Các plasmid của Agrobacterium được sử dụng vào công nghệ gen thực vật ở hai dạng vector cis và trans (Hình 8.1). Đây là hai dạng vector rất thuận lợi để tái tổ hợp gen ngoại lai và chuyển vào tế bào thực vật. Dạng cis chỉ sử dụng Ti-plasmid và tế bào vật chủ là Agrobacterium tumefaciens mà không có sự tham gia của plasmid và vi khuẩn khác. Vùng T-DNA của Ti-plasmid được thiết kế lại để gắn những gen ngoại lai mong muốn, các phần còn lại của Ti-plasmid vẫn được giữ nguyên. Agrobacterium tumefaciens được dùng làm tế bào vật chủ để nhân lên nhiều bản sao của Ti-plasmid và chuyển gen. Dạng trans hay binary là dạng sử dụng hai hay nhiều loại plasmid và vi khuẩn cùng lúc, ví dụ: vi khuẩn E. coli và Agrobacterium, plasmid trong trường hợp này thích ứng với cả E. coli và Agrobacterium. Trước tiên, plasmid của E. coli chứa đoạn T-DNA được giới hạn bởi bờ phải (right border-RB) và bờ trái (left border-LB) mang gen ngoại lai (gen đích) được thiết kế và nhân lên trong vi khuẩn E. coli. Tiếp đến plasmid mang gen ngoại lai được chuyển nạp vào vi khuẩn Agrobacterium nhờ một helper plasmid (quá trình triparental matting). Vi khuẩn Agrobacterium đã mang sẵn một loại plasmid khác chứa vùng vir (virulence region) có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen ngoại lai. Sự tồn tại song song hai plasmid này đã tương tác lẫn nhau trong việc chuyển gen vào tế bào thực vật. Như vậy, gen ngoại lai và vùng DNA giúp quá trình chuyển gen (vùng vir) không nằm trên cùng một plasmid nên hệ chuyển gen này được gọi là hệ trans. 125 Hình 8.1. Các dạng của Ti-plasmid A: dạng tự nhiên; B: dạng cis; C: dạng trans Sinh tổng hợp cytokinin Sinh tổng hợp opine Sinh tổng hợp auxin Lề phải Lề trái Chuyển nạp T-DNA VirF Điểm khởi đầu sao chép VirF VirD VirC Vùng Vir VirE Ti plasmid 200kb VirG Dị hóa opine VirB VirA Hình 8.2. Cấu tạo của Ti-plasmid Trong các vùng DNA của Ti -plasmid, ngoài T -DNA, được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trá ch khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt 126 động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1... Các protein này đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến nạp của A. tumefaciens. Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm ), kích thích sản sinh ra các đoạn T -DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn. Vùng vir rộng khoảng 30-40 kb. Vùng này được tạo bởi ít nhất 6 operon cần thiết (virA, virB, virC, virD, virE và virG) và 2 operon không cần thiết (virF và virH). Sự biểu hiện của các gen vir được điều khiển bởi hệ thống hai thành phần là protein virA và protein virG. Protein virA định vị trên màng tế bào, có khả năng tự phosphoryl hóa ở gốc histidin 474 và gốc phosphat này được chuyển tới protein virG. Sau đó protein này hoạt hóa cho sự phiên mã các gen vir khác. Sự biểu hiện của các gen vir được điều khiển bởi hệ thống hai thành phần là protein virA và protein virG. Protein virA định vị trên màng tế bào, có khả năng tự phosphoryl hóa ở gốc histidin 474 và gốc phosphat này được chuyển tới protein virG. Sau đó protein này hoạt hóa cho sự phiên mã các gen vir khác 1.1.3. T-DNA T-DNA được nghiên cứu rất kỹ . Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u (oncogenes). Trong Ti -plasmid, vị trí của T -DNA được giới hạn bằng RB và LB. Ngoài T -DNA, trên Ti-plasmid còn có các vùng DNA mã hóa cho việc tái sinh plasmid (replication), cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine (opine catabolism) (Hình 8.2). Khi cây nhiễm A. tumefaciens, do T-DNA nạp vào trong hệ gen của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin , cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u . Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” . Nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti -plasmid. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizogenes đối với cây hai lá mầ m cũng tương tự , nhưng trong vùng T DNA của A. rhizogenes chỉ có gen sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tơ (hairy roots) khi bị nhiễm bệnh. Trên thực tế bệnh cây , Agrobacterium chỉ gây hại ở cây hai lá mầm , vì vậy người ta cho rằng chúng chỉ có thể đưa T -DNA vào hệ gen các cây hai lá mầm . Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn , các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác khả năng biến nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm. 127 Hình 8.3. Cơ chế xâm nhiễm tự nhiễm tự nhiên của Agrobacterium tumefaciens 1.1.4. Chuyển DNA ngoại lai vào tế bà o và mô thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào , chúng gắn đoạn T -DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật , dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng n ội sinh , tạo ra khối u (trường hợp A. tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A. rhizogenes). Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn. Quá trình chuyển nạp đoạn T-DNA từ Agrobacterium vào tế bào thực vật bao gồm các giai đoạn: hướng hóa của Agrobacterium tới tế bào thực vật bị thương; gắn với tế bào thực vật; cảm ứng các gen vir để tạo ra T-DNA; tạo phức hợp T; vận chuyển phức hợp T vào tế bào thực vật và gắn T-DNA vào genome thực vật Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hoá một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA. Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia 128 di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào genome của cây chủ. Hình 8.4. Quy trình chuyển gen bằng Agrobacterium tumerfaciens Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào genome tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên TDNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hoá nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thương. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE. Trước đó, khi gen virD được hoạt hoá, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm xuất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Sự hình thành phức hợp vận chuyển T-DNA bao gồm các quá trình sau: sản phẩm virD2 của operon D là một endonuclease, nhận biết trình tự đầu tiên bên phải tại base thứ 3 hoặc thứ 4 tính từ trái sang và tách T-DNA thành 2 mạch đơn. 129 Một mạch đơn sẽ được chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5' đi trước. Đoạn mạch đơn còn lại trên Ti plasmid sẽ làm khuôn để tổng hợp nên mạch DNA bổ trợ mới, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA. Trong quá trình di chuyển sợi đơn DNA phải chui qua rất nhiều màng trước khi vào nhân tế bào thực vật. Để tránh đứt gãy, T- DNA sợi đơn gắn với protein virE2. Sản phẩm gen virD2 liên kết cộng hóa trị với đầu 5' của sợi T-DNA đơn và liên kết không cộng hóa trị với virE2 trên T-DNA, tạo ra phức hợp T. Ngay sau đó, sợi T-DNA trong phức hợp T được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng xâm nhập vào genome tế bào thực vật (integration) được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác. Tính hướng nhân của phức hợ p T và gắn T-DNA vào genome thực vật là một quá trình cho thấy T-DNA được vận chuyển tới nhân tế bào thực vật và gắn hóa trị vào genome thực vật. Việc định hướng tới nhân của T-DNA cũng như gắn nó với genome thực vật xảy ra dễ dàng là nhờ có "đoạn định vị nhân" của các sản phẩm virD2 và virE2 trong phức hợp T. Sau khi gắn vào genome thực vật T-DNA được phiên mã nhờ RNA polymerase II 1.1.5. Các gen chỉ thị chọn lọc và gen chỉ thị sàng lọc Các gen chỉ thị chọn lọc chung nhất mã hóa các protein khử độ c các nhân tố ức chế trao đổi chất như các kháng sinh hoặc chất diệt cỏ (herbicide). Các gen chỉ thị sàng lọc thường được sử dụng là các gen β-glucuronidase (gusA), luciferase và gần đây hơn là gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lục (green fluorescent) của sứa. Bằng các phương pháp sinh học phân tử có thể tạo ra các cấu trúc DNA plasmid, trong đó ngoài các gen khởi động (promoter gene ), các gen của vi khuẩn Agrobacterium giúp cho DNA plasmid gắn đư ợc vào bộ gen thực vật , gen ngoại lai cần chuyển vào... còn có các gen giúp phân lập ra tế bào hoặc mô thí nghiệm . Các gen được lắp ghép vào DNA plasmid với mục đích này được gọi là gen chỉ thị chọn lọc hay gen chỉ thị sàng lọc. Gen chỉ thị chọn lọc thường dùng nhất là các gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới thực vật . Sau khi chuyển gen , nếu thấy enzyme vi khuẩn hoạt động thì có thể suy ra là toàn bộ DNA plasmid đã được gắn vào bộ gen của thực vật và gen ngoại lai mà ta cần chuyển đã trở thành một bộ phận của bộ máy di truyền thực vật. Các gen chỉ thị thường dùng nhất là các gen gus A (β-glucuronidase), gen npt II (neomycin phosphotransferase), gen lux (luciferase), gen cat (chloramphenicol acetyltransferase), gen nos (nopaline synthase) (Bảng 8.1). Gen npt II. Enzyme neomycin phosphotransferase (npt II) là một enzyme vi sinh vật có trọng l ượng phân tử khoả ng 25 kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc aminoglycoside như neomycin , kanamycin và G 148. Trong phản ứng này, nhóm γ phosphate của ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome. Gen bar. Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT), là hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta . Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp . Mô, tế bào hoặc cây chuyển 130 gen đượ c đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinothricin khác nhau (hoặc các thuốc trừ cỏ tương ứng ) và so sánh sinh trưởng của mô , tế bào hoặc cây đối chứng đặt trên cùng môi trường. Gen gus A. là gen mã hóa cho sinh tổng hợp en zyme β-glucuronidase. βglucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có màu xanh chàm đặc trưng , dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme βglucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm rất đặc trưng. Gen lacZ. Enzyme β-galactosidase (lacZ) trọng lượng phân tử 116 kD, pH tối thích 7-7,5 được mã hóa do gen lacZ. Gen lacZ ở E. coli được dùng rất phổ biến trong công nghệ gen vi sinh và đã có sẵn các hệ thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với thuốc thử X -Gal. Sự tồn tại hoạt động c ủa lacZ trong tế bào thực vật đã được khẳng định. Vì vậy trước khi kiểm tra sự có mặt của gen lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt gen lacZ nội sinh bằng glutaraldehyde. Gen cat. Được phân lập và tạo dòng từ dòng vi khuẩn Tn9, là gen gây khả năng kháng chloramphenicol ở vi khuẩn nói chung. Gen cat đã được dùng rộng rãi trong công nghệ gen động vật và thực vật vì gen cat mã hóa cho enzyme chloramphenicol acetyltransferase (CAT). Enzyme này xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí trên phân tử chloramphenicol và làm nó bất hoạt. Bảng 8.1. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) A. Một số gen chỉ thị chọn lọc Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng để chọn lọc npt II Neomycin phosphotransferase Kanamycin Hyg Hygromycin phosphotransferase Hygromycin Gent Gentamycin transferase Aat Streptomycin phosphotransferase Bleo Bar Bxn acetyl Gentamycin Streptomycin Enzyme kháng bleomycin Phosphinothricin acetyltransferase Bromoxynil nitrilase Bleomycin Phosphinothricin Bromoxynil B. Một số gen chỉ thị sàng lọc Kí hiệu gen gus A Enzyme tương ứng β-glucuronidase Chất dùng để phát hiện X-Gluc 131 A. Một số gen chỉ thị chọn lọc Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng để chọn lọc lacZ β-galactosidase X-Gal Luc Luciferase đom đóm Lumis Phos Lux Luciferase vi khuẩn Lumi Phos Cat Nos Chloramphenicol acetyltransferase Nopaline synthase Chloramphenicol đánh dấu Nopaline 1.1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất biến nạp gián tiếp thông qua A. tumerfaciens Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ thuộc vào một số yếu tố như kiểu mô nuôi nhiễm, nồng độ vi khuẩn và thời gian nuôi nhiễm, tiền xử lý mô nuôi nhiễm. Khi phân tích sự biểu hiện của gen gus ở mô lúa, Hiei và cs (1994) đã phát hiện mô sẹo từ vòi phôi (scutellum) là vật liệu phù hợp nhất để chuyển gen thông qua Agrobacterium so với các loại mô khác (mô lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ...). Thời gian nuôi nhiễm cũng ảnh hưởng tới tần suất biến nạp. Ở lúa, khoảng thời gian nuôi nhiễm từ 2-3 ngày là lý tưởng nhất. Trong khi đó thời gian nuôi nhiễm 5-7 ngày đã làm tăng hiệu quả biến nạp ở Lilium usitatissimum và Agapanthus praecox ssp. Orientalis (Dong và McHughen 1991, Suzuki và cs 2001). Theo Cardoza và cs (2003), trụ dưới lá mầm của cây Brassica napus đồng nu ôi cấy với Agrobacterium tumefaciens GV3850 mang gen eGFP và mGFP 5-ER trong thời gian 2 ngày đã cho hiệu quả biến nạp tối ưu hơn 1 ngày và 3 ngày. Gần đây, kết quả nghiên cứu của Jin và cs (2005) cho biết, thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày là tối ưu để làm tăng hiệu quả biến nạp của phôi callus Gossypium hirsutumỞ thuốc lá và Arabidopsis, An và cs thấy rằng nồng độ vi khuẩn cao (1010/mL) có hiệu quả biến nạp gen cao hơn nồng độ thấp (106/mL). Tuy nhiên, nồng độ vi khuẩn không ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen ở Petunia. Các nghiên cứu cho thấy rằng nếu tăng mức độ biểu hiện của các gen vir sẽ cải thiện hiệu quả biến nạp gen của Agrobacterium. Tăng khả năng biểu hiện của gen vir đạt được bằng cách gây tiền cảm ứng vi khuẩn với các chất acetosyringone (AS) hoặc AS + opine. Tiền xử lý mô lá trên môi trường chứa AS đã làm tăng tần suất biến nạp gen ở cây thuốc lá, bông vải, Phaseolus acutifolius. Bổ sung AS vào môi trường nuôi nhiễm và môi trường nuôi cộng sinh cũng làm tăng hiệu quả chuyển gen bằng Agrobacterium ở cây một lá mầm như lúa japonica, indica (Hiei và cs 1994, Rashid và cs 1996, Seo và cs 2002, Al-Forkan và cs 2004) và lúa mì (Wu và cs 2003). Theo Vernade và cs (1998), betain cũng làm tăng sự cảm ứng của các gen vir đối với AS ở pH thấp. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Seo và cs (2002), khi thêm 120mg/L betain vào môi trường đồng nuôi cấy, sự biểu hiện của gen gus trong callus lúa cao hơn khi không bổ sung betain. Ở thuốc lá, Palmgren và cs (1993) cho biết 5-azacytidine đã cải thiện sự biến nạp và biểu hiện của gen ngoại lai. Tuy nhiên 5-azacytidine không cải thiện hiệu suất biến nạp gen ở cây bông cải (cauliflower). 132 Ngoài ra, các nhân tố pH, nồng độ phosphat trong môi trường và nhiệt độ nuôi cấy cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự chuyển nạp T-DNA vào tế bào thực vật thông qua sự cảm ứng gen phụ thuộc vào chủng Agrobacterium. Khả năng cảm ứng gen vir tăng khi nồng độ phosphat trong môi trường thấp. Nhiệt độ thích hợp cho sự cảm ứng gen vir là từ 25-280C. Theo Stachel và cs (1986), pH < 7 của môi trường là cần thiết để tối ưu hóa sự biểu hiện của các gen vir. Wu và cs (2006) đã thiết lập một hệ thống các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình biến nạp gen CMV-RNA2 gián tiếp vào cây cà chua thông qua A. tumerfaciens. Tám yếu tố bao gồm: dạng mẫu, nguồn gốc và kích thước mẫu, nồng độ cytokinin, nồng độ acetosyringone, pH của môi trường ủ và môi trường đồng nuôi cấy, nồng độ khuẩn, thời gian ủ đã được nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình biến nạp. 1.2.Chuyển gen bằng phương pháp bắn gen 1.2.1. Chuyển gen bằng súng Chuyển gen bằng súng là một phương pháp thường dùng để đưa gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn và nấm. Hàng triệu hạt vi đạn kim loại được bọc DNA được bắn trực tiếp vào tế bào đích hay mô đích bởi súng bắn gen. DNA sẽ tách khỏi vi đạn khi chúng ở bên trong tế bào, một phần DNA sẽ hợp nhất một cách ổn định với vật chất di truyền của tế bào vật chủ khi vi đạn ở trong nhân tế bào. Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới . Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các viên đạn c ó kích thước hiển vi, có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào , đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. Hạt tungsten hoặc vàng có đường kính 1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile). Ưu điểm của đạn tungsten là không quá đắt, có nhiều loại với kích thước khác nhau để lựa chọn. Khả năng dính bám DNA trên bề mặt khá tốt. Nhược điểm của loại đạn này là có khả năng gây độc cho một số loại tế bào. Đạn bằng vàng có khá ít kích cỡ, hình dạng nhẵn, đồng đều hơn so với đạn tungsten. Ưu điểm nổi bật của loại đạn này là tính đồng nhất của chúng, cho phép chúng ta có thể tối ưu kích thước đạn để phù hợp với dạng tế bào cần chuyển. Vàng không độc cho tế bào và đã được chứng nhận bởi FDA về tính an toàn khi sử dụng trong quá trình chuyển gen. Tuy nhiên, nhược điểm của đạn vàng là rất đắt, đồng thời nó không ổn định trong hỗn hợp chất lỏng. Các công bố về chuyển gen bằng kỹ thuật vi đạn hiện nay chủ yếu sử dụng hai loại đạn này. Ngoài ra, một số kim loại khác cũng đã được sử dụng làm đạn cho quá trình chuyển gen như iridium hay platinium, tuy nhiên hiệu suất biến nạp khá thấp. Mật độ 133 đạn sử dụng trong quá trình chuyển gen cũng ảnh hưởng đến quá trình biến nạp. Mật độ cao sẽ có hiệu quả tăng khả năng xuyên phá thành, màng tế bào. Kích thước đạn cũng ảnh hưởng đến hiệu suất biến nạp, và nó phụ thuộc vào loại tế bào mà chúng ta sử dụng. Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quanh vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao . Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại , nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào . Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gen (Hình 8.5). Hình 8.5. Sơ đồ súng bắn gen Cũng giống như các phương pháp chuyển gen khác, phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen cũng có một số khó khăn gặp phải là việc chọn lựa loại mô để chuyển gen phải có khả năng tái sinh cao. Thứ hai là không kiểm soát được lượng bản sao của gen vào tế bào cũng như khả năng hợp nhất của nó vào vùng hoạt động của genome vật chủ. Thứ ba là thiết bị khá đắt tiền và chi phí tốn kém cho mỗi thí nghiệm. Tuy vậy, phương pháp này còn được sử dụng biến nạp hiệu quả không chỉ với thực vật mà còn đối với các loài vi sinh vật và cả tế bào động vật. Nó có khả năng chuyển gen vào các cơ quan tử trong tế bào. 134 Hình 8.6. Súng bắn gen 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen - Mức độ chân không trong buồng bắn: Môi trường chân không trong buồng bắn làm giảm lực ma sát trượt khi các vi đạn bay về phía tế bào đích. Điều này giúp cho đường đi của đạn luôn giữ chính xác hướng di chuyển và làm cho vận tốc của đạn không bị giảm. Mức độ chân không trong buồng bắn tối ưu từ 28-29 inHg và ứng dụng tốt cho hầu hết mô, tế bào thực vật và vi sinh vật. Đối với mô, tế bào động vật thì sử dụng mức chân không thấp hơn, khoảng 15 inHg là phù hợp nhất. Khí hellium sẽ đi vào buồng bắn khi đĩa chắn khí (rupture disk) bị phá vỡ. Việc sử dụng khí hellium, loại khí nhẹ nhất nhằm giảm tối thiểu sự giảm tốc của các vi đạn khi chúng di chuyển trong dòng khí và giúp giảm lực tác động khi dòng khí va chạm lên tế bào đích. Điều này cho phép giảm tối thiểu sự tổn thương của mô, tế bào đích. - Lựa chọn loại đĩa chắn khí: Các đĩa chắn khí chặn ống gia tốc khí và chỉ bị phá vỡ khi áp suất dòng khí đạt được giá trị chịu đựng của nó. Có nhiều loại đĩa chắn khí, giới hạn áp suất từ 450-2200 psi. Áp suất phá vỡ đĩa này xác định là áp suất đi vào buồng bắn tác động vào viên đạn lớn. Tăng áp suất khi hellium sẽ tăng sự gia tốc của vi đạn dẫn đến tăng sự thâm nhập của vi đạn bọc DNA đi sâu vào trong mô, tế bào đích. Tuy nhiên, điều đó cũng gây tổn thương đến mô, tế bào. Sử dụng mức áp suất thấp nhất có thể sẽ cho hiểu suất biến nạp cao. Các tế bào vi khuẩn, động vật và thực vật thường sử dụng áp suất 1100 psi. Tế bào nấm và nấm men thường sử dụng áp suất 1300 psi là thích hợp nhất. - Khoảng cách giữa đĩa chắn khí và viên đạn lớn: Ảnh hưởng đến vận tốc di chuyển của các vi đạn một phần được xác định là do khoảng cách giữa đĩa chắn khí và viên đạn lớn. Khoảng cách này càng nhỏ thì vi đạn càng có gia tốc lớn và ngược lại. Khoảng cách này thay đổi trong phạm vi 1/8 inch, 1/4 inch và 3/8 inch. Để thăm dò điều kiện tối ưu của thông số này trong thí nghiệm chuyển gen thông thường bắt đầu với khoảng cách 1/4 inch. - Khoảng cách di chuyển của vi đạn: Một trong những thông số ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả biến nạp là khoảng cách di chuyển của vi đạn tính từ màng chắn đến vị trí đặt mô đích. Việc thay đổi các vị trí đặt mô đích sẽ làm thay đổi khoảng cách 135 này. Có 4 mức và có thể thay đổi trong buồng bắn: 3 ,6 ,9 và 12 cm. Việc lựa chọn mức nào phụ thuộc nhiều vào loại mô, tế bào đích. - Các thông số vật lý của vi đạn ảnh hưởng lớn đến hiệu quả chuyển gen. Kim loại làm vi đạn phải có khối lượng riêng đủ lớn để có đủ động lượng xuyên qua mô, thành tế bào đích. Các kim loại thường được sử dụng là vàng, tungsten, palladium, rhodium, platinium và iridium. Chúng phải được làm trơ về mặt hóa học để tránh những phản ứng với DNA hay các thành phần trong tế bào. Đồng thời hình dạng, bề mặt của vi đạn phải đầy đủ các tính chất để đảm bảo chúng có thể ngưng tụ DNA hay ly giải DNA một cách dễ dàng. - Bọc DNA lên bề mặt đạn là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình biến nạp bằng vi đạn. Sự kết lắng DNA trên bề mặt đạn diễn ra rất nhanh và rất khó để thu được một dạng hỗn hợp đồng nhất, đặc biệt do vi đạn bằng vàng hay tungsten rất khó ở dạng huyền phù 1.3. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng xung điện Xung điện được tạo ra khi giải phóng dòng điện chứa trong một điện dung (capacitor) từ điện cực này qua điện cực khác . Các vật nằm trong không gian giữa hai điện cực chịu tác động tắt dần của xung điện . Xung điện được xác định bởi hai giá trị là sự chênh lệch điện thế và thời gian tắt dần . Ở các thiết bị điện xung hiện đại , thời gian tắt dần được thu lại rất ngắn và trên biểu đồ xung điện được biểu diễn gầ n như một cột vuông (Hình 8.7). Nói chung, các thiết bị điện xung hoàn chỉnh được nhiều hãng cung cấp để thực hiện chuyển gen vào vi sinh vật , protoplast thực vật hoặc tế bào động vật. Thiết bị điện xung (electroporator) là thiết bị có khả năng tạo ra các xung điện trong thời gian rất ngắn (5-6 phần nghìn giây) và ở điện thế (pulse strenght) chính xác (500 V/cm) với thời gian tắt dần (decay time) 20 ms. Protoplast được đặt giữa hai tấm kim loại cách nhau từ 1-4 mm trong một cuvette bằng nhựa. Ở điện thế cao, xung điện tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) trên màng protoplast và DNA bên ngoài có thể xâm nhập vào chất nguyên sinh. Hình 8.7. Thời gian tắt dần của xung điện trên các thiết bị chuẩn (----) và thiết bị đơn giản (―) 1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng kỹ thuật vi tiêm Vi tiêm (microinjection) là kỹ thuật sử dụng phổ biến trong công nghệ tế bào động vật (animal cell biotechnology ). Trên hiển v i trường, DNA plasmid có thể được tiêm vào protoplast và thực hiện biến nạp gen thành công ở khá nhiều đ ối tượng thực vật (Hình 6.8 và hình 6.9). 136 Tuy nhiên, Kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm ừ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền. Ngoài ra, nó còn dòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên. Hình 8.8. Vi tiêm DNA vào protoplast 2. SỰ HỢP NHẤT VÀ BIỂU HIỆN CỦA DNA NGOẠI LAI TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT Sau khi chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực vật có hai hướng sau đó phải khảo cứu tiếp: (a) đoạn DNA ngoại lai xen vào T -DNA có cùng đ ược chuyển nạp hay không, và (b) biểu hiện chức năng của DNA ngoại lai trong tế bào thực vật. Những nghiên cứu đầu tiên về biểu hiện của đoạn DNA ngoại lai chuyển vào trong tế bào thực vật đã không có kết quả lắm . Những nghiên cứu sau đó về sự biểu hiện của các gen kháng sinh được mã hóa nhờ các gen nhảy (transposons) ở prokaryote, gen dehydrogenase ở nấm men lên men rượu , gen β-globin ở động vật có vú và các gen interferon ở tế bào thực vật e ukaryote cũng không thànhh công (Barton và cs 1983, Shaw và cs 1983). Sự không biểu hiện của gen (đối với cấu trúc vector plasmid có mang các đoạn mở đầu và kết thúc sao mã ) được biết là thuộc về chức năng ở tế bào thực vật . Giữa hai đoạn này phải có vị trí tạo dòng để nạp đoạn mã hóa của DNA ngoại lai mong muốn. Sự biểu hiện được thông báo lần đầu tiên của gen chuyển nạp ở tế bào thực vật dựa trên nguyên tắc này bao gồm promoter và đoạn 5’ nằm bên cạnh của gen tổng hợp nopaline đã tái tổ hợp với đoạn mã hóa và đầu 3’ của gen tổng hợp octopine . Sự hiện diện của octopine trong các mô thực vật được chuyển nạp bằng cách dùng cấu trúc này đã xác định rằng gen kh ảm non-ocs đã được biểu hiện. Tương tự, cấu trúc bao gồm sự dung hợp của đoạn mã hóa của gen CAT từ vi khuẩn plasmid pBR 325 đối với các đoạn 3’ promoter tổng hợp nopaline cũng đã biểu hiện hoạt tính enzyme CAT ở các tế bào thực vật. 137 Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc loại bỏ vùng lặp lại bên phải (25 bp) của T-DNA đào thải khả năng Ti plasmid chuyển DNA vào tế bào thực vật , trong khi sự khuyết đoạn của vùng lặp lại bên trái (25 bp) có ảnh hưởng ít hoặc không ảnh hưởng. Vì thế, vùng lặp lại bên phải 25 bp (nhân tố hoạt động cis) thể hiện một vai trò quan trọng trong cơ chế định hướng của việc chuyển T -DNA. Thông tin di truyền mới được biến nạp vào thực vật eukaryotic biểu hiện không chỉ ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền lại cho các thế hệ sau của chúng. Hình 8.9. Sơ đồ vi tiêm theo phương pháp pipette và sau đó nuôi cấy giọt treo 3. MỘT SỐ KẾT QUẢ BIẾN NẠP Ở THỰC VẬT 3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gen thành công Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gen . Các loài cây trồng chính đã được biến nạp gen thành công (Bảng 6.2). Thông thường, hiệu quả biến nạp gen khác nhau tùy thuộc vào từng loại cây trồng , và dĩ nhiên quá trình biến nạp gen vẫn còn bị hạn chế ở nhiều loài 3.1.1. Cây ngô 138 Cây ngô biến nạp gen đầu tiên tái sinh từ protoplast được biến nạp bằng xung điện đã bất thụ (Rhodes và cs 1988). Tuy nhiên, có thể dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gen biến nạp , sử dụng phương pháp bắn gen và chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gen. Bảng 8.2. Các cây trồng chính đã được biến nạp gen Stt Loài Phương pháp biến nạp gen Thử nghiệm trên đồng ruộng - 1 Chuối Bắn gen/Agrobacterium 2 Luá mạch Bắn gen 3 Đậu tây Bắn gen 4 Canola Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ, điều khiển sự thụ phấn 5 Sắn Bắn gen/Agrobacterium - 6 Ngô Bắn gen/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ 7 Bông Bắn gen/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống chịu chất diệt cỏ 8 Đu đủ Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus 9 Đậu phụng Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus 10 Bạch dương Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 11 Khoai tây Agrobacterium Kháng côn trùng, kháng virus, chống chịu chất diệt cỏ 12 Lúa Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 13 Đậu tương Bắn gen/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ 14 Bí Bắn gen/Agrobacterium Kháng virus 15 Củ đường 16 Mía Bắn gen - 17 Hướng Bắn gen - Kháng vi rus - cải Agrobacterium 139 Chống chịu chất diệt cỏ Stt Loài Phương pháp biến nạp gen Thử nghiệm trên đồng ruộng dương 18 Cà chua Agrobacterium 19 Lúa mì Bắn gen Quả chín muộn, kháng virus - Các cây biến nạp gen hữu thụ đã được tái sinh , ổn định di truyền và biểu hiện gen bar (kháng chất diệt cỏ glufosinate kh ông chọn lọc ) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau . Hiện nay, biến nạp gen ở ngô bằng phương pháp bắn gen được sử dụng rộng rãi . Gần đây, các kết quả biến nạp gen gián tiếp ở ngô nhờ Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gen của dòng ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung (cocultivation) giữa vector “super -binary” với phôi non . Tần số được thông báo ở dòng A 188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số cây biến nạp gen độc lập/phôi). 3.1.2. Cây lúa Kết quả tái sinh của cây lúa biến nạp gen bằng xung điện hoặc PEG thông qua nuôi cấy protoplast được thông báo lần đầu tiên cách đây chưa hơn 10 năm. Các nghiên cứu sau đó cũng đã sử dụng hai kỹ thuật này để biến nạp gen vào protoplast và phục hồi các cây biến nạp gen hữu thụ. Tuy nhiên, hạn chế của hai phương pháp này là phải xây dựng phương thức tái sinh cây từ tế bào đơn . Mặc dù các phương thức này đang dùng cho một số giống lúa thuộc loài phụ japonic a (chẳng hạn: Taipei 309) nhưng hầu hết các giống japonica ưu tú cũng như phần lớn các giống indica là khó tái sinh cây từ protoplast. Phương pháp bắn gen cho phép thực hiện biến nạp gen hiệu quả ở lúa trong các kiểu gen độc lập, và hiện nay hơn 40 giống đã được biến nạp gen thành công . Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành . Hygromycin B là marker chọn lọc thường được dùng cho lúa . Tần số biến nạp có thể cao tới 50% (tính theo số cây biến nạp gen có nguồn gốc độc lập/số mẫu được bắn gen). Gần đây , kỹ thuật biến nạp gen ở lúa thông qua Agrobacterium cũng đã có những cải tiến quan trọng có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gen. 3.1.3. Cây lúa mì Phương pháp bắn gen cũng được sử dụng để biến nạp gen ở lúa mì . DNA ngoại lai được bắn vào trong các vảy nhỏ (scutellum) của phôi non của hai giống mùa xuân và một giống mùa đông. Các callus chốn g chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố ức chế trao đổi chất tương tự như basta , bialaphos hoặc glufosinate ammonium . Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác nhận sự hợp nhất ổn định của các gen biến nạp. Nói chung, công nghệ di truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gen. 140 3.1.4. Cây lúa mạch Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn các cây lúa mạch biến nạp gen độc lập , tự thụ phấn . Các phôi hợp tử non , các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc t ừ tiểu bào tử hạt phấn đã được dùng để bắn gen với plasmid mang gen bar và gusA đơn độc hoặc phối hợp với plasmid khác mang gen protein vỏ của virus gây bệnh lùn vàng ở lúa mạch . Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để ph ân lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của gen. 3.1.5. Cây đậu tương Những cố gắng đầu tiên ở cây đậu tương biến nạp tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi . Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gen vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn. Công nghệ biến nạp gen ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hóa của kỹ thuật bắn gen . Thực tế, đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền. Kết quả đầu tiên ở đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gen nhờ Agrobacterium. Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm vớ i Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate . Có thể biến nạp gen hiệu quả vào protoplast đậu tương bằng các phư ơng thức thông dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gen vào các giống đậu tương khác nhau người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản - phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh của cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh của trụ phôi ) với sự tăng gia tốc của vi đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai. Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều phenotype khác nhau . Nói chung, ở các dòng đậu tương biến nạp gen có nhiều bản sao của các gen biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50 nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ sau của các bản sao ge n phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời , như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên. 3.1.6. Cây đậu tây Cho đến nay, việc nghiên cứu biến nạp gen ở Phaseolus thành công rất ít . Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gen . Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả nă ng phục hồi các cây biến nạp. Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gen gusA, bar và protein vỏ của virus khảm màu vàng đã được phục hồi . Các cây biến nạp gen qua năm thế hệ tự thụ phấn vẫn không mất các gen biến nạp hoặc k hả năng biểu hiện . Kỹ thuật bắn gen cũng được sử dụng để biến nạp gen gusA được điều khiển bằng promoter concanavalin A , hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và vỏ hạt của các cây biến nạp. 3.1.7. Cây bông 141 Phương thức biế n nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gen vào cây bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gen cũng của giống trên đã được phục hồi sau khi bắn gen vào dịch huyền phù nuôi cấy phát sinh phôi (Finer và McMullen 1990). Hầu hết các giống bông có giá trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus . Một số ít các giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô tính (somaclonal variation). Phương thức phân phối gen ngoại lai trực tiếp vào trong mô phân sinh của trụ phôi dựa trên công nghệ ACCELL cũng được phát triển và đã phục hồi cây biến nạp gen. Hình 8.10. Sự tái sinh của lá mầm cà chua chuyển gen ctb A B Hình 8.11. Tái sinh cây từ callus mía A: Callus được biến nạp gen ctb chọn lọc có kháng sinh B: callus đối chứng tái sinh trên môi trường bình thường A 142 B C D Hình 8.12. Tái sinh chồi từ cuống lá rau má chuyển gen ltb. A: Chồi tái sinh cây từ cuống lá không chuyển gen trên môi trường bình thường; B: Chồi tái sinh cây từ cuống lá không chuyển gen trên môi trường chọn lọc; C: Chồi tái sinh cây từ cuống lá chuyển gen ltb trên môi trường chọn lọc; D: Chồi rau má chuyển gen ltb . A B Hình 8.13. Tái sinh chồi từ cuống lá cây càng cua A: chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen LTB trên môi trường chọn lọc; B:cây chuyển gen LTB 143 3.2. Biến nạp gen nif Ở một số loài vi khuẩn và tảo lam sống tự do hoặc cộng sinh tồn tại phương thức biến đổi nitơ phân tử của khí trời thành dạng NH3. Nitrogenase N2 ... NH3 Quá trình cố định nitơ tự do của khí trời xảy ra n hờ một loại enzyme là nitrogenase (nitrogen fixation gene -gọi tắt là gen nif) chỉ tồn tại ở một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu (Fabaceae). Dùng kỹ thuật gen tách gen nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển sang các cây trồng quan trọng như lúa , ngô là một mô hình lý tưởng của các nhà tạo giống. Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenase phải xảy ra trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O 2 ở vùng phản ứng . Điều kiện này được thực hiện ở các nốt sần cây họ đậu như một loại protein là leghemoglobin hoặc legoglobin (gắn O2 như hemoglobin của máu). Muốn cho nitrogenase hoạt động trong tế bào thực vật bậc cao phải t ạo ra được vùng phản ứng sạch O 2 hoặc đưa vào tế bào một cơ chế bảo vệ như legoglobin . Đó là một vấn đề lớn mà kỹ thuật contransformation (chuyển nạp liên hợp gen ) đang tìm cách giải quyết. Hình 8.14. Mô hình biến nạp gen nif 144 4. TRIỂN VỌNG VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN Trong những năm qua , các phương pháp biến nạp gen ở thực vật bậc cao đã có rất nhiều tiến bộ. Hiện nay, các phòng thí nghiệm công nghệ gen đang bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho một số loài cây trồng nhờ các công cụ của sinh học tế bào và sinh học phân tử. Trong một vài trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô và bông) các phương pháp biến nạp gen bị giới hạn bởi genotype . Một số các cây trồng quan trọng cần thiết cho nhu cầu sử dụng của người dân ở các nước đang phát triển hiện ít được chú ý. Công nghệ di truyền thực vật là một bước ngoặt quyết định . Một số cây trồng quan trọng đã được biến nạp g en; một vài vấn đề kỹ thuật vẫn đang còn tồn tại , nhưng chúng đang dần dần được giải quyết . Để có kết quả cần phải thay đổi dần dần sang một phạm vi khác , như là phát hiện và tạo dòng các gen mang các tính trạng đa gen (multigenic traits). Một điều không thể quên là vấn đề nhận thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác động xấu đến môi trường do các sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái tổ hợp DNA mang lại. Hiện nay, công nghệ biến nạp g en đang được quan tâm hơn thông qua các quỹ tài trợ của các cơ quan quốc tế như là chương trình Rockefeller Foundation (Mỹ), và vấn đề đang được thảo luận nhiều là cần thiết xác định phương thức tốt nhất để chuyển các lợi ích do công nghệ biến nạp gen mang lại đến các nước đang phát triển. Cây biến nạp gen đầu tiên thu được vào năm 1983. Điều này cho phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ của công nghệ DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào đã giúp ích rất nhiều cho c nác nhà tạo giống thực vật . Việc lựa chọn phương thức sử dụng các cây trồng thu được từ công nghệ DNA tái tổ hợp có thể cung cấp thêm nguồn tài nguyên mới cho công nghiệp và người t iêu dùng, như vậy có thể mở rộng cơ sở kinh tế ở cả các nước công nghiệp lẫn các nước đang phát triển. Các hướng chính trong chọn tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen: 4.1. Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Cỏ dại là loại thực vật mọc không theo mục đích của con người, chúng gây ra ảnh hưởng xấu đến cây trồng. Vì vậy, nền nông nghiệp gắn liền với việc sử dụng thuốc trừ cỏ. Vấn đề đặt ra là khi dùng thuốc trừ cỏ chỉ diệt cỏ mà không ảnh hưởng xấu hay diệt cây trồng. Muốn vậy, người ta phải tạo ra các giống có đặc tính kháng thuốc trừ cỏ. Phương pháp chuyển gen sẽ giải quyết tốt vấn đề này. Người ta sẽ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào cây trồng. Những cây trồng này sẽ không bị ảnh hưởng bởi thuốc trừ cỏ. Nguyên tắc chung là phải tìm được gen kháng lại cơ chế gây hại của thuốc trừ cỏ như: nâng cao hoạt tính của các enzyme bị hại do thuốc trừ cỏ, tạo ra các enzyme đột biến không bị ảnh hưởng bởi thuốc trừ cỏ, tạo các enzyme làm mất tính độc của thuốc trừ cỏ,… Ví dụ: Thuốc glyphosat là một loại thuốc trừ cỏ được dùng phổ biến vì chúng có tác dụng diệt cỏ cao, dễ phân giải và ít gây ô nhiễm môi trường. Cơ chế hại của thuốc là kìm hãm hoạt động của enzyme enol pyruvat sikimat phosthat synthetase (EPSPS). Enzyme này biến đổi sản phẩm quang hợp thành acid mang mạch vòng. Cơ thể thực vật nếu thiếu acid này sẽ bị rối lo toàn bộ quá trình trao đổi chất và chết. Người ta đã tìm được các gen mã hóa EPSPS có hoạt tính rất cao, cải biến chúng và chuyển vào cây trồng. 145 Kết quả tạo ra cây có hàm lượng hoạt tính của enzyme EPSPS cao hơn gấp 4 lần so với cây bình thường và hoàn toàn chống chịu với thuốc trừ cỏ glyphosphat. Bằng cách này người ta đã tạo hàng loạt các cây trồng kháng thuốc trừ cỏ như cây đậu tương, ngô, cây bông,… 4.2.Chuyển gen kháng sâu Hơn 30 năm nay, trong sản xuất người ta đã sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt do vi khuẩn Bacillus thuringiensis tạo ra. Vi khuẩn này mang các gen sản sinh ra các ptotein kết tinh rất độc đối với ấu trùng của nhiều loại côn trùng nhưng không độc đối với động vật có xương sống. Người ta đã tách chiết, xác định trình tự tổng hợp thiết kế vào vector và chuyển các gen này vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: bông, lúa, đậu,.. Kết quả tạo ra nhiều giống cây trồng kháng sâu có ý nghĩa. Các nhà khoa học còn tiếp tục cải tiến các gen này để nâng cao hoạt tính độc của chúng. Ngoài ra, vi khuẩn Bacillus cereus có mang các gen mã hóa cho các protein ức chế hoạt động của enzyme protease làm hỏng quá trình tiêu hóa của côn trùng. Các nhà nghiên cứu đã tách chiết, xác định trình tự tổng hợp thiết kế vào vector và chuyển các gen này vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: ngô, đậu,.. Việc phối hợp chuyển đồng thời gen mã hóa sản phẩm protein gây độc đối với sâu vào cây trồng có khả năng làm tăng hoạt tính, tăng phổ hoạt động của cây được chuyển gen, đồng thời duy trì được ổn định đặc tính kháng sâu của cây qua nhiều thế hệ. 4.