Đang tải... (xem toàn văn)
... strychnin sulfat 88,76% + Với dm dầu hoả nhiệt độ cao: Chiết nóng (chiết lần) hiệu suất chiết strychnin base 89,46% strychnin sulfat 88,44% 3.2 - Đề xuất: - Chúng nghiên cứu chiết strychnin từ... dụng ethanol để chiết chứa tạp sắc tố, nhựa nên không ảnh hưởng đến trình tinh chế Mặt khác độ tan strychnin ethanol cao, nên chiết nhiệt độ thường Chúng đặt vấn đề nghiên cứu chiết strychnin ethanol ... phần thu lần chiết cao cắc lần chiết sau thấp (so sánh với bảng 16 2.18), nguyên nhân là: + Ở lần chiết chiết ethanol 95° lấy dược liệu, lần chiết sau coi chiết ethanol cao độ mặt nước (Bằng cách
m BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐAI HOC D ươc HÀ NÔI ĐỖ THỊ HÀ 16. ý o p c 1'í' Tff .\ IH Ư -V IE S lĩ-c n k NGHIÊN CỨU CHIẾT STRYCHNIN SULFAT BANG ETHANOL (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩK H O Ả 2000 - 2005) - Ngưòi hướng dẫn: PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị - Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược Trường ĐH Dược Hà Nội - Thòi gian thực hiện: Tháng 02 - 05/2005 HÀ NỘI, 05 - 200p f . rtt w @ & Ị v_ M \U - Á LỜI CẢM ƠN Trong 3 tháng thực hiện khoá luận, vói sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo và các bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp “ Nghiên cứu chiết strychnin sulfat bằng ethanol Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. - Các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm. Hà Nội, ngày 28/05/2005. SINH VIÊN Đỗ Thị Hà MỤC LỤC Trang CHÚ GIẢI CHỮVIÊT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 01 PHẦN 1 - TỔNG QUAN 02 1.1-C â y Mã tiền 02 1.1.1- Đặc điểm thực vật 02 1.1.2- Phân bố và sinh thái 03 1.1.3 - Bộ phận dùng và thành phần hoá học 04 1.1.4-Ú n g dụng 05 1.2 -Strychnin 06 1.2.1- Công thức hoá học 06 1.2.2 - Tính chất 06 1.2.3 - Định tính, định lượng 08 1.2.4 - Tác dụng dược lý và ứng dụng 08 1 .3 - 09 Các phương pháp chiết xuất alcaloid 1.3.1-N guyêntắc chung 09 1.4 - Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết 13 1 .5 - Chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền 13 1.5.1 - Phương pháp chiết xuất strychnin ở Việt Nam 13 1.5.2 - Phương pháp chiết xuất strychnin trên thế giói 14 PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15 2.1 - Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 15 2.1.1 - Nguyên vật liệu 15 2 .1 .2 - 15 Phương pháp thực nghiệm 2.2 - Kết quả thực nghiệm và nhận xét 22 2.2.1- Định lượng strychnin trong nguyên liệu hạt mã tiền 22 2.2.2 - Chiết xuất strychnin bằng ethanol 25 2.2.3 - Chiết xuất strychnin bằng dầu hoả 34 2.2.4 - Kiểm nghiệm thành phẩm strychnin sulíat 37 PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 3 .1 - Kết luận 40 3.2 - Đề xuất 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT - Bh : Bão hoà - Dd : Dung dịch - Dm : Dung môi - DĐVN: Dươc Điển Viêt Nam ĐẶT VẤN ĐỀ Alcaloid là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt, đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo. Strychnin là một alcaloid được dùng trong điều trị với tác dụng chính là kích thích thần kinh trung ương, mặc dù hiện nay strychnin ít được dùng trong điều trị nhưng lại rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu cách tác dụng của các thuốc chống co giật [6]. Hiện nay ở nước ta, xí nghiệp dược phẩm trung ương II đang chiết strychnin bằng dầu hoả. Dung môi này có ưu điểm là chiết chọn lọc nên dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế và cho hiệu suất cao. Tuy nhiên do độ tan của strychnin trong dung môi này rất thấp nên phải chiết nóng ở 100°c do đó đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng (nồi hơi, nồi chiết 2 vỏ), đồng thcd dầu hoả là dung môi dễ cháy. Các điều kiện chiết xuất này không phải cơ sở nào cũng đáp ứng được. Trong phương pháp chung để chiết alcaloid thì ngoài chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ không phân cực còn có phương pháp chiết alcaloid bằng các dung môi phân cực (nước hoặc các dung môi trộn lẫn vói nước). Ở Việt Nam, ethanol là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm. Ethanol có khả năng hoà tan alcaloid ở cả dạng base lẫn dạng muối. Nhược điểm của ethanol là dung môi không chọn lọc với alcaloid, nó hoà tan nhiều tạp chất khác như sắc tố, nhựa làm cho quá trình tinh chế khó khăn. Tuy nhiên hạt mã tiền có thể sử dụng ethanol để chiết vì nó chứa ít tạp sắc tố, nhựa nên không ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. Mặt khác độ tan của strychnin trong ethanol rất cao, nên có thể chiết ở nhiệt độ thường. Chúng tôi đặt vấn đề “nghiên cứu chiết strychnin bằng ethanol” và so sánh với phương pháp chiết bằng dầu hoả để có thể thực hiện chiết strychnin từ hạt mã tiền với các thiết bị đơn giản mà vẫn đảm bảo hiệu suất chiết so vói chiết bằng dầu hoả. Mục tiêu của khoá luận là: - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất strychnin sulíat bằng ethanol, xác định các thông số chiết xuất: Độ cồn, nhiệt độ, thời gian. - So sánh hiệu suất chiết xuất strychnin sulíat bằng hai phương pháp chiết xuất vói dm ethanol và dm dầu hoả. 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 - Cây Mã Tiền : Strychnos nux-vomica L. 1.1.1 - Đặc điểm thực vật: +Strỵchnos nux - vomica L.\ Cây Mã tiền. Cây gỗ, thân đứng, cao 5 - 12m. v ỏ màu xám có lỗ bì. Cành nhẩn, không có móc, đôi khi có gai ở kẽ lá. Lá mọc đối, gốc tù đầu nhọn, dài 6 - 12m, rộng 3,5 8,5cm, nhẵn và dai, mặt trên xanh bóng có 5 gân hình cung nỗi rõ ở mặt dưới. Cụm hoa hình ngù mọc đối ở đầu cành, có 1 - 2 đôi lá có lông mịn. Hoa nhỏ hình ống, màu trắng hoặc vàng nhạt, có 5 cánh hoa hàn liền thành một ống dài 1 - l,2cm, nhị 5, dính ở phía trên ống tràng. Bầu hình trứng nhẵn. Quả thịt hình cầu, đường kính 3 5cm, vỏ cứng, nhẵn bóng, khi chín màu vàng cam chứa cơm quả màu trắng và 1 - 5 hạt hình đĩa dẹt, đường kính 2 - 2,5cm, dày 4 - 4,5mm, một mặt lồi, một mặt lõm có lông mượt toả đều từ giữa ra màu xám bạc. [4, 6] Mùa hoa: tháng 3 - 4 . Mùa quả: tháng 5 - 8 . Ngoài cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica L.) ở nước ta còn có một số loài mã tiền dây leo thân gỗ khác: ♦ Strychnos vanprukii Craib. (= s. quadrangularìs Hill., s. nitida Gagnep.): mã tiền cành vuông, dây vuông. Dây leo, thân gỗ, dài 5 - 20m, có móc, xếp từng đôi một, vỏ thân màu nâu. Cành non có 4 cạnh nhẵn. Lá hình mác, mọc đối, màu xanh bóng, dài 7 - 12cm, rộng 2,5 - 5,5cm, gốc thuôn, đầu nhọn, có 3 gân, gân phụ nhiễu tạo thành mạng xít nhau. Cụm hoa hình chuỳ dài 2 - 4cm, mọc ở kẽ lá. Hoa mẫu 5, tràng màu vàng nhạt. Quả thịt hình cầu, đường kính 4 - 5cm, khi chín màu vàng cam có 1 - 6 hạt. [4, 7] ềStrỵchnos ignatii Bergius (= s. hainanensỉs Merr et Chun): cây đậu gió, dây gió. Dây leo, thân gỗ dài 5 - 20m, dựa vào cây khác bằng móc đơn ở kẽ lá. v ỏ thân màu nâu hoặc xám nhạt, có nhiều lỗ bì. Cành tròn nhẵn. Lá mọc đối, hình trứng hoặc thuôn, dài 6 - 17cm, rộng 3,5 - 7cm, đầu nhọn gốc tròn, hai mặt lá nhẵn có 3 2 gân toả từ gốc. Cụm hoa hình chuỳ mọc ở kẽ lá (thường ở những lá đã rụng) dài 2 2,5cm, cuống hoa có lông. Hoa mẫu 5, tràng màu trắng hoặc vàng nhạt. Quả hình cầu, đường kính 6 - 20cm, khi chín màu vàng có 4 - 10 hạt, hình elip dẹt mặt lõm mặt lồi, phủ lông dài màu vàng xám, mép hạt có một đường gờ nổi chạy vòng. [4, 7] ♦ Strychnos axilỉaries Coỉebr.: Mã tiền hoa nách. Cây nhỏ mọc đứng hoặc leo cao 5 - 20m, cành đen đen có móc đơn ở kẽ lá. Lá có phiến đa dạng hình tròn đến thon, dài 3 - 9cm, không lông trừ lông ở mặt dưới, gân chính 3, cuống dài 2 - lOmm, có lông hoặc không. Xim ở nách lá có lông, cuống hoa ngắn, đài cao lmm, tràng có ống cao 3,5mm, nhị 5, bầu không lông. Quả mọng hình cầu, đường kính 1 - 2cm, khi chín màu đỏ cam, có 1- 2 hạt không lông, đường kính 10 - 12mm. [4,7] +Strychnin umbellata (Lour.) Merr.: Mã tiền hoa tán. Cây nhỡ đứng hoặc leo, không mấu, không gai, cành tròn không lông. Lá có phiến nhỏ, dài 2,5- 8cm, rộng 2 - 4,5cm, không lông, cuống dài 1 - 5mm, không lông. Chuỳ hoa ở nách lá và ngọn cành, dài 3 - 7cm, hoa mẫu 4 - 5 , đài nhỏ, tràng trắng nhỏ, cao 4 - 5mm. Quả hình cầu, đường kính 1 - 2cm, có 1 - 3 hạt hình đồng tiền. [4, 7] iStrychnos cathayensis Merr.: Mã tiền Trung Quốc, Mã tiền Cát Hải. Cây nhỡ, leo, mấu từng cặp, cành màu nâu có lông mịn. Phiến lá thon, dài 6 lOcm, rộng 2 - 4cm, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới mờ, có ít lông hay không lông. Có 3 gân từ gốc, cuống có lông mịn. Chuỳ hoa ờ nách lá và ở ngọn cành, cao 3 - 4 cm, trục có lông, hoa mẫu 5, đài nhỏ, tràng trắng nhỏ, cao 4 - 5mm. Quả mọng, tròn, đường kính 1 - 2cm, có 3 - 7 hạt. [4, 7] Y học cổ truyền sử dụng hạt của các loài mã tiền này như hạt của cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica L.), nhưng hàm lượng strychnin trong hạt của cây Mã tiền là cao nhất và là nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất strychnin. 1.1.2 - Phân bố và sinh thái: Chi Strychnos L. có khoảng 150 loài trên thế giới, ở Việt Nam có gần 20 loài, hầu hết là những cây dạng bụi trườn, dây leo gỗ và chỉ có ít loài là cây gỗ trong đó có cây Mã tiền. [6] 3 Cây Mã tiền phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á bao gồm: Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Bắc Malaysia, Mianma, Thái Lan, Bắc úc, Lào, Camphuchia, Việt Nam. Ở Việt Nam, cây Mã tiền chỉ thấy mọc hoang ở các vùng rừng núi phía nam, nhiều nhất ở Khánh Hoà, Bà rịa-Vũng Tàu, Bình Thuận, Ninh Thuận, Gia Lai và Đắc Lắc. Các loài Mã tiền khác phân bố ở hầu khắc các tỉnh miền núi nước ta: Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoà Bình, Bắc Giang, Sơn La, Nghệ An, Quảng Trị...đặc biệt có nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên, Thuận Hải, Đồng Nai, Kiên Giang, riêng loài strychnos cathayensis Merr. mới gặp ở tỉnh Quảng Trị. [4, 6] Sinh thái: Mã Tiền thuộc loại cây nhiệt đới điển hình. Cây thích nghi ở vùng có nhiệt độ trung bình năm 24 - 26°c trở lên. Cây ưa sáng, chịu được khí hậu khô nóng, thường mọc ở rừng thưa, rừng nửa rụng lá hoặc rừng kín thường xanh ở đai thấp, dưới 500 m. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm. Cây có khả năng tái sinh cây chồi sau khi bị chặt. Ở các vùng đồi ven biển thuộc tỉnh Khánh Hoà, Đồng Nai...có đến trên 50% là cây chồi. Cây mọc từ hạt phải sau 7 - 1 0 năm mới có hoa quả. [6] 1.1.3 - Bộ phận dùng và thành phần hóa học: 1.1.3.1 - Bộ phận dùng: Hạt, thu hái từ quả chín, đã phơi hoặc sấy khô. Loài Strychnos nux - vomica L.: hạt hình đĩa dẹt, hơi dày lên ở mép, một số hạt hơi méo mó, cong không đều, đường kính 1,2 - 2,5cm, dày 0,4 - 0,6cm, hoi bóng, màu xám nhạt đến vàng nhạt. Hạt không mùi, vị rất đắng. [5] 1.1.3.2 - Thành phần hoá học: Hạt Mã tiền (Strychnos nux - vomica) chứa nhiều chất thuộc các nhóm: -Acaloid (2-5%): Strychnin chiếm gần 50%, còn lại chủ yếu là brucin, còn khoảng 2-3% là các alkaloid phụ khác như: a-colubrin, P-colubrin, vomicin, novacin, pseudo strychnin...[4] 4 Strvchnin: Rị = Rọ = -H Brucin: R , = R 2 = -OCH3 oc-colubrin: R , = H; R2 = -OCH3 p-colubrin: Rị = OCíỉ3; R2 = -H. Ì a ^ n -cm , Rị = R2 = -0 CH3 R3 = -H N o v a xin =R2 = -H NH Ỵ Ỵ A cr ^ 'o - ^ o Pscudosừychnin Ngoài alcaloid, trong hạt còn có chất béo (4 - 5%), acid igasuric (= acid clorogenic), acid loganic, stigmasterin, cycloarteroi và một glycozit là loganin (= loganozit) (Loganin có nhiều trong cơm quả). Trong lá có khoảng 2% và trong vỏ thân trên 8% alkaloid nhưng chủ yếu là brucin. Các loài mã tiền khác hiện nay đang khai thác có tỷ lệ alkaloid toàn phần cũng như tỷ lệ strychnin khác nhau. Hạt mã tiền sử dụng làm thuốc phải chứa không ít hơn 1,2% strychnin tính theo dược liệu khô kiệt. [5] 1.1.4 - ứng dụng: Hạt mã tiền được dùng trong cả y học cổ truyền và y học hiện đại. 5 Y học cổ truyền sử dụng hạt mã tiền đã qua chế biến (gọi là mã tiền chế) để chữa: tiêu hoá kém, ăn uống không biết ngon, phong thấp nhức mỏi tay chân, bại liệt, liệt nửa người, di chứng bại liệt trẻ em, trị đau dây thần kinh, liệt do rượu, liệt não do có nguồn gốc tuỷ, tiêu khí huyết tích tụ trong bụng. Mã tiền chưa chế thường chỉ dùng ngoài làm thuốc xoa bóp chữa nhức mỏi tay chân do thấp khớp, đau dây thần kinh, sử dụng dạng cồn thuốc, dùng riêng hoặc phối hợp với ô đầu phụ tử. Y học hiện đại: Hạt mã tiền là nguyên liệu để chiết xuất strychnin. Strychnin thường dùng dưới dạng muối sulíat hoặc nitrat để chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, liệt dương, dùng làm thuốc kích thích hành tuỷ trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hoá. [4, 6,7]. 1.2 - Strychnin: Strychnin thường được dùng dưói dạng strychnin sulfat. 1.2.1 - Công thức hoá học : .H2 S04.5H20 (C2iH22N20 2)2. H2S 0 4. 5H2ơ Phân tử lượng: 856,93 Tên khoa học: Strychnidin_10 on sulíat penta_hydrat. 1.2.2 - Tính chất: 1.2.2.1- Lý tính: ‘ Tinh thể hình kim không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi, vị rất đắng. Bị mất nước kết tinh ở 100°c. Độ chảy khi khan khoảng 200°c (bị phân huỷ). 6 Độ tan: lg tan trong 35ml nước, 7ml nước sôi, 81ml ethanol, 26ml ethanol ở 60°c, không tan trong ether, khó tan trong cloroíorm. 1.2.2.2 - Hoá tính: ♦ Tính chất chung của alkaloid: - Tính base yếu: + Tác dụng với các acid tạo muối tương ứng: Alcaloid = N + HC1 -------------- ► [Alcaloid = N] . HC1 Muối Hydroclorid + Kết hợp với kim loại nặng (Hg,Bi,Pt. •.) tạo ra muối phức. - Phản ứng vái thuốc thử chung của alkaloid: + Phản ứng tạo tủa: Tạo tủa rất ít tan trong nước với các thuốc thử: thuốc thử Mayer (K2HgI4), thuốc thử Bouchardat (iodo - iodid), thuốc thử Dragendorff (KB1I4)... Phản ứng tạo tủa rất nhạy, cho phép phát hiện có alkaloid trong dược liệu hay không. [4] Tạo tủa ở dạng tinh thể vói dung dịch vàng clorid, dung dịch Platin clorid, dung dịch nước bão hòa acid picric... [4] + Phản ứng tạo màu: Ngoài phản ứng tạo màu vói các thuốc thử tạo màu chung của alcaloid như acid sulíuric đậm đặc (d =1,84), acid nitric đậm đặc (d =1,4), thuốc thử Frohde, thuốc thử Marquis, thuốc thử Mandelin...[4], strychnin còn có phản ứng tạo màu đặc biệt đó là phản ứng OTTO : 7 Brucin không cho phản ứng này vì có nhóm - OCH3 khoá phản ứng. 1.2.3 - Định tính, định lượng: 1.2.3.1 - Định tính: Định tính strychnin sulfat theo DĐVNIII Có thể chọn một trong 2 nhóm định tính sau: Nhóm 1: B, c và D. Nhóm 2: A và D. A: Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của strychnin sulíat chuẩn. B: Trong phép thử "tạp chất liên quan": vết chính của dung dịch thử phải giống về vị trí, màu sắc và kích thước so với vết chính của dung dịch đối chiếu. C: Hoà tan 50mg chế phẩm trong 5ml nước, thêm 0,1 ml amoniac đậm đặc và chiết bằng 5ml cloroíòrm. Bốc hơi dịch chiết cloroíorm đến cạn trên cách thuỷ. Thêm vào cắn 0,1 ml acid sulíuric đậm đặc và một tinh thể Kali dicromat, xung quang tinh thể có màu tím, màu đỏ, màu vàng khi lắc. D: Chế phẩm cho phản ứng của ion sulfat. 