Đang tải... (xem toàn văn)
... Phân tích đa dạng di truyền cá Bỗng sông, suối số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam thị phân tử - Đa dạng di truyền vấn đề phân loại học cá Bỗng sông, suối số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam CHƯƠNG... tài: Nghiên cứu đa dạng di truyền cá Bỗng sông, suối số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam phục vụ cho bảo tồn khai thác Kết đề tài sở để bảo tồn phát triển loài cá quí địa Mục tiêu nghiên cứu 2.1... mẫu cá Bỗng thu thập sông, suối số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam hình thái phân tử - Giải trình tự ADN vùng gen 16S, COI cá Bỗng Việt Nam Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền cá Bỗng sông, suối
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁ BỖNG Ở SÔNG, SUỐI MỘT SỐ TỈNH MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM PHỤC VỤ BẢO TỒN VÀ KHAI THÁC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Thái Thanh Bình PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết HÀ NỘI - 2015 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả được trình bày trong luận là hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào. Những kết quả có được trong luận văn là do sự cố gắng làm việc, nghiên cứu và học hỏi một cách nghiêm túc của bản thân. Những trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của tác giả khác, tài liệu sử dụng trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng qui định, tiện cho việc đối chiếu. Hà Nội, Ngày 15 tháng 7 năm 2015 Tác giả luận văn Triệu Anh Tuấn 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Xuân Viết – Trưởng Bộ môn Di truyền học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và TS. Thái Thanh Bình – Trưởng phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế – Trường Cao đẳng Thủy Sản, người Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Cho tôi xin gửi lời cảm ơn tới Th.s Nguyễn Thị Hiến cán bộ làm việc tại Phòng Công nghệ Sinh học – Trường Cao đẳng Thủy Sản đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cám ơn tới Trường Đại học Sư phạm Hà Nội – Bộ môn Di truyền học, Trường Cao đẳng Thủy Sản I – Phòng Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Hà Nội, Ngày 15 tháng 7 năm 2015 Tác giả luận văn 3 MỤC LỤC 4 DANH MỤC CÁC BẢNG 5 DANH MỤC CÁC HÌNH ĐDDT ĐDSH HST CTV ADN PCR UV PCR TBE RFLP RAPD 6 Đa dạng di truyền Đa dạng sinh học Hệ sinh thái Cộng tác viên Acid desoxyribonucleic Polymerase Chain Reaction Ultra Violet Polymerase Chain Reaction Tris Bonic acid Restriction Fragment Length Polymorphisms Random Amplified Polymorphic DNA MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cá Bỗng phân bố tự nhiên ở vùng trung và thượng lưu các sông lớn ở các tỉnh phía Bắc. Ở lưu vực sông Hồng cá phân bố tập trung từ Yên Bái trở lên, ở lưu vực sông Lô từ Tuyên Quang trở lên. Cá Bỗng còn có ở sông Lam, Con Cuông, Cửa Rào Nghệ An [13]. Cá Bỗng thích sống nơi nước chảy, ở tầng giữa và tầng đáy. Đây là loài cá nước ngọt có giá trị kinh tế cao, thịt cá thơm ngon, hiện nay giá cá Bỗng bán trên thị trường dao động từ 250.000 – 300.000 đồng/kg. Người dân nuôi cá Bỗng không chỉ vì mục đích kinh tế mà còn là loài cá cảnh. Những năm 1960 – 1970, cá Bỗng đánh bắt được chiếm chủ yếu trong sản lượng cá đánh bắt trên hệ thống sông Hồng. Cá Bỗng được đồng bào dân tộc sống ven sông Lô, sông Gâm, sông Thao, sông Chảy - nơi có nhiều cá Bỗng con đưa vào nuôi trong ao và lồng bè[16] [18]. Những năm gần đây do ảnh hưởng của môi trường suy thoái, việc đắp đập làm hồ thủy điện hoặc hồ thủy lợi đã làm cá Bỗng không di cư sinh sản được. Thêm vào đó là việc khai thác triệt để bằng các phương tiện hủy diệt như dùng xung điện, thuốc nổ... làm cho sản lượng cá Bỗng giảm sút nghiêm trọng. Hầu hết các sông suối thuộc hệ thống sông Hồng không còn vớt được cá Bỗng con để nuôi. Cá Bỗng vì thế thuộc diện cần bảo vệ khẩn cấp, cấp độ V liệt kê trong Sách đỏ và được IUCN liệt trong danh sách các loài cá quí hiếm cần được bảo vệ cấp độ LC. Nghiên cứu bảo tồn loài cá bản địa quí hiếm này là rất cấp thiết [49]. Mặc dù cá Bỗng đã được đưa vào nuôi phổ biến ở các tỉnh miền núi nhưng phân loại về loài cá Bỗng hiện còn nhiều điều chưa sáng tỏ. Một số nhà khoa học cho rằng ở Việt Nam có 4 loài trong giống cá Bỗng (Spinibarbus): Cá Bỗng (Spinibarbus denticulatus), cá Thần (Spinibarbus sinensis), cá Bỗng hồng (Spinibarbus sp.) và cá Bỗng thon (Spinibarbus nammauensis Hảo & Hiệp nov.sp). 7 Các nghiên cứu phân loại cá Bỗng ở Việt Nam chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái bên ngoài. Tuy nhiên hình thái ngoài của các loài động vật nói chung và cá nói riêng dễ thay đổi do điều kiện môi trường sống. Sự đa dạng của môi trường sống có thể tạo nên sự nhiều dạng hình thái khác nhau, điều này có thể dẫn đến những nhầm lẫn trong phân loại loài và số lượng loài cá Bỗng. Ngày nay các kỹ thuật phân tử được sử dụng rộng rãi trong phân tích mối quan hệ hệ thống giữa các nhóm động vật, định danh hoặc định phân loại các loài [44]. Kỹ thuật giải trình tự ADN cho ta những thông tin chính xác về trình tự các nucleotide trong phân tử ADN và các mối quan hệ huyết thống [52]. DNA ty thể (mtDNA) thường được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại và phát sinh hệ thống bởi các ADN ty thể có sự di truyền theo dòng mẹ, không bị trộn lẫn qua các thế hệ và tiến hóa nhanh (10 lần) hơn so với ADN ở trong nhân [52] [58] [59] [64]. Xuất phát từ lý luận và thực tiễn đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền của cá Bỗng ở sông, suối một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam phục vụ cho bảo tồn và khai thác”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở để bảo tồn và phát triển loài cá quí bản địa này. 2. Mục tiêu nghiên cứu. 2.1. Mục tiêu chung. Góp phần làm sáng tỏ vấn đề định loại loài và bước đầu đánh giá đa dạng di truyền cá Bỗng ở sông, suối các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam phục vụ cho mục đích bảo tồn và thác nguồn gen, phát triển nuôi trồng thủy sản loài cá Bỗng ở nước ta. 2.2. Mục tiêu cụ thể. - Phân loại được các mẫu cá Bỗng thu thập ở các sông, suối một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam bằng hình thái và phân tử. 8 - Giải trình tự ADN vùng gen 16S, COI cá Bỗng Việt Nam. Bước đầu đánh giá được sự đa dạng di truyền cá Bỗng ở sông, suối các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử. 3. Nội dung nghiên cứu. Đề tài luận văn thực hiện các nội dung chính sau: - Nghiên cứu phân loại cá Bỗng ở sông, suối một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam dựa trên các đặc điểm hình thái học. - Phân tích sự đa dạng di truyền cá Bỗng ở sông, suối một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử. - Đa dạng di truyền và vấn đề phân loại học cá Bỗng ở sông, suối một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam. 9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về cá Bỗng 1.1.1. Đặc điểm hình thái Cá Bỗng ở miền Bắc có thân dài, thấp, dẹp bên, lưng cong hơi tròn hoặc hình thoi, dẹp bên nhất là cán đuôi. Viền lưng và viền bụng cong tròn. Đầu vừa phải, sống đầu hình cung. Mõm tròn tù, hơi nhô ra phía trước. Da mõm không che lấp môi trên. Miệng ở cuối hoặc kề dưới, hình móng ngựa. Môi trên phía trong có viền liên tục ít hoặc không có, gờ ngoài tù hoặc trơn nhẵn. Môi trên và môi dưới liền nhau ở góc miệng. Có hai đôi râu to và dài. Râu hàm dài bằng 1,6-1,8 đường kính mắt. Rãnh sau môi dưới nông. Mắt vừa phải, gần mút mõm hơn viền sau nắp mang, khoảng cách trước ổ mắt nhỏ hơn khoảng cách sau ổ mắt. Khoảng cách hai mắt rộng, đỉnh đầu hơi lồi [16] [20]. Vây lưng của cá có khởi điểm ở trước hoặc sau khởi điểm vây bụng, có 3 – 4 tia đơn và 8 – 9 tia phân nhánh. Tia đơn cuối vây lưng là tia phân mảnh, cứng không hoàn toàn hoặc gai cứng hoàn toàn, phía sau trơn láng hoặc có gai răng cưa. Viền sau vây lưng lõm. Trước vây lưng có 1 gai mọc ngược hướng về phía đầu và ẩn dưới da. Vây hậu môn có 3 tia đơn và 5 tia phân nhánh. Vây ngực không chạm vây bụng. Vây bụng chưa chạm đến vây hậu môn. Vây đuôi phân thùy sâu, mút nhọn và tương đương nhau. Màng mang liền với eo mang. Lược mang cứng, nhọn. Răng hầu 3 hàng 2.3.5 – 5.3.2 hình dẹp bên và đỉnh hơi cong. Vẩy tròn lớn, sắp xếp đều. Đường bên hoàn toàn, hơi cong về phía dưới và chạy giữa cán đuôi. Hậu môn sát gốc vây hậu môn [20]. Gốc vây bụng có vảy nách, dài bằng 2/5 chiều dài vây bụng. Lưng cá màu xám, nhạt dần về phía bụng, bụng hơi vàng. Các vây màu xám, hai má hơi hồng. 1.1.2. Đặc điểm dinh dưỡng Cá Bỗng là loài cá ăn tạp, thức ăn chủ yếu là các loại thực vật bậc cao điển hình. Lúc còn nhỏ cá ăn động vật phù du, mùn bã hữu cơ, khi đạt kích cỡ 10 trên 6cm chúng mới có thể ăn thực vật thuỷ sinh. Cá càng lớn thể hiện càng rõ tính ăn thực vật; cá ăn thực vật, lá cây, quả. Theo nghiên cứu của Đoàn Văn Đẩu và Lê Thị Lệ [17] cá Bỗng ăn khoảng 25 loại cây khác nhau như: rau muống, bắp cải, dâu tằm, bèo.... Ngoài ra cá còn thích ăn các loại thức ăn công nghiệp như thức ăn viên, cám hỗn hợp trong điều kiện nuôi. 1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản Phạm Thị Minh Giang [18] đã mô tả phương pháp xác định tuổi của cá Bỗng dựa trên số vòng thể hiện trên vảy. Đối với cá Bỗng, vòng tuổi trên vảy thể hiện vừa có tính chất tiếp giáp giữa vòng vân xếp dày, thưa và vừa có tính cắt nhau giữa các vòng vân. Vòng tuổi thể hiện hoàn toàn rõ ở hai bên sườn vảy và vai vảy. Cá Bỗng hình thành vòng tuổi vào cuối mùa đông đầu mùa xuân. Cá Bỗng là loài cá có kích thước lớn. Chiều dài của cá có thể đạt gần 1m và nặng gần 15kg, con lớn nhất có thể đạt 30kg. Cấu trúc tuổi của quần thể khá phức tạp, tuổi thọ cao đến 15 năm [17]. Tuy nhiên, Phạm Báu [11] khi điều tra đã bắt gặp cá có độ tuổi 20. Tuổi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Chiều 15- 22,3- 24,2- 33,6- 39,4- 45,6- 51,5- 53,0- 58,6- 65,0- 70,2- 76dài 90,4 >93 17,5 24,7 28,0 40,4 48,7 52,2 61,7 68,2 75,0 72,0 83,2 87 (cm) (Nguồn lợi thuỷ sản Việt Nam, 1996) Tốc độ tăng trưởng của cá Bỗng thuộc loại trung bình. Cá tăng chiều dài nhanh ở hai năm đầu. Sự tăng trưởng nhanh về khối lượng bắt đầu từ năm thứ 3 sau đó chậm dần và thay đổi ít. Sau 1 năm tuổi cá đạt kích cỡ 672g, năm thứ 2 đạt 1500g và năm thứ 3 đạt 2135g. Tuổi thọ của cá là 15 năm. Sự tăng trưởng của cá đực chậm hơn cá cái khoảng 10,0-11,5cm. Ở tuổi 10-15 tăng trưởng chiều dài trung bình 4,3-5,4 cm/năm. Theo Phạm Báu [11] cá Bỗng sống trong điều kiện tự nhiên (sông Gâm) và cá nuôi trong lồng bè, ao trên cơ sở cùng tuổi có sự tăng trưởng về chiều dài khác nhau rõ rệt. Sự sai khác trên 11 chủ yếu do điều kiện thức ăn chi phối. Trong điều kiện nuôi trong ao tại Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ Sản 1, cá 1 tuổi đạt chiều dài 16,9cm và khối lượng 69,1g. Khi cá nuôi được 18 tháng tuổi, chiều dài đạt 26,0cm và khối lượng đạt 261g. Kết quả về tăng trưởng của cá nuôi tại Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ Sản 1 tương đương ở cá 3 năm tuổi thu ngoài tự nhiên. Chế độ chăm sóc và nguồn thức ăn bổ sung đối với cá Bỗng là rất quan trọng cho sự tăng trưởng của cá Bổng. Các bãi đẻ trong vực nước cạn ở vùng trung lưu sông Hồng, từ Yên Bái tới Lào Cai, như các bãi: Hợp Thành, Tân An, Phan Thanh, An Dương, Đông Thái... Ở sông Nậm Thi cá Bỗng đẻ ở Bản Quần, ở sông Lô chúng đẻ rải rác từ phía trên Vĩnh Tuy đến biên giới Việt – Trung [17]. Vụ đẻ thứ 2 cá thường vào các ngòi lớn như: Ngòi Bo (Sông Hồng), ngòi Mã (sông Lô) để đẻ. Bãi đẻ của cá Bỗng có địa hình đặc biệt, đáy có cát sỏi lớn, nước chảy mạnh (Lưu tốc nước khoảng 0,22-0,54m/s), nước có độ trong cao, chảy xiết – giàu ôxy hoà tan, pH hơi kiềm. Sau bãi đẻ là vực sâu cho cá trú ẩn và kiếm thức ăn. Tuy nhiên hiện nay do nguồn lợi bị suy giảm nghiêm trọng nên hầu hết các sông suối thuộc hệ thống sông Hồng không còn gặp cá Bỗng nữa, các bãi đẻ trước đây công bố cũng không còn nữa. Hiện nơi còn cá Bỗng đẻ nhiều hơn cả là đoạn sông Gâm từ Na Hang đến Bắc Mê, nhưng do bị đánh bắt nên cá đẻ không còn tập trung như trước đây. Đoàn Văn Đẩu và Lê Thị Lệ [17], khi nghiên cứu cá Bỗng đánh bắt từ tự nhiên đã phát hiện tuổi thành thục của cá Bỗng khá muộn, dao động từ 5 – 6 tuổi trở lên. Mùa vụ sinh sản của cá chia làm hai đợt từ tháng 2 đến tháng 6 và tháng 7 đến tháng 8. Cá Bỗng thường có lượng noãn hoàng từ 18 – 520g. Chỉ số thành thục từ 0,8 – 6,1. Khối lượng dịch hoàn 38 – 200g. Chỉ số thành thục từ 0,19 – 0,9. Trứng cá có vỏ dày, tròn căng, rời nhau, giàu noãn hoàng, 12 khi già có màu vàng đậm. Ngâm trứng trong dung dịch làm trong trứng thấy nhân bắt đầu lệch và di chuyển ra ngoại biên. Khi nghiên cứu sức sinh sản của cá Bỗng, Đoàn Văn Đẩu và Lê Thị Lệ [17] đã xác định được sức sinh sản tương đối của cá Bỗng trung bình đạt 6.700 trứng/kg, sức sinh sản tuyệt đối đạt 20.700 trứng/1kg cá cái. Cũng theo nhận định của các tác giả trên thì sức sinh sản tương đối và sức sinh sản tuyệt đối tỷ lệ thuận với khối lượng cơ thể cá. Cá Bỗng thành thục ở năm thứ 3 (2 + tuổi) khi trọng lượng tương ứng khoảng 2kg. Trong ao nuôi cá có tỷ lệ thành thục thấp 1,54 – 4,67%. Cá đẻ trứng dính vào các giá thể. Cá có thể đẻ 13.000 – 142.000 trứng/kg cá cái. Từ năm 1999, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 đã di giống cá Bỗng từ Tuyên Quang về Trại thực nghiệm nuôi trồng thủy sản Mê Linh, Vĩnh Phúc để nghiên cứu sản xuất giống, tuy nhiên số lượng cá giống sản xuất không nhiều và hiện nay không còn lưu giữ đàn cá bố mẹ do thiếu nguồn nước và môi trường bị ô nhiễm. Việc di giống cá Bỗng về đồng bằng nuôi trong điều kiện nước tĩnh là không có tính khả thi do cá ưa thích sống trong môi trường nước trong, sạch, giàu ôxy và có nước chảy. Chưa có công trình nghiên cứu đầy đủ về cá Bỗng, nhất là vấn đề bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen, mới dừng lại nghiên cứu sơ bộ về đặc điểm sinh học và vùng gen 16S, COI đã được ứng dụng và nghiên cứu thành công đối với một số loài cá ở nước ta như: cá Song, cá Trích... 