Đang tải... (xem toàn văn)
... hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng nấm men lên men vang nho Mục đích nghiên cứu Phân lập đƣợc chủng nấm men có khả lên men vang nho Cabernet sauvignon Nghiên cứu số tính. .. ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ***** NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG NHO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học. .. cứu số đặc tính sinh học chủng nấm men lên men vang nho Cabernet sauvignon 3.3 Lên men vang nho Cabernet sauvignon Ý nghĩa khoa học thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu nhằm sâu tìm hiểu đặc
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ***** NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG NHO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ***** NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG NHO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô giáo PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung - giảng viên môn Vi sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 - ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn trong tổ Vi sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Con cảm ơn bố mẹ, anh trai vì đã luôn yêu thƣơng con và cho con cơ hội để học bao điều hay trong cuộc sống… Cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với tác giả khác. Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh nấm men Saccharomyces cerevisiae trong lên men rƣợu vang ....................................................................................... 9 Hình 1.2. Một số vi khuẩn lactic trong lên men rƣợu vang .......................... 11 Hình 3.1. Chủng nấm men phân lập trên môi trƣờng đĩa thạch ................... 25 Hình 3.2. Chủng nấm men N1, N6, N9 trên môi trƣờng thạch nghiêng ......... 25 Hình 3.3. Khả năng lên men của các chủng nấm men ở pH khác nhau ........ 28 Hình 3.4. Động thái phát triển của các chủng nấm men trong môi trƣờng nhân giống ................................................................................... 30 Hình 3.5. Khuẩn lạc của chủng nấm men N1 trên môi trƣờng MT1 ............. 31 Hình 3.6. Ảnh chụp qua kính hiển quang học với độ phóng đại 1000 cho thấy hình thái tế bào của chủng nấm men N1 ............................... 31 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của pH đến sự phát triển của chủng S. cerevisiae N1 33 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sự phát triển của chủng S. cerevisiae N1 ............................................................................ 34 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ vô cơ tới sự sinh trƣởng của chủng S. cerevisiae N1 ................................................................ 35 Hình 3.10. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng pepton đến sự sinh trƣởng của chủng S. cerevisiae N1 ............................................................... 36 Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự sinh trƣởng của chủng S. cerevisiae N1 ............................................................... 37 Hình 3.12. Động thái lên men vang nho Cabernet sauvignon của chủng S. cerevisiae N1 .............................................................. 41 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại rƣợu vang ...................................................................... 4 Bảng 3.1. Các chủng nấm men thu đƣợc qua các lần phân lập ..................... 24 Bảng 3.2. Hàm lƣợng CO2 giải phóng sau 72 giờ lên men của 3 chủng nấm men N1, N6 và N9 ................................................................. 26 Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men ...................... 27 Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của ba chủng nấm men ................................... 28 Bảng 3.5. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1 ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau .............................................................. 38 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1 .................................................................. 39 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1 ........................................................... 40 Bảng 3.8. Kết quả phân tích rƣợu thành phẩm ............................................. 42 CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN S. cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae CFU : Colony Forming Unit V : Thể tích MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3 1.1. Sơ lƣợc về đặc điểm và tình hình phát triển của nho Cabernet sauvignon ................................................................................ 3 1.2. Khái quát chung về rƣợu vang ................................................................. 3 1.2.1. Phân loại rƣợu vang.............................................................................. 3 1.2.2. Nguyên liệu sản xuất rƣợu vang ........................................................... 5 1.2.3. Thành phần của rƣợu vang ................................................................... 6 1.2.4. Tàng trữ rƣợu vang .............................................................................. 6 1.3. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang ........... 7 1.3.1. Nấm men .............................................................................................. 7 1.3.1.1. Sơ lƣợc về nấm men ........................................................................ 7 1.3.1.2. Hình dạng, kích thƣớc của tế bào nấm men ...................................... 9 1.3.1.3. Cấu tạo của tế bào nấm men ............................................................. 9 1.3.1.4. Sinh sản của tế bào nấm men .......................................................... 10 1.3.2. Vi khuẩn lactic ................................................................................... 11 1.3.3. Các vi sinh vật gây hỏng rƣợu vang ................................................... 12 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm men ............................................................................................... 12 1.4.1. Nguồn cacbon ................................................................................... 12 1.4.2. Nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ ............................................................... 13 1.4.3. Nguồn photpho vô cơ ....................................................................... 13 1.4.4. Nguồn nguyên tố khoáng ................................................................... 13 1.4.5. Ảnh hƣởng của oxi ............................................................................ 13 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men vang ................................. 13 1.5.1. Nhiệt độ ............................................................................................. 13 1.5.2. Độ pH ................................................................................................ 14 1.5.3. Nồng độ rƣợu .................................................................................... 14 1.5.4. Hàm lƣợng đƣờng .............................................................................. 14 1.5.5. Men giống ......................................................................................... 15 1.5.6. Oxy hòa tan ....................................................................................... 15 1.5.7. Ảnh hƣởng của chất khử trùng ........................................................... 16 1.6. Tình hình sản xuất vang nho Cabernet sauvignon trên thế giới và ở Việt Nam .............................................................................................. 16 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 18 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 18 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 18 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 18 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 18 2.1.4. Môi trƣờng ......................................................................................... 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 19 2.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu ......................................................................... 19 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập ........................................................................ 19 2.2.3. Phƣơng pháp giữ giống vi khuẩn ........................................................ 20 2.2.4. Phƣơng pháp hoạt hóa giống .............................................................. 20 2.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men ........................ 20 2.2.6. Xác định khả năng kết lắng ................................................................ 21 2.2.7. Phƣơng pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm men ................... 21 2.2.8. Phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào .............................................. 21 2.2.9. Phƣơng pháp hóa học ......................................................................... 22 2.2.10. Phƣơng pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu .......................... 22 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 24 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon .............................................................. 24 3.1.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch nho Cabernet sauvignon ................. 24 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon .................................................................... 25 3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men ............................................................... 26 3.1.2.2. Khả năng lên men đƣờng ................................................................. 27 3.1.2.3. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men ..................................... 27 3.1.2.4. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau ........................................... 28 3.1.2.5. Nghiên cứu động thái phát triển của các chủng nấm men trong môi trƣờng nhân giống .................................................................... 29 3.1.2.6. Xác định tên khoa học của chủng nấm men tuyển chọn .................. 31 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men tuyển chọn ... 