1.2.3.2 - Định lượng: Theo DĐVNIII. Hoà tan 0,500g chế phẩm trong 25ml acid acetic khan, thêm lm l alhydric acetic. Định lượng bằng dung dịch acid perclorid 0,1N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế hoặc bằng chỉ thị xanh malachit. lml dung dịch acid perclorid 0,1N tương đương với 76,70mg 1.2.4 - Tác dụng dược lý và ứng dụng: 1.2.4.1 - Tác dụng dược lý: Strychnin được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá vào máu cả trong huyết tương và hồng cầu, và nhanh chóng chuyển từ máu vào các mô. Strychnin kích thích tất cả 8 các phần của hệ thần kinh trung ương nhưng kích thích tương đối mạnh hơn trên tế bào vận động, đặc biệt là trên tuỷ sống theo cơ chế: Trong synap của hệ thần kinh trung ương có hai loại receptor có chức năng đối lập nhau đó là: receptor kích thích và receptor ức chế. Receptor glycin là một trong những loại chính của receptor ức chế và nó bị khoá bởi strychnin. Kết quả là các thông tin được truyền đi mạnh hơn rất nhiều trong cung phản xạ mà bình thường các thông tin này bị khử bởi tác dụng sau sinap của glycin. Strychnin kích thích những khả năng về trí não, làm tăng những cảm nhận về xúc giác, thính giác, vị giác và cơn đau. Strychnin kích thích tim mạch, làm tăng lượng epinephrine từ đó làm tăng huyết áp do sự kích thích trực tiếp của hệ thần kinh giao cảm trên cơ trơn động mạch. Tác dụng này rất có ý nghĩa trong điều trị một số bệnh tim mạn tính, đặc biệt trong bệnh viêm cơ tim. Nó cũng được coi là có ích trong điều tri giảm thị lực do ngộ độc, đặc biệt là ngộ độc nicotin. [6] Strychnin kích thích sự bài tiết nước bọt và dịch vị, tăng tốc độ chuyển của thức ăn sang ruột gây ra sự thèm ăn và giúp dễ tiêu. Tuy nhiên nếu dùng luôn sẽ gây ra biến loạn tiêu hoá, biến loạn co bóp dạ dày. [9] Strychnin liều nhỏ làm chậm mệt mỏi, tiếp theo là giai đoạn ức chế hoạt lực cơ. Strychnin được coi là có ích trong điều trị những bệnh co thắt khác nhau như: múa giật, hen, động kinh. 1.2.4.2 - ứng dụng: Strychnin thường được dùng dưới dạng muối sulíat hoặc nitrat chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, suy nhược, viêm dây thần kinh do nghiện rượu, say rượu cấp, đái dầm, liệt dương. Sử dụng làm thuốc kích thích hành tuỷ trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hoá. [4, 7] 1.3 - Các phương pháp chiết xuất alcaloid: 1.3.1 - Nguyên tắc chung: Trong nhóm các hợp chất tự nhiên do alcaloid là nhóm chất có các đặc trưng lý hoá chung nên để phân lập chúng khỏi các nhóm hợp chất tự nhiên khác (Aavonoid, coumarin, glycosid...) thì có thể sử dụng một số phương pháp được gọi là các 9 phương pháp chung chiết xuất alcaloid và thu được hỗn hợp alcaloid toàn phần. Từ hỗn hợp alcaloid toàn phần để tách riêng từng alcaloid ta phải dựa vào tính chất riêng của mỗi alcaloid mà có phương pháp thích hợp. sau: Alcaloid base dễ tan trong dm hữu cơ, không tan trong nước, ngược lai alcaloid dưới dạng muối không tan trong dm hữu cơ và tan trong nước. [8] Như ta biết alcaloid có thể ở trạng thái rắn (strychnin, morphin, codein...) và ở trạng thái này trong phân tử thường chứa oxy. Ngoài ra, alcaloid có thể ở dạng lỏng (nicotin, spactein,...) và ở trạng thái này trong phân tử thường không có chứa oxy. Các alcaloid ở thể lỏng ngoài các phương pháp chung chiết xuất còn có thể chiết tách bằng phương pháp cất kéo hơi nước. Với những alcaloid ở thể rắn người ta sử dụng hai phương pháp chiết xuất chung sau: 1.3.1.1 - Phương pháp chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu cơ: a - Chiết alcaloid base bằng dm hữu cơ không phân cực : - Giai đoan 1: Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô: để tăng khả năng chiết ta phải xay nhỏ dược liệu trước khi chiết nhằm làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa hai pha rắn và lỏng đẩy nhanh quá trình khuếch tán. Tuy nhiên nếu ta xay nhỏ dược liệu quá, dm sẽ khó chuyển động qua khối dược liệu và rất khó thu được dịch chiết do đó tuỳ thuộc vào từng loại dược liệu ta có thể xay nhỏ khác nhau để vừa đảm bảo đẩy nhanh quá trình khuếch tán vừa dễ dàng trong rút dịch chiết. Mặt khác nếu xay dược liệu nhỏ quá làm các tế bào bị dập nát nhiều, do đó dịch chiết sẽ kéo theo nhiều tạp chất ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. [1] Kiềm hoá: Kiềm hoá và làm trương nở nguyên liệu bằng dung dịch kiềm (thường dùng Ca(OH)2, NH4OH, Na2C 03...) để chuyển alcaloid trong nguyên liệu sang dạng base. - Giai đoan 2: Chiết xuất Dùng dm hữu cơ không phân cực thích hợp, dm này hoà tan các alcaloid base vừa được giải phóng. Ở phòng thí nghiệm thường dùng benzen, cloroíorm, ether hoặc hỗn hợp ether và cloroíorm. Có thể chiết nguội hoặc chiết nóng. [1,4] 10 - Giai đoan 3: Tinh chế Nguyên tắc: Chuyển alcaloid nhiều lán từ dm hữu cơ sang dm nước và ngược lại w-- -để loại các tạp chất không phải là alcaloid. Cuối cùng bốc hơi dm thu được hỗn hợp alcaloid base tinh khiết - gọi là alcaloid toàn phần Sơ đồ chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu c ơ : •Ưu điểm: - Dịch chiết sạch, dễ tinh chế loại các tạp kèm theo do đó hiệu suất chiết cao. 11 - Dm hữu cơ không phân cực thường có khả năng chiết chọn lọc với các alcaloid base. • Nhược điểm: - Dm hữu cơ thường đắt tiền, dễ cháy. - Sử dụng dm hữu cơ đòi hỏi phải có thiết bị kín đ hơi dm, có biện pháp thu hồi dm do đó đầu tư cho thiết bị lớn. • ứng dụng: Phương pháp này được dùng phổ biến trong chiết xuất alcaloid, đặc biệt với các dược liệu có nhiều chất nhày, pectin, tinh bột... dễ trương nở trong nước. b - Chiết xuất alcaloid base bằng dm hữu cơ phân cực ịethanol, methanol...): Do dm hữu cơ phân cực (ethanol, methanol...) hoà tan alcaloid ở cả dạng muối và dạng base nên có thể sử dụng để chiết alcaloid dưới dạng base. Tuy nhiên nếu dùng dm phân cực để chiết alcaloid thì tuỳ vào bản chất của dược liệu mà dịch chiết có thể kéo theo nhiều tạp chất hơn so với sử dụng dm hữu cơ không phân cực. Và trong khâu tinh chế không thể chuyển trực tiếp alcaloid base sang dạng muối bằng cách dùng nước acid để chiết alcaloid từ pha dm hữu cơ (chiết lỏng/lỏng) mà phải cất thu hồi dm trước khi chuyển sang dạng muối và chiết bằng nước hoặc dùng một dm không phân cực chiết nó từ dịch cô đặc sau khi loại dm chiết. 1.3.1.2 - Chiết xuất alcaloid dưới dạng muối (muối tự nhiên hoặc muối với acid vô cơ) bằng dm nước, nước acid hoặc các dm phân cực khác: - Giai đoan 1: Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô: như phương pháp 3.1.1. Sau đó làm ẩm dược liệu cho trương nở bằng nước. - Giai đoan 2: Chiết xuất Dùng dm nước để chiết alcaloid ở dạng muối tự nhiên trong cây hoặc dùng dung dịch acid loãng để chiết alcaloid dưới dạng muối với acid vô cơ tương ứng, hoặc dùng dm là methanol và ethanol để chiết xuất alcaloid dưới dạng muối tự nhiên. - Giai đoan 3 : Tinh chế Trong trường hợp chiết bằng nước, từ dịch chiết thô alcaloid base được giải phóng bằng cách thêm kiềm sau đó được chiết bằng một dm hữu cơ không hoà tan 12 trong nước. Tiếp tục tinh chế bằng cách bốc hơi dm và kết tinh lại trong dm hữu cơ hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. Trong trường hợp chiết bằng ethanol, dịch chiết ethanol được cô đặc, thêm acid và loại các tạp chất bằng các dm hữu cơ không phân cực, thêm kiềm chuyển alcaloid sang dạng base rồi chiết alcaloid base bằng một dm hữu cơ thích hợp. Bốc hoi dm hữu cơ, kết tinh alcaloid hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. • Ưu điểm: - Dm rẻ tiền, dễ kiếm. - Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít. • Nhược điểm: - Dịch chiết thường lẫn nhiều tạp do đó khó tinh chế, hiệu suất thấp. - Với những dược liệu có nhiều chất nhầy, pectin, tin nước trương nở, làm tăng độ nhớt do đó khó chiết, khó rút dịch chiết. • ứng dụng: Với các dược liệu có ít tạp tan trong nước, trong dung môi phân cực. Các phương pháp chung đã nêu ở trên có kết quả tốt đối vói phần lớn các alcaloid trong dược liệu, nhưng một số alcaloid ở dạng base lại tan nhiều trong nước (ephedrin, colchicin...) hoặc ở dạng muối ít tan trong nước (berberin