1.1.4. Giá trị của cá Bỗng 1.1.4.1. Giá trị khoa học Việc nghiên cứu, đánh giá đa dạng loài cá Bỗng có vai trò quan trọng, trước hết nhằm mục đích bảo tồn loài cá Bỗng tránh nguy cơ tuyệt chủng đồng thời cung cấp nguồn gen cá Bỗng vào ngân hàng gen thế giới. 13 Từ đó đưa loài này vào phát triển, nhân giống nuôi đại trà cung cấp nguồn thực phẩm nhằm mục tiêu phát triển kinh tế địa phương. 1.1.4.2. Giá trị kinh tế Cá Bỗng là loài cá nước ngọt có giá trị kinh tế cao, chiếm sản lượng lớn trong sản lượng cá đánh bắt được ở trên hệ thống sông Hồng vào những thập kỷ 60 – 70 của thế kỷ trước [16] [20], đây là nguồn cung cấp thực phẩm có giá trị. Thịt cá Bỗng chắc, có tính lành và không có mùi tanh, thơm ngon có giá trị.giá trị dinh dưỡng cao. Giá cá bỗng trên thị trường hiện nay dao động từ 250.000 – 300.000 đồng/kg. Cá Bỗng mang lại giá trị kinh tế, do vậy việc phát triển nghề nuôi cá Bỗng thương phẩm có giá thành cao góp phần nâng cao đời sống đồng bào miền núi đặc biệt là người dân tộc thiểu số. 1.1.4.3. Giá trị tâm linh. Cá Bỗng hay còn gọi là cá Thần ở huyện Cẩm Thủy – Thanh Hóa không chỉ có giá trị về khoa học mà nó còn có giá trị về mặt tâm linh. Người dân Cẩm Thủy tin rằng duy trì loài cá này sẽ mang lại sự may mắn, phồn thịnh cho dân bản. Do yếu tố tâm linh tác động nên người ta không ăn loại cá này. Điều đó khiến cho đàn cá được bảo vệ và ngày càng nhiều lên, do vậy mà suối cá Cẩm Lương đến giờ đã phát triển thành 2 suối cá song song. Do những quan niệm của người dân ở Cẩm Thủy mà cá Bỗng ở đây mang ý nghĩa tâm linh đặc biệt góp phần vào việc bảo vệ đang dạng sinh học loài cá này. 1.1.5. Nghiên cứu cá Bỗng trên thế giới và Việt Nam Cá Bỗng phân bố tự nhiên ở châu Á, bao gồm: miền Bắc Việt Nam, Lào, Vân Nam và Hải Nam Trung Quốc. Cá Bỗng được nuôi từ lâu ở các nước như Trung Quốc, Lào và Việt Nam nhưng những công trình nghiên cứu khoa học về loài cá này công bố rất hạn chế. Các công trình công bố chủ yếu của các tác giả Trung Quốc. Các nghiên cứu tập trung điều tra các đặc điểm sinh học của cá Bỗng ở ngoài tự nhiên và các hình thức nuôi. 14 Ở Trung Quốc, cá Bỗng phân bố ở trung và thượng lưu sông Ngọc [54] [58]. Ngư dân thường đánh bắt được cá có cỡ trung bình từ 1 – 1,5kg và cỡ lớn nhất từ 5 – 8kg [67]. Wang [54] đã điều tra tuổi của cá Bỗng thành thục trên sông Ngọc thấy rằng cá cái thành thục ở 5 tuổi và cá đực thành thục ở 3 tuổi. Mùa sinh sản của cá từ tháng 4 – 6 hằng năm. Cỡ cá thành thục trung bình từ 11,5 – 29,5cm, cỡ cá cái thành thục và cá đực thành thục lớn nhất lần lượt là 69cm và 59,5cm. Tác giả đã mô tả được sự phát triển của tuyến sinh dục cái và đực của cá Bỗng. Một số nghiên cứu của Jiang [61] về mối quan hệ giữa tuổi và tốc độ sinh trưởng của cá trong điều kiện nuôi. Yi Zusheng nghiên cứu về sự phát triển phôi thai cá Bỗng. Luo [58] nghiên cứu mối quan hệ của sự phát triển phôi đến nhiệt độ và độ mặn. Tuy nhiên phía Trung Quốc không công bố chi tiết các nghiên cứu này. Đây là loài cá có giá trị kinh tế [68] và nó đã trở thành loài nuôi chính ở sông, hồ ao. Ở Việt Nam những nghiên cứu về cá Bỗng thực sự được bắt đầu từ năm 1960. Cá Bỗng là một phân họ lớn nhất trong họ cá chép (Cypridae) và có nhiều loài cá là nguồn cung cấp thực phẩm, mang lại giá trị và lợi ích kinh tế cao nhưng hiện nay, một số loài trong phân họ có nguy cơ diệt vong vì nhiều nguyên nhân khác nhau. Việc nghiên cứu hệ thống phân loại và tìm hiểu sự phân vùng địa động vật của phân họ là việc làm có ý nghĩa, chính vì thế đã có nhiều tác giả quan tâm và nghiên cứu như: Mai Đình Yên [42] công bố 50 loài 16 giống trong phân họ khu vực Bắc Việt Nam ; Nguyễn Thái Tự công bố 20 loài trong phân họ ở khu hệ cá sông Lam [37]; Nguyễn Văn Hảo công bố 99 loài thuộc 27 giống trong phân họ cá Bỗng của Việt Nam [20]; Nguyễn Hữu Dực công bố 15 giống 33 loài [14] ; Hoàng Xuân Quang công bố 12 loài ở khu vực Tây Bắc Nghệ An [27]; V.Kottelat công bố 10 loài trong phân họ [50], khu vực Bắc Trung Bộ đã điều tra được 10 giống. Tuy nhiên cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu đầy đủ về phân loại và đánh giá đa dạng di truyền cá 15 Bỗng phục vụ cho bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen. Các nghiên cứu chỉ mới tập trung điều tra nguồn lợi tự nhiên, một số đặc điểm sinh học và thăm dò sinh sản. 1.2. Đa dạng sinh học và tầm quan trọng của đa dạng quần thể Việc nghiên cứu đa dạng sinh học cũng như việc bảo vệ đa dạng sinh học và những vấn đề quan trọng, cấp thiết được rất nhiều nhà khoa học quan tâm. Theo Odum tỷ lệ giữa số lượng loài và các chỉ số phong phú (số lượng, sinh khối, năng suất...) gọi là chỉ số đa dạng về loài [49]. Theo Quỹ Bảo vệ thiên nhiên Quốc tế đã định nghĩa: “ĐDSH là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gen chứa đựng trong các loài và là những HST vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường’’. ĐDSH bao gồm 3 cấp độ: Đa dạng nguồn gen, đa dạng loài và đa dạng HST. Trong đó, đa dạng loài bao gồm toàn bộ các loài sinh vật sống trên Trái đất, từ vi khuẩn đến các loài động vật, thực vật và các loài nấm. Ở mức độ vi mô hơn, ĐDSH bao gồm sự khác biệt về gen giữa các loài, khác biệt về gen giữa các cá thể cùng chung sống trong một quần thể. ĐDSH còn bao gồm cả sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các loài sinh sống, và cả sự khác biệt của mối tương tác giữa chúng với nhau [5]. Theo luật ĐDSH năm 2008, ĐDSH là sự phong phú về nguồn gen, các loài sinh vật và HST trong tự nhiên [7]. Theo Công ước đa dạng sinh học thì ĐDSH là sự phong phú các sinh vật sống gồm các hệ sinh thái trên cạn, hệ sinh thái biển, các hệ sinh thái nước ngọt, và tập hợp các HST mà sinh vật chỉ là một bộ phận. ĐDSH bao gồm sự đa dạng trong một loài (đa dạng gen) hay còn gọi là đa dạng di truyền, sự đa dạng giữa các loài (đa dạng loài) và sự đa dạng hệ sinh thái (đa dạng HST). Nói cách khác ĐDSH là sự đa dạng của sự sống ở các cấp độ và các tổ hợp [6]. 16 Đa dạng sinh học còn là sự đa dạng của các sinh vật trên trái đất, bao gồm cả sự đa dạng về di truyền của chúng và các dạng tổ hợp. Đây là một thuật ngữ khái quát về sự phong phú của sinh vật tự nhiên, hỗ trợ cho cuộc sống và sức khoẻ của con người. Khái niệm này bao hàm mối tương tác qua lại giữa các gen, các loài và các hệ sinh thái [49]. ĐDSH trực tiếp phục vụ đời sống của con người trong phát triển kinh tế, góp phần xóa đói, giảm nghèo…. Những giá trị trực tiếp đó là giá trị sử dụng, tiêu thụ, và sản xuất ra các mặt hàng phục vụ nhu cầu của con người. ĐDSH và cảnh quan là nền tảng cho sự phát triển các dịch vụ hệ sinh thái, điều tiết nguồn nước, bảo vệ môi trường đặc biệt trong giảm nhẹ các tác động bất lợi do biến đổi khí hậu hiện nay [6] [7][8]. Như vậy đa dạng sinh học là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá đối với các thế hệ hôm nay và mai sau. Tuy nhiên, nguồn tài nguyên này đang bị thách thức bởi hiểm họa to lớn do các hệ sinh thái đang dần bị phá vỡ và tốc độ tuyệt chủng của các loài động thực vật ngày càng tăng. Sự tuyệt chủng của các loài động thực vật trước đây là do quá trình tiến hóa tự nhiên còn sự tuyệt chủng của các loài động thực vật ngày nay lại chủ yếu do hoạt động của con người gây ra với mức độ nghiêm trọng hơn bao giờ hết. 1.3. Điều kiện tự nhiên các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam 1.3.1. Địa hình Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam gồm các Tỉnh: Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La, Hòa Bình với tổng diện tích là 33.102,19 km 2 gồm các dãy núi phía Tây Bắc và đồi núi Đông Bắc. Phía Tây Bắc là một vùng gồm chủ yếu là các núi có độ cao trung bình và cao. Đây là nơi có địa hình cao nhất, bị chia cắt nhất và hiểm trở nhất Việt Nam. Các dạng địa hình phổ biến ở đây là các dãy núi cao, các thung lũng sâu hay hẻm vực, các cao nguyên đá vôi có độ cao trung bình. Dãy núi cao và đồ 17 sộ nhất là dãy Hoàng Liên Sơn với nhiều đỉnh cao trên 2500m, đỉnh núi cao nhất là Fansipan (3143m). Vùng đồi núi Đông Bắc gồm chủ yếu là núi trung bb nh và núi thấp. Khối núi thượng nguồn sông Chảy có nhiều đỉnh cao trên dưới 2000m là khu vực cao nhất của vùng. Từ khối núi này ra tới biển là các dãy núi hình cánh cung thấp dần về phía biển. Có bốn cánh cung lớn là cánh cung sông Gâm, cánh cung Ngân Sơn, cánh cung Bắc Sơn và cánh cung Đông Triều [69] [70]. 1.3.2. Khí hậu Khí hậu nhiệt đới chịu ảnh hưởng của gió mùa. Chế độ gió mùa có sự tương phản rõ rệt: Mùa hè chịu ảnh hưởng của gió mùa Tây Nam nóng khô, mưa nhiều, Về mùa đông chịu ảnh hưởng của gió mùa Đông Bắc lạnh, khô, ít mưa. Nhiệt độ trung bình trong năm nằm trong khoảng từ 22 0C – 250C. Sự phân hóa khí hậu theo địa hình ở các tỉnh miền núi phía bắc có sự phân hóa rất rõ theo địa hình: Vùng đồng bằng, trung du , đồi núi thấp và đồi núi cao. Lượng mưa: Miền núi phía Bắc có thể chia thành 2 mùa: Mùa hè nóng ẩm mưa nhiều và mùa đông lạnh và khô hạn. Lượng mưa cũng thay đổi theo độ cao của địa hình đồi núi Hướng gió: Mang tính chất chung khí hậu nhiệt đới gió mùa, vùng Tây Bắc có chế độ gió thay đổi theo mùa rõ rệt, chịu ảnh hưởng nhiều của hướng núi dãy Trường Sơn: gió mùa đông và gió mùa hè. Vùng Đông Bắc chịu ảnh hưởng của các dãy núi hướng Đông Bắc nên chịu ảnh hưởng của gió mùa Đông Bắc. Sự hoạt động của gió mùa đã tác động đến khí hậu. Gió mùa đông bắc làm cho nhiệt độ hạ thấp ở vùng núi cao kèm theo hiện tượng sương muối, sương giá. Gió tây nam vốn là luồng khí có hàm lượng ẩm cao, khi vượt qua dãy Trướng Sơn đã trở thành luồng gió khô nóng. Đó là gió Lào. Gió này làm nhiệt độ của vùng lên đến 39 – 41oC, độ ẩm chỉ còn 30 – 45% [69] [70]. 18 1.3.3. Hệ thống sông ngòi Các tỉnh miền núi phía Bắc Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La và Hòa Bình có hệ thống sông suối dày đặc chảy theo hướng của các dãy núi với nhiều con sông lớn như Sông Lô, sông Ngâm, sông Phó Đáy, sông Đà, sông Bôi, sông Bưởi, sông Mã với tổng chiều dài lên đến hàng ngàn km và diện tích lưu vực lên tới hàng trăn nghìn km2. 1.3.4. Đặc điểm nhân văn Hiện nay do được vận động và sự hiểu biết thì phần lớn dân cư trong vùng đã ổn định cuộc sống định canh, định cư, nhưng còn gặp nhiều khó khăn bởi dân tập trung sống trên địa hình núi cao, gặp nhiều thiên tai, ảnh hưởng đến đời sống dân trí. Con người những nơi này vẫn còn phụ thuộc nhiều vào nguồn tài nguyên thiên nhiên, sử dụng bất cứ nguồn lợi thiên nhiên nào để phục vụ cho mình. Cá là đối tượng thường được săn bắt làm thực phẩm, bị khai thác quá mức nên số lượng trong tự nhiên ngày càng giảm sút; nhiều loài có nguy cơ khó có thể phục hồi được. Hơn nữa hoạt động khai thác vàng, khai thác quặng than, sắt... làm ô nhiễm nguồn nước cũng là nguyên do cá giảm sút cả về sản lượng và số loài. 1.4. Tổng quan về ứng dụng di truyền phân tử trong thủy sản 1.4.1. Ý nghĩa của việc lựa chọn chỉ thị phân tử Sử dụng chỉ thị phân tử trong nông nghiệp và trong thủy sản có vai trò quan trọng. Trong chọn giống có thể phát hiện những cá thể có chứa một gen mong muốn trong quần thể phân ly dựa vào một đoạn ADN liên kết chặt chẽ với gen đó. Vì vậy, có thể đánh giá từng cá thể trong quần thể phân ly ở bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào, có thể chọn lọc cùng một lúc nhiều tính trạng mong muốn. Mặt khác dùng chỉ thị phân tử có thể làm tăng hiệu quả và độ chính xác trong việc chọn lọc các tính trạng mong muốn, loại trừ được sự tương tác giữa các alen của một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sử biểu hiện tính trạng. 19 Chỉ thị phân tử còn dùng để đánh giá đa dạng di truyền các quẩn thể sinh vật, đánh giá mức độ quan hệ giữa các cá thể. Từ đó có những biện pháp cần thiết để bảo vệ đa dạng sinh học các quần thể sinh vật … Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển nhanh chóng trong nghiên cứu bộ gen thì người ta đã dùng chỉ thị phân tử để thiết lập chi tiết các bản đồ gen về các chỉ thị phân tử liên kết với các gen quy định tính trạng quan trọng trong nghiên cứu thực vật, động vật và thủy sản. Trên cơ sở đó các nhà sinh học đã chọn lọc được các giống tốt gián tiếp dựa vào các chỉ thị phân tử liên kết được các gen quy định tính trạng mong muốn, đánh giá được độ đa dạng sinh học các quần thể sinh vật. 1.4.2. Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong nghiên cứu thủy sản ở Việt Nam Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử tạo vật liệu khởi đầu trong chọn giống ở Tôm sú, cá Tra tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, II và Viện Công nghệ sinh học... đã cho thấy những tiềm năng to lớn của việc ứng dụng công nghệ di truyền phân tử trong nuôi trồng thủy sản. Phạm Anh Tuấn và Nguyễn Hữu Ninh (2003), sử dụng chỉ thị Microsatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc thịt trắng và thịt vàng của cá Tra đã công bố sự sai khác về tần số alen và xuất hiện alen đặc trưng (alen F) ở locus Phy03 giữa hai loại cá có màu sắc thịt khác nhau, khoảng cách di truyền của hai loại cá thịt trắng và cá thịt vàng là khá lớn 0,145 [35]. Đào Thị Tuyết và ctv (2003) sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá đa hình di truyền 4 quần thể Cá Tra nuôi (Pangasius hypophthamus) ở Việt Nam được ký hiệu R (Trại bà Rô), D (Trại ông Dương), T (Trại ông Tường) và TN (quần thể tự nhiên). Kết quả đa hình RAPD với mồi A7 giúp phân biệt được quần thể R với D, T và TN ở chỉ thị băng ADN có kích thước 2400 bp, giữa các quần thể R, T với D, TN ở chỉ thị 2200 bp; Với mồi A8 giúp phân biệt được quần thể D với 3 quần thể còn lại ở chỉ thị phân tử lớn hơn 500 bp; D, R 20 với T, TN ở chỉ thị phân tử 1800 – 1900 bp; Với mồi 101 giúp phân biệt quần thể TN với các quần thể còn lại ở chỉ thị phân tử 1800 – 2200 bp ...[38]. Thái Thanh Bình và Christoppher Austin đã giải trình tự ADN vùng gen ty thể để đánh giá đa dạng di truyền của các quần thể cá chép đỏ thu từ các tỉnh Cao Bằng, Yên Bái, Bắc Kạn, Quảng Bình, Đắk Lắk, cá chép trắng, vàng thu từ Inđônêxia, cá chép vảy thu từ Hungari, cá chép đỏ thu từ Trung Quốc và cá chép Koi thu từ Nhật Bản cũng được giải trình tự để so sánh. Mặc dù hình thái gần giống nhau nhưng kết quả phân tích ADN cho thấy đa dạng haplotype cao 0,80 ± 0,17, kết quả phân tích cây phân loài cho thấy cá chép đỏ Đắk Lắk, Cao Bằng, Bắc Kạn có quan hệ gần gũi và khác xa với cá chép Quảng Bình và Yên Bái. Các dòng cá chép đỏ ở Việt Nam có quan hệ với cá chép vàng Inđônêxia nhưng khác xa với cá chép đỏ thu từ Trung Quốc, cá chép Koi của Nhật Bản và cá chép vẩy Hungari. Kết quả nghiên cứu bước đầu cung cấp thông tin quan trọng cho việc định hướng bảo tồn các dòng cá đỏ bản địa [45]. Bên cạnh những thành công của việc ứng dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu Cá thì những thành công của việc ứng dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu Tôm phải kể đến: Quyền Đình Thi [34] sử dụng chỉ thị Microsatellite, mtRFLP và RAPD để phân tích đa hình ở 20 mẫu Tôm Sú (Peneaus monodo) đã phát hiện 20 kiểu gen khác nhau với giá trị thông tin đa hình (PIC) luôn lớn hơn 0,5. Phân tích RFLP của hai phân đoạn 16S rARN và 12S rARN của mtADN cho thấy tính đa hình thấp. Sử dụng chỉ thị Microsatellite để đánh giá đa hình 3 quần thể Tôm Sú nuôi ở Việt Nam, quần thể I có nguồn gốc ở Miền Bắc, quần thể II có nguồn gốc ở Miền Trung và quần thể III có nguồn gốc nhập ngoại từ Singapore, Nguyễn Thị Thảo đã báo cáo đa hình của 6 locus CSCUPmo1, CSCUPmo2, 21 CSCUPmo3, CSCUPmo4, CSCUPmo5, CSCUPmo6. Tính đa hình trong mỗi quần thể là rất cao với giá trị thông tin đa hình (PIC) lớn hơn 0,829, tính đa hình giữa các quần thể lớn hơn 0,913. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể trong khoảng 0,4693 – 0,7268 [34]. Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm sử dụng chỉ thị Microsatellite và RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 2 quần thể Tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp mồi Microsatellite và 5 cặp mồi ngẫu nhiên RAPD. Kết quả chỉ có một vệt băng cho tất cả 6 mồi Microsatellite giữa Tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc. Tuy nhiên kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD lại cho thấy sự khác biệt di truyền giữa 2 quần thể Tôm với trung bình 14,9 alen ở Tôm càng xanh Trung Quốc và 12,9 alen ở Tôm càng xanh Việt Nam, đa dạng haplotype ở Tôm càng xanh Trung Quốc là 0,84 – 0,88 và 0,86 – 0,88 ở Tôm càng xanh Việt Nam [35]. Trần Thị Thúy Hà và ctv sử dụng 5 chỉ thị Microsatellite để đánh giá đa dạng di truyền với 2 phản ứng PCR đa mồi áp dụng trong 5 quần thể Tôm thẻ chân trắng (Litopennaeus vannamei) nuôi ở Việt Nam. Số alen trên mỗi vị trí Microsatellite dao động từ 6 – 8 alen và có alen xuất hiện với tần số thấp (nhỏ hơn 0,1). Giá trị dị hợp tử quan sát (Ho, dao động từ 0,21 – 0,50) thấp hơn so với dị hợp tử mong đợi (He, dao động từ 0,41 – 0,72). Giá trị tương đồng (Fis) trung bình dao động khoảng 0,18 – 0,40 và cao ở 2 vị trí TUMXL v6.23 và Lvan 01 trên các quần thể đạt 0,446 – 0,496. Giá trị Fst đạt ở mức trung bình 0,054 – 0,185 và không thể hiện sự sai khác lớn về di truyền giữa các quần thể [19]. 1.4.3. Giải trình tự ADN ở ty thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Các nghiên cứu trên ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có những đặc trưng riêng, phân biệt với hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng mẹ, có từ vài trăm đến vài nghìn bản copy trong một tế bào. Phân tử ADN ty thể mạch vòng, kép, có kích thước nhỏ nên tồn tại lâu, số lượng 22 bản sao lớn, bền vững hơn ADN nhân khi tách chiết và lại chứa các gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào do vậy mà ADN ty thể được coi là đối tượng lý tưởng đển nghiên cứu hệ gen phục vụ cho phân loại. Các gen trong ty thể có hệ số biến đổi nhanh hơn hệ gen trong nhân tế bào từ 10 – 15 lần nên rất thuận lợi cho việc nghiên cứu về tiến hóa và đánh giá đa dạng di truyền. ADN ty thể được ưu tiên sử dụng trong giải trình tự để xác định đa dạng sinh học và biến động di truyền của sinh vật bởi vùng mã hóa lớn, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ [66], cho kết quả nhanh, chính xác, thu mẫu không gây hại tới động vật và số lượng bản sao lớn [66]. ADN nhân di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn ADN nào đó trở nên rất khó khăn. Trong khi đó, ADN ty thể di truyền theo dòng mẹ, nên có thể hạn chế trường hợp này [60]. Sự tái tổ hợp (recombination) trên ADN ty thể thường không xảy ra, nên sẽ không hình thành các đoạn ADN tái tổ hợp [52]. Một tế bào chứa vài trăm ty thể, mà một ty thể chứa hàng chục bản sao bộ gen của nó. Vì vậy, trong một tế bào có thể chứa được hàng ngàn bản sao của bộ gen ty thể, nhưng bộ gen nhân thì chỉ có hai bản sao. Hơn nữa, ở ADN nhân, vùng không mã hóa chiếm tới 93%; trong khi ở ADN ty thể, vùng không mã hóa chỉ chiếm 3% [66]. Các vùng không mã hóa này sẽ làm cho quá trình giải trình tự thêm phức tạp vì đôi khi cần phải tạo dòng để thu được đoạn gen mong muốn [64]. Việc khuếch đại các đoạn gen của ADN ty thể chỉ cần một số lượng giới hạn các đoạn mồi. Trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen cytochrome oxidase subunit 1 (CO1) của ADN ty thể có thể định danh được đến loài ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật ngoại trừ ngành ruột khoang Cnidaria. ADN ty thể là một công cụ đắc lực trong xác định các loài, 23 đánh giá mối quan hệ của các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyền trong công tác bảo tồn các loài đang bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng. Tuy nhiên, việc sử dụng ADN ty thể cũng có một số giới hạn. Kích thước của ADN ty thể nhỏ, nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền. Tỷ lệ đột biến ở ADN ty thể cao hơn ADN nhân, trong khi đó kích thước ADN ty thể lại nhỏ, nên đột biến có thể dễ dàng xảy ra mà không phản ánh được mối quan hệ phát sinh loài hay lịch sử tiến hóa. Hơn nữa, việc không tuân theo quy luật di truyền của Mendel không phù hợp với nhiều nghiên cứu di truyền. Người ta đề nghị nên sử dụng kết hợp các chỉ thị phân tử để có kết quả với độ chính xác cao. Các marker ADN ty thể được sử dụng kết hợp với marker ADN nhân trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn. ADN ty thể được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong xác định các loài, đánh giá mối quan hệ của các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyền trong công tác bảo tồn các loài đang bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng [66]. 1.4.4. Vùng gen 16S và COI. Vùng gen 16S từ lâu được biết đến như là thước đo về sự biến đổi trong hệ gen của các sinh vật. Ribosome ty thể 55S ở động vật gồm tiểu đơn vị lớn 16S và tiểu đơn vị nhỏ 12S. Vùng gen 16S và COI có chức năng cần thiết cho sự sống đồng thời nó vừa có vùng bảo tồn, vừa có vùng biến động ở các cấp độ khác nhau giúp cho gen 16S và COI luôn là sự lựa chọn trong việc xác định loài, đánh giá mức độ đặc trưng cho loài. Bên cạnh đó, số lượng trình tự 16S và COI được nghiên cứu rất chi tiết và nhiều trình tự của các loài, giống đã được giải mã, công bố trên ngân hàng gen. Sự tiến hóa và biến đổi của các vùng gen là rất thấp. Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt quá trình tiến hóa nên các vùng gen 16S và COI được dùng để giải trình tự giúp cho việc phân loại, xác định mối quan hệ giữa các loài và đánh giá đa dạng di truyền [22]. 1.4.5. Những nghiên cứu liên quan đến vùng gen 16S và COI trong lĩnh vực thủy sản. 24 Nguyễn Anh và ctv đã xác định được trình tự gen 16S rADN và gen Cytb hệ gen ty thể của 8 loài cá song có giá trị kinh tế cao thu thập tại vùng biển Việt Nam, phân tích tỉ lệ tương đồng và mối quan hệ phả hệ với 16 loài của thế giới. Tám loài nghiên cứu được phân thành 2 nhánh, nhánh 1 bao gồm các mẫu ở Hải Phòng, Nha Trang và Đồng Nai ( EpHP, EpS1, EpS2, EpS5, EpS9, EpS10) có độ đồng nhất 100% với các loài cá Song Trung Quốc thuộc loài E. coicoides. Hai mẫu cá Song Hải Phòng (EpS3, EpS8) thuộc nhánh 2, không phải là loài E. Coicoides [1]. Thái Thanh Bình 2009, đã nghiên cứu phân loại cua xanh (Scylla sp) dựa trên trình tự ADN vùng gen Cytochrome oxdase subunitl (COI) đối với 33 mẫu cua xanh được thu từ 10 tỉnh ven biển Việt Nam và Úc. Trình tự ADN của cua xanh Việt Nam cũng được so sánh với trình tự DNA của cua xanh ở các nước Trung Quốc, Úc và Inđônêxia. Kết quả nghiên cứu cho thấy vùng gen COI rất hữu hiệu trong việc nhận dạng 4 loài cua xanh có ở Việt Nam: Scylla paramamosian, S. Serrata, S. Olivacea và S. Tranquebaria. Loài Scylla paramamosian là loài gặp phổ biến nhất. Kết quả nghiên cứu góp phần quan trọng trong việc xây dựng hệ thống phân loại, định hướng lựa chọn vật liệu cho chọn giống và bảo tồn các loài cua xanh ở Việt Nam [12]. Trương Ngọc Trinh và ctv (2012), đã so sánh đặc điểm hình thái và di truyền của các dòng cá rô đồng bằng giải trình tự vùng gen COI, khi so sánh trình tự gen COI của 5 mẫu cá rô đồng tự nhiên thu từ Cà Mau (gọi tắt là cá rô Cà Mau) với 5 mẫu cá rô đầu vuông đã báo cáo mức độ tương đồng di truyền giữa chúng lên đến 99 – 100%, tương tự mức tương đồng độ các cá thể trong cùng dòng. Trình tự vùng gen COI của 10 mẫu cá rô (kể cả mẫu cá rô đầu vuông) trong nghiên cứu là tương đồng 97% với COI của cá rô Anabas testudineus [38]. 25 Vũ Đặng Hạ Quyên và ctv (2014), sử dụng trình tự gen 16S của ADN ty thể đã kiểm chứng phân loại dựa vào hình thái và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá nghiên cứu [28]. Nguyễn Thị Anh Thư và ctv (2014), đã nghiên cứu di truyền quần thể của Trai tai tượng ở vùng biển Nam Trung Bộ và Nam Bộ Việt Nam, phân tích đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của 2 loài trai tai tượng ( Tridacna crocea thu ở vịnh Nha Trang và Côn Đảo, T. squamosa thu ở vịnh Nha Trang và đảo Phú Quốc) dựa trên chỉ thị phân tử gen COI của ADN ty thể. Kết quả cho thấy, quần thể Tridacna crocea thể hiện mức độ đa dạng trung bình với khác biệt trình tự giữa các cá thể từ 0 – 3,5%, 10 haplotype/30 cá thể (đa dạng haplotype = 0,846) ở vịnh Nha Trang và khác biệt trình tự gen từ 0 – 9,7%, 16 haplotype/28 cá thể (đa dạng haplotype = 0,934) ở Côn Đảo. Quần thể T.squamosa thể hiện mức độ đa dạng thấp với khác biệt trình tự gen của loài từ 0 – 2,1%, 7 haplotype/19 cá thể (đa dạng haplotype = 0,468) ở vịnh Nha Trang và khác biệt trình tự gen từ 0 – 1,72%, 5 haplotype/18 cá thể ở đảo Phú Quốc (đa dạng haplotype = 0,314). Hai quần thể trai tai tượng ở Việt Nam có mối quan hệ gần gũi về mặt di truyền với quần thể ở một số khu vực thuộc vùng biển Đông Nam Á [38]. 