32 3.2.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nhân giống đến sự sinh trƣởng của chủng nấm men tuyển chọn ............................................................... 32 3.2.1.1. Ảnh hƣởng của độ pH ...................................................................... 32 3.2.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ................................................................... 33 3.2.1.3. Ảnh hƣởng của nguồn nito vô cơ .................................................... 34 3.2.1.4. Ảnh hƣởng của pepton .................................................................... 36 3.2.1.5. Ảnh hƣởng của KH2PO4 ................................................................. 37 3.2.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon của chủng nấm men tuyển chọn .................. 38 3.2.2.1. Khả năng lên men ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau .................... 38 3.2.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng lên men ................. 39 3.2.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng lên men ............. 40 3.3. Lên men vang nho Cabernet sauvignon ................................................ 41 3.3.1. Động thái lên men vang nho Cabernet sauvignon .............................. 41 3.3.2. Lên men vang nho Cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm .... 42 3.3.3. Quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm ............................................................... 43 3.3.3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon ........................................................................ 43 3.3.3.2. Thuyết minh quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon ......................................................................... 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Rƣợu đã đƣợc con ngƣời sản xuất và sử dụng cách đây rất lâu vào khoảng 6000 năm trƣớc Công Nguyên, trong đó rƣợu vang (wine, vine) là một sản phẩm đƣợc tạo thành trong quá trình lên men từ dịch ép trái nho của một số chủng nấm men. Song phải đến hàng ngàn năm sau, nhờ sự phát triển của khoa học kĩ thuật mà việc sản xuất rƣợu nho mới thực sự trở thành nghề mang tính thƣơng mại của nhiều quốc gia trên thế giới nhƣ: Anh, Pháp, Đức (các nƣớc thuộc khối liên minh Châu Âu), hay nhƣ Hoa Kỳ, Úc, Bungary, Bồ Đào Nha, Nga… với tổng sản lƣợng đạt khoảng 29 tỷ lít/năm. Đến nay, rƣợu vang không chỉ đƣợc làm từ nho mà còn đƣợc làm từ nhiều loại quả khác nhau rất phong phú và đa dạng nhƣ vang dâu, vang vải, vang mơ, vang táo, vang sherry, vang điều, vang lê,… tùy thuộc vào điều kiện tự nhiên của từng quốc gia. Ở Việt Nam ngành sản xuất rƣợu vang mới thực sự bắt đầu những năm 80 của thế kỷ XX, đƣợc đánh dấu bằng sự hiện diện của vang Thăng Long. Sau đó có một số cơ sở sản xuất rƣợu vang khác nhƣ vang Gia Lâm, Vang Thanh Ba, vang Đà Lạt… [12] . Nho Cabernet sauvignon là giống nho làm rƣợu vang đỏ nổi tiếng nhất thế giới, đƣợc tạo ra nhờ sự kết hợp giữa hai dòng nho Sauvignon Franc và Cabernet Blanc. Đây là loại nho dễ trồng, có khả năng thích ứng rất tốt với nhiều vùng đất khác nhau và đem trồng ở đâu cũng vẫn giữ đƣợc những đặc tính rất riêng của thứ nho Quý phái nhất thế giới. Hiện nay và những năm sắp tới nhu cầu tiêu thụ rƣợu vang nho rất lớn và thị trƣờng này đầy tiềm năng, chính vì vậy việc nghiên cứu sử dụng nho Cabernet sauvignon để sản xuất vang theo chúng tôi là cần thiết có triển vọng và phù hợp với điều kiện thực tiễn của Việt Nam. Chính vì những lí do trên nên tôi đã chọn và tiến hành 1 nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men lên men vang nho”. 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập đƣợc chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon. Nghiên cứu một số tính sinh học và khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon của chủng nấm men tuyển chọn. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men lên men vang nho Cabernet sauvignon 3.3. Lên men vang nho Cabernet sauvignon 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu góp phần đƣa ra qui trình sản xuất vang từ nho Cabernet sauvignon. 5. Điểm mới của đề tài Đề tài không chỉ phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon mà đã đi sâu nghiên cứu đƣợc đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về đặc điểm và tình hình phát triển của nho Cabernet sauvignon Nho Cabernet sauvignon là một trong những loại nho số 1 để làm vang đỏ trên thế giới. Quả của giống nho này nhỏ, tròn, có màu đen với vỏ rất dầy và cứng cáp. Nhờ lớp vỏ đó, loại nho này có thể chống chọi lại sâu bệnh, ít bị hỏng và có thể chống chịu đƣợc với những trận mƣa của mùa thu. Chính những đặc tính đó kết hợp với hƣơng vị đƣợc ƣa thích nên Cabernet sauvignon là một trong những loại nho đỏ làm rƣợu vang phổ biến nhất trên thế giới. Quả nho có bốn thành phần chính: Cuống (3 đến 5% tổng trọng lƣợng): mỗi chùm có một cuống, đƣợc loại bỏ vào lúc ban đầu của quá trình làm rƣợu. Vỏ quả (6 đến 10%): chứa các chất tạo màu, cùng chất tannin và các men, làm cho nƣớc cốt lên men. Thịt (82 đến 90%): phần mềm bên trong của quả, là nguồn cấp nƣớc cốt, gồm nƣớc, đƣờng, các acid, các chất muối khoáng và vitamin. Các hạt (2 đến 4%): giàu chất tannin và các dầu. Cabernet sauvignon đƣợc trồng chủ yếu ở Bordeaux (thung lũng xứ Loire, Languedoc, Roussillon, Provence và ở Tây Nam nƣớc Pháp) và đƣợc lan rộng cả ở các vùng trồng nho nổi tiếng khác ở các nƣớc Tân thế giới nhƣ: Chile, Argentina, Nam Phi, Úc, California (Mỹ). Ở Việt Nam, nho Cabernet sauvignon đƣợc trồng nhiều ở Ninh Thuận. 1.2. Khái quát chung về rƣợu vang 1.2.1. Phân loại rượu vang Rƣợu vang là loại nƣớc giải khát thơm ngon giàu chất bổ dƣỡng với độ cồn nhẹ và có hƣơng thơm từ trái cây còn giữ lại trong rƣợu. Rƣợu vang theo đúng nghĩa là rƣợu lên men từ nƣớc ép quả nho (không chƣng cất). Gần đây 3 ngƣời ta mới mở rộng khái niệm rƣợu vang để chỉ các loại rƣợu lên men từ các loại quả khác nhau nhƣ: mơ, táo, dứa, vải, nhãn, xoài,... [24]. Có nhiều cách phân loại khác nhau, có thể căn cứ vào chỉ tiêu giới hạn về màu sắc của sản phẩm mà phân thành các loại: rƣợu vang đỏ là loại rƣợu vang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thẫm; rƣợu vang trắng là rƣợu vang có màu vàng rơm đến vàng ánh; rƣợu vang hồng có màu hồng đến đỏ tƣơi. Hoặc căn cứ theo độ rƣợu, hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng axit... có trong rƣợu vang mà phân thành các loại: rƣợu vang khô, rƣợu vang dịu, rƣợu vang ngọt. Nhƣng xu hƣớng chung thì rƣợu vang đƣợc phân thành hai nhóm chính là rƣợu vang không có gas (trong rƣợu vang thành phẩm không có CO2) và rƣợu vang có gas (trong rƣợu vang thành phẩm có CO 2), trong đó mỗi nhóm lại phân thành một số loại khác nhau tùy theo hƣơng, vị... của từng loại sản phẩm. Bảng 1.1. Phân loại rƣợu vang Loại rƣợu vang Cay Rƣợu vang bàn ăn (table Nửa ngọt wine) Ngọt Vang Nặng Rƣợu vang không Nửa ngọt nặng (Fortified Điểm gas Ngọt wine) tâm Tạo hƣơng Không ngọt (Brut) Rất cay Sâm banh Cay (Champagne) Nửa cay Ngọt Đỏ Rƣợu Hồng vang có gas Thơm (Muxcat) Rƣợu vang bọt Rƣợu vang bọt 4 Độ cồn (%/V) Độ đƣờng(%) 9 ÷ 14 < 0,3 9 ÷ 12 0,3 ÷0,5 9 ÷ 12 3,0 ÷ 8,0 17 ÷ 20 1 ÷ 14 14 ÷ 16 5 ÷ 20 15 ÷ 17 14 ÷ 20 16 ÷ 18 6 ÷ 16 10,5 ÷ 12,5 < 0,3 10,5 ÷ 12,5 0,8 10,5 ÷ 12,5 3,0 10,5 ÷ 12,5 5,0 10,5 ÷ 12,5 8,0 11 ÷ 13,5 7÷8 10,5 ÷ 12,5 6÷7 10,5 ÷ 12,5 9 ÷ 12 9 ÷ 12 3÷8 1.2.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang Đây đƣợc coi là yếu tố hàng đầu, quyết định đến chất lƣợng của rƣợu vang. Từ lâu nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất rƣợu vang ở hầu hết quốc gia vẫn là dịch ép quả nho chín. Để sản xuất rƣợu vang, ngƣời ta thƣờng phải quan tâm đến một số chỉ tiêu chất lƣợng của nguyên liệu nhƣ sau [24]: Hàm lƣợng đƣờng: là chỉ tiêu chính đánh giá chất lƣợng nguyên liệu, các giống nho đƣợc lựa chọn để sản xuất rƣợu vang cho đến nay hầu hết đều có hàm lƣợng đƣờng khá cao từ 18 ÷ 25%V. Thành phần và hàm lƣợng axit: Hai loại axit chủ yếu của nho là D tartric và L - malic, trong đó D - tartric là axit khá mạnh, là chất đệm để giữ rƣợu ở pH tƣơng đối thấp. Trong sản xuất rƣợu vang ngƣời ta ƣa dùng loại nho có hàm lƣợng axit malic thấp. Pectin: Trong một số loại quả chín, pectin chiếm tỉ lệ trung bình từ 0,02 ÷ 0,6% chủ yếu ở dạng keo và araban. Sự có mặt của pectin trong thành phần dịch lên men và trong rƣợu vang sẽ làm tăng độ nhớt và bọt của sản phẩm, ảnh hƣởng tới giá trị cảm quan. Tanin: Có chủ yếu ở cuống, vỏ và hạt quả, các loại nho trắng chứa hàm lƣợng tanin ≈ 0,02% ít hơn so với nho đỏ. Sự có mặt của tanin trong rƣợu vang sẽ làm cho rƣợu có vị chát và có độ trong hơn, nhƣng khi hàm lƣợng tanin trong dịch lên men càng nhiều sẽ ức chế hoạt động của nhiều loại enzim và làm giảm quá trình lên men rƣợu. Các loại vitamin: Là thành phần chủ yếu có trong dịch quả và có vai trò rất quan trọng đối với sự sinh sản, phát triển của nấm men cũng nhƣ chất lƣợng rƣợu vang. Các loại enzym: Trong dịch quả nho ép ngƣời ta đã phát hiện đƣợc một số loại enzym proxylaza, polyphemoloxydaza, tananaza, pectinanza, catalaza, esteraza,... có liên quan đến quá trình chín, hình thành màu của quả. 5 1.2.3. Thành phần của rượu vang Các thành tố cơ bản của một rƣợu vang đã hoàn thành là nƣớc và alcohol, một số thành tố khác có hàm lƣợng rất nhỏ, nhƣng là tác nhân về chất lƣợng và đặc điểm của rƣợu [26]. Nƣớc (80 đến 85%): nƣớc này phát sinh từ nƣớc cốt trái nho, nên tinh khiết về sinh học. Alcohol (10 đến 17%): các alcohol trong rƣợu vang là từ những chất đƣờng đƣợc nấm men chuyển hóa. Acid (0.4 đến 1%): các acid trong rƣợu vang cho rƣợu vang có vị chua đặc trƣng, giúp tăng hƣơng vị khi cân xứng với các thành tố khác. Các chất đƣờng: trái nho chứa 15 đến 25% glucoza và fructoza, là những đƣờng phần lớn đƣợc chuyển hóa thành alcohol trong quá trình lên men. Các muối khoáng (0.2 đến 0.4%): các muối đƣợc sinh ra từ các acid khoáng hoặc acid hữu cơ, thêm vị tƣơi mát vào hƣơng vị của rƣợu vang. Các chất tạo hƣơng vị và tạo màu (0.01 đến 0.5%): các phức chất phenol tạo màu cho rƣợu và những khác biệt trong hƣơng vị giữa các vang đỏ và vang trắng. 