Đang tải... (xem toàn văn)
... tài: Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng vi sinh vật có khả phân hủy cellulose rơm rạ Mục tiêu đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học số chủng vi sinh vật có khả phân hủy cellulose rơm rạ Nội... dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu số tính chất chất (rơm, rạ) kiểm tra khả sinh enzyme phân giải cellulose chủng vsv nghiên cứu 3.2 .Đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả phân hủy cellulose. .. dụng 10 chủng vsv tuyển chọn cho nghiên cứu Hình 3.1 Hoạt tính cellulase số chủng vsv nghiên cứu 3.2 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả phân hủy cellulose rơm rạ 3.2.1 Đặc điểm
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== LÊ THỊ THÙY DUNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TRONG RƠM RẠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung và các thầy cô, chuyên viên phòng thí nghiệm Vi sinh vật, tổ Thưc vật – Vi sinh, khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em thực hiện và hoàn thành khóa luận trong thời gian qua. Em xin cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn nghiên cứu tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận. Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè luôn sát cánh, động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong thời gian làm khóa luận. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Lê Thị Thùy Dung LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đề tài “ Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy Cellulose trong rơm rạ” là do em thực hiện. Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí thống kê, không có số liệu sao chép không trùng với kết quả của tác giả nào đã công bố. Trong đề tài em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, em xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận tốt nghiệp của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Lê Thị Thùy Dung MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài ...................................................... 2 4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ................................................................ 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ................................................................. 2 5. Điểm mới của đề tài ................................................................................... 3 CHƢỚNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4 1.1. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose .................................. 4 1.1.1. Vi sinh vật phân hủy cellulose ......................................................... 4 1.1.2. Vi sinh vật phân hủy hemicellulose ................................................. 6 1.1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin .............................................................. 6 1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam ............................................... 7 1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên ............................. 8 1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên .......................................... 8 1.3.2. Cellulose ........................................................................................... 8 1.3.3. Hemicellulose ................................................................................. 10 1.3.4. Lignin ............................................................................................. 10 1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose.................................................. 11 1.4. Thành phần chính của rơm rạ ............................................................... 14 1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh ...................................................... 14 1.5.1. Trên thế giới ................................................................................... 14 1.5.2. Ở Việt Nam .................................................................................... 15 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 16 2.2. Hóa chất, thiết bị ................................................................................... 16 2.2.1. Hóa chất.......................................................................................... 16 2.2.2. Thiết bị ........................................................................................... 16 2.3. Các loại môi trường nuôi cấy ............................................................... 16 2.3.1. Môi trường giữ giống vi khuẩn MPA ............................................ 16 2.3.2. Môi trường giữ giống xạ khuẩn Gauze I ....................................... 17 2.3.4. Môi trường giữ giống nấm mốc Crapeckdox ................................ 17 2.3.5. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV ................................................................................................ 17 2.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 17 2.4.1. Phương pháp vi sinh học ................................................................ 17 2.4.2. Phương pháp hóa sinh .................................................................... 19 2.4.3. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu.................. 23 2.6. Địa điểm thực hiện đề tài ...................................................................... 23 2.7. Thời gian thực hiện đề tài ..................................................................... 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 24 3.1. Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năngsinh enzyme phân giảicellulose của các chủng vsv nghiên cứu ... 24 3.1.1. Xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm, rạ nghiên cứu ......................... 24 3.1.2. Kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu ..................................................................... 25 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ ........................................................... 26 3.2.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn................................... 26 3.1.2. Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn ........................................ 28 3.2.3. Đặc điểm hình thái các chủng nấm mốc ........................................ 29 3.3. Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu ......... 30 3.3.1. Đồ thị đường chuẩn ........................................................................ 30 3.3.2. Hoạt độ enzyme của các chủng vsv nghiên cứu ............................ 32 3.4. Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các chủng vi sinh vật nghiên cứu ................................................................ 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 37 1. Kết luận .................................................................................................... 37 2. Kiến nghị.................................................................................................. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 38 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU : Colony forming unit CMC : Cacboxyl methyl cellulose ĐC : Đối chứng G : Gram MPA : Meat peptone agar MT : Môi trường PTN : Phòng thí nghiệm STT : Số thứ tự TN : Thí nghiệm U :Ủ V : Vi khuẩn mẫu làm giàu VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật XK : Xạ khuẩn VSV : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rơm rạ ..................................................... 14 Bảng 1.2. Hàm lượng một số chất có trong rơm rạ ......................................... 14 Bảng 2.1. Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose ................................. 17 Bảng 3.1. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV nghiên cứu ......... 25 Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme của tổ hợp vi sinh vật nghiên cứu ....................... 32 Bảng 3.3. Vi sinh vật bổ sung vào mỗi khối ủ thí nghiệm .............................. 34 Bảng 3.4. Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ ........................................ 35 Bảng 3.5. Độ giảm khối lượng của các khối ủ sau 32 ngày............................ 36 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose .......................................................... 