clorid...) tan trong dm hữu cơ (resecpin hydroclorid tan trong cloroform) thì người ta phải có cách chiết riêng cho thích hợp. 1.4 - Các phương pháp tách alcaloid dưói dạng tinh khiết: Từ hỗn hợp alcaloid toàn phần thu được ở giai đoạn tinh chế để tách riêng từng alcaloid dưới dạng tinh khiết có nhiều phương pháp khác nhau như : thăng hoa, cất, giải phóng phân đoạn, kết tinh phân đoạn, sắc ký hấp phụ... Tuỳ vào tính chất của alcaloid cần tách mà lựa chọn phương pháp thích hợp. 1.5 - Chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền: 1.5.1 - phương pháp chiết xuất strychnin ở Việt Nam: - Strychnin đã được chiết xuất công nghiệp từ lâu và phương pháp mà xí nghiệp 2 thực hiện là chiết nóng với dm dầu hoả, dịch chiết sau đó được khuấy với dd H2S04 3% và gạn thu lấy lớp acid, dm đem thu hồi để chiết tiếp mẻ sau. Lớp acid được kiềm hóa bằng dd Na2C 0 3 bão hoà để tạo tủa alcaloid toàn phần. Lọc thu lấy tủa, rồi tiến hành loại brucin bằng cách chuyển sang dạng muối nitrat, strychnin 13 nitrat kết tinh còn brucin nitrat thì ở trong nước cái. Lọc thu lấy tinh thể strychnin nitrat đem tẩy màu bằng than hoạt, sau đó chuyển sang dạng muối sulíat. [2] - Quy trình thực tập trước đây của bộ môn Công nghiệp dược là dùng benzen để chiết xuất tiến hành tương tự như chiết bằng dầu hoả như trên nhưng chiết nguội. [3] 1.5.2 - Phương pháp chiết xuất strychnin trên thế giói: Quy trình của tác giả p. H. List và cộng sự: Các tác giả chiết strychnin base bằng dm hữu cơ phân cực rồi cô thu hồi dm và tách strychnin dưới dạng muối (HN03). [10] 14 PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 2.1 - Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm: 2.1.1 - Nguyên vật liệu: 2.1.1.1 - Nguyên liệu: Hạt Mã tiền (Strychnos nux -vomica L.) đã được phơi khô. 2.1.1.2 - Hoá chất và dm: - Ethanol. - Dầu hoả. - Sữa vôi. - Na2C 0 3. - H2S04. - H N 03. - Cloroform. - Và các hoá chất khác (HC1, NaOH, acid acetic,.. .)• 2.1.1.3 - Trang thiết bị: - Dụng cụ chiết nóng. - Bình gạn 500 ml. - Máy quang phổ u v - VIS. - Máy cất thu hồi dm. - Máy siêu âm. - Máy đo góc quay cực. - Tủ sấy. - Các dụng cụ khác: Bếp điện, cốc có mỏ, ống đong, bình gạn 125 m l,... 2.1.2 - Phương pháp thực nghiệm: 2.1.2.1 - Định lượng strychnin trong hạt Mã tiền: Bằng phương pháp đo quang theo DĐVNIII. Cân chính xác khoảng 0,4g dược liệu qua rây số 355 vào bình nón nút mài lOOml. Thêm chính xác 20ml cloroíorm và 0,3ml amoniac đậm đặc. Đậy kín bình 15 và cân. Để 40 phút trong bể siêu âm (350 w , 35 kHz). Cân, bổ sung lượng cloroíorm hao hụt. Lắc đều, lọc nhanh vào bình nón. Lấy chính xác lOml dịch lọc cho vào bình gạn 50ml. Chiết 4 lần, mỗi lần với 10 ml dd acid sulíuric 0,5M. Lọc dịch acid qua giấy lọc đã thấm ướt trước bằng dd acid sulíuric 0,5M, gộp dịch rửa vào bình định mức và thêm cùng dm cho tới vạch, lắc kỹ. Xác định độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 262nm và 300nm. Hàm lượng strychnin được tính theo công thức. a: Độ hấp thụ ở 262nm % strychnin = 5(0,32 l a -0,4676) mx(ì-x) b: Độ hấp thụ ở 300nm m: Khối lượng mẫu thử (g) x: Độ ẩm của dược liệu (%). Hàm lượng strychnin (C21ĨỈ22N2O2) không ít hơn 1,2% tính theo dược liệu khô kiệt. 2.1.2.2 - Phương pháp chiết xuất strychnỉn bằng ethanol: Hạt mã tiền sau khi đã được kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn về hàm lượng, chúng tôi tiến hành chiết xuất bằng ethanol theo sơ đồ sau: Sơ đồ chiết xuất strychnin bằng ethanol: Sữa vôi Ethanol ethylic 16 Thu hồi •*- Dm Cai mu noi dm Dd H2S04 3% Dịch chiết đậm đặc Dầu mỡ Tạo muối sulíat, lọc, gạn Dịch gạn Nước cái Dd Na2C 0 3 bh Kết tủa alcaloid base, lọc Dd HNO, 3% Tủa alcaloid toàn phán Nước cái (brucine) Tạo muối nitrat để kết tinh, lọc loai brucin nitrat Tinh thể strychnin nitrat Bã than hoạt Nước cất Than hoạt Hoà tan, tẩy màu, lọc nóng Dd Na2C 03 bh Nước cái Dịch lọc Kết tủa strychnin base, lọc Tủa strychnin base Thu hồi Nước cái Tạo muối sulfat, để kết tinh, loc Tinh thể strychnin sulfat Sấy, cân, kiểm nghiệm, đóng Sản phẩm strychnin sulíat Dd H2S04 3% Tiến hành các giai đoạn chiết xuất: - Giai đoan 1: Chuẩn bị nguyên liệu Ngâm hạt mã tiền trong nước vôi trong cho mềm (3 ngày), thái mỏng, sấy khô ở 60° - 80°c (2 ngày đêm), đem xay thành bột thô. - Giai đoan 2: Kiềm hoá Cân lOOg bột hạt Mã tiền cho vào cốc thuỷ tinh 400ml, trộn đều vói sữa vôi (150 ml), đảo kỹ cho đến khi thành dạng bột nhão, ủ khoảng 24 h. - Giai đoan 3: Chiết xuất Lót bông vào bình gạn 500ml, cho bột dược liệu đã kiềm hoá vào, đổ dm đến ngập (200 - 300ml), khuấy đều. Ngâm đủ thời gian thì mở van rút dịch chiết vào cốc thuỷ tinh 500ml và bổ sung dm mới vào bình chiết để chiết mẻ sau. - Giai đoan 4: Tinh chế + Tạo muối suỉfat tan trong nước của các alcaloid: Dịch chiết ethanol đem cất thu hồi, cất kiệt tạo thành cắn, hoà tan cắn trong 10 ml dung dịch H2S04 3%, thêm khoảng 30ml nước cất, khuấy kỹ. Lọc loại tạp không tan trong acid, gạn loại chất béo. + Tạo tủa alcaỉoid toàn phần: Kiềm hoá lớp nước acid trên bằng dd Na2C 03 bão hoà, vừa nhỏ kiềm vừa khuấy đều cho đến khi dung dịch hết sủi bọt và có phản ứng kiềm pH=10-ll. Để lắng (qua đêm) cho tủa hết, lọc hút qua phễu Buchner lấy tủa alcaloid base toàn phần, rửa tủa bằng nước cất (rửa 3 lần mỗi lần vói lOml nước cất vừa đủ để ngập tủa). Loại bỏ nước cái và nước rửa. Sấy khô tủa, cân. + Tạo muối nitrat của các alcaloid (loại Brucin): Nguyên tắc loại Brucin: Tạo muối nitrat của các alcaloid tại pH=4-4,5, strychnin nitrat kết tinh còn brucin nitrat tan trong nước cái. Thử Brucin: Nhỏ 1 giọt dd H N 03 đậm đặc vào 1 vài hạt tinh thể nếu có brucin thì sẽ xuất hiện màu đỏ hoặc hồng. Tiến hành: Hoà tủa alcaloid toàn phần vào một lượng nước sao cho vừa đủ ngập tủa (khoảng 5ml), đun trong nồi cách thuỷ, vừa khuấy vừa nhỏ dần dd H N 03 3% cho đến khi tủa tan hết và pH=4-4,5. Để kết tinh qua đêm. Lọc qua phễu Buchner 18 nhỏ. Rửa tinh thể bằng nước cất (rửa 3 lần mỗi lần khoảng 4ml nước cất). Loại bỏ nước cái và nước rửa. Chuyển tinh thể sang cốc đun lOOml. + Tẩy màu bằng than hoạt: Hoà tan nóng tinh thể vào một lượng nước cất vừa đủ (khoảng 50ml), đun trong nồi cách thuỷ, khuấy cho tan hết. Thêm khoảng 0,5g than hoạt, khuấy 7 phút, lọc nóng, rửa bã bằng nước cất nóng (rửa 3 lần mỗi lần khoảng lOml). Loại bã than hoạt. Chuyển dịch lọc vào cốc lOOml. + Tạo sản phẩm strychnin sulfat: Chuyển sang dạng base: Kiềm hoá dịch lọc trên bằng dd Na2C 0 3 bão hoà, vừa nhỏ vừa khuấy cho đến khi hết sủi bọt và pH=10-ll. Để lắng qua đêm cho tủa hết. Lọc lấy tủa base, rửa tủa bằng nước cất (rửa 3 lần mỗi lần khoảng lOml). Loại bỏ nước cái và nước rửa. Tủa đem sấy khô và cân. Chuyển sang dạng muối sulíat: Hoà tủa trên vào một lượng nước vừa đủ (khoảng 5ml), đun trong nồi cách thuỷ, vừa khuấy vừa nhỏ dd H2S04 3% cho đến khi tủa tan hết và pH=4-4,5. Để kết tinh qua đêm. Lọc lấy tinh thể. Sấy khô. Phương pháp chiết xuất bằng ethanol được thực hiện ở các độ cồn khác nhau, thòi gian khác nhau và nhiệt độ khác nhau. 2.1.2.3 - Chiết xuất strychnin bằng dầu hoả: Đây là phương pháp chiết xuất đang được xí nghiệp 2 sử dụng để chiết xuất strychnin sulfat. Chúng tôi chiết xuất theo phương pháp nàynhằm so sánh hiệu quả chiết xuất so với chiết bằng ethanol. Sơ đồ quy trình chiết xuất strychnin bằng dầu hỏa: Hạt Mã tiền yr Sấy xay cân Bột hạLt mã tiền Kiềm hoá. 19 Dầu hoả Bột hạt mã tiền đã kiềm hóa Chiết nóng Bã dược liệu ìr Dịch cliiếl Thu hồi Dầu hoảL 4 1r Dd H2S04 3% *. Tạo muối sulfat, khuấy, gạn Pha nước acid Dd Na2C 03 bh Kết tủa alci base,lọc Nước cái Dd HNO, 3% ĩ Tủa alcaloid toàn phần Tạo muối nitrat để kết tinh, lọc loai brucin nitrat Nước cái (brucine) Tinh