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus nhờ chuyển nạp gen protein vỏ virus Đối với cây trồng, bệnh do virus gây ra là rất nghiêm trọng và không chữa được.Vì vậy, việc tạo ra cây trồng kháng virus có ý nghĩa thực tiễn. Kỹ thuật chuyển gen đã được ứng dụng theo các hướng: chuyển gen mã hóa protein vỏ, chuyển gen tạo các ribozyme (enzyme phân giải virus), chuyển các gen đối mã với RNA của virus (các đối bản này sẽ khóa lại sự sao chép và phiên mã của RNA virus). Trong đó, chuyển gen mã hóa protein vỏ virus tương đối phổ biến. Virus có cấu tạo gồm phần lõi (DNA, RNA) và phần vỏ protein. Khi chuyển gen này vào trong tế bào cây trồng sẽ gây hiệu ứng kìm hãm sự nhân virus nhiễm vào. Bằng cách này, người ta đã tạo ra được nhiều cây trồng kháng virus như: đu đủ kháng bệnh virus đốm vàng PRSV (Yeh và cộng sự, 1988; Viện Công nghệ sinh học, 2003), các cây chống chịu virus khảm alfafa (AMV), virus khảm dưa chuột (CMV), cây khoai tây kháng virus X (Lawon và cộng sự, 1900; Stark và Beachy, 1900),… 4.4. Chuyển gen tạo tính bất dục ở cây trồng Trong công tác tạo giống lai cây bất dục đực có ý nghĩa rất quan trọng. Các nhà chọn giống đưa ra một phương pháp mới để làm mất chức năng của hạt phấn qua đó tạo dòng bất dục đực. Nguyên lý chung của phương pháp là chuyển gen ARNse mã hóa barmnase (enzyme phân giải RNA) phân lập từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens gắn với promoter TA29 vào cây. Promoter này chỉ hoạt động ở vùng hạt phấn. Vì vậy, khi chuyển gen ARNse gắn promoter vào cây thì toàn bộ các vật chất thông tin di truyền ở hạt phấn sẽ bị phá hủy còn vùng ngoài hạt phấn thì bình thường. Kết quả là tạo được các dòng bất dục. Chúng sẽ được sử dụng làm mẹ trong tổ hợp tạo hạt lai F1. Để khắc phục hiện tượng bất dục ở F1 người ta phải chuyển gen barstar (ức chế và điều hòa 146 hoạt động của barmnase) vào cây bố trong tổ hợp tạo hạt lai F1. Kết quả hạt lai F1 sẽ hữu thụ 4.5. Chuyển gen tạo giống hoa có kiểu và màu sắc mới Kỹ thuật chuyển gen vào cây hoa tạo giống mới là một hướng đầy triển vọng. Các nghiên cứu cơ bản đã xác định được hệ thống enzyme biến đổi các sắc tố của hoa. Trên cơ sở đó có thể chuyển các gen mã hóa các enzyme gây ức chế hoặc hoạt hóa các khâu của hệ thống biến đổi sắc tố mà tạo nên các giống hoa có màu sắc mới. Ngoài ra, người ta có thể phân lập các gen tổng hợp sắc tố từ các sinh vật để chuyển vào hoa tạo giống mới. Thành công đầu tiên là việc chuyển gen tạo anthocyanin (sắc tố màu sắc của hoa) của hạt ngô vào cây hoa Petuni. Năm 1991, Coen đã phát hiện có 3 loại gen điều hòa (A, B, C) sự phát triển của hoa (điều khiển hình thái, cơ quan của hoa) trên cơ sở đó chuyển để tạo hoa có hình thái mới như: chỉ có cánh hoa mà không có nhị hoa và nhụy hoặc có cấu trúc không gian mới. Người ta còn chuyển các gen kháng ethyle một phytohormon gây già, chín và rụng ở cây như đối bản của ACC synthase vào cây hoa để kéo dài tuổi thọ. 4.6. Chuyển gen thay đổi protein của thực phẩm và thức ăn gia súc Cây đậu tương và ngô thường làm thức ăn cho gia súc nhưng protein của chúng có hàm lượng methion thấp nên không đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng cao. Vì vậy, người ta đã nghiên cứu việc và sản xuất cây đậu tương và cây ngô mang gen mã hóa cho các protein chứa nhiều acid amin methionine. Kết quả là các cây chuyển gen này tăng hàm lượng protein giàu methionine hơn 8% trong tổng số protein của hạt. Các methionine này cũng rất quan trọng trong dinh dưỡng cho các động vật nuôi để lấy lỏng sản xuất len như cừu. Ở cây khoai tây đã có công trình nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho một loại Thaumatin (một chất có độ ngọt gấp hàng nghìn lần so với đường mía). Toàn bộ thân, rễ, lá, củ của cây khoai tây chuyển gen đều ngọt. Trần Thị Cúc Hòa công tác tại Viện lúa Đồng bằng song Cửu Long đã tạo ra giống lúa Golden rice (giống lúa có khả năng tổng hợp β carotene) bằng phương pháp chuyển gen. Trong gạo không có β caroten nhưng có tiền thân là geranyl pyrophosphate. Một nhóm gen mã hóa cho các enzyme xúc tác sự biến đổi chất geranyl geranyl pyrophosphate thành β carotene đã được chuyển vào cây lúa. Kết quả là cây lúa chuyển gen tổng hợp được β caroten. Các nhà nghiên cứu cũng tạo ra giống lúa có hàm lượng sắt dễ tiêu thụ cho cơ thể bằng cách chuyển gen mã hóa cho enzyme phytase phân giải các phytat sắt vào cây lúa. 4.7. Chuyển gen sản xuất các protein động vật vào thực vật Protein động vật có thể được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào động vật. Nhưng phương pháp này rất tốn kém nên các nhà khoa học nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein đó vào thực vật, biến thực vật thành cơ thể sản xuất được protein động vật. Lactoferin là một loại protein có trong sữa người. Gen tổng hợp nó đã từng được chuyển vào cây khoai tây và cây thuốc lá, cây lúa. Ở cây lúa gen này có khả năng biểu hiện rất tốt và tổng hợp lactoferin với nồng độ cao. Ví dụ: Trong 1 kg gạo có thể đạt được 5 g lactoferin và khá ổn định trong thế hệ sau 147 4.8. Chuyển gen sản xuất protein kháng nguyên vào cây trồng- vaccine thực phẩm Các nhà khoa học đã nghiên cứu chuyển một hay nhiều gen sinh tổng hợp các protein có tác dụng như một kháng nguyên vào một đối tượng cây trồng như rau quả, cây ăn quả,…. Như vậy, thay vì phải tiêm vaccine phòng bệnh, chúng ta có thể ăn quả chuối, đu đủ, cà chua đã được chuyển gen tổng hợp protein kháng nguyên-vaccine đó. Và protein kháng nguyên này được gọi là vaccine thực phẩm. Mô hình của loại vaccine này là chuyển các gen độc tố của virus hoặc vi khuẩn vào thực vật-thông thường là những cây lương thực thực phẩm-các cây chuyển gen sau đó sẽ sản xuất protein kháng nguyên tương ứng. Protein này được sử dụng dưới dạng rau quả tươi sống để ăn sẽ có tác dụng như là chủng ngừa vaccine Các protein kháng nguyên thường bị biến tính ở nhiệt độ cao nên chúng ta thường chọn những cây trồng có thể ăn sống không qua nấu chín để làm đối tượng chuyển gen. Các loại vaccine chủng ngừa truyền thống hoặc DNA tái tổ hợp nói chung có giá thành cao, điều kiện bảo quản khắc khe nên việc triển khai tiêm chủng mở rộng tại các nước đang phát triển gặp nhiều khó khăn. Mặt khác, các loại vaccine truyền thống có nhược điểm là dễ độc hóa trở lại, có nguy cơ làm biến dị gen, dễ gây dị ứng do nhiễm tạp các protein khác trong vaccine. Vaccine thực phẩm có thể vượt qua những hạn chế của vaccine truyền thống, vì chúng chỉ chứa một phần nhỏ của mầm bệnh, không có khả năng tạo nên một cơ thể toàn vẹn để gây bệnh. Quan trọng hơn, vaccine thực phẩm dựa trên cơ sở thực vật cảm ứng hiệu quả đáp ứng miễn dịch màng nhầy, được xem là hàng rào bảo vệ đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh bằng cách ngăn chặn sự tương tác đặc hiệu của mầm bệnh với bề mặt màng nhầy. Các kháng nguyên vaccine biểu hiện trong những cơ quan thực vật như củ, quả, hạt, lá... thường ổn định ở nhiệt độ phòng, không cần giữ lạnh khi bảo quản và vận chuyển Bên cạnh đó, điều kiện sống của thực vật đơn giản. Nhiều công trình đã công bố chuyển gen vào cây trồng tạo vaccine thực phẩm: Vaccine phòng bệnh viêm gan B (Thanavala và cs 1995), vaccine dịch tả được sản xuất từ khoai tây (Anakwa và cs 1997). Kang và cs (2003), Kim và cs (2004) đã chuyển gen CTB (cholera toxin B subunit) vào cây thuốc lá và gen HIV-1 gp120 V3 vào khoai tây. Danniell và cs (2001) chuyển gen CTB vào cây thuốc lá. Năm 2000, Sandhu và cs đã nghiên cứu phản ứng miễn dịch ở chuột đối với sự biểu hiện của quả cà chua chuyển gen F của virus gây bệnh hô hấp nguyên thể. Năm 2002, Jani và cs đã nghiên cứu sự biểu hiện của kháng nguyên CTB trong cây cà chua chuyển gen. Jiang và cs (2007) đã nghiên cứu sự cảm ứng của hệ thống miễn dịch của protein kháng nguyên CTB trong cây cà chua chuyển gen. Năm 2003, Ma và cs đã nghiên cứu việc chuyển gen ORF2 của virus gây bệnh viêm gan E vào cây cà chua. Hiện nay, Nguyễn Hoàng Lộc (2006-2009), Viện Tài nguyên Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại hoc Huế đã tái sinh thành công các loại cây trồng chuyển gen: rau má, xà lách xoong, rau cần cua mang gen LTB (Heat-labile enterotoxin subunit của E.coli) và cây cà chua mang gen CTB. 148 TÓM TẮT CHƯƠNG Biến nạp thông tin di truyền (chuyển gen) ở thực vật là kỹ thuật đưa DNA tinh khiết vào cơ thể thực vật và theo dõi sự biểu hiện của DNA mới này. Phương pháp này thành công chỉ khi đáp ứng đủ hai yêu cầu: DNA mới phải hợp nhất với nhân tế bào thực vật và được biểu hiện; tế bào mang DNA mới này phải được tái sinh. Có hai phương pháp chuyển gen chính: chuyển gen gián tiếp và chuyển gen trực tiếp 1. Phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được đưa vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian thường là vi sinh vật hoặc virus. + Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng để chuyển gen vào tế bào thực vật. Trong tự nhiên, vi khuẩn này có khả năng xâm nhiễm vào tế bào thực vật tại vết thương là nhờ vào Ti-plasmid. Trên Ti-plasimd có chứa các gen vùng vir, vùng gen chuyển hóa opine và đoạn T-DNA. Gen cần chuyển sẽ được gắn vào T-DNA, sản phẩm vùng gen vir sẽ đưa đoạn T-DNA vào tế bào thực vật và hợp nhất với nhân tế bào thực vật. Như vậy, gen cần chuyển cũng đã được vào và hợp nhất với nhân của tế bào thực vật. 2. Phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định mà không nhờ vào các sinh vật trung gian + Chuyển gen bằng phương pháp bắn gen: Các hạt vi đạn kim loại được bọc DNA được bắn trực tiếp vào tế bào thực vật bởi sung bắn gen. Một phần DNA sẽ hợp nhất với hệ gen của tế bào vật chủ. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các viên đạn có kích thước hiển vi, có tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng tế bào, đưa DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào thực vật. + Chuyển gen vào protoplast bằng xung điện: DNA sẽ được chuyển vào tế bào trần (thành cellulose đã được loại bỏ bởi enzyme) nhờ thiết bị xung điện tạo lỗ màng trên tế bào thực vật và DNA sẽ đi vào tế bào thực vật qua lỗ màng. + Chuyển gen vào protoplast bằng kỹ thuật vi tiêm: DNA được tiêm trực tiếp vào tế bào trần. 149 CÂU HỎI Câu 1: Trình bày biến nạp di truyền vào tế bào thực vật. Câu 2: Phân biệt phương pháp chuyển gen gián tiếp và chuyển gen gián tiếp ở thực vật? Câu 3: Phân tích cấu tạo của Ti-plasmid? Câu 4: Vì sao có thể sử dụng vi khuẩn A.tumerfaciens làm vector chuyển gen? Câu 5: Phân tích phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen? Câu 6: Phân tích phương pháp chuyển gen bằng? Câu 7: Phân tích phương pháp chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm? 150 Chương 9. SẢN XUẤT CÁC CÂY SẠCH BỆNH VIRUS Hầu hết các cây trồng nông -lâm nghiệp đều bị nhiễm các hệ thống gây bệnh như nấm, virus, vi khuẩn , mycoplasma và nematodes . Các tác nhân gây bệnh không phải luôn gây chết cây, nhưng nó thường xuyên làm giảm năng suất và chất lượng của cây trồng. Trong khi các tác nhân gây bệnh khác gần như luôn xâm nhiễm vào cơ thể thực vật qua nhân giống sinh dưỡng , thì các bệnh virus lại xuất hiện ở cả những cây trồng nhân giống bằng hạt cũng như nhân giống sinh dưỡng. Mặc dù các cây trồng bị nhiễm bệnh vi khuẩn và nấm có thể phản ứng với việc xử lý các hợp chất diệt khuẩn (bactericidal) và diệt nấm (fungicidal), nhưng người ta chưa thể sản xuất ra các hợp chất thương mại diệt virus để chữa bệnh ch o các cây trồng nhiễm virus. Có khoảng 600 loài virus ở thực vật đã được biết đến và trong số đó có ít nhất 80 loài có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là một loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân vô tính (do tồn tại trong các bộ phận sống), qua môi giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện…), qua tiếp xúc cơ giới. Khác với các bệnh gây ra do nấm và vi khuẩn, virus là một bệnh không chữa được trong khi lại gây tổn thất rất lớn về năng suất, phẩm chất và lan truyền qua các thế hệ khi nhân giống vô tính, gây ra hiện tượng thoái hóa giống. Để sản xuất cây sạch bệnh virus, thông thường người ta chọn ra một hoặc nhiều cây khỏe mạnh và sau đó nhân giống chúng bằng phương thức sinh dưỡng , tạo ra một quần thể cây khoẻ mạnh. Nhưng tại nơi mà quần thể của một dòng hoàn toàn bị nhiễm bệnh virus thì chỉ có cách thu được cây sạch bệnh thông qua nuôi cấy mô. Các mô phân sinh đỉnh chồi, đỉnh rễ, và lá bao thứ nhất ở các cây bị nhiễm bệnh thường hoặc là sạch bệnh hoặc chứa nồng độ virus rất thấp . Tuy nhiên, nồng độ của virus trong cây tăng lên tương ứng với việc tăng khoảng cách tính từ các đ ỉnh phân sinh. Theo Mathews (1970), Wang và Hu (1980) các lý do khác nhau để cho mô phân sinh không hoặc ít bị virus xâm nhiễm là: - Virus di chuyển dễ dàng trong cơ thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn là cấu trúc mà ở đỉnh phân sinh không có nên virus không thể xâm nhiễm. - Hoạt động trao đổi chất cao trong quá trình phân chia của các tế bào phân sinh ngăn cản sự sao chép thông tin di truyền của virus - Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác trong cây. - Nồng độ auxin nội sinh cao ở trong các đỉnh chồ i có thể ức chế sinh sản c ủa virus. Lý do đầu tiên được xem là lý do chủ yếu nhất. Morel và Martin (1952) đã ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để loại bỏ sự xâm nhiễm virus ở thực vật . Họ nuôi cấy các đỉnh phân sinh tách ra từ cây Dahlia bị nhiễm virus và thu được các cây sạch bệnh . Sau đó , các tiến bộ trong loại bỏ virus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đã được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp . Nuôi cấy đỉnh phân sinh cũng cho phép thu được các cây sạch những bệnh khác như bệnh viroid (dạng virus -tác nhân gây bệnh chỉ chứa một đoạn rất ngắn RNA ), mycoplasma, vi khuẩn, và nấm. 151 Một cách khác để tạo cây sạch virus là dùng các phương pháp chẩn đoán bệnh virus để thanh lọc các mẫu nhiễm bệnh trước khi đưa vào nuôi cấy, sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân nhanh mẫu bệnh. 1. NGUYÊN LÝ LÀM SẠCH VIRUS VÀ DUY TRÌ TÍNH SẠCH BỆNH Danh từ làm sạch virus chỉ đúng về nội dung của công việc. Đó là việc phải giải phóng các thực vật bị nhiễm virus khỏi virus . Ở đây chỉ đề cập tới các cây trồng nhân giống vô tính vì phương thức nhân giống này là nguyên nhân truyền bệnh từ thế hệ này sang thế hệ khác . Vì vậy , biện pháp làm sạch bệnh virus luôn phải kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh . Cả hai biện pháp nằm trong phạm vi phục tráng giống, người ta gọi là biện pháp giữ sạch bệnh. Bên cạnh hai nhiệm vụ là duy trì đặc tính giống và tính đồng đều của giống nhiệm vụ chủ yếu của công tác phục tráng giống là cung cấp được tập đoàn cây bố mẹ và hạt giống sạch virus . Kinh nghiệm thực tế cho hay những biện pháp phục tráng giống có hiệu quả là những biện pháp được thực hiện một cách triệt để và có trách nhiệm. Làm sạch virus được coi là mục tiêu của công tác phục tráng giống. Bên cạnh xử lý nhiệt và xác định tính sạ ch bệnh, các phương pháp để thu được cây sạch virus bao gồm chủ yếu vẫn là nuôi cấy đỉnh phân sinh . Đương nhiên là kỹ thuật nuôi cấy đỉnh phân sinh ở đây được thực hiện theo một mục đích khác nên phức tạp và tốn kém hơn tro ng nhân giống vô tính . Vì thế, người ta phân biệt rõ giữa nuôi cấy đỉnh phân sinh trong công tác phục tráng giống nói chung và làm sạch virus nói riêng. Mục đích của công tác bảo vệ thực vật (trong nuôi cấy đỉnh phân sinh và nuô i cấy mô) phân biệt rõ với công tác duy trì giống. Trong công tác bảo vệ thực vật thì yêu cầu lớn nhất là làm sạch virus , nhưng trong thực tế điều đó hầu như không thể đạt được. Vì vậy phải kết hợp nhiều biện pháp để đả m bảo kết quả . Xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh và xác định (thử) virus phải được thực hiện theo một chu trình kín . Các nhà duy trì giống đòi hỏi phải có những cơ thể thực sự sạch virus , để rồi thông qua phương pháp n hân in vitro có thể nh ân thành số lượng cây bất kỳ mà không bị tái nhiễm. Các nhà nuôi cấy mô thực vật rất quan tâm đến phương pháp nhân giống in vitro, mà lý do chính là việc làm sạch virus đối với cây trồng . Vì hiệu quả kinh tế , người ta chỉ giới hạn việc nhân giống in vitro ở những cây trồng mà đối với chúng các phương pháp cổ điển để nhân nhanh những giống mới hoặc làm sạch virus không thực hiện được. Phương pháp nhân giống in vitro loại trừ được nguy cơ tái nhiễm và vì thế tỏ ra ưu việt hơn các phương pháp cổ điển . Tuy vậy theo kinh nghiệm thực tiễn , các cây trồng được nhân giống in vitro vẫn còn mang ít nhiều tác nhân gây bệnh. Đa số các cây trồng thương mạ i (commercial crop plants ), đặc biệt là các cây nhân giống vô tính đều chứa các virus nội hấp (systemic virus ), các virus này ảnh hưởng xấu đến năng suất . Vì vậy, việc sản xuất ra các nguyên liệu thực vật sạch virus hoặc gần s ạch virus là rất cần thiết trước khi chúng được nhân gi ống để đưa ra thị trường. Ở nhiều loài, phương thức cho hiệu quả cao là xử lý nhiệt các cơ quan khác nhau hoặc lúc cây đang sinh trưởng mạnh. Tuy nhiên, đối với một số v irus phương thức này hoàn toàn không thích hợp vì thế phải sử dụng một số phương thức khác . Phương thức cho hiệu quả cao nhất là nuôi cấy đỉnh phân sinh , thường có thể kết hợp với xử lý hóa học hoặc xử lý nhiệt . Các phương pháp này cho phép có thể thu được các cá thể không những sạch virus mà còn sạch cả nấm và các nhân tố gây bệnh khác. 152 Từ năm 1952, 1953 Morel và Martin đã thành công trong việc loại trừ một số virus ở khoai tây và thược dược (Dahlia variabilis) bằng cách nuôi cấy đỉnh phân sinh, điều đáng tiếc là các chồi này đã không tạo rễ và người ta phải ghép lên các cây mầm khoẻ mạnh. Tuy nhiên, sau đó trên cơ sở các kết quả của Morel và Martin người t a đã đưa ra nhiều phương pháp sản xuất các cây trồng sạch virus có khả năng tạo rễ ở nhiều loài thực vật khác nhau và các dòng cây đó hiện nay đã được sử dụn g rộng rãi trên thị trường. Nuôi cấy đỉnh phân sinh là nuôi cấy các mẫu nhỏ của chồi đỉnh lên môi trường dinh dưỡng thích hợp để chúng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh . Phần mô thường được dùng là vòm phân sinh (meristem dome ) cộng thêm cặp lá đầu tiên . Tùy thuộc vào từng loài khác nh au mà đỉnh phân sinh có thể có chiều dài từ 0,1-0,5 mm, một số tác giả yêu cầu chỉ nuôi cấy vòm phân sinh , tuy nhiên một số tác giả lại thu được cây sạch virus từ đỉnh sinh trưởng có chiều dài 0,5 mm. Chồi đỉnh hoặc đỉnh si nh trưởng sau khi cắt thường phải khử trùng bề mặt , nhưng giai đoạn này có thể không cần thiết . Các kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng rất khác nhau tùy thuộc từng loài. Môi trường agar thường không thích hợp cho cây sinh trư ởng khi nuôi cấy , chỉ có các “cầu giấy lọc” (filter paper bridge) với phần chân được nhúng trong môi trường lỏng chứa trong ống nghiệm nuôi cấy là thích hợp hơn cả . Chỉ trên các cầu