9 Hình 3.1. Hoạt tính của một số chủng tuyển chọn .......................................... 26 Hình 3.2. Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trường MPA . 27 Hình 3.3. Hình thái tế bào các chủng vi sinh vật nghiên cứu (x1000) ........... 27 Hình 3.4. Khuẩn lạc xạ khuẩn nghiên cứu dưới kính hiển vi soi nổi ............. 28 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bào tử của các chủng xạ khuẩn (x 1000) ..... 29 Hình 3.6. Khuẩn lạc các chủng nấm mốc trên môi trường thạch đĩa ............. 29 Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất CMC .......................... 31 Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất bột giấy ...................... 31 Hình 3.9. Khối ủ thí nghiệm và đối chứng sau khi phối trộn nguyên liệu ..... 33 và bổ sung giống vi sinh vật ............................................................ 33 Hình 3.10. Biến thiên nhiệt độ trung bình của các khối ủ lớn ........................ 35 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Lúa gạo cung cấp nguồn lương thực chính cho nhu cầu tiêu dùng của người dân và xuất khẩu. Tuy nhiên ngoài sản phẩm chính là thóc, rơm rạ còn chiếm đến 50% trọng lượng của cây lúa do vậy sản xuất lúa còn tạo ra lượng rơm rạ khổng lồ. Những năm gần đây cơ giới hóa khâu làm đất phát triển, số lượng trâu, bò nuôi giảm mạnh, việc sử dụng rơm làm thức ăn cho trâu, bò cũng giảm theo, rơm, rạ cũng không còn được sử dụng làm chất đốt. Mặt khác, rơm rạ sau khi thu hoạch không thể vùi trực tiếp vào trong đất vì tỉ số C/N của chúng rất cao, trong điều kiện ngập nước sẽ sản sinh ra khí độc gây ra hiện tượng vàng lá nghẹt rễ, cây trồng sẽ không phát triển được hoặc chết và đất đai ngày càng suy giảm độ phì nhiêu. Nguồn rơm, rạ dư thừa sau mỗi vụ thu hoạch không tìm được cách sử dụng hợp lý nên đã được nông dân tự xử lý bằng biện pháp đốt cháy ngay tại đồng ruộng. Hậu quả là phá vỡ sự cân bằng tự nhiên, ô nhiễm không khí. Phân hữu cơ chủ yếu được sử dụng hiện nay là phân chuồng, loại phân này nếu ủ theo phương pháp truyền thống mất thời gian từ 55 - 60 ngày, quá trình ủ gây ra mùi hôi thối khó chịu. Nhiều lúc người dân bón phân tươi, chưa được xử lý các vi sinh vật có hại. Thông qua con đường này đã đưa các các chủng nấm, vi sinh có hại vào đất, gây nên một số bệnh hại cho cây trồng và ảnh hưởng đến sức khỏe người sản xuất, tiêu dùng. Theo thống kê của các nhà khoa học lượng rơm, rạ thu được từ 1ha lúa là 5 đến 7 tấn/năm. Bình quân lượng rơm rạ thu được từ 1ha lúa có: 51,5 kg N; 25,4 kg P2O5; 137,4 kg K2O và các nguyên tố vi lượng. Trước thực trạng đó, một giải pháp để xử lý các phụ phẩm nông nghiệp này là sử dụng những phế phẩm bỏ đi trong nông nghiệp như rơm rạ để ủ phân hữu cơ. Rơm rạ có thành phần chính là cellulose, bên cạnh đó còn có lignin và hemicellulose. Trong tự nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có 1 khả năng phân giải cellulose, lignin và hemicellulose nhờ có hệ enzyme ngoại bào. Do đó tôi chọn đề tài:“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ”. 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu 3.2.Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ 3.3. Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu 3.4. Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các chủng vi sinh vật nghiên cứu 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài nhằm nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase. Góp một phần nhỏ bổ sung cho các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói riêng và ứng dụng trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Việc nghiên cứu này nhằm mục tiêu tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để xử lý nhanh rơm rạ, rút ngắn quá trình ủ, nhằm hạn chế nguồn sâu bệnh, tạo nguồn phân bón hữu cơ từ rơm rạ, bón trở lại cho ruộng đồng, góp phần nâng cao dinh dưỡng đất, giảm thiểu ô nhiễm môi trường. 2 5. Điểm mới của đề tài Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát có hoạt độ enzyme cellulase của một số chủng VSV có khả năng sinh enzyme lignocellulase được phân lập, tuyển chọn trong đất tại 3 địa điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc). 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose 1.1.1. Vi sinh vật phân hủy cellulose Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. a) Nấm sợi Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase thì nấm sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất. Chúng là những vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm cho đất trở nên màu mỡ hơn [9]. Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho quá trình chuyển hoá cellulose đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một vài loại enzyme. Các loại nấm đáng chú ý nhất là: Alternaria tenuis, Aspergillus wentii, Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Fusarium solani, Penicillium pinophinum,, Aspergillus niger... [8]. Các nấm ưa nhiệt cũng được chú ý vì chúng có thể tổng hợp các enzyme bền nhiệt hơn, chúng sinh trưởng và phân giải nhanh cellulose nhưng hoạt tính cellulase của dịch lọc lại thấp. Nấm có khả năng sinh trưởng và sản xuất cellulase cực đại ở phạm vi pH bằng 3,5 - 6,6 [9]. b) Vi khuẩn Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kị khí có khả năng phân giải cellulose. Những năm đầu thế kỷ XX (1903) G.Van Iterson phân lập được các vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng 4 này. Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose, niêm vi khuẩn chiếm một vị trí quan trọng, chúng thường có hình que nhỏ bé hơi uốn cong, có thành tế bào mỏng, bắt màu thuốc nhuộm kém, chủ yếu ở các giống Cytophaga, Sporocytophaga và Sorangium. Niêm vi khuẩn nhận năng lượng khi oxy hoá các sản phẩm của sự phân giải cellulose thành CO2 và H2O [9]. Ngoài ra còn thấy các loài thuộc giống Cellvibrio cũng có khả năng phân huỷ cellulose. Trong điều kiện kị khí, các loài ưa ấm hoặc ưa nhiệt thuộc giống Clostridium và Bacillus tiến hành phân giải cellulose. Chúng phát triển yếu trên môi trường chứa đường đơn. Khi phân giải cellulose thành glucose và xenlobiose, chúng sử dụng các đường này như nguồn năng lượng và nguồn cacbon cũng thường kèm theo việc tạo thành các axit hữu cơ CO2 và H2O. Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt. Chúng có khả năng phân giải cellulose thành các sản phẩm. Các vi sinh vật đó thường là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio fibrisolvens, Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus, Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium... [9]. c) Xạ khuẩn Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm về nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng: Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 300C. Xạ khuẩn ưa nhiệt : phát triển tốt ở nhiệt độ 50 – 700C. Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt trong đất. Cellulase của xạ khuẩn là enzyme ngoại bào [7]. Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân cellulose. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Nhiều nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các môi trường có dịch chiết nấm men, pepton, dịch thuỷ phân cazêin thường thuận lợi cho sinh trưởng. Xạ khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường. Bào tử 5 của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa axitdipicolinic, canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt của chúng. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng. Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi lượng [9]. Veigia và cộng sự đã phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh Lacoruva (Tây Ban Nha), trong đó có 19 chủng có khả năng tổng hợp cellulose và sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 3,5% NaCl. Mandels và cộng tác viên nghiên cứu khả năng tổng hợp enzyme cellulase của hai chủng Streptomyces antibioticus và Streptomyces sp. với cơ chất là CMC, nhiệt độ tối thích là 370C và pH tối thích là 5,9 [9]. 1.1.2. Vi sinh vật phân hủy hemicellulose Hemicellulase là enzyme ít người nghiên cứu ngoại trừ xylanase vì xylan là một loại hemicellulose phổ biến trong tự nhiên. Các tác giả cho rằng nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp cả cellulase đồng thời tổng hợp cả hemicellulase. Khả năng này thường thấy ở vi khuẩn dạ cỏ như Bacillus, Bacteriodes, Butyvibrio và các loại thuộc chi Clostridium. Ngoài vi khuẩn thì nhiều loại nấm sợi cũng có khả năng tổng hợp xylanase. Các loại nấm này bao gồm: Mycothecium verrucaria, Aspergillus oryzae, A.niger, A.wentti, Aspergillus terreus, T.reesei, Chaetomium trilaterates, Penicilium...