26 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Cá Bỗng được thu mẫu trên các hệ thống sông, suối ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam: Sơn La, Hòa Bình, Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn và Thanh Hóa (Hình 2.1). Phân loại cá bằng hình thái, tách chiết ADN, PCR và tinh sạch sản phẩm PCR được thực hiện phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thủy sản thuộc Trường Cao đẳng Thủy sản – Đình Bảng – Từ Sơn – Bắc Ninh. Giải trình tự ADN được thực hiện tại Trường đại học tổng Hợp Monash ở Sunway, Malaysia. Quá trình thu mẫu được sự hỗ trợ của Công ty trách nhiệm hữu hạn Đầu tư và Phát triển nông nghiệp Đông Bắc – Đồng Hỷ – Thái Nguyên. Hình 2.1. Bản đồ thu mẫu cá Bỗng Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2014 đến tháng 06 năm 2015 27 Bảng 2.1. Địa điểm thu, số lượng mẫu phân tích cá Bỗng STT Quần thể Mã mẫu 1 Sơn La SL 2 Hòa Bình HB 3 Hà Giang HG 4 Tuyên Quang TQ 5 Lạng Sơn SL 6 Thanh Hóa HQ 7 Cao Bằng CB Địa điểm thu mẫu Xuân Nha – Mộc Châu Sơn La Hiền Lương – Đà Bắc Hòa Bình Đạo Đức – Vị Xuyên Hà Giang Hoàng Khai – Yên Sơn Tuyên Quang Tràng Định – Lạng Sơn Cẩm Lương – Cẩm Thủy Thanh Hóa Bảo Lạc – Cao Bằng Số lượng mẫu Phân tích 10 10 10 10 10 3 1 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành trên đối tượng cá Bỗng phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam (Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La và Hòa Bình) và cá Bỗng (Cá thần) ở Cẩm Thủy Thanh Hóa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu ngoài thực địa Phương pháp chọn địa điểm để thu mẫu: Các địa điểm thu mẫu được thiết kế theo sự khảo sát địa hình tại các vị trí trên các sông, suối ở các tỉnh: Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La, Hòa Bình và Thanh Hóa. Phương pháp thu mẫu: Cá Bỗng được thu bằng cách dùng lưới vét bắt cá với sự hỗ trợ của người dân địa phương. Mẫu vật được thu nguyên con và được định hình bằng formalin 5% dùng để phân loại hình thái. Để phân loại 28 bằng chỉ thị ADN, mẫu được thu là 1cm vây cá và bảo quản trong etanol 90%. Mỗi địa điểm thu từ 10 – 15 mẫu. Mẫu thu ở thực địa đựng trong các lọ có ghi nhãn với các thông tin về địa điểm, thời gian, dụng cụ thu mẫu, dung dịch bảo quản. Thu thập các tài liệu: + Thu thập các tài liệu liên quan: Các số liệu về điều kiện tự nhiên, khí hậu, thủy văn. Tài liệu nghiên cứu về phân loại và định loại cá của Việt Nam, và các nước lân cận. + Phỏng vấn những người dân chài, người hiểu biết về cá trong vùng thu mẫu. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 2.2.2.1. Phương pháp phân loại bằng hình thái Theo phương pháp phân tích hình thái của Pravdin [25], có bổ sung tài liệu của Nguyễn Văn Hảo, Ngô Sỹ Vân [20], Kottelat [50] [49]. Hình 2.2. Sơ đồ đo cá bộ cá Chép (Cyprinidae) ab: Chiều dài toàn thân; ac: Chiều dài theo Smith; ad: Chiều dài không có C; od: Chiều dài mình; an: Chiều dài mõm; np: Đường kính mắt; po: Phần đầu sau mắt; ao: Chiều dài đầu; lm: Chiều cao đầu ở chẩm; gh: Chiều cao lớn nhất ở thân; ik: Chiều cao nhỏ nhất của thân; aq: Khoảng cách từ mõm đến vây lưng; fd: Chiều dài thân đuôi; qs: Chiều dài gốc D; tu: Chiều dài lớn 29 nhất của D; yy1: Chiều dài gốc A; ej: Chiều cao lớn nhất của A; vx: Chiều dài P; zz1: Chiều dài V; vz: Khoảng cách giữa P và V; zy: Khoảng cách giữa V và A; Ở bên phải là sơ đồ đo chiều rộng của chán: (OO) Các chỉ tiêu hình thái bảng 2.2. Bảng 2.2. Các chỉ tiêu hình thái Dài tiêu chuẩn (Lo) Đường kính mắt (O) Dài toàn thân (L) Dài bên đầu (T) Dài trước vây lưng (daD) Dài sau vây lưng (daP) Dài lưng đầu (T) Dài trước vây hậu môn (daA) Dài đầu sau mắt (Op) Dài trước vây ngực Cao đầu ở gáy (hT) Dài trước vây bụng (daV) Cao đầu ở mắt (hT) Dài trước lỗ faauj môn Cao cơ thể ở hậu môn (Ha) Dài tia cứng vây lưng Cao cơ thể ở vây lưng (H) Rộng đầu ở gáy (wc) Dài tia mềm vây lưng Dài tia mềm vây hậu môn Rộng đầu ở mắt (we) Dài gốc vây lưng (gốc D) Rộng miệng (wm) Dài tia cứn vây hậu môn Rộng thân ở vây lưng (wd) Dài gốc vây hậu môn (gốc A) Rộng thân ở vây bụng Dài vây ngực Rộng thân ở vây hậu môn (wa) Dài vây bụng Dài mõm (Ot) Dài thùy bên đuôi Khoảng cách hai mắt (OO) Dài thùy dưới đuôi Khoảng cách mõm – sau mắt Dài chẻ vây đuôi Khoảng cách P – V Dài cán đuôi (lcd) Khoảng cách V – A Cao cán đuôi (ccd) Các chỉ tiêu đếm: Số vảy trước vây lưng (D), Số vảy đường bên, số vảy dọc cán đuôi, số vảy quanh cán đuôi, số tia vây lưng (D), số tia vây hậu môn (A), số tia vây ngực (P), số tia vây bụng (V), số tia vây đuôi (C). 30 Các Tỷ lệ về các chỉ số đo hình thái: L0/H, L0/T, L0/dày thân, L0/daD, L0/dpD, L0/lcd, L0/ccd, T/Ot, T/O, T/OO, T/hT, T/rộng đầu, H/h, OO/O, P V/V/A, lcd/ccd. Lập phiếu hình thái: Chúng tôi tiến hành lập 50 phiếu hình thái cho mẫu cá nghiên cứu. Phương pháp định loại: Định loại dựa vào hình thái ngoài, trong quá trình định loại các mẫu tôi có sử dụng và tham khảo các tài liệu chính trong định loại: + Cá nước ngọt Việt Nam Nguyễn Văn Hảo và Ngô Sỹ Vân [20]. + Định loại cá nước ngọt các tỉnh phía Bắc Việt Nam Mai Đình Yên [43] và có bổ sung dựa vào tài liệu của các tác giả Kottelat [50], Chen Yiyu ctv [46]. Các bước định loại. Sử dụng phương pháp định loại của Mayr [24] gồm các bước sau: + Phân chia các lô mẫu + Sử dụng khóa định loại để xác định taxon bậc loài (Phụ lục 3) + Đối chiếu đặc điểm hình thái phân loại và hình vẽ + Phân tích đặc điểm biến dị của quần thể loài. 2.2.2.2. Phương pháp giải trình tự ADN cá Bỗng Phương pháp tách chiết ADN bằng bộ kít QIAGEN. Quy trình tách chiết ADN bằng bộ kít Qiagen được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được tiến hành tại phòng Công nghệ Sinh học – Trường Cao đẳng Thủy Sản – Từ Sơn – Bắc Ninh. Phương pháp điện di ADN tổng số. Chuẩn bị 25 ml Agarose với nồng độ 1%: Đong 25 ml dung dịch TBE 1X vào lọ, cân 25 g Agarose cho vào và đun trên lò vi sóng cho tan hoàn toàn đưa ra ngoài khi nhiệt độ lớn hơn 55 oC cho thêm 1,25 gelred và lắc đều không để tạo bọt, để nguội khoảng 55 oC sau 31 đó đổ dung dịch vào khuôn gel có cài sẵn lược để tạo các giếng, chờ cho đông lại( xuất hiện màu đục). Bỏ tấm lược ra và đặt gel vào buồng điện di có chứa dung dịch TBE 1X. Tra mẫu vào giếng: Mẫu gồm 3 ADN và 1 Loading dye, hỗn hợp được trộn đều sau đó dùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng. Chạy điện di: Điều chỉnh hiệu điện thế 220 V, cường độ dòng điện 110 mA và tiến hành trong khoảng 30 phút. Khi vạch chạy đến 2/3 bản gel thì dừng lại, mang bản gel sau khi chạy điện di quan sát dưới đèn UV. Kỹ thuật PCR để nhân đại đoạn gen 16S và gen COI. Đoạn gien 16S và COI của ADN ty thể cá Bỗng được khuếch đại bằng sử dụng cặp mồi được trình bày ở Bảng 2.3. Hỗn hợp tạo phản ứng PCR sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 25 µl (Nước tinh khiết 4,2 µl, Top taq Maxter mix 12,5µl, primers 2µl, ADN khuôn mẫu 1µl). Bảng 2.3. Các cặp mồi được sử dụng để giải trình tự ADN của cá Bỗng Gen 16S COI Mồi 16Sp1F Trình tự mồi (5'-3') Tài liệu tham khảo CTT ACA CCG AGA ARA CAT C 16Sp1R CTT AAG CTC CAA AGG GTC COI-L5956 CACAAAGACATTGGCACCCT COI- H6855 AGTCAGCTGAAKACTTTTAC Li et al [55] Miya & Nishida [59] Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR nhân bản vùng gen 16S và COI: 94 o C trong 3 phút, tiếp theo 30 chu kỳ (94 oC 30 giây, nhiệt độ gắn mồi 56 0C 30 giây, và 72oC trong 1 phút), kéo dài đoạn 72 oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR được làm sạch bằng QIAGEN QIAquick PCR Kit. Phương pháp làm sạch sản 32 phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose/TAE 2%. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Chuẩn bị 25 ml Agarose với nồng độ 2%: Đong 25 ml dung dịch TBE 1X vào lọ, cân 50g Agarose cho vào và đun trên lò vi sóng cho tan hoàn toàn đưa ra ngoài khi nhiệt độ lớn hơn 55 oC cho thêm 1,25 gelred và lắc đều không để tạo bọt, để nguội khoảng 50 oC sau đó đổ dung dịch vào khuôn gel có cài sẵn lược để tạo các giếng, chờ cho đông lại (xuất hiện màu đục). Bỏ tấm lược ra và đặt gel vào buồng điện di có chứa dung dịch TBE 1X. Cho mẫu vào giếng: Mẫu gồm 3 ADN và 1 loading dye, hỗn hợp được trộn đều sau đó dùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng. Chạy điện di: Điều chỉnh hiệu điện thế 220 V, cường độ dòng điện 110 mA và tiến hành trong khoảng 30 phút. Khi vạch chạy đến 2/3 bản gel thì dừng lại, mang bản gel sau khi chạy điện di quan sát dưới đèn UV. Kết quả điện di cho các vạch gọn, phân tách rõ ràng là ADN trong mẫu đã tinh sạch cho nghiên cứu tiếp. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR được làm sạch bằng QIAGEN QIAquick PCR Kit. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose/TAE 2%. Tiếp theo trình tự ADN được giải theo phương pháp của ABI 3130XL, mỗi mẫu được giải trình tự bằng 2 mồi xuôi và ngược. Bước 1. Thêm 100 Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ (5 : 1) PB : PCR = 100 : 20 sau đó tiến hành voltex. 33 Bước 2. Tiến hành hút tất cả dung dịch vào ống đầu lọc đã được chuẩn bị sẵn. Bước 3. Li tâm 1 phút với tốc độ 1300 vòng/ 1 phút,loại bỏ ống dưới và lấy ống cọt lọc. Bước 4. Thêm 750 Buffer BE vào cột lọc và tiến hành li tâm 13000 vòng/1 phút trong thời gian 1 phút. Bước 5. Loại bỏ nước ở phía dưới, lắp cột lọc vào ống Eppandoss 1,5 và đánh dấu theo tỉ lệ như ống cũ. Bước 6. Thêm 30 Buffer EB vào chính giữa màng cột lọc ( tránh không để chạm vào màng lọc) để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó mang li tâm 13000 vòng/1 phút trong thời gian 1 phút. Bước 8. Kiểm tra sản phẩm trên Agarose. 2.2.2.3. Phương pháp định trình tự gen bằng máy giải tự động Trình tự ADN ty thể của cá Bỗng được giải mã trên máy ABI 3130XL. Trình tự ADN ty thể của các loài cá Bỗng có sẵn trong ngân hàng gen được sử dụng để so sánh với mẫu cá Bỗng ở một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, sử dụng phần mềm BioEdit [48] và BLAST [72]. Mối liên hệ giữa các loài cá Bỗng được xây dựng trên phần mềm MEGA6.0 [47]. 2.2.2.4. Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Bỗng Đa dạng di truyền của các quần thể cá Bỗng được tính bằng: Tổng số haplotype (k): Haplotype là một biến thể thứ tự duy nhất của một gen tại cùng một locus trong bộ gen. Các trình tự gen có cùng số điểm đột biến lập thành một haplotype. Các haplotype khác nhau bởi một điểm đột biến. Đa dạng haplotype (h): Xác suất hai lựa chọn ngẫu nhiên các haplotype trong một mẫu là khác nhau (tương đương với dị hợp tử được mong đợi) Công thức h = 34 Trong đó: h là đa dạng haplotype, n là số lượng haplotype trong một mẫu, p là tần số của từng haplotype trong mẫu. Đa dạng nucleotide (Π): là số lượng trung bình của các vị trí nucleotide khác nhau giữa hai chuỗi nucleotide được rút ra ngẫu nhiên từ một mẫu. n ÷∑ X i X jπ ij n − 1 Công thức: Π = Trong đó: xi, xj là tần số của các alen i và j; π ij là tần suất sai khác giữa alen i và j, n là chiều dài của chuỗi nucleotide. Số đột biến (η): Xác suất mà bất kỳ một vị trí xảy ra đột biến. Xác suất đột biến = Số đột biến/ Tổng số nucleotide trong chuỗi (trong một thế hệ). Tổng số đột biến trong cả chiều dài của chuỗi nucleotide η = Xác suất đột biến x (Tổng số nucleotide – Số nucleotide đã bị đột biến). Các số liệu được xử lý bằng phần mềm DNAsp5 [56]. Phương pháp phân tích cây tiến hóa. Phân tích đa dạng di truyền của cá Bỗng được tiến hành dựa trên 3 thuật toán Maximum parsimony (MP), Neighbor joining (NJ) và Maximum likelihood (ML), các phương pháp được phân tích bằng các phần mềm MEGA 6.0 [47]. Giá trị bootstrap (BT) được tính toán để xác định tính chính xác của thuật toán MP, ML và NJ với độ lặp lại 1.000. 35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân loại cá Bỗng 3.1.1. Phân loại cá Bỗng dựa vào hình thái học Kết quả phân tích hình thái để định loại mẫu cá Bỗng thu được tại 5 tỉnh: Sơn La, Hòa Bình, Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả phân tích hình thái cá Bỗng ở một số tỉnh phía Bắc Đặc điểm hình Sơn La thái L0/H 3,21 L0/T 3,75 Lo /da D. 1,84 Lo/ dp D 3,01 Lo/lcd 6,30 Lo/h 7,86 T/O 4,30 T/OO 2,35 T/ hT 1,43 T/Ot 2,88 T/Op 2,15 H/h 2,45 P- V/ V- A……. 1,15 Lcd/h 1,25 D III – IV,9 A 3,5 P 1,15-16 V 1,9 C (16- 18)+2 Ll 29-33 Vảy trên - dưới 41/ 2 − 51/ 2 đường bên 3− 4 Công thức răng 4.3.2/5.3.2 hầu (E) Số lược mang ở 8-10 cung mang I Vẩy dọc cán đuôi 7-9 36 Hòa Bình Hà Giang Tuyên Quang Lạng Sơn 2,96 4,07 1,59 3,01 5,57 7,64 4,78 2,18 1,29 2,93 2,11 2,58 1,00 1,39 III,9 3,5 1,5-16 1,8-9 18+2 28-30 5−6 3−4 4.3.2/ 5.3.2 3,05 3,92 1,74 2,37 4,33 7,61 4,93 2,32 1,40 2,62 2,13 2,49 1,06 1,36 III-IV,8-9 3,5 1,14-16 1,9 16+2 27-32 5 − 51/ 2 3 − 31/ 2 5.3.2 30,1 3,92 1,74 2,38 4,33 7,63 4,90 2,32 1,40 2,62 2,12 2,50 1,06 1,35 III-IV,8-9 3,5 1,14-16 1,8 16+2 27-32 5 − 51/ 2 3 − 31/ 2 5.3.2 3,00 4,18 1,82 3,10 5,63 7,15 4,14 2,19 1,44 2,48 2,41 2,38 1,19 1,27 IV,9 3,5 1,14-16 1,8 16-18+2 28-29 4−6 3−4 5.3.2 8-10 10-12 10-12 10-12 6-8 7-8 7-8 7-9 Vẩy trước vây lưng Vẩy quanh cán đuôi 8-10 12 9-11 12-13 9-10 14 9-10 13-14 9-12 12-14 Từ số liệu phân tích hình thái (Bảng 3.2) các mẫu cá Bỗng cho thấy: Vây hậu môn của cá chỉ có 5 tia phân nhánh, tia không phân nhánh cuối cùng của vây hậu môn mềm và không có răng cưa, răng hầu 3 hàng, vây lưng có gai cứng, râu có hai đôi, là những đặc điểm của cá thuộc phân họ cá Bỗng Barbinae. Thân tròn, dài hình thoi, dẹp bên phần cuống đuôi. Viền lưng và viền bụng cong tròn. Đầu vừa phải, sống đầu hình cung. Mõm tròn tù, hơi nhô về phía trước. Miệng ở cuối, kề dưới, hình móng ngựa. Môi trên và môi dưới liền nhau ở góc miệng. Có hai đôi râu; mắt vừa phải gần mút mõm hơn viền sau nắp mang. Viền sau vây lưng lõm, có gai ngược trước khởi điểm vây lưng ẩn dưới da. Vây hậu môn có 3 tia đơn, 5 tia phân nhánh. Đây là đặc điểm thuộc giống cá Bỗng Spinibarbus (Phụ lục 3). Khi phân tích hình thái các mẫu cá Bỗng thu tại Tuyên Quang, Hà Giang và Lạng Sơn đều có đặc điểm (Bảng 3.2): Khởi điểm vây lưng sau vây bụng và gần mõm hơn so với gốc vây đuôi, L 0= 2,9 – 3,2, H = 4,5 – 4,7, T = 6,8 – 7,0, Lcd = 6,1 – 6,8 , L1= 32 – 33; lược mang cung mang I 10 – 12 và răng hầu 2.3.4 – 4.3.2 là những đặc điểm thuộc loài cá Bỗng Spinibarbus denticulatus (Phụ lục 3). Các mẫu cá Bỗng thu tại Sơn La và Hòa Bình đều có đặc điểm: Khởi điểm vây lưng cách mút mõm bằng tới mút cuối tia giữa vây đuôi, L 0 = 3,5 – 4,1, H = 4,2 – 4,3, T = 4,7 – 5,6, Lcd = 3,9 – 5,3, L.1 = 29 – 30; lược mang cung mang I có 6 – 8, là những đặc điểm của loài Spinibarbus sp và có nhiều đặc điểm giống với loài cá Bỗng thon S. nammauensis Nguyen & Nguyen. Như vậy từ các phân tích về hình thái, giải phẫu, so sánh với các tài liệu định loại hiện có, bước đầu sơ bộ kết luận như sau: 37 - Các mẫu cá Bỗng thu thập từ 5 địa điểm và qua phân tích hình thái có thể phân trong hai loài khác nhau: - Cá Bỗng thu ở Tuyên Quang, Hà Giang và Lạng Sơn thuộc loài cá Bỗng Spinibarbus denticulatus. Cá Bỗng thu ở Sơn La và Hòa Bình thuộc loài Spinibarbus sp và có nhiều đặc điểm giống với loài cá Bỗng thon S. nammauensis Nguyen & Nguyen. 