Đang tải... (xem toàn văn)
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC 1.1. Khái niệm về công nghệ sinh học Có nhiều định nghĩa về công nghệ sinh học (Biotechnology), tùy theo từng tác giả khác nhau, nhưng tất cả đều thống nhất về khái niệm cơ bản sau đây: Công nghệ sinh học là sự sản xuất các sản phẩm trên quy mô công nghiệp, trong đó nhân tố tham gia trực tiếp và quyết định là các tế bào sống (vi sinh vật, thực vật, động vật). Mỗi tế bào sống củ a cơ thể sinh vật hoạt động trong lĩnh vực sản xuất này được xem như một lò phản ứng nhỏ. Vào những năm 1980, công nghệ sinh học đã chuyển sang một giai đoạn mới là là giai đoạn công nghệ sinh học hiện đại với việc sử dụng các thành tựu của kỹ thuật gen, là lĩnh vực công nghiệp sử dụng hoạt động sinh học của các t ế bào đã được biến đổi di truyền. Cơ sở sinh học được áp dụng ở đây bao gồm sinh học phân tử, sinh học tế bào, hóa sinh học, di truyền học, vi sinh vật học, miễn dịch học, cùng các nguyên lý kỹ thuật máy tính . Có hai cách định nghĩa công nghệ sinh học một cách tổng quát nhất: Do UNESCO (1985) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ sử dụng một bộ phận hay tế bào riêng rẽ của c ơ thể sinh vật vào việc khai thác sản phẩm của chúng. Do Trường Luật Stanford (1995) định nghĩa: Công nghệ sinh học là công nghệ chuyển một hay nhiều gen vào sinh vật chủ nhằm mục đích khai thác sản phẩm và chức năng của gen đó.
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014) Giảng viên: Ninh Thị Thảo 1/19/2013 BM CNSH TV – Khoa CNSH CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) Chức ứng dụng enzyme giới hạn Giới thiệu vector nhân dòng kỹ thuật nhân dòng gen Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome cDNA 1/19/2013 BM CNSH TV – Khoa CNSH Kiến thức ơn tập • Cấu trúc phân tử DNA 1/19/2013 Thành phần cấu tạo DNA- bazơ Purines 1/19/2013 Pyrimidines Nucleoside [structure of deoxyadenosine] Nucleotide 1/19/2013 ii) Structure the Structure of theofDNA DNA double chain helix polynucleotide 5’ 3’ • polynucleotide chain •1/19/2013 3’,5’-phosphodiester bond 1/19/2013 Học thuyết trung tâm:The Central Dogma DNA RNA Protein Function Replication Translation Work Transcription 1/19/2013 Phân loại Gene coding genes Chromosome intergenic non-coding region genes Messenger RNA Structural RNA Proteins transfer RNA Structural proteins 1/19/2013 ribosomal RNA other RNA Enzymes 2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE) Khái niệm: enzyme có khả nhận dạng cắt DNA vị trí đặc hiệu – Restriction enzymes = Restriction endonuclease Endo (bên trong), nuclease (cắt nucleic acid) – Trình tự nhận biết RE gọi trình tự giới hạn Ví dụ: trình tự nhận biết EcoRI 1/19/2013 BM CNSH TV – Khoa CNSH 10 Thư viện cDNA Tập hợp tất mRNA thu từ loại tế bào, giai đoạn phát triển khác tạo nên tập hợp cDNA tách dòng gọi ngân hàng cDNA tế bào Tổng hợp ngân hàng cDNA loại tế bào mô sơ quan ngân hàng cDNA quan Vì khơng phải tất gene thể hoạt động tế bào thời điểm chiết xuất mRNA, vậy, thư viện cDNA luôn nhỏ thư viện genome Nếu biết loại tế bào sinh protein nghiên cứu việc tách gene thơng qua khảo sát thư việc cDNA dễ dàng nhiều so với việc khảo sát thư viện genome Nguyên lý tạo cDNA Như theo định nghĩa, phân tử DNA tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ sợi RNA (chủ yếu mRNA) khuôn, nhờ enzyme chép ngược reverse transcriptase Như vậy, muốn tổng hợp cDNA cần phải tách mRNA khỏi RNA tổng số cần có tham gia enzyme chép ngược reverse transcriptase NHÂN TẾ BÀO Đoạn DNA gene TB nhân chuẩn Phiên mã mRNA sơ cấp Loại bỏ intron mRNA ỐNG NGHIỆM Mạch cDNA cDNA gene (khơng có intron) Tách mRNA từ tế bào bổ sung reverse transcriptase; tổng hợp mạch DNA Phân hủy mRNA Tổng hợp mạch DNA thứ Các bước tạo ngân hàng cDNA • Bước 1: Chuẩn bị mRNA • Bước 2: Tổng hợp cDNA • Bước 3: Tạo thư viện cDNA Các bước ngân hàng cDNA (tiếp…) • Bước 1: Chuẩn bị mRNA: – Tách chiết RNA tổng số – Tách mRNA khỏi hỗn hợp RNA tổng số dựa vào đặc điểm mRNA trưởng thành sinh vật nhân chuẩn có polyA đầu 3’.Có nhiều phương pháp để tách mRNA khỏi RNA tổng số VD: sử dụng sắc mang cellulose-oligo(dT), sử dụng hạt Mgoligo(dT)…(hình) Các bước thu mRNA từ hỗn hợp RNA tổng số sử dụng sắc ký cột mang cellulose-oligo(dT) Các bước thu mRNA từ hỗn hợp RNA tổng số sử dụng hạt Mg-oligo(dT) Các bước tạo ngân hàng cDNA (tiếp…) • Bước 2: Tổng hợp cDNA với tham gia enzyme chép ngược reverse transciptase nguyên liệu hóa chất cần thiết khác Bước gồm giai đoạn: (1) tổng hợp cDNA mạch đơn, (2) tổng hợp cDNA mạch kép Các bước tạo ngân hàng cDNA (tiếp…) • Bước 3: Nhân dịng cDNA Các cDNA nhân dòng tập hợp thành thư viện cDNA (xem lại nhân dòng gene) Một số phương pháp tạo cDNA Phương pháp tạo cấu trúc kẹp tóc • Dùng mRNA làm khn với có mặt enzym chép ngược (inverse transcriptase) với nguyên liệu (dNTP) để tổng hợp nên DNA bổ sung hay cDNA sợi đơn có cấu trúc kẹp tóc • Dùng enzyme RNase H (hoặc alkali) phân huỷ hoàn tồn sợi khn mRNA • Bổ sung DNA polymerase nucleotid tự để tổng hơp sợ cDNA thứ (phần móc cong trở thành primer cho DNA polymerase) • Xử lý với S1 nuclease để cắt bỏ đoạn có cấu trúc kẹp tóc thu phân tử cDNA có cấu trúc xoắn kép Phương pháp RACE • RACE (rapid amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA • Q trình chép ngược thực nhờ PCR (RT-PCR) nhân nhanh trình tự RNA thành dạng cDNA • Gồm quy trình: – Nhân nhanh đầu 5’ (5’ RACE) – Nhân nhanh đầu 3’ (3’ RACE) 3’ RACE • mRNA phiên mã ngược sử dụng mồi (dT17) c ó gắn neo đầu 5’ Neo mang trình tự cắt giới hạn để phục vụ cho nhân dịng • Q trình nhân nhanh thực nhờ (dT17) c ó gắn neo mồi đặc hiệu cho cDNA mục tiêu 5’ RACE • mRNA phiên mã ngược sử dụng mồi đặc hiệu • Sản phẩm cDNA sau kéo dài nhờ terminal transferase để tạo đuôi poly(dA) đầu 3’ cDNA • Q trình nhân nhanh thực nhờ mồi dT17 có gắn neo (oligo (dT17)/anchor system) tương tự quy trình 3’RACE mồi đặc hiệu So sánh thư viện genome thư viện cDNA Thư viện cDNA chứa trình DNA nhiễm sắc thể tự phiên mã mRNA khơng phải tồn bộ gene Phiên mã Thư viện cDNA khơng chứa tồn gene thể Cắt enzyme giới hạn mRNA sơ cấp Tạo Thư viện genome cần chứa tất Các đoạn mRNA DNA gene thể trưởng Nếu gen biểu mạnh thành mô, thư viện cDNA có mRNA thể chứa nhiều Nhân dịng DNA Phiên mã ngược gen Các gen khơng biểu nhân dịng cDNA biểu mức thấp khơng có mặt thư viện cDNA Thư viện genom thường chứa tất dịng gen gen xuất nhiều hệ gen Các dòng đoạn DNA Các dòng cDNA sinh vật thư viện genome thư viện cDNA Ứng dụng thư viện cDNA • Cung cấp trình tự cho phân tích, khuếch đại, nhân dịng thể gen • Thiết kế mẫu dị, mồi biết trình tự để cung cấp cho nghiên cứu, chuẩn đoán (lai, blot, PCR, trị liệu gen ) • Tổng hợp hoạt chất thơng qua điều khiển thể gen tế bào chủ đặc thù Ứng dụng thư viện cDNA • Xác định trình tự base phân tích gene • Thiết kế mẫu dò cho gene mục tiêu nhiễm sắc thể • Nghiên cứu biểu gene • Tổng hợp protein nhân tạo ... CNSH 19 Ứng dụng RE loại II công nghệ gen • Tạo DNA tái tổ hợp • Lập đồ giới hạn 1/19/2013 BM CNSH TV – Khoa CNSH 20 Tạo DNA tái tổ hợp • DNA tái tổ hợp DNA tạo thành từ hai đoạn DNA có nguồn... nạp vector nhân dòng sau phản ứng gắn vào tế bào sinh vật chủ để nhân đoạn DNA gắn với vector Chọn lọc, tập hợp đoạn gắn thành dịng riêng hình thành thư viện mẫu nhân dịng Từ chọn lọc trình tự... plasmid pUC BM CNSH TV – Khoa CNSH Nhóm plasmid pBR 4363bp “p” : plasmid “BR” : tên hai nhà khoa học F Bolivar R.Rodrigues “332”: số thứ tự BM CNSH TV – Khoa CNSH Nhóm plasmid pUC • • • Đây