[11]. 1.1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin Đối với lignin, là loại có chất khó chuyển hoá nhất thời gian phân huỷ rất chậm kéo dài hàng tháng đến hàng năm. Các vi sinh vật phân giải lignin thường là các loại nấm mục xốp như: Paocylimyces, Allescheria, Pseussis, Chaetomium, Stachybotrys, Lemzites… Ngoài ra còn có các loại nấm trắng như: Corrolus versicolor, Polyrus anceps, Phanerochaeter Sporotrichum pulverulentum, Aspergillus fumigatus... [12]. 6 chrysosporium, 1.2. Thực trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam Ở nước ta sản xuất lúa hàng năm đã tạo ra hàng chục triệu tấn rơm rạ. Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long mỗi năm cũng có tới 15 triệu tấn rơm. Tuy nhiên, loại phế thải nông nghiệp này thường được nông dân đốt gây lãng phí và làm ô nhiễm môi trường. Hiện nay, cùng với việc ứng dụng các tiến bộ khoa học vào sản xuất, nhiều loại máy móc được đưa vào gặt và tuốt lúa. Sau khi gặt xong nông dân đã tuốt lúa ngay tại đồng ruộng nên giảm được nhiều công sức trong việc vận chuyển lúa chưa tuốt về nhà tuốt. Vì thế, rơm rạ phần lớn để lại ngoài đồng ruộng chỉ một phần nhỏ được nông dân đưa về nhà để làm thức ăn cho gia súc về mùa đông. Phần rơm rạ ngoài đồng lại được người dân đốt thành tro. Đây là một việc làm gây hại cho môi trường và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ của người dân. Theo các chuyên gia y tế, mù bụi ro đốt rơm rạ (đã từng xảy ra vào tháng 6/2009 tại Hà Nội) gây ô nhiễm không khí rất có hại đối với sức khỏe con người, nhất là đối với trẻ em, người già và người mắc bệnh đường hô hấp. Việc đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng rơm rạ cho việc trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng màu… Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể mua máy đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả trong việc ép rơm rạ thành bánh giúp cho việc vận chuyển và bảo quản rơm rạ được dễ dàng. Từ đó có thể sử dụng rơm rạ cho nhiều mục đích khác. Máy ép rơm đã được sản xuất và đưa vào sử dụng ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Thành phố Hồ Chí Minh... Việc dùng rơm rạ cho mục đích làm giấy, sản xuất ethanol được áp dụng rất ít ở nước ta. Hiện nay tại nhiều tỉnh thành trong cả nước đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón. Chẳng hạn, tại tỉnh Quảng Nam, người dân đã ứng dụng công nghệ vi sinh phân hủy rơm rạ để làm phân bón ở Hội An. Kết quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh từ phế phẩm nông nghiệp đã cho thấy cây phát triển tốt hơn so với mẫu đối chứng về mật độ gieo trồng, bộ lá xanh, mượt, 7 cây cao, chắc khoẻ và đặc biệt là đã hạn chế được nấm bệnh cho cây trồng. Hàng năm, nông dân đổ xuống đồng ruộng lượng lớn phân hoá học, thuốc bảo vệ thực vật làm cho cấu trúc đất bị thay đổi. Do vậy, việc sử dụng rơm, rạ làm phân bón hữu cơ có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế, xã hội. 1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên 1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên Sinh khối thực vật của trái đất ước tính khoảng 1,8.1012 tấn. Trong đó cellulose chiếm khoảng 4.1010 tấn. Sản lượng cellulose được tổng hợp hàng năm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác. Dưới dạng phế thải, cellulose có trong các phế liệu nông nghiệp chăn nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt từ nhà bếp, đường phố... Sự phân bố đa dạng với khối lượng lớn ở khắp nơi của cellulose có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ môi trường, do đó để thu gom và xử lý triệt để lượng chất thải hữu cơ này đòi hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng vùng [6], [7], [9]. 1.3.2. Cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Thông thường, cellulose của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất của chúng ta. Người ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu như không gặp cellulose ở dạng tinh khiết mà nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với những chất khác như hemicellulose, lignin, pectin... các chất này liên kết với nhau tạo nên màng tế bào thực vật và có tên gọi chung là lignocellulose. Trong đó, cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Hai chất này được bao bọc bởi một lượng lignin. Các thành phần này thường có tỉ lệ khác nhau trong các loại cây khác nhau tạo ra các đặc tính hoá lý riêng cho từng loại thực vật. Về mặt cấu tạo hoá học, cellulose là một polime mạch thẳng, có thành phần cấu trúc cơ bản là các D-glucopiranose. Các gốc này nối với nhau nhờ liên 8 kết β-1,4-glucozit. Mức độ polime hoá của phân tử cellulose thay đổi nhiều (từ vài trăm đến 15000) trung bình là 3000. Các đơn phân glucoza trong cellulose thì có cấu trúc dạng ghế bành (hình 1.1). Trong công thức phối cảnh, biểu diễn glucoza số chẵn, quay góc 180o so với glucose số lẻ và các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang [9], [11]. H H H CH2OH O OH O H HO HO H H H O H OH H H CH2OH O Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử cellulose Dùng phương pháp phân tích của Rơngen, người ta đã chứng minh được rằng phân tử cellulose có dạng sợi. Các sợi này của cellulose lại gắn với nhau nhờ liên kết hydro tạo thành từng bó nhỏ gọi là các microfibrin. Microfibrin có cấu trúc không đồng nhất và thường có hai vùng β. Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao vì thế nó rất bền vững với tác động bên ngoài. Vùng vô định hình có cấu trúc trật tự không chặt do đó kém bền vững hơn. Do có cấu trúc như thế, vùng vô định hình của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên. Trong khi đó vùng kết tinh, mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này. Ở vùng kết tinh, enzyme chỉ tác dụng lên bề mặt các sợi [7]. Cellulose là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững. Nó không tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và động vật có dạ dày một túi. Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất 9 có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là enzyme thuỷ phân cellulose [9]. 1.3.3. Hemicellulose Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng. Hemicellulose là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với cellulose. Thông thường chúng chỉ có 150 gốc đường. Các gốc đường được nối với nhau bằng liên kết β-1.4, β-1.5, β-1.6 glucozit. Chúng tạo thành mạch ngắn và phân nhánh. Do đó, so với cellulose thì hemicellulose có cấu trúc không chặt chẽ bằng, chúng dễ dàng bị phân giải khi bị axit loãng tác dụng. Đôi khi hemicellulose còn bị phân giải trong nước nóng và chúng dễ dàng bị phân giải bởi enzyme hemicellulase. Hemicellulose tồn tại chủ yếu ở các phần như hạt, bẹ ngô, cám, rơm, rạ, trấu. Trong các loại hemicellulose thì xylan là loại có nhiều trong tự nhiên. Trong đó nhiều nhất là ở rơm rạ (chiếm hơn 30%), kế đến là cây lá rộng (20 - 30%). ở cây lá kim, xylan ít hơn nhiều (7 - 17%) [7], [8], [11]. 1.3.4. Lignin Lignin là hợp chất cao phân tử ngưng tụ từ ba loại rượu chủ yếu: rượu trans-P-cumarylic, trans-conyferylic và trans-cynapylic. Tuy nhiên, tỉ lệ ba loại rượu nói trên trong lignin của các loại thực vật khác nhau không giống nhau. Trong lignin các đơn phân này thường liên kết với nhau bằng liên kết C-O và CC. Trong đó kiểu liên kết aryl-glyxecol, aryl-aryl hoặc diaryl ete là phổ biến [7]. Lignin của cây gỗ gồm 8% conyferylic, 14% cumarylic và 6% cynapylic. Trong thực vật, lignin tập trung ở các mô hoá gỗ và vai trò như chất liên kết tế bào, do đó mà làm tăng độ bền cơ học, tăng khả năng chống thấm, ngăn chặn các chất độc gây bệnh và các vi sinh vật gây bệnh cũng như các tác dụng khác từ bên ngoài. Lignin không hoà tan trong nước, trong các dung môi hữu cơ đậm đặc kể cả axit. Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần. Lignin rất bền đối với tác dụng của các 10 enzyme. Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà không tham gia vào sự trao đổi chất. Ba cấu tử cellulose, hemicellulose, lignin tạo nên lignocellulose. Thành phần lignin, cellulose, hemicellulose trong các loại thực vật có sự khác biệt lớn. Điều này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật lý và thành phần hoá học. Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau [7], [11]. 1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose Lignocellulose là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzyme. Các cấu phần hợp thành nên lignocellulose được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ. Do thành phần cấu tạo của lignocellulose rất đa dạng và phức tạp nên để có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ enzyme tương ứng. Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể sinh tổng hợp một phức hệ enzyme phong phú và đa dạng như vậy. Muốn chuyển hoá được lignocellulose cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh vật khác nhau. 1.3.5.1. Enzyme và cơ chế thủy phân lignocellulose a) Enzyme thuỷ phân cellulose: Cellulase Cellulase ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được một số tác giả tổng kết khá chi tiết. Đây là phức hệ enzyme thuỷ phân cellulose tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât. Nhiều tác giả cho rằng phức hệ enzyme cellulase bao gồm ba enzyme chủ yếu sau: Exo-β(1,4)-glucanasehay xenlobiohydrolase: Enzyme này phân cắt chuỗi cellulose từ đầu không khử và giải phóng ra xenlobioza. Enzyme này không thuỷ phân cellulose kết tinh cũng như cellulose hoà tan (caboxymetyl cellulose) nhưng có thể thuỷ phân được cellulose đã bị cắt ngắn mạch. Có lẽ vai trò chính của enzyme này là giúp cho enzyme endocellulase tác động lên được cellulose kết tinh. 11 Endoglucanase hay Endocellulase (1,4 β-D-glucano-hydrolaza): Enzyme này có nhiệm vụ cắt đứt các liên kết ò 1,4-glucozit trong phân tử cellulose một cách ngẫu nhiên để giải phóng ra xenlodextrin, xenlobiose và glucose. Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose vô định hình nhưng lại tác dụng yếu trên cellulose kết tinh và không phân giải được xenlobiose. Chính nhờ sự phân cắt trước của endocellulase, đã tạo ra các đầu không khử làm dễ dàng enzyme xenlobio-hydrolase, do đó mà thuỷ phân được cellulose kết tinh. Enzyme β-1,4-glucozidasehay xenlobiase: Đây là những enzyme rất đặc hiệu. β-glucozidase làm thuỷ phân xenlobiose và các xenlooligo-sacarit mạch ngắn thành glucose. Vận tốc chung của phản ứng thuỷ phân cellulose phụ thuộc chặt chẽ vào quá trình hoạt động của xenlobiase. Tuy nhiên theo một số tác giả cơ chế thuỷ phân cellulose bởi phức hệ enzyme trên diễn ra theo một trật tự khác nhau. b) Cơ chế thuỷ phân cellulose Theo Reese và các đồng sự thì C1 là enzyme “tiền tố thuỷ phân” hay là không đặc hiệu. Các enzyme này chỉ có tác dụng làm trương cellulose tự nhiên. Các cellulose tự nhiên sẽ được chuyển thành các cellulose hoạt động trương nở có mạch ngắn hơn. Các chuỗi này sẽ được enzyme Cx tiếp tục phân cắt tạo thành đường tan (xenlobiose) và sau cùng thành glucose [9]. Tuy nhiên Erikson và các đồng sự lại cho rằng: Đầu tiên enzyme endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt các liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó exoglucanose sẽ cắt ra tạo thành những đoạn xenlobiose. Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit mạch ngắn, xelobiose, glucose. Cuối cùng enzyme xenlobiase thuỷ phân tiếp theo tạo thành glucose. Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về enzyme C1 và Cx. Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở cellulose kết tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra cellulose biến tính. Sau đó enzyme endoglucanase tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobiose. Ông cho rằng sự thuỷ 12 phân cellulose là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanase, enxoglucanase và xenlobiase. Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân cellulose nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân cellulose vẫn chưa hoàn toàn thống nhất. 1.3.5.2. Enzyme và cơ chế thủy phân hemicellulose Khi nghiên cứu hemicellulose, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống nhau giữa hai thành phần này. Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzyme hemicellulase cũng có nhiều điểm tương đồng với cellulase ví dụ như cơ chế tác động... Tuy nhiên, giữa hemicellulase và cellulase vẫn còn nhiều điểm khác biệt:Hemicellulose có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém bền hơn so với cellulose. Hemicellulose là cơ chất dễ đồng hoá hơn cellulose do đó hemicellulase thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemicellulose thường diễn ra song song với quá trình phân giải cellulose [7]. 1.3.5.3. Enzyme và cơ chế thủy phân lignin Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin. Một số tác giả cho rằng, lignin có tác dụng như một nguồn cảm ứng để tổng hợp ra ligninase. Nhưng một số tác giả khác lại cho rằng quá trình phân giải lignin là một quá trình trao đổi chất thứ cấp. Chúng chỉ xảy ra khi môi trường thiếu các nguồn dinh dưỡng cacbon dễ đồng hoá hoặc thiếu nguồn nitơ. Nếu thêm nitơ vào sẽ làm giảm nhanh quá trình phân giải lignin. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 15 loại enzyme tham gia vào quá trình thuỷ phân lignin. Ligninase không thuỷ phân lignin thành các tiểu phần hoà tan như phân giải cellulose và hầu hết các polime khác, vì lignin chứa một số lượng các liên kết có thể bị phân huỷ nhỏ. Mặt khác ligninase lại rất khó hoà tan, chúng sẽ liên kết theo một kiểu nào đó cho phép tiếp xúc với lignin. 13 1.4. Thành phần chính của rơm rạ Tại thời điểm thu hoạch, hàm lượng ẩm của rơm rạ thường cao tới 60%, tuy nhiên trong điều kiện thời tiết khô hanh rơm rạ có thể trở nên khô nhanh đạt đến trạng thái độ ẩm cân bằng vào khoảng 10 - 12%. Rơm rạ, có hàm lượng tro cao và lượng protein thấp [13]. Trong rơm rạ chứa lượng lớn các chất hóa học và cacbon-hydrate thể hiện trong bảng 1.2. và 1.3. [14]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của rơm rạ Các chất hóa học Rơm rạ (%) Cellulose 32 – 47 Hemicelluose 19 – 27 Ligin 5 – 24 Protein - Tro 12.4 Bảng 1.2. Hàm lượng một số chất có trong rơm rạ Cacbon-hydrate Rơm rạ (%) Glucose 41 – 43.4 Xylose 14.8 – 20.2 Mannose 1.8 Galactose 0.4 Arabinose 2.7 – 4.5 1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh 1.5.1. Trên thế giới Phân bón vi sinh vật (tên thường gọi: phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọ với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định, góp phần nâng cao năng xuất, chất lượng nông sản. Phân hữu cơ vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến con người, động vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. 14 Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và được đặt tên là Nitragin. Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở Mỹ ( 1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914). Nitragin là một loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizibium do Beijerink phân lập năm 1888 và được Ferd đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại cây thích hợp họ Đậu. Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh cố đinh nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích khác như một số xạ khuẩn cố đinh nitơ sống tự do Frankia spp. , Azotobacter spp. , các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium, Pasterium, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hoặc một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ photpho, kali ở dạng khó hòa tan với một số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng apatit, photpho,… chuyển chúng thành dạng dễ hòa tan, cây trồng có thể hấp thụ được. 1.5.2. Ở Việt Nam Phân vi sinh vật cố đinh đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960. Đến năm 1987, phân Nitragin nền chất mang than bùn mới được hoàn thiện. Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và vi sinh vật phân giải lân. [5] Nhiều loại phân HCVS đã được nghiên cứu sản xuất và được ộ N ng nghiệp và hát triển n ng th n công nhận là tiến bộ kỹ thuật. Theo ước tính của Cục Tr ng trọt, lượng phân HCVS sản xuất trong năm 2008 có trên 100 loại với khoảng 1,2 triệu tấn, bước đầu tham gia vào sản xuất nông nghiệp theo hướng hữu cơ. Thị trường cho các sản phẩm dạng này đang dần được mở rộng, trong đó ứng dụng nhiều nhất là các vùng đất cơ giới nhẹ, các vùng trồng rau tập trung như Lâm Đồng, vùng ven Hà Nội và những vùng trồng các loại cây có giá trị kinh tế cao như cà phê, hồ tiêu, thanh long. 15 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 10 chủng vi sinh vật V6, Uv2.23, Uv2.8, X4, X9, X10, M4, M16, M17, M21 đã được phân lập và tuyển chọn từ khu vực đất nông nghiệp Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội) và VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc) thông qua đề tài “ Phân lập, tuyển chon một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ” của Lê Thị Thùy Dung, Đại học Sư phạm Hà nội 2. 2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất Giấy lọc, thuốc thử lugol 1%, côngô đỏ 1%. Các hóa chất: NaNO3, MgSO4.7H2O, KCl, K2HPO4, FeSO4, NaCl, NH4Cl, (NH4)2 SO4, CaCO3, saccarose, cao thịt, pepton... các hóa chất thông dụng khác. 2.2.2. Thiết bị Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), box vô trùng (Haraeus), máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5 μl – 10 ml, máy so màu UV – vis (Nhật), máy đo pH (MP 200R Thuỵ Sĩ), cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ), kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức), tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn... và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác. 2.3. Các loại môi trƣờng nuôi cấy 2.3.1. Môi trường giữ giống vi khuẩn MPA Peptôn : 5g; Thạch agar : 20g; Cao thịt : 5g; NaCl : 5g; 16 Nước : 1000ml. 2.3.2. Môi trường giữ giống xạ khuẩn Gauze I Tinh bột tan : 20g; KNO3 : 1g; Thạch : 20g; MgSO4.7H2O : 0,5g; FeSO4 : 0,01g; Nước : 1000ml. KH2PO4 NaCl : 0,1g; : 0,5g; 2.3.4. Môi trường giữ giống nấm mốc Crapeckdox Sacarose : 30g; FeSO4 : 0,01g; K2HPO4 : 0,5g; Nước cất : 1000ml; pH : 7; Thạch aga : 20g; MgSO4 : 0,5g; NaNO3 : 3g; KCl : 0,5g; 2.3.5. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV Bảng 2.1. Môi trường thử hoạt tính phân giải cellulose Môi trường CMC CMC Môi trường bột giấy Bột giấy : 5g Thạch agar : 20g Nước : 5g Thạch agar : 20g : 1000ml; Nước : 1000ml 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp vi sinh học 2.4.1.1. hương pháp cấy truyền và bảo quản giống Giữ giống và cấy truyền định kỳ hàng tháng trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng và thạch đĩa. Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30ºC 1 ngày đối với vi khuẩn, từ 7 - 12 ngày nuôi cấy mẫu xạ khuẩn và nấm mốc, chuyển sang để ở tủ lạnh nhiệt độ 2 - 40C. Cấy truyền định kì 2 tháng 1 lần trên môi trường phù hợp với từng nhóm VSV. Trước khi sử dụng giống cần hoạt hóa giống [1]. 2.4.1.2. hương pháp m tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn Cấy vi khuẩn theo hình dích dắc trên môi trường MPA, ủ ở 30 ºC trong 24h để vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc. Quan sát, lựa chọn các khuẩn lạc mọc 17 riêng rẽ mô tả các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc.Làm tiêu bản nhuộm đơn, tiêu bản nhuộm Gram, quan sát và mô tả đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trên kính hiển vi quang học. 2.4.1.2. hương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn Quan sát hình thái của hệ sợi khí sinh Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh… Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961). Quan sát cuống sinh bào tử Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause - I có găm lamen nghiêng 45ºC trên bề mặt môi trường. Sau 7 - 9 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có dạng thẳng hay lượn sóng ký hiệu là RF (Rectus Flexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculum Apertum) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira). [12] 2.4.1.3. hương pháp quan sát hình thái nấm mốc * hương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên m i trường Crapek-Dox để nghiên cứu đặc điểm vĩ m . Để hạn chế hiện tượng bào tử nấm phát tán và mọc lan trên bề mặt đĩa thạch, úp ngược, đánh dấu lại và không lật đĩa thạch lên, cứ thế đem nuôi ở 300C trong 7 ngày. Sau đó tiến hành quan sát và chụp hình, mô tả các đặc điểm của nấm bằng mắt thường hoặc kính hiển vi soi nổi. 18 Màu sắc bào tử: chính là màu sắc của bông nấm đây là đặc điểm quan trọng để phân loại nấm. Màu sắc hệ sợi: Thường có màu trắng nhưng một số loài có màu khác. Màu của mặt sau khuẩn lạc: là màu sắc quan sát được phía dưới khuẩn lạc bằng cách nhìn phía dưới đĩa thạch. * hương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi m (Robert A. Samson and Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad àn Filtenborg, 1996) Đổ môi trường định loại nghiên cứu vào các hộp lồng sao cho có độ dầy đạt gần 1mm, dùng khoan nút chai khoan lấy các khối thạch. Đặt hai khối thạch ở 2 điểm cách đều nhau trên một lam kính, cấy bào tử lên khối thạch. Đậy lamen lên từng khối thạch, sau đó quan sát theo dõi sự phát triển của hệ sợi, các hạch nấm bằng kính hiển vi. 2.4.2. Phương pháp hóa sinh 2.4.2.1. hương pháp định lượng hoạt độ enzyme cellulose theo phương pháp DNS (Miller, 1959) * Xác định hoạt độ Endoglucanase: a. Lập đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất CMC Nguyên lý: CMC-ase phân cắt CMC thành các oligosacaride và glucose có tính khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng. Tiến hành thí nghiệm: Pha dung dịch cơ chất: Dung dịch 0,5% CMC trong đệm 50mM Na-acetat. Dung dịch thuốc thử DNS: Hòa tan 2g phenol và 10g NaOH trong 300ml nước cất, thêm tiếp 0,5g Na2SO3, 200g KNaC4H4O6.4H20, 10g DNS, khuấy đều cho các hóa chất tan hoàn toàn. Bổ sung nước cất để đạt 1000ml Pha dung dịch mẹ 10µmol/ml D-glucose trong đệm 50mM Na-acetat. Từ đó pha loãng thành các nồng độ: 0; 2; 4; 6; 8; 10µmol/ml). Lấy 50µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450µl dịch 0,5% CMC + 750µl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước 19 sóng λ540mm. Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel. b. Xác định hoạt tính Endoglucanase: Mẫu thí nghiệm: 450µl dung dịch 0,5% CMC + 50µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500C trong 30 phút, sau đó bổ sung 750µl dung dịch DNS để dừng phản ứng. Mẫu đối chứng: 450µl dung dịch 0,5% CMC + 750µl dung dịch DNS để bất hoạt enzyme + 50µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 500C trong 30 phút. Đun cách thủy mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5 phút, cho qua nước lạnh. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540mm. Từ giá trị OD ta tính được lượng đường khử được tạo ra nhờ đồ thị đường chuẩn đã xác định. Quy ước: Một đơn vị hoạt tính CMC-ase (IU) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol đường glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm. * Thí nghiệm xác định hoạt tính Exoglucanase: a. Lập đồ thị đường chuẩn đối với cơ chất giấy lọc: Lấy 50µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên (0; 2; 4; 6; 8; 10µmol/ml)) + 450µl dịch 0,5% giấy lọc + 750µl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540mm. Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel. b. Xác định hoạt tính exoglucanase: Mẫu thí nghiệm: 450ml dung dịch đệm Na-acetat 50mM pH 5,5 + 0,7mg giấy lọc + 50µl enzyme. Ủ ở 500C trong 1 giờ. Sau đó bổ sung 750µl dung dịch DNS để dừng phản ứng. Mẫu đối chứng: 450µl dung dịch đệm Na-acetat 50mM pH 5,5 +750µl dung dịch DNS để bất hoạt enzyme + 0,7mg giấy lọc + 50µl enzyme. Ủ ở 500C trong 1 giờ. 20 Đun cách thủy mẫu thí nghiệm trong 5 phút, làm nguội bằng nước lạnh. Li tâm 4000v/phút trong 5 phút. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ 540mm. Từ giá trị OD tính được lượng đường khử nhờ đồ thị đường chuẩn đã xác định. 2.4.2.2. hương pháp xác định độ ẩm Độ ẩm, được biểu thị bằng tỷ số phần trăm giữa khối lượng nước có trong mẫu bay hơi sau khi sấy đến khô tuyệt đối với khối lượng mẫu trước khi sấy (ký hiệu A%).Mẫu sấy khô tuyệt đối, được biểu thị bằng tỷ số giữa mẫu trước khi sấy và sau sấy đến khối lượng không đổi. Tiến hành Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu Chuẩn bị chén cân: Sấy chén cân trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 C trong 1 h, sau đó đặt chén vào bình hút ẩm, đậy nắp lại, để nguội về nhiệt độ phòng. Cân chén trên cân , ghi lại kết quả khối lượng chén cân (mc). Cân mẫu trước khi sấy: Cân khoảng 5 g đến 10 g mẫu phân bón (mt) bằng cân vào chén cân đã biết khối lượng, ghi lại kết quả khối lượng của chén cân có mẫu (mc + mt). Đậy nắp chén. Sấy mẫu: Đặt chén cân đã có mẫu vào tủ sấy , mở nắp chén, sấy khô mẫu ở nhiệt độ thích hợp theo trong thời gian 3 h đến 4 h. Sau đó đậy nắp chén lại, đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội về nhiệt độ phòng. Cân mẫu sau khi sấy: Cân lần thứ nhất sau khi tiến hành sấy mẫu , ghi kết quả (mc + ms). Cân lần thứ hai, tiếp tục sấy mẫu như trong thời gian 2 h đến 3 h, cân mẫu sau sấy khi kết quả (mc + ms). Tính kết quả: Độ ẩm của mẫu phân bón tính theo phần trăm khối lượng được tính theo công thức sau: A% (m t ms ) 100 mt 21 Trong đó: mc khối lượng chén sau khi đã sấy ở nhiệt độ 105 C (g); mt khối lượng của mẫu trước khi sấy (g); ms khối lượng của mẫu sau khi sấy), tính bằng (g). 