giấy lọc như thế rễ mới phát triển tốt , và cây có thể sẳn sàng để đưa ra đãt . Rất nhiều loại môi trường đã được dùng trong nuôi cấy đỉnh phân sinh nhưng không có một môi trường chung thích hợp cho mọi loài . Môi trường chứa các nguyên tố đa lượng và vi lượng của Knop và Berthlot (không có beryllium và titanium ), glucose 40 g/L, thiamine 105g/L và myo-inositol 10-3 g/L ở pH 5,5 có thể được dùng cho nhiều loài. NAA ở nồng độ 10-3 mg/L cần thiết cho sự hình thành các rễ ban đầu , nhưng sau đó phải cấy chuyển sang môi trường không có NAA. Các số liệu về điều kiện chiếu sáng và nhiệt độ lý tưởng được công bố rất ít , o mặc dù trước đây Hollings (1968) đã đưa ra nhiệt độ nuôi là 20 C dưới ánh sáng đèn huỳnh quang với thờ i gian chiếu sáng 22 giờ/ngày. Thời gian để đỉnh phân sinh tạo chồi và rễ là từ vài tuần đến vài tháng tùy loài. Hiện nay, ba biện pháp làm sạch virus tỏ ra có hiệu quả đối với cây lương thực và cây thực phẩm , đó là xử lý nhiệt , nuôi cấy đỉnh phân sinh và chọn lọc bằng các phương pháp thử virus. Mỗi một biện pháp đều thu được kết quả nhất định , nhưng chỉ khi xử dụng một cách tổng hợp cả ba biện pháp người ta mới thu được kết quả sạ ch virus thực sự. Mức độ hữu hiệu của quá trình làm sạch virus đối với thực tiễn phụ thuộc vào những yếu tố sau: - Khả năng xử lý nhiệt. - Khả năng nuôi cấy đỉnh phân sinh. - Phương pháp thử virus có độ chính xác cao. - Hệ số nhân giống vô tính cây khá cao. - Trồng các vật liệu sạch bệnh ban đầu dưới điều kiện cách ly tốt, tránh được tái nhiễm. - Mức độ (diện tích) trồng trọt cho phép cung cấp đủ cây giống mới trong mỗi năm. Những điều kiện trên đây được thực hiện ở các mức độ rất khác nhau đối với các loài cây trồng khác nhau . Việc làm sạch virus không thể thay bằng việc phân tích 153 virus của một loài cây trồng , phân tích virus cần được thực hiệ n trước đó và để rồi từ đó mà tìm ra biện pháp thích hợp để bảo đảm cây trồng sạch bệnh. Hình 9.1. Nuôi cấy cầu giấy lọc Bảng 9-1. Các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy chồi đỉnh của một số cây trồng Thành phần NH4NO3 KNO3 (NH4)2SO4 KCl CaCl2.2H2O Ca(NO3)2.4H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 FeCl3.6H2O Fe-citrate Fe(SO4)3 FeSO4.7H2O Na2-EDTA MnSO4.4H2O ZnSO4.H2O NiCl2.6H2O MnCl2.H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O AlCl3 H2MoO.H2O Na2MoO4.2H2O Môi trường (mg/L) (a) 1 2 3 4 5 125 500 125 125 (b) (b) (b) (b) (b) (b) (b) (b) (b) 125 500 125 125 25 0,8 0,04 0,025 0,025 0,025 - 125 500 125 125 (b) (b) (b) (b) (b) (b) (b) (b) (b) 200 800 200 200 0,2 0,3 1,8 0,08 0,02 - 125 1000 1000 500 125 125 1 5 0,1 1 0,03 0,03 - 154 6 7 8 60 60 125 80 80 500 170 170 125 240 240 40 125 40 5 25 27,8 37,3 1 22,3 0,05 0,05 8,6 0,025 0,025 0,4 0,025 0,025 0,05 0,025 0,025 0,02 0,025 - 9 (c) 1650 1900 440 370 170 27,85 37,25 22,30 8,60 0,025 0,025 0,25 Thành phần KI H3BO3 Myo-inositol Ca-pantothenate Inositol Nicotinic acid Pyridoxine.HCl Thiamine.HCl Glycine Biotin Cystein Adenine AdSO4 Casein hydrolysate Sucrose Glucose Môi trường (mg/L) (a) 1 (b) (b) 0,1 10 1 1 0,1 20000 - 2 3 4 5 6 7 8 9 (c) 0,25 (b) 0,01 0,83 0,25 0,83 0,025 (b) 2,8 1 0,6 6,2 0,025 6,2 0,001 0,1 100 0,1 0,1 0,001 10 1 10 10 100 1 5 1 1 1 0,5 1 1 1 1 1 0,5 0,001 1 1 1 1 1 0,1 2,0 0,001 0,01 0,01 0,01 0,01 0,001 10 1 10 10 0,1 5 5 8 1 1 1 20000 3000 20000 0 40000 1000 30000 40000 0 Chú thích: (a). 1: Morel (1948), 2: Morel and Martin (1955), 3: Kassanis (1975), 4: Nielsen (1960), 5: Morel and Müller (1964); 6: Mori (1971), 7: Wang and Huang (1975), 8: Baker and Kinnaman (1973), 9: Mellor and Stace-Smith (1977). (b). Dung dịch Berthelot (mg/L): MnSO4 (2000), NiSO4 (60), TiO2 (40), CoSO4 (60), ZnSO4 (100), CuSO4 (50), BeSO4 (100), H3BO3 (50), Fe2(SO4)2 (50000), KI (50), H2SO4 (sp. gr. 1,83) (1 ml). (c). Môi trường sử dụng đặc biệt cho nuôi cấy đỉnh chồi khoai tây có các hormone sinh trưởng (mg/L): Kinetin (0,04), IAA (0,5), GA3 (0,1), bổ sung than hoạt tính (2857). Các môi trường từ 1-8 có tỷ lệ các hormone sinh trưởng khác nhau tùy loài. 2. LÀM SẠCH VIRUS Ở MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG 2.1. Cây khoai tây Khoai tây là cây trồng ở châu Âu được nhân giống vô tính và bị virus phá hoại nhiều nhất. Trong thời gian qua việc làm sạch virus ở khoai tây mới được ứng dụng một cách chậm chạp trong quá trình duy trì giống . Người ta chú ý nhiều nhất tới việc tạo ra các cây giống sạch bệnh bằng qui trình thử virus và trồng ở các khu vực sạch bệnh để tránh tái nhiễm thông qua các loài rệp lá . Qui trình được xử dụng chủ yếu là giết các cây thảo có thể truyền bệnh vào củ khoai tây . Qui trình này có thể nâng cao hiệu suất thông qua xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Quá trình xử lý nhiệt giữa 32 và 38oC trong thời gian 7 ngày đến 7 tuần và sau đó nuôi cấy đỉnh phân sinh có thể loại 155 trừ được virus A, xoăn lá, X và Y trong khi virus M và S cũng được giảm đi một cách đáng kể. Các ảnh hiển vi điện tử của đỉnh sinh trưởng khoai tây có độ lớn từ 80-100 µm cho thấy chúng vẫn còn chứa trong tiêu bản tới 12 thể virus X. Tuy vậy, sau quá trình phân loại từ các đỉnh phân sinh đó vẫn thu được một tỷ lệ phần trăm nhất định các cây sạch virus. 2.2. Cây thức ăn gia súc Để sản xuất hạt giống cây trồng làm thức ă n gia súc, ví dụ cỏ ba lá cần phải có cây bố mẹ sạch bệnh virus để tránh sự lây bệnh thông qua hạt giống và đảm bảo thu được năng suất hạt cao. Người ta nghiên cứu nhiều phương pháp làm sạch virus khác nhau. Xử lý lạnh và nuôi chồi ngọn mang lại tốc độ sinh trưởng cao , nhưng chỉ sạch virus từng phần, nếu xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh thì thu được phần lớn các cây sạch virus. 2.3. Cây hoa bia Các loại bệnh virus ở hoa bia thư ờng làm giảm năng suất đáng kể . Tiến hành chọn lọc bằng mắ t thường, xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng , cải tiến dần tình trạng sạch bệnh người ta đã giải phóng 66% cây khỏi virus hop -mosaic (HMV) và latent bằng nuôi cấy đỉnh phân sinh , sau đó làm sạch virus prumis necrotic ringspot (PNRV) bằng xử lý nhiệt trong thời gian 10 ngày. 2.4. Cây rau Hầu hết các loài rau trừ một vài trường hợp ngoại lệ đều được nhân giống bằng hạt. Truyền bệnh virus qua hạt vừa mới được chứng minh ở loài virus gây bệnh khảm ở xà lách và đậu (đậu ăn quả trắng hoặc xanh ), vì vậy ở những cây trồng này cần phải chọn lọc những cây làm giống và thông qua biện pháp trồng trọt cách l y để tạo ra hạt giống sạch virus . Đối với các loài virus gây bệnh ở các cây rau khác thì quá trình lây lan thường xảy ra do cơ học hoặc do rệp lá , vì vậy cần có biện pháp vệ sinh đồng ruộng và phòng trừ tác nhân truyền bệnh. Ở một số cây rau nhân giống vô tính cần sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh hoặc xử lý nhiệt để giải phóng virus . Đối với nấm rơm có thể làm sạch bệnh bằng phương pháp xử lý nhiệt và trong thời gian gần đây n gười ta đã tạo được phương pháp miễn dịch trong agar gel. Ngoài ra, ở những cây trồng dùng để sản xuất h ạt của chúng có thể nhân giống vô tính qua nhiều năm , ví dụ như s úp-lơ người ta cũng cần phải có vật liệu sạch bệnh virus ban đầu . Thông qua nuôi cấy mô người ta tạo được một vài trăm cây và bằng biện pháp thử virus đã thu được 3.220 cây sạch bệnh. 2.5. Cây ăn quả Cây ăn quả thường bị virus phá hoại một cách mạnh nhất . Các thể virus gây bệnh không những lan truyền khi nhân giống vô tính mà cả khi nhân giống bằng hạt . Ngoài ra cây ăn quả thường là cây lâu năm , luôn luôn chịu tác động của các tác nhân truyền bệnh vì thế chúng rất dễ bị nhiễm bệnh. Việc chứng min h virus nhiễm ở cây ăn quả gặp nhiều khó khăn , hơn nữa thời gian ủ bệnh dài và khả năng chống chịu cao gây nhiều khó khăn cho việc làm sạch virus cây ăn quả, vì vậy cần tiến hành công tác chống virus gây bệnh ở cây ăn quả mộ t cách liên tục. Vì việc xử lý nhiệt đối với các cây thân gỗ và việc nuôi cấy đỉnh phân sinh của chúng khó khăn hơn nhiều so với các loài cây thân thảo cho nên từ lâu người ta đã xử 156 dụng phương pháp thử để tìm ra các vật liệu sạch bệnh ban đầu . Quá trình xử lý nhiệt đối với cây ăn quả đến nay thường được tiến hành chủ yếu ở những đoạn cành mà các mắt của chúng sẽ được xử dụng để ghép sau này. Theo tài liệu tổng hợp của Nyland và Coheen (1969) về vấn đề xử lý nhiệt ở các cây thân gỗ có thể loại trừ được bốn loài virus ở cây anh đào , một loài virus ở cây mận, bảy loài virus ở cây táo, hai virus ở cây nho đất (nho tây), sáu virus ở cây đào và hai virus ở phúc bồn tử. Thành công trong xử lý nhiệt ở cây ăn quả không bao giờ đạt được 100%. Ở mỗi đối tượng ít nhất còn lại một thậm chí một số loài còn tới bốn virus không bị mất hoạt tính khi xử lý nhiệt. Nuôi cấy đỉnh phân sin h ở cây ăn quả tới nay mới chỉ được sử dụng ở những đối tượng sau: dâu chua, dâu chua quả đỏ, dâu chua quả đen và cây táo . Thực tiễn cho thấy đối với cây ăn quả (cây thân gỗ) việc nuôi cấy đỉnh phân sinh còn gặp khó khăn hơn bởi vì khả năng tái sinh của chúng yếu hơn so với cây thân thảo . Các thí nghiệm trong những năm sắp tới chắc chắn sẽ nêu ra những kết quả mới. 2.6. Cây hoa Ở đối tượng cây hoa chỉ gặp những cây nhân giống vô tính thường bị bệnh virus trong khi bước đầu người ta chỉ tập trung làm sạch bệnh ở những cây hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên...). Hiện nay, người ta bắt đầu nuôi cấy các loài hoa khác ví dụ như : hài vệ nữ, hoa huệ, hoa layơn... Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh được sử dụng để làm sạch virus ở hoa anh túc và hoa cúc. Việc ứng dụng thực tiễn trong các xí nghiệp chuyên sản xuất hoa đã trở thành quen thuộc trong những năm gần đây . Ở Hà lan, có những cơ sở của tổ chức trồng hoa chuyên nhận các loài vật liệu để làm sạch virus . Ở Anh, cũng tổ chức một cơ quan tương tự như vậy. Ở Đông Đức (cũ) có xí nghiệp ươm cây con ở thàn h phố Dresden cũng nhân các loài hoa như cúc , hoa anh túc , hoa thủy tiên ... để xử lý nhiệt và làm sạch virus. Các điều kiện để làm sạch virus đối với cây hoa thường được thực hiện dễ dàng, vì thế ở những loài cây trồng n ày việc làm sạch virus thường có kết quả nhất. Vì thế dưới đây một số biện pháp quan trọng như xử lý nhiệt , nuôi cấy đỉnh phân sinh và xét nghiệm virus được trình bày trên đối tượng cây hoa. 3. PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH VIRUS 3.1. Xử lý nhiệt Quá trình xử lý nhiệt được coi như là biện pháp làm sạch bệnh có cơ sở thực tiễn. Những cây mía mắc bệnh có thể cho năng suất cao sau khi ngâm ở nước nóng , các nghiên cứu về vấn đề này cho thấy dùng không khí nóng thuận lợi hơn đối với hầu hết cây trồng bởi vì chúng có thể chịu đựng tốt hơn và virus bị loại trừ dần dần . Những hiểu biết của chúng ta về quá trình làm sạch bệnh thông qua xử lý nhiệt còn chưa đầy đủ. Người ta nêu ra giả thiết chung là virus bị ức chế sinh sản ở nhiệt độ từ 34-40oC. Quá trình sinh trưởng của thực vật trong khi xử lý nhiệt cũng bị ức chế nhưng ít hơn vì thế những bộ phận vừa được sinh trường thường sạch h oặc nghèo virus . Kết quả xử lý nhiệt còn cho thấy cơ thể thực vật có thể được bảo tồn ở trạng thái tối thích trong một thời gian dài ở nhiệt độ cao . Tốt nhất là nên xử lý với chu kỳ quang 16 giờ/ngày. Nhiệt độ phải được kiểm tra liên tục bằng máy ghi tự động để đảm bảo cung cấp lượng nhiệt năng cần thiết , độ ẩm tương đ ối phải đạt trung bình là 50%. Để đảm bảo sự phân bố nhiệt độ đồng đều trong phòng cần phải có quạt gió . Mỗi một loài cây 157 hoa thường mẫn cảm rất khác nhau đối với nhiệt độ cao trong khi xử lý , ví dụ: hoa cúc có khả năng chịu đựng nhiệt rất lớn : 38oC trong thời gian nửa năm tiếp theo là hoa anh túc. Hoa thủy tiên thì chịu được nhiệt độ 34oC trong thời gian từ 4-6 tuần. 3.2. Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem) Mô phân sinh đỉnh là phần đỉnh ngọn có hình cầu và một số lá bao mầm non, không chưa mô mạch. Người ta đã chứng minh được rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng riêng đỉnh phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Thực tế này đã được ứng dụng để làm sạch virus bằng cách tách đỉnh sinh trưởng ở điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy chúng thành thực vật hoàn chỉ nh. Trong nuôi cấy, các cây con tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng có tính ổn định di truyền rất cao. Do chồi hình thành trực tiếp từ mô phân sinh mà không qua giai đoạn hình thành callus hoặc tái sinh các cơ quan bất định nên tính không ổn định di truyền và biến dị soma được hạn chế tối đa. Các ưu điểm chính của nuôi cấy mô phân sinh: - Tạo cây sạch bệnh virus cũng như các bệnh truyền nhiễm khác - Nhân giống vô tính cây trồng với sự ổn định di truyền cao nhất - Ứng dụng trong bảo quản nguồn gen - Vi nhân giống chính xác các kiểu gen - Đáp ứng các quy định về kiểm dịch trong vận chuyển quốc tế. Việc phân lập đỉnh phân sinh có kích thước 0,01-0,1 mm rất khó khăn và việc tái sinh thành cây hoàn chỉnh cũng chỉ đạt được với tần số rất thấp (0,2-5%) vì vậy người ta thường phân lập cả chồi ngọn và gọi nó là đoạn đỉnh (shoot tips ) có kích thước từ 0,1- 1 mm qua đó tính sạch bệnh của mẫu vật nuôi cấy bị giảm xuống nhưng tốc độ tái sinh cây được tăng l ên và đó chính là phương pháp được ứng dụng trong thực tiễn Thao tác tách mô phân sinh đỉnh cũng giống như thao tác đã làm trong nhân giống in vitro bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh. Khái niệm sạch virus của thực vật không có nghĩ a là cần phải có đỉnh phân sinh hoàn toàn sạch các phần tử virus mà nó được hoàn thiện trong quá trình phân hóa của các tế bào chưa phân hóa . Vì vậy, trong thực tiễn phải giới hạn nồng độ virus và khối lượng mô phân hóa ở một mức nhất định nếu cần có thực vật sạch virus. Việc phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh là phương pháp rất thuận lợi bởi vì thông qua xử lý nhiệt quá trình sinh sản của virus trong chồi ngọn bị ức c hế mạnh và thông qua quá trình phân hóa đỉnh phân sinh tính sạch virus sẽ được đả m bảo với độ xác suất cao . Biện pháp này cho phép có thể tách mô phân sinh ở kích thước lớn hơn (0,5-1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0,1-0,2mm. Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-37oC một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách mô phân sinh đỉnh (5-10 tuần). Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy in vitro ở nhiệt độ 39-40oC trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao. Các hóa chất diệt virus như ribavirin (virazole) thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô phân sinh. Đây là một chất tương tự với guanosine – có khả năng kháng lại virus ở động vật và khi có mặt trong cây bị nhiễm virus nó cũng ngăn chặn sự tái bản của virus, nhưng nếu nồng độ ribavirin quá cao thì có thể gây độc và làm chết mẫu cấy. 158 Theo quan điểm lý thuyết và kinh nghiệm thực tiễn người ta thu đượ c những kết quả khác nhau trong từng phòng thí nghiệm, nếu việc nuôi cấy đỉnh phân sinh được thực hiện trên quan điểm sản xuất lớn thì cần phải chú ý những mặt sau đây: - Đảm bảo độ đồng nhất của giống trong tất cả các khâu nuôi cấy - Đảm bảo tốc độ sinh trưởng nhanh và đều đối với một số lượng đỉnh phân sinh lớn đồng thời - Kết quả đưa cây ra đất cũng cần phải được bảo đảm. Các đỉnh sinh trưởng sau khi phân lập cần được nuôi ở các buồng nuôi cây hoàn toàn khống chế về mặt khí hậu: nhiệt độ 22oC và 16 giờ chiếu sáng ở 1.000-3.000 lux . Khi đưa cây tái sinh từ đỉnh phân sinh ra ngoài đất cần phải phủ nilon để chúng thích nghi dần với độ ẩm không khí thấp. Tốt nhất là nên trồng ở các buồng nuôi cây cách ly có thông khí và hoàn toàn sạch rệp lá . Từ tháng 10 đến tháng 3 cần phải chiếu sáng thêm, nhưng trong mùa hè lại phải che bớt ánh sáng. 3.3. Kỹ thuật vi ghép (micrografting) Vi ghép là kỹ thuật ghép mô phân sinh đỉnh lên gốc ghép sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch bệnh virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với cây thân gỗ, đặc biệt là họ Cam, Chanh. Kỹ thuật này có thể thực hiện được cả in vivo và in vitro. Gốc ghép dùng trong vi ghép chủ yếu là cây con mới nảy mầm. Trong một số trường hợp có thể sử dụng các chồi in vitro. Nếu sử dụng cây gieo từ hạt, hạt cần được khử trùng và gieo trên môi trường MS nền thạch cứng. Mô phân sinh đỉnh dùng để vi ghép có thể lấy từ chồi đỉnh hoặc chồi nách phát triển khỏe mạnh trong in vivo hoặc từ chồi in vitro. Sự sống sót của đỉnh vi ghép phụ thuộc chủ yếu vào kích thước của chúng. Thao tác tách mô phân sinh đỉnh cũng giống như thao tác đã làm trong nhân giống in vitro bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh (các thao tác này thường được thực hiện dưới kính hiển vi). Tùy theo các loại cây mà kích thước mô phân sinh có thể dao động từ 0,2-0,5mm. Các mô phân sinh đỉnh này được nuôi cấy trong môi trường khởi đầu (MS + 0,01mg/l Zeatine) khoảng 2 tuần cho đến khi đạt được kích thước 10mm thì có thể tiến hành ghép. Khi vi ghép được thực hiện trong điều kiện in vitro, khâu khó khăn nhất là chuyển thành công cây ghép ra môi trường bên ngoài. Vì thế, nhiều tác giả đã đề xuất nên thực hiện vi ghép trong điều kiện in vivo. Khi đó, tỷ lệ vết ghép liền mạch có thể ít hơn so với điều kiện in vitro, nhưng không còn khó khăn khi chuyển cây ghép ra điều kiện tự nhiên. Hiện nay, công nghệ sản xuất các giống cây sạch bệnh bắt nguồn từ kỹ thuật nuôi cấy mô là công nghệ phổ biến và bắt buộc ở nhiều nước trên thế giới. Ở Việt Nam cũng đã nghiên cứu thành công và đang bắt đầu triển khai hệ thống sản xuất giống sạch virus cho cây khoai tây, cam quýt. Đây là hai đối tượng bị virus gây thoái hóa nghiêm trọng. 3.4. Xét nghiệm virus Không phải tất cở các loài cây sau quá trình xử lý phối hợp nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì đều sạch virus , vì vậy cần phải tiến phải xét nghiệm khoảng thời gian từ lúc tái s inh cây cho tái khi xét nghiệm phải từ 4 đến 6 tháng để các thể virus còn tồn tại trong thực vật đạt được nồng độ cần thiết cho việc xét nghiệm đảm bảo độ chính xác. Xét nghiệm virus trong khuôn khổ của qui trình làm sạc h virus hoàn toàn khác quá trình phân tích virus ở một cây trồng . Đối với việc làm sạch virus thì độ 159 chính xác của phương pháp thử virus trong mỗi loài xét nghiệm mang ý nghĩa quyết định cho nên mỗi một cây cần được xét ng hiệm theo nhiều phương pháp khác nhau trong đó cần chú ý tới các phương pháp xét nghiệm những loài virus phổ biến và có ý nghĩa kinh tế. Đối với việc phân tích virus một loài cây trồng người ta chỉ chú ý tới số lượng cũng như sự phân loại của chúng. Độ nhạy cảm của mỗi phương pháp xét nghiệm có vai trò thứ yếu , sau đây là một số phương pháp xét nghiệm virus được ứng dụng trong trồng trọt các loài cây hoa : 3.4.1. Xét nghiệm bằng cây chỉ thị Dùng dịch ép của thực vật cần được xét nghiệm gây bệnh trên một cây chỉ thị thích hợp hoặc dùng phương pháp ghép có thể chứng minh được bệnh virus . Chỉ sau khi thực hiện phương pháp thử này kết luận về bệnh virus mớ i thực sự đảm bảo tính chính xác của nó. Phương pháp thử bằng cây chỉ thị luôn được coi là phương pháp xác định đầu tiên và cũng là phương pháp nhạy cảm nhất , tuy nhiên kết quả xét nghiệm cũng còn phụ thuộc các yếu tố khác nữa. Trong trường hợp xét nghiệm hàng loạt công việc gây bệnh nhân tạo đối với số lượng cây chỉ thị là 10.000 đến 100.000 ở một thời gian nhiều tháng thì độ chính xác của phương pháp giảm đi vì không thể tiến phải các thí nghiệm lặp lại . Tuổi của cây trồng cũng như trạng thái sinh lý của chúng trong các mùa khác nhau của một năm ảnh hưởng rất nhiều đến tính chính xác của phương pháp xét nghiệm. Vì lý do đó, trong trường hợp phải xét nghiệm hàng loạt phương pháp dùng cây chỉ thị không đảm bảo bằng phương pháp miễn dịch . Nếu chỉ xét nghiệm một số lượng cây vừa phải ví dụ 1.000 cá thể thì phương pháp dùng cây chỉ thị không cần thay bằng phương pháp khác vì công việc có thể tiến hành trong một thời vụ thích hợp. Triệu chứng bệnh lý có thể quan sát được sau 3-5 ngày song thông thường là sau hai tháng vì vậy cần một diện tích nhà kính khá rộng trong một thời gian tương đối dài chi phí cho xét nghiệm bằng phương pháp cây chỉ thị thường đắt gấp ba lần so với phương pháp huyết thanh. 