3.1.2. Kết quả phân loại cá Bỗng sử dụng chỉ thị ADN 3.1.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Tổng số 54 mẫu cá Bỗng thu từ các tỉnh Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La, Hòa Bình, Cao Bằng và Thanh Hóa đã được tách chiết ADN thành công. Kết quả kiểm tra ADN tổng số của các mẫu cá Bỗng trên gel agarose (1%) cho thấy các băng ADN gọn, sáng rõ đồng đều, chứng tỏ ADN có chất lượng tốt (Hình 3.1). Hình 3.1. Kết quả kiểm tra ADN tổng số của một số mẫu cá Bỗng thu tại Sơn La Ghi chú: SL: Sơn La, M: Marker DNA 3.1.2.2. Kết quả nhân đoạn gen 16S và gen COI từ mtADN của cá Bỗng Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của mt ADN các mẫu cá Bỗng cho thấy sản phẩm PCR của cả 2 vùng gen (16S và COI) có kích thước khoảng 38 700 – 800bp, nằm trong khoảng giới hạn của hai vùng gen (Hình 3.2). Các băng rõ nét, đảm bảo đủ tiêu chuẩn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. A B Hình 3.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR của đoạn gen 16S mẫu mtADN cá Bỗng thu tại Tuyên Quang (A) và của gen COI mẫu mtADN thu tại Hòa Bình (B) Ghi chú: TQ: Tuyên Quang, HB: Hòa Bình, M: Marker DNA 3.1.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S và COI từ mtADN ở các mẫu cá Bỗng Tổng số 54 trình tự vùng gen 16S với độ dài 665 bp và 54 trình tự vùng gen COI với độ dài 628bp đã được giải trình tự thành công (Phụ lục 3). Các trình tự ADN cá Bỗng đã được kiểm chứng với các trình tự ADN của cá Bỗng trên ngân hàng gen (GenBank) sử dụng chương trình BLAST. Kết quả so sánh mức độ tương đồng với các trình tự trên Genbank cho thấy, Trình tự vùng gen 16S mtADN của cá Bỗng mẫu thu tại Sơn La (SL2) trong nghiên cứu này tương đồng với trình tự gen 16S của S. Sinensis với mã số DQ845864.1 là 98% và trình tự vùng gen COI mtADN của cá Bỗng mẫu thu tại Lạng Sơn (LS3) trong nghiên cứu này tương đồng với trình tự gen COI của S. Denticulatus (mã số JX042168.1) là 99% (Hình 3.3 và 3.4). 39 Hình 3.3. Mối quan hệ di truyền giữa cá thể cá Bỗng (SL2) thu tại Sơn La với loài cá Bỗng S. sinensis dựa trên số liệu giải trình tự đoạn gen 16S Ghi chú: Trình tự đoạn gen 16S của cá thể cá Bỗng Sơn La (SL2) mã số Query_41627) Hình 3.4. Mối quan hệ di truyền giữa cá thể cá Bỗng (LS3) thu tại Lạng Sơn với loài cá Bỗng S. denticulatus dựa trên số liệu giải trình tự đoạn gen COI Ghi chú: Trình tự đoạn gen COI của cá thể cá Bỗng Lạng Sơn (LS3) mã số Query_26267 40 3.1.2.4. Kết quả phân loại cá Bỗng dựa vào trình tự ADN vùng gen ty thể 16S và COI Với 4 thuật toán Neighbor – Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP), Minimum Evolution (ME); Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean (UPGMA) sử dụng để xây dựng 4 cây phân loài cho mỗi vùng gen (Hình 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9). Các cây phân loài phân chia các mẫu cá Bỗng trong nghiên cứu này thành 2 nhóm chính: - Nhóm I gồm các mẫu cá Bỗng ở Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa và Lạng Sơn, nhóm này hợp thành từ 2 nhóm nhỏ. Tất cả các mẫu thu ở Sơn La, Hòa Bình và Thanh Hóa được ghép trong một nhóm nhỏ, ở nhóm nhỏ còn lại chỉ bao gồm các mẫu cá Bỗng của Lạng Sơn. - Nhóm II gồm các mẫu cá Bỗng ở Tuyên Quang, Hà Giang và Cao Bằng. Khoảng cách di truyền của các nhóm cá Bỗng nghiên cứu so với các loài có trình tự của 2 vùng gen công bố trên genbank được trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2. Bảng 3.2. Khoảng cách di truyền giữa các nhóm cá Bỗng nghiên cứu so với các loài cá Bỗng có số liệu trình tự vùng gen 16S công bố trên ngân hàng gen. S.sinensi Nhóm I Nhóm II S.sinensis S.canldweli S.denticulatus Nhóm I Nhóm II s S. canldweli 0,01 0,03 0,04 0,01 0,02 0,04 0,01 0,04 0,02 0,03 Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền giữa các nhóm cá Bỗng nghiên cứu so với các loài cá Bỗng có số liệu trình tự vùng gen COI công bố trên ngân hàng gen Nhóm I Nhóm I 41 Nhóm II S.sinensis S. canldweli Nhóm II S.sinensis S.canldweli S.denticulatu 0,02 0,05 0,10 0,05 0,10 0,10 s 0,02 0,01 0,05 0,10 Số liệu ở Bảng 3.2 cho thấy, các mẫu cá bỗng của nhóm I và II rất gần gũi về mặt di truyền so với nhau và gần với cá Bỗng S. denticulatus (mã số Genbank DQ 464906) với khoảng các di truyền là 0,01 và tương đối xa hơn với loài S. canldweli (0,04) và loài S. sinensis (0,03). Ở vùng gen COI cũng tương tự, các mẫu cá Bỗng của nhóm I và II rất gần gũi về mặt di truyền so với nhau và gần với cá Bỗng S. denticulatus (mã số Genbank JX 042168.1) với khoảng các di truyền từ 0 – 0,02 và tương đối xa hơn với loài cá Bỗng S. canldweli (0,1) và loài S. sinensis (0,05) Bảng 3.3. Theo nghiên cứu về đánh giá đa dạng di truyền giữa hai vùng gen 16S và gen COI của Zheng và ctv (2014) thì vùng gen COI cho kết quả sai khác di truyền trong cùng loài trung bình là 0,004, vùng gen 16S cho kết quả sai khác di truyền trong cùng loài trung bình là 0,003. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các mẫu cá Bỗng trong cùng quần thể sai khác nhau từ 0,00 – 0,004 (Bảng 3.6) đối với vùng gen 16S và từ 0 – 0,006 (Bảng 3.6) đối với vùng gen COI. Kết quả thu được trong nghiên cứu này là tương tự với kết quả nghiên cứu của Zheng và ctv (Bảng 3.6). Tang và ctv (2003) đã nghiên cứu quá trình phân bố của cá Chầy thuộc giống cá Bỗng (S. cadlwelli) dựa vào trình tự ADN vùng gen Cytochome b trong đó có so sánh với giống cá Bỗng S. sinensis. Nhóm tác giả công bố sự sai khác giữa các cá thể trong cùng loài từ 0,012 – 0,037 và khác loài từ 0,13 – 0,14. Kết quả phân tích tổng sai khác giữa các mẫu cá Bỗng trong nghiên cứu này là 0 – 0,006 (Bảng 3.6), trong khi sự khác nhau giữa các loài từ 0,05 – 0,1 42 (Bảng 3.2 và Bảng 3.3). Do vậy có thể sơ bộ kết luận các mẫu cá Bỗng trong nghiên cứu này chủ yếu là loài S. denticulatus. Kết quả phân loại cá Bỗng bằng chỉ thị phân tử cho thấy nhóm I và nhóm II có mức độ tương đồng cao, gần gũi với nhau về mặt di truyền và thuộc loài S. denticulatus. Tuy nhiên việc phân chia loài phụ cần có các nghiên cứu sâu hơn. HQ2 HQ3 HQ1 HB10 HB9 HB8 HB7 57 HB5 HB3 HB2 HB1 SL5 65 SL8 SL2 73 SL1 SL3 62 SL4 SL6 SL7 SL9 43 SL10 HB4 99 HB6 57 HG2 HG7 S.Denticulatus (DQ464906) HG1 HG6 67 CB1 LS9 LS10 LS8 LS7 99 LS6 LS5 LS4 LS3 LS2 LS1 98 TQ7 42 85 TQ10 TQ4 TQ1 TQ2 TQ3 61 TQ5 TQ6 TQ8 TQ9 61 HG4 HG5 HG8 HG9 HG3 HG10 S.Sinensis (KF214722) S.Caldwelli (NC_022149.1) 90 HG9 CB1 HG8 HG4 HG3 TQ10 TQ9 11 TQ8 TQ7 TQ6 TQ5 9 TQ4 TQ3 TQ2 TQ1 LS1 16 LS4 87 LS9 S.Denticulatus (JX042168.1) 18 HG2 63 HG7 LS2 29 LS5 LS7 15 82 LS10 94 HG6 HG5 HG1 HG10 53 SL9 SL10 SL7 63 SL5 SL4 SL2 SL1 HB10 QH1 HB8 HB7 95 39 HB6 HB4 HB3 HB1 QH2 SL3 26 SL6 SL8 HB2 HB5 56 HB9 LS3 LS6 LS8 QH3 S.Sinensis (KF214722.1) S.Caldwelli (KF134718.1) 0.01 0.005 A B Hình 3.5. Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình tự ADN vùng gen 16S (A) và COI (B) theo phương pháp NJ 43 (Neighbor – Joining) 57 HQ2 HQ3 HQ1 HB10 HB9 HB8 HB7 HB5 HB3 HB2 71 HB1 SL5 61 SL8 SL2 SL1 SL3 61 SL4 SL6 SL7 SL9 SL10 HB4 99 HB6 HG2 HG7 S.Denticulatus (DQ464906) HG1 HG6 66 CB1 S.Sinensis (KF214722) S.Caldwelli (NC_022149.1) 89 HG9 HG10 HG8 HG5 HG4 HG3 TQ9 TQ8 TQ6 43 TQ5 TQ3 TQ2 TQ7 85 TQ10 TQ4 TQ1 LS1 LS2 20 LS3 LS4 LS5 99 LS6 LS7 LS8 LS9 LS10 91 0.002 0.01 A 44 B HG9 CB1 HG8 HG4 HG3 TQ10 TQ9 TQ8 TQ7 TQ6 TQ5 TQ4 22 TQ3 TQ2 TQ1 LS1 LS4 88 LS9 S.Denticutus (JX042168.1) 12 HG2 HG7 64 LS2 LS5 75 87 LS7 LS10 HG6 HG5 HG1 HG10 LS8 QH3 LS6 LS3 HB9 HB5 SL3 SL6 SL8 HB2 SL9 91 SL10 SL7 64 SL5 SL4 SL2 SL1 QH2 HB1 HB3 56 HB4 HB6 HB7 HB8 HB10 QH1 S.Sinensis (KF214722.1) S.Caldwelli (KF134718.1) Hình 3.6. Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình tự ADN vùng gen 16S (A) và COI (B) theo phương pháp MP (Maximum Parsimony) 42 HQ2 HQ3 HQ1 HB10 HB9 HB8 HB7 57 HB5 HB3 HB2 HB1 SL5 62 SL8 SL2 74 SL1 SL3 62 SL4 SL6 SL7 SL9 HG9 CB1 HG8 HG4 HG3 TQ10 TQ9 13 TQ8 TQ7 TQ6 TQ5 11 TQ4 TQ3 TQ2 TQ1 LS1 17 LS4 85 LS9 S.Denticutus (JX042168.1) 17 HG2 64 HG7 LS2 29 LS5 LS7 14 83 LS10 92 HG6 HG5 HG1 57 HG10 SL9 SL10 SL7 62 SL5 SL4 SL2 SL1 HB10 QH1 HB8 HB7 95 42 HB6 HB4 HB3 HB1 QH2 SL3 23 SL6 SL8 HB2 HB5 59 HB9 LS3 LS6 LS8 QH3 S.Sinensis (KF214722.1) S.Caldwelli (KF134718.1) SL10 HB4 99 HB6 58 HG2 HG7 S.Denticulatus (DQ464906) HG1 HG6 65 CB1 LS9 LS10 LS8 LS7 99 LS6 LS5 LS4 LS3 LS2 LS1 97 TQ7 42 87 TQ10 TQ4 TQ1 TQ2 TQ3 65 TQ5 TQ6 TQ8 TQ9 59 HG4 HG5 HG8 HG9 HG3 HG10 S.Sinensis (KF214722) S.Caldwelli (NC_022149.1) 90 0.005 0.01 A 45 B Hình 3.7. Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình tự ADN vùng gen 16S (A) và COI (B) theo phương pháp ME (Minimum Evolution) 56 52 66 52 51 42 65 44 63 54 86 69 89 41 30 34 81 99 99 0.020 0.015 0.010 0.005 A HB1 HB8 HB2 HQ1 HQ3 HB9 HB7 HB10 HQ2 HB3 HB5 SL5 SL8 SL2 SL6 SL3 SL9 SL1 SL4 SL7 HG6 CB1 HG1 HG2 HG7 S.Denticulatus (DQ464906) TQ4 TQ7 TQ1 TQ10 HG3 HG10 TQ3 TQ6 TQ2 TQ5 TQ9 HG5 HG9 HG4 TQ8 HG8 HB4 SL10 HB6 S.Sinensis (KF214722) LS1 LS3 LS6 LS7 LS4 LS8 LS10 LS5 LS2 LS9 S.Caldwelli (NC_022149.1) 0.000 21 18 17 2364 32 43 58 99 86 85 99 64 99 64 30 21 26 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 TQ2 TQ10 HG9 CB1 TQ8 TQ6 HG4 TQ5 TQ1 TQ9 HG8 TQ7 TQ3 HG3 TQ4 HG2 HG7 HG5 HG6 HG1 HG10 LS2 LS10 LS5 LS7 LS1 LS9 LS4 S.Denticulatus (JX042168.1) SL3 HB9 QH3 LS3 HB5 LS8 SL8 HB2 SL6 LS6 QH2 SL1 SL7 SL10 SL9 SL4 SL2 SL5 HB6 HB7 HB1 HB4 QH1 HB10 HB3 HB8 S.Sinensis (KF214722.1) S.Caldwelli (KF134718.1) 0.00 B Hình 3.8. Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình 46 tự ADN vùng gen 16S (A) và COI (B) theo phương pháp UPGMA (Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean) 47 Hình 3.9. Cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng nghiên cứu dựa trên số liệu trình tự ADN vùng gen 16S và gen COI theo phương pháp NJ (Neighbor – Joining) 48 3.2. Kết quả phân tích đa dạng di truyền trong các mẫu cá Bỗng nghiêu cứu 3.2.1. Đa dạng di truyền các vùng gen 16S và COI trong các quần thể cá Bỗng nghiêu cứu Kết quả so sánh đa dạng di truyền của 2 vùng gen 16S và COI ở cá Bỗng cho thấy vùng gen 16S đa dạng hơn vùng gen COI (Bảng 3.4 và Bảng 3.5). Vùng gen 16S có số lượng vị trí đa hình (Polymorphic sites) s = 28, tổng số đột biến Ƞ = 30, vùng gen COI có số lượng vị trí đa hình (Polymorphic sites) s = 17, tổng số đột biến Ƞ = 17. Bảng 3.4. Đa dạng di truyền vùng gen 16S mtADN giữa các quần thể và trong mỗi quần thể cá Bỗng nghiên cứu Quần thể Sơn La Hòa Bình Tuyên Quang Hà Giang Lạng Sơn 5 Quần thể n 10 10 10 10 10 50 h 3 2 2 5 1 11 Đa dạng di truyền Hd () 0,600 ± 0,131 0,356 ± 0,159 0,533 ± 0,095 0,822 ± 0,097 0,000 0,877 0,020 Π () 0,00296 ± 0,00161 0,00315 ± 0,00141 0,00189 ± 0,00034 0,00418 ± 0,00068 0,000 0,01504 0,00168 *Ghi chú n: số lượng các trình tự trong phân tích, h: số lượng haplotype, hd: đa dạng haplotyp, π: đa dạng nucleotide. : average value (giá trị trung bình) SD: standard deviation (Độ lệch chuẩn) Từ số liệu ở Bảng 3.4 với vùng gen 16S của 50 mẫu cá Bỗng được nghiên cứu có tổng số haplotype h = 11, hệ số đa dạng haplotype (hd) = 0,877 0,020, đa dạng nucleotide (π) = 0,01504 0,00168. Trong từng quần thể thì quần thể cá Bỗng Hà Giang có đa dạng cao nhất (hd = 0,822 ± 0,097, π = 49 0,00418 ± 0,00068). Không phát hiện có sự sai khác di truyền trong quần thể cá Bỗng ở Lạng Sơn. Bảng 3.5. Đa dạng di truyền vùng gen COI mtADN giữa các quần thể cá Bỗng và trong mỗi quần thể cá Bỗng Vùng thu mẫu Sơn La Hòa Bình Tuyên Quang Hà Giang Lạng Sơn 5 Quần thể n 10 10 10 10 10 50 h 2 2 1 5 3 11 Đa dạng di truyền Hd () 0,4670 ± 0,1320 0,4670 ± 0,1320 0,000 0,822 ± 0,097 0,7330 ± 0,0760 0,853 0,025 Π () 0,00149 ± 0,00042 0,00074 ± 0,00021 0,000 0,0205 ± 0,00037 0,01125 ± 0,00217 0,01132 0,00033 *Ghi chú n: số lượng các trình tự trong phân tích, h: số lượng haplotype, hd: đa dạng haplotyp, π: đa dạng nucleotide. : average value (giá trị trung bình) SD: standard deviation (Độ lệch chuẩn) Qua Bảng 3.5 với vùng gen COI của 50 mtADN từ mẫu cá Bỗng nghiên cứu đã phát hiện có tổng số haplotype (h) = 11, đa dạng haplotype (hd) = 0,853 0,025, đa dạng nucleotide (π) = 0,01132 0,00033. Trong đó quần thể cá Bỗng Hà Giang có đa dạng di truyền vùng gen COI cao nhất (hd = 0,822 ± 0,097, π = 0,00205 ± 0,00037). Quần thể cá Bỗng ở Hòa Bình và Sơn La có mức độ đa dạng di truyền trung bình và tương đương nhau. Không có sự sai khác về đa dạng di truyền trong quần thể cá Bỗng Tuyên Quang. Cho đến nay nghiên cứu về đa dạng di truyền cá Bỗng được công bố rất hạn chế. Các công bố chủ yếu do các tác giả Trung Quốc. Huang và ctv (2011) khi nghiên cứu trình tự ADN vùng gen ty thể Cytochome b của 57 mẫu cá Bỗng để đánh giá đa dạng di truyền cá Bỗng S.sinensis ở sông Giang Tây 50 (Trung Quốc) đã báo cáo đa dạng haplotype của các quần thể là 0,782 và đa dạng của nucleotide là 0,0025. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của các mẫu cá Bỗng thu được trong nghiên cứu này cũng tương tự với kết quả nghiên cứu của Huang và ctv. Như vậy đa dạng haplotype và đa dạng nucleotide của cá Bỗng trong nghiên cứu này là thấp nhưng đã cung cấp bước đầu các thông tin cần thiết về cây phân nhóm các mẫu cá Bỗng ở sông, suối một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam. 3.2.2. Mối quan hệ di truyền giữa các quần thể cá Bỗng nghiên cứu 3.2.2.1. Khoảng cách di truyền giữa các cá thể Khoảng cách di truyền vùng gen 16S và COI từ mtADN giữa các cá thể của 5 quần thể được trình bày ở Bảng phụ lục 1 và phụ lục 2. Kết quả cho thấy, khoảng cách di truyền giữa các cá thể cá Bỗng thu ở 7 tỉnh dao động từ 0,00 – 0,04. Trong đó một số mẫu ở Sơn La và Lạng Sơn, Hòa Bình và Lạng Sơn khoảng cách di truyền cao, dao động từ 0,36 – 0,4. Phát hiện sự sai khác về khoảng cách di truyền giữa một số mẫu ở Sơn La và Hòa Bình là rất thấp, dao động từ 0,002 – 0,011, một số mẫu ở Hòa Bình và Thanh Hóa có khoảng cách di truyền d = 0. Về khoảng cách di truyền trung bình giữa các cá thể trong từng quần thể đối với vùng gen 16S cho thấy, quần thể cá Bỗng ở Hà Giang có khoảng cách di truyền cao nhất, tiếp đến là quần thể ở Sơn La, Hoà Bình và Tuyên Quang và thấp nhất là ở quần thể cá Bỗng ở Lạng Sơn. Ở vùng gen COI, khoảng cách di truyền trung bình giữa các cá thể nhìn chung là thấp, hầu như không có sự khác biệt. Khoảng cách di truyền cao nhất ở quần thể Lạng Sơn, tiếp đến là quần thể ở Sơn La, Hà Giang; ở quần thể Hòa Bình và Tuyên Quang không phát hiện có sự sai khác về khoảng cách di truyền trung bình giữa các cá thể (Bảng 3.6). 51 Bảng 3.6. Khoảng cách di truyền giữa các cá thể trong quần thể cá Bỗng Vùng gen Sơn La Hòa Bình Tuyên Quang Hà Giang Lạng Sơn 16S 0,003 0,003 0,002 0,004 0,000 COI 0,001 0,000 0,000 0,001 0,006 3.2.2.2. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể Khoảng cách di truyền giữa các quần thể cá Bỗng đối với vùng gen 16S và COI được trình bày qua Bảng 3.7 và Bảng 3.8. Bảng 3.7. Ước lượng khoảng cách di truyền giữa các quần thể cá Bỗng dựa trên trình tự vùng gen 16S Sơn La Hòa Bình Sơn La Hòa Bình Tuyên Quang 0,004 0,013 0,012 Hà Giang Lạng Sơn 0,011 0,039 0,009 0,037 Tuyên Quang Hà Giang 0,004 0,030 0,031 Bảng 3.8. Ước lượng khoảng cách di truyền giữa các quần thể cá Bỗng dựa trên trình tự vùng gen COI Sơn La Hòa Bình Sơn La Hòa Bình Tuyên Quang 0,001 0,012 0,011 Hà Giang Lạng Sơn 0,011 0,009 0,011 0,009 Tuyên Quang Hà Giang 0,001 0,004 0,005 Từ số liệu ở Bảng 3.7 và Bảng 3.8 cho thấy khoảng cách di truyền giữa các quần thể là tương đối thấp. Đối với vùng gen 16S, khoảng cách di truyền giữa các quần thể dao động từ 0,004 – 0,039 và từ 0,001 – 0,012 đối với vùng gen COI. Khoảng cách về mặt địa lý giữa các tỉnh miền núi phía Bắc là không lớn, khí hậu và địa hình không nhiều khác biệt có thể đã dẫn đến các quần thể cá Bỗng không có sự khác nhau rõ rệt. 52 Như vậy có thể thấy rằng đa dạng di truyền ở các quần thể cá Bỗng được nghiên cứu không cao nhưng kết quả ban đầu cho thấy trình tự ADN ty thể có hiệu quả trong việc đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu sơ đồ phả hệ và phân loại cá Bỗng. 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận. Kết quả phân loại bằng hình thái: - Nhóm mẫu cá Bỗng thu ở Tuyên Quang, Hà Giang và Lạng Sơn được phân loại thuộc loài cá Bỗng Spinibarbus denticulatus. - Nhóm mẫu cá Bỗng thu ở Sơn La và Hòa Bình được phân loại thuộc loài Spinibarbus sp và có nhiều đặc điểm gần với loài cá Bỗng thon S. nammauensis Nguyen & Nguyen. Kết quả phân loại bằng chỉ thị phân tử: - Kết quả phân loại cá Bỗng bằng chỉ thị phân tử cho thấy cá bỗng ở các tỉnh Sơn La, Hòa Bình, Tuyên Quang, Hà Giang, Cao Bằng, và Lạng Sơn có mức độ tương đồng trình tự nucleotide vùng 16S và vùng COI cao, gần gũi với nhau về mặt di truyền và thuộc loài S. denticulatus. - Các quần thể cá Bỗng ở sông suối các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam được nghiên cứu nhìn chung có đa dạng di truyền thấp. Tuy nhiên, quần thể cá Bỗng ở Hà Giang có đa dạng di truyền cao nhất so với các quần thể các bỗng khác trong nghiên cứu. Đề xuất. - Tiếp tục nghiên cứu phát hiện marker phân tử trong nhân tế bào như microsatellite, SNP, để bổ sung số liệu đánh giá đa dạng di truyền cá Bỗng ở miền núi phía Bắc. - Quần thể cá Bỗng Hà Giang có đa dạng di truyền cao và là nguồn gen quý cần được nghiên cứu bảo tồn và khai thác. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1 Nguyễn Anh và ctv (2009), Xác định trình tự gen 16S rADN và gen Cytb hệ gen ty thể của 8 loài cá Song có giá trị kinh tế cao thu thập tại vùng biển Việt Nam, Tạp chí Công nghệ Sinh học 5 (2), tr. 171 – 178, 2007. 2 Bộ Khoa học và Công nghệ (1996), Nguồn lợi thủy sản Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 3 Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007), “Sách Đỏ Việt Nam, phần I- động vật”, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội. 4 Bộ Tài nguyên và Môi trường (2004), “Đa dạng sinh học và bảo tồn”, Hà Nội. 5 Bộ Tài nguyên và Môi trường (2005), “Báo cáo hiện trạng môi trường Quốc gia- Chuyên đề ĐDSH”, Hà Nội. 6 Bộ Tài nguyên và Môi trường (2010), “Báo cáo hiện trạng môi trường Quốc gia- Chuyên đề ĐDSH”, Hà Nội. 7 Bộ Tài nguyên và Môi trường (2010), “Bối cảnh - sự cần thiết xây dựng chiến lược quốc gia về ĐDSH đến năm 2020”, Hà Nội. 8 Bộ Tài nguyên và Môi trường (2011), “Báo cáo quốc gia về Đa dạng sinh học”, Hà Nội. 9 Chính phủ nước CHXHCN Việt Nam (2006), “Nghị định 32/2006/NĐ-CP, về quản lý động vật rừng, thực vật rừng nguy cấp, quý hiếm”, Hà Nội. 10 Cộng hoà xã hội chủ nghĩa Việt Nam (2008), “Luật số 20/2008/QH12, luật Đa dạng sinh học”, NXB Hồng Đức. 11 Phạm Báu (1998), Điều tra các loài cá kinh tế trên hệ thống sông Lô, Gâm, Tuyển tập báo cáo Khoa học toàn quốc nuôi trồng thủy sản, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, Bắc Ninh 2000. 55 12 Thai Thanh Binh và Chris Austin (2012), Nhận dạng các loài cua Xanh ở Việt Nam bằng giải trình tự ADN ty thể vùng gen COI, Tạp chí Khoa học và Công nghệ tháng 7/2012. 13 Nguyễn Hữu Dực, Nguyễn Văn Hảo (1997), Giống cá Chầy đất ở Việt Nam và mô tả 2 loài mới thuộc giống này, Tạp chí khoa học đại học Quốc gia Hà Nội. 14 Nguyễn Hữu Dực (2005), Nghiên cứu khu hệ cá sông Đà thuộc tỉnh Lai Châu, Sơn La, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 15 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học phân tử, tr. 12 – 18, NXB Giáo dục, Hà Nội. 16 Hoàng Đức Đạt (1963), Nghiên cứu đặc điểm sinh dưỡng và sinh sản của cá Bỗng, tr.57 – 61, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 17 Đoàn Văn Đẩu, Lê Thị Lệ (1973), Điều tra nguồn lợi thủy sản nước ngọt. Tuyển tập 1, tr. 252 – 270, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 18 Phạm Thị Minh Giang (1973), Định loại cá bằng phương pháp hình thái ngoài, tr. 109 -122, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 19 Trần Thúy Hà (2012), Sử dụng 5 chỉ thị Microsatellite để đánh giá đa dạng di truyền 5 quần thể Tôm thẻ chân trắng (Litopennaeus vannamei) nuôi ở Việt Nam, Tạp chí Nông Nghiệp và PTNT 2013, tập 11, số 6, tr 797 – 803. 20 Nguyễn Văn Hảo, Ngô Sỹ Vân (2001), Cá nước ngọt Việt Nam, tập 1 Họ cá chép, tr. 260 – 440, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 21 Cao Xuân Hiếu (2005), Phân tích trình tự đoạn gen mã hóa 18s rRNA của một số loài cá kinh tế Biển Đông, tr. 18 – 26, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 22 Nguyễn Như Hiền (2003), Sinh học tế bào, tr. 211 – 250, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội. 56 23 Vương Dĩ Khang (1963), Ngư loại phân loại học, Tập 1, tr. 235 – 287, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, (Nguyễn Bá Mão, dịch). 24 Mayr E. (1974), Những nguyên tắc phân loại động vật, tr. 346 – 470, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 25 Pravdin I.F. (1973), Hướng dẫn nghiên cứu cá, tr. 198 – 268, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội (Nguyễn Thị Minh Giang dịch). 26 Dương Quang Ngọc (2005), Đa dạng sinh học loài cá Sông Mã, tr. 62 -70, Luận án tiến sĩ, Trường Đại học sư phạm Vinh. 27 Hoàng Xuân Quang (2008), Tài liệu dùng cho bài thực hành phân loại cá, Trường Đại học sư phạm Vinh. 28 Vũ Đặng Hạ Quyên (2014), Sử dụng trình tự gen 16S của ADN ty thể để kiểm chứng phân loại dựa vào hình thái và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá nghiên cứu, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2014 (11), tr. 123 – 131. 29 Vũ Trung Tạng và Nguyễn Đình Mão (2005), Ngư loại học, tr. 123 – 186, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 30 Khuất Hữu Thanh ( 2003), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, tr. 72 – 140, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 31 Nguyễn Bá Thông (1999), Xác đinh một số chỉ tiêu sinh lý sinh thái cá Bỗng (Spinibarbus denticulatus Oshima,1926) ở giai đoạn cá hương, NXB Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội. 32 Lê Thông (2003), Địa lý các tỉnh, thành phố Việt Nam, tập 3, NXB Giáo dục, Hà Nội. 33 Nguyễn Thị Thảo (2004), Đánh giá đa hình 3 quần đàn Tôm sú nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp Microsatellite, Tạp chí Công nghệ Sinh học 2(3), tr. 315 – 324. 57 34 Nguyễn Thị Thảo (2004), Quyền Đình Thi và Lê Thị Tuyết (2003), Sử dụng Microsatellite, mtRFLP và RAPD để phân tích đa hình Tôm sú, Tạp chí Công nghệ Sinh học 1 (3), tr. 287 – 289. 35 Quyền Đình Thi và Phạm Anh Tuấn (2004), Sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa hình đàn cá Tra nuôi ở Việt Nam, Tuyển tập hội thảo toàn quốc về NC và UDKHCN trong nuôi trồng Thủy Sản, tr. 919 – 938. 36 Nguyễn Thị Anh Thư (2014), Nghiên cứu di truyền quần thể của Trai Tai Tượng ở vùng biển Nam Trung Bộ và Nam Bộ, Việt Nam, Tạp chí Sinh học 2014, 36 (1), tr. 189 – 194. 37 Nguyễn Thái Tự ( 1983), Khu hệ cá lưu vực Sông Lam. tr. 64 – 80, Luận án PTS Trường Đại học sư phạm Hà Nội. 38 Trương Ngọc Trinh (2012), So sánh đặc điểm hình thái và di truyền của các dòng cá rô đồng bằng giải trình tự vùng gen COI. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2012 (1), tr. 133 – 140. 39 Nguyễn Tấn Trịnh, Hà Ký, Bùi Đình Chung, Trần Mai Thiên (1996). Nguồn lợi thuỷ sản Việt Nam, tr. 86 – 128. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 40 Nguyễn Thanh Tuyền (2009), Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn khử nitrat trong một số môi trường sinh thái ở Việt Nam, Tạp chí Đại học Quốc Gia Hà Nội 2(3), tr. 278 – 287. 41 Mai Đình Yên (1969), Cá loài cá kinh tế nước ngọt Miền Bắc Việt Nam, tr. 108 – 193, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 42 Mai Đình Yên (1978), Định loại cá nước ngọt các tỉnh Bắc Việt Nam. Tr. 87 – 165, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 43 Mai Đình Yên (1993), Cá kinh tế nước ngọt Việt Nam, tr. 46 – 154, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 58 Tài liệu tiếng Anh 44 Avise J.C (2000), Phylogeography: The History and Formation of Species. Harvard University Press, Cambridge, pp. 447. 45 Thai Thanh Binh, Ngo Si Van, Phan Dinh Phuc, Chris Austin (2007), Phylogenetic evaluation of subfamily classification of the Cyprinidae focusing on Vietnamese species. Aquatic Living Resource, 20(2), pp. 143-153. 46 Chu Xinluo and Chen Yinrui (1989), The fishes of Yunnan, China, part II. 47 Hall B. G. (2013), Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA. Mol. Biol. Evol., 30(5), pp. 1229-1235. 48 Hall T.A. (2013), BioEdit: a user – friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows. Nucl. Acids. Symp. 49 Huckstorf V. ( 2012), Spinibarbus denticulatus, In: IUCN 2013, IUCN Red List of Threatened Species, Version 2013. 50 Kottelat M. (2001), Freshwater Fishes of Northern Viet Nam, Environmen and Social sector unit, East Asia and Pacific region. 51 Kottelat M. (2006), Fishes of Lao, The IUCN Environmen and Social sector unit, East Asia and Pacific region. 