thể strychnin nitrat Nước cất Than hoạt Hoà tan, tẩy màu, lọc nóng Bã than hoạt Dd Na2CƠ3 bh Dịch lọc Kết tủa strychnin b loc Nước cái 1 Tủa strychnin base Thu hồi Nước cái Tạo muối sulfat, để kết tinh, loc Tinh thể strychnin sulíat Sấy, cân, kiểm nghiệm, đóng /• SOI 20 Dd H2S04 3% Tiến hành các giai đoạn chiết xuất: -Giai đoan 1: Chuẩn bị nguyên liệu -Giai đoan 2: Kiềm hoá Được tiến hành tương tự như phương chiết xuất bằng ethanol 2.1.2.2. -Giai đoan 3: Chiết xuất Nguyên tắc ch iết: Ngâm nóng ở 90° - 100°c. Tiến hành chiết: Lắp lưới và lót bông vào bình chiết, cho bột dược liệu đã kiềm hóa vào, đổ dm (400ml), khuấy trộn để dm tiếp xúc tốt vói dược liệu. Sau thời gian chiết, mở van cho dịch chiết chảy vào bình thuỷ tinh nút mài một lít. Đổ dm mói vào bình chiết để chiết tiếp mẻ sau. -Giai đoan 4: Tinh chế + Chiết alcaloid toàn phần từ pha dầu hoả sang pha nước : Bằng cách chuyển các alcaloid sang dạng muối sulfat tan trong nước. Tiến hành: Cho dung dịch gồm 10 ml dd H2S04 3% và 40 ml nước cất vào bình chứa dịch chiết đầu, lắc kỹ 10'. Để yên cho phân lớp. Sau đó gạn lấy lóp acid, lớp dầu hoả đem thu hồi. Các dịch chiết sau đem lắc với dung dịch gồm 10 ml dd H2S04 3% và 15 ml nước cất. Các bước tạo tủa alcaloid toàn phần, loại brucin và tạo strychnin sulfat tiến hành tương tự phương pháp chiết xuất bằng ethanol 2.1.2.2. 2.1.2.4 - Kiểm nghiệm sản phẩm strychnin sulfat: theo DĐVN3. Gồm các chỉ tiêu: Tính chất Định tính: Nhóm 1: B, c và D. Độ trong và màu sắc dd Giói hạn acỉd - kiềm Góc quay cực riêng Brucỉn Tạp chất liên quan : Tiến hành theo phương pháp sắc ký lớp mỏng. 21 Nước Tro sulíat Định lượng Hoà tan 0,500 g chế phẩm trong 25 ml acid acetic khan, thêm 1 ml anhydrid acetic. Định lượng bằng dd acid perclirric 0,1 N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo thế hoặc bằng chỉ thị xanh malachit. 1 mldd acid perclorid 0,1 N tương đương với 76,70 mg(C21H22N202)2.H2S0 4. 2.2 - Kết quả thực nghiệm và nhận xét: 2.2.1 - Định lượng strychnin trong nguyên liệu hạt mã tiền (strychnos nuxvomica L.): Tiến hành như phương pháp 2.1.2.1. thu được kết quả ở bảng 2. 1: a: Độ hấp thụ ở 262nm % strychnin = 5(0,32 la -0,4676) m x (l-jc) b: Độ hấp thụ ở 300nm m: Khối lượng mẫu thử (g) x: Độ ẩm của dược liệu (%). Bảng 2. 1: Độ hấp thụ của dd chiết từ dược liệu và hàm lượng strychnin tính theo công thức. m(g) X a b % strychnin Lần 1 0,41 0,09 2,4159 0,5259 7,10 Lần 2 0,41 0,09 2,3851 0,5079 7,08 Lần 3 0,41 0,09 2,4671 0,5272 7,31 Lần 4 0,4 0,09 2,3741 0,5174 7,15 Lần 5 0,4 0,09 2,4281 0,5201 7,37 Trung bình 0,406 0,09 2,4140 0,5197 7,20 Do kết quả đo được quá cao so vói hàm lượng strychnin trong hạt mã tiền đã công bố từ trước đến nay, nên chúng tôi xác định độ chính xác của phương pháp bằng cách tiến hành đo với strychnin tinh khiết và hỗn hợp strychnin và brucin đã biết trước tỷ lệ, trên cơ sở sau: Dựa vào cách tiến hành định lượng nguyên liệu theo phương pháp 2.1.2.1, gọi: 22 m: là khối lượng dược liệu đem định lượng (g). c: là hàm lượng strychnin thực trong hạt mã tiền, là số cần xác định (%). m s: là khối lượng strychnin trong dược liệu (g). Vậy : m s= c. m. (1-x) Theo quy định của DĐVN III thì cân chính xác khoảng 0,4g bột hạt mã tiền để chiết làm định lượng. Giả sử hàm lượng strychnin trong hạt mã tiền là khoảng 1,5% thì trong 0,4g hạt mã tiền có khoảng 6mg strychnin. Khi định lượng ta sẽ chiết kiệt được lượng này bằng 20 ml cloroíorm. Với strychnin tinh khiết, để hạn chế sai số chúng tôi cân chính xác khoảng 30 mg strychnin vào bình nón nút mài 250ml, thêm lOOml cloroíòrm và tiến hành chiết như phương pháp 2.1.2.1 thu được kết quả ở bảng 2. 2: Bảng 2. 2: Độ hấp thụ của dd chiết từ strychnin tinh khiết m cân (mg) a b Lần 1 30,2 2.9631 0.7256 Lần 2 30,6 3.0586 0.7543 Lần 3 30,5 2.9865 0.7489 Lần 4 30,4 2.9782 0.7459 Lần 5 30,6 2.9985 0.7518 Trung bình 30,44 2.9970 0.7453 % strychnin theo công t lức tính trong DĐVNIII là : ~ . _ 5(0,32l a - 0,467ố) _ „ c % strychnin = _— - = %s đo (1) ,,, m X (1 - x ) % strychnin thưc là : c = — —------------------- .(2) /íix (l-x ) Giả sử: X (độ ẩm dược liệu) = 9%. m = 0,4 (g) Ta có kết quả ở bảng 2. 3: 23 Bảng 2. 3: Hàm lượng strychnin tính theo công thức của DĐVNIII (1) và hàm lượng strychnin thực tính theo công thức (2) C(%) %SDo Lần 1 1,68 8,41 Lần 2 1,70 8,65 Lần 3 1,69 8,36 Lần 4 1,69 8,35 Lần 5 1,70 8,40 Trung bình 1,69 8,43 Như vậy kết quả đo vói strychnin tinh khiết vẫn cho kết quả cao hơn thực tế với tỷ lê trung bình là : = 4,99 lần. 1,69 Vói hỗn hợp strychnin : brucin có tỷ lệ khoảng 48 : 52, tiến hành như vói strychnin tinh khiết nhưng cân chính xác khoảng 60 mg hỗn hợp, thu được kết quả ở bảng 2. 4: Bảng 2. 4: Độ hấp thụ của dd chiết từ hỗn hợp strychnin : brucin (48 : 52) m cân (mg) a b Lần 1 60,8 2,7846 0,6841 Lần 2 61,2 2,6854 0,6753 Lần 3 60,6 2,7235 0,6958 Lần 4 61,8 2,8049 0,7152 Lần 5 61,2 2,7534 0,7034 Trung bình 61,12 2,7504 0,6948 Tương tự, giả sử : X (độ ẩm dược liệu) = 9%. m = 0,4 (g) Ta có kết quả ở bảng 2. 5: 24 Bảng 2. 5: Hàm lượng strychnin tính theo công thức của DĐVNIII (1) và hàm lượng strychnin thực tính theo công thức (2) C(%) %Sf)o Lần 1 1,62 7,89 Lần 2 1,63 7,51 Lần 3 1,62 7,55 Lần 4 1,65 7,78 Lần 5 1,63 7,63 Trung bình 1,63 7,67 Như vậy kết quả đo vói hỗn hợp strychnin : brucin cũng cho kết quả cao hơn thưc tế với tỷ lê trung bình là : J Ế L = 4 7 1 lần. 1,63 Như vậy có thể coi như giữa hàm lượng strychnin đo và thực tế có sự chênh lệch 4 99 + 4 71 với tỷ lệ trung bình là : ’ ’ = 4,85 Từ tỷ lệ này ta suy ra hàm lượng strychnin thực tế trong nguyên liệu đem định lượng là: — = 1,48% 4,85 2.2.2 - Chiết xuất strychnin bằng ethanol: Với dm ethanol chúng tôi khảo sát các thông số ảnh hưởng đến hiệu suất chiết là : thời gian, nhiệt độ, độ cồn. 2.2.2.1 - Chiết strychnin dưới dạng base bằng ethanol 95° ở nhiệt độ phòng (27 -30°) A - Vứi dươc liêu sấy khỏ sau khi kiềm hoá Tiến hành như phương pháp 2.1.2.2 với: Lượng dược liệu: 100 g/mẻ. Số lần chiết: 4 lần/mẻ. Lượng dm chiết: 200 ml. Thời gian cho mỗi lần rút dịch chiết khác nhau 25 ♦ Với thời gian 48h: Kết quả thu được ở bảng 2. 6; 2. 7 Bảng 2. 6: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 0,92 0,94 0,94 0,91 0,93 0,928 Lần chiết 2 0,48 0,45 0,43 0,44 0,45 0,45 Lần chiết 3 0,21 0,23 0,24 0,25 0,22 0,23 Lần chiết 4 0,10 0,09 0,11 0,08 0,09 0,094 T ổng: 1,71 1,71 1,72 1,68 1,69 1,702 Bảng 2. 7: Lượng strychnin base và strychnin sulfat (g) thu được sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 0,82 0,82 0,83 0,80 0,80 4,07 0,814 Strychnin sulíat 1,05 1,03 1,07 0,98 1,00 5,13 1,026 Nhận x é t: - Dịch chiết có màu vàng sau khi cất thu hồi dm được dịch chiết đậm đặc, lắc với nước acid thì có nhiều tạp không tan trong nước acid và tạp chất béo. ± Với thời sian 24h: Kết quả thu được ở bảng 2. 8; 2. 9 Bảng 2. 8: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 0,95 0,94 0,91 0,93 0,94 0,934 Lần chiết 2 0,40 0,41 0,43 0,45 0,40 0,418 Lần chiết 3 0,25 0,25 0,24 0,24 0,24 0,244 Lần chiết 4 0,08 0,10 0,11 0,09 0,11 0,098 Tổng : 1,68 1,70 1,69 1,71 1,69 1,694 Bảng 2. 9: Lượng strychnin base và strychnin sulíat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 0,81 0,82 0,82 0,83 0,81 4,09 0,818 Strychnin sulíat 1,04 1,05 1,04 1,06 1,02 5,21 1,042 26 Nhận xét: - Lượng alcaloid chiết được tương đương với thời gian chiết là 48h. - Lượng tạp không tan trong nước acid và tạp chất béo ít hơn là chiết trong 48h. Với thời gian Ịà Ỉ4h: Kết quả thu được ở bảng 2. 10; 2. 11 ♦ Bảng 2. 