3.4.2. Phương pháp huyết thanh Tính đặc hiệu cao của phương pháp huyết thanh là một đặc điểm quan trọng . Ngoài ra, phương pháp này còn cho phép xác minh nhanh sự tồn tại của virus và phân loại chúng. Kết quả thu được chậm nhất là sau 48 giờ. Chi phí cho xét nghiệm thấp, để chứng minh virus không cần có nhà kính trồng cây . Phương pháp huyết thanh lại có độ chính xác cao , tuy nhiên người ta chưa sản xuất được kháng thể đối với tất cả các loài virus và kể cả khi có huyết thanh rồi cũng chưa có thể nói rằng kết quả xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm . Vì rằng với phương pháp này người ta không thể xác minh được đặc tính gây bệnh của từng loài virus đối với thực vật chủ, có nhiều phương pháp huyết thanh khác nhau đã được ứng dụng trong xét nghiệm hàng loạt đối với cây hoa, trong đó có phương pháp kết tủa giọt , xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều , xét nghiệm latex, xét nghiệm miễn dịch hướng tâm... Mỗi một phương pháp đều có ưu và nhược điểm đặc trưng thông số về độ chính xác thường thu được với dãy nồng độ dịch ép từ thực vật hoặc virus phân lập . Nhiều nghiên cứu cho thấy không thể coi độ nhạy cảm này thường thu được khi pha loãng dịch ép nhiều lần hoàn toàn cho phép tin tưởng vào kết quả xét nghiệ m hàng loạt . Vì thế cần chọn phương pháp thích hợp cho xét nghiệm hàng loạt. 160 3.4.3. Xét nghiệm bằng kính hiển vi điện tử Kính hiển vi điện tử với sự hoàn chỉnh về kỹ thuật và sau khi ứng dụng phương pháp nhúng có thể đưa vào xét nghiệm hàng loạt với số lượng mẫu vừa phải . Khi chứng minh virus hình đũa và hình sợi ở hoa phong lan và hoa huệ kính hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng loạt . Khó khăn chủ yếu hiện nay là chi phí cho thiết bị và số lượng mẫu được xét nghiệm bị hạn chế , đồng thời loại virus được chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi. Nếu virus tồn tại dạng cầu thì rất khó phát hiệ n vì nó khá giống các cơ quan tử của tế bào thực vật bình thường. 3.4.4. Xét nghiệm virus bằng phương pháp PCR Hiện nay, một phương pháp được sử dụng phổ biến của công nghệ sinh học có rất nhiều tiềm năng ứng dụng đó là khuếch đại gen bằng phản ứng trùng hợp polymerase (polymerase chain reaction) trên máy PCR. Bằng cách thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu của các gen gây bệnh ở virus, người ta có thể khuếch đại các gen này (nếu có) từ DNA hệ gen của thực vật đã được xử lý làm sạch virus. Nếu không xuất hiện sản phẩm PCR đặc trưng của gen virus sau khi phân tích điện di agarose gel thì ta có thể kết luận là cây đã được làm sạch bệnh hoặc ngược lại, cây được xử lý vẫn còn mang virus. Phương pháp này có độ nhạy rất cao, chính xác và ít tốn kém hơn các phương pháp nói trên. Hiện nay, người ta đã sản xuất một thiết bị phân tích PCR có độ nhạy rất cao gọi là Realtime-PCR (PCR thời gian thực hay còn gọi là PCR định lượng) cho phép phân tích với một nồng độ virus vô cùng thấp ở những sinh vật mới bị nhiễm bệnh. Kỹ thuật này đã khắc phục được thời gian chờ đợi virus sinh sản tới một nồng độ đủ cao để đảm bảo độ chính xác của phương pháp xét nghiệm. Phương pháp phân tích PCR đã được ứng dụng rất rộng rải để chẩn đoán bệnh ở người như sốt xuất huyết Dengue, viêm gan B, viêm gan C, Chlamydia... Và rõ ràng nó rất hữu ích trong việc ứng dụng để xét nghiệm các thực vật bị nhiễm bệnh virus, vi khuẩn hoặc vi nấm... 4. KIỂM ĐỊNH LÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CUỐI CÙNG TRONG QUY TRÌNH KHÉP KÍN Nếu trong qui trìn h làm sạch virus có thể áp dụng được kỹ thuật xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh phân sinh thì việc xét nghiệm virus chỉ còn là biện pháp kiểm tra cuối cùng của quá trình làm sạch virus , như vậy sẽ có mâu thuẩn với mục đích làm sạch virus nếu người ta xử dụng 50% cây trong tập đoàn cây trồng bị bệnh làm vật liệu ban đầu và coi chúng là những cây có phẩm chất tốt , một mặt thông qua cải tiến phương pháp xét nghiệm đưa độ chính xác của phương p háp lên cao người ta phải luôn tính để số lượng virus bảo tồn ở nồng độ tối thiểu mà phương pháp xét nghiệm không chứng minh được. Vì vậy , theo kinh nghiệm thực tế cần tiến phải xét nghiệm theo phương thức sau: Đưa vật liệu ban đầu vào xử lý nhiệt trong một thời gian dài để làm sạch những virus mẫn cảm nhiệt độ sau đó dùng phương pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh sau từ 4-6 tháng kể từ ngày nuôi cấy mới bắt đầu xét nghiệm thời gian này đủ để cho virus bảo tồn trong cây đủ nồng độ cho phép chứng minh được . Những cơ thể được xác định là sạch bệnh là nguồn vật liệu ban đầu để cung cấp cây mẹ cho sản xuất . Khoảng 5-10% số cơ thể này được tách riêng ra thành tập đoàn nhân mạnh khoẻ (health nucleus clone) 161 để các nhà tạo giống cải tiến tính chất theo ý muốn và độ thuần chủng (đồng nhất) của giống. Người ta kiểm tra những cơ thể này bằng tất cả các phương pháp xét nghiệm virus hiện có. Với hoa nelken người ta đã kiểm tra bằng phương pháp huyết thanh các loài virus caruation woltle , caruation latent, caruation ringspot... và xét nghiệm bằng cây chỉ thị Cheuopodium quinoa và Vaccara pyramydata nhằm loại trừ những vi rus ít sinh sản không có biểu hiện nhận biết được . Những cây xác minh được là khoẻ được tiến hành ươm cành rồi sau đó đưa vào xử lý nhiệt , tiếp theo nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và cuối cùng kiểm tra bằng xét nghiệm virus . Đó là toàn bộ qui trình làm sạch virus khép kín. Ngoài phương pháp và quá trình xét nghiệm thì kết quả làm sạch virus phụ thuộc nhiều vào trạng thái của cây cần được xét nghiệm , nghĩa là nồng độ virus có trong các bộ p hận khác nhau , tuổi khác nhau , mùa khác nhau . Muốn bảo đảm xét nghiệm hàng loạt chính xác thì cần phải có nhà nuôi cây. Nhiệt độ ổn định, tương quan ánh sáng ổn định và cây xét nghiệm phải cùng độ tuổi nhất định với nồ ng độ virus thích hợp cho xét nghiệm, cho phép thu được kết quả xét nghiệm chính xác. 5. DUY TRÌ TÍNH SẠCH BỆNH VIRUS Vấn đề có tầm quan trọng đáng kể và cũng là vấn đề quyết định cuối cùng đối với thực tiễn nông nghiệp liên quan tới thời gian duy trì được cây trồng sạch virus. Sau khi các mẫu nhiễm được tẩy sạch virus thì việc nhân nhanh giống sạch bệnh và duy trì độ sạch virus của giống là vô cùng quan trọng. Thông thường các cây hoặc củ sạch bệnh được tạo ra từ cây hoặc củ nuôi cấy mô phải được trồng trong điều kiện cách ly với các nguồn bệnh (trồng trong nhà màng, nhà lưới) và các vector truyền bệnh (rệp, bọ phấn, nhện…). Sau giai đoạn trồng trong nhà màn, nhà lưới thì có thể nhân nhanh các giống sạch bệnh ở các vùng cách ly xa với nguồn bệnh. Trong vùng cách ly, không được phép có mặt các cây bị bệnh hay các cây cùng họ mang bệnh và cách xa các vùng sản xuất thông thường. Mặt khác, vùng cách ly còn là vùng có mật độ côn trùng truyền bệnh thấp hoặc có tốc độ gió cũng như các điều kiện sinh thái khác không thích hợp cho sự di chuyển và sinh sôi của chúng. Ví dụ, vùng sản xuất khoai tây thường là các vùng ven biển như vùng Bretagne của Bắc Pháp, Hamburg, Rostock ở Bắc Đức. Để duy trì độ sạch cần tiến hành vệ sinh đồng ruộng, quan sát ruộng trồng liên tục, nhổ bỏ kịp thời các cây bị tái nhiễm virus. Đối với thực tiễn sản xuất thì cây được coi là bị bệnh chỉ khi nào năng xuất giảm xuống. Hiện nay, trong sản xuất nông nghiệp và trồng cây ăn quả vấ n đề này còn chưa được giải quyết thỏa đáng . Việc sản xuất dòng Elite trong qui trình sản xuất khoai tây giống kéo dài nhiều năm , trong khi đó nguy cơ tái nhiễm thông qua yếu tố truyền bệnh luôn tồn tại và phụ thuộc vào điề u kiện khí hậu. Trong ngành trồng hoa tình hình thuận lợi hơn nhiều . Hiện nay ở CHLB Đức với tập đoàn nhân (nucleus clone) của hoa cúc và nelken người ta duy trì được tính sạch bệnh trong một năm rưỡi, trong khi chỉ cần một n ăm là có thể thay được hoàn toàn tập đoàn giống . Vì vậy, vấn đề nêu ra ở trên có thể được trả lời tóm tắt như sau: khối lượng và chất lượng vật liệu có sẳn ban đầu xác định khả năng sản xuất một vụ không bị giảm năng xuất do bệnh virus. Giảm năng xuất có thể xuất hiện nếu nguồn giống sạch virus bị nhiễm sớm . Đối với khoai tây thì nhiễm chủ yếu do các yếu tố truyền bệnh sống ở điều kiện tự nhiên đối với cây hoa thì tái nhiễm xảy ra khi đưa cây giống sạch bệnh vào các xí nghiệp sản xuất bị nhiễm sẳn. Có thể nói rằng trong ngành trồng hoa qui trình làm sạch virus được 162 coi như mô hình phương pháp . Cũng qua đó có thể nhận thấy phương pháp làm sạch virus không phải là biện pháp chữa bệnh một lần mà là một quá trình phức tạp đối với cây trồng đã bị bệnh từ trước. Người ta có thể so sánh bệnh virus của thực vật nhân giống vô tính như bệnh xã hội của con người không thể chữa bằng thuốc men mà phải thay đổi cả thói quen sinh hoạt. Ở các xí nghiệp công nghiệp sản xuất cây trồng có thể gọi các tiến bộ khoa học kỹ thuật là một loại stress khi mà từ một cây cúc mẹ một năm cho 100 cây ươm, trước kia chỉ thu được 15 và một cây ươm chỉ cần 11 ngày để ra rễ trong khi trước đây cần 21 ngày. Để tạo điều kiện cho các xí nghiệp sản xuất công nghiệp cây giống thu được những thành tích to lớn hơn nữa thì việc đầu tư hàn g năm cho công tác chống bệnh virus trở nên cần thiết . Trong trường hợp nhân giống vô tính in vitro thì việc làm sạch virus càng phải được coi là điều kiện trước tiên. TÓM TẮT CHƯƠNG Các phương pháp làm sạch virus + Xử lý nhiệt: Dùng nhiệt độ cao để ức chế sự sinh sản của virus. Tùy từng loài chọn nhiệt độ thích hợp để đảm bảo mẫu nuôi sinh trưởng bình thường. + Nuôi cấy đỉnh phân sinh: Trong thực vật, đỉnh phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Vì vậy, sử dụng đỉnh phân để nuôi cấy để làm sạch virus. + Kỹ thuật vi ghép: ghép mô phân sinh đỉnh lên gốc ghép sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch bệnh virus. + Xét nghiệm virus: Xét nghiệm từ lúc tái sinh cây cho đến khi cây 4-6 tháng tuổi để các thể virus còn tồn tại trong thực vật đạt được nồng độ cần thiết cho việc xét nghiệm đảm bảo độ chính xác. Kiểm định là phương pháp kiểm tra cuối cùng trong quy trình khép kín: sau khi xét nghiệm virus phải tiến hành kiểm định . Duy trì tính sạch bệnh của virus: Sau khi các mẫu đã sạch bệnh virus thì tiến hành nhân giống và duy trì độ sạch virus của giống CÂU HỎI Câu 1: Hãy trình bày nguyên lý làm sạch virus và duy trì tính sạch bệnh virus? Câu 2: Hãy phân tích các phương pháp làm sạch virus? 163 Chương 10. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP Thực vật là nguồn cung cấp nhiều loại sản phẩm phục vụ đời sống loài người bao gồm thực phẩm, vật liệu, hương liệu, dược phẩm… Số lượng các hợp chất hóa học đã biết đến ở thực vật được đánh giá là nhiều gấp 4 lần so với giới Vi sinh vật. Trên thế giới, 121 các thuốc điều trị bệnh là bắt nguồn từ thực vật. Cho đến ngày nay, 75% dân số thế giới vẫn dựa vào các cây thuốc truyền thống. Rõ ràng, sự đa dạng di truyền của thực vật làm cho chúng trở thành một nguồn sản xuất các chất hóa học đầy tiềm năng. Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp (bậc 2) là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất, sau đó, chúng thoát ra khỏi tế bào đi ra môi trường ngoài. Phần lớn các sản phẩm thứ cấp thường không có nhiều ý nghĩa sinh lý đối với bản thân các tế bào. Quá trình tạo ra những sản phẩm thứ cấp chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa. Chúng còn là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường chung quanh, là sự thích nghi với stress của môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là các chất thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính: - Alkaloid: có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Đôi khi toàn thân chưa alkaloid, đôi khi chỉ tập trung trong lá (thuốc lá, chè, cacao), trong quả (thuốc phiện), trong vỏ (cây canh-ki-na, họ Rubiaceae), trong rễ (cây phụ tử, cây cà độc dược). Trong cùng một cây có thể tùy theo bộ phận của cây mà tạo ra những alkaloid khác nhau. Các alkaloid có các hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số tác dụng lên hệ thần kinh (caffein, atropin, strychnin…), một số tác dụng lên các cơ (veratrin, atropin…), một số tác dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin…), một số khác tác dụng lên bộ máy hô hấp (morphin…). Alkaloid thường độc với liều lượng lớn, nhưng với liều lượng nhỏ chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994). - Tinh dầu: chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung môi. Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước. Terpene được xây dụng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene, ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene (Lee 2001). - Glycoside: bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm (Lee 2001). Một số con đường có thể sản xuất hợp chất thứ cấp bao gồm: - Tổng hợp hóa học - Phát triển vùng trồng trọt các cây dùng để chiết xuất nguyên liệu - Sản xuất chất đồng hóa trong các cây trồng biến đổi gen - Sản xuất trong nuôi cấy tế bào. Ngoài kỹ thuật hóa học và kỹ thuật dược học đang phát triển một cách nhanh chóng và hiện đại thì thực vật bậc cao vẫn là một nguồn cung cấp các hợp chất hóa học 164 và dược liệu rất quan trọng . Tuy nhiên trong những năm gần đây sản lượng các thực vật đó rất khó đảm bảo ở mức ổn định do hậu quả của một số yếu tố như: - Điều kiện tự nhiên không thuận lợi. - Chi phí lao động ngày càng tăng. - Khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong trồng trọt. Phương pháp nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng) của thực vật có khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên . Những tiến bộ của kỹ thuật này trong những năm gần đây đã được nhiều công trình tổng kết. Nuôi cấy tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các chất tự nhiên có một số ưu điểm sau: - Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô. - Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản. - Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh. Thách thức lớn nhất đối với công nghệ tế bào thực vật là sự ổn định cho phép nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn và đạt hiệu suất tối đa cho sự tích lũy và sản xuất các hợp chất tự nhiên (hay còn gọi là các sản phẩm thứ cấp). Điều này có thể thực hiện bằng cách chọn lọc các kiểu gen thích hợp và các dòng tế bào có sản lượng cao, xây dựng các công thức môi trường dinh dưỡng hợp lý để nuôi cấy tế bào, thiết kế và vận hành các hệ thống nuôi cấy tế bào (bioreactor) hiệu quả. Chúng ta cũng có thể sử dụng kinh nghiệm và kiến thức có được từ nuôi cấy vi sinh vật để áp dụng cho nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, tế bào thực vật và vi sinh vật có một số đặc điểm khác nhau, vì thế cần phải cải biến và điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy cũng như cấu hình của nồi phản ứng (bioreactor) để tìm được các yêu cầu đặc thù của nuôi cấy tế bào thực vật. Một số đặc điểm chính khác nhau giữa tế bào thực vật và vi sinh vật: - Tế bào thực vật lớn hơn tế bào vi khuẩn hoặc vi nấm từ 10-100 lần. - Sự trao đổi chất của tế bào thực vật chậm hơn vì thế đòi hỏi phải duy trì một điều kiện vô trùng trong thời gian lâu hơn. - Tế bào thực vật có khuynh hướng kết thành một khối gây ra sự lắng đọng, có khả năng hòa trộn kém. - Các tế bào thực vật mẫn cảm dễ biến dạng hơn tế bào vi sinh vật. 165 - Quá trình sản xuất các chất thứ cấp ở tế bào thực vật phụ thuộc các cơ chế điều hòa phức tạp hơn so với các tế bào vi sinh vật. - Các tế bào thực vật có độ ổn định di truyền thấp hơn tế bào vi sinh vật. 1. NUÔI CẤY TẾ BÀO CHO NĂNG SUẤT CAO Nuôi cấy tế bào của nhiều cây dược liệu đã được tiến hành nhưng trong nhiều trường hợp người ta không tìm thấy hoặc thấy với lượng rất nhỏ (dạng vết) các hợp chất muốn có. Tuy nhiên, tới nay thực tế đã cho thấy có những thí nghiệm nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp thực vật với hàm lượng lớn hơn cả hàm lượng của các chất đó ở chính những bộ phận thực vật có nhiệm vụ tích trữ các hợp chất đặc biệt này . Câu hỏi đặt ra là tại sao chúng ta cần nghiên cứu sản xuất các chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật mà không phải chỉ đơn giản thu hồi các sản phẩm này từ các cây hoàn chỉnh, một số lý do chính được đề cập như sau: - Khó có thể cung cấp nguồn nguyên liệu một cách ổn định - Chi phí cao khi thu nhận trực tiếp từ thực vật - Nguồn nguyên liệu có sẵn không đủ để cung cấp. Những nhân tố ảnh hưởng đến khả năng thu nhận các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học là: - Số lượng chất thứ cấp thu hoạch được tính trên một đơn vị mô hay tế bào đưa đi chiết xuất. Nếu khả năng chiết xuất ở đối tượng là tế bào thực vật có hàm lượng tương đương hay cao hơn so với khi chiết xuất ở thực vật hoàn chỉnh, điều này cho phép hy vọng có thể sử dụng nuôi cấy tế bào thay thế cho cây hoàn chỉnh để thực hiện việc sản xuất các chất thứ cấp. Một số tác giả khi nuôi cấy mô của 16 loài thực vật (chủ yếu là các loài thực vật sản xuất các chất thứ cấp sử dụng trong y học) cho thấy hàm lượng các chất thứ cấp thu được tương đương như khi chiết xuất ở thực vật hoàn chỉnh. - Khả năng duy trì sự tổng hợp các chất thứ cấp qua nuôi cấy tế bào. Trong suốt quá trình nuôi cấy, có thể xuất hiện biện dị tế bào soma dẫn đến hàm lượng chiết xuất thấp, những dòng tế bào này được tái sinh và nhân liên tục và tạo ra dòng tế bào cho hàm lượng chất thứ cấp thấp. Có thể do các nguyên nhân sau: + Điều kiện nuôi cấy tế bào không thích hợp cho việc tổng hợp các chất thứ cấp + Điều kiện duy trì quá trình nuôi cấy làm xuất hiện dòng tế bào có năng suất thấp. Vì vậy để thu các chất thứ cấp cao cần phải: + Nuôi cấy những loài thực vật (giống cây trồng) có hàm lượng các chất chiết xuất cao + Phân lập và chọn lọc dòng tế bào có năng xuất cao và nhân liên tục những dòng tế bào này trong suốt quá trình nuôi cấy. + Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp thu nhận các chất thứ cấp cao nhất. - Sự cần thiết phải sử dụng cơ chất trong quá trình nuôi cấy để tăng hiệu suất thu nhận các chất thứ cấp. Điều này cho phép thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp ra các chất thứ cấp mới mà bản thân tế bào thực vật không có. Các chất thứ cấp có thể được tổng hợp trong các hình thái chuyên biệt khác nhau. Để các chất thứ cấp tích tụ trong tế bào, có 3 yêu cầu trong nội tại tế bào phải thỏa mãn: 166 - Tốc độ phân hủy các chất thứ cấp phải thấp hơn tốc độ tổng hợp - Những phản ứng sinh tổng hợp các chất thứ cấp phải được thực hiện - Có sự xuất hiện các chất trung gian trong quá trình sinh tổng hợp. Nuôi cấy đầu tiên được phân lập có chứa hàm lượng cao các sản phẩm thứ cấp đó là các nuôi cấy sản xuất ra các hợp chất sắc tố như anthocyanin tron g tế bào Haplopappus, betalain trong callus của củ cải đường hoặc anthraquinon trong tế bào của Lithospermum erythrorhizon, Morinda citrifolia và các loài Galium. Trong trường hợp của cây Morinda và Galium, người ta đã nâng được hàm lượ ng anthraquinon trong nuôi cấy tế bào lên 20 lần so với rễ là cơ quan tích trữ các hợp chất này của các cây nói trên . Kể cả khi người ta so sánh hàm lượng các chất trong tế bào và là tế bào chuyên sản sinh ra các chất đó thì hàm lượng ở tế bào nuôi cấy vẫn lớn hơn từ 2-4 lần. Hàm lượng tương đối cao của ubiquinon-10 được tìm thấy trong tế bào thuốc lá và L -dopa trong môi trường nuôi cấy tế bào Mucuna pruriens. Nhiều công trình cho thấy nuôi cấ y callus và tế bào của cây Catharanthus roseus có hàm lượng serpentin ngang với cây dược liệu bình thường. Người ta đã phân lập được các dòng tế bào Catharanthus sản xuất serpentin ajmalicin từ nuôi cấy in vitro. Bằng loại môi trường sản xuất đặc biệt họ đã đưa được sản lượng alkaloid của hai dòng tốt nhất lên một mức cao hơn nữa , trong đó một dòng tạo được 162 mg/L serpentin, còn dòng kia tạo được 72 mg/L serpentin cùng với 264 mg/L ajmalicin. Cũng rất đáng chú ý là nuôi cấy tế bào cây Panax pseudoginseng cho hàm lượng saponin khá cao và nuôi cấy tế bào của cây Glycyrrhiza glabra đạt được hàm lượng glycyrrhizin từ 3-4% trọng lượng khô . Hàm lượng chất thứ cấp cao nhất được xác định trong nuôi cấy tế bào của cây Coleus blumei, đó là 13-15% trọng lượng khô chất rosmarinic acid trong chu kỳ nuôi 13 ngày. Nồng độ rosmarinic acid trong tế bào nuôi cấy lớn hơn năm lần so với trong cây. Trên lĩnh vực steroid và chuyển hóa steroid các dòng tế bào có năng suất cao đã được nghiên cứu. Một số công trình đã nuôi cấy thành công tế bào của cây Dioscorea deltoidea với sản lượng diogenin là nguyên liệu thô chính để sản xuất các steroid chống thụ thai và các hormone thượng thận . Quá trình chuyển hóa các steroid được khá nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu. Chẳng hạn, nghiên cứu quá trình sinh chuyển hóa các hợp chất glycoside cardiac bằng nuôi cấy tế bào của Digitalis lanata mặc dù tế bào Digitalis lanata ngừng sản xuất glycoside cardiac nhưng chúng vẫn có khả năng hydroxyd hóa digitoxin ở nguyên tử C 12 để tạo ra digoxin. Digoxin là một hợp chất có ý nghĩa y học lớn hơn digitoxin. Quá trình hydroxyd hóa xảy ra trong nuôi cấy tế bào rất nhanh và rất hiệu quả khi đưa vào môi trường nuôi cấy chất β-methyl-digitoxin. Sau 12 ngày người ta thu được 4 g β-methyl-digoxin trong một bình nuôi dung tí ch 20 lít. Ngoài ra, người ta còn có thể thu được các chất như caffein từ nuôi cấy tế bào cây Coffea arabica, berberin từ tế bào cây Coptis japonica (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng đáng kể berberin trong rễ , song hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần bằng phương pháp nuôi cấy tế bào )... Những chất này được sử dụng rộng rãi trong công nghệ hương liệu và trong y học . Chất reserpin là chất có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và các bệnh rối loạn tu ần hoàn khác cũng được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy tế bào cây Rauwolfia serpentina. Nuôi cấy tế bào cây này trong 30 ngày có thể sản xuất được 3500 kg reserpin , tương đương với lượng hàng năm của cả thế giới thu được từ rễ cây đó. Chất naptathoquinones chiết từ rễ cây cỏ rễ máu (puccoon) được dùng để chữa bỏng và bệnh ngoài da . Chất này cũng được sản 167 xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô , sản lượng chất này được tạo ra từ mô nuôi cấy cao hơn tám lần so với cây tự nhiên. Các nhà nghiên cứu thuộc tổ hợp dược phẩm Gibageigy (Based, Thụy Sĩ ) đã sản xuất được loại alkaloid scopolanin từ tế bào cây Hyoscyanus aegypticus nuôi cấy trong hệ lên men không có cánh khuấy . Bằng cách chọn lọc các dòng tế bào cao sản nhờ kỹ thuật đột biến tế bào trần , biến dị đơn dòng và kỹ thuật gen , người ta đã làm tăng sản lượng scopolamin gấp ngàn lần. Tóm lại, nuôi cấy mô và tế bào thực vật có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp với năng suất cao và trong một vài trường hợp cao hơn hẳn so với những cây hoàn chỉnh có năng suất cao nhất. Bảng 10-1. Sự tích lũy các chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy mô và tế bào Loại nuôi cấy Các chất trao đổi thứ cấp Nguồn thực vật - Anthocyanins Cyanidin C Dimorphothica auriculata C Haplopappus gracilis C D. auriculata Alizartin C Morinda citrifolia Digitolutein C Digitalis lanata 4-hydroxydigitolutein C D. lanata 3-methyl purpurin C D. lanata Rhein C Cassia angustifolia C Ruta graveolens C, SC Phaseolus aureus C, SC Glycine max C P. aureus Delphinidin - Anthraquinones - Carotenoids Antheraxanthin Beta-carotene Lutein Lutein-5, 6 epoxide Neoxanthin Voilaxanthin Zeaxanthin - Chalcones and Deoxyflavones Daidzein 2’,4,4’-trihydroxy chalcone - Coumestanes và Coumarino 168 Loại nuôi cấy Nguồn thực vật Coumestrol C, SC P. aureus Pisatin C Pisum sativum Soyagol C, SC P. aureus SC G. max C Solanum dulcamara C Trigonella corniculata Artimissinine C Artemisia scoparia Chrysoerion SC Petroselinum hortense Isorhamnetin SC Argemone mexicana SC P. hortens Keempferol C C C C C C C Agave wightii Allium sativum A. scoparia Dolichos lablab G. max P. sativum Lycopersicon esculentum Luteolin C SC Datura pinnata Papaver hortense Negretin SC Solanum tuberosum Nobeletin C Citrus aurantinum Quercetin C SC C C C C C A. wightii Crotalaria juncea Datura metel D. taluta L. esculentum P. hortense S. aviculare Sinensetin C C. aurantium Các chất trao đổi thứ cấp chromans - Flavones và Flavanoids Apigenin - Naphthoquinones 169 Loại nuôi cấy Nguồn thực vật C Plumbago zeylanica C Yucca aloifolia Diosgenin C C C C S. aviculare S. dulcamara S. nigrum S. xanthocarpum Gitogenin C A. wightii Hecogenin C A. wightii Tiggenin SC S. nigrum SC C Andrographis paniculata Lindra strychinifolia C L. strychinifolia Các chất trao đổi thứ cấp Plumbagin - Sapogenins Chlorogenin Hecogenin Sarsasapogenin Smilagenin Tiggenin - Sesquiterpenes Cryophyllenebisabolene Lindenenol Linderane L. strychinifolia - Steroidal alkaloids Solasonine C S. xanthocarpu Tomatin C L. esculentumm Beta-amyrin C C Paul’s Scarlet Rose Tylophora indica Beta-sitosterol C Nicotiana tabacum Campesterol C C Withania sommifera D. metel C C C C Helianthus annuus Paul’s Scarlet Rose Trigonella indica T. foenum-graceum - Sterols và Triterpenes 170 Loại nuôi cấy Nguồn thực vật Cholesterol C, SC C, SC H. annuus S. indicum Cycloartinol C, SC N. tabacum Isofucosterol C, SC H. annuus Lanosterol C S. nigrum Obtusifoliol C, SC N. tabacum Stigma sterol C Dioscorea tokora Catechin C SC Camellia sinensis Paul’s Scarlet Rose Epicatechin C C. sinensis Các chất trao đổi thứ cấp - Tannins Chữ viết tắt: C: callus, SC: nuôi cấy dịch huyền phù (suspension culture) 2. PHƯƠNG HƯỚNG CHIẾN LƯỢC TRONG SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM THỨ CẤP BẰNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 2.1. Các tồn tại trong sản xuất các chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật Các tồn tại có thể tổng kết thành 3 nhóm chính - Các vấn đề về sinh học cần giải quyết bao gồm: + Cần phát triển các phương pháp phát hiện và đánh giá sản phẩm tốt hơn + Nâng cao được hiệu suất nuôi cấy + Nâng cao thể tích, quy mô nuôi cấy + Khắc phục hiện tượng tế bào bị mất khả năng tổng hợp chất mong muốn khi nuôi cấy kéo dài + Cải tiến các kỹ thuật thu hồi sản phẩm - Các vấn đề về kinh tế + Cần lựa chọn sản phẩm có giá trị cao để có thể mang lại lợi nhuận + Cần có thị trường tiêu thụ lớn + Cải tiến hệ thống để giảm chi phí. - Các vấn đề về xã hội: sự chấp nhận của người tiêu dùng với các sản phẩm thu hồi từ nuôi cấy tế bào so với các sản phẩm tự nhiên. 2.2. Chiến lược trong sản xuất các sản phẩm thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào Mặc dù trong nhiều trường hợp các hợp chất có giá trị chữa bệnh hoàn toàn thu được hoặc được sản xuất nhưng với hàm lượng rất nhỏ thì người ta vẫn có thể tổng kết chung được rằng : Mỗi tế bào đều có khả năng biểu hiện tính toàn thể hóa học cũng như hình thái học. Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức 171 cao hơn. Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao 2000, Dixon 1999). Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như (1) chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp, (2) chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, (3) bổ sung tiền chất nuôi cấy và (4) các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004). Bản chất của các tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro rất phức tạp mà chúng ta chưa hiểu hết được, việc đưa ra các cải tiến nhằm nâng cao hiệu suất nuôi cấy là cần thiết. Sau đây là một số chiến lược chung nhất có thể áp dụng nhằm cải tiến hiệu suất nuôi cấy của bất kỳ đối tượng nào: - Chọn lọc (selection), sàng lọc (screening) dòng tế bào: + Các biến dị luôn gắn liền trong nuôi cấy in vitro có thể trở thành nguồn vật liệu quý giá nếu như được kiểm soát. Tuy nhiên, khi nuôi cấy trên quy mô lớn, yêu cầu tiên quyết đặt ra là phải tạo được các dòng tế bào nuôi cấy ổn định và vì thế các biến dị không kiểm soát là không thể chấp nhận trong quy trình nuôi cấy sinh khối tế bào. Trong những giai đoạn đầu khi thiết lập nuôi cấy, sự sai khác sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu phong phú cho quá trình chòn lọc nhằm tạo được các dòng nuôi cấy sinh trưởng nhanh và có khả năng sản xuất các chất mong muốn cao và ổn định. + Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L. - Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy + Để đạt được hiệu quả kinh tế cao, các môi trường thích hợp cho từng đối tượng nuôi cấy là vô cùng cần thiết. Nếu sự sản xuất liên quan đến sinh trưởng của tế bào thì có thể chỉ cần phát triển một loại môi trường nuôi cấy cho cả quá trình mà vẫn đạt được hiệu quả sản xuất cao. Tuy nhiên, nếu nhiều sản phẩm được hình thành mà không liên quan đến sự sinh trưởng của tế bào thì cần phát triển các môi trường thích hợp cho từng giai đoạn. Các nghiên cứu về môi trường ngoài ra cần chú ý đến sự kết hợp cân đối thành phần, loại chất dinh dưỡng cũng như thể + Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, thể tích môi trường sẽ sử dụng và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và cs 1999). Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy. - Cung cấp tiền chất (precursor feeding). + Một trong những chiến lược quan trọng để tăng sản lượng là bổ sung những chất tiền thân đặc hiệu vào một con đường đồng hóa cụ thể để kích thích sự hình thành 172 một sản phẩm mong muốn có giá trị cao hơn. Việc sử dụng các gốc đồng phân tổng hợp vào các chất tự nhiên có thể dẫn đến sự tổng hợp một hợp chất hoàn toàn mới mà chúng có thể sử dụng làm dược liệu quan trọng. + Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy làm tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ. - Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation) + Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor – phát tín hiệu) giúp kích thích sự hình thành và tiết ra các hợp chất thứ cấp mong muốn. Ngoài ra, elecitor còn có khả năng định hướng để tạo ra những hợp chất hoàn toàn mới. + Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). Tuy nhiên, để sử dụng hiệu quả các elicitor, thông tin về các bước trong con đường cung như mạng lưới đồng hóa cần phải được làm sáng tỏ. - Sự tiết sản phẩm từ tế bào ra ngoài môi trường + Vị trí tích lũy cuối cùng của sản phẩm là một trong những thông số quan trọng của một quy trình nuôi cấy. Thông thường các sản phẩm thứ cấp của thực vật được tích lũy trong không bào. Tuy nhiên, có thể làm tăng khả năng sản xuất những chất này bằng cách kích thích cho chúng được tiết ra ngoài môi trường. + Sự tích lũy các sản phẩm thứ cấp bên trong tế bào đôi khi lại cản trở chính sự sinh tổng hợp ra chúng do các cơ chế điều hòa. Để cho những hệ thống tế bào thực vật cố định có thể hoạt động, điều cần thiết là phải làm cho một lượng lớn sản phẩm tiết ra ngoài môi trường. Một vài ví dụ chứng minh cho chiến lược chung mà chúng ta cần phải tuân theo để có thể có được các dòng tế bào có năng suất cao . Đầu tiên là cấy gây nuôi cấy tế bào của loài thực vật sản sinh ra hợp chất chúng ta cần có (nên chọn loài có năng suất cao) và sau đó tiến hành chọn tính ổn định của những dòng tế bào khác nhau từ những cơ thể khác nhau để tìm ra dòng có năng suất cao . Theo phương thức này những dòng tế bào có năng suất alkaloid cao đượ c chọn từ nuôi cấy mô của Catharanthus hoặc những dòng tế bào với hoạt tính hydroxyd hóa cao được chọn từ nuôi cấy của cây Digitalis. Tuy nhiên, những dòng tế bào Digitalis này cho đến thời điểm hiện tại vẫn không sản sinh ra cardiac glycoside. Kỹ thuật chọn dòng này cũng đã được ứng dụng để chọn ra dòng tế bào sản xuất ra nhiều nicotin từ một dòng tế bào của Nicotiana rustica đã mất hoàn toàn khả năng tổng hợp alkaloid. Phương pháp chọn dòn g này đã được cải tiến bằng cách kết hợp với những phương pháp phân tích có độ nhạy và tính đặc thù cao hơn , ví dụ miễn dịch phóng xạ . Mặc dù đó không phải là tiền đề cần thiết trong mỗi trường hợp . Đương nhiên, con đường tối ưu nhất vẫn là tìm ra được những phương pháp cho phép xác định những sản phẩm thứ cấp ở ngay trong tế bào sống , chẳng hạn thông qua các chất huỳnh quang UV hay chất có màu sắc nhận thấy được. Thế nhưng trong thực tế rất khó tìm ra 173 chất màu có khả năng thâm nhập vào không bào là nơi các sản phẩm thứ cấp được tích trữ để vẫn tạo ra phản ứng màu mà không làm chết tế bào. Sự phân lập các dòng tế bào chịu p -fluorphenylalanine, trong đó có một dòng có hoạt tính enzyme tăng lên và hàm lượng cao các hợp chất fenol tan trong etanol cho thấy một triển vọng khác trong việc chọn dòng tế bào. Đó là cách sử dụng các chất đặc biệt gây áp lực ch ọn lọc để ph ân lập những tế bào sản xuất dư thừa các sản phẩm thứ cấp thực vật điều đó có thể kiểm nghiệm với những nuôi cấy tế bào tạo alkaloid có nguồn gốc là các acid amin. Tuy nhiên, người ta cần thấy rằng việc sản xuất các amino acid đặc thù này không phải là yếu tố hạn chế duy nhất đối với quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp trong tế bào mà ở đây còn có nhiều yếu tố khác cần đề cập tới. Một bước tiếp theo là phải cải tiến qui trình nuôi cấy bằng cách thay đổi hợp lý môi trường , cũng như nhiều tài liệu đã thông báo người ta thay đổi hàm lượng hormone, đường, vitamin, nhiệt độ... Hàng loạt những biến đổi môi trường , điều kiện nuôi cấy hoặc thay đổi cả dòng tế bào cũng mới chỉ được kiểm nghiệm trong hệ thống kiểm định như phương pháp giọt nhỏ kết hợp với phương pháp miễn dịch phóng xạ. Nghiên cứu thay đổi môi trường nuôi cấy được cải tiến thêm một bước khi kỹ thuậ t nuôi chemostat (thể ổn định hóa tính) được ứng dụng. 3. TÍNH KHÔNG ỔN ĐỊNH CỦA CÁC DÒNG TẾ BÀO Một vấn đề khác được đề cập tới trong thông báo về nuôi cấy tế bào Catharanthus là tính không ổn định của các dòng tế bào đối với việc tạo sản phẩm thứ cấp. Một vài dòng mất khả năng tạo alkaloid ngay cả khi tiến hành bảo quản chúng. Vì thế, hiện tượng giảm năng suất không thể hoàn toàn loại trừ được. Khó khăn ngày càng trở nên lớn hơn khi đưa qui mô sản xuất lên dạng công nghiệp . Như vậy trước hết là phải tiến hành chọn lọc những dòng tế bào tỏ ra tương đối ổn định và tiến hành nghiên cứu cơ chế và nguyên nhân dẫn đến tính bất ổn định. Hiện nay, người ta cần tuân theo qui trình được ứng dụng trong ngành vi sinh vật học nhằm thu được những dòng tế bào có năng suất ổn định trong tất cả các giai đoạn nuôi cấy đồng thời để tránh mất hoàn toàn những dòng sản xuất này . Một số nghiên cứu cho thấy có những dòng tế bào chuyên tạo ra sắc tố có tính ổn định đặc biệt là những điều rất quan trọng trong vấn đề năng suất . Thế nhưng, xét về nghiên cứu di truyền cho đến nay thì chỉ mới có một công trình duy nhất phân tích số lượng nhiễm sắc thể của dòng tế bào tạo nhiều caroten và dòng không tạo caroten của cây Daucus carota và tác giả không tìm thấy sự sai khác giữa hai dòng này. Sự ổn định năng suất ở đây có thể do quá trình cấy chuyển, người ta chỉ cấy chuyển những khối callus có màu sắc đậm nhất, mặc dù việc làm đó hoàn toàn vô ý thức. Ngoài ra, người ta sẽ còn phát triển kỹ thuật bảo quản đông lạnh đạt tới trình độ cho phép tránh hoàn toàn sự xuất hiện những thay đổi do chính kỹ thuật đông lạnh gây ra. Phương pháp bảo quản bằng cách giảm phân chia tế bào trong nuôi cấy ở nhiệt độ 0oC là phương pháp có hiệu quả. Việc tái thiết được năng suất của dò ng tế bào Catharanthus nêu ở trên có thể được giải thích bằng hiện tượng tái biến song toàn bộ vấn đề mất đi và tái thiết năng suất sẽ được giải thích nếu những dòng tế bào được nghiên cứu là dòng epigenetic chứ không phải là những dòng genetic . Sự thật rằng tế bào thực vật nuôi cấy mang nhiều đặc điểm không di truyền đã được biết khá kỹ . Chỉ có một số ít trường hợp người ta chứng minh được rằng những thay đổi của dòng tế bào là do những đột biến cụ thể trong genome và plastome hoặc người ta chứng minh được có những sản phẩm gen thay đổi, ví dụ như enzyme thay đổi được tạo ra. Như vậy, việc sử dụng những dòng tế 174 bào epigenetic hoặc không di truyền làm p hức tạp hóa mục tiêu sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào. Thật không may mắn vì rất khó chọn được dòng tế bào không mang những thay đổi không di truyền vì rằng muốn chứng minh điều đó phải tái sinh cây hoàn chỉnh từ những dòng tế bào này và sau đó tiến hành kiểm tra nuôi cấy mô từ hạt hoặc cây thu được từ những cây hoàn chỉnh đó. 4. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ CÔNG TÁC TẠO GIỐNG CÂY DƯỢC LIỆU Trong mỗi trường hợp không nhất thiế t hoặc cũng không có thể tiến hành sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy mô tế bào. Phương thức tốt hơn vẫn là việc trồng trọt chính các loài cây này, việc cải tiến kỹ thuật canh tác , việc chọn lọc những loài hay dòng có năng suất cao và việc tạo ra các cây dược liệu thông qua con đường tạo giống nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể có những đóng góp quan trọng trong công tác tạo giống cây dược liệu. Nhưng vấn đề được đặt ra ở đây cũng hoàn toàn giống như đối với cây lương thực , trong cả hai lĩnh vực cây trồng đều có thể sử dụng những kỹ thuật hoàn toàn giống nhau. Kết quả dung hợp tế bào trần và tái sinh cây từ sản phẩm lai vô tính của hai loài Datura không lai được trong tự nhiên hứa hẹn triển vọng chuyển được thông tin di truyền từ một chi (genus) này sang một chi khác mà trong thực tế không thực hiện bằng lai tạo được. Cụ thể trong giai đoạn này phương pháp nuôi một tế bào hay một tế bào dung hợp đã được xây dựng hoàn chỉnh để chứng minh rằng trong tế bào nhân dị hợp của đậu tương và thuốc lá (N. glauca) bộ nhiễm sắc thể của thuốc lá vẫn tồn tại sau 3 tháng nuôi cấy và như quan sát đư ợc chúng vẫn phân chia đồng pha với bộ nhiễm sắc thể của đậu tương . Đối với hai loài gần nhau hơn , một loài là của Brassica và một loài là của Arabidopsis thì nhiễm sắc thể của cả hai loài đều tồn tại song song trong sản phẩm dung hợp , phân chia nhiều lần và chỉ có một vài thay đổi nhỏ xãy ra sau 6 tháng nuôi cấy. Những dẫn liệu hấp dẫn này chứng tỏ rằng kỹ thuật trên có triển vọng ứng dụng, mặc dù vậy vấn đề cần được giải quyết đó là: xây dựng những phương pháp phân tích có độ chính xác cao , tìm ra những phương pháp chọn dòng tế bào có hiệu quả đối với bất kỳ trường hợp đặc biệt nào, bảo đảm tính ổn định của dòng tế bào mới. Ví dụ Tabata và cs. (1977) phát hiện được rằng thế hệ S2 của những cây hạt phấn có thành phần alkaloid khác với cây bố mẹ. Điều đó có thể giải thích được rằng thành phần alkaloid của cây bố mẹ là kết quả của những tác động epigenetic. Một số vấn đề xuất hiện ngay trong quá trình ứng dụng các kỹ thuật, chẳng hạn một kết quả gây ngạc nhiên là ở điều kiện nuôi cấy nhất định các tiểu bào tử chưa giảm nhiễm có ưu thế ch ọn lọc mạnh hơn tiểu bào tử đơn bội , vì thế tác giả đã thu được nhiều cây dị hợp tử từ bao phấn khi tiến hành nuôi cấy một bao phấn kết quả này làm cho việc sử dụng qui trình kỹ thuật đơn bội thêm phức tạp , vì như vậy người ta phải kiểm tra toàn bộ những cây nhị bội thu được từ nuôi cấy bao phấn về tính đồng hợp tử của chúng nếu như cây được nghiên cứu không mang đặc điểm đánh dấu nào cả. Một kết quả không ngờ khác nữa là tất cả những cây thu được từ nuôi cấy một bao phấn của cây lai thuộc chi Hyoscyamus trở nên hoàn toàn đồng nhất về hình thái và hàm lượng alkaloid . Điều đó có nghĩa là trong tất cả các loài tổ hợp gen chỉ có một tổ hợp duy nhất đã phát triển thành cây hoặc là những cây đó xuất hiện thông qua quá trình tạo đa phôi thứ cấp như trường hợp ở Datura. Vấn đề chính cần nói tới trong đa số trường hợp nuôi cấy tế bào là những phương pháp được áp dụng ở đây còn mang nặng tính chất kinh nghiệm vì thế không 175 thể ứng dụng từ loài này cho loài khác. Điều đó có nghĩa là cho đến nay chúng ta vẫn chưa nắm vững nguyên tắc cơ bản một cách chặt chẽ. Vì vậy, chúng ta không thể đòi hỏi kết quả nhanh chóng trong lĩnh v ực này , đặc biệt là trong nghiên cứu ứng dụng . Chúng ta phải quan niệm công việc nghiên cứu chứa đựng nhiều tính chất tiếp cận cơ bản nhằm xây dựng những kỹ thuật mới trong di truyền , tạo giống và sinh lý thực vật và đồng thời mở ra những triển vọng có khả năng mới. Điều này cũng đang đúng trong nghiên cứu sản xuất chất thứ cấp mặc dù trong một vài trường hợp cụ thể việc ứng dụng sản xuất công nghiệp không còn xa nữa. 5. SẢN XUẤT DƯỢC CHẤT BẰNG NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở CÁC NƯỚC CÔNG NGHIỆP Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại. Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995). Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: - Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng - Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng) - Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau - Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999). Đối với các nước đang phát triển v iệc xuất khẩu cây dược liệu hoặc sản phẩm chiết xuất từ chúng có thể không tồn tại dài lâu. Lý do là chẳng bao lâu nuôi cấy tế bào sẽ trở thành một nguồn cung cấp thương phẩm các dược chất có nguồn gốc thảo mộc . Kỹ thuật tiến bộ về nuôi cấy tế bào đang được triển khai ngày càng rõ ràng ở các nước công nghiệp tiên tiến. Sản phẩm công nghiệp đầu tiên từ nuôi cấy tế bào là là shikonin được tập đoàn công nghiệp hóa dầu Mitsui (Nhật) sản xuất. Shikonin cũng là một vị thuốc dân tộc Nhật Bản dùng làm thuốc chống viêm. Năm 1983, Mitsui thông báo về quá trình phát triển kỹ nghệ sản xuất công nghiệp chất shikonin bằng nuôi cấy tế bào trong thùng lên men loại nhỏ 750 lít. Thành công bước đầu là chọn được một dòng tế bào tích lũy shikonin gấp mười lần nhiều hơn so với nguồn nguyên liệu tự nhiên ở cây Lithospermum erythrozhizon (koshikon) và xây dựng phương pháp hai giai đoạn để sản xuất shikonin từ nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, có năm vấn đề quan trọng hạn chế kỹ thuật nuôi cấy tế bào cho mục tiêu thương phẩm đối với một số chất có giá trị cao: 176 - Chọn được dòng thực sự có năng suất cao. - Điều khiển được tế bào tạo ra chất quan tâm. Gen mã hóa các sản phẩm hóa học đó thường chỉ hoạt động ở những điều kiện rất đặc biệt. - Nhiễm khuẩn và nhiễm nấm vì tế bào thực vật sinh trưởng chậm , xử lý kháng sinh cũng gây ra hậu quả cho sinh trưởng và tạo hoạt chất. - Sản phẩm không tập trung vì tế bào thực vật không tổng hợp chuyên một sản phẩm thứ cấp mà thường là kèm một số chất khác nữa. - Nuôi cấy tế bào thay đổi vì những biến độ ng trong tương tác các gen khác nhau và dòng năng suất kém có thể lấn át toàn bộ nuôi cấy. Mặc dù vậy, những đột phá trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào (ví dụ nuôi cấy rễ tơ) cho thấy trong tương lai gần bất cứu hóa chất công nghiệp nào có nguồn gốc thực vật cho dù đó là dược liệu , thuốc nhuộm hay chất màu thực vật đều có thể sản xuất trong các nồi phản ứng sinh học. 6. NUÔI CẤY RỄ LÔNG TƠ (HAIR ROOTS) VÀ SINH TỔNG HỢP Những vấn đề tồn tạ i trong nuôi cấy tế bào công nghiệp có thể được giải quyết thông qua kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ , cơ sở khoa học của giải pháp này là việc nhiễm callus với giống vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes khiến cho tế bào callus đồng nhất phân hóa thành rễ. Vi khuẩn này chuyển DNA của nó vào trong bộ gen của tế bào thực vật và khiến cho những gen tạo chất điều khiển sinh trưởng của rễ hoạt động. Hệ thống rễ đa bội bào là nơi lý tưởng để sản sinh ra hóa chất thực vật và chúng rất ổn định về di truyền , sinh trưởng nhanh (từ một đầu rễ nuôi cấy rễ lông có thể tăng trọng lượng từ 2500 - 5000 lần trong 3 tuần) mang lại cho nuôi cấy tế bào khá nhiều ưu điểm trong đó đáng k ể là khả năng tránh nhiễm khuẩn . Nhìn chung rễ tơ thường được sử dụng trong các hệ thống nuôi cấy vì những lý do sau: - Ổn định về di truyền, khả năng sản xuất các chất thứ cấp cao - Tăng trưởng nhanh, không phụ thuộc vào auxin - Phù hợp với các hệ thống lên men. Vì vậy, đây là một kỹ thuật dễ dàng sử dụng với quy mô công nghiệp Các công ty Nhật Bản đã xử dụng kỹ thuật này để mở rộng nuôi cấy rễ nhân sâm, loại nuôi cấy này tỏ ra dễ điều khiển hơn. Công ty Escagenetics (California, Mỹ) cũng đã thông báo thành công trong việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy rễ lông. Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của cây thủy tùng (Taxus brerifolia) đang được dùng thử có kết quả trong điều trị nhiều loại ung thư . Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp . Escagenetics đã có thể sản xuất taxol với nồng độ cao hơn nồng độ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thủy tùng. Hiện nay, hãng Phyton Catalytic (New York, Mỹ) đã mua bản quyền sản xuất toxol hoặc chất đồng đẳng của taxol ở qui mô pilot. Giá bán taxol hiện nay được xác định là 200.000 - 300.000 USD/kg. Theo Escagenetics việc sản xuất vanillin bằng nuôi cấy tế bào công nghiệp đã là bệ phóng tốt để họ đi tới nuôi cấy tế bào taxol. Thông qua mối quan tâm về sản xuất taxol hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp dược chất được mở rộng. Tới nay mới có 10 trong số các dược chất có nguồn gốc thực vật đang được xử dụng rộng rãi (khoảng 300.000 loài) được tổng hợp nhân tạo trong phòng thí nghiệm, số còn lại đều được chiết trực tiếp từ cây cỏ . Thế nhưng mới đây Văn phòng thương mạ i và bản quyền Mỹ đã cấp quyền tác giả cho ĐH Quốc gia Florida về qui 177 trình công nghệ bán tổng hợp thuốc chống ung thư . Công nghệ này kết hợp một chất gọi là baccatin III và một chuỗi tổng hợp để thu được một chất có cấ u trúc giống chất taxol tự nhiên. Baccatin III được tách chiết từ thủy tùng nước Anh , họ hàng với thủy tùng Địa Trung Hải . Công ty dược Bristol -Myers Squibb, nơi cung cấp taxol tự nhiên chính vừa ký hợp đồng bản quyền với ĐH Quốc gia Florida để đưa công nghệ sản xuất taxol vào sản xuất. Srinivasan và cs. (1997) đã nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của 2 loài thuỷ tùng là Taxus chinensis và T. baccata trong hệ thống nuôi cấy mô hình (model system ) nhằm chứ ng minh khả năng tương tự trong tích lũy sinh khối (biomass) và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp (taxane) thu từ nuôi cấy trong các đĩa polystyrene 6 ngăn (six-well polystyrene plates ) và các bình thủy tinh (loại 25 ml và 125 ml, lắc 120 vòng/phút). Merkli và cs . (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum với sự gây nhiễm chủng A 4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợ p (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040% trọng lượng khô (trên môi trường nuôi cây thích hợp nhất -McCown’s woody plant medium có 1% saccharose) gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A 4 8 tháng tuổi (0,024%). Các tác giả này cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol , pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin . Bổ sung 40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng. Sevón và cs . ( 1997) đã tái sinh cây từ protoplast của rễ cây Hyoscyamus muticus được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes và sau đó phân tích hóa học trên 34 cây riêng rẽ đã trưởng thành . Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây này có sản xuất hyoscyamine, scopolamine, và nhiều loại calystegin , và điều đáng kể là đã tìm thấy các biến dị dòng soma trong các cây này . Tuy nhiên, sự có mặt của các gen rol (A, B và C) của A. rhizogenes gây bất lợi cho việc tích lũy các alkaloid trong các cây chuyển gen ngược lại với ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ. Sikuli và cs. (1997), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối và sản lượ ng alkaloid của rễ tơ thu được sau khi gây nhiễm cây Datura stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834. Hàm lượng hyoscimine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy khoảng 100mg/l. Bên cạnh đó, các tác giả này còn nghiên cứu ảnh hưở ng của sự cân bằng ion ( NO 3- , SO 24- , H 2 PO -4 , K+, Ca2+ và Mg2+) đến sản lượng sinh khối và sự tích lũy hyoscyamine . Nồng độ NO 3- và K+ cao cho sinh khối cao nhất, còn sản lượng hyoscyanine cao nhất khi SO 24- và K+ cao. TÓM TẮT CHƯƠNG Thực vật cung cấp các sản phẩm thứ cấp gồm ba nhóm chính: alkaloid, tinh dầu, glycoside. Các kỹ thuật nuôi cấy nhằm kích thích sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy: + Chọn lọc, sàn lọc dòng tế bào 178 + Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy + Cung cấp tiền chất + Kích kháng bảo vệ thực vật Kỹ thuật nuôi cấy rễ lông tơ nhằm thu các hợp chất thứ cấp. CÂU HỎI Câu 1: Hãy phân tích vai trò của kỹ thuật nuôi cấy mô trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp. Câu 2: Hãy trình bày chiến lược sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Câu 3: Hãy phân tích những vấn đề có thể gặp trong sản xuất hợp chất bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. 179 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1]. Nguyễn Hoàng Bách (2010). Nghiên cứu chuyển gen LTB vào cây càng cua (Peperomia pellucida) bằng kỹ thuật vi đạn. Luận văn thạc sĩ, Đại học Huế. [2]. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2000), Di truyền phân tử, Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (2). NXB Nông Nghiệp. [3]. Trịnh Đình Đạt (2007), Công nghệ sinh học tập (4), NXB Giáo dục. Nguyễn Như Hiền (2007), Công nghệ sinh học tập (1), NXB Giáo dục. [4]. Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật [5]. Phan Thị Á Kim (2008). Thăm dò điều kiện thích hợp để chuyển gen ltb vào cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban). Luận văn thạc sĩ, Đại học Huế. [6]. Nguyễn Thị Duy Khoa (2007). Nghiên cứu phương pháp chuyển gen cholera toxin B subunit vào cây cà chua. Luận văn thạc sĩ, Đại học Huế. [7]. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình Nhập môn Công nghệ sinh học, NXB Đại học Huế. [8]. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi (2007), Giáo trình Sinh học phân tử, NXB Đại học Huế. [9]. Nguyễn Hoàng Lộc (2006), Giáo trình Công nghệ tế bào, NXB Đại học Huế. [10]. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2009), Giáo trình Công nghệ DNA tái tổ hợp, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh . [11]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TPHCM. [12]. Trần Văn Minh (2001), Công nghệ sinh học thực vật, Viện Sinh học nhiệt đớiTrung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ quốc qia. [13]. Dương Tấn Nhật (2007), Công nghệ sinh học thực vật (1), NXB Nông Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh. [14]. Hoàng Minh Tấn (Chủ biên), Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng (2006), Sinh lý Thực vật, NXB Nông nghiệp, 193-199. [15]. Nguyễn Quang Thạch,Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, 53-57. [16]. Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 180 [17]. Lê Thị Thính (2006). Nghiên cứu chuyển gen cholera toxin B subunit (ctb) vào cây trồng bằng phương pháp biến nạp Agrobacterium tumefaciens. Luận văn thạc sĩ, Đại học Huế. [18]. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật (1), NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. [19]. Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật (2), NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. [20]. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng (2007), Công nghệ sinh học tập 2, NXB Giáo dục, 32-35. 2. TÀI LIỆU TIẾNG ANH [21]. A.J.Nair, PH.D (2008), ”Introduction to Biotechnology and genetic engineering”. Infinity Sicence press LLC, India, 681-685. [22]. Bhojwani S.S and Razdan. MK (1996), “Plant tissue culture Theory and Practice”, Elsevier Science B.V, Netherland. [23]. De la Riva GA, González-Cabrera J, Vázquez-Padrón R, and Ayra-Pardo C (1998), "Agrobacterium tumefaciens: a nutural tool for plant transformation", Electronic Journal of Biotechnology 1(3), 1-16. [24]. Duchefa Biochemie B.V (2003-2005), “Biochemicals plant cell and tissue culture”, Catalogue. [25]. Edwin F. George and Michael A. Hall (2008), “Plant propagation by tissue culture”, Sringer. [26]. Jiang XL, He ZM, Peng ZQ, Qi Y, Qing C and Yu SY (2007), “Chorela toxin B protein in transgenic tomato fruit induces systemic immune in mice”, Transgenic Res 16, 169-175. [27]. Karl.H.N and Aswani. K.J (2009), “Plant cell and tissue culture- A tool in Biotechnology”, Sringer, Verlag Berlin Heidelerg. [28]. Lydiane Kyte and John Kleyn (2001), “Plants from test tubes-An introduction to micropropagation”, third edtion, Timber Press, Portland, Oregon. [29]. Murashige T and Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Plant Phylosiology 15, 473-497. 181 [30]. Peña Leandro (2004), Transgenic plants, Humana Press [31]. Ramaxhandra R.S and Ravishankar GA (2002), “ Plant tissue culture, Chemical factories of secondary metabolites”, Biotechology Advances, Elsevier Science, Netherland. [32]. Robert N.Trigino and Dennis J (2000), Plant tissue culture concepts and Laboratory excercises second 2, CRC Press LLC, 45-29. [33]. Sanjaya and Chan MT (2005), “Advances in Agrobacterium mediated transformation in tomato-an overview”, Journal of Genetics and Moleculer Biology 4, 211-224. 182 MỤC LỤC 183 Lời nói đầu ............................................................................................................. 1 Chương 1. GIỚI THIỆU VỀ TÍNH TOÀN THỂ CỦA TẾ BÀO ........................ 2 1. HỌC THUYẾT TẾ BÀO..................................................................................... 2 2. TÍNH TOÀN THỂ CỦA TẾ BÀO ...................................................................... 2 2.1. Tính toàn thể của tế bào.................................................................................... 2 2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào ................................................... 3 2.3. Tế bào thực vật và sự phân bào ...................................................................... 4 2.4. Thể bội và gen ....................................................................................................10 2.5. Thể bào tử và thể giao tử ở thực vật bậc cao ............................................ 11 TÓM TẮT CHƯƠNG ..................................................................................................11 CÂU HỎI ......................................................................................................................12 Chương 2. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG ............................................................. 13 1. NGUỒN DINH DƯỠNG KHOÁNG VÀ CARBON .......................................... 13 1.1. Các nguyên tố đa lượng ................................................................................. 14 1.2. Các nguyên tố vi lượng ....................................................................................16 1.3. Carbon và nguồn năng lượng ......................................................................18 2. CÁC PHỤ GIA HỮU CƠ ................................................................................. 19 2.1. Các vitamin .........................................................................................................19 2.2. Các acid amin .....................................................................................................21 2.3. Các phụ gia hữu cơ khác ................................................................................21 2.4. Than hoạt tính (activated charcoal-AC)...................................................... 22 2.5. Các kháng sinh (antibiotics) ..........................................................................23 3. CÁC CHẤT ĐIỀU KHIỂN SINH TRƯỞNG THỰC VẬT ............................. 23 3.1. Auxin (hormone sinh trưởng).......................................................................23 3.2. Cytokinin (hormone phân bào).....................................................................24 3.3. Gibberellin ..........................................................................................................25 3.4. Abscisic acid (ABA) ...........................................................................................25 4. CÁC NHÂN TỐ KHÁC..................................................................................... 25 4.1. Các nhân tố làm rắn môi trường...................................................................25 4.2. pH môi trường ..................................................................................................26 5. MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN ........................................................ 27 TÓM TẮT CHƯƠNG ..................................................................................................29 184 CÂU HỎI ......................................................................................................................30 Chương 3. NHÂN GIỐNG IN VITRO THỰC VẬT .................................................. 31 1. MỘT SỐ THUẬT NGỮ DÙNG TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO THỰC VẬT ........................................................................................ 31 1.1. Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem-tip culture) .................................... 31 1.2. Sinh sản chồi nách (axillary shoot proliferation) .................................... 31 1.3. Tạo chồi bất định (adventitious shoot induction) ................................... 31 1.4. Phát sinh cơ quan (organogenesis) ............................................................. 32 1.5. Phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis) ................................... 32 2. MỤC ĐÍCH CHUNG CỦA NUÔI CẤY MÔ ............................................................. 34 3. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC HỆ THỐNG NUÔI CẤY MÔ ................ 34 3.1. Tái sinh cây mới từ các cấu trúc sinh dưỡng ........................................... 35 3.2. Nhân giống thông qua giai đoạn callus ...................................................... 38 3.3. Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính-công nghệ phôi vô tính38 4. CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO ........... 