52 Kuhner, J.Felsenstein (2000), Molecular Biology and Evolution (11), pp. 459. 53 Liao F. C., He W., Huang X. R. (2002), Situation and variation of fisheries resources in Dongting Lake. Journal of Hydrobiology, 26(6), pp. 623-627. 54 Li J., Wang X., Kong X., Zhao K., He S. (2008), Variation patterns of the mitochondrial 16S rRNA gene with secondary structure constraints and their application to phylogeny of cyprinine fishes (47), pp. 472-487. 55 Li (2009), MicroRNA-276a Functions in Ellipsoid Body and Mushroom Body Neurons for Naive and Conditioned Olfactory Avoidance in Drosophila, J. Neurosci, 33(13), 5821tr. 5833. 59 56 Librado P., Rozas J. (2009), DnaSP5.10: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics, 52(11), pp. 1451 – 1452. 57 Lovejoy N.R., Collette B.B., McEachran J.D. (2001), Phylogenetic Relationships of New World Needlefishes (Teleostei: Belonidae) and the Biogeography of Transitions between Marine and Freshwater Habitats, pp. 324-338. 58 Luo W. K. and Xie Z. Y. (2004), Experiment on Spinibarbus denticulatus denticulatus cultured in reservoir net cages. Guangxi fisheries science and technology, pp. 14-15. 59 Miya M. and Nishida M. (2000), Use of Mitogenomic Information in Teleostean Molecular Phylogenetics: A Tree-Based Exploration under the Maximum-Parsimony Optimality Criterion, (17) pp. 437- 455. 60 Nei M. and Kumar (2000), Molecular Evolution and Phylogenetics, Oxford University Press, New York, pp. 333 61 Jiang L. Y., Yu X. L., Chen F. Y. (2003), The Age and Growth of Spinibarbus denticulatus denticulatus underculture condition. Journal of Zhanjiang marine university, 23(4): 6-13. 62 Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisher Sciences (1991), Guangdong ichthyography of freshwater fishes. Press of science and technology of Guangdong. Guangzhou, 141-143. 63 Reid and Miller (1989), The Scientific Basis for Conserving Biological Diversity, World Resources Institute. 64 Shanghai Fisheries (1979), Histology and Embryology, Agriculture press, Beijing, 152-161. 65 Swofford D.L. and Olsen (1996), Phylogenetic Inference, Molecular Systematics, 407-514. 60 66 Taylor and Turnbull (2005), Mitochondrial medicine: A metabolic perspective on the pathology of oxidative phosphorylation disorders. 67 Xiao W., Zhang Y., Liu H. (2001), Molecular Systematics of Xenocyprinae (Teleostei: Cyprinidae): Taxonomy, Biogeography, and Coevolution of a Special Group Restricted in East Asia. Mol Phylogenet Evol 18: 163-173. 68 Yang J.X. and Y.R. Chen (1995), The biology and resource utilization of the fishes of Fuxian Lake, Yunnan. Yunnan Science and Technology Press, Kunming, China. Trang Web 69 https://vi.wikipedia.org/wiki/Vùng_Đông_Bắc_(Việt_Nam) 70 https:// vi.wikipedia.org/wiki/Vùng_Tây_Bắc_(Việt_Nam) 71 http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/mtdna 72 61 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank PHỤ LỤC Phụ lục 1: Khoảng cách di truyền vùng gen 16S giữa các cá thể cá Bỗng nghiên cứu SL1 SL2 SL3 SL4 SL5 SL6 SL7 SL8 SL9 SL10 HB1 HB2 HB3 SL1 SL2 0,002 SL3 0,000 0,002 SL4 0,000 0,002 0,000 SL5 0,002 0,000 0,002 0,002 SL6 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 SL7 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 0,000 SL8 0,002 0,000 0,002 0,002 0,000 0,002 0,002 SL9 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 SL10 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 HB1 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 HB2 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,000 HB3 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,000 0,000 HB4 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,000 0,009 0,009 0,009 HB4 HB5 HB6 HB7 HB8 HB5 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,000 0,000 0,000 0,009 HB6 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,000 0,009 0,009 0,009 0,000 0,009 HB7 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,000 0,000 0,000 0,009 0,000 0,009 HB8 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,000 0,000 0,000 0,009 0,000 0,009 0,000 HB9 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,000 0,000 0,000 0,009 0,000 0,009 0,000 0,000 HB10 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,000 0,000 0,000 0,009 0,000 0,009 0,000 0,000 TQ1 0,014 0,016 0,014 0,014 0,016 0,014 0,014 0,016 0,014 0,020 0,013 0,013 0,013 0,020 0,013 0,020 0,013 0,013 TQ2 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,009 0,009 0,009 0,018 0,009 0,018 0,009 0,009 TQ3 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,009 0,009 0,009 0,018 0,009 0,018 0,009 0,009 TQ4 0,014 0,016 0,014 0,014 0,016 0,014 0,014 0,016 0,014 0,020 0,013 0,013 0,013 0,020 0,013 0,020 0,013 0,013 TQ5 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,009 0,009 0,009 0,018 0,009 0,018 0,009 0,009 TQ6 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,009 0,009 0,009 0,018 0,009 0,018 0,009 0,009 TQ7 0,014 0,016 0,014 0,014 0,016 0,014 0,014 0,016 0,014 0,020 0,013 0,013 0,013 0,020 0,013 0,020 0,013 0,013 TQ8 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,009 0,009 0,009 0,018 0,009 0,018 0,009 0,009 TQ9 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,009 0,009 0,009 0,018 0,009 0,018 0,009 0,009 TQ10 0,014 0,016 0,014 0,014 0,016 0,014 0,014 0,016 0,014 0,020 0,013 0,013 0,013 0,020 0,013 0,020 0,013 0,013 HG1 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,014 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 HG2 0,005 0,007 0,005 0,005 0,007 0,005 0,005 0,007 0,005 0,013 0,005 0,007 0,005 0,005 0,007 0,005 0,005 0,007 HG3 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014 0,013 0,020 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014 HG4 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 HG5 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 HG6 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,014 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 HG7 0,005 0,007 0,005 0,005 0,007 0,005 0,005 0,007 0,005 0,013 0,005 0,007 0,005 0,005 0,007 0,005 0,005 0,007 HG8 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 HG9 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,018 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 0,011 0,011 0,013 HG1 0 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014 0,013 0,020 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014 0,013 0,013 0,014 LS1 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS2 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS3 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS4 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS5 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS6 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS7 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS8 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS9 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 LS10 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 0,038 0,038 0,040 CB1 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,014 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 0,007 0,007 0,009 HQ1 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 HQ2 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 HQ3 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,009 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 0,002 0,002 0,004 HB9 HB1 0 TQ1 TQ2 TQ3 TQ4 TQ5 TQ6 TQ7 TQ8 HB10 0,00 0 TQ1 0,01 3 0,013 TQ2 0,00 9 0,009 0,004 TQ3 0,00 9 0,009 0,004 0,000 TQ4 0,01 3 0,013 0,000 0,004 0,004 TQ5 0,00 9 0,009 0,004 0,000 0,000 0,004 TQ6 0,00 9 0,009 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 TQ7 0,01 3 0,013 0,000 0,004 0,004 0,000 0,004 0,004 TQ8 0,00 9 0,009 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 TQ9 0,00 9 0,009 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 TQ10 0,01 3 0,013 0,000 0,004 0,004 0,000 0,004 0,004 0,000 0,004 TQ9 0,004 TQ10 HG1 HG2 HG3 HG4 HG5 HG6 HG1 0,00 7 0,014 0,011 0,007 0,007 0,011 0,007 0,007 0,011 0,007 0,007 0,011 HG2 0,00 5 0,013 0,009 0,005 0,005 0,009 0,005 0,005 0,009 0,005 0,005 0,009 0,00 2 HG3 0,01 3 0,020 0,005 0,002 0,002 0,005 0,002 0,002 0,005 0,002 0,002 0,005 0,00 9 0,00 7 HG4 0,01 1 0,018 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,00 7 0,00 5 0,00 2 HG5 0,01 1 0,018 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,00 7 0,00 5 0,00 2 0,00 0 HG6 0,00 7 0,014 0,011 0,007 0,007 0,011 0,007 0,007 0,011 0,007 0,007 0,011 0,00 0 0,00 2 0,00 9 0,00 7 0,00 7 HG7 0,00 5 0,013 0,009 0,005 0,005 0,009 0,005 0,005 0,009 0,005 0,005 0,009 0,00 2 0,00 0 0,00 7 0,00 5 0,00 5 0,002 HG8 0,01 1 0,018 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,00 7 0,00 5 0,00 2 0,00 0 0,00 0 0,007 HG9 0,01 1 0,018 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,004 0,00 7 0,00 5 0,00 2 0,00 0 0,00 0 0,007 HG1 0 0,01 3 0,020 0,005 0,002 0,002 0,005 0,002 0,002 0,005 0,002 0,002 0,005 0,00 9 0,00 7 0,00 4 0,00 2 0,00 2 0,009 LS1 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS2 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS3 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS4 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS5 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS6 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS7 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS8 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS9 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 LS10 0,03 8 0,038 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,029 0,029 0,031 0,03 1 0,03 3 0,03 1 0,02 9 0,02 9 0,031 CB1 0,00 7 0,014 0,011 0,007 0,007 0,011 0,007 0,007 0,011 0,007 0,007 0,011 0,00 0 0,00 2 0,02 9 0,00 7 0,00 7 0,000 HQ1 0,00 2 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,00 5 0,00 4 0,01 1 0,00 9 0,00 9 0,005 HQ2 0,00 2 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,00 5 0,00 4 0,01 1 0,00 9 0,00 9 0,005 HQ3 0,00 2 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,009 0,009 0,013 0,00 5 0,00 4 0,01 1 0,00 9 0,00 9 0,005 HG7 HG8 HG9 HG1 0 LS1 LS2 LS3 LS4 LS5 LS6 HG8 0,00 5 HG9 0,00 5 0,000 HG1 0 0,00 7 0,002 0,002 LS1 0,03 3 0,029 0,029 0,031 LS2 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 LS3 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 0,000 LS4 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 0,000 0,000 LS5 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 0,000 0,000 0,000 LS6 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 LS7 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 LS8 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 LS7 0,000 LS8 LS9 LS10 CB1 HQ1 HQ2 HQ3 LS9 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 LS10 0,03 3 0,029 0,029 0,031 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,00 0 CB1 0,00 2 0,007 0,007 0,009 0,031 0,031 0,031 0,031 0,031 0,031 0,031 0,031 0,03 1 0,03 1 HQ1 0,00 4 0,009 0,009 0,011 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,03 7 0,03 7 0,00 5 HQ2 0,00 4 0,009 0,009 0,011 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,03 7 0,03 7 0,00 5 0,00 0 HQ3 0,00 4 0,009 0,009 0,011 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,037 0,03 7 0,03 7 0,00 5 0,00 0 0,00 0 HB5 HB6 HB7 Phụ lục 2: Khoảng cách di truyền vùng gen COI giữa các cá thể cá Bỗng nghiên cứu SL1 SL2 SL3 SL4 SL5 SL1 SL2 0,000 SL3 0,003 0,003 SL4 0,000 0,000 0,003 SL5 0,000 0,000 0,003 0,000 SL6 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 SL6 SL7 SL8 SL9 SL10 HB1 HB2 HB3 HB4 HB8 SL7 0,000 0,000 0,003 0,000 0,000 0,003 SL8 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,003 SL9 0,000 0,000 0,003 0,000 0,000 0,003 0,000 0,003 SL10 0,000 0,000 0,003 0,000 0,000 0,003 0,000 0,003 0,000 HB1 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 HB2 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,003 0,000 0,003 0,003 0,002 HB3 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,002 HB4 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,002 0,000 HB5 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,003 0,000 0,003 0,003 0,002 0,000 0,002 0,002 HB6 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 HB7 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 0,000 HB8 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 HB9 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,003 0,000 0,003 0,003 0,002 0,000 0,002 0,002 0,000 0,002 0,002 0,002 HB10 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 TQ1 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 TQ2 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,109 0,021 0,021 0,109 0,021 0,021 0,021 TQ3 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 TQ4 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 TQ5 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 TQ6 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 TQ7 