1.2.4. Tàng trữ rượu vang Để rƣợu vang có chất lƣợng cao, ngƣời ta thƣờng tàng trữ rƣợu vang vào trong các thùng gỗ sồi. Những hóa chất có sẵn trong gỗ sồi có ảnh hƣởng sâu sắc tới rƣợu vang. Chất phenol trong gỗ sồi khi tác dụng với rƣợu vang sẽ tạo mùi vanilla và vị ngọt chát của trà hay vị ngọt của hoa quả. Gỗ sồi cũng tác động lên màu sắc của rƣợu. Chai rƣợu vang thƣờng đƣợc bảo quản ở tƣ thế nằm ngang, từ 6 tháng đến 1 năm trƣớc khi bán nhằm đảm bảo tiếp xúc trực tiếp giữa rƣợu vang và nút, để có đƣợc tính chất hài hòa và bắt đầu phát triển những mùi thơm thứ 6 cấp thứ ba, đƣợc gọi là bouquet. Điều này sẽ hạn chế việc nút chai bị khô và khả năng thẩm thấu của không khí qua các khe hở tạo ra trên nút khô nứt. Nhiệt độ thích hợp bảo quản rƣợu tốt nhất dƣới 200C. Nhiệt độ phải ít dao động, sự thay đổi nhiệt độ làm rƣợu mau hỏng. Tránh để rƣợu tiếp xúc với ánh sáng trực tiếp của mặt trời. Độ ẩm thích hợp 55% đến 75%. Không khí khô ráo, độ ẩm thấp là nguyên nhân vang mau hƣ hại. Không phải mọi loại rƣợu vang đều thích hợp cho tàng trữ lâu để tăng chất lƣợng rƣợu. Phần lớn các loại rƣợu vang trắng nên dùng khi còn trẻ. Các loại rƣợu vang đỏ giàu tannin đƣợc tàng trữ lâu hơn để chúng đạt đến độ chín. Vang đóng chai có thể bảo quản hàng chục năm trong hầm chứa ở nhiệt độ thấp (khoảng 160C) [14]. 1.3. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang Hệ vi sinh vật của rƣợu vang rất đa dạng và phong phú bao gồm các loại nấm men, nấm mốc, vi khuẩn, chúng tồn tại trong không khí, đất, nƣớc, dịch ép cùi quả... và tham gia vào quá trình lên men rƣợu vang, trong số đó có nhiều loại khi tham gia vào quá trình biến đổi đã tạo ra những sản phẩm có lợi, nhƣng cũng có nhiều loại lại tạo ra nhiều sản phẩm không có lợi, thậm chí làm hỏng rƣợu vang [28]. 1.3.1. Nấm men 1.3.1.1. Sơ lược về nấm men Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ yếu theo lối nảy chồi. Ngay từ năm 1857, Pasteur đã có những nghiên cứu khá kỹ về nấm men rƣợu. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, nƣớc, không khí, thực phẩm, hoa quả), trong đó có nhiều loại nấm men có khả năng lên men rƣợu. Chính vì vậy, từ lâu con ngƣời đã biết sử dụng chúng để sản xuất rƣợu bia. Nấm men sinh sản nảy chồi nhanh chóng, sinh khối của chúng giàu 7 protein và vitamin nên chúng còn đƣợc sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho ngƣời nhƣ sản xuất protein đơn bào, tạo hƣơng nƣớc chấm, sản xuất dƣợc phẩm, gần đây còn đƣợc sử dụng để sản xuất lipit [13]. Tuy nhiên, bên cạnh những nấm men có ích cũng có một số loại nấm men dại có hại cho ngƣời, gia súc và làm hỏng sản phẩm. Trƣớc đây, căn cứ vào cấu tạo, đặc điểm sinh lý, khả năng lên men tạo cồn và hƣơng vị đặc trƣng của nấm men khi lên men rƣợu vang, ngƣời ta thƣờng phân nấm men thƣờng gặp trong quá trình sản xuất thành một số loại cơ bản sau [10]: Saccharomyces vini (còn gọi là Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae Hansen hay Saccharomyces vini Meyen) là những tế bào hình ô van, kích thƣớc trung bình: (3 ÷ 8) × (5 ÷ 12)µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và có khả năng tạo thành bào tử. Trong dịch ép nƣớc quả S.vini chứa tới hơn 80% tổng số Saccharomyces, chúng có khả năng sinh ra invectaza ngoại bào để chuyển hóa saccaroza thành fructoza và glucoza vì vậy có thể sử dụng S.vini để lên men rƣợu từ dịch quả có bổ sung thêm saccaroza ở hàm lƣợng khá cao. S.vini có thể tạo đƣợc 18 ÷ 19%V cồn, có khả năng kết lắng khá nhanh sau khi kết thúc quá trình lên men. Saccharomyces cerevisiae (còn gọi là S.cerevisiae var ellipsoideus) là những tế bào có hình elip, kích thƣớc tƣơng tự nhƣ Saccharomyces vini, nhân tế bào có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy S. cerevisiae có khả năng lên men dịch có hàm lƣợng đƣờng cao và có thể tạo đƣợc 18 ÷ 20%V cồn, khả năng kết lắng và tạo hƣơng, vị đặc trƣng cho rƣợu vang của S.cerevisiae cũng rất tốt, vì vậy trong sản xuất rƣợu vang có độ cồn cao, ngƣời ta thƣờng sử dụng S.cerevisiae để lên men. Saccharomyces oviformis: có hình dạng và kích thƣớc tƣơng tự nhƣ S.vini nhƣng khả năng sinh sản và phát triển ở giai đoạn đầu chậm hơn S.vini, 8 do có khả năng chịu cồn khá tốt, nên số lƣợng tế bào vẫn tiếp tục tăng dần trong quá trình lên men. S. oviformis không lên men galactoza, và có thể tạo thành màng trên bề mặt rƣợu vang khô có chứa 10%V cồn. S. oviformis có khả năng lên men kiệt đƣờng và độ rƣợu có thể đạt tới 18%V, sản phẩm có hƣơng vị khá tốt, nên thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất các loại rƣợu vang khô. Tuy nhiên theo công bố gần đây nhất của Barnet. J. A., Payne. R. W., Yarrow. D., thì các chủng nấm men trên chỉ đồng danh của S. cerevisiae [30]. Hình 1.1. Hình ảnh nấm men Saccharomyces cerevisiae trong lên men rượu vang 1.3.1.2. Hình dạng, kích thước của tế bào nấm men Tế bào nấm men đa số có cấu tạo hình cầu, hình trứng hoặc hình ô van. Hình dạng này có thể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào [10]. Kích thƣớc tế bào khoảng 3 – 10 µm x 5 – 12 µm. Nấm men có màu trắng đục,vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt tế bào thƣờng khô và căng, có thể dính riêng lẻ hoặc dính nhau thành chuỗi. 1.3.1.3. Cấu tạo của tế bào nấm men Các tế bào nấm men khác nhau thì có cấu tạo, thành phần khác nhau nhƣng nhìn chung đều bao gồm: màng, chất nguyên sinh và nhân [10]. 9 Màng: Màng tế bào có cấu tạo chủ yếu là hemixenluloza, chiếm khoảng 70% trọng lƣợng khô của tế bào (31% mannan + 29% glucam), ngoài ra còn chứa 1 – 3% kitin, 6 – 10% protein, 8 – 8.5% lipit, 7% chất khoáng. Chất nguyên sinh: Màng chất nguyên sinh là lipoprotein, chúng ăn sâu vào chất nguyên sinh tạo thành mạng lƣới nội chất gồm 2 lớp và rầy 30 – 40 A0. Chất nguyên sinh của tế bào nấm men có một số bào quan nhƣ: Ty thể: Có hình bầu dục hoặc dạng hạt và có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện của môi trƣờng cũng nhƣ trạng thái sinh lý của tế bào. Ty thể có màng trong suốt, mỏng (60 – 80A0) có tính thấm cao,màng có cấu tạo 2 lớp, lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lƣợc, lớp ngoài có cấu trúc bằng nhiều đơn vị hình thái. Có khoảng 10 – 20 ty thể trong một tế bào nấm men, chúng tham gia vào quá trình sinh trƣởng tế bào, sự hình thành và nảy chồi bào tử. Phức hệ golgi: Là nơi giải phóng các sản phẩm của quá trình dị hóa, đồng thời tổng hợp oligosaccarit từ monosaccarit cho màng tế bào. Lizoxom: Có chứa nhiều loại enzyme có khả năng phân giải protein, lipit, polysaccarit. Ngoài ra, trong tế bào nấm men còn chứa một hệ thống không bào hình thành từ thể golgi hay mạng lƣới nội chất. Nhân: Khác với tế bào vi khuẩn tế bào nấm men có nhân thật. Nhân có hình ovan đƣợc bao bọc bởi lớp màng nhân. Nhân có kích thƣớc từ 1 – 2.4µm × 2 – 8µm cấu tạo bởi protein, ADN, ARN và nhiều enzym. 1.3.1.4. Sinh sản của tế bào nấm men Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính). Bình thƣờng tế bào nấm men sinh sản nảy chồi, khi gặp điều kiện không thuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử [10], [19]. 10 Sinh sản vô tính: sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất. Khi tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể nó đâm ra một chồi nhỏ gọi là mầm (hay chồi). Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một đầu của tế bào mẹ. Cùng một lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều chồi. Ở phía khác nhau, ở mỗi chồi sẽ nhận đƣợc một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách ra khỏi tế bào mẹ và tiếp tục nảy mầm tạo ra một lớp tế bào giống nhau và giống hình cành cây. Nấm men có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi đƣợc sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi nang chứa từ 1 đến 8 bào tử. Nấm men đƣợc tạo thành từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành nấm men. Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất hai tế bào nấm men thành hợp tử. Tế bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào từ. 1.3.2. Vi khuẩn lactic Các nghiên cứu đã chứng minh đƣợc trong quá trình sản xuất rƣợu vang, ngoài quá trình lên men tạo cồn của nấm men còn có quá trình lên men khác là sự lên men malolactic để chuyển hóa axit malic có trong dịch quả nho và rƣợu vang non thành axit lactic có vị chua dịu hơn ở trong rƣợu vang thành phẩm mà tác nhân của quá trình lên men này chính là vi khuẩn lactic [7]. Hình 1.2. Một số vi khuẩn lactic trong lên men rượu vang 11 1.3.3. Các vi sinh vật gây hỏng rượu vang Có không ít các loại vi khuẩn làm cho rƣợu vang bị đục, có vị chua gắt, mùi khó chịu, làm cho rƣợu vang bị hỏng nhƣ Bacterium gacile, Acetobacter xylium, Acetobecter xylium, Acetobacter acetic [7]. Các vi khuẩn kỵ khí: mặc dù một số vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng đối với sự lên men malolactic, xong phần lớn vi khuẩn lactic nhƣ: Lb. brevis, Lb. pastoriaus, Lb. buchneri… đã làm cho rƣợu vang bị vẩn đục, có mùi dƣa muối, ngay cấu khi đã lắng xuống đáy thùng lên men, đã làm cho hƣơng vị của rƣợu vang bị thay đổi đáng kể. Các vi khuẩn hiếu khí: Một số loại nấm men tạo màng trên bề mặt rƣợu vang nhƣ Pichia, Candida, Zygopichia… phân giải đƣờng thành những axit hữu cơ: xitric, axetic,… làm cho rƣợu vang bị đục, độ chua tăng cao. Các vi khuẩn thuộc Acetobacter oxy hóa etylic thành axit axetic và CO 2 và H2O đã làm cho rƣợu vang có vị chua gắt của dấm, rƣợu vang bị nhớt không thể sử dụng đƣợc. Một số loại nấm men thuộc Torulopsis, Brettanomyces… lên men đƣờng thành rƣợu và nhiều loại axit bay hơi, làm hỏng rƣợu vang bị nhầy hóa, Hansenula oxy hóarƣợu etylic, glyxerin, axit hữu cơ… làm cho rƣợu vang bị đục, có vị đắng. 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm men 1.4.1. Nguồn cacbon Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzyme, axit và các sản phẩm trao đổi chất [10]. Vì vậy, những hợp chất cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men. Nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là hidratcacbon đáp ứng 3 nhu cầu: sản sinh năng lƣợng, tạo tiền chất và thực hiện các quá trình oxy hóa khử. 12 1.4.2. Nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ Nitơ rất cần cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men. Do đó, môi trƣờng nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hóa. Nitơ có tác dụng cung cấp nguyên liệu cho tế bào tổng hợp protein và các chất khác của nguyên sinh chất [10]. 1.4.3. Nguồn photpho vô cơ Photpho có vai trò quan trọng đối với nấm men, là nguyên liệu để tổng hợp lên axit nucleic, các enzyme, các hợp chất cao năng ATP… nếu thay đổi nồng độ của hợp chất photpho trong môi trƣờng sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho nhƣ tế bào chất và nhân [10]. 