45 4.1. Giai đoạn I-cấy gây ........................................................................................ 45 4.2. Giai đoạn II-nhân nhanh ................................................................................45 4.3. Giai đoạn III-chuẩn bị và đưa ra ngoài đất ................................................ 46 5. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ VIỆC SỬ DỤNG ƯU THẾ LAI ...................... 47 6. NHÂN GIỐNG IN VITRO VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM KHÔNG DI TRUYỀN ........ 47 6.1. Hiện tượng các đặc điểm epigenetic không lưu lại ................................ 47 6.2. Hiện tượng các đặc điểm epigenetic được lưu lại ................................... 47 TÓM TẮT CHƯƠNG ..................................................................................................48 CÂU HỎI ......................................................................................................................49 Chương 4. THỤ PHẤN IN VITRO VÀ NUÔI CẤY PHÔI HỮU TÍNH .......... 50 1. TÍNH BẤT HỢP CỦA GIAO TỬ TRƯỚC VÀ SAU KHI THỤ TINH ........ 50 1.1. Tính bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh ............................................. 50 1.2. Tính bất hợp giao tử sau khi thụ tinh .........................................................50 2. THỤ PHẤN IN VITRO .................................................................................... 50 2.1. Phương pháp học ..............................................................................................52 2.2. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro . 53 2.3. Ứng dụng của thụ phấn in vitro ....................................................................56 185 3. NUÔI CẤY PHÔI HỮU TÍNH ........................................................................ 56 3.1. Các kiểu nuôi cấy phôi .....................................................................................57 3.2. Kỹ thuật nuôi cấy...............................................................................................58 3.3. Môi trường dinh dưỡng .................................................................................58 3.4. Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi .......................................................... 61 3.5. Ứng dụng của nuôi cây phối hữu tính ......................................................... 61 TÓM TẮT CHƯƠNG ..................................................................................................62 CÂU HỎI ......................................................................................................................63 Chương 5. NUÔI CẤY BAO PHẤN VÀ HẠT PHẤN ...................................... 64 1. TÍNH ĐƠN BỘI CỦA THỰC VẬT .................................................................. 64 2. PHƯƠNG PHÁP TẠO THỂ ĐƠN BỘI IN VIVO ............................................ 65 2.1. Sinh sản đơn tính cái (gynogenesis) ............................................................ 65 2.2. Sinh sản đơn tính đực (androgenesis) ........................................................ 65 2.3. Sự đào thải hệ gen bằng lai xa ......................................................................65 2.4. Sự giao phối không hoàn toàn (semigamy) ............................................... 65 2.5. Xử lý hóa chất ....................................................................................................65 2.6. Shock nhiệt ........................................................................................................66 2.7. Ảnh hưởng của chiếu xạ .................................................................................66 3. PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐƠN BỘI IN VITRO .................................................. 66 3.1. Phương thức phát sinh cây đơn bội............................................................. 66 3.2. Các bước phát triển bình thường và phát triển phôi của hạt phấn..... 69 3.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn ...................................... 69 186 4. HIỆN TƯỢNG BẠCH TẠNG TRONG NUÔI CẤY ĐƠN BỘI ........................ 72 5. ỨNG DỤNG CỦA THỂ ĐƠN BỘI .................................................................. 72 5.1. Nghiên cứu về phôi học thực nghiệm ........................................................... 72 5.2. Nghiên cứu về tế bào học ................................................................................72 5.3. Nghiên cứu đột biến và di truyền .................................................................73 5.4. Cải thiện giống cây trồng.................................................................................73 6. NHỮNG TỒN TẠI TRONG NGHIÊN CỨU ĐƠN BỘI .................................. 76 6.1. Các vấn đề nảy sinh trong quá trình hình thành thể đơn bội ............... 76 6.2. Những vấn đề cụ thể.........................................................................................77 7. QUY TRÌNH TẠO CÂY ĐƠN BỘI THUỐC LÁ TỪ HẠT PHẤN PHÂN LẬP 77 7.1. Cảm ứng...............................................................................................................77 7.2. Nuôi bao phấn ....................................................................................................78 7.3. Tách và nuôi hạt phấn ......................................................................................78 TÓM TẮT CHƯƠNG ..................................................................................................78 CÂU HỎI ......................................................................................................................79 Chương 6. PROTOPLAST THỰC VẬT ............................................................ 80 1. GIỚI THIỆU VỀ PROTOPLAST ................................................................. 80 2. PHÂN LẬP PROTOPLAST............................................................................ 80 2.1. Các phương pháp phân lập protoplast ........................................................ 80 2.2. Nguyên liệu phân lập protoplast .................................................................. 83 3. NUÔI CẤY PROTOPLAST ............................................................................ 85 3.1. Môi trường nuôi cấy ..................................................................................... 85 3.2. Phương pháp nuôi cấy .................................................................................. 88 3.3. Tái sinh cây từ protoplast ............................................................................ 90 4. ỨNG DỤNG CỦA PROTOPLAST THỰC VẬT ........................................... 93 4.1. Chọn dòng tế bào .......................................................................................... 94 4.2. Dung hợp protoplast ..................................................................................... 94 5. CHỌN LỌC CÁC THỂ LAI SOMA .............................................................. 97 6. TỒN TẠI CỦA KỸ THUẬT PROTOPLAST .............................................. 100 6.1. Phân lập ....................................................................................................... 101 6.2. Điều kiện nuôi cấy ....................................................................................... 101 6.3. Sự phân bào ................................................................................................ 101 6.4. Sự phân hoá ................................................................................................. 101 187 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 101 CÂU HỎI ................................................................................................................... 102 Chương 7. BIẾN DỊ DÒNG SOMA .................................................................. 103 1. KHÁI NIỆM................................................................................................... 103 2. PHÂN LOẠI BIẾN DỊ DÒNG SOMA .......................................................... 103 2.1. Biến dị kiểu gene ......................................................................................... 103 2.2. Biến dị kiểu hình ......................................................................................... 103 2.3. Cơ sở phân tử của biến dị ........................................................................... 104 3. CÁC NGUYÊN NHÂN CHÍNH GÂY RA BIẾN DỊ DÒNG SOMA ........... 105 3.1. Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy ............................. 105 3.2. Tác động của các yếu tố trong quá trình nuôi cấy ..................................... 105 4. CHỌN LỌC BIẾN DỊ DÒNG SOMA........................................................... 106 4.1. Phương pháp chọn dòng ............................................................................. 107 4.2. Phân lập biến dị .......................................................................................... 107 4.3. Xử lý đột biến .............................................................................................. 117 5. BẢN CHẤT CỦA BIẾN DỊ DÒNG SOMA .................................................. 117 6. ỨNG DỤNG BIẾN DỊ DÒNG SOMA TRONG CÔNG TÁC GIỐNG CÂY TRỒNG ..................................................................................... 117 188 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 119 CÂU HỎI ................................................................................................................... 119 CHƯƠNG 8. BIẾN NẠP DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT ................................... 120 1. CÁC KỸ THUẬT CHUYỂN GEN .................................................................. 122 1.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium ....................................... 123 1.2.Chuyển gen bằng phương pháp bắn gen .................................................. 131 1.3. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng xung điện ................ 134 1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào protoplast bằng kỹ thuật vi tiêm ..... 135 2. SỰ HỢP NHẤT VÀ BIỂU HIỆN CỦA DNA NGOẠI LAI TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT ........................................................................................................ 135 3. MỘT SỐ KẾT QUẢ BIẾN NẠP Ở THỰC VẬT ............................................. 136 3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gen thành công ......... 136 3.2. Biến nạp gene nif............................................................................................ 142 4. TRIỂN VỌNG VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN ............................................... 143 4.1. Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ ................................................................. 143 4.2.Chuyển gen kháng sâu ................................................................................... 144 4.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus nhờ chuyển nạp gen protein vỏ virus .................................................................................................................................... 144 4.4. Chuyển gen tạo tính bất dục ở cây trồng ................................................. 144 4.5. Chuyển gen tạo giống hoa có kiểu và màu sắc mới ............................... 145 4.6. Chuyển gen thay đổi protein của thực phẩm và thức ăn gia súc ....... 145 4.7. Chuyển gen sản xuất các protein động vật vào thực vật ..................... 145 4.8. Chuyển gen sản xuất protein kháng nguyên vào cây trồng- vaccine thực phẩm ........................................................................... 146 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 147 CÂU HỎI ................................................................................................................... 148 Chương 9. SẢN XUẤT CÁC CÂY SẠCH BỆNH VIRUS ............................... 149 1. NGUYÊN LÝ LÀM SẠCH VIRUS VÀ DUY TRÌ TÍNH SẠCH BỆNH .... 150 2. LÀM SẠCH VIRUS Ở MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG ............................... 153 2.1. Cây khoai tây .............................................................................................. 153 2.2. Cây thức ăn gia súc ..................................................................................... 154 2.3. Cây hoa bia .................................................................................................. 154 2.4. Cây rau ........................................................................................................ 154 189 2.5. Cây ăn quả................................................................................................... 154 2.6. Cây hoa ........................................................................................................ 155 3. PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH VIRUS ......................................................... 155 3.1. Xử lý nhiệt ................................................................................................... 155 3.2. Nuôi cấy đỉnh phân sinh (meristem) .......................................................... 156 3.3. Kỹ thuật vi ghép (micrografting) ............................................................... 157 3.4. Xét nghiệm virus ......................................................................................... 157 4. KIỂM ĐỊNH LÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CUỐI CÙNG TRONG QUY TRÌNH KHÉP KÍN .......................................................................................... 159 5. DUY TRÌ TÍNH SẠCH BỆNH VIRUS......................................................... 160 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 161 CÂU HỎI ................................................................................................................... 161 Chương 10. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP ................................... 162 1. NUÔI CẤY TẾ BÀO CHO NĂNG SUẤT CAO .......................................... 163 2. PHƯƠNG HƯỚNG CHIẾN LƯỢC TRONG SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM THỨ CẤP BẰNG NUÔI CẤY TẾ BÀO .......................................................... 169 2.1. Các tồn tại trong sản xuất các chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật .. 169 2.2. Chiến lược trong sản xuất các sản phẩm thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào ... 169 3. TÍNH KHÔNG ỔN ĐỊNH CỦA CÁC DÒNG TẾ BÀO .............................. 172 4. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ CÔNG TÁC TẠO GIỐNG CÂY DƯỢC LIỆU ..................................................................................................... 172 5. SẢN XUẤT DƯỢC CHẤT BẰNG NUÔI CẤY TẾ BÀO Ở CÁC NƯỚC CÔNG NGHIỆP ................................................................................................ 173 6. NUÔI CẤY RỄ LÔNG TƠ (HAIR ROOTS) VÀ SINH TỔNG HỢP ........ 175 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 176 CÂU HỎI ................................................................................................................... 177 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 178 190 191 [...]... phải là hợp tử Chủng tế bào (cell strain): Chủng tế bào gồm những tế bào có đặc điểm riêng biệt được chọn từ nuôi cấy khởi sinh hay dòng tế bào có trước Thường phải nêu rõ nguồn gốc của chủng tế bào trong các công bố khoa học nhất là khi các chủng đó có nguồn gốc từ các phòng thí nghiệm khác Con lai tế bào soma (somatic cell hybrid): Tế bào hoặc cây hoàn chỉnh tạo được do lai tế bào trần với đặc tính... thể hiện tính toàn thể, các tế bào phân hóa đầu tiên phải trải qua sự phản phân hóa và sau đó là sự tái phân hóa Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau Sự phản phân hóa là sự trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ của các tế bào mô chuyên hóa Sự sinh trưởng của tế bào là nhờ vào sự phân bào 11 CÂU HỎI Câu 1: Vì sao... Phần trăm số tế bào đã tạo được dòng khi nuôi trải trên bề mặt môi trường Kỹ thuật vô trùng (aseptic technique): Quy trình ngăn ngừa sự nhiễm nấm, vi khuẩn, siêu vi khuẩn, hoặc các loại vi sinh vật khác đối với nuôi cấy mô và tế bào Lai tế bào (cell hybridization): Sự dung hợp hai hay nhiều tế bào không giống nhau để tạo một thể tế bào hỗn hợp Lai tế bào soma (somatic cell hybridization): Quá trình dung... tính di truyền khác nhau Dị bội (heteroploid): Tình trạng các tế bào trong phòng thí nghiệm nuôi cấy có bộ nhiễm sắc thể ở nhiều mức bội thể khác nhau Khái niệm này dùng như một cơ thể đa bào hay nuôi cấy gồm nhiều tế bào Dị nhân (heterkaryon): Một tế bào có hai hay nhiều nhân khác nhau ở trong một tế bào chung, thông thường là do dung hợp tế bào tạo thành Đỉnh sinh trưởng chồi ngọn (shoot apical meristem):... Phương thức nuôi tế bào đơn hay cụm tế bào ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng Nuôi cấy khởi đầu, nuôi cấy sơ cấp (primary culture): Nuôi cấy đầu tiên khi tách tế bào, mô hoặc mẫu vật từ cơ thể ban đầu tính đến khi cấy chuyển hữu hiệu lần đầu, từ đó sẽ thu dòng tế bào Nuôi cấy phôi (embryo culture): Duy trì và phát triển phôi non hoặc đã trưởng thành được phân lập từ hạt Nuôi cấy tế bào (cell culture):... khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình phức tạp vì: - Có những mối tương quan cần phải phá vỡ để lập lại những mối tương quan khác có thể đưa đến việc tái sinh cơ quan: - Gồm có các quá trình sau: + Sự phản phân hóa của những tế bào đã phân hóa, có thể dẫn đến sự trẻ hóa của tế bào + Sự phân chia tế bào, đôi khi tạo thành mô sẹo; khi tế bào phân chia thì bắt đầu xảy ra sự hình thành cơ...2.5 Thể bào tử và thể giao tử ở thực vật bậc cao Thể bào tử (sporophyte) gồm có hợp tử và tất cả các tế bào sản sinh từ hợp tử kể cả hạt phấn trong túi phấn và noãn Thể giao tử (gametophyte) gồm có hạt phấn đã nảy mầm và tất cả các tế bào do nó sinh ra, bao gồm các giao tử Khi hai giao tử khác giới dung hợp, thể bào tử 2n được tái lập ở thực vật bậc cao thể giao tử thường có không quá 3 tế bào, trong... thước nhỏ hơn và cũng có thể ra hoa, nhưng các bào tử hình thành không có sức sống Tạo thể bào tử đơn bội và những cây đơn bội kép là mục đích của nuôi cấy túi phấn và hạt phấn TÓM TẮT CHƯƠNG Thực vật là cơ thể đa bào Mỗi tế bào thực vật đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cơ thể hay tế bào có tính toàn thể Vì vậy, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp tế bào soma thực vật có thể phát triển thành cơ... không liên kết của các tế bào thực vật trong khối mô sẹo Mô sẹo xốp lỏng rất khó tái sinh cây hoàn chỉnh Dòng (clone): Tập hợp các thể nhân được bằng phương thức nhân giống vô tính từ một cá thể duy nhất 32 Dòng tế bào (cell line): Khái niệm để chỉ sự nuôi cấy của những tế bào có nguồn gốc chung từ lần cấy chuyển đầu tiên Già hóa (senesemce): Biểu hiện mất khả năng phân chia của tế bào và mô trong nuôi... chồi, lá, rễ từ tế bào, mô sẹo hay mẫu vật nuôi cấy Sạch bệnh (pathogen free): Được kiểm định là không mang mầm bệnh Sạch virus (virus free): Được kiểm tra bằng phép thử đặc hiệu chứng tỏ không mang virus đặc trưng cần phát hiện Tái sinh (regeneration): Hiện tượng tế bào hoặc mô nuôi cấy chịu tác động kích thích phân hóa thành mô, cơ quan hoặc cây hoàn chỉnh Tế bào trần (protoplast): Tế bào bị làm mất