2.4.2.3. hương pháp xác định hoạt tính sinh enzyme phân hủy Cellulose của các chủng nghiên cứu Trang chủng vi sinh vật trên môi trường thích hợp: môi trường MPA dùng cho vi khuẩn, Gauze – I dùng cho xạ khuẩn, Czapekdox dùng cho nấm mốc các môi trường này được đổ với độ dày đồng đều 3mm (25ml/1 đĩa petri). Các môi trường thử hoạt tính cũng được đổ với độ dày đồng đều 3mm. Tiến hành: Nhỏ 100µl nước muối sinh lý vô trùng vào đĩa thạch chứa môi trường thích hợp nuôi cấy vi sinh vật. Dùng que cấy lấy một đầu que cấy sinh khối chủng vi sinh vật cần tuyển chọn hòa đều vào giọt nước muối sinh lý, sau đó trang đều và để tủ ấm ở 300C cho đến khi vi sinh vật mọc kín đĩa thạch (24 – 36h đối với vi khuẩn, 48 – 72h đối với nấm mốc, 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn). Dùng khoan nút chai (có đường kính d = 5mm hoặc d = 10mm), khoan các khối thạch trên đĩa môi trường đã nuôi cấy vi sinh vật. Đặt úp các khối thạch này lên mặt thạch của các môi trường thử hoạt tính (có chứa cơ chất CMC, bột giấy), sao cho bề mặt có sinh khối vi sinh vật của khối thạch nằm tiếp giáp với mặt thạch của môi trường thử hoạt tính. Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần đối với mỗi chủng vi sinh vật nghiên cứu và với mỗi loại cơ chất khác nhau. Các đĩa petri thử hoạt tính được ủ trong tủ lạnh 40C trong 12h, rồi nuôi trong tủ ấm 300C trong 12 - 24h. Kiểm tra hoạt tính enzyme trên đĩa thạch chứa cơ chất: Môi trường CMC và bột giấy: Thử hoạt tính enzyme cellulase bằng dung dịch côngô đỏ 1% : Ngâm đĩa petri thử hoạt tính trong dung dịch côngô đỏ trong 30 phút, sau đó đổ bỏ côngô đỏ đi, tiếp tục ngâm trong dung dịch muối 22 NaCl 1M trong 15 phút rồi đổ bỏ dung dịch muối đi, tiếp tục ngâm trong dung dịch muối như vậy trong 15 phút. Vùng không bị phân giải sẽ có màu đỏ của côngô đỏ, vùng bị phân giải có màu vàng, tiến hành đo đường kính vòng phân giải. 2.4.3. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu. Tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp: Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại TN. X 1 n Xi n i 1 Sai số đại diện của trung bình cộng: M= S n Hệ số biến thiên: Cv = S x 100% X Trong đó: n: Số lần nhắc lại Xi: Giá trị của lần thứ i S: Độ lệch chuẩn m: Sai số trung bình học 2.6. Địa điểm thực hiện đề tài Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 2.7. Thời gian thực hiện đề tài Đề tài được tiến hành từ tháng 10 năm 2014 đến tháng 05 năm 2015 tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 23 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năngsinh enzyme phân giảicellulose của các chủng vsv nghiên cứu 3.1.1. Xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm, rạ nghiên cứu Rơm rạ của mỗi loài lúa có các đặc tính khác nhau, cùng một loài lúa thì rơm rạ thu được ở mỗi vùng miền cũng có những đặc tính khác nhau, chúng tôi tiến hành xác định độ ẩm của cơ chất rơm rạ tươi và khô thu được trước khi sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Xác định độ ẩm của rơm tươi:Cân 20,012g rơm tươi cho vào đĩa petri, sấy ở 1050C trong 16h, đem cân lại, tiếp tục sấy 1h rồi bỏ ra cân lại, cứ làm như vậy cho tới khi cân thấy trọng lượng không đổi thu được rơm sấy có trọng lượng 4,577g Hàm lượng nước trong nguyên liệu rơm tươi là: – % H20 x 100 = 69,92 % Xác định độ ẩm của rơm khô (rơm phơi tự nhiên): Cân 2 phần bằng nhau 6,25g rơm cho vào đĩa petri, sấy ở 1050C trong 12h, đem cân lại, tiếp tục sấy 1h rồi bỏ ra cân lại, cứ làm như vậy cho tới khi cân thấy trọng lượng không đổi được 2 phần như sau: Phần 1: 6,85g Phần 2: 5,85g Hàm lượng nước trong nguyên liệu rơm phơi khô là: % H20 – x 100 = 11,96 % Như vậy xác định được độ ẩm trong cơ chất rơm tươi là 69,92%, độ ẩm của cơ chất rơm kh là 11,96%, việc này thuận lợi cho việc tính toán bổ sung hàm lượng nước trong các khối ủ rơm rạ thành phân hữu cơ. 24 3.1.2. Kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu Rơm rạ có thành phần chính là cellulose do vậy để tuyển chọn được tổ hợp các chủng VSV hữu hiệu có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ tôi tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào các chủng VSV.Đối tượng là tập hợp 10 chủng vi sinh vật, trong đó có 3 chủng vi khuẩn là: V6, Uv2.23, Uv2.8; 3 chủng xạ khuẩn là: X4, X9, X10; 3 chủng nấm mốc là: M4, M16, M17, M21 đã được phân lập và tuyển chọn từ khu vực đất nông nghiệp Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội) và VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc) thông qua đề tài “ Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ” của Lê Thị Thùy Dung, Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Kết quả thể hiện ở bảng 3.1: Bảng 3.1. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV nghiên cứu STT Tên chủng 1 Cellulose Phân loại Mẫu 21.12 ± 0.4 VK (Ba Vì) - 17.89 ± 0.4 VK (Mê Linh) Uv2.23 14 22.0 ± 0.4 VK (Mê Linh) 4 X4 - 8.67 ± 0.4 XK (Ba Vì) 5 X9 - 18.21 ± 0.4 XK (Tam Đảo) 6 X10 - 12.14 ± 0.4 XK (Tam Đảo) 7 M4 + 11.67 ± 0.4 NM (Tam Đảo) 8 M16 + 13.45 ± 0.4 NM (Mê Linh) 9 M17 22.03 ± 0.81 - NM (Tam Đảo) 10 M21 19.07 ± 0.81 9,33 ± 0.4 NM (Tam Đảo) CMC Bột giấy V6 - 2 Uv2.8 3 + : Có hoạt tính rất yếu- : Không có hoạt tính Kết quả kiểm tra xác định hoạt tính của các chủng vsv nghiên cứu cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulose của các chủng VSV được 25 phân lập, tuyển chọn từ khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội) và VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc) cao so với các nghiên cứu khác ở trong nước của các tác giả Kiều Ngọc Bích (2012), Trần Thị Xuân Hương (2013)và khá ổn định ở thời điểm kiểm tra hoạt tính chênh lệch không nhiều so với kết quả thử hoạt tính của nghiên cứu trước đó[14], phù hợp với mục đích nghiên cứu của đề tài. Trong đó, có 2 chủng vừa có hoạt tính với cơ chất CMC và bột giấy là chủng vi khuẩn Uv2.23 và chủng nấm mốc M21. Có 3 chủng có hoạt tính CMC là chủng vi khuẩn Uv2.23, nấm mốc M17, nấm mốc M21, và chủng có hoạt tính CMC cao nhất là nấm mốc M17(22.03 ± 0.81). Hầu hết các chủng có hoạt tính đối với cơ chất bột giấy, trong đó chủng vi khuẩn V6 có hoạt tính mạnh nhất (21.12 ± 0.4 mm). Dựa trên kết quả phân tích kiểm tra tính đối kháng trong 10 chủng không có chủng vsv nàođối kháng nhau có thể nuôi cấy trên cùng một môi tường cơ chất [14]; tôi quyết định lựa chọn 10 chủng vsv trên để thử nghiệm chuyển hóa cơ chất rơm rạ. Khả năng sinh enzyme cellulose của 10 chủng vsv cao và ổn định, do vậy t i quyết định sử dụng 10 chủng vsv tuyển chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng vsv nghiên cứu 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ 3.2.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường MPA, sau 24h quan sát hình thái khuẩn lạc mọc trên đĩa petri và tiến hành quan sát bằng mắt thường và 26 quan sát dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2 và 3.3: V6 Uv2.8 Uv2.23 Hình 3.2. Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trường MPA V6 Uv2.23 Uv2.8 Hình 3.3. Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn nghiên cứu (x1000) Quan sát hình thái khuẩn lạc (hình 3.2) các chủng vi khuẩn cho thấy: khuẩn lạc của chủng V6 lồi, có màu trắng sữa, không đều, rìa mép khuẩn lạc lượn sóng. Khuẩn lạc Uv2.8 màu trắng vàng, bóng nhầy nhớt, rìa mép nhẵn. Khuẩn lạc Uv2.23 to màu trắng ngà, bóng, lồi, khá đồng đều. Ảnh kính hiển vi quang học ( hình 3.3) cho thấy: Chủng V6 có hình que xếp đơn lẻ hoặc xếp chuỗi, bắt màu xanh khi nhuộm Gram chứng tỏ chủng V6 thuộc vi khuẩn Gram dương. Chủng Uv2.23 tế bào hình que ngắn, nằm riêng rẽ, bắt màu xanh khi nhuộm Gram chứng tỏ chủng Uv2.23 thuộc vi khuẩn Gram dương. Chủng Uv2.8 tế bào hình que ngắn, nằm riêng rẽ, hoặc xếp chuỗi, bắt màu xanh khi nhuộm Gram chứng tỏ chủng Uv2.8 thuộc vi khuẩn Gram dương. 27 3.1.2. Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn * Hình thái khuẩn lạc, màu sắc hệ sợi Tiến hành nghiên cứu đặc điểm hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất của 3 chủng xạ khuẩn X4, X9, X10 đã được tuyển chọn. Nuôi cấy các chủng xạ khuẩn này trên môi trường Gause I, sau 3-5 ngày thì đem quan sát bằng mắt thường và soi dưới kính hiển vi soi nổi. Kết quả quan sát các chủng xạ khuẩn nghiên cứu được dẫn ra ở hình 3.4: Hình 3.4. Khuẩn lạc xạ khuẩn nghiên cứu dưới kính hiển vi soi nổi Khuẩn lạc X4 có đường kính 1 – 1,5mm. hệ sợi cơ chất sinh sắc tố màu xám vàng. Hệ sợi khí sinh màu trắng xám, khi già chuyển màu xám hơi đen, sắc tố tan ở môi trường thạch có màu xám nhạt. Khuẩn lạc X9 có đường kính 0,5 – 1mm, hệ sợi cơ chất sinh sắc tố màu xám hồng, hệ sợi khí sinh có màu vàng nhạt. Sắc tố tan ở môi trường thạch có màu nâu nhạt. Khuẩn lạc X10 có đường kính 1 – 1,5mm, hệ sợi cơ chất sinh sắc tố màu trắng. Hệ sợi khí sinh có màu trắng, khi già chuyển sang màu xám sần sùi. Sắc tố tan màu trắng đục. *Cuống sinh bào tử Tiến hành nuôi cấy 3 chủng xạ khuẩn X4, X9, X10 trên môi trường Gauze I có găm lamen nghiêng 450 trên bề mặt môi trường, nuôi 5 ngày ở nhiệt độ 300C thì lấy ra quan sát hình dạng cuống sinh bào tử trên kính hiển vi quang học. Kết quả được dẫn ra ở hình 3.6: 28 X4 X9 X10 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bào tử của các chủng xạ khuẩn (x 1000) Từ hình 3.5 nhận thấy: Chủng X4 có cuống sinh bào tử dạng xoắn. Chủng X9 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, đến hơi lượn sóng. Chủng X10 có cuống sinh bào tử dạng lượn xoắn 3.2.3. Đặc điểm hình thái các chủng nấm mốc Tiến hành nuôi cấy và quan sát đặc điểm hình thái các chủng nấm mốc nghiên cứu, kết quả thể hiện ở hình 3.6 Hình 3.6. Khuẩn lạc các chủng nấm mốc trên môi trường thạch đĩa Khuẩn lạc chủng nấm mốc M4 có đường kính 5 – 6mm. Bào tử có màu xanh đen, mịn, khi già chuyển sang màu xanh đen đậm. Màu cơ chất cùngmàu 29 với hệ sợi khí sinh. Hệ sợi có vách ngăn. Cuống sinh bào tử hình cành cây, thể bình hình chai, thường chẽ đôi từ cuống. Chỉ có một bào tử hình oval đính trên mỗi thể bình. Khuẩn lạc chủng nấm mốc M16 có đường kính 8 – 9mm, hệ sợi khí sinh màu trắng chuyển dần sang màu xanh, khi già chuyển sang màu hồng. Cuống sinh bào tử hình chùy, thể bình có 1 tầng, bào tử đính hình oval, tạo thành chuỗi dài gắn với thể bình. Khuẩn lạc chủng nấm mốc M17 có đường kính 6 – 9mm, hệ sợi cơ chất có màu trắng mịn, có vách ngăn. Khuẩn lạc chủng nấm mốc M21có đường kính 7 – 8mm, hệ sợi khí sinh có màu trắng có vách ngăn. Cuống sinh bào tử hình chạc đôi/ba, thể bình không rõ. Bào tử đính hình cầu, màu trắng xanh và thường chỉ có một bào tử đính trên một thể bình. 3.3. Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu Để đo khả năng xúc tác của enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme của tổ hợp vsv nghiên cứu theo phương pháp DNS (Miller, 1959). Đơn vị hoạt độ là lượng cơ chất mà emzym xúc tác chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian và các điều kiện như nhiệt độ, pH,... xác định. Để đo khả năng xúc tác của enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme của tập hợp vsv nghiên cứu theo phương pháp DNS (Miller, 1959). Đơn vị hoạt độ là lượng cơ chất mà emzym xúc tác chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian và các điều kiện như nhiệt độ, pH,... xác định. 3.3.1. Đồ thị đường chuẩn Trước tiên để xác định được hoạt độ enzyme tôi tiế hành xây dựng đồ thị đường chuẩn với các cơ chất CMC, giấy lọc, xylan. 30 3.1.1.2. Đ thị đường chuẩn đối với cơ chất CMC Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel. Kết quả thể hiện ở hình 3.7: Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất CMC 3.1.1.2. Lập đ thị đường chuẩn đối với cơ chất bột giấy Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel. Kết quả thể hiện ở hình 3.8: Hình 3.8. Đồ thị đường chuẩn D-glucose với cơ chất bột giấy 31 3.3.2. Hoạt độ enzyme của các chủng vsv nghiên cứu Hoạt tính phân giải của một tổ hợp VSV thường là tổng hoạt tính của từng chủng VSV riêng lẻ, nhưng đôi khi, sự phối hợp của chúng trong tập hợp nhằm phân giải một cơ chất phức tạp lại cao hơn rất nhiều, nhờ sự hỗ trợ lẫn nhau của các hệ enzyme thủy phân khác nhau. Sau khi tiến hành thí nghiệm xác định được hàm lượng enzyme của tổ hợp vsv nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2: Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme của tổ hợp vi sinh vật nghiên cứu Chủng V6 Uv2.8 Uv2.23 X4 X9 X10 M4 M16 M17 M21 (Hàm lượng enzyme (IU/ml)) Endoglucanase Exoglucanase 2.8 ± 0,05 1.6 ± 0,05 9.9 ± 0,05 1.5 ± 0,05 2.2 ± 0,05 9.1 ± 0,05 3.1 ± 0,05 27.9 ± 0,05 17.5 ± 0,05 20.9 ± 0,05 6.6 ± 0,05 15.3 ± 0,05 22.3 ± 0,05 24.7 ± 0,05 46.2 ± 0,05 49.9 ± 0,05 48.4 ± 0,05 52.1 ± 0,05 36.1 ± 0,05 36.5 ± 0,05 Kết quả cho thấy trong tổ hợp VSV nghiên cứu, các chủng nấm mốc đều có hoạt tính phân giải cellulose cao (thể hiện ở nồng độ hai enzyme endoglucanase và exoglucanase), trong đó hai chủng nấm mốc M16 và M17 có hoạt tính cao và các chủng nấm mốc nghiên cứu có hoạt tính cao hơn hẳn hoạt tính của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu. Hoạt tính endoglucanase của chủng nấm mốc M17 (48.4 IU/ml) cao gấp 22 lần hoạt tính của chủng vi khuẩn Uv2.23 (2.2 IU/ml). Đối với hoạt tính exoglucanase chủng nấm mốc M17 cũng có giá trị cao nhất (52.1 IU/ml), chủng vi khuẩn Uv2.8 có hoạt tính thấp nhất (1.5 IU/ml) trong số các chủng vsv nghiên cứu. So sánh với hoạt tính enzyme cellulose của 10 chủng nghiên cứu có giá trị cao hơn hẳn các chủng vsv nghiên cứu của tác giả Nguyễn Ngô Yến Ngọc và cộng sự (2014). 32 Tuy các chủng vi khuẩn có hoạt độ enzyme cellulase thấp hơn so với nấm mốc nhưng vi khuẩn có nhiều ưu việt so với các nhóm nấm vì vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo được nhiều sinh khối hơn so với nấm mốc do đó giá thành khi sản xuất chế phẩm sẽ rẻ hơn. 3.4. Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các chủng vi sinh vật nghiên cứu Để đánh giá hiệu quả phân giải rơm rạ của tổ hợp VSV tuyển chọn, chúng tôi ủ thử nghiệm tổ hợp VSV này trên các khối ủ rơm rạ lớn có thể tích ~ 0,5 m3, tương ứng 10 kg rơm khô, được bổ sung dung dịch khoáng ammoni nitrate và nước sao cho độ ẩm đạt khoảng 60%. Khối ủ thí nghiệm (TN1 - TN2 - TN3 được bổ sung tổ hợp VSV nghiên cứu) và các khối ủ đối chứng (TN4 – TN5 TN6 không bổ sung tổ hợp VSV) đều được lặp lại 3 lần (Hình 3.8): Hình 3.9. Khối ủ thí nghiệm và đối chứng sau khi phối trộn nguyên liệu và bổ sung giống vi sinh vật Giống VSV được bổ sung vào cơ chất của từng khối ủ thí nghiệm (TN1, TN2, TN3) sao cho đạt mật độ VSV ban đầu khoảng 106 – 107 tế bào hoặc bào tử trong 1 g cơ chất rơm rạ đã phối trộn (Bảng 3.3). 33 Bảng 3.3. Vi sinh vật bổ sung vào mỗi khối ủ thí nghiệm Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc (ml dịch nuôi) (cm2 bề mặt thạch) (cm2 bề mặt thạch) V6 Uv2.8 Uv2.23 X4 43.33 57.68 164.1 X9 X10 M4 M16 M17 M21 1.1 10.39 148.6 11.9 77.1 166.85 126.19 Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ được thể hiện trong bảng 3.4 và nhiệt độ các khối ủ được thể hiện trong hình 3.10. So với nền nhiệt của môi trường (Hình 3.10), các khối ủ có bổ sung tổ hợp VSV tuyển chọn (TN1-TN2-TN3) và các khối ủ không bổ sung tổ hợp VSV (các đống đối chứng, TN4-TN5-TN6) đều có nhiệt độ cao hơn, chứng tỏ trong các khối ủ này đều có sự sinh trưởng, phát triển của VSV. Tuy nhiên, nhiệt độ của các khối ủ có bổ sung tổ hợp VSV cao hơn hẳn (tối đa 54⁰C) so với các khối ủ đối chứng (tối đa 44⁰C). Độ mủn hóa của cơ chất cũng diễn ra nhanh hơn và cao hơn (Bảng 3.4). Quá trình mủn hóa nhanh hơn và cao hơn cũng chính là lý do làm cho độ giảm khối lượng của các khối ủ có bổ sung tổ hợp VSV tuyển chọn cao hơn (độ giảm khối lượng trung bình là 9,3kg trong 32 ngày) trong khi độ giảm khối lượng trung bình ở các khối ủ không bổ sung tổ hợp VSV chỉ đạt 5,4kg trong 32 ngày (Bảng 3.4): 34 Bảng 3.4. Kết quả theo dõi độ mủn của các khối ủ Thời gian TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 23/2/2015 + + + - - - 28/2/2015 ++ ++ ++ + + + 3/3/2015 +++ ++ ++ + + + 8/3/2015 +++ +++ +++ ++ ++ ++ 13/3/2015 +++ +++ +++ ++ ++ ++ 19/3/2015 ++++ +++ +++ ++ ++ ++ - : Không mủn ++ : Mủn trung bình + : Mủn ít ++++ : Mủn tốt +++ : Mủn Hình 3.10. Biến thiên nhiệt độ trung bình của các khối ủ lớn Như vậy là tổ hợp VSV tuyển chọn đã thể hiện hoạt động sinh trưởng và phân giải cơ chất rơm rạ tốt hơn hẳn các VSV tự nhiên, vốn có trong cơ chất rơm rạ. Nhiệt độ trong các khối ủ thí nghiệm tăng nhanh và đạt ngưỡng cao nhất 53⁰C đến 54⁰C vào ngày thứ 8-9; đây là mức nhiệt tốt cho sự phân giải hữu cơ. 35 Trong khi đó ở các khối đối chứng, nhiệt độ tăng chậm hơn và đạt ngưỡng cao nhất là 44⁰C đến 45⁰C vào ngày thứ 10-11. Nhiệt độ của các khối ủ thí nghiệm duy trì và dao động ở mức trên 500C cho đến ngày thứ 12-13 thì bắt đầu giảm. Trong thời gian giảm nhiệt độ, có hai lần nhiệt độ tăng nhẹ (ngày thứ 15-16 và 20-21) nhưng vẫn năm trong xu hướng giảm nhiệt ở các khối ủ, cả thí nghiệm và đối chứng. Sự tăng cường nhiệt độ này thể hiện hoạt động sinh trưởng, phát triển tối ưu của các nhóm VSV khác nhau trong khối ủ. Đây cũng là giai đoạn ổn định của các khối ủ rơm dạ, khi mà cơ chất được chuyển hóa dần từ dạng này sang dạng khác. Bảng 3.5. Độ giảm khối lượng của các khối ủ sau 32 ngày Độ giảm khối lượng TN ĐC ∆m (kg) 9,3 ± 0,3 5,4 ± 0,38 Các kết quả thực nghiệm bảng 3.4 và bảng 3.5 cho thấy hoạt động của các VSV trong tập hợp tuyển chọn được bổ sung vào khối ủ thí nghiệm (TN1-TN2TN3) đã chuyển hóa hiệu quả cơ chất rơm rạ thành CO2, làm giảm khối lượng khối ủ (giảm trung bình 9,3 kg, tương ứng 4,02% khối lượng khối ủ ban đầu) so với các đống đối chứng (giảm trung bình 5,4 kg) và làm tăng độ mủn của cơ chất rơm rạ cao hơn hẳn so với các khối ủ đối chứng (TN4-TN5-TN6). Tổ hợp vi sinh vật nghiên cứu có thể sử dụng như một tổ hợp vi sinh vật hữu hiệu để chuyển hóa rơm rạ thành phân hữu cơ. 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Xác định được hàm lượng ẩm trong rơm tươi là 69,92 %, trong rơm phơi khô tự nhiên là 11,96 %. Khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv tuyển chọn nghiên cứu cao và khá ổn định. 1.2. Nghiên cứu được sơ bộ một số đặc điểm hình thái của 3 chủng vi khuẩn V6, UV2.23, UV2.8, 3 chủng xạ khuẩn X4, X9, X10 và 4 chủng nấm mốc M 4, M16, M17, M21. 1.3. Xác định và đánh giá được hoạt độ enzyme của các chủng vsv nghiên cứu. Trong đó các chủng nấm mốc M17 có hoạt độ cellulase mạnh nhất, hoạt độ endoglucanase của chủng nấm mốc M17 có giá trị 48.4 IU/ml, enzyme exoglucanase có giá trị 52.1 IU/ml. 1.4. Các chủng vsv nghiên cứu có thể sử dụng như một tổ hợp vi sinh vật hữu hiệu để chuyển hóa rơm rạ thành phân hữu cơ. 2. Kiến nghị 2.1. Tiếp tục nghiên cứu nhằm định loại các chủng vi sinh vật tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử. 2.2. Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy khả năng sinh enzyme lignocellulose của các chủng vi sinh vật nhằm ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Văn Mùi, (2007). Thực hành hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. [2]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào, (2011). Thực hành vi sinh vật. Nhà xuất bản Đại học Sư phạm Hà Nội. [3]. Kiều Ngọc Bích, (2012). “ hân lập tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulose cao”. Khóa luận tốt nghiệp đại học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. [4]. Trần Cẩm Vân, Bạch Thị Phương Lan, (1995). Công nghệ vi sinh và bảo vệ môi trường. Nhà xuất bản giáo dục. [5]. Nguyễn Ngọc Tâm Huyên, (2011). Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất phân bón vi sinh. Báo cáo chuyên đề vi sinh vật môi trường. [6]. Nguyễn Lân Dũng, (1984). “Vi sinh vật đất và sự chuyển hoá các hợp chất cacbon, nitơ”. [7]. Nguyễn Đức Lượng (1996), “Nghiên cứu tính chất của một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase cao và ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ”, Luận án PTS, trường Đại học ách Khoa, ĐHQG-HCM. [8]. Phạm Hồ Trương (1993), “Chuyển hoá phế liệu ligno-cellulose nhờ nấm sợi bằng phương pháp lên men bán rắn”, Luận án PTS, trường Đại học Sư phạm Hà Nội. [9]. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân, Nguyễn Lân Dũng (1982), “Enzyme vi sinh vật tập II”. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật. [10]. Trần Thị Xuân Hương, (2013). “ hân lập tuyển chọn tổ hợp vi sinh vật hữu hiệu có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ”. Khóa luận tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 38 [11].Phương Phú Công, (2009). “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp Xylanase trên phế phụ phẩm n ng nghiệp phục vụ chăn nu i”. Luận án Tiến sĩ sinh học. Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. [12]. Trần Thị Thùy Duyên, ( 2014). “Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt ở Xuân Hòa, húc Yên, Vĩnh húc, luận văn thạc sĩ”, luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. [13]. Tăng Thị Chính, (2001). “Nghiên cứu các vi sinh vật phân giải cellulose trong phân hủy rác thải hiếu khí và ứng dụng”. Tóm tắt luận án Tiến sĩ. Viện c ng nghệ sinh học. [14]. Lê Thị Thùy Dung, (2014). “ hân lập tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ”, khóa luận tốt nghiệp đại học. Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 39 [...].. .khả năng phân giải cellulose, lignin và hemicellulose nhờ có hệ enzyme ngoại bào Do đó tôi chọn đề tài: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ 2 Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, ... chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu 3.2 .Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ 3.3 Xác định hoạt độ enzyme của các chủng vi sinh vật nghiên cứu 3.4 Thử nghiệm hiệu quả sản xuất phân hữu cơ từ rơm, rạ sử dụng các chủng vi sinh vật nghiên cứu 4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài... THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu một số tính chất của cơ chất (rơm, rạ) và kiểm tra khả năngsinh enzyme phân giảicellulose của các chủng vsv nghiên cứu 3.1.1 Xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm, rạ nghiên cứu Rơm rạ của mỗi loài lúa có các đặc tính khác nhau, cùng một loài lúa thì rơm rạ thu được ở mỗi vùng miền cũng có những đặc tính khác nhau, chúng tôi tiến hành xác định độ ẩm của cơ chất rơm rạ tươi và khô... khoa học của đề tài Đề tài nhằm nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase Góp một phần nhỏ bổ sung cho các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói riêng và ứng dụng trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế Vi t Nam 4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Vi c nghiên cứu này nhằm mục tiêu tuyển chọn các chủng vi sinh vật. .. 10 chủng vsv cao và ổn định, do vậy t i quyết định sử dụng 10 chủng vsv tuyển chọn cho các nghiên cứu tiếp theo Hình 3.1 Hoạt tính cellulase của một số chủng vsv nghiên cứu 3.2 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng phân hủy cellulose trong rơm rạ 3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường MPA, sau 24h quan sát hình thái khuẩn... vi c tính toán bổ sung hàm lượng nước trong các khối ủ rơm rạ thành phân hữu cơ 24 3.1.2 Kiểm tra khả năng sinh enzyme phân giải cellulose của các chủng vsv nghiên cứu Rơm rạ có thành phần chính là cellulose do vậy để tuyển chọn được tổ hợp các chủng VSV hữu hiệu có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ tôi tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào các chủng VSV.Đối tượng là tập hợp 10 chủng vi. .. Phân vi sinh vật cố đinh đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin nền chất mang than bùn mới được hoàn thiện Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và vi sinh vật phân giải lân [5] Nhiều loại phân HCVS đã được nghiên cứu sản xuất... lignocellulase được phân lập, tuyển chọn trong đất tại 3 địa điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc) 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose 1.1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn a) Nấm sợi Trong rất... hoá của người và động vật có dạ dày một túi Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và trong đất 9 có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là enzyme thuỷ phân cellulose [9] 1.3.3 Hemicellulose Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng Hemicellulose là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với cellulose Thông thường chúng chỉ có 150... TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 10 chủng vi sinh vật V6, Uv2.23, Uv2.8, X4, X9, X10, M4, M16, M17, M21 đã được phân lập và tuyển chọn từ khu vực đất nông nghiệp Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà Nội) và VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc) thông qua đề tài “ Phân lập, tuyển chon một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ” của Lê Thị Thùy Dung, Đại học Sư phạm Hà nội