1.4.4. Nguồn nguyên tố khoáng Trong môi trƣờng dinh dƣỡng cần phải có một lƣợng khoáng để đảm bảo cho tế bào phát triển [10]. Các nguyên tố S, P đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân, nhiễm sắc thể, các enzyme. Ion Ca 2+, Mg++ điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men. Ion Fe++, Mg++ nằm trong thành phần của enzyme hoạt động. 1.4.5. Ảnh hưởng của oxi Oxi cần trong giai đoạn đầu giúp nấm men sinh trƣởng, tăng sinh khối. Quá trình lên men diễn ra ở điều kiện hiếm khí để tăng hiệu quả tạo cồn, sự khuấy đảo làm tăng tốc độ lên men rút ngắn thời gian lên men. Ngoài ra, nguồn oxi có liên quan tới sự tổng hợp các xitocrom. Nếu nồng độ oxi là 0,05 micromol/l thì hệ thống xitocrom b, c1, c, a, a3 sẽ vắng mặt [10]. 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men vang 1.5.1. Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hƣởng rất lớn đến chất lƣợng của rƣợu vang, các công trình nghiên cứu cảu Hickinbotham, Ryan, Breckmann và Stier cho thấy khi 13 lên men ở điều kiện nhiệt độ lạnh thì hƣơng, vị của rƣợu sẽ có mùi trái cây và tƣơi hơn, hàm lƣợng axit bay hơi thấp hơn, hàm lƣợng glyxerin sẽ tăng hơn, ngƣợc lại khi lên men ở nhiệt độ cao thì chất lƣợng của rƣợu vang sẽ bị kém đi rõ rệt [26]. 1.5.2. Độ pH Nấm men có thể sinh sản và phát triển trong môi trƣờng có độ pH từ 2,5 ÷ 7,5, tuy nhiên độ pH phù hợp nhất với sự sinh sản và phát triển của nấm men đƣợc xác định là 4 ÷ 6, nhiều chủng nấm men có thể sinh sản và phát triển tốt ở pH 3 ÷ 3,5 vì vậy để hạn chế quá trình lây nhiễm và phát triển của nhiều loại vi khuẩn, phù hợp với độ pH tự nhiên của nguyên liệu các nhà sản xuất luôn duy trì độ pH ở mức 3,2 ÷ 4,0. Theo Desoto và Warkentin ở pH ˂ 3,7 rƣợu vang sẽ chống đƣợc sự kết tủa của canxitartrate đồng thời cũng làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm [27]. Độ pH thấp hoặc quá cao cũng sẽ làm thay đổi cấu trúc protein của nhiều loại enzyme tham gia trực tiếp vào quá trình lên men rƣợu vang và làm giảm khả năng hoạt hóa của enzyme. 1.5.3. Nồng độ rượu Trong quá trình lên men rƣợu, nồng độ rƣợu tăng dần sẽ gây ức chế không chỉ cho các hoạt động sống của nấm men mà còn kìm hãm hoạt động của nhiều loại enzyme chuyển hóa đƣờng thành rƣợu, khả năng sống sót của nấm men phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ rƣợu có trong dịch lên men [26]. 1.5.4. Hàm lượng đường Nhiều chủng nấm men có thể tồn tại trong dịch lên men có hàm lƣợng đƣờng đạt tới 80% nhƣng hầu hết các chủng nấm men lại không có khả năng lên men rƣợu, khi hàm lƣợng đƣờng trong dịch lên men có từ 1 ÷ 2% thì tốc độ lên men đạt nhanh nhất nhƣng hiệu suất lên men lại thấp. Hàm lƣợng đƣờng phù hợp cho quá trình lên men rƣợu vang đƣợc xác định là 12÷20% và khi hàm lƣợng đƣờng đạt 25% sẽ ức chế quá trình lên men [28]. 14 Tỉ lệ các loại đƣờng trong dịch lên men cũng ảnh hƣởng lớn tới tốc độ và hiệu suất lên men, glucoza là loại đƣờng phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của nấm men cũng nhƣ quá trình tạo rƣợu, tiếp đó là đƣờng fructoza và sacaroza… . 1.5.5. Men giống Số lƣợng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian nhân giống và lên men rƣợu vang sẽ bị kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn, ngƣợc lại hàm lƣợng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men sẽ ngắn hơn, hạn chế đƣợc khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men. Nhìn chung thì số lƣợng men giống trong dịch lên men chỉ nên từ 6 ÷ 10 triệu tế bào/1ml dịch lên men là phù hợp [7]. 1.5.6. Oxy hòa tan Nồng độ oxy hòa tan giữ vai trò quan trọng không chỉ đối với sự sinh sản và phát triển tối đa của nấm men mà còn quyết định đến hiệu suất lên men và chất lƣợng của rƣợu vang [7]. Khi môi trƣờng có đủ oxy thì nấm men sẽ sử dụng đƣờng làm nguồn năng lƣợng tăng sinh khối theo phƣơng trình: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + H2O + Q Ngƣợc lại, khi môi trƣờng thiếu oxy thì nấm men lại tiến hành hô hấp kỵ khí và chuyển hóa đƣờng thành rƣợu theo phƣơng trình: C6H12O6 → 6CO2 + 2C2H5OH + Q Sự có mặt của oxy trong quá trình lên men rƣợu sẽ làm cho sự tạo thành ATP mạnh mẽ hơn và trạng thái tích lũy năng lƣợng E.C (eneray chare) của tế bào tăng lên đã ức chế quá trình lên men, làm giảm hiệu suất lên men rƣợu và đƣợc gọi là Hiệu ứng Pasteur. Vì vậy, khi lên men rƣợu vang để có đƣợc hiệu suất lên men rƣợu cao nhất, đồng thời hạn chế quá trình tạo aldyhyt, rƣợu bậc cao, axit bay hơi, 15 diaxetyl và axeton… có trong rƣợu thành phẩm, ngƣời ta hạn chế tối đa sự có mặt của oxy có trong dịch lên men khi tiến hành lên men kỵ khí [10], [26]. 1.5.7. Ảnh hưởng của chất khử trùng SO2 làm tăng lƣợng axetaldehyt và glyxerin trong quá trình lên men, đồng thời cũng hạn chế sự lên men malolactic, vì vậy việc sử dụng SO 2 trong quá trình lên men rƣợu vang cũng cần phải có sự tính toán phù hợp với công nghệ và thông thƣờng sử dụng SO2 với hàm lƣợng 75 – 100ppm làm chất diệt khuẩn, đồng thời là chất chống oxy hóa là phù hợp và có hiệu quả tốt [28]. 1.6. Tình hình sản xuất vang nho Cabernet sauvignon trên thế giới và ở Việt Nam Việc sản xuất rƣợu vang đã đƣợc con ngƣời biết từ thời Ai Cập cổ đại. Năm 1875, lần đầu tiên trong lịch sử, nhà bác học ngƣời Pháp Louis Pasteur đã công bố các kết quả nghiên cứu của ông về quá trình lên men rƣợu. Bƣớc “đột phá” này đã làm thay đổi về nhận thức, kỹ thuật với những cải tiến về công nghệ đã tạo ra các loại rƣợu vang có chất lƣợng cao hơn, đƣợc sản xuất với quy mô lớn hơn. Tuy nhiên phải tới những năm 60 của thế kỉ 20 ngành sản xuất rƣợu vang mới thực sự phát triển mạnh mẽ cả về số lƣợng và chất lƣợng, có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học về kỹ thuật sản xuất rƣợu vang đã đƣợc công bố và đƣa vào sản xuất trong giai đoạn này, đánh dấu thời kỳ hƣng thịnh của rƣợu vang với sản lƣợng đạt khoảng 27,6 tỷ lít/năm. Châu Âu đứng đầu thế giới về sản xuất rƣợu vang với 80 % tổng sản lƣợng rƣợu vang trên toàn thế giới, châu Mỹ 14 %, châu Phi 5 %, châu Á – Úc 0,5 %. Với một số thƣơng hiệu vang nổi tiếng nhƣ: Johnnie Walker – thƣơng hiệu hàng đầu trên thế giới với 2 nhãn hiệu lớn là Red Label và Black Label, hãng Courvoier với nhãn hiệu Courvoier XO nổi tiếng, rƣợu Bordeau –Pháp. Sản lƣợng rƣợu vang toàn cầu đã đạt mức đỉnh vào năm 2004 khi cung vƣợt cầu khoảng 600 triệu thùng (1 thùng gồm 12 chai, tƣơng đƣơng với 9 lít) và đang 16 trên đà sụt giảm kể từ đó đến nay. Năm 2013 sản lƣợng vang toàn cầu có thể đƣợc coi là tƣơng đối cao, mang đến hy vọng về một sản lƣợng rƣợu vang cao trong những năm kế tiếp [15], [16]. Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu và sản xuất các loại vang khác nhau. Đặc biệt là vang nho Cabernet sauvignon đã trở thành loại vang nổi tiếng số 1 thế giới, đặc biệt là ở Pháp đƣợc trồng và sản xuất vang Cabernet sauvignon với số lƣợng lớn. Ở Việt Nam, từ những năm cuối thập niên 90 trở về trƣớc, vẫn chƣa có một nhà sản xuất rƣợu vang nào trong nƣớc sản xuất ra những loại rƣợu vang “chính thống”, theo công nghệ Châu Âu, rƣợu vang trong nƣớc chủ yếu đƣợc nhập ngoại từ các nƣớc Châu Âu, với nhãn hiệu vang Bordeaux của Pháp, đƣợc nhiều ngƣời tiêu dùng biết đến, sử dụng. Tuy nhiên khoảng 100 năm nay nhờ sử dụng quy trình sản xuất rƣợu vang chất lƣợng cao chúng ta cho ra đời dòng vang đầu tiên khá thành công Vine Wine. Theo công nghệ sản xuất đó một loạt những dòng vang khác lần lƣợt ra đời: Vang Gia Lâm, vang Đông Đô, vang Tây Hồ,… Đến nay nhiều công trình nghiên cứu trong lĩnh vực sản xuất rƣợu vang nho cũng đã và đang đƣợc tiến hành mang lại nhiều kết quả tốt. Đồng thời vang Việt Nam cũng bắt đầu bƣớc vào thời kỳ hội nhập các sản phẩm cũng đƣợc xuất khẩu đến 1 số nƣớc trên thế giới. Vang Đà Lạt, Anh Đào, Sao La là những sản phẩm đƣợc yêu thích ở Việt Nam bởi mùi vị và chất lƣợng. Đặc biệt năm 2008 vang Đà Lạt đƣợc Phòng Thƣơng mại Công nghiệp Việt Nam và AC Nielsen Việt Nam trao tặng danh hiệu Thƣơng hiệu nổi tiếng (trong top 500 thƣơng hiệu nổi tiếng nhất tại thị trƣờng Việt Nam). Theo thống kê của Hiệp hội Rƣợu Bia và Nƣớc giải khát Việt Nam, hiện cả nƣớc có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rƣợu vang với sản lƣợng mỗi năm tăng khoảng 12 – 13 triệu lít [11]. Nho Cabernet sauvignon là loại nho mới ở Việt Nam chƣa đƣợc biết đến nhiều, nên chƣa có nhiều công trình nghiên cứu và hoạt động sản xuất rƣợu vang nho Cabernet sauvignon. 17 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Dịch siro nho Cabernet sauvignon do TS. Nguyễn Quang Thảo, Vụ Khoa Học Công Nghệ, Bộ Công Thƣơng cung cấp. Cây nho thuộc họ Nho: Vitaceae. Loài: Vitis vinifera. Các chủng nấm men nghiên cứu đƣợc phân lập từ dịch siro nho Cabernet sauvignon. 2.1.2. Hóa chất Các loại đƣờng: saccaraza, glucoza, fructoza, một số chất vô cơ, hữu cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH, HCl, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4. Rƣợu etylic, pepton, agar, phenolphthalein, nƣớc máy, cồn. 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị Tủ ấm vi sinh (Heraeus-Đức), tủ sấy (Heraeus-Đức), nồi hấp (TOMYNhật), máy lắc ổn nhiệt (BR300LF-Nhật), pipette (lapsystem-Phần Lan), máy đo pH (MP200R-Thụy Sĩ), ống nghiệm, que trang, đĩa peptri, bình tam giác, máy đo độ đƣờng… . 2.1.4. Môi trường Dựa vào tính chất của nấm men chúng tôi lựa chọn môi trƣờng theo tỉ lệ sau: 2.1.4.1. Môi trường HanSen (MT1) g/l: môi trường phân lập và sơ tuyển chủng nấm men Đƣờng glucoz: 50g Pepton : 5,0g MgSO4.7H2O: 0,5g 18 KH2PO4 : 1,0g (NH4)2SO4 : 1,0g Thạch agar : 20g Nƣớc cất : 1000ml 2.1.4.2. Môi trường nhân giống (MT2): g/l Đƣờng glucoz: 50g Pepton : 5,0g MgSO4.7H2O: 0,5g KH2PO4 : 1,0g (NH4)2SO4 : 1,0g Nƣớc cất : 1000ml 2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3): g/l Dịch siro hoa quả: 200ml MgSO4.7H2O : 0,5g KH2PO4 : 1,0g (NH4)2SO4 : 1,0g Nƣớc cất : 1000ml 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thu mẫu Nguyên liệu để sản xuất rƣợu vang là nho Cabernet sauvignon. Dùng siro nho Cabernet sauvignon do TS. Nguyễn Quang Thảo cung cấp, đem pha loãng với nƣớc cất theo tỉ lệ 2 :1 ta đƣợc dịch siro nho, dùng dịch đó để phân lập và lên men. Siro nho lấy về bảo quản trong tủ lạnh ở 40C. 2.2.2. Phương pháp phân lập Dịch siro nho sau khi pha loãng, ta để trong tủ ấm 280C trong 3 ngày rồi tiến hành phân lập. Dùng pipet hút 1ml dịch siro này chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nƣớc biển đã thanh trùng, trộn đều, đƣợc dịch siro có độ 19 pha loãng 10-2. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ hai, thu đƣợc dịch siro có độ pha loãng 10-3. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ ba, thu đƣợc dịch siro có độ pha loãng 10 -4. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ tƣ, thu đƣợc dịch siro có độ pha loãng 10-5. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ năm, thu đƣợc dịch siro có độ pha loãng 10 -6. Dùng pipet hút 100µl dịch siro có độ pha loãng 10-5 , 10-6 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri chứa môi trƣờng phân lập MT1, trang đều dịch siro trên bề mặt thạch, sau đó gói các hộp petri lại và đặt trong tủ ấm 24 - 28ºC. Sau 24 - 48h trên mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng. Sau đó đem cấy vào ống thạch nghiêng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo [5]. 2.2.3. Phương pháp giữ giống Tiến hành cấy truyền các chủng nấm men giống định kỳ 1.5 - 2 tháng một lần trên ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trƣờng MT1, đặt trong tủ ấm 24 - 28ºC, sau 1- 2 ngày khi nấm men đã mọc tốt thì chuyển sang giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC. 2.2.4. Phương pháp hoạt hóa giống Cấy chủng nấm men nghiên cứu trên môi trƣờng MT1 ở nhiệt độ 28ºC trong 48h, cấy chuyển sang môi trƣờng MT2, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC trong 24 giờ, lúc này chủng nấm men đã đƣợc hoạt hóa xong (giống nấm men) sẵng sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình [9]. 2.2.5. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Xác định hoạt lực lên men của nấm men thông qua hàm lƣợng CO2 đƣợc sinh ra (g/l dịch lên men) khi tiến hành lên men các chủng nấm men đã hoạt hóa trong các bình tam giác chứa môi trƣờng lên men MT3 và có cùng số lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Hàm lƣợng CO 2 sinh ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Sau 72 giờ lên men đem cân trọng 20 lƣợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại. Hàm lƣợng CO 2 sinh ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Kết hợp với việc phân tích hàm lƣợng cồn và hàm lƣợng đƣờng sót để xác định hiệu suất lên men, nếu hiệu suất lên men càng cao thì hoạt lực lên men của nấm men càng cao [8]. 2.2.6. Xác định khả năng kết lắng Khả năng kết lắng của nấm men đƣợc xác định dựa trên tốc độ lắng của sinh khối. Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (pH: 4,5) trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc bằng nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hoàn toàn bằng nhau. Sau đó lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3 – 5 phút, để lắng 15 phút. Khối dịch chia thành 2 lớp bằng, phần đáy là nấm men. Tiến hành đo lớp kết lắng của chủng nấm men trong các ống nghiệm. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất tức là có độ kết lắng tốt nhất [8]. 2.2.7. Phương pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm men Cấy chủng nấm men theo hình dích dắc trên môi trƣờng MT1, ủ ở 28ºC trong 48 giờ để nấm men mọc thành khuẩn lạc. Quan sát, lựa chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ mô tả các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc. Làm tiêu bản nhuộm đơn, quan sát và mô tả đặc điểm hình thái tế bào của chủng nấm men tuyển chọn trên kính hiển vi quang học [5]. 2.2.8. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật • Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc [5] Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa nấm men, pha loãng theo phƣơng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng pipet hút 0,1ml dịch pha loãng rồi trang đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 280C trong 48 giờ đếm số lƣợng khuẩn lạc (CFU) trong môi trƣờng đĩa peptri, từ đó xác định số lƣợng tế bào nấm men trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức: N = (A : V) : Df 21 Trong đó: N: Tổng số CFU trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu A: Số CFU trung bình đếm đƣợc trên một đĩa petri V: Thể tích mẫu cấy trên một đĩa petri (V = 0,1ml) Df: Độ pha loãng của mẫu (n lần) • Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào bằng buồng đếm Goriaev [5] Đây là phƣơng pháp đếm trực tiếp số lƣợng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phù VSV đến 10-n, nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa buồng đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ buồng đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm số lƣợng tế bào theo các ô theo đƣờng chéo hoặc theo các góc ở trung tâm buồng đếm. Thƣờng đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của buồng đếm để tính số lƣợng tế bào trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml ban đầu: N = A . 25 : V : n Trong đó: N: Số lƣợng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù A: Số lƣợng tế bào trung bình có trong 1 ô lớn V: Thể tích của 1 ô lớn (V = 0.004 mm3) n: Độ pha loãng của dung dịch huyền phù (10-n) 25 là số ô lớn của toàn khung đếm 2.2.9. Phương pháp hóa học Xác định hàm lƣợng đƣờng bằng đƣờng kế. Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. Xác định hàm lƣợng axit bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Xác định hàm lƣợng cồn bằng cồn kế. 2.2.10. Phương pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê Giá trị trung bình số học: 22 Độ lệch chuẩn: nếu n < 30 nếu n ≥ 30 Sai số trung bình số học: Hệ số biến thiên: Trong đó: n: Số lần lặp lại Xi: Giá trị đo lần thứ i 23 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon 3.1.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch nho Cabernet sauvignon Căn cứ vào mật độ nấm men trong dịch siro nho thu đƣợc, chúng tôi chọn dịch siro nho có độ pha loãng 10-5 và 10-6 để phân lập, kết quả thu đƣợc 10 chủng nấm men, đƣợc kí hiệu từ N1 đến N10. Bảng 3.1. Các chủng nấm men thu đƣợc qua các lần phân lập STT Kí hiệu Hình thái khuẩn lạc Đƣờng kính khuẩn lạc 1 N1 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 3mm 2 N2 Trắng bóng, không răng cƣa 1mm 3 N3 Trắng, tròn, nhẵn bóng 1,5mm 4 N4 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 1,5mm 5 N5 Trắng bóng, không răng cƣa 1mm 6 N6 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 2mm 7 N7 Trắng, tròn, nhẵn bóng 1mm 8 N8 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 1.5mm 9 N9 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 2,5mm 10 N10 Trắng bóng, không răng cƣa 1mm 24 Hình 3.1. Chủng nấm men phân lập trên môi trường đĩa thạch Theo nguyên lí của chọn lọc tự nhiên, từ 10 chủng nấm men phân lập đƣợc, chúng tôi chọn ra 3 chủng có đƣờng kính khuẩn lạc lớn nhất, trắng, bóng, lồi, không răng cƣa là N1, N6 và N9 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Sau đó, ba chủng nấm men tuyển chọn này chúng tôi chuyển sang môi trƣờng giữ giống ở thạch nghiêng để thuận lợi cho các nghiên cứu tiếp theo. Sau 2 – 3 ngày thu đƣợc kết quả ở hình 3.2. Hình 3.2. Chủng nấm men N1, N6, N9 trên môi trường thạch nghiêng Vậy từ 10 chủng nấm men phân lập chúng tôi đã sơ tuyển được 3 chủng nấm men N1, N6, N9 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon 25 Để khẳng định kết quả tuyển chọn và chọn ra chủng có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon tốt nhất, chúng tôi tiến hành lên men từ đó tìm ra chủng nấm men: Chịu đƣợc độ cồn và độ axit cao. Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn. Có khả năng lên men tốt trong môi trƣờng có hàm lƣợng đƣờng cao. Hƣơng thơm tạo este đặc biệt, không sinh độc tố. Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm. Khả năng cạnh tranh tốt với các vi sinh vật khác, ổn định lâu dài trong sản xuất. 3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men đƣợc đánh giá bằng lƣợng CO2 thoát ra. Lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Chúng tôi tiến hành lên men 3 chủng N1, N6 và N9 trong 72 giờ, kết quả thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Hàm lƣợng CO2 giải phóng sau 72 giờ lên men của 3 chủng nấm men N1, N6 và N9 Tên chủng Trọng lƣợng Trọng lƣợng bình sau Lƣợng CO2 nấm men bình ban đầu (g) 72 giờ lên men (g) thoát ra (g) N1 155.5 ± 0.02 152.5 ± 0.02 3,0 ± 0.02 N6 156.95 ± 0.03 154.4 ± 0.03 2.55 ± 0.03 N9 157.04 ± 0.02 154.24 ± 0.02 2,8 ± 0.02 Kết quả cho thấy 3 chủng nấm men N1, N6 và N9 lên men đều mạnh, hàm lƣợng CO2 thoát ra nhiều đạt yêu cầu dùng cho lên men rƣợu vang các loại hoa quả ( trên 2g/100ml). Sự phát triển của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn khó xâm nhập, sự tạo cồn hạn chế 1 số nấm men dại và vi khuẩn bị ức 26 chế không phát triển đƣợc trong môi trƣờng lên men. Qua đây ta thấy chủng N1 có hàm lƣợng CO2 thoát ra mạnh nhất là 3,0g/100ml, tiếp đó là chủng N 9 với hàm lƣợng CO2 thoát ra là 2,8g/100ml và chủng N6 hàm lƣợng CO2 thoát ra thấp nhất là 2,55g/100ml. Vậy chủng N1 có hoạt lực lên men mạnh nhất. 3.1.2.2. Khả năng lên men đường Để xác định khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men thu đƣợc từ đó tìm ra chủng có hiệu suất lên men cao nhất, chúng tôi tiến hành xác định lƣợng đƣờng sót và nồng độ cồn trong dịch lên men. Các chủng nấm men đã hoạt hóa đƣợc đƣa vào môi trƣờng lên men MT3 100ml với hàm lƣợng đƣờng 220g/l, pH: 4 và ở nhiệt độ 280C. Sau 7 ngày lên men, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.2. Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men Chỉ tiêu đánh giá Chủng nấm men Đơn vị N1 N6 N9 Đƣờng tổng số g/l 220 ± 0,2 220 ± 0,2 220 ± 0,2 Lƣợng đƣờng sót % 4,8 ± 0,05 6,3 ± 0,06 5,5 ± 0,06 Độ cồn %V 11,2 ± 0,04 10,04 ± 0,04 10,34 ± 0,04 Kết quả cho thấy, chủng nấm men N1 sau 7 ngày lên men thì lƣợng đƣờng sót thấp nhất (4,8) và đạt độ cồn cao nhất (11,2); tiếp đó là chủng N9 (lƣợng đƣờng sót là 5,5 và độ cồn là 10,34); chủng N6 có hiệu suất lên men thấp nhất (lƣợng đƣờng sót là 6,3 và độ cồn là 10,04). Vậy chủng N1 có hiệu suất lên men cao nhất. 3.1.2.3. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men Trong lên men rƣợu vang, việc tạo ra các sản phẩm có độ trong có ý nghĩa rất lớn trong sản xuất, tạo giá trị cảm quan tốt cho sản phẩm từ đó mang 27 lại giá trị cao. Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng kết lắng của các chủng nấm men, để tìm ra chủng nấm men dễ lắng trong nhất. Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của ba chủng nấm men Tên chủng N1 N6 N9 Chiều cao cột sinh khối (mm) 18 16 17,5 Kết quả cho thấy chủng N1 có khả năng kết lắng tốt nhất (với chiều cao cột sinh khối là 18mm), tiếp đó là chủng N9 (với chiều cao cột sinh khối là 17,5mm) và chủng N6 có khả năng kết lắng thấp nhất (với chiều cao cột sinh khối là 16mm). Vậy chủng N1 có khả năng tạo độ trong cho sản phẩm tốt nhất. 3.1.2.4. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau Để xác định ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng tới khả năng lên men của các chủng nấm men. Chúng tôi tiến hành lên men 3 chủng nấm men N1, N6 và N9: các chủng nấm men sau khi đã đƣợc hoạt hóa đƣợc đƣa vào môi trƣờng lên men MT3 100ml, ở 280C với độ pH biến đổi ở các mức là 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5 trong 72 giờ, kết quả thu đƣợc ở hình 3.3. Hình 3.3. Khả năng lên men của các chủng nấm men ở pH khác nhau 28 Kết quả cho thấy cả 3 chủng nấm men đều lên men mạnh nhất ở độ pH từ 4 đến 4,5; ở độ pH này cũng phù hợp với độ pH của dịch quả, trong đó chủng N1 có hoạt lực lên men mạnh nhất (với hàm lƣợng CO 2 thoát ra là 3 và 2,85) tiếp đó là chủng N9 và thấp nhất là chủng N6. Ở độ pH từ 2,5 đến 3,5 hàm lƣợng CO2 đƣợc tạo ra thấp là do ở độ pH thấp môi trƣờng axit ức chế quá trình sinh trƣởng của tế bào nấm men. Ở độ pH 5 hàm lƣợng CO2 đƣợc tạo ra cũng thấp là do các tế bào nấm men phát triển chậm môi trƣờng dịch lên men thuận lợi cho nấm mốc phát triển ảnh hƣởng đến chất lƣợng rƣợu. Vậy độ pH thích hợp cho lên men là 4 – 4,5 và chủng N1 có hoạt lực lên men mạnh nhất trong tất cả các độ pH khác nhau. 3.1.2.5. Nghiên cứu động thái phát triển của các chủng nấm men trong môi trường nhân giống Trong công nghệ sản xuất vang, giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn khoảng 24 – 28 giờ, nhƣng lại đóng vai trò hết sức quan trọng, giai đoạn này làm tăng nhanh số lƣợng tế bào nấm men và giúp ta chọn đƣợc nấm men có chất lƣợng tốt nhất để đáp ứng cho quá trình lên men vang. Việc tìm ra thời điểm nào chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất có ý nghĩa rất lớn trong quá trình làm thí nghiệm và trong thực tế. Do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu động thái phát triển của các chủng nấm men trong môi trƣờng nhân giống MT2, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC. Thu mẫu ở các thời điểm 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ, 48 giờ và đếm số lƣợng tế bào. 29 Hình 3.4. Động thái phát triển của các chủng nấm men trong môi trường nhân giống Kết quả cho thấy cả 3 chủng nấm men sau khi đƣợc đƣa vào môi trƣờng nhân giống từ 24 – 30 giờ đều sinh trƣởng đạt giá trị cực đại. Đối với chủng N1 trong quá trình nuôi cấy, quần thể nấm men sinh trƣởng tăng dần và đạt giá trị cực đại ở thời điểm 24 giờ (135 . 10 6 tế bào). Từ 30 – 48 giờ, quần thể sinh trƣởng giảm dần, trong đó ở thời điểm 48 giờ là thấp nhất (58 . 106 tế bào). Cũng tƣơng tự nhƣ chủng N1, sự sinh trƣởng chủng N6 và N9 cũng tăng dần theo thời gian và đạt giá trị cực đại ở thời điểm 24 giờ ( N 6 là 115 . 106 tế bào, N9 là 121 . 106 tế bào). Từ 30 – 48 giờ, quần thể sinh trƣởng giảm dần, trong đó ở thời điểm 48 giờ là thấp nhất (N 6 là 39 . 106 tế bào, N9 là 46 . 106 tế bào). Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy thời gian 24 giờ là phù hợp cho các chủng nấm men sinh trưởng, phát triển và chủng N 1 phát triển mạnh nhất, tiếp theo là N9 và cuối cùng là N6. Qua các kết quả vừa nghiên cứu về các chủng nấm men, chúng tôi nhận thấy chủng N1 đạt các chỉ tiêu đưa ra ở mức cao nhất: có hoạt lực lên men 30 cao, khả năng kết lắng cao, chịu được độ đường cao 220g/l, khả năng lên men ở độ pH 4 – 4,5 và khả năng sinh trưởng phát triển mạnh. Do đó, chúng tôi chọn chủng N1 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2.6. Xác định tên khoa học của chủng nấm men tuyển chọn Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1972), và các kết quả thí nghiệm đối với chủng nấm men N1 có đặc tính: Khuẩn lạc tròn, màu trắng, nhẵn bóng, mép không có răng cƣa (hình 3.5.). Hình 3.5. Khuẩn lạc của chủng nấm men N1 trên môi trường MT1 Tế bào có dạng hình trứng (hình 3.6.). Sinh sản nảy chồi nhiều phía (hình 3.6.). Hình 3.6. Ảnh chụp qua kính hiển quang học với độ phóng đại 1000 cho thấy hình thái tế bào của chủng nấm men N1 31 Có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ: Glucose… . Điều kiện không thuận lợi hình thành 1- 4 bào tử. Mỗi nang chứa 2 bào tử. Từ đó, chúng tôi xác định đƣợc tên khoa học của chủng nấm men tuyển chọn N1 phân lập từ dịch nho Cabernet sauvignon là Saccharomyces cerevisiae N1 (S. cerevisiae N1). Vậy từ dịch siro nho Cabernet sauvignon, chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn được chủng nấm men S. cerevisiae N 1 có khả năng lên men vang Cabernet sauvignon. 3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men tuyển chọn 3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nhân giống đến sự sinh trưởng của chủng nấm men tuyển chọn 3.2.1.1 Ảnh hưởng của độ pH pH của môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự phân li của các ion, đến cấu trúc và hoạt tính của protein nên có ý nghĩa quyết định đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp các chất của nấm men [10]. Xuất phát từ lý do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hƣởng của pH đến chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng nhân giống MT2 với các độ pH 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5 ở 280C trong máy lắc 180 vòng/phút, sau 24 giờ đếm số lƣợng tế bào. 32 Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng S. cerevisiae N1 Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng, phát triển trên tất cả các pH mà nghiên cứu tiến hành (3 đến 5,5). Tuy nhiên sự sinh trƣởng đạt tốt nhất ở pH 4 – 4,5 chứng tỏ chủng này thuộc nhóm vi sinh vật ƣa axit và ở độ pH này cũng phù hợp với pH của dịch quả. Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn pH là 4 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh, Nguyễn Thị Huệ [1], [14]. 3.2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là tác nhân vật lý có ảnh hƣởng sâu sắc đến tốc độ của các phản ứng hóa sinh trong tế bào vi sinh vật [10], vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 nhằm tìm ra khoảng nhiệt độ tối ƣu để áp dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. Chủng S. cerevisiae N1 sau khi đƣợc hoạt hóa đem cấy trên môi trƣờng thạch đĩa MT1 với số lƣợng tế bào ban đầu là 3,5 . 106, ở các nhiệt độ: 240C, 280C, 320C, 360C, sau 24 giờ đếm số lƣợng tế bào. 33 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của chủng S. cerevisiae N1 Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng tốt trên khoảng nhiệt độ từ 24 – 360C và sinh trƣởng tốt nhất ở 28 – 320C. Căn cứ vào khoảng nhiệt độ tối ƣu này có thể kết luận chủng S. cerevisiae N1 thuộc nhóm vi sinh vật ƣa ấm trung bình. Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 280C để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung khi nghiên cứu nấm men lên men vang vải thiều [3]. 3.2.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ Nitơ có tác dụng cung cấp nguyên liệu cho tế bào tổng hợp protein và các chất khác của nguyên sinh chất. Do đó, môi trƣờng nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hóa. Có rất nhiều nguồn nitơ vô cơ khác nhau nhƣ: (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, KNO3 và KNO2. Tuy nhiên trong thực tế sản xuất thì chỉ có nguồn (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 là đƣợc sử dụng làm nguồn cung cấp nitơ cho quá trình sinh trƣởng, phát triển của nấm men. Do nguồn nitơ ở dạng NH4+ gần với tiền chất của nitơ hữu cơ, là nguồn cung cấp nitơ rất dễ cho nấm men sử dụng. Còn KNO 3 và KNO2 không đƣợc sử dụng vì chúng chứa gốc nitrat gây độc có thể gây bệnh ung 34 thƣ cho con ngƣời. Chính vì vậy chúng tôi đã nuôi cấy chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 trên môi trƣờng nhân giống MT2 pH: 4, có nguồn nitơ là (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 với hàm lƣợng từ 1- 8g, trên máy lắc 180 vòng/phút ở 280C và sau 24 giờ tiến hành đếm số lƣợng tế bào để đánh giá sự phát triển của chủng nấm men trên từng nguồn nitơ khác nhau, ở các nồng độ khác nhau. Hình 3.9. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ vô cơ tới sự sinh trưởng của chủng S. cerevisiae N1 Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng và phát triển tốt trên cả 2 nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4, tuy nhiên chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng có nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4. Khi sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4 thì chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng phát triển mạnh nhất ở hàm lƣợng từ 3 – 4g/l (với số lƣợng tế bào là 162 . 106 /ml). Còn khi sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2HPO4 thì sự sinh trƣởng phát triển của chủng S. cerevisiae N1 mạnh nhất ở hàm lƣợng từ 2 – 3g/l (với số lƣợng tế bào là 157 . 106/ml). Vì vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn nguồn nitơ vô cơ từ (NH 4)2SO4 với hàm lượng 35 từ 3 – 4g/l để bổ sung vào quá trình nhân giống. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung [3]. 3.2.1.4. Ảnh hưởng của pepton Có rất nhiều nguồn nitơ khác nhau đƣợc sử dụng trong nuôi cấy nấm men. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các axit amin (nấm men chỉ sử dụng đƣợc axit amin ở dạng tự nhiên), các peptit, các nucleotit,... .Trong thực tế ngƣời ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tƣơng, khô lạc,...) làm nguồn nitơ hữu cơ. Tuy nhiên chúng ta thấy rằng pepton là nguồn nitơ hữu cơ đƣợc sử dụng chủ yếu, bởi pepton là nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men cộng với giá thành thấp thích hợp cho quá trình sản xuất. Chính vì vậy chúng tôi đã nuôi cấy chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 này trên môi trƣờng nhân giống MT2 pH: 4, với hàm lƣợng pepton từ 1 đến 10g, trên máy lắc 180 vòng/phút ở 280C và sau 24 giờ đếm số lƣợng tế bào để đánh giá ảnh hƣởng của pepton tới sự phát triển của chủng nấm men tuyển chọn. Hình 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến sự sinh trưởng của chủng S. cerevisiae N1 36 Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng, phát triển trên tất cả các hàm lƣợng peton mà nghiên cứu tiến hành (từ 1 – 10g). Tuy nhiên sự sinh trƣởng đạt tốt nhất ở hàm lƣợng peton từ 4 – 5g/l (với số lƣợng tế bào 165 . 106/ml). Vì vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn hàm lượng pepton từ 4 – 5g/l để bổ sung vào quá trình nhân giống. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh [1]. 