10: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 0,75 0,73 0,73 0,71 0,72 0,728 Lần chiết 2 0,29 0,30 0,28 0,28 0,24 0,284 Lần chiết 3 0,14 0,15 0,15 0,16 0,15 0,15 Lần chiết 4 0,09 0,08 0,11 0,09 0,09 0,092 Tổng : 1,26 1,26 1,27 1,24 1,23 1,254 Bảng 2. 11: Lượng strychnin base và strychnin sulfat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 0,59 0,60 0,61 0,59 0,58 2,97 0,594 Strychnin sulíat 0,74 0,75 0,75 0,73 0,73 3,70 0,75 Nhận xét : - Lượng alcaloid thu được giảm hẳn so với thời gian chiết là 24h, đồng thời lượng tạp cũng ít hơn. ♦ Với thời gian ịà 6h : Kết quả thu được ở bảng 2. 12; 2. 13 Bảng 2. 12: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 0,74 0,73 0,75 0,74 0,73 0,738 Lần chiết 2 0,27 0,28 0,26 0,28 0,26 0,27 Lần chiết 3 0,16 0,15 0,16 0,15 0,15 0,154 Lần chiết 4 0,09 0,09 0,10 0,08 0,10 0,092 Tổng : 1,26 1,25 1,27 1,25 1,24 1,254 27 Bảng 2. 13: Lượng strychnin base và strychnin sulíat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 0,60 0,58 0,62 0,59 0,57 2,96 0,592 Strychinin sulfat 0,74 0,72 0,75 0,73 0,72 3,66 0,732 Nhận xét: - Lượng alcaloid thu được giảm hẳn so với thời gian chiết là 24 h. Từ so sánh các kết quả trên chúng tôi chọn thời gian cho mỗi lần rút dịch chiết với phương pháp chiết bằng ethanol ở nhiệt độ phòng là 24 h. 2.2.2.2 - Chiết bằng ethanol 95° ở nhiệt độ sôi: Để đáng giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết, chúng tôi tiến hành chiết bằng ethanol 95° ở nhiệt độ sôi với dược liệu sấy khố sau khi kiềm hoá. Tiến hành như phương pháp 2.1.2.2. nhưng thay bằng thiết bị chiết xuất là bình cầu 500ml, sau khi cho dược liệu vào bình chiết đổ dm vào, đun cách thuỷ hồi lưu trong 3h. Gạn dịch chiết vào cốc 400ml. Tiếp tục xử lý dịch chiết như phương pháp 2.1.2.2. Ta thu được kết quả ở bảng 2. 14; 2. 15 Bảng 2. 14: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 1,53 1,50 1,54 1,51 1,55 1,526 Lần chiết 2 0,63 0,66 0,62 0,62 0,60 0,626 Lần chiết 3 0,41 0,45 0,42 0,44 0,41 0,426 Lần chiết 4 0,10 0,09 0,09 0,11 0,08 0,094 Tổng : 2,67 2,70 2,67 2,68 2,64 2,672 Bảng 2. 15: Lượng strychnin base và strychnin sulíat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,28 1,29 1,28 1,29 1,28 6,41 1,282 Strychnin sulíat 1,62 1,65 1,62 1,64 1,61 8,13 1,626 Nhận xét: - Hiệu suất chiết cao hơn khoảng 2 lần so vói chiết bằng ethanol 95° ở nhiệt độ phòng (so sánh bảng 2. 8; 2. 9 với bảng 2. 14; 2. 15). 28 - Lượng tạp không tan trong nước acid và tạp chất béo nhiều hơn chiết bằng ethanol nguội (chủ yếu là ở lần chiết thứ nhất). - Phương pháp tiến hành đòi hỏi thiết bị kín để tránh mất mát ethanol trong quá trình chiết xuất. Do đó mặc dù hiệu suất chiết tăng cao nhưng chúng tôi không ưu tiên lựa chọn phương pháp này 2.2.2.3 - Chiết bằng ethanol thấp độ (80° và 70°): Để khảo sát ảnh hưởng của độ cồn tói hiệu suất chiết, chúng tôi tiến hành chiết bằng ethanol thấp độ vói dược liệu sấy khô sau khi kiềm hóa. Tiến hành như phương pháp 2.1.2.2 với: Lượng dược liệu: lOOg/mẻ. Lượng dm : 300ml/mẻ. Số lần chiết: 4 lần/mẻ. Thời gian chiết: 2 h/lần. ± Với ẹthanol 80°: kết quả thu được ở bảng 2. 16; 2. 17 Bảng 2. 16: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 1.39 1.36 1.35 1.38 1.36 1.368 Lần chiết 2 0.61 0.73 0.74 0.68 0.7 0.692 Lần chiết 3 0.34 0.29 0.3 0.31 0.33 0.314 Lần chiết 4 0.17 0.14 0.15 0.16 0.12 0.148 T ổng: 2,51 2,52 2,54 2,53 2,51 2,522 Bảng 2. 17: Lượng strychnin base và strychnin sulfat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,19 1,21 1,23 1,23 1,20 6,06 1,212 Strychnin sulíat 1,51 1,54 1,56 1,55 1,53 7,69 1,538 Nhận xét: - Lượng alcaloid toàn phần ở lần chiết 1 rất cao, cao hơn nhiều so với lượng alcaloid toàn phần chiết bằng ethanol 95° với dược liệu đã sấy khô sau khi 29 kiềm hóa (so sánh với bảng 2. 8; 2. 9). Ở các lần chiết sau lượng alcaloid giảm hẳn so vói lần chiết đầu. - Lượng tạp không tan trong nước acid nhiều hơn chiết bằng ethanol 95° (chủ yếu ở lần chiết 1, các lần chiết sau ít hơn) nhưng tạp chất béo ít hơn. - Thời gian cất thu hồi dm lâu hơn so với ethanol 95°. # Vcri ẹthanol 70° kết quả thu được ở bảng 2. 18; 2. 19 Bảng 2. 18: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 1.54 1.56 1.61 1.58 1.59 1.576 Lần chiết 2 0.78 0.74 0.76 0.79 0.72 0.758 Lần chiết 3 0.28 0.24 0.21 0.25 0.26 0.248 Lần chiết 4 0.10 0.12 0.14 0.11 0.12 0.118 Tổng : 2.70 2.66 2.72 2.73 2.69 2.70 Bảng 2. 19: Lượng strychnin base và strychnin sulfat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,30 1,28 1,32 1,31 1,29 6,50 1,30 Strychnin sulíat 1,65 1,62 1,69 1,66 1,64 8,26 1,652 Nhận xét: - Lượng alcaloid thu được ở lần chiết 1, 2 và tổng lượng alcaloid thu được cao hơn chiết bằng ethanol 95° và ethanol 80°. - Lượng tạp không tan trong nước cũng nhiều hơn chiết bằng ethanol 80° và ethanol 95° nhưng tạp chất béo ít hơn. - Thời gian cất thu hồi dm lâu hơn. Với 2 thí nghiệm chiết bằng ethanol 70° và ethanol 80°, chúng tôi thấy sự có mặt của nước làm tăng cao hiệu suất chiết. Để hiểu rõ hơn ảnh hưởng của nước tới hiệu suất chiết, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm sau: B: Vởi dươc liêu không sấy khỏ sau khỉ kiềm hoá mà đem chiết luôn # Chiết bằng ethanoỉ 95 °ta thu được kết quả ở bảng 2. 20; 2. 21 30 Bảng 2. 20: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 1,68 1,70 1,71 1,71 1,69 1,698 Lần chiết 2 0,44 0,40 0,42 0,45 0,43 0,432 Lần chiết 3 0,12 0,13 0,13 0,12 0,15 0,13 Lần chiết 4 0,06 0,08 0,08 0,07 0,07 0,07 Tổng : 2,30 2,31 2,34 2,35 2,33 2,33 Bảng 2. 21: Lượng strychnin base và strychnin sulíat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,07 1,11 1,13 1,13 1,12 5,56 1,112 Strychnin sulíat 1,36 1,41 1,43 1,44 1,42 7,06 1,412 Nhận xét: - So với chiết bằng ethanol 70° và ethanol 80° vói dược liệu sấy khô thì lượng alcaloid toàn phần thu được ở lần chiết 1 cao hơn nhưng ở cắc lần chiết sau thì thấp hơn (so sánh với bảng 2. 16 và 2.18), do 2 nguyên nhân là: + Ở lần chiết 1 chiết bằng ethanol 95° đã lấy hết nước trong dược liệu, các lần chiết sau coi như là chiết bằng ethanol cao độ không có mặt của nước. (Bằng cách xác định lượng nước còn lại trong dược liệu trước khi chiết là 123g và lượng ethanol 95°dùng để chiết là 300ml thì thực tế dm chiết là ethanol khoảng70°). Lượng alcaloid thu được ở lần chiết 1 rất cao do đó lượng còn lại trong dược liệu ít. Vì vậy mà ở các lần chiết sau lượng alcaloid thấp hơn hẳn so vói lần đầu và thấp hơn chiết bằng ethanol 70° và ethanol 80°. + Vì dược liệu không bị sấy khô nên không cần thời gian để nước làm trương nở tế bào do đó ở lần chiết 1 lượng alcaloid thu được cao hơn hẳn chiết bằng ethanol 70° và ethanol 80°. - Lượng tạp không tan trong nước acid và tạp chất béo tăng so với chiế bằng ethanol 70° và ethanol 80°, chủ yếu tập trung ở lần chiết 1. 31 4 Chiết bằng ethanol 95° ở lần chiết 1, các lần chiết sau chiết với ethanol 80°, ta thu được kết quả ở bảng 2. 22; 2. 23 Bảng 2. 22: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 1,70 1,69 1,68 1,70 1,68 1,69 Lần chiết 2 0,44 0,46 0,43 0,42 0,43 0,436 Lần chiết 3 0,18 0,16 0,17 0,18 0,18 0,172 Lần chiết 4 0,08 0,10 0,10 0,09 0,09 0,092 Tổng : 2,40 2,41 2,38 2,39 2,38 2,39 Bảng 2. 23: Lượng strychnin base và strychnin sulíat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,16 1,17 1,15 1,16 1,14 5,78 1,156 Strychnin sulíat 1,47 1,48 1,46 1,46 1,45 7,32 1,464 Nhận xét: - So vói chiết cả 4 lần bằng ethanol 95° thì lượng alcaloid toàn phần thu được ở dịch chiết 1 tương đương còn ở các dịch chiết sau có tăng lên nhưng không đáng kể và tổng lượng alcaloid tăng lên. (so sánh vói bảng 2. 20; 2. 21) # Các lần chiết sau bằng ethanol 70°, ta thu đượckết quả ở bảng 2. 24; 2. 25 Bảng 2. 