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 TQ8 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 TQ9 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 TQ10 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 HG1 0,019 0,019 0,016 0,019 0,019 0,016 0,019 0,016 0,019 0,019 0,018 0,016 0,018 0,018 0,016 0,018 0,018 0,018 HG2 0,021 0,021 0,018 0,021 0,021 0,018 0,021 0,018 0,021 0,021 0,019 0,018 0,019 0,019 0,018 0,019 0,019 0,019 HG3 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 HG4 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 HG5 0,021 0,021 0,018 0,021 0,021 0,018 0,021 0,018 0,021 0,021 0,019 0,018 0,019 0,019 0,018 0,019 0,019 0,019 HG6 0,021 0,021 0,018 0,021 0,021 0,018 0,021 0,018 0,021 0,021 0,019 0,018 0,019 0,019 0,018 0,019 0,019 0,019 HG7 0,021 0,021 0,018 0,021 0,021 0,018 0,021 0,018 0,021 0,021 0,019 0,018 0,019 0,019 0,018 0,019 0,019 0,019 HG8 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 HG9 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 HG1 0 0,019 0,019 0,016 0,019 0,019 0,016 0,019 0,016 0,019 0,019 0,018 0,016 0,018 0,018 0,016 0,018 0,018 0,018 LS1 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,024 0,023 0,024 0,024 0,023 0,024 0,024 0,024 LS2 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 LS3 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,003 0,000 0,003 0,003 0,002 0,000 0,002 0,002 0,000 0,002 0,002 0,002 LS4 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,024 0,023 0,024 0,024 0,023 0,024 0,024 0,024 LS5 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 LS6 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,003 0,000 0,003 0,003 0,002 0,000 0,002 0,002 0,000 0,002 0,002 0,002 LS7 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 LS8 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,003 0,000 0,003 0,003 0,002 0,000 0,002 0,002 0,000 0,002 0,002 0,002 LS9 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,024 0,023 0,024 0,024 0,023 0,024 0,024 0,024 LS10 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 CB1 0,023 0,023 0,019 0,023 0,023 0,019 0,023 0,019 0,023 0,023 0,021 0,019 0,021 0,021 0,019 0,021 0,021 0,021 HQ1 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,000 0,002 0,000 0,000 0,002 0,000 0,000 0,000 HQ2 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,002 0,003 0,002 0,002 0,003 0,002 0,002 0,002 HQ3 0,003 0,003 0,000 0,003 0,003 0,000 0,003 0,000 0,003 0,003 0,002 0,000 0,002 0,002 0,000 0,002 0,002 0,002 HB9 HB1 0 TQ1 TQ2 TQ3 TQ4 TQ5 TQ6 TQ7 TQ8 HB10 0,00 2 TQ1 0,01 9 0,021 TQ2 0,10 9 0,021 0,000 TQ3 0,01 9 0,021 0,000 0,000 TQ4 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 TQ5 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 TQ6 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 TQ7 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 TQ8 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 TQ9 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 TQ10 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 TQ9 0,000 TQ10 HG1 HG2 HG3 HG4 HG5 HG6 HG1 0,01 6 0,018 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 HG2 0,01 8 0,019 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,00 5 HG3 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,00 3 0,00 2 HG4 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,00 3 0,00 2 0,00 0 HG5 0,01 8 0,019 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,00 2 0,00 3 0,00 2 0,00 2 HG6 0,01 8 0,019 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,00 2 0,00 3 0,00 2 0,00 2 0,00 3 HG7 0,01 8 0,019 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,00 5 0,00 0 0,00 2 0,00 2 0,00 3 0,003 HG8 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,00 3 0,00 2 0,00 0 0,00 0 0,00 2 0,002 HG9 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,00 3 0,00 2 0,00 0 0,00 0 0,00 2 0,002 HG1 0 0,01 6 0,018 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,00 0 0,00 5 0,00 3 0,00 3 0,00 2 0,002 LS1 0,02 3 0,024 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,00 6 0,00 5 0,00 3 0,00 3 0,00 5 0,005 LS2 0,01 9 0,021 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,00 6 0,00 5 0,00 3 0,00 3 0,00 5 0,005 LS3 0,00 0 0,002 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,01 6 0,01 8 0,01 9 0,01 9 0,01 8 0,018 LS4 0,02 3 0,024 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,00 6 0,00 5 0,00 3 0,00 3 0,00 5 0,005 LS5 0,01 9 0,021 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,00 6 0,00 5 0,00 3 0,00 3 0,00 5 0,005 LS6 0,00 0 0,002 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,01 6 0,01 8 0,01 9 0,01 9 0,01 8 0,018 LS7 0,01 9 0,021 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,00 6 0,00 5 0,00 3 0,00 3 0,00 5 0,005 LS8 0,00 0 0,002 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,01 6 0,01 8 0,01 9 0,01 9 0,01 8 0,018 LS9 0,02 3 0,024 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,00 6 0,00 5 0,00 3 0,00 3 0,00 5 0,005 LS10 0,01 9 0,021 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,00 6 0,00 5 0,00 3 0,00 3 0,00 5 0,005 CB1 0,01 9 0,021 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,00 3 0,00 2 0,00 0 0,00 0 0,00 2 0,002 HQ1 0,00 2 0,000 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,021 0,01 8 0,01 9 0,02 1 0,02 1 0,01 9 0,019 HQ2 0,00 3 0,002 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,01 9 0,02 1 0,02 3 0,02 3 0,02 1 0,021 HQ3 0,00 0 0,002 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 0,01 6 0,01 8 0,01 9 0,01 9 0,01 8 0,018 HG7 HG8 HG9 HG1 0 LS1 LS2 LS3 LS4 LS5 LS6 HG8 0,00 2 HG9 0,00 2 0,000 HG1 0 0,00 5 0,003 0,003 LS1 0,00 5 0,003 0,003 0,006 LS2 0,00 5 0,003 0,003 0,006 0,006 LS3 0,01 8 0,019 0,019 0,016 0,023 0,019 LS4 0,00 5 0,003 0,003 0,006 0,000 0,006 0,023 LS5 0,00 5 0,003 0,003 0,006 0,006 0,000 0,019 0,006 LS6 0,01 8 0,019 0,019 0,016 0,023 0,019 0,000 0,023 0,019 LS7 0,00 5 0,003 0,003 0,006 0,006 0,000 0,019 0,006 0,000 0,019 LS8 0,01 8 0,019 0,019 0,016 0,023 0,019 0,000 0,023 0,019 0,000 LS7 0,019 LS8 LS9 LS10 CB1 HQ1 HQ2 HQ3 LS9 0,00 5 0,003 0,003 0,006 0,000 0,006 0,023 0,000 0,006 0,023 0,006 0,023 LS10 0,00 5 0,003 0,003 0,006 0,006 0,000 0,019 0,006 0,000 0,019 0,000 0,019 0,00 6 CB1 0,00 2 0,000 0,000 0,003 0,003 0,003 0,019 0,003 0,003 0,019 0,003 0,019 0,00 3 0,00 3 HQ1 0,01 9 0,021 0,021 0,018 0,024 0,021 0,002 0,024 0,021 0,002 0,021 0,002 0,02 4 0,02 1 0,02 1 HQ2 0,02 1 0,023 0,023 0,019 0,026 0,023 0,003 0,026 0,023 0,003 0,023 0,003 0,02 6 0,02 3 0,02 3 0,00 2 HQ3 0,01 8 0,019 0,019 0,016 0,023 0,019 0,000 0,023 0,019 0,000 0,019 0,000 0,02 3 0,01 9 0,01 9 0,00 2 0,00 3 Phụ lục 3: Khóa định loại phân họ BARBINAE. 1(10) Môi dưới bao chặt ở ngoài của hàm dưới làm cho nếp bên môi cũng là nếp bên của bụng bao lấy hàm dưới 2(5) Trước vây lưng có gai ngược 3(4) Rãnh sau môi dưới nối liền. Tia đơn cuối vây lưng hóa xương cứng, lớn.............................................................................Paraspinibarbus 4(3) Rãnh sau môi dưới gián đoạn ở giữa. Tia đơn cuối vây lưng mỏng mềm.................................................................................. Spinibarbus 5(2) Trước vây lưng không có gai ngược. 6(7) Mõm ngắn, chiều dài mõm tương đương đường kính mắt .......................................................................................Capoeta 7(6) Mõm tương đối dài, chiều dài mõm lớn hơn đường kính mắt rất rõ ràng. 8(9) Da môi không tách ra khỏi hàm dưới bởi một rãnh.......................................................................................Propuntius 9(8) Da môi tách ra khỏi hàm dưới bởi một rãnh......Barbodes 10(1) Môi dưới và hàm dưới phân hóa cánh môi lùi về phía sau khiến cho hàm dưới nhô ra phía ngoài, mút trước của hàm dưới cũng lộ ra. 11(12) Miệng dưới hoặc kề dưới hình cung................Acrossocheilus 12(11) Miệng dưới hoặc kề dưới, mép ngang mép trước hàm bằng phẳng................................................................................Varicorhinus Phụ lục 4: Một số hình ảnh thực địa thu mẫu Suối cá Thần – Cẩm Thủy – Thanh Hóa Cá Bỗng tại Xuân Nha – Mộc Châu – Sơn La Cá Bỗng Tràng Định - Lạng Sơn Phụ lục 5: Một số hình ảnh làm việc trong phòng thí nghiệm Phụ lục 6: Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR A Kết quả điện di sản phẩm PCR từ B Kết quả điện di sản phẩm PCR ADN tổng số mẫu thu tại Tuyên từ ADN tổng số mẫu thu tại Sơn La Quang (A) (B) Ghi chú: TQ: Tuyên Quang, M: Ghi chú: SL: Sơn La, M: Marker Marker C Kết quả điện di sản phẩm PCR D Kết quả điện di sản phẩm PCR từ ADN tổng số mẫu thu tại Hòa từ ADN tổng số mẫu thu tại Lạng Sơn Bình (C) (D) Ghi chú: HB: Hòa Bình, M: Marker Ghi chú: SL: Lạng Sơn, M: Marker [...]... ngọt, và tập hợp các HST mà sinh vật chỉ là một bộ phận ĐDSH bao gồm sự đa dạng trong một loài (đa dạng gen) hay còn gọi là đa dạng di truyền, sự đa dạng giữa các loài (đa dạng loài) và sự đa dạng hệ sinh thái (đa dạng HST) Nói cách khác ĐDSH là sự đa dạng của sự sống ở các cấp độ và các tổ hợp [6] 16 Đa dạng sinh học còn là sự đa dạng của các sinh vật trên trái đất, bao gồm cả sự đa dạng về di truyền của. .. thể của các loài cá Bỗng có sẵn trong ngân hàng gen được sử dụng để so sánh với mẫu cá Bỗng ở một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, sử dụng phần mềm BioEdit [48] và BLAST [72] Mối liên hệ giữa các loài cá Bỗng được xây dựng trên phần mềm MEGA6.0 [47] 2.2.2.4 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể cá Bỗng Đa dạng di truyền của các quần thể cá Bỗng được tính bằng: Tổng số haplotype (k): Haplotype là một. .. và ngày càng nhiều lên, do vậy mà suối cá Cẩm Lương đến giờ đã phát triển thành 2 suối cá song song Do những quan niệm của người dân ở Cẩm Thủy mà cá Bỗng ở đây mang ý nghĩa tâm linh đặc biệt góp phần vào việc bảo vệ đang dạng sinh học loài cá này 1.1.5 Nghiên cứu cá Bỗng trên thế giới và Việt Nam Cá Bỗng phân bố tự nhiên ở châu Á, bao gồm: miền Bắc Việt Nam, Lào, Vân Nam và Hải Nam Trung Quốc Cá Bỗng. .. tượng ở Việt Nam có mối quan hệ gần gũi về mặt di truyền với quần thể ở một số khu vực thuộc vùng biển Đông Nam Á [38] 26 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Cá Bỗng được thu mẫu trên các hệ thống sông, suối ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam: Sơn La, Hòa Bình, Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn và Thanh Hóa (Hình 2.1) Phân loại cá. .. vực Bắc Trung Bộ đã điều tra được 10 giống Tuy nhiên cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu đầy đủ về phân loại và đánh giá đa dạng di truyền cá 15 Bỗng phục vụ cho bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen Các nghiên cứu chỉ mới tập trung điều tra nguồn lợi tự nhiên, một số đặc điểm sinh học và thăm dò sinh sản 1.2 Đa dạng sinh học và tầm quan trọng của đa dạng quần thể Việc nghiên cứu đa dạng. .. hình Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam gồm các Tỉnh: Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La, Hòa Bình với tổng di n tích là 33.102,19 km 2 gồm các dãy núi phía Tây Bắc và đồi núi Đông Bắc Phía Tây Bắc là một vùng gồm chủ yếu là các núi có độ cao trung bình và cao Đây là nơi có địa hình cao nhất, bị chia cắt nhất và hiểm trở nhất Việt Nam Các dạng địa hình phổ biến ở đây là các dãy núi cao, các thung... tượng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành trên đối tượng cá Bỗng phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam (Tuyên Quang, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La và Hòa Bình) và cá Bỗng (Cá thần) ở Cẩm Thủy Thanh Hóa 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ngoài thực địa Phương pháp chọn địa điểm để thu mẫu: Các địa điểm thu mẫu được thiết kế theo sự khảo sát địa hình tại các vị trí trên các sông, suối. .. của cá Bỗng Một số nghiên cứu của Jiang [61] về mối quan hệ giữa tuổi và tốc độ sinh trưởng của cá trong điều kiện nuôi Yi Zusheng nghiên cứu về sự phát triển phôi thai cá Bỗng Luo [58] nghiên cứu mối quan hệ của sự phát triển phôi đến nhiệt độ và độ mặn Tuy nhiên phía Trung Quốc không công bố chi tiết các nghiên cứu này Đây là loài cá có giá trị kinh tế [68] và nó đã trở thành loài nuôi chính ở sông,. .. từ lâu ở các nước như Trung Quốc, Lào và Việt Nam nhưng những công trình nghiên cứu khoa học về loài cá này công bố rất hạn chế Các công trình công bố chủ yếu của các tác giả Trung Quốc Các nghiên cứu tập trung điều tra các đặc điểm sinh học của cá Bỗng ở ngoài tự nhiên và các hình thức nuôi 14 Ở Trung Quốc, cá Bỗng phân bố ở trung và thượng lưu sông Ngọc [54] [58] Ngư dân thường đánh bắt được cá có... tính khả thi do cá ưa thích sống trong môi trường nước trong, sạch, giàu ôxy và có nước chảy Chưa có công trình nghiên cứu đầy đủ về cá Bỗng, nhất là vấn đề bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen, mới dừng lại nghiên cứu sơ bộ về đặc điểm sinh học và vùng gen 16S, COI đã được ứng dụng và nghiên cứu thành công đối với một số loài cá ở nước ta như: cá Song, cá Trích 1.1.4 Giá trị của cá Bỗng 1.1.4.1