3.2.1.5. Ảnh hưởng của KH2PO4 Photpho có vai trò quan trọng đối với nấm men, là nguyên liệu để tổng hợp lên axit nucleic, các enzyme, các hợp chất cao năng ATP… nếu thay đổi nồng độ của hợp chất photpho trong môi trƣờng sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho nhƣ tế bào chất và nhân. Vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của KH2PO4 đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng S. cerevisiae N1 nhằm tìm ra hàm lƣợng KH2PO4 tối ƣu để áp dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. Chủng S. cerevisiae N1 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nhân giống MT2 với nồng độ KH2PO4 là 0,5‰, 0,8‰, 1‰, 1,5‰ và 2‰, pH: 4, trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 280C, 24 giờ đếm số lƣợng tế bào. Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến sự sinh trưởng của chủng S. cerevisiae N1 37 Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng, phát triển trên tất cả các nồng độ KH2PO4 mà nghiên cứu tiến hành (từ 0,5 - 2‰). Tuy nhiên sự sinh trƣởng đạt tốt nhất ở nồng độ KH2PO4 1‰ (với số lƣợng tế bào là 165 . 106/ml). Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ KH2PO4 thích hợp cho chủng S. cerevisiae N1 là 1‰. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung khi nghiên cứu nấm men lên men vang vải thiều [3]. 3.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon của chủng nấm men tuyển chọn 3.2.2.1 Khả năng lên men ở các hàm lượng đường khác nhau Đƣờng là nguồn cacbon đóng vai trò quan trọng nhất trong việc tạo thành rƣợu trong vang nho. Để nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men vang nho, chúng tôi tiến hành lên men chủng nấm men S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng lên men MT3, với hàm lƣợng đƣờng: 220g/l, 250g/l, 270g/l, 290g/l, ở 26 - 280C, pH: 4, hàm lƣợng men giống là 10%, trong 7 ngày, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1 ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau Chỉ tiêu phân tích Lƣợng đƣờng sót (%) Độ cồn (%V) Hàm lƣợng đƣờng (g/l) 220 ± 0,2 250 ± 0,2 270 ± 0,2 290 ± 0,2 4,8 ± 0,05 5,1 ± 0,05 5,7 ± 0,05 6,4 ± 0,05 11,2 ± 0,04 10,4 ± 0,04 10,0 ± 0,04 9,1 ± 0,04 Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 có khả năng lên men ở tất cả các hàm lƣợng đƣờng. Tuy nhiên, hiệu suất lên men cao nhất là ở hàm lƣợng đƣờng 220g/l (với hàm lƣợng đƣờng sót thấp nhất là 4,8 và hàm lƣợng cồn cao nhất là 11,2), hàm lƣợng đƣờng càng cao thì hiệu suất lên men càng giảm. 38 Vì vậy chúng tôi quyết định lựa chọn hàm lượng đường trong dịch lên men 220g/l cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung trƣớc đó [3]. 3.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng lên men Để xác định ảnh hƣởng của KH2PO4 đến khả năng lên men của chủng nấm men tuyển chọn, chúng tôi tiến lên men chủng S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng MT3: với nồng độ KH2PO4 là 0,5‰, 0,8‰, 1‰, 1,2‰; hàm lƣợng đƣờng 220g/l, pH: 4, hàm lƣợng men giống 10%, ở 280C, trong 7 ngày, kết quả thể hiện ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1 Chỉ tiêu phân tích Nồng độ KH2PO4 (‰) 0,5 0,8 1 1,2 Lƣợng đƣờng sót (%) 5,8 ± 0,05 5,3 ± 0,05 4,8 ± 0,05 5,6 ± 0,05 Độ cồn (%V) 10,2 ± 0,04 10,5 ± 0,04 11,2 ± 0,04 10,7 ± 0,04 Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 lên men trên tất cả các nồng độ KH2PO4 mà nghiên cứu tiến hành. Tuy nhiên, hiệu suất lên men đạt cao nhất ở nồng độ KH2PO4 1‰ (với hàm lƣợng đƣờng sót thấp nhất là 4,8 và hàm lƣợng cồn cao nhất là 11,2). Ở nồng độ KH2PO4 0,5‰ khả năng lên men của chủng nấm men thấp do nồng độ KH2PO4 quá ít làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra chậm. Tƣơng tự nhƣ vậy, khi nồng độ KH2PO4 quá cao 1,2‰ sẽ làm rối loạn quá trình sinh tổng hợp các chất trong tế bào, do đó khả năng lên men của chủng nấm men cũng giảm. Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ KH2PO4 thích hợp cho quá trình lên men của chủng S. cerevisiae N1 là 1‰. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Quang Thảo trƣớc đó [18]. 39 3.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng lên men Để xác định ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 đến khả năng lên men của chủng nấm men tuyển chọn, chúng tôi tiến lên men chủng S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng MT3: với nồng độ (NH4)2SO4 là 1‰, 2‰, 3‰, 4‰, 5‰, hàm lƣợng đƣờng 220g/l, pH: 4, hàm lƣợng men giống 10%, ở 28 0C, trong 7 ngày, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1 Nồng độ (NH4)2SO4 (‰) Chỉ tiêu đánh giá Lƣợng đƣờng sót (g/l) Độ cồn (%V) 1 2 3 4,8 ± 0.05 4.7 ± 0,05 4,6 ± 0,05 4 5 5,0 ± 0,05 5,3 ± 0,05 11,2 ± 11,3 ± 11,4 ± 10,8 ± 10,5± 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 lên men trên tất cả các nồng độ (NH4)2SO4 mà nghiên cứu tiến hành. Tuy nhiên, chúng tôi thấy rằng nồng độ (NH4)2SO4 trong khoảng 2‰ – 3‰ thích hợp nhất cho quá trình lên men. Vì ở nồng độ này dịch lên men có hàm lƣợng đƣờng sót thấp từ 4,7 – 4,6 và hàm lƣợng cồn cao 11,3 – 11,4%V. Bên cạnh đó chúng ta thấy rằng nồng độ (NH4)2SO4 trong dịch lên men tăng thì hàm lƣợng đƣờng sót cũng tăng, trong khi đó độ cồn đạt đƣợc giảm do pH của dung dịch thay đổi làm rối loạn quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. Nếu quá ít sẽ làm tốc độ lên men yếu, hàm lƣợng đƣờng sót cũng tăng, hàm lƣợng cồn giảm. Kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung [3]. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn nguồn nitơ vô cơ từ (NH4)2SO4 với nồng độ 2‰ – 3‰ để bổ sung vào dịch lên men. 40 3.3. Lên men vang nho Cabernet sauvignon 3.3.1. Động thái lên men vang nho Cabernet sauvignon Để xác định động thái lên men vang nho Cabernet sauvignon, chúng tôi tiến hành lên men chủng nấm men S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng lên men MT3: với hàm lƣợng đƣờng 220g/l, pH: 4, hàm lƣợng men giống 10%, ở 280C. Tiến hành thu mẫu ngày một lần trong thời gian 7 ngày. Hình 3.12. Động thái lên men vang nho Cabernet sauvignon của chủng S. cerevisiae N1 Kết quả cho thấy, trong quá trình lên men số lƣợng tế bào nấm men tăng dần và đạt cực đại ngay sau 1 ngày (với số lƣợng tế bào là 156 . 10 6/ml), từ ngày thứ 2 trở đi số lƣợng tế bào giảm dần và thấp nhất ở ngày thứ 7 (với số lƣợng tế bào là 51 . 106/ml). Bên cạnh đó thì hàm lƣợng đƣờng giảm dần và hàm lƣợng cồn tăng dần (với hàm lƣợng đƣờng thấp nhất là 4,8% và hàm lƣợng cồn cao nhất là 11,3%V ở ngày cuối cùng của quá trình lên men), 41 nguyên nhân do phần lớn đƣờng đã chuyển hóa thành rƣợu, ngoài ra một lƣợng nhỏ tham gia vào quá trình chuyển hóa và hình thành nhiều loại axit hữu cơ, cũng nhƣ để duy trì hoạt động sống của tế bào nấm men. Vậy trong quá trình lên men vang nho Cabernet sauvignon thì số lượng tế bào nấm men phát triển tốt nhất ở cuối ngày đầu tiên và kết thúc quá trình lên men hàm lượng đường sót thấp nhất, độ cồn thu được cao nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung khi lên men vang vải thiều [3]. 3.3.2. Lên men vang nho Cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi tiến hành lên men vang nho ở quy mô phòng thí nghiệm đối với chủng S. cerevisiae N1 với hàm lƣợng đƣờng ban đầu là 220g/l, hàm lƣợng men giống là 10 %, pH: 4, nhiệt độ 26 - 280C trong bình lên men có dung tích 500 ml. Sau 7 ngày kết thúc giai đoạn lên men chính, đánh giá rƣợu thành phẩm sau đó chuyển tiếp sang lên men phụ. Kết quả phân tích đƣợc dẫn ở bảng 3.5. Bảng 3.8. Kết quả phân tích rƣợu thành phẩm Chỉ tiêu phân tích Đƣờng sót (%) Độ rƣợu (%V) Axit tổng số (%) Độ pH Kết quả 4,6 11,4 0,45 3,7 Qua bảng trên. ta thấy rƣợu vang thu đƣợc có hàm lƣợng đƣờng sót thấp 4,6%, hàm lƣợng rƣợu cao 11,4 %, pH: 3,7. Ngoài ra, rƣợu trong có hƣơng vị đặc trƣng của nho Cabernet sauvignon , khả năng kết lắng tốt. Vậy chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 lên men vang nho Cabernet sauvignon đạt chất lượng tốt. Trên cơ sở đó chúng tôi đã đƣa ra sơ đồ công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon. 42 3.3.3. Quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm 3.3.3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon Môi trƣờng nhân giống Siro nho Cabernet Sauvignon Giống Pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ 2: 1 Giống cấp 1 Dịch siro nho Cabernet Sauvignon Giống cấp 2 Môi trƣờng lên men Lên men chính (7 – 9 ngày) Vang non Lên men phụ Vang thô Lọc, tàng trữ Lọc Đóng chai 43 3.3.3.2. Thuyết minh quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon Quy trình sản xuất vang nho Cabernet sauvignon gồm 4 giai đoạn chính: Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men Từ siro nho Cabernet sauvignon do TS. Nguyễn Quang Thảo cung cấp, chúng tôi tiến hành pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ 2 : 1 để làm giảm lƣợng đƣờng trong siro nho. Giai đoạn 2: Lên men chính Lên men chính là quá trình chuyển hóa đƣờng thành rƣợu nhờ hệ enzim của nấm men tạo ra. Đây là giai đoạn quyết định hàm lƣợng rƣợu tạo thành trong vang. Đƣa men giống (10%V) sau khi đã hoạt hóa và nhân giống các cấp vào môi trƣờng lên men. Điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men thƣờng khoảng 25 – 280C. Quá trình lên men thƣờng kết thúc sau khoảng 7 – 9 ngày. Giai đoạn 3: Lên men phụ Đây là giai đoạn đóng vai trò quan trọng quyết định chất lƣợng của vang. Mục tiêu chủ yếu của giai đoạn này là sự chuyển hóa của vang non thành vang có độ chín thuần thục. Ở giai đoạn này quá trình lên men diễn ra chậm chạp từ 2 đến 3 tháng, ở nhiệt độ thấp 8 – 120C, sản phẩm lúc này chƣa thực sự “chín”, vì vậy một số quá trình biến đổi axit, muối, các cấu tử tạo chất thơm… tiếp tục diễn ra, cùng với quá trình biến đổi này là sự tự phân và kết lắng của nấm men cùng một số cặn lơ lửng có trong lên men. Sau đó chúng ta tiến hành lọc và tách cặn, việc tách cặn đƣợc tiến hành 2 đến 3 lần trong suốt thời gian tàng trữ. Giai đoạn 4: Hoàn thiện chất lƣợng và tiêu thụ sản phẩm 44 Để tăng cƣờng giá trị cảm quan của sản phẩm (nhất là độ trong) cần tiến hành lọc vang cho đến khi sản phẩm đạt đến độ trong hoàn thiện. Việc đóng chai đƣợc tiến hành ngay sau khi lọc vang lần cuối. Thông thƣờng rƣợu rất có thể bị nhiễm ở khâu đóng chai, vì vậy các yêu cầu vệ sinh ở giai đoạn này phải hết sức nghiêm ngặt. Vang đóng chai có thể đƣợc cất giữ bảo quản trong thời gian dài. 