24: Lượng alcaloid toàn phần (g) Lần chiết 1 Lần chiết 2 Lần chiết 3 Lần chiết 4 Tổng : Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình 1,69 1,70 1,68 1,69 1,71 1,694 0,58 0,57 0,56 0,59 0,59 0,578 0,33 0,33 0,32 0,34 0,34 0,332 0,12 0,14 0,13 0,12 0,13 0,128 2,72 2,74 2,69 2,74 2,77 2,732 32 Bảng 2. 25: Lượng strychnin base và strychnin sulíat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,32 1,33 1,29 1,32 1,34 6,07 1,32 Strychnin sulíat 1,69 1,69 1,64 1,69 1,70 7,67 1,682 Nhận xét: - So với chiết cả 4 lần bằng ethanol 95° và ethanol 80° thì lượng alcaloid toàn phần thu được ở dịch chiết 1 tương đương còn ở các dịch chiết sau thì tăng lên và tổng lượng alcaloid cũng tăng lên. (so sánh với bảng 2. 20; 2. 21 - bảng 2. 22; 2. 23) - Thời gian cất thu hồi dm lâu hơn. Qua các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ cồn tới hiệu suất chiết, chúng tôi thấy: - Vói dược liệu sấy khô sau khi kiềm hoá thì hiệu suất chiết bằng ethanol 70° cao hơn ethanol 80° và cao hơn ethanol 95°. (so sánh các bảng 2. 8; 2. 9 - bảng 2. 16; 2. 1 7 -bảng 2. 18; 2.19). - Cùng chiết bằng ethanol 95°, thì dược liệu sau khi kiềm hoá không sấy khô mà đem chiết luôn cho hiệu suất cao là dược liệu đem sấy khô trước khi chiết. - Với dược liệu không sấy khô sau khi kiềm hoá, tiến hành chiết cả 4 lần với ethanol 95° hay lần chiết 1 vói ethanol 95° và 3 lần sau với ethanol 70° hoặc ethanol 80° thì lượng alcaloid toàn phần thu được với ethanol 70° cao hơn ethanol 80° và hơn ethanol 95° nhưng không đáng kể. (so sánh các bảng 2. 20; 2. 21 - bảng 2. 22; 2. 23 - bảng 2. 24; 2. 25) - Lượng alcaloid toàn phần thu được cao nhất trong thí nghiệm chiết bằng ethanol 70° với dược liệu đã sấy khô. Ảnh hưởng của nước tới hiệu suất chiết được giải thích là do nước làm trương nở tế bào giúp dm dễ thấm vào các tế bào dược liệu làm cho quá trình chiết xuất sảy ra nhanh và triệt để hơn. Để làm rõ hơn ảnh hưởng của nước tới hiệu suất chiết, chúng tôi đem làm ẩm lại dược liệu đã sấy khô sau khi kiềm hóa với lượng nước bằng lượng sữa vôi đem 33 kiềm hoá (150ml/100g dược liệu) rồi chiết bằng ethanol 95°, thu được kết quả ở bảng 2. 26; 2. 27 Bảng 2. 26: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 1,72 1,73 1,71 1,73 1,73 1,722 Lần chiết 2 0,44 0,43 0,43 0,44 0,41 0,43 Lần chiết 3 0,13 0,14 0,13 0,12 0,13 0,13 Lần chiết 4 0,08 0,07 0,09 0,08 0,09 0,082 Tổng : 2,37 2,37 2,36 2,36 2,36 2,364 Bảng 2. 27: Lượng strychnin base và strychnin sulfat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,14 1,15 1,13 1,13 1,14 5,68 1,136 Strychnin sulíat 1,44 1,45 1,43 1,42 1,45 7,19 1,438 Nhận xét: - Kết quả này tương đương vói chiết bằng ethanol 95° vói dược liệu không sấy khô trước khi chiết (so sánh với bảng 2. 20; 2. 21). Kết quả này giúp khẳng định giải thích về ảnh hưởng của nước tói hiệu suất chiết ở trên. 2.2.3 - Chiết xuất strychnỉn bằng dầu hoả: Để so sánh hiệu suất chiết bằng ethanol và bằng dầu hoả, đồng thời để làm rõ thêm ảnh hưởng của nước tới hiệu suất chiết, chúng tôi tiến hành chiết strychnin bằng dầu hoả trên cùng nguyên liệu hạt mã tiền. 2.2.3.1 - Chiết nóng bằng dầu hoả: a ) Với dươc Ịịêu không sấy khô sau khi kịềm hoá: Cách tiến hành như phương pháp 2.1.2.3 với: Số lần chiết: 4 lần/mẻ. Lượng dm là: 400 ml /lần. Thời gian chiết là: 3 h/mẻ. Kết quả thu được ở bảng 2. 28; 2. 29 34 Bảng 2. 28: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 0,97 0,99 0,97 0,96 0,99 0,976 Lần chiết 2 0,96 0,98 0,96 0,96 0,97 0,962 Lần chiết 3 0,54 0,54 0,56 0,55 0,53 0,544 Lần chiết 4 0,26 0,27 0,24 0,24 0,24 0,25 T ổng: 2,73 2,78 2,72 2,70 2,73 2,732 Bảng 2. 29: Lượng strychnin base và strychnin sulíat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,33 1,35 1,32 1,30 1,32 6,62 1,324 Strychnin sulíat 1,69 1,71 1,69 1,65 1,69 8,43 1,676 Nhận xét: - Chiết bằng dầu hoả cho phép ta loại các tạp chất béo tan trong dầu hoả dễ dàng hơn. - Hiệu suất chiết cao. - Tuy nhiên dầu hoả đắt hơn ethanol và đòi hỏi thiết bị chiết nóng. bì Với dươc Uêu sau khi Ịáềm hoa đem sấy khô sau đó Ịàm ẩm Ịai vói thể tích nước bằng thể tích sữa vôi đem kiềm hoá (150ml/100g dược liệu), ta thu được kết quả ở bảng 2. 30; 2. 31 Bảng 2. 30: Lượng alcaloid toàn phần(g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 0,96 0,96 0,98 0,97 0,99 0,972 Lần chiết 2 0,95 0,94 0,96 0,96 0,97 0,956 Lần chiết 3 0,53 0,55 0,54 0,53 0,52 0,534 Lần chiết 4 0,26 0,24 0,27 0,26 0,23 0,252 Tổng : 2,70 2,69 2,75 2,72 2,71 2,714 35 Bảng 2. 31: Lượng strychnin base và strychnin sulfat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 1,29 1,29 1,33 1,32 1,30 6,53 1,306 Strychnin sulfat 1,65 1,64 1,69 1,69 1,65 8,32 1,664 Kết quả thu được tương đương vói chiết dược liệu chưa sấy khô giúp khẳng định hơn giải thích về ảnh hưởng của nước với hiệu suất chiết. c) Với dươc liêu sấy khô sau khi kiềm hoá, ta thu được kết quả ở bảng 2. 32, 2. 33. Bảng 2. 32: Lượng alcaloid toàn phần (g) Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình Lần chiết 1 0,41 0,42 0,42 0,43 0,43 0,422 Lần chiết 2 0,28 0,27 0,26 0,27 0,28 0,272 Lần chiết 3 0,12 0,11 0,11 0,12 0,14 0,12 Lần chiết 4 0,10 0,09 0,10 0,09 0,09 0,094 Tổng : 0,91 0,89 0,89 0,91 0,94 0,908 Bảng 2. 33: Lượng strychnin base và strychnin sulfat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 0,44 0,42 0,42 0,43 0,45 2,16 0,432 Strychnin sulíat 0,55 0,52 0,51 0,54 0,55 2,67 0,534 Nhận xét: - Tương tự như chiết suất bằng ethanol thì chiết xuất bằng dầu hoả mà không có mặt của nước làm trương nở màng tế bào dược liệu thì hiệu suất chiết thấp hơn nhiều. 2.2.3.2 - Chiết nguội bằng dầu hoả: Để chứng minh độ tan của strychnin trong dầu hoả rất thấp, chúng tôi tiến hành chiết nguội bằng dầu hoả. Tiến hành như phương pháp 2.1.2.3 nhưng ở nhiệt độ thường. Kết quả thu được ở bảng 2. 34; 2. 35 36 Bảng 2. 34: Lượng alcaloid toàn phần (g) Lần chiết 1 Lần chiết 2 Lần chiết 3 Lần chiết 4 Tổng : Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Trung bình 0,17 0,16 0,17 0,15 0,17 0,164 0,14 0,16 0,15 0,14 0,16 0,15 0,13 0,14 0,14 0,13 0,14 0,136 0,11 0,12 0,11 0,13 0,12 0,118 0,55 0,58 0,57 0,55 0,59 0,568 Bảng 2. 35: Lượng strychnin base và strychnin sulíat (g) sau khi tinh chế Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 3 Mẻ 4 Mẻ 5 Tổng Trung bình Strychnin base 0,24 0,26 0,25 0,24 0,27 1,26 0,252 Strychnin sulfat 0,29 0,31 0,30 0,28 0,32 1,50 0,30 Nhận xét: - Hiệu suất chiết thấp hơn rất nhiều so vói chiết nóng cũng như so vói chiết nguội bằng cồn. 2.2.4 - Kiểm nghiệm thành phẩm strychnin sulfat: Tiến hành theo D ĐVNIII các chỉ tiêu sau: Tính chất Tinh thể hình kim không màu hay bột kết tinh màu trắng, không mùi. Dễ tan trong nước sôi, hơi tan trong ethanol và nước lạnh, khó tan trong cloroíorm và không tan trong ether. Kết luận: Đạt. Định tính: Chọn nhóm 1: B, c và D. B: Trong phép thử “tạp chất liên quan vết chính của dd thử giống về vị trí, màu sắc và kích thước so với vết chính của dd đối chiếu (1). (xem hình 2. 1, trang 39) C: Tiến hành như DĐVNIII, kết quả xung quanh tinh thể kali dicromat có màu tím, màu đỏ, màu vàng khi lắc. D: Chế phẩm cho phản ứng của ion sulíat như trong phụ lục 7.1 Độ trong và màu sắc dd: 37 Kết quả: dd s có độ trong và màu sắc tương đương với độ trong và màu sắc của dm hoà tan là nước không có carbon dioxyd. => Kết luận : Đạt. Giới hạn acỉd - kiềm: Kết quả: Lấy 5 ml dd s, cho 0,1 ml đỏ methyl dd có màu đỏ. Thêm 0,48 ml dd natri hydroxyd 0,02 N dd chuyển sang màu vàng. => Kết luận: Đạt. Góc quay cực riêng: [a] * = - 26,26° => Kết luận: Đạt. Brucỉn: Lấy 0,1 g chế phẩm, thêm 1 ml acid nitric và 0,2 ml nước, lắc cho tan hoàn toàn dung dịch có màu xanh nhạt, trong suốt. So với dd chuẩn gồm 1 ml acid nitric và 0,2 ml đd brucin 0,054% thì dung dịch này có màu hồng nhạt. => Kết luận: Đạt. Tạp chất liên quan: Tiến hành theo phương pháp sắc ký lớp mỏng, kết quả: không có vết phụ. => Kết luận: Đạt (xem hình 2. 1, trang 39) Nước: Định lượng theo phương pháp Karl-Fischer Kết quả: 10,36% => Kết luận: Đạt. Tro sulfat Kết quả: 0,061%. => Kết luận Đạt Định lượng Bằng phương pháp chuẩn độ đo thế trong môi trường khan. Kết quả: 99,57%. => Kết luận: Đạt. 38 '5 Hình 2. 1: sắc ký lớp mỏng tạp chất liên quan, trong đó 1 - Dung dịch đối chiếu 1% (1) 2 - Dung dịch đối chiếu 0,05% (2) 3 - Dung dịch thử 1%. 39 PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 3.1 - Kết luận: - Đã xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất với dm ethanol là nhiệt độ, thời gian chiết và đặc biệt là độ ẩm của dược liệu và đã xác định các thông số trên để đạt được hiệu suất chiết xuất cao nhất với dm ethanol bằng phương pháp ngâm. - Có thể sử dụng ethanol làm dm chiết xuất strychnin sulíat từ hạt mã tiền ở nhiệt độ thường đạt hiệu suất tương đương với chiết nóng bằng dầu hoả. Cụ thể là: + Với dm ethanol ở nhiệt độ thường: Chiết bằng ethanol 95° ở lần chiết đầu, 3 lần sau chiết bằng ethanol 70° với dược liệu không sấy khô sau khi kiềm hoá (lOOg bột hạt mã tiền + 123g nước) hoặc chiết cả 4 lần bằng ethanol 70° với dược liệu sấy khô sau khi kiềm hóa, hiệu suất chiết strychnin base là 89,19% và strychnin sulfat là 88,76%. + Với dm dầu hoả ở nhiệt độ cao: Chiết nóng (chiết 4 lần) hiệu suất chiết strychnin base là 89,46% và strychnin sulfat là 88,44%. 3.2 - Đề xuất: - Chúng tôi mới nghiên cứu chiết strychnin từ hạt mã tiền với dm ethanol bằng phương pháp ngâm là phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Để đưa ra sản xuất công nghiệp cần nghiên cứu chiết xuất bằng phương pháp chiết ngược dòng gián đoạn và xác định số lần chiết để đạt hiệu suất cao và tiết kiệm dm. - Nên xem lại và hiệu chỉnh phương pháp định lượng strychnin trong hạt mã tiền của DĐVNIII. 40 DANH SÁCH TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1 - Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường ĐH Dược Hà Nội (2001) - Kỹ thuật chiết xuất dược phẩm - Trung tâm thông tin thư viện trường ĐH Dược - Tập I, Tr. 107 109. 2 - Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường ĐH Dược Hà Nội (1999) - Thực tập sản xuất thuốc - Trung tâm thông tin thư viện trường ĐH Dược - Tr. 65 - 66. 3 - Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường ĐH Dược Hà Nội (1978) - Thực tập kỹ thuật chiết xuất - Trung tâm thông tin thư viện trường ĐH Dược - Tr. 3-8. 4 —Bộ môn Dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội (1998) —Bài giảng Dược liệu Trung tâm thông tin thư viện trường ĐH Dược - Tập II, Tr. 262, Tr. 407. 5 - Bộ Y tế (2003) - Dược điển Việt Nam - NXB Y học - Tập III, tr. 262, tr. 407. 6 - Viện dược liệu (2004) - Cây thuốc và động vật làm thuốc - NXB Khoa học kỹ thuật - Tập II, tr. 209. 7 - Võ Văn Chi (1997) -T ừ đ iể n cây thuốc Việt Nam - NXB Y học - Tr. 705-706. 8 - Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985) - Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc - NXB Y học - Tr.385. 9 - Đỗ Tất Lợi (1999) - Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam - NXB Y học - Tr. 530. TIẾNG ANH 10 —p. H. List and p. c. Schmidt (1989) —Phytopharmaceutical Technology —CRC Press. Inc - p. 102. [...]... Phương pháp chiết xuất bằng ethanol được thực hiện ở các độ cồn khác nhau, thòi gian khác nhau và nhiệt độ khác nhau 2.1.2.3 - Chiết xuất strychnin bằng dầu hoả: Đây là phương pháp chiết xuất đang được xí nghiệp 2 sử dụng để chiết xuất strychnin sulfat Chúng tôi chiết xuất theo phương pháp nàynhằm so sánh hiệu quả chiết xuất so với chiết bằng ethanol Sơ đồ quy trình chiết xuất strychnin bằng dầu hỏa:... Nhận xét: - So với chiết bằng ethanol 70° và ethanol 80° vói dược liệu sấy khô thì lượng alcaloid toàn phần thu được ở lần chiết 1 cao hơn nhưng ở cắc lần chiết sau thì thấp hơn (so sánh với bảng 2 16 và 2.18), do 2 nguyên nhân là: + Ở lần chiết 1 chiết bằng ethanol 95° đã lấy hết nước trong dược liệu, các lần chiết sau coi như là chiết bằng ethanol cao độ không có mặt của nước (Bằng cách xác định... chế Trong trường hợp chiết bằng nước, từ dịch chiết thô alcaloid base được giải phóng bằng cách thêm kiềm sau đó được chiết bằng một dm hữu cơ không hoà tan 12 trong nước Tiếp tục tinh chế bằng cách bốc hơi dm và kết tinh lại trong dm hữu cơ hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại Trong trường hợp chiết bằng ethanol, dịch chiết ethanol được cô đặc, thêm acid và loại các tạp chất bằng các dm hữu cơ không... liệu (%) Hàm lượng strychnin (C21ĨỈ22N2O2) không ít hơn 1,2% tính theo dược liệu khô kiệt 2.1.2.2 - Phương pháp chiết xuất strychnỉn bằng ethanol: Hạt mã tiền sau khi đã được kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn về hàm lượng, chúng tôi tiến hành chiết xuất bằng ethanol theo sơ đồ sau: Sơ đồ chiết xuất strychnin bằng ethanol: Sữa vôi Ethanol ethylic 16 Thu hồi •*- Dm Cai mu noi dm Dd H2S04 3% Dịch chiết đậm đặc Dầu... bình Strychnin base 1,30 1,28 1,32 1,31 1,29 6,50 1,30 Strychnin sulíat 1,65 1,62 1,69 1,66 1,64 8,26 1,652 Nhận xét: - Lượng alcaloid thu được ở lần chiết 1, 2 và tổng lượng alcaloid thu được cao hơn chiết bằng ethanol 95° và ethanol 80° - Lượng tạp không tan trong nước cũng nhiều hơn chiết bằng ethanol 80° và ethanol 95° nhưng tạp chất béo ít hơn - Thời gian cất thu hồi dm lâu hơn Với 2 thí nghiệm chiết. .. xét: - Lượng alcaloid thu được giảm hẳn so với thời gian chiết là 24 h Từ so sánh các kết quả trên chúng tôi chọn thời gian cho mỗi lần rút dịch chiết với phương pháp chiết bằng ethanol ở nhiệt độ phòng là 24 h 2.2.2.2 - Chiết bằng ethanol 95° ở nhiệt độ sôi: Để đáng giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết, chúng tôi tiến hành chiết bằng ethanol 95° ở nhiệt độ sôi với dược liệu sấy khố sau khi... tỷ lệ trung bình là : ’ ’ = 4,85 Từ tỷ lệ này ta suy ra hàm lượng strychnin thực tế trong nguyên liệu đem định lượng là: — = 1,48% 4,85 2.2.2 - Chiết xuất strychnin bằng ethanol: Với dm ethanol chúng tôi khảo sát các thông số ảnh hưởng đến hiệu suất chiết là : thời gian, nhiệt độ, độ cồn 2.2.2.1 - Chiết strychnin dưới dạng base bằng ethanol 95° ở nhiệt độ phòng (27 -30°) A - Vứi dươc liêu sấy khỏ sau... xét: - Lượng alcaloid toàn phần ở lần chiết 1 rất cao, cao hơn nhiều so với lượng alcaloid toàn phần chiết bằng ethanol 95° với dược liệu đã sấy khô sau khi 29 kiềm hóa (so sánh với bảng 2 8; 2 9) Ở các lần chiết sau lượng alcaloid giảm hẳn so vói lần chiết đầu - Lượng tạp không tan trong nước acid nhiều hơn chiết bằng ethanol 95° (chủ yếu ở lần chiết 1, các lần chiết sau ít hơn) nhưng tạp chất béo... xác định lượng nước còn lại trong dược liệu trước khi chiết là 123g và lượng ethanol 95°dùng để chiết là 300ml thì thực tế dm chiết là ethanol khoảng70°) Lượng alcaloid thu được ở lần chiết 1 rất cao do đó lượng còn lại trong dược liệu ít Vì vậy mà ở các lần chiết sau lượng alcaloid thấp hơn hẳn so vói lần đầu và thấp hơn chiết bằng ethanol 70° và ethanol 80° + Vì dược liệu không bị sấy khô nên không... pháp chung chiết xuất còn có thể chiết tách bằng phương pháp cất kéo hơi nước Với những alcaloid ở thể rắn người ta sử dụng hai phương pháp chiết xuất chung sau: 1.3.1.1 - Phương pháp chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu cơ: a - Chiết alcaloid base bằng dm hữu cơ không phân cực : - Giai đoan 1: Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô: để tăng khả năng chiết ta phải xay nhỏ dược liệu trước khi chiết nhằm