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1.1. Chúng tôi đã phân lập đƣợc 10 chủng nấm men từ siro nho Cabernet sauvignon, từ các chủng này chúng tôi đã chọn ra đƣợc 1 chủng nấm men S. cerevisiae N1 có khả năng sinh trƣởng mạnh, chịu đƣợc độ cồn cao, hoạt lực lên men tốt, tạo độ cồn cao, hàm lƣợng đƣờng sót trong dịch lên men thấp, khả năng kết lắng tốt. 1.2. Chủng S. cerevisiae N1 thuộc nhóm vi sinh vật ƣa ấm trung bình (nhiệt độ: 280C), ƣa axit (pH: 4), có khả năng sinh trƣởng tốt trong môi trƣờng có: nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4 (với hàm lƣợng 3 – 4g) và (NH4)2HPO4 (với hàm lƣợng 2 – 3g/l) trong đó tốt nhất là từ (NH4)2SO4; nguồn nitơ hữu cơ là pepton (với hàm lƣợng 4 – 5g/l); nguồn photpho là KH2PO4 với nồng độ 1‰. Chủng S. cerevisiae N1 có khả năng lên men cao ở môi trƣờng có: hàm lƣợng đƣờng là 220g/l, nguồn nitơ là (NH4)2SO4 với nồng độ 2‰ – 3‰ và nguồn photpho là KH2PO4 với nồng độ 1‰. 1.3. Đã lên men vang nho Cabernet sauvignon với quy mô phòng thí nghiệm thu đƣợc rƣợu vang có hàm lƣợng đƣờng sót thấp 4,6%, hàm lƣợng rƣợu cao 11,4 %, pH: 3,7. Trên cơ sở đó đƣa ra đƣợc quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon. 2. KIẾN NGHỊ Với kết quả thu đƣợc, chúng tôi mong muốn chủng nấm men đã đƣợc tuyển chọn cùng với những kết quả nghiên cứu sẽ đƣợc áp dụng vào sản xuất rƣợu vang nho Cabernet sauvignon ở Việt Nam, góp một phần nhỏ vào thị trƣờng vang trong nƣớc cũng nhƣ với mong muốn vang Việt sẽ vƣơn tầm ra thế giới. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh ( 2001) Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố vô cơ tới sự phát triển Saccharomyces cerevisiae H8, H2. Thông báo khoa học trƣờng. Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. Số 1(pp300310). [2]. Đinh Thị Kim Nhung (2001) Nghiên cứu động thái phát triển và quá trình lên men rượu vang phối hợp 2 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae N9 và P6. Thông báo khoa học trƣờng. Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. (pp289-300). [3]. Đinh Thị Kim Nhung (2005) Nghiên cứu nấm men lên men vang vải thiều. Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ. Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. [4]. Đinh Thị Kim Nhung (2007) Tạp chí khoa học và công nghệ. Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. Tập 45, số 2 (pp.87-92). [5]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011) Thực hành vi sinh sinh vật học. Nxb Đại học sƣ phạm. [6]. Lê Thanh Minh (1994) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm men dùng trong sản xuất bia. Khóa luận tốt nghiệp. Trƣờng Đại học KHTN – DHQG Hà Nội. (9, 10). [7]. Lƣơng Đức Phẩm (2006) Nấm men công nghiệp. Nxb Khoa học và kĩ thuật Hà Nội. [8]. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty ( 1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật. Nxb Khoa học và kĩ thuật Hà Nội. Tập 1. [9]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phúc, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976) 47 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật. Nxb Khoa học và kĩ thuật Hà Nội. Tập 2 (5, 6, 14, 295 – 298, 309 – 313). [10]. Nguyễn Thành Đạt (1999) Cơ sở sinh học Vi sinh vật. Nxb Giáo dục. Tập 1 (76 – 82, 125 – 127,135 – 139). [11]. Nguyễn Văn Đạt, Ngô Văn Tâm (1974) Phân tích lương thực, thực phẩm. Bộ Lƣơng thực, thực phẩm. (6 – 16, 37 – 40, 52 – 54, 127, 132, 230 – 232, 244). [12]. Nguyễn Quang Hào, Nguyễn Quang Thảo, Trần Quí Thắng (1997) Nghiên cứu nâng cao chất lượng rượu vang Việt Nam. Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học. Hà Nội. (tháng 12). [13]. Nguyễn Thị Hồng (2005) Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ứng dụng vào lên men vang táo. Khóa luận tốt nghiệp. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. [14]. Nguyễn Thị Huệ (2008) Tuyển chọn chủng nấm men, nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và KH2PO4 tới quá trình lên men vang táo mèo, dâu và mơ. Khóa luận tốt nghiệp. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. [15]. Nguyễn Đình Sinh, (1997) Nấm men và khả năng sử dụng chúng trong công nghệ sinh học. Luận án tiến sĩ. Trƣờng ĐHSP Hà Nội. [16]. Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Quang Hào (1999) Một số kết quả lên men vang vải thiều. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc. [17]. Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thành Đạt, Lê Văn Nhƣơng (1999) Tuyển chọn chủng nấm men theo nguyên tắc chọn lọc tự nhiên để sản xuất rượu vang từ quả vải thiều (Litchi chinensis sonn). Tạp chí KH và CN. N0 5. (13 – 19). 48 [18]. Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Quang Hào (1999) Một số kết quả lên men vang từ quả vải thiều (Litchi chinensis sonn). Báo cáo khoa học. Hội nghị Công nghệ sinh học quốc gia. Hà Nội. (tháng 12). [19]. Nguyễn Quang Thảo, Tào Thành Nam (2000) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh sản và phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae LT2 trong quá trình nhân giống sản xuất vang vải thiều. Tạp chí NN và CNTP. N0 3. (135, 136). [20]. Nguyễn Quang Thảo (2000) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến quá trình lắng trong vang vải thiều. Tạp chí NN và CNTP. N0 5.(229 – 230). [21]. Nguyễn Quang Thảo, Tào Thành Nam (2000) Sử dụng enzim để phân giải pectin trong dịch quả vải thiều (litchi chinensis sonn). Tạp chí NN và CNTP. N0 8. (374 – 375). [22]. Nguyễn Thị Thúy (2012) Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới quá trình lên men vang táo mèo. Khóa luận tốt nghiệp. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. [23]. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Văn Hiếu (2004) Nghiên cứu sử dụng bánh men để sản xuất rượu vang thích hợp ở các tỉnh vùng núi phía Bắc. Tạp chí nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm. 10. (pp.69-470). [24]. Nguyễn Quỳnh Vân, Nguyễn Văn Việt, Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thị Thu Vinh, Tào Thành Nam (1999) Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nâng cao chất lượng rượu vang từ hoa quả nhiệt đới. Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học: 168 – RD – 98. Bộ Công Nghiệp. (18,43 – 50, 58). [25]. Phạm Thị Thủy ( 2008) Phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng men giống tới quá trình lên men vang táo mèo và mơ. Khóa luận tốt nghiệp. Khoa sinh học. Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. 49 B. TÀI LIỆU TIẾNG ANH [26]. Amerine.M.A, and Cruess. M. V. (1960) The technology of wine making. The Avi Publishing Company, Inc. (2, 3, 144-150, 163-203). [27]. Amerine.M.A, Rosseler. E. B., and Ough. C. S. (1965) Acids and the acid taste. The effect of pH and titratable acidity. Hm. J. Enol. Vitic. 16. (29 - 37). [28]. Amerine.M.A, and Kunknee . (1968) Microbiology of wine making. The AVi Publishing Company,Inc. (22, 323 - 358). [29]. AOAC. (1984) Offical Methods of Analysis. 14th Ediction. (220 - 225). [30]. Barnet. J. A., Payne. R. W, Yarrow. D. (1990) Yeast characteristic and identification. Cambridge University Press. (5-10). 50 [...]... đƣợc chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon Nghiên cứu một số tính sinh học và khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon của chủng nấm men tuyển chọn 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon 3.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men lên men vang nho Cabernet sauvignon 3.3 Lên men vang nho Cabernet... thụ rƣợu vang nho rất lớn và thị trƣờng này đầy tiềm năng, chính vì vậy việc nghiên cứu sử dụng nho Cabernet sauvignon để sản xuất vang theo chúng tôi là cần thiết có triển vọng và phù hợp với điều kiện thực tiễn của Việt Nam Chính vì những lí do trên nên tôi đã chọn và tiến hành 1 nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men lên men vang nho 2 Mục đích nghiên cứu Phân... sauvignon 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu góp phần đƣa ra qui trình sản xuất vang từ nho Cabernet sauvignon 5 Điểm mới của đề tài Đề tài không chỉ phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon... đi sâu nghiên cứu đƣợc đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc về đặc điểm và tình hình phát triển của nho Cabernet sauvignon Nho Cabernet sauvignon là một trong những loại nho số 1 để làm vang đỏ trên thế giới Quả của giống nho này nhỏ, tròn, có màu đen với vỏ rất dầy và cứng cáp Nhờ lớp vỏ đó, loại nho này... chủng nấm men đã đƣợc hoạt hóa xong (giống nấm men) sẵng sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình [9] 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Xác định hoạt lực lên men của nấm men thông qua hàm lƣợng CO2 đƣợc sinh ra (g/l dịch lên men) khi tiến hành lên men các chủng nấm men đã hoạt hóa trong các bình tam giác chứa môi trƣờng lên. .. thành rƣợu, khả năng sống sót của nấm men phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ rƣợu có trong dịch lên men [26] 1.5.4 Hàm lượng đường Nhiều chủng nấm men có thể tồn tại trong dịch lên men có hàm lƣợng đƣờng đạt tới 80% nhƣng hầu hết các chủng nấm men lại không có khả năng lên men rƣợu, khi hàm lƣợng đƣờng trong dịch lên men có từ 1 ÷ 2% thì tốc độ lên men đạt nhanh nhất nhƣng hiệu suất lên men lại thấp Hàm... dụng để sản xuất lipit [13] Tuy nhiên, bên cạnh những nấm men có ích cũng có một số loại nấm men dại có hại cho ngƣời, gia súc và làm hỏng sản phẩm Trƣớc đây, căn cứ vào cấu tạo, đặc điểm sinh lý, khả năng lên men tạo cồn và hƣơng vị đặc trƣng của nấm men khi lên men rƣợu vang, ngƣời ta thƣờng phân nấm men thƣờng gặp trong quá trình sản xuất thành một số loại cơ bản sau [10]: Saccharomyces vini (còn gọi... nghiên cứu đã chứng minh đƣợc trong quá trình sản xuất rƣợu vang, ngoài quá trình lên men tạo cồn của nấm men còn có quá trình lên men khác là sự lên men malolactic để chuyển hóa axit malic có trong dịch quả nho và rƣợu vang non thành axit lactic có vị chua dịu hơn ở trong rƣợu vang thành phẩm mà tác nhân của quá trình lên men này chính là vi khuẩn lactic [7] Hình 1.2 Một số vi khuẩn lactic trong lên. .. kê toán học trong xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê Giá trị trung bình số học: 22 Độ lệch chuẩn: nếu n < 30 nếu n ≥ 30 Sai số trung bình số học: Hệ số biến thiên: Trong đó: n: Số lần lặp lại Xi: Giá trị đo lần thứ i 23 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon 3.1.1 Phân lập chủng nấm men từ... bào vi khuẩn tế bào nấm men có nhân thật Nhân có hình ovan đƣợc bao bọc bởi lớp màng nhân Nhân có kích thƣớc từ 1 – 2.4µm × 2 – 8µm cấu tạo bởi protein, ADN, ARN và nhiều enzym 1.3.1.4 Sinh sản của tế bào nấm men Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính) Bình thƣờng tế bào nấm men sinh sản nảy chồi, khi gặp điều kiện không thuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo