Đang tải... (xem toàn văn)
... phòng trừ bệnh đạo ôn lúa có hiệu cao 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập dòng vi khuẩn Bacillus Pseudomonas flourescens từ vùng đất rễ lúa có khả đối kháng với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn Chuyên... chủng vi khuẩn đối kháng với mầm bệnh lúa 11 Bảng Ảnh hưởng vi khuẩn đối kháng đến bệnh cháy đạo ôn cổ giống lúa UPLRi-5 Philipin 13 Bảng Khả hạn chế bệnh đạo ôn xử lý vi khuẩn giống lúa. .. vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả đối kháng mạnh với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa từ 10 mẫu đất lúa thu từ hai tỉnh Đồng Tháp Cần Thơ Hầu hết dòng vi khuẩn Bacillus phân lập
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ VÙNG ĐẤT RỄ LÚA CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Pyricularya oryzae GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THỊ LIÊN LÊ THỊ HUYỀN TRANG MSSV: 3103995 LỚP: VSVH K36 Cần Thơ, 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ VÙNG ĐẤT RỄ LÚA CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Pyricularia oryzae GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THỊ LIÊN LÊ THỊ HUYỀN TRANG MSSV: 3103995 LỚP: VSVH K36 Cần Thơ, 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Nguyễn Thị Liên Lê Thị Huyền Trang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ ---------Sau gần bốn năm học tập và nghiên cứu tại Trường Đại học Cần Thơ, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Vi sinh vật học. Trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học đã nhận được rất nhiều sự đóng góp quý báu từ phía cán bộ hướng dẫn, Ban lãnh đạo viện, bạn bè và sự quan tâm ủng hộ từ phía gia đình để có thể vượt qua những khó khăn trong thời gian qua, vững tin thực hiện đề tài. Trước tiên tôi chân thành gửi lời cảm ơn Ban giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh đã tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, máy móc, dụng cụ và hỗ trợ đắc lực trong quá trình thực hiện luận văn giúp tôi học tập, nghiên cứu nâng cao trình độ để hoàn thành tốt luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất của mình đến cô Nguyễn Thị Liênngười đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dạy dỗ, đồng hành và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện đề tài nghiên cứu một cách tốt nhất. Xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai và cô Nguyễn Thị Pha phòng Công Nghệ Gen Thực Vật, các anh chị cao học cũng như các bạn học viên đã nhiệt tình chỉ bảo, hỗ trợ, đóng góp ý kiến trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Gián tiếp tạo nên thành công trên của tôi là tập thể các bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 và những người bạn thân đã luôn bên cạnh động viên, cổ vũ và giúp tôi suốt quá trình học và nhất là khoảng thời gian làm luận văn. Một lần nữa xin gửi lời tri ân đến tất cả mọi người, những người đã yêu thương, quan tâm và hết lòng giúp đỡ tôi và kính chúc quý Thầy cô cùng các bạn sinh viên sức khỏe và thành công. Chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2013 Lê Thị Huyền Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÓM TẮT Đề tài phân lập được 43 dòng vi khuẩn, trong đó có 19 dòng vi khuẩn Bacillus và 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng mạnh với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa từ 10 mẫu đất lúa được thu về từ hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ. Hầu hết các dòng vi khuẩn Bacillus phân lập được có màu trắng đục, một số có màu vàng nhạt, tất cả có dạng không đều hoặc răng cưa. Độ nổi khuẩn lạc có 2 dạng mô và lài, đa số khuẩn lạc có bề mặt nhăn. Riêng đối với các dòng Pseudomonas fluorescens thì khuẩn lạc có màu trắng đục hay vàng kem, khuẩn lạc nhỏ, trơn, đa số bìa nguyên, một số khuẩn lạc có dạng nhầy. Tất cả các dòng vi khuẩn có dạng hình que và có khả năng di động. Các dòng vi khuẩn Bacillus này được tiến hành khảo sát thêm các thử nghiệm sinh hóa như catalase, amylase, nhuộm gram đều cho thấy là phù hợp với các đặc điểm của vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens được tiến hành thử nghiệm oxidase, khử nitrite và nhuộm Gram đều cho kết quả giống với vi khuẩn Pseudomonas fluorescens. Mười chín dòng vi khuẩn Bacillus tiếp tục được khảo sát các đặc tính kháng nấm như khả năng sinh các enzyme: có 8 dòng vi khuẩn biểu hiện khả năng sinh enzyme cellulase, tất cả 19 dòng vi khuẩn sinh enzyme protease và có 11 dòng sản sinh siderohore. Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens khi khảo sát các đặc tính kháng nấm cho thấy 24 dòng vi khuẩn sinh enzyme protease và 16 dòng sản sinh siderophore. Từ khóa: Bacillus, bệnh đạo ôn, đối kháng, Pseudomonas fluorescens, Pyricularia oryzae. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT ...................................................................................................... LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................... TÓM TẮT ................................................................................................................... i MỤC LỤC .................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ iv DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. vi TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................................... vii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................. 2 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................. 2 2.1. Bệnh đạo ôn ..................................................................................................... 3 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phân bố của bệnh ............................................................. 3 2.1.2. Tác hại .................................................................................................................. 3 2.1.3. Triệu chứng........................................................................................................... 4 2.2. Nguyên nhân gây bệnh và sinh thái bệnh ..................................................... 6 2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh ......................................................................................... 6 2.2.2. Sinh học bệnh ....................................................................................................... 7 2.3. Sinh thái bệnh.................................................................................................. 8 2.3.1. Điều kiện thời tiết ................................................................................................. 8 2.3.2. Đất đai, phân bón .................................................................................................. 9 2.3.3. Giống .................................................................................................................... 9 2.3.4. Biện pháp phòng chống ........................................................................................ 9 2.4. Vi sinh vật đối kháng ................................................................................... 10 2.4.1. Những nghiên cứu trong nước ............................................................................ 10 2.4.2. Những nghiên cứu ngoài nước ........................................................................... 11 2.5. Vi khuẩn Bacillus .......................................................................................... 14 2.6. Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ............................................................. 18 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 22 3.1. Thời gian ........................................................................................................ 22 3.2. Địa điểm ......................................................................................................... 22 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.3. Phƣơng tiện.................................................................................................... 22 3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm nuôi cấy ................................................................ 22 3.3.2. Vật liệu ............................................................................................................... 22 3.4. Phƣơng pháp ................................................................................................. 23 3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens từ vùng đất của rễ lúa ........................................................................................................ 23 3.4.2. Thí nghiệm 2: Một số thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Bacillus (Sharmin và Rahman, 2007) ........................................................................... 25 3.4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (Nguyễn Trọng Thể, 2005) ................................................ 26 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng đối kháng ...................................................... 26 3.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát đặc tính đối kháng của Bacillus và Pseudomonas fluorescens .................................................................................................................... 27 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 29 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens vùng đất của rễ lúa. ......................................................................................................... 29 Thí nghiệm 2: Một số thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Bacillus .. 32 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ............................................................................................................. 35 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập được ....................................................................................................................... 38 Thí nghiệm 5: Khảo sát đặc tính đối kháng của Bacillus và Pseusomonas fluorescens ............................................................................................................. 41 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 49 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 49 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 50 PHỤ LỤC .............................................................................................................. PL1 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Các chủng vi khuẩn đối kháng với các mầm bệnh chính trên cây lúa ......... 11 Bảng 2. Ảnh hưởng của vi khuẩn đối kháng đến bệnh cháy lá và đạo ôn cổ bông trên giống lúa UPLRi-5 tại Philipin........................................................................... 13 Bảng 3. Khả năng hạn chế bệnh đạo ôn bởi xử lý vi khuẩn trên giống lúa IR50 và CO39 trong các thí nghiệm ngoài đồng ở Ấn Độ. ................................................ 14 Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của 19 dòng vi khuẩn Bacillus ..... 29 Bảng 5. Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .......................................................................................... 31 Bảng 6. Kết quả chung các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn Bacillus ......... 34 Bảng 7. Kết quả chung các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .......................................................................................... 37 Bảng 8. Khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae của các dòng vi khuẩn Bacillus ...................................................................................................................... 39 Bảng 8. Khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .......................................................................................... 40 Bảng 10. Khả năng sản sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn Bacillus ....... 42 Bảng 11. Khả năng sản sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens .......................................................................................... 43 Bảng 12. Khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi khuẩn Bacillus ............... 45 Bảng 13. Khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ................................................................................................................. 46 Bảng 14. Khả năng phân hủy cellulose vách tế bào nấm của các dòng vi khuẩn Bacillus ...................................................................................................................... 47 Bảng 15. Phân tích ANOVA về khả năng đối kháng với nấm P.oryzae của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 5 ngày ......................................................................... PL5 Bảng 16. Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng khả năng đối kháng với nấm P.oryzae của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 4 ngày ............................... PL5 Bảng 17. Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 3 ngày ......................................................................... PL5 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 18. Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 3 ngày ............................................. PL6 Bảng 19. Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn Bacillus ........................................................................................... PL6 Bảng 20. Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn Bacillus ................................................................ PL6 Bảng 21. Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 5 ngày ...................................................................................... PL7 Bảng 22. Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi khuẩn Bacillus sau 5 ngày ............................................................ PL7 Bảng 23. Phân tích ANOVA về khả năng đối kháng với nấm P.oryzae của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày............................................. PL7 Bảng 24. Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng khả năng đối kháng với nấm P.oryzae của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày .. PL7 Bảng 25. Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ............................................................... PL8 Bảng 26. Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ................................... PL8 Bảng 27. Phân tích ANOVA về khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày .......................................................... PL8 Bảng 28. Kiểm định sự khác biệt trung bình về khả năng sản sinh siderophore của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày................................ PL9 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Một số triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa ........................................................ 5 Hình 2. Nấm Pyricularia oryzae ................................................................................. 6 Hình 3. Sự giới hạn phát triển khuẩn ty trên đĩa petri của nấm M. grisea bởi dòng P. fluorescens Pf7-14 (phải) và đối chứng không xử lý vi khuẩn (trái) ........... 12 Hình 4. Vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................................. 14 Hình 5. Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ............................................................. 19 Hình 6. Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng Bacillus phân lập được với độ phóng đại 10 lần ........................................................................................................ 29 Hình 7. Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng Pseudomonas fluorescens phân lập được với độ phóng đại 10 lần ..................................................................... 30 Hình 8. Hình nhuộm gram tế bào của hai dòng vi khuẩn .......................................... 32 Hình 9. Bọt khí do enzyme Catalase tiếp xúc với H2O2 tạo thành ............................ 33 Hình 10. Thử nghiệm amylase đối với các dòng vi khuẩn Bacillus.......................... 34 Hình 11.Thử nghiệm oxidase đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ................................................................................................................. 36 Hình 12.Thử nghiệm nitratase đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ................................................................................................................. 37 Hình 13. Các dòng vi khuẩn có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khuẩn ty nấm ............................................................................................................................ 38 Hình 14. Vòng halo thể hiện khả năng phân hủy protein của vi khuẩn .................... 42 Hình 15. Khả năng sản sinh siderophore ................................................................... 45 Hình 16. Vòng halo sau khi nhuộm Congo Red xung quanh khuẩn lạc bằng phương pháp đục lỗ ................................................................................................... 48 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT BVTV Bảo vệ thực vật CAS Chrome Azurol S CMC Carboxylmethyl Cellulose ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long g/l gram/lít IRRI International Rice Research Institute LB Luria-Broth NA Nutrient Agar NB Nitrate Broth NN & PTNT Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn PDA Potato Dextrose Agar PCA phenazine-1-carboxylic acid SD-CASA A Simple double-layered Chrome Azurol S Agar SMA Skim Milk Agar YEG Yeast Extract Glucose Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Cây lúa là một trong 3 cây lương thực chính và chủ yếu trên thế giới. Cây lúa được trồng rộng rãi ở nhiều nơi và trong những điệu kiện sinh thái khác nhau như châu Á, châu Phi, châu Mỹ, châu Âu, châu Đại Dương. Ở Việt Nam cây lúa đứng hàng đầu trong các cây lương thực. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2012, trong ngành trồng trọt, tổng sản lượng lương thực có hạt cả năm ước đạt 48,47 triệu tấn, tăng 1,24 triệu tấn (+2,6%) so với năm 2011. Trong đó, sản lượng lúa cả 3 vụ đều được mùa, đạt hơn 43,7 triệu tấn, diện tích gieo cấy lúa cả năm ước đạt 7.753,2 nghìn ha. Bên cạnh đó, theo đánh giá chung thì diễn biến sâu bệnh trên các vùng trong cả nước tuy xảy ra nhiều nhưng không phức tạp như những năm trước, mức độ gây hại của một số sâu bệnh nguy hiểm như bệnh lùn sọc đen, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá đều tăng, trong đó đáng chú ý nhất là bệnh đạo ôn lá: Diện tích nhiễm bệnh 294.130 ha, tăng 21% so với năm 2011, diện tích nhiễm nặng 11,4 nghìn ha, tăng 118% so với năm 2011, diện tích mất trắng 8 ha. Đạo ôn hay còn gọi là bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra đang là vấn đề lớn cho các quốc gia trồng lúa trên thế giới. Chúng thường xuất hiện ở các quốc gia có khí hậu nóng ẩm và có thể tấn công vào tất cả các phần trên cây lúa. Ở Việt Nam, bệnh xuất hiện cả 2 vụ lúa đông xuân, hè thu và xuất hiện ở hầu khắp các tỉnh thành. Hiện nay biện pháp phòng trừ bệnh đạo ôn đang được sử dụng phổ biến là dùng các loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV). Việc sử dụng hoá chất BVTV nhằm tăng sản lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại rất đa dạng. Mỗi năm, Việt Nam sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa học diệt sâu bệnh. Theo thống kê cho đến năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hoá chất với 1231 tên thương phẩm và phải nhập tới 166 triệu USD thuốc BVTV, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0%. Bên cạnh đó việc sử dụng liên tục thuốc BVTV dẫn đến việc kháng thuốc của các mầm bệnh, sinh ra nhiều mầm bệnh mới dưới áp lực của chọn lọc và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái. Do đó, việc hạn chế sử dụng hóa chất này đang là một vấn đề cấp bách và đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Mặt khác, cũng có nhiều nghiên cứu cải tiến giống lúa mới có tính kháng bệnh cao Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT được đưa vào sản xuất, nhưng hầu như tính kháng của các giống lúa này ít khi có hiệu quả kéo dài hơn 3 năm vì nấm dễ phát sinh nòi mới phá vỡ tính kháng. Vì vậy hạn chế sự phát tán và gây bệnh của nấm P.oryzae dựa vào khả năng đối kháng của các vi sinh vật đang là một lựa chọn của các nhà nghiên cứu, nhằm đưa ra một phương pháp tối ưu để phòng trừ bệnh đạo ôn hại lúa bằng các chế phẩm vi sinh vật. Một trong những nghiên cứu đó là sử dụng vi khuẩn đối kháng nấm bệnh hại lúa đã được phát triển sớm (Cao li-yong et al., 2003 và Lee at al., 2002). Mặt khác để bổ sung thêm và làm giàu nguồn vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh đạo ôn hại lúa, việc tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens có hoạt tính đối kháng nấm bệnh P.oryzae cao ở quy mô phòng thí nghiệm, để từ đó có thể nghiên cứu và đưa ra quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh đạo ôn ở lúa có hiệu quả cao nhất. 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập các dòng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas flourescens từ vùng đất rễ lúa có khả năng đối kháng với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Bệnh đạo ôn 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu và phân bố của bệnh Bệnh đạo ôn hay còn gọi là bệnh cháy lá (Rice blast disease) là một dịch hại nguy hiểm và phổ biến trên cây lúa. Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae là một trong những bệnh hại nghiêm trọng ở các nước trồng lúa trên thế giới (Ou, 1985). Bệnh chính thức được phát hiện ở Italia vào năm 1560 sau đó bệnh được quan sát thấy ở các nước Châu Á như Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Ấn Độ năm 1913, các nước Trung Á, Tây Á, ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, quần đảo Antin, ở Châu Âu như: Yas, Bungari, Rumani, Bồ Đào Nha, Liên Xô,… Đến nay, bệnh đạo ôn là một trong những bệnh hại trên cây lúa có lịch sử xuất hiện rất lâu đời. Đây là loại bệnh phổ biến, phạm vi phân bố rộng, chúng xuất hiện gây hại trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới bao gồm Châu Á, Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Phi,…Đã có rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về loại bệnh này. Tại Việt Nam bệnh đạo ôn được biết đến từ lâu với tên gọi là bệnh tiêm lụi hay bệnh cháy lá lúa. Vincens (1921) đã thấy bệnh xuất hiện trên lúa ở các tỉnh phía Nam. Ngoài ra, cũng đã thấy bệnh xuất hiện ở các tỉnh phía Bắc (Roger, 1951). Tại đồng bằng sông Cửu Long hằng năm thường có hai cao điểm của bệnh vào các tháng 11-12 và tháng 5-6 dương lịch. Các tỉnh Tiền Giang, An Giang và Cần thơ là những nơi thường có bệnh. 2.1.2. Tác hại Bệnh đạo ôn được coi là một trong những bệnh chính gây hại nghiêm trọng đối với sự sinh trưởng, năng suất và chất lượng lúa. Bệnh phân bố ở hầu hết các nước trồng lúa và có thể gây thành dịch trong những điều kiện thuận lợi ở nhiều quốc gia. Mức độ thiệt hại năng suất lúa do bệnh đạo ôn gây ra đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Khi lúa bị đạo ôn cổ bông 1% thì năng suất có thể giảm từ 0,7 - 17,4 % tùy thuộc vào nhiều nhân tố có liên quan khác (Padmandha, 1965). Ở Liên Xô, trong các thí nghiệm xác định tác hại của bệnh đạo ôn (Potkin, 1983) cũng thấy, ở các mức độ bị bệnh với chỉ số cấp bệnh 10%, 25%, 33%, 42%, 63%, 75%,100%, đã làm giảm năng suất ở mức độ 0 - 22% đối với dạng đạo ôn lá, từ 0 - 64% đối với đạo ôn đốt thân, từ 078 % đối với đạo ôn cổ bông. Ở Nhật Bản từ năm 1953 - 1960, hàng năm thiệt hại bình quân 2,89% tổng sản lượng lúa, mặc dù đã có sự nỗ lực sử dụng thuốc hóa học trong Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT việc phun để phòng trị bệnh. Năm 1988, dịch bệnh đạo ôn gây thiệt hại nặng ở vùng duyên hải phía Bắc Nhật Bản, tổng sản lượng lúa bị thiệt hại của quận Fukushima là 24%, có những nơi thiệt hại lên tới 90%. Ở Philippin năm 1962-1963, năng suất lúa bị giảm do bệnh đạo ôn gây ra ước tính là 90% ở một số nơi, từ 50% -60% ở tỉnh Bicol và tỉnh Leyte. Ở Nam Triều Tiên năm 1989 cũng có báo thiệt hại về sản lượng lúa do bệnh đạo gây ra là 4,2% năm 1978 và 3,9% năm 1980 (Vũ Triệu Mân, 2007). Tại Việt Nam năm 1956, người ta phát hiện ở một trong các khu vực lúa của nông trường Đồng Giao bệnh đạo ôn bột phát làm chết lụi 200 ha lúa và sau đó bệnh gây hại nhiều ở các khu vực khác. Có thể nói những năm 1956 -1962 là thời kỳ bệnh đạo ôn phát sinh thành dịch ở miền Bắc nước ta, từ năm 1976 đến nay bệnh đạo ôn đã gây thành dịch hại ở nhiều vùng trọng điểm thâm canh lúa thuộc Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long, các tỉnh duyên hải miền Trung và cả Tây Nguyên, một số vùng trung du miền núi phía bắc trên các giống lúa mẫn cảm.Vụ đông xuân năm 1979, có trên 15.000 ha lúa bị nhiễm đạo ôn. Vụ xuân năm 1982 có trên 80.000 ha lúa bị nhiễm đạo ôn, vụ chiêm xuân năm 1985 có trên 160.000 ha lúa bị nhiễm bệnh đạo ôn, vụ xuân năm 1997 có trên 150.000 ha lúa bị nhiễm đạo ôn. Năm 2001 bệnh đạo ôn lá là 336.370 ha chiếm khoảng 4,56% diện tích gieo cấy, trong đó diện tích nhiễm nặng 1à 5.790 ha, diện tích bị lụi là 62,4 ha. Năm 2007, cả nước có 188.711 ha lúa bị nhiễm đạo ôn lá trong đó có 10.312 ha bị nhiễm nặng. Diện tích bị nhiễm đạo ôn cổ bông là 39.552 ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 1.350 ha và diện tích bị giảm năng suất trên 70% là 33 ha. Như vậy, ta thấy các đợt dịch đạo ôn có xu hướng gây hại ngày càng tăng mạnh trên quy mô diện tích ngày càng lớn (Nguyễn Văn Hoan et al., 2007). 2.1.3. Triệu chứng Bệnh đạo ôn có thể gây hại trên tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Theo Peresipkin (1974), triệu chứng bệnh được chia làm ba dạng là đạo ôn lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông. Theo Reissig et al., (1985) căn cứ vào tính chất và vị trí bộ phận bị nhiễm chia bệnh làm 4 dạng là đạo ôn lá, đạo ôn cổ lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông. Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 a b Trường ĐHCT c d e Hình 1. Một số triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa a. Đạo ôn lá, b. Đạo ôn cổ lá, c. Đạo ôn cổ bông, d. Đạo ôn đốt thân, e. Đạo ôn hạt (* Nguồn: http://thuocdietcontrung.net.vn/vi/Thong-tin-san-pham.aspx?id=37&idn=2015, ngày 20/7/2013) Đạo ôn lá và cổ lá Trên lá, đặc điểm của vết bệnh có thể thay đổi theo tuổi cây, điều kiện thời tiết và tính nhiễm của giống. - Trên các giống nhiễm, vết bệnh ban đầu chỉ là đốm úng nước, nhỏ, màu xám xanh. Vết bệnh sau đó lan ra, tạo vết bệnh to, hình thoi, màu nâu nhạt, có khi có quầng màu vàng nhạt, phần giữa vết bệnh có màu tro xám. Kích thước vết bệnh (1-1,5 cm x 0,3-0,5 cm). Trong điều kiện ẩm ướt, dinh dưỡng đạm quá nhiều, các giống nhiễm xuất hiện vết bệnh cấp tính hình tròn hay hình bầu dục, nâu xanh tái do đài và bào tử nấm xuất hiện trên đó, dạng thấm nước về sau trở thành dạng mãn tính điển hình (Vũ Triệu Mân, 2007). - Trên các giống kháng, vết bệnh là những chấm nhỏ hình dạng không đặc trưng. Tùy thuộc vào mức độ kháng của giống lúa mà vết bệnh có kích thước khác nhau: trên giống kháng mạnh, vết bệnh là những đốm nâu nhỏ có kích thước từ bằng đầu kim đến 1-2 mm; ở các giống kháng vừa, vết bệnh có hình tròn hay trứng, tâm sáng trắng, viền nâu, kích thước 2-3mm. Nhiễm nặng và sớm lúa có thể bị lùn, nhiều vết bệnh trên lá liên kết với nhau làm cháy lá (Nguyễn Văn Hòa, 2007). Đạo ôn đốt thân Lúc đầu là một đốm nhỏ màu nâu sau lớn rộng ra thành một vành tròn bao quanh đốt thân làm cho thân lõm tóp lại, màu đen. Khi trời mưa ẩm thân mềm nhũn dễ bị gãy gập khi gặp mưa giông gió (Nguyễn Văn Hòa et al., 2007). Đạo ôn cổ bông và gié lúa Trên cổ bông, gié lúa vết bệnh ban đầu là những đốm nhỏ, sau lan ra theo chiều dài làm cả đoạn cổ bông có màu nâu xám, khô tóp. Nếu nhiễm bệnh sớm (ngay sau trổ) làm cho toàn bộ bông lúa bị lép trắng, nhiễm bệnh muộn (vào thời kì làm hạt chín) gây Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT ra hiện tượng bông lúa nhỏ, có nhiều hạt lép lửng, dễ gãy, gié lúa dễ rụng dẫn đến làm giảm năng suất lúa (Lê Lương Tề, 2007). Đạo ôn hạt Vết bệnh gây hại trên hạt không đồng nhất về hình dạng như trên lá lúa mà có dạng đốm tròn hoặc không định hình, có màu nâu đen hoặc xám. Nấm ký sinh ở vỏ trấu và có thể ở bên trong hạt. Hạt giống bị nhiễm bệnh là nguồn bệnh lây truyền từ vụ này sang vụ khác. Trên bề mặt vết bệnh ở các bộ phận lá, đốt thân, cổ bông đều có thể hình thành bào tử trông như lớp mốc xám (Lê Lương Tề, 2007). 2.2. Nguyên nhân gây bệnh và sinh thái bệnh 2.2.1. Nguyên nhân gây bệnh Phân loại - Giai đoạn vô tính: Pyricularia oryzae Cav. et. Bri (còn gọi là Pyricularia grisea) thuộc họ Moniliacea, bộ Miniiales - lớp nấm bất toàn. - Giai đoạn hữu tính: Magnaportha grisea thuộc lớp nấm túi (thường không có ngoài tự nhiên). Hình thái Cành bào tử thường mọc thành chùm ở khí khổng, có 2- 4 vách ngăn ngang, phần chân hơi phồng to và nhỏ dần về phía ngọn, có màu xanh hơi vàng hay màu xám nâu, nhạt màu dần về phía ngọn, mang một hay nhiều bào tử (1-20). Trên mỗi cành hình thành 3- 10 bào tử phân sinh. Bào tử phân sinh có hình quả lê, 2 vách ngăn ngang có khi 1-3 vách ngăn, không có màu hay có màu xanh nhạt 19-23 µm. Bào tử thường nảy mầm ở tế bào đầu hay gốc và tạo đĩa bám. Trong mỗi tế bào của khuẩn ty hay bào tử có thể có một hay nhiều nhân, đa số là đơn nhân và chứa 2-6 nhiễm sắc thể. Hình 2. Nấm Pyricularia oryzae (*Nguồn:http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/LabExercises/Pages/Cytology.aspx ,ngày 20/07/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính và được gọi tên là Magnaporthe grisea (Heber, 1980). Quả nang bầu có thể tạo đơn hay thành cụm, mọc chìm trong mô cây, có màu nâu sậm đến đen, đường kính phần chân của quả nang là 30-600µm (trung bình 180 µm), có các gai đệm dài bên trong. Nang hình trụ vách dày, 8,5-70µm. Nang bào tử trong suốt, hình liềm và có 3 vách ngăn. 2.2.2. Sinh học bệnh Khuẩn ty phát triển và sinh bào tử tốt nhất ở nhiệt độ 28°C. Ở nhiệt độ này bào tử sinh sản nhanh và giảm dần sau 9 ngày, trong khi nếu ở nhiệt độ 16oC, 20oC, 24°C bào tử chậm được sinh ra nhưng có chiều hướng gia tăng ngay cả sau 15 ngày. Trong nước nóng 50°C trong 13-15 phút bào tử nấm sẽ chết, nhưng nếu trong không khí khô ở 60°C, bào tử có thể sống đến 30 giờ. Bào tử nẩy mầm tốt nhất ở 25-28°C. Trên mặt vết bệnh, bào tử chỉ được tạo ra khi ẩm độ không khí từ 93% trở lên, ẩm độ càng cao thì tốc độ sinh sản càng nhanh. Bào tử nẩy mầm khi có lớp nước tự do hay ẩm độ không khí bão hòa. Trên bề mặt nước, 80% lượng bào tử có thể nẩy mầm được và sau 24 giờ có khả năng sinh sản được. Khuẩn ty phát triển tốt khi ẩm độ không khí đạt 93 %, cao hơn hay thấp hơn thì khuẩn ty sẽ phát triển kém. Để sinh bào tử, nấm cần có sự chiếu sáng và tối xen kẽ. Bào tử được sinh chủ yếu là vào ban đêm ngay khi trời vừa tối và đạt cao điểm trong 1-2 giờ, rồi sau đó giảm dần và ngừng hẳn khi trời sáng. Ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự mọc mầm và phát triển ống mầm của bào tử (Đỗ Tấn Dũng, 2005). Nấm sẽ phát triển tốt trên môi trường tổng hợp nếu có thêm nước trích rơm lúa, có lẽ nhờ sự hiện diện của các chất như biotin, thiamine, các malic acid, citric acid, glutamic acid, aspartic acid cùng các nguyên tố vi lượng như manganese, zinc, molybdenum. Khả năng sử dụng carbon trong các hợp chất thay đổi tùy theo chủng nấm; nói chung acid hữu cơ thì không thích hợp, thích hợp nhất là maltose, sucrose, glucose, insulin và mannitol. Nấm sử dụng thích hợp nhất là đạm ở dạng KNO3 và NaNO3, dinh dưỡng có ảnh hưởng đến việc sinh sản bào tử của nấm. Trong cây bệnh hay trong môi trường nuôi cấy, người ta trích được hai loại độc tố: alpha-picolinic acid (C6H5NO2) và một chất khác được gọi tên là piricularin (C18H14N2O3). Nếu bôi piricularin lên một vết thương cơ học trên lá lúa, sẽ tạo một đốm cháy giống như vết bệnh cháy lá. Piricularin còn làm cây bệnh, tập trung coumarin và làm cây lúa bị lùn. Piricularin bị chlorogenic acid và ferulic acid làm mất độc tính. Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ngoài ra, nấm còn tạo ra hai loại độc tố khác là pyricucol và tenuazonic acid. Ngoài độc tố, nấm còn tạo ra riboflvin, panthothenic acid, vitamin B6 và folic acid. Nấm ít tiết phân hóa tố phân giải amylose (amylase) nên khả năng phân giải pectin kém nhưng nấm có tiết các phân hóa tố phân giải cellulose (cellulase) như beta-glucosidase (Lê Lương Tề, 2007). Nấm gây bệnh đạo ôn là nấm rất dễ biến dị, có khả năng tạo ra rất nhiều nòi gây bệnh. Giữa các địa phương khác nhau hay giữa các mùa vụ trong cùng một địa phương, do có sự khác nhau về giống canh tác, điều kiện môi trường... nòi gây bệnh cũng sẽ khác nhau. Hơn nữa, từ một vết bệnh hay thậm chí từ một bào tử phân sinh, khi nuôi cấy thì ở các thế hệ sau người ta thấy nấm lại là hỗn hợp nhiều nòi gây bệnh khác nhau. Có nhiều nguyên nhân làm nấm thay đổi độc tính gây bệnh (nòi gây bệnh) (Lê Lương Tề, 2007). 2.3. Sinh thái bệnh. 2.3.1. Điều kiện thời tiết Bệnh đạo ôn có thể phát sinh gây hại với các mức độ khác nhau, trên các mùa vụ khác nhau. Riêng ở các tỉnh miền Bắc bệnh phát sinh gây hại ở các vụ lúa chiêm xuân thường lớn hơn trong vụ mùa. Trên vụ lúa chiêm xuân, bệnh thường xuất hiện trên tháng 1, tháng 2 trên mạ chiêm, đầu tháng 3 bệnh xuất hiện cục bộ trên lúa xuân đẻ nhánh. Từ giữa tháng 3 đến tháng 5, bệnh thường phát sinh gây hại mạnh trên diện rộng. Trên các trà lúa mùa, bệnh phát sinh vào thời kì lúa trổ trở đi từ tháng 10 đến tháng 11. Điều đó chứng tỏ bệnh đạo ôn phát sinh theo qui luật chung trong những tháng có nhiều ngày liên tiếp bảo đảm nhiệt độ 18- 25oC, ẩm độ cao trên 90% mưa lai rai, số giờ nắng ít (nhỏ hơn 2h/ngày). Theo kết quả nghiên cứu ở Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long, mật độ bào tử bắt được trong bẫy tỷ lệ với ẩm độ không khí. Sự phát tán của các bào tử nấm Pyricularia oryzae mạnh nhất trong các tháng 8, 9, 11. Lượng mưa trong các tháng ở mùa mưa tỷ lệ thuận với sự nhiễm bệnh của các cây kí chủ. Gió làm tăng tính nhiễm của cây. Trời mát thích hợp cho sự phát triển vết bệnh ở giai đoạn đầu, nhưng giai đoạn sau thì sự phát triển của vết bệnh sẽ được kích thích nếu có một ít nắng. Khi không có đủ sáng do mây mù, lá lúa sẽ tập trung nhiều asparagine, glutamine và nhiều amino acid khác nên sẽ tăng tính nhiễm của cây. Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.2. Đất đai, phân bón Những chân ruộng nhiều mùn, trũng, khó thoát nước, những vùng đất mới vỡ hoang, đất có kết cấu nhẹ, giữ nước kém, khô hạn và những chân ruộng có lớp đất sét nông là điều kiện rất thuận lợi cho nấm bệnh đạo ôn phát triển. Phân bón cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Nếu bón phân không hợp lý, bệnh vẫn phát sinh gây hại trong những điều kiện thời tiết không thuận lợi cho nấm bệnh phát triển. Bón quá thừa như phân ammonium sulfate, sẽ có ảnh hưởng nghiêm trọng hơn là bón nhiều lần. Bón quá trễ hay bón khi nhiệt độ quá thấp trong giai đoạn phát triển đầu của lúa cũng có ảnh hưởng nhiều. Đất có khả năng giữ phân kém (đất cát) cũng bị ảnh hưởng nhiều hơn đất có khả năng giữ phân tốt (đất sét). Bón phân lên lá cũng làm bệnh phát triển mạnh hơn. 2.3.3. Giống Ngoài các yếu tố khí hậu thời tiết ở đất đai, phân bón, đặc tính của giống có ảnh hưởng rất lớn tới mức độ phát triển của bệnh trên đồng ruộng. Những giống nhiễm bệnh nặng (mẫn cảm) không những là điểm bệnh phát sinh ban đầu mà còn là điều kiện cho bệnh dễ dàng lây lan hàng loạt hình thành nên dịch bệnh trên đồng ruộng. Tính chống bệnh của cây lúa tăng khi tỷ lệ SiO2/N tăng (Sakomoto, 1993). Giống lúa chống bệnh chứa nhiều polyphenol hơn ở giống nhiễm bệnh (Wakimoto và Yoshii, 1958). Trong giống lúa chống bệnh sẽ sản sinh ra lượng lớn hợp chất Fytoaclexin có tác dụng ngăn cản sự phát triển của nấm trong cây. Tính chống bệnh của cây lúa do 23 gen kháng đạo ôn đã được phát hiện và đồng thời còn phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo của giống, nhìn chung các giống lúa đẻ nhánh tập trung, cứng cây, chịu phân, tỷ số khối lượng thân trên khối lượng 20 cm gốc nhỏ, ống rơm dày, lá cứng, có tầng cutin dày là những giống thể hiện khả năng chống chịu bệnh tốt. Nhiều giống lúa đã được khảo nghiệm và đánh giá là những giống có năng suất cao và chống chịu bệnh đạo ôn như IR1820, IR17494, C71, RSP13, Xuân số 2, Xuân số 5,...và đã được gieo cấy rộng rãi ở miền Trung và vùng Đồng bằng Sông Hồng trước đây. Đến nay một số giống đã mất khả năng chống bệnh với một số chủng nòi đạo ôn mới xuất hiện. Một số giống lúa nếp hoặc NN8, CR203, một số giống lúa thuần,…là giống mẫn cảm bệnh đạo ôn (Vũ Triệu Mân, 2007). 2.3.4. Biện pháp phòng chống Dự tính dự báo Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Muốn phòng trị bệnh có hiệu quả cao, cần phải có biện pháp dự báo tốt. Nghiên cứu của Refaci (1977), trong điều kiện của Philippines, cho thấy số giờ mưa, ẩm độ không khí trung bình vào ban ngày, nhiệt độ trung bình của ngày và đêm không có tương quan với số vết bệnh trên cây, chỉ có nhiệt độ trung bình vào ban đêm, mật số bào tử trong không khí, số giờ có sương mù là có ảnh hưởng đến mức độ bệnh trên cây. Cũng có thể dự báo bệnh bằng ruộng dự báo. Các giống trồng chủ lực của một địa phương được gieo trong các lô 1 m2 ở trung tâm khu vực muốn dự báo. Trên các lô này bón phân đạm hơi cao hơn trong thực tế sản xuất tại địa phương và có thể gieo sớm hơn ruộng sản xuất 7-10 ngày. Theo dõi bệnh xuất hiện trên các lô này, từ đó có thể dự báo cho các khu vực có trồng cùng giống đã bị nhiễm trong khu dự báo (Phạm Văn Kim, 2003). Biện pháp phòng trừ khác - Đối với những vùng thường xảy ra dịch bệnh đạo ôn cần phải quan tâm tiêu huỷ những tàn dư thực vật sau khi thu hoạch lúa: Cày lật gốc rạ, bón vôi, xử lí đất, dọn sạch bờ mương trước khi xuống vụ. - Xử lý hạt giống bằng 3 sôi 2 lạnh (54oC) trong 10 phút hoặc xử lý bằng các loại thuốc hoá học như Sulfat đồng (CuSO4), Carbenzim,… - Khi lúa đã bị bệnh cần ngừng ngay việc bón phân đạm, phân kali; phun thuốc kịp thời bằng các loại thuốc hoá học như Fujione, Baem,...Cần lưu ý là phải phun đúng nồng độ ghi trên nhãn thuốc, phun đủ liều lượng mỗi sào 500m2 thì phun 16-20 lít nước pha thuốc; phun lần 2 cách nhau 5-10 ngày tuỳ theo tình hình. - Đối với những ruộng đã bị bệnh đạo ôn trên lá cần phải phun thuốc phòng bệnh đạo ôn cổ bông trước và sau khi trổ, nên phun vào lúc chiều tối để khỏi ảnh hưởng đến việc trổ bông. 2.4. Vi sinh vật đối kháng 2.4.1. Những nghiên cứu trong nước Hiện nay, tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng sử dụng vi sinh vật đối kháng như: Một số chủng vi khuẩn đối kháng như Burkholderia, Pseudomonas, Bacillus đã và đang được quan tâm nghiên cứu tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme – Viện Công nghệ sinh học, vì chúng tổng hợp một số chất ngoại bào với khả năng ức chế sự nẩy Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT mầm và phát triển của nấm bệnh F.oxysporum và R.solani gây ra các triệu chứng thối đen rễ, lở cổ rễ, thối gốc thân, thối thân, khô vằn, thối lá trên cây cà chua. Vi khuẩn đối kháng Bacillus, Burkholderia và Pseudomonas được phân lập từ đất, rễ cây, có khả năng kiểm soát hiệu quả đối với nấm Pythium, R. solani và F. oxysporum… gây bệnh thối rễ, thối thân ở cây đậu tương, cây đỗ, rau diếp, cây trạng nguyên, cây khoai tây. Ngoài ra, nhiều nhóm chuyên gia trong nước đã và đang nghiên cứu về khả năng phòng trừ bệnh trên cây như Nguyễn Thị Thu Nga và Phạm Văn Kim (2003) đã có khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17 đối với nấm Rhizoctonia solani gây bệnh đốm vằn trên lúa, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng trường Đại học Cần Thơ đã đưa ra chế phẩm sinh học Biobac có khả năng phòng trừ bệnh trên lúa là đốm vằn, hay nghiên cứu khả năng gây hại của các chủng Erwinia carotovora trên cải bắp và bước đầu sử dụng vi khuẩn vùng rễ để phòng trị bệnh (Phạm Thị Thắm, 2012). Ngoài ra, theo Phạm Văn Dư (2004), hiện nay phòng trừ sinh học đối với một số bệnh có nguồn gốc từ đất bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng đã gặt hái được nhiều thành công đáng kể trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng. 2.4.2. Những nghiên cứu ngoài nước Ngày nay, nhiều dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với các mầm bệnh trên cây lúa được tìm thấy và ứng dụng hiệu quả, chủ yếu là các dòng vi khuẩn Pseudomonas và Bacillus. Bảng 1. Các chủng vi khuẩn đối kháng với các mầm bệnh chính trên cây lúa Bệnh lúa Mầm bệnh Đạo ôn Pyricularia oryzae Chủng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens (Blast) Bacillus spp. B. polymyxa B. pumulus B. coagulans Enterobacter agglomerans Đốm vằn Rhizoctonia solani P. fluorescens (Sheath blight) P. putida Bacillus megaterium B. polymyxa B. pumulus Enterobacter agglomerans Chuyên ngành Vi sinh vật học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Thối bẹ (Sheath-rot) Sarocladium oryzae P. fluorescens Bạc lá Xanthomonas oryzae B. lentus (Bacterial Blight) B. cereus B. circulans P. fluorescens (*Nguồn: Immanuel, 2006) Các nghiên cứu cho thấy cơ chế cơ bản và quan trọng nhất của sự đối kháng bởi vi khuẩn đối với mầm bệnh là do sản sinh ra các kháng sinh. Gnanamanickam (1989) và Mew (1992) đã phân lập hơn 400 dòng vi khuẩn từ các đồng lúa tại Viện nghiên cứu lúa quốc tế. Các dòng này có khả năng đối kháng với nấm M.grisea trong phòng thí nghiệm. Khả năng ngăn chặn sự phát triển của nấm M. grisea bởi dòng vi khuẩn P. fluorescens Pf7-14 được thể hiện trong hình 3. Sau đó tiến hành thí nghiệm ngoài đồng với các dòng đã tuyển chọn: 2 dòng Pseudomonas 4-15R và 7-14RN, 2 dòng Bacillus 4-03R và 33R. Thí nghiệm trên giống lúa UPLRi-5, hạt giống được áo dung dịch huyền phù vi khuẩn hoặc hóa chất kháng nấm pyroquilon (8g/kg hạt giống) trước khi sạ. Các dòng vi khuẩn hay pyroquilon được phun thêm vào 3 thời điểm 20, 30 và 40 ngày sau khi sạ. Kết quả được thể hiện trong bảng 2, cho thấy dòng Pseudomonas 4-15R và 7-14RN lần lượt làm giảm 59% và 47% bệnh cháy lá. Hai dòng Bacillus 4-03R và 33R làm giảm tỉ lệ mắc bệnh cháy lá 46% và 44%. Đối với bệnh đao ôn cổ bông, dòng Pseudomonas 7-14RN cho hiệu quả cao nhất. Sự ngăn chặn bệnh đạo ôn bởi dòng Pseudomonas 7-14 là do sản sinh ra kháng sinh kháng nấm phenazine-1-carboxylic acid (PCA) (Valasubramanian, 2004). Hình 3. Sự giới hạn phát triển khuẩn ty trên đĩa petri của nấm M. grisea bởi dòng P. fluorescens Pf7-14 (phải) và đối chứng không xử lý vi khuẩn (trái) (* Nguồn: Gnanamanickam và Mew, 1992) Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 2. Ảnh hƣởng của vi khuẩn đối kháng đến bệnh cháy lá và đạo ôn cổ bông trên giống lúa UPLRi-5 tại Philipin Nghiệm thức Bệnh cháy láa Bệnh đạo ôn cổ bôngb Bacillus 4-03R 3,3 3,0 Bacillus 33R 3,5 3,7 Pseudomonas 4-15R 2,6 3,0 Pseudomonas 7-14RN 3,3 2,8 Pyroquilon 2,0 3,7 Đối chứng 6,3 3,8 LSD (0,05) 2,2 1,8 (*Nguồn: Gnanamanickam và Mew, 1992) a Số vết thương bệnh cháy lá/ cm2 lá b Tỉ lệ bệnh đạo ôn cổ bông = n(1)+n(2)+......+n(9) x100, n là số chồi mắc bệnh Total theo thang điểm từ 1-9. Năm 2003, Yoshihiriro et al.,của Nhật Bản tiến hành nghiên cứu đặc tính đối kháng của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis IK1080. Trong các thí nghiệm ở phòng thí nghiệm, chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Pyricularia oryzae. Nghiên cứu trong nhà kính cho thấy khi áp dụng vi khuẩn này trên cây lúa 14 ngày tuổi đã làm giảm chiều dài vết thương trên lá do bệnh đạo ôn do chủng nấm bệnh Pyricularia oryzae. Một nghiên cứu khác, Kavitha et al., (2005) sử dụng chủng B.polymyxa VLB16 trong nghiên cứu sản xuất protein kháng nấm có khả năng ức chế sự tăng trưởng của nấm Pyricularia oryzae. Ở thí nghiệm ngoài đồng, VLB16 ngăn chặn 50% bệnh đạo ôn lúa. Các chủng Bacillus khác như B.pumilus, B. polymyxa, B. coagulans và Enterobacter cũng làm giảm tỉ lệ bệnh đạo ôn lúa trong các thí nghiệm ngoài đồng (Bảng 3). Chuyên ngành Vi sinh vật học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 3. Khả năng hạn chế bệnh đạo ôn bởi xử lý vi khuẩn trên giống lúa IR50 và CO39 trong các thí nghiệm ngoài đồng ở Ấn Độ. Kích thƣớc vòng giới hạn phát Phần trăm ngăn chặn bệnh triển nấm Pyricularia grisea (cm) đạo ôn Bacillus pumilus (IM3) 3,0 46,22 Bacillus polymyxa (KRU22) 4,4 53,30 Bacillus polymyxa (VLB16) 5,0 50,06 Bacillus coagulans (PD7) 3,4 46,02 2,4 56,09 Chủng vi khuẩn Enterobacter agglomerans(UPM18) (*Nguồn: Kavitha, 2002 và Kavitha et al., 2005) 2.5. Vi khuẩn Bacillus Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus (* Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus, ngày 11/06/2013) Hình 4. Vi khuẩn Bacillus subtilis (*Nguồn:http://www.astrobio.net/exclusive/3866/mutant-microbes-test-radiation-resistance,ngày 20/07/2013) Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí Chuyên ngành Vi sinh vật học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N. Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,...Một vài loài có thể lên men carbohydrate tạo thành glycerol và butanediol, một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC. Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 -10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase,..), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường,… Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: Bacillus subtilis Bacillus subtilis còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô. Chúng phân hủy pectin và polysacharide ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính acid ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 –5) x 0,6 µm. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi. Khuẩn lạc khô, không màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36–50oC, tối đa khoảng 60oC. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu Chuyên ngành Vi sinh vật học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT dục, kích thước 0,6–0,9µm, phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200-300 năm. Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B.subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) (Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007). Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “con thú lớn”. Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2–1,5) µm có thể đến 2 µm, dài từ 3–12 µm, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen). Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1) µm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 µm. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự B.subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp. Bacillus cereus Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí,…Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính và gây ngộ độc thực phẩm. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1–1,5) x (3 –5) µm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 –1,5) µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm. Chuyên ngành Vi sinh vật học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 –1) x (2 –7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7–2,6) µm, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysacharide trong cây. Ngoài ra, chúng còn có khả năng cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược. Bacillus brevis Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm. Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc. Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7–1) x (3–5) µm. Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ (0,8–1) µm, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên. Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu một hỗn hợp acid amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin. Bacillus simplex Khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với bề mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường. Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2–5) x 0,6 µm, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 µm, nằm lệch tâm. Bacillus lincheniformis Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D–glutamate và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác. Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT bacitracin, một kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược . 2.6. Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Pseudomonas Loài: Pseudomonas fluorescens (*Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas, ngày 11/06/2013) Trong số các loài Pseudomonas spp., P.fluorescens là được chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể et al., 2005). Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram âm, có đơn hoặc nhiều chiên mao, sống hiếu khí bắt buộc nhưng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào. Chúng có cơ chế trao đổi chất cực kì linh hoạt giúp chúng sống được cả trong đất và trong nước. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25-30oC. Chúng có trắc nghiệm dương tính với oxidase. Một số dòng Pseudomonas fluorescens (chẳng hạn như CHAO hay Pf-5) có những đặc tính kiểm soát sinh học, giúp bảo vệ vùng rễ một số loài thực vật chống lại nấm kí sinh như Fusarium, Pyricularia hay Pythium. Đến nay, người ta vẫn chưa biết được chính xác cơ chế kiểm soát sinh học của Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết được đưa ra như sau: thứ nhất người ta cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự. Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe. Và cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn như các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide. Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 5. Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (*Nguồn:http://www.quorumtech.com/image-gallery/low-angle-rotary-shadowing-images,ngày 20/07/2013) Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Ở Việt Nam hiện nay cũng có những báo cáo về sử dụng biên pháp sinh học để phòng trừ bệnh đạo ôn. Năm 2005, Nguyễn Trọng Thể et al., đã phân lập được những dòng Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng với một vài nấm bệnh và xác định kháng sinh được sinh ra bởi chủng vi khuẩn này là 2,4-diacetylphlorocinol. Nguyễn Tuyết Nhung (2006), đã nghiên cứu tính đối kháng của 7 dòng vi khuẩn Pseudomonas, kết quả các dòng vi khuẩn này có khả năng sản sinh siderophore, cyanide và protease nội bào giúp đối kháng với một số loại nấm bệnh. Những chủng vi khuẩn ở vùng rễ trong đó có loài Pseudomonas fluorescens đối kháng mạnh với Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectium, Fusarium oxysporum f. sp.cubense, Rhizoctonia solani, Sclerotium (corticium) rolfsii, Sarocladium oryzae và Aspergilus flavus và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. Citri và Xanthomonas campestris pv. oryzae. Các thí nghiệm tiếp theo cũng sử dụng nguồn vi khuẩn này trong phòng trừ sinh học hiệu quả đối với bệnh thối bẹ lá, bệnh thối thân đậu phộng, nâng cao sự phát triển cây trồng và tăng năng suất (Sakthivel, 1986). Còn vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dòng HV37a được chứng minh rằng sinh ra ít nhất ba loại kháng sinh ức chế phát triển của nấm Pythium ulimun, được dùng phòng trừ bệnh héo cây con trên cây bông vải do nấm Pythium ulimun gây ra (Gutter Son, 1986). Sivamani et al, (1987) cho rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể được dùng như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây bệnh héo moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. oryzae gây bệnh cháy lá lúa. Lamber et al., (1987) đã phân lập Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas cepacia, Seratia liquefacien và Bacillus sp. có hoạt tính chống nấm phổ rộng từ cây bắp, lúa Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT mạch và xà lách xoong. Nghiên cứu sự đối kháng giữa vi khuẩn và nấm đối với mầm bệnh héo rũ dưa leo (Jee et al., 1988). Những chủng chính đã được chọn lọc là Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida và Seratia sp. và Giocladium sp., Trichoderma harzianum và Trichoderma viride. Trong môi trường bán đặc, vi khuẩn đối kháng đã ức chế sự nảy mầm của bào tử Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium từ 26-45%, Pseudomonas fluorescens là vi khuẩn có tính kìm hãm mạnh nhất. Theo Alstrom và Burn (1989) chỉ ra rằng cyanide sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể kìm hãm sự phát triển cây trồng, ngăn cản sự phát triển rễ rau diếp (Latuca sativa). Cùng năm đó, Devi et al., nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng Pseudomonas flurescens có huỳnh quang và không có huỳnh quang được phân lập ở vùng rễ lúa ở miền nam Ấn Độ đối kháng tốt với nấm Rhizoctonia solani được đánh giá là biện pháp sinh học dùng để đối phó với bệnh đốm vằn. Còn Gnanamanickcam et al., (1992) cho rằng những nhóm vi khuẩn đối kháng huỳnh quang và không huỳnh quang được quan sát ở Ấn Độ trong ống nghiệm đã kìm hãm nấm Rhizoctonia solani vì chúng mang gen chitinase đã mã hóa làm chitin hóa vách tế bào sợi nấm. Nhiều dòng của vi khuẩn có hiệu quả kìm hãm sự phát triển của khuẩn ty, làm ảnh hưởng đến sự sống sót của hạch nấm bảo vệ cây trồng tránh sự xâm nhiễm của nấm bệnh. Trong số các loài Pseudomonas spp, Pseudomonas flurescens là được nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loài nấm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng. Tác động đối kháng của vi khuẩn được xác nhận do chất kháng khuẩn pyrrolnitrin. Những nghiệm thức xử lý vi khuẩn có khả năng giảm ảnh hưởng bệnh nhưng không có ý nghĩa là gia tăng năng suất. Còn Rindran và Vidhyaekaran (1995) cho rằng những nòi vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, được phân lập từ vùng rễ, có sắc tố phát huỳnh quang vàng- xanh lục cũng kìm hãm sự phát triển của Rhizoctonia solani. Một trong những dòng có hiệu quả nhất là PfAIR2, phân lập trên than bùn được dùng để xử lý hạt, xử lý rễ, rải vào đất và phun lên lá. Từng nghiệm thức riêng lẻ đã kiểm soát bệnh có hiệu quả. Tuy nhiên, sự kết hợp của 4 cách dẫn đến hiệu quả phòng trừ tốt nhất trong nhà lưới. Trên đồng ruộng, sử dụng PfAIR2 phòng trừ bệnh có hiệu quả, gia tăng năng suất và có thể so sánh với cá loại thuốc trừ nấm thông dụng như Carbendazim. Abdelzaher và Elnaghy (1998) cho biết bệnh thối rễ cây bông vải do nấm Pythium carolinianum ở Ai Cập đã được kiểm soát bởi sử dụng vi khuẩn đối kháng Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Pseudomonas fluorescens. Vi khuẩn đối kháng với nấm cao trong thí nghiệm trên đĩa petri và hạn chế được bệnh khi áp dụng trong đất. Hiệu quả kiểm soát cao khi trộn vi khuẩn vào đất hơn là chủng vi khuẩn vào vùng rễ cây con trước khi trồng. Tác động đối kháng do sự cạnh tranh về dinh dưỡng, siderophores, những chất có đặc tính kháng khuẩn– HCN, Mavrodi et al., (2000) nói rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens tạo ra DAPG chống lại bệnh chết cây con do nấm nhiễm trong đất gây ra và đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế bệnh chết cây do nấm Gaeumannomyces graminis var. tritici. Hợp chất này được kiểm soát bởi gen PhlD, một gen rất biến đổi về hóa cấu trúc. Các hình thức xử lý vi khuẩn đối kháng bằng cách khử hạt giống, ngâm rễ cây con bằng dịch vi khuẩn hoặc tưới dịch vi khuẩn vào đất cần được chú ý. Kết hợp nhiều dòng vi khuẩn với nhau kết quả sẽ tốt hơn là sử dụng một dòng vi khuẩn, đề nghị này được quan tâm và có hiệu quả trong phòng trừ sinh học (Mew et al., 1998). Trong những năm gần đây khi bệnh đạo ôn trên lúa phát triển mạnh thì một số nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng khác đã được thực hiện và nhận thấy một số dòng Pseudomonas fluorescen có khả năng đối kháng với nấm Pyricularia oryzae. Cho thấy khi vi khuẩn hình thành khuẩn lạc đã đẩy lùi sự phát triển của nấm, thể hiện tính kháng nấm của vi khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian Từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2013. 3.2. Địa điểm Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. 3.3. Phƣơng tiện 3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm nuôi cấy Dụng cụ thí nghiệm Ống nghiệm, đĩa Petri, kim cấy, bình tam giác, cốc thuỷ tinh, ống thủy tinh, bộ micropipet Gibson, đèn cồn, đầu côn xanh, vàng, kim mũi giáo, lamelle và một số dụng cụ khác… Thiết bị thí nghiệm Tủ cấy vô trùng Esco, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức), tủ ủ vi sinh vật, kính hiển vi Olympus CHT, máy lắc mẫu, nồi khử trùng nhiệt ướt, pH kế Orion 420A, cân điện tử Sartorius, máy khuấy từ HB50 BIBBY và một số thiết bị khác,… 3.3.2. Vật liệu Mẫu nấm Pyricularia oryzae của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long được bảo quản trong tủ lạnh, 10 mẫu đất lấy từ vùng đất rễ cây lúa tại hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ. 3.3.3. Hóa chất - Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) để cấy chuyển nấm (Phụ lục 1) - Môi trường Nutrient Agar (NA) để phân lập vi khuẩn Bacillus (Phụ lục 1) - Môi trường King „B để phân lập vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (Phụ lục 1) - Môi trường Nutrate Broth (NB) để thử nghiệm nitratase (Phụ lục 1) - Hóa chất dùng để khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus: H2O2 3%, tinh bột, nước muối,... - Hóa chất dùng để khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens: Acid sulfanilic, acid acetic, N- naphthylethylenediamine,.. Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - Hoá chất dùng để quan sát sự chuyển động và nhuộm Gram vi khuẩn: Nước cất khử trùng, amonium oxalate, iodide, fucshin, Crystal violet, cồn 70%, cồn 96% và các hóa chất cần thiết khác. 3.4. Phƣơng pháp 3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens từ vùng đất của rễ lúa a) Thu mẫu đất trên ruộng lúa tại hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ Các mẫu đất được thu từ các ruộng lúa không bị bệnh đạo ôn khi cây lúa được 4045 ngày. Mỗi mẫu đất được thu tại 5 vị trí trên hai đường chéo của ruộng; 4 vị trí ở 4 góc ruộng, 1 vị trí tại giao điểm hai đường chéo. Đất được cho vào túi nilon có gòn thấm nước để giữ ẩm, ghi thông tin về mẫu như mã số, địa chỉ thu mẫu,... Mẫu được giữ ở nhiệt độ 4-8oC và được phân lập trong 24 giờ. Theo sơ đồ sau: b) Phân lập và tách ròng vi khuẩn vùng rễ lúa từ các mẫu đất thu được Phân lập Trộn đều mẫu đất, mỗi mẫu cân 10g đất và cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất đã được khử trùng. Bình tam giác và các dụng cụ chứa dung dịch đất khác phải có nắp đậy để hạn chế mẫu bị nhiễm vi khuẩn từ không khí. Khuấy đều mẫu 30 phút bằng máy khuấy từ. Sau đó tiếp tục: - Rút 1ml dung dịch đất và cho vào 9ml nước cất trong ống đã được khử trùng, trộn đều. - Rút 1 ml dung dịch trong ống và cho vào 9ml nước cất trong ống mới đã được khử trùng, trộn đều. - Rút 1ml dung dịch đất trong ống mới và cho vào 9ml nước cất trong ống mới khác đã được khử trùng, trộn đều. Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - Rút 50 µl dung dịch đất trong ống pha loãng cuối cùng cho vào đĩa môi trường NA để phân lập các dòng Bacillus và môi trường đặc hiệu King‟ B đối với Pseudomonas fluorescens. Dùng que trải thủy tinh để trải đều mẫu. Mỗi mẫu trải 2 đĩa để hạn chế sai số. Các đĩa được ủ ở nhiệt độ 300C cho đến khi các khuẩn lạc xuất hiện. Tách ròng Khi khuẩn lạc xuất hiện, chọn những khuẩn lạc vi khuẩn có hình dạng và màu sắc tương sự như đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus và Pseudomonas fluorescens để tiến hành cấy chuyển sang đĩa petri khác chứa môi trường tương ứng. Việc cấy chuyển được tiến hành nhiều lần cho đến khi thu được khuẩn lạc ròng, quan sát dưới kính hiển vi, vi khuẩn được gọi là ròng (thuần chủng) khi có sự đồng nhất về hình dạng, kích thước và màu sắc. c) Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn - Quan sát và mô tả đặc điểm các khuẩn lạc Khi cấy chuyển phân lập vi khuẩn trên đĩa môi trường đặc hiệu, ta tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu sau: hình dạng, màu sắc, độ nổi và hình dạng bìa bằng mắt thường (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008). Tuy nhiên đối với khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ ta có thể dùng kính lúp để quan sát. - Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng tế bào và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008) - Cách làm tiêu bản giọt ép: Nhỏ khoảng 20 µl nước cất vô trùng lên miếng lam sạch. Khử trùng que cấy vòng bằng cách đốt cho nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ một khuẩn lạc rời rồi trải vào trong giọt nước trên lame. Đậy lamelle lên giọt huyền phù vi khuẩn. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi để thấy được hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn. - Nhuộm Gram vi khuẩn Lấy 10 µl nước cất vô trùng nhỏ lên kính mang vật Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít sinh khối vi sinh vật trải đều lên kính Hơ mẫu vật trên ngọn đèn cồn, cố định vi sinh vật Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều khoảng 2 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để mẫu khô Rửa mẫu bằng cồn 70% đến khi mất hết màu tím Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô vài giây Nhỏ 1-2 giọt Fucshin, trải đều, để yên 1 phút Rửa lại nước cất vô trùng đến khi mất hết màu Fucshin Dùng giấy thấm chấm nhẹ khô nước. Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh: vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào ăn màu Crystal violet nên có màu tím xanh. Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ: vi khuẩn Gram âm do không còn màu của Crystal violet nên có màu hồng của Fucshin. 3.4.2. Thí nghiệm 2: Một số thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Bacillus (Sharmin và Rahman, 2007) a. Thử nghiệm catalase Hóa chất được sử dụng là dung dịch H2O2 3% được giữ lạnh trong chai màu nâu, tránh ánh sáng, dung dịch đệm phosphate pH 7.0 Thử trên phiến kính (lame): dùng kim cấy lấy một ít sinh khối từ Bacillus đã tách ròng đặt lên một phiến kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối trên phiến kính. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Thử nghiệm là (+) nếu có khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 tạo ra, ngược lại là (-) khi không có sủi bọt khí. b. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase Chủng 1ml nuôi trong môi trường LB vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm chứa 1ml nước muối 0,1%. Cho 1ml tinh bột vào, lắc đều, đun cách thủy ở 30°C/30 phút, lấy ra nhỏ 1 giọt iod vào. Đọc kết quả: + Nếu có hoạt tính amylase: mất màu hỗn hợp tinh bột và iod + Nếu không có hoạt tính amylase: có màu xanh Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (Nguyễn Trọng Thể, 2005) - Thử nghiệm oxidase Thử nghiệm được thực hiện bằng giấy thử oxidase. Dùng kim cấy lấy một ít sinh khối của khuẩn lạc đã thuần chấm lên vùng giấy thấm có thuốc thử. Tránh để giấy thử tẩm thuốc thử trực tiếp ngoài sáng lâu vì ánh sáng sẽ phân hủy hóa chất. Đọc kết quả sau 20-60 giây, không được để vượt quá thời gian này. Phản ứng oxidase là (+) khi có sự xuất hiện màu tím xanh hay xanh dương đậm và (-) khi giấy thử không đổi màu. - Thử nghiệm nitratase (Khử nitrate) Môi trường sử dụng là ống môi trường lỏng Nitrate Broth (NB). Cấy sinh khối chủng thuần và ủ ở 37oC trong 3 ngày. Sau thời gian ủ acid hóa môi trường bằng cách bổ sung vài giọt HCl 1N, sau đó bổ sung 0,5 ml dung dịch sulphanilamide 0,2% và 0,5 ml N-napthylethyenediamine hydrochloride. Đọc kết quả: Thử nghiệm nitratase là (+) khi xuất hiện màu hồng. Trường hợp không có màu hồng xuất hiện, tiếp tục định tính nitrate bằng bột kẽm. Nếu phản ứng nitrate có màu hồng do sự hiện diện của nitrate thì thử nghiệm là (-), ngược lại nếu không chuyển màu thì thử nghiệm nitrate là (+). 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng đối kháng Việc thử đối kháng nhằm tìm được các dòng đối kháng với nấm Pyricularia oryzae. Tiến hành bằng phương pháp cấy kép: nấm được cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ ở nhiệt độ 30oC trong 5 ngày ở tủ ủ. Sau 5 ngày, tiến hành cấy vi khuẩn ở 4 bên bề mặt đĩa nấm đã ủ. Các đĩa môi trường này sau đó tiếp tục được ủ trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày quan sát sự hình thành vùng kháng nấm và tính tỷ lệ ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn được tính theo công thức: I Rr 100 R Trong đó: I: tỷ lệ ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn R: bán kính của hệ sợi nấm trên môi trường trên đĩa đối chứng (cm) r: bán kính của hệ sợi trong đĩa có chủng vi khuẩn (cm) Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Nhận diện trên đĩa petri các dòng vi khuẩn đối kháng dựa trên khả năng ngăn chặn sự phát triển của khuẩn ty nấm xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn. Chọn những dòng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm tốt bên cạnh những dòng vi khuẩn không biểu hiện khả năng này, từ đó tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và hình thái. 3.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát đặc tính đối kháng của Bacillus và Pseudomonasfluorescens - Khả năng sản sinh siderophore của Bacillus và Pseudomonas fluorescens Dựa theo phương pháp SD-CASA (A Simple double-layered Chrome Azurol S Agar) của Hu và Xu (2011), dựa trên sự biến đối từ màu xanh của dung dịch Chrome Azurol S sang màu vàng khi có sự hiện hiện của siderophore được sản sinh xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn. Đo đường kính vòng halo màu vàng xung quanh khuẩn lạc để so sánh khả năng sản sinh siderophore của vi khuẩn… Chuẩn bị dung dịch CAS-blue: 60mg CAS trong 50 ml H2O, 10 ml Fe3+ gồm 0,0027g FeCl3.6H20, 8,3µl HCl 37% và 72,9 mg HDTMA trong 40 ml H 2O (Đặng Thị Thùy Vân, 2013). - Xác định khả năng sản sinh các enzyme phân hủy vách tế bào nấm bệnh cellulose của vi khuẩn Bacillus (Võ Văn Phƣớc Quệ, 2011) Dựa vào khả năng phân hủy của các enzyme trên cơ chất đặc trưng: cellulase phân hủy CMC (Carboxylmethyl Cellulose). Cách tiến hành: dùng que cấy lấy sinh khối vi khuẩn rồi chấm lên những vị trí khác nhau trên đĩa môi trường khoáng cơ bản có bổ sung 1% CMC. Đo đường kính vòng phân hủy các cơ chất tương ứng của từng enzyme để xác định khả năng sản sinh các enzyme...Công thức tính khả năng thủy phân (Võ Văn Phước Quệ, 2011) (Đường kính halo – Đường kính khuẩn lạc)/Đường kính halo x 100 - Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme Protease của Bacillus và Pseudomonas fluorescens Hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn được đánh giá nhờ vào khả năng tạo vòng phân giải trên môi trường sữa (Priest et al., 1993). Đây là phương pháp đơn giản để bước đầu đánh hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn. Với mỗi dòng vi khuẩn hút 5µl dịch nuôi nhỏ vào môi trường SMA và ủ ở 37oC trong 24 giờ. Các dòng vi khuẩn có hoạt tính protease sẽ tạo vòng halo trên môi trường sữa. Đo đường kính thủy phân Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT để đánh giá hoạt tính protease của các dòng vi khuẩn. Đánh giá khả năng sinh enzyme để tuyển chọn những chủng có hoạt tính enzyme cao: dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D). (D - d) càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao (D là đường kính vòng halo, d đường kính giọt nuôi vi khuẩn). Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens vùng đất của rễ lúa. Từ các mẫu đất vùng rễ lúa được thu thập tại hai tỉnh Đồng Tháp và Cần Thơ, tiến hành phân lập được 77 dòng vi khuẩn, kết quả thu được 19 dòng vi khuẩn Bacillus và 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescen có khả năng đối kháng với mẫu nấm Pyricularia oryzae. Nhận diện trên đĩa petri các dòng vi khuẩn đối kháng dựa trên khả năng ngăn chặn sự phát triển của khuẩn ty nấm xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn. Hình 6. Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng Bacillus phân lập đƣợc với độ phóng đại 10 lần Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của 19 dòng vi khuẩn Bacillus Đặc điểm khuẩn lạc Tên STT dòng vi khuẩn Màu sắc Hình dạng Bìa Đặc điểm tế bào Độ Đƣờng Chuyển nổi kính (mm) động Hình dạng Gram 1 B3 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 1,3 + Que dài + 2 B9 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,0 + Que dài + 3 B11-1 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 1,5 + Que dài + 4 B11-2 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,3 + Que dài + 5 B13 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que ngắn + 6 B15 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,0 + Que dài - 7 B16-1 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,5 + Que dài + 8 B16-2 Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1,3 + Que dài + 9 B18 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,5 + Que rất dài + 10 B19 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,5 + Que dài + 11 B25 Vàng đậm Tròn Nguyên Mô 0,8 + Que ngắn + Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 12 B28 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que dài + 13 B29 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que dài + 14 B30 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 2,0 + Que ngắn + 15 B31 Trắng đục Không đều Nguyên Lài 1,5 + Que dài + 16 B33 Vàng đục Không đều Nguyên Mô 1,5 + Que dài + 17 B35 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 1,6 + Que dài + 18 B39 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,0 + Que dài + 19 B41 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 1,2 + Que dài - Đặc điểm tế bào và khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn Bacillus trên môi trường NA được trình bày trong Bảng 4, hầu hết các dòng vi khuẩn Bacillus phân lập được có màu trắng đục, một số có màu vàng nhạt, tất cả có dạng không đều hoặc răng cưa. Độ nổi khuẩn lạc có 2 dạng mô và lài, đa số khuẩn lạc có bề mặt nhiều nếp nhăn. Qua quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn có dạng hình que, có khả năng di động. Tiến hành nhuộm Gram đa số là gram dương, cụ thể trong số 19 dòng vi khuẩn Bacillus có 17 dòng Gram dương bắt màu tím xanh của crystal violet chiếm 89,47% và 2 dòng Gram âm do bắt màu hồng của fucshin (10,53%), điều này cho thấy đặc điểm của tế bào và khuẩn lạc giống với đặc điểm của vi khuẩn Bacillus phù hợp với kết quả của Nguyễn Thị Phương Như (2009) và tương tự như mô tả của Nguyễn Lân Dũng (1997). Hình 7. Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng Pseudomonas fluorescens phân lập đƣợc với độ phóng đại 10 lần Chuyên ngành Vi sinh vật học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 5. Đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens STT Đặc điểm khuẩn lạc Tên dòng vi khuẩn Màu sắc Hình dạng Bìa Đặc điểm tế bào Độ Đƣờng Chuyển nổi kính (mm) động Hình dạng Gram 1 P1 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Mô 1,5 + Que dài - 2 P3 Vàng nhạt Không đều Răng cưa Mô 2,0 + Que rất dài - 3 P4 Vàng nhạt Không đều Nguyên Lài 1,2 + Que rất dài - 4 P8 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que ngắn - 5 P11-1 Vàng nhạt Không đều Nguyên Lài 2,0 + Que dài - 6 P11-2 Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1,5 + Que dài - 7 P12 Vàng nhạt Tròn Nguyên Lài 1,2 + Que ngắn - 8 P13-1 Vàng nhạt Tròn Nguyên Lài 1,5 + Que ngắn - 9 P13-2 Trắng đục Tròn Nguyên Mô 1,2 + Que rất dài - 10 P15 Vàng nhạt Không đều Nguyên Lài 1,0 + Que dài - 11 P16 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que dài - 12 P19 Vàng đục Tròn Nguyên Lài 2,0 + Que dài - 13 P21 Vàng đục Không đều Nguyên Mô 2,0 + Que ngắn - 14 P22 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que ngắn - 15 P27 Vàng đục Không đều Nguyên Mô 1,6 + Que dài - 16 P28 Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que dài - 17 P29 Vàng đục Không đều Nguyên Mô 1,5 + Que dài - 18 P31 Vàng nhạt Tròn Nguyên Mô 1,2 + Que ngắn - 19 P36 Vàng nhạt Tròn Nguyên Mô 2,0 + Que rất dài - 20 P37 Vàng nhạt Tròn Nguyên Lài 1,2 + Que ngắn - 21 P40 Vàng nhạt Không đều Nguyên Lài 1,5 + Que ngắn - 22 P11-1(Đ1) Vàng nhạt Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que rất dài - 23 P11-2(Đ1) Trắng đục Không đều Nguyên Mô 2,0 + Que dài - 24 P12(Đ1) Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2,0 + Que ngắn - Qua bảng 5 về đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường King‟B cho thấy, màu sắc khuẩn lạc có màu trắng đục hay vàng kem, khuẩn lạc nhỏ, trơn, đa số bìa nguyên và một số là bìa răng cưa, trong đó có một số khuẩn lạc có dạng nhầy hầu hết tế bào đều có dạng hình que và có khả năng di động, tất cả các dòng vi khuẩn thuộc Gram âm khi bắt màu hồng fucshin qua kết quả nhuộm Gram dưới kính hiển vi quang học, theo nghiên cứu trước đây về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens của Nguyễn Trọng Thể và cộng sự (2005). Chuyên ngành Vi sinh vật học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 6 µm 6 µm a b Hình 8. Hình nhuộm gram tế bào của hai dòng vi khuẩn a. Pseudomonas fluorescens b. Bacillus Tất cả 19 dòng vi khuẩn Bacillus và 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đã phân lập được đều có khả năng chuyển động trong môi trường lỏng khi quan sát bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi, tương tự như mô tả của Nguyễn Lân Dũng (1997), Slepecky và Hemphill (2006). Thí nghiệm 2: Một số thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Bacillus a. Thử nghiệm catalase Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn có khả năng tạo enzyme catalase có khả năng thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) sinh ra H2O và O2 tạo nên hiện tượng sủi bọt khí theo nghiên cứu trước đây về khả năng tạo catalase của Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương (2003), Slepecky và Hemphill (2006), Sharmin và Rahman (2007), thử nghiệm này dùng để phân biệt các vi sinh vật hiếu khí với vi sinh vật kỵ khí. Cơ chế phản ứng của enzyme catalase: H2O2 catalase H 2O +O2 Cho vài giọt H2O2 nhỏ lên kính mang vật, sau đó dùng que cấy lấy 1 ít sinh khối của vi khuẩn Bacillus cho vào giọt H2O2 trên, quan sát thấy có hiện tượng sủi bọt khí ở tất cả các dòng vi khuẩn Bacillus được thử nghiệm , cho thấy tất cả 19 dòng trên đều có khả năng sinh enzyme catalase nhưng khác nhau giữa các dòng, kết quả cụ thể như sau : có 6 dòng sủi bọt khí nhanh và ngay lập tức khi giọt H2O2 tiếp xúc với sinh khối vi khuẩn Bacillus chiếm 31,57 %, 9 dòng sủi bọt khí ở mức trung bình, lượng bọt khí sinh ra ít và sau vài giây mới bắt đầu sinh ra nhiều hơn chiếm 47,37 %, 4 dòng sủi bọt khí Chuyên ngành Vi sinh vật học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT khoảng sau 15 giây và rất ít khi sinh khối vi khuẩn tiếp xúc với giọt H2O2 chiếm 21,06%. a b c d Hình 9. Bọt khí do enzyme Catalase tiếp xúc với H2O2 tạo thành a. Đối chứng ; b. Khả năng tạo Catalase yếu c. Khả năng tạo Catalase trung bình; d. Khả năng tạo Catalase mạnh b. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase Tinh bột là những phân tử có cấu trúc xoắn ốc hay còn gọi là cấu trúc của amylose do đó khi dung dịch iod tiếp xúc sẽ bị giữ lại bên trong và tạo nên màu xanh thẫm. Enzyme amylase phân hủy tinh bột chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho phản ứng màu với iod (Hình 10) và một ít maltose (Nguyễn Minh Thùy, 2012). Chuyên ngành Vi sinh vật học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT ĐC a b Hình 10. Thử nghiệm amylase đối với các dòng vi khuẩn Bacillus a. Thử nghiệm đối chứng b. Sau khi thêm iod vào các ống dịch vi khuẩn Trong bảng 6, thể hiện kết quả khảo sát 19 dòng vi khuẩn Bacillus đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase cụ thể chia làm 3 nhóm: nhóm 1 có 10 dòng vi khuẩn làm mất màu tinh bột và iod ngay lập tức chiếm 52,63%, nhóm 2: 5 dòng vi khuẩn làm mất màu tinh bột và iod sau vài giây chiếm 26,31% cho thấy các dòng này có hoạt tính amylase trung bình và nhóm 3 có 4 dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase yếu chiếm 21,06% vì làm mất màu dung dịch tinh bột và iod sau thời gian khoảng 60 giây. Bảng 6. Kết quả chung các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn Bacillus Tên dòng vi khuẩn Catalase Amylase 1 B3 +++ ++ 2 B9 +++ + 3 B11-1 +++ +++ 4 B11-2 ++ +++ 5 B13 + +++ 6 B15 ++ ++ 7 B16-1 +++ + 8 B16-2 ++ +++ 9 B18 +++ +++ 10 B19 ++ +++ 11 B25 +++ +++ 12 B28 ++ + 13 B29 + ++ 14 B30 ++ + 15 B31 ++ +++ STT Chuyên ngành Vi sinh vật học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 16 B33 + +++ 17 B35 + +++ 18 B39 ++ ++ 19 B41 +++ ++ Chú thích: Catalase + Khả năng tổng hợp catalase mạnh: +++ + Khả năng tổng hợp catalase trung bình: ++ +Khả năng tổng hợp catalase yếu: + Amylase +Khả năng tổng hợp amylase mạnh: +++ +Khả năng tổng hợp amylase trung bình: ++ +Khả năng tổng hợp amylase yếu: + Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens a. Thử nghiệm oxidase Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase hay cytochrome oxidase ở vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, đặc biệt là với dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens. Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine. Trong điều kiện có sự hiện diện của cytochrome trong tế bào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thì thuốc thử này bị oxi hóa thành một hợp chất idolphenol có màu xanh tím hay xanh đen. Thử nghiệm này được thực hiện sau khi cấy chuyển khuẩn lạc vi khuẩn trong 24-48 giờ thì sẽ cho kết quả cao nhất. Trong tổng số 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được tiến hành thử nghiệm thì có 16 dòng cho kết quả dương tính tức làm giấy thử chuyển sang màu xanh tím hay xanh đen khi chấm sinh khối khuẩn lạc lên giấy thử, chiếm 66,67% và có 8 dòng vi khuẩn không có xuất hiện màu giấy thử tức vẫn giữ màu khuẩn lạc trên giấy thử cho kết quả âm tính và chiếm 33,33%. Màu sắc xanh đậm nhạt trên giấy thử khi cho sinh khối khuẩn lạc tiếp xúc với phần thuốc thử cũng là một phần chứng tỏ khả năng sinh enzyme oxidase của các dòng vi khuẩn là khác nhau. Kết quả được thể hiện qua số liệu của bảng 7. Chuyên ngành Vi sinh vật học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT ĐC a b c Hình 11. Thử nghiệm oxidase đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens a. Phản ứng dƣơng tính khi giấy thử chuyển sang màu xanh đen b. Phản ứng âm tính khi giấy thử giữ nguyên màu sắc khuẩn lạc c. Thử nghiệm đối chứng b. Thử nghiệm nitratase (Khử nitrate) Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử diễn ra trong điều kiện không có oxi phân tử. Hoạt tính nitratase được định tính dựa trên sự tạo hành nitrite và sự cạn kiệt nitrate. Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng.Tuy nhiên, một số dòng vi khuẩn tiếp tục chuyển hóa nitrite thành các hợp chất khác nên mặc dù có sự hiện diện của nitratase nhưng môi trường cũng không xuất hiện màu hồng. Trường hợp này kiểm chứng sự cạn kiện của nitrate bằng bột kẽm, nếu xuất hiện màu hồng thì là âm tính. Thí nghiệm này được tiến hành với 24 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens cho kết quả như bảng 7 Qua bảng 7 cho thấy có 16 dòng vi khuẩn cho màu hồng ngay lập tức (chiếm 66,67%) ngay sau khi cho sulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride vào các ống nghiệm chứa dịch vi khuẩn, màu hồng trên các ống nghiệm là khác nhau từ nhạt đến đậm cho thấy khả năng khử nitrate của các dòng vi khuẩn là khác nhau và 8 ống nghiệm không đổi màu vẫn giữ màu của dịch tăng sinh, tiếp tục cho một ít bột kẽm vào 8 ống nghiệm trên, sau 60 giây vẫn không đổi màu điều này chứng tỏ 8 dòng vi khuẩn trên điều có khả năng khử nitrase và dương tính. Chuyên ngành Vi sinh vật học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 a Trường ĐHCT b c Hình 12. Thử nghiệm nitratase đối với các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens a. Thử nghiệm đối chứng vào môi trƣờng không nuôi tăng sinh vi khuẩn b. Phản ứng dƣơng tính sau khi thêm thuốc thử vào môi trƣờng chuyển sang hồng c. Phản ứng dƣơng tính khi thêm bột kẽm vào vẫn không đổi màu môi trƣờng Bảng 7. Kết quả chung các đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Tên dòng vi khuẩn Oxidase Khử nitrate 1 P1 + + 2 P3 + + 3 P4 + + 4 P8 + + 5 P11-1 + + 6 P11-2 + + 7 P12 - + 8 P13-1 + + 9 P13-2 + + 10 P15 - + 11 P16 - + 12 P19 - + 13 P21 - + 14 P22 + + 15 P27 - + STT Chuyên ngành Vi sinh vật học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 16 P28 - + 17 P29 + + 18 P31 + + 19 P36 + + 20 P37 + + 21 P40 - + 22 P11-1 (Đ1) + + 23 P11-2 (Đ1) + + 24 P12 (Đ1) + + Ghi chú: Oxidase + Oxidase dương tính:+ + Oxidase âm tính:Khử nitrate: + Nitrate dương tính:+ + Nitrate âm tính :- Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc Dựa trên các đặc điểm tế bào và khuẩn lạc bước đầu xác định được các dòng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens, các dòng vi khuẩn này được cấy ở 4 điểm trên đĩa petri xung quanh khuẩn ty nấm đã được cấy trước đó 5 ngày trên môi trường PDA nhằm đánh giá khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm. Tiến hành đo khoảng cách từ vị trí khuẩn lạc đến vị trí khuẩn ty ngừng phát triển, đo bán kính của hệ sợi nấm trên môi trường đĩa đối chứng cũng như bán kính của hệ sợi trên đĩa có chủng vi khuẩn để tính được tỷ lệ ức chế sự phát triển của nấm. Hình 13. Các dòng vi khuẩn có khả năng ngăn chặn sự phát triển của khuẩn ty nấm Hình 13 thể hiện khả năng đối kháng của vi khuẩn đối với nấm P.oryzae bằng cách vi khuẩn đẩy lùi sự phát triển của khuẩn ty nấm. Trong số 19 dòng vi khuẩn Bacillus được khảo sát thể hiện khả năng đối kháng rất rõ trên đĩa petri, khoảng cách đo Chuyên ngành Vi sinh vật học 38 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT được từ khuẩn lạc vi khuẩn đến khuẩn ty nấm trong khoảng từ 0,4-1,1 cm sau 5 ngày ủ ở nhiệt độ 30oC, có 2 dòng thể hiện khả năng đối kháng mạnh nhất là B11-1 và B39 với khoảng cách đo được là 1,1 cm và có khác biệt ý nghĩa thống kê với các dòng vi khuẩn còn lại. Điều này phù hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Đặng Thị Thùy Vân (2013), qua kết quả tính toán cho thấy 2 dòng vi khuẩn này có thể ức chế sự phát triển của nấm bệnh P.oryzae là 53,33%. Dòng vi khuẩn B11-2 là dòng vi khuẩn ức chế sự phát triển của nấm thấp nhất và chỉ đạt 27,78% so với các dòng vi khuẩn còn lại. Bảng 8. Khả năng kháng nấm Pyricularia oryzae của các dòng vi khuẩn Bacillus Dòng vi khuẩn STT Khả năng đối Tỉ lệ ức chế sự phát kháng với nấm triển của nấm P.oryzae P.oryzae (%) 1 B3 0,8667abcd 49,44 2 B9 0,9abc 50,00 3 B11-1 1,1333a 53,33 4 B11-2 0,4f 27,78 5 B13 0,7bcdef 46,11 6 B15 1,0ab 51,67 7 B16-1 0,6667cdef 43,89 8 B16-2 0,75bcde 48,33 9 B18 0,7167bcdef 46,11 10 B19 0,9333abc 50,56 11 B25 0,7bcdef 46,11 12 B28 0,5667def 40,56 13 B29 0,6667cdef 44,44 14 B30 0,7bcdef 46,11 15 B31 0,5333ef 28,89 16 B33 0,7333bcde 48,33 17 B35 0,7667bcde 48,33 18 B39 1,1a 53,33 19 B41 0,6833bcdef 46,67 P-value 0,0045 %CV 25,64 Chuyên ngành Vi sinh vật học 39 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Các giá trị trong cùng một cột cùng mẫu kí tự không khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% (P[...]... tính đối kháng nấm bệnh P .oryzae cao ở quy mô phòng thí nghiệm, để từ đó có thể nghiên cứu và đưa ra quy trình sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh đạo ôn ở lúa có hiệu quả cao nhất 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập các dòng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas flourescens từ vùng đất rễ lúa có khả năng đối kháng với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Vi n NC&PT Công nghệ... trừ bệnh đạo ôn hại lúa bằng các chế phẩm vi sinh vật Một trong những nghiên cứu đó là sử dụng vi khuẩn đối kháng nấm bệnh hại lúa đã được phát triển sớm (Cao li-yong et al., 2003 và Lee at al., 2002) Mặt khác để bổ sung thêm và làm giàu nguồn vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh đạo ôn hại lúa, vi c tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas fluorescens có hoạt tính đối. .. bị nhiễm chia bệnh làm 4 dạng là đạo ôn lá, đạo ôn cổ lá, đạo ôn đốt thân và đạo ôn cổ bông Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 a b Trường ĐHCT c d e Hình 1 Một số triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa a Đạo ôn lá, b Đạo ôn cổ lá, c Đạo ôn cổ bông, d Đạo ôn đốt thân, e Đạo ôn hạt (* Nguồn: http://thuocdietcontrung.net.vn /vi/ Thong-tin-san-pham.aspx?id=37&idn=2015,... có khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Burkholderia cepacia TG17 đối với nấm Rhizoctonia solani gây bệnh đốm vằn trên lúa, khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng trường Đại học Cần Thơ đã đưa ra chế phẩm sinh học Biobac có khả năng phòng trừ bệnh trên lúa là đốm vằn, hay nghiên cứu khả năng gây hại của các chủng Erwinia carotovora trên cải bắp và bước đầu sử dụng vi khuẩn vùng rễ để phòng trị bệnh. .. học đối với một số bệnh có nguồn gốc từ đất bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng đã gặt hái được nhiều thành công đáng kể trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng 2.4.2 Những nghiên cứu ngoài nước Ngày nay, nhiều dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với các mầm bệnh trên cây lúa được tìm thấy và ứng dụng hiệu quả, chủ yếu là các dòng vi khuẩn Pseudomonas và Bacillus Bảng 1 Các chủng vi khuẩn đối kháng với. .. đã phân lập được những dòng Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng với một vài nấm bệnh và xác định kháng sinh được sinh ra bởi chủng vi khuẩn này là 2,4-diacetylphlorocinol Nguyễn Tuyết Nhung (2006), đã nghiên cứu tính đối kháng của 7 dòng vi khuẩn Pseudomonas, kết quả các dòng vi khuẩn này có khả năng sản sinh siderophore, cyanide và protease nội bào giúp đối kháng với một số loại nấm bệnh. .. của bệnh đạo ôn (Potkin, 1983) cũng thấy, ở các mức độ bị bệnh với chỉ số cấp bệnh 10%, 25%, 33%, 42%, 63%, 75%,100%, đã làm giảm năng suất ở mức độ 0 - 22% đối với dạng đạo ôn lá, từ 0 - 64% đối với đạo ôn đốt thân, từ 078 % đối với đạo ôn cổ bông Ở Nhật Bản từ năm 1953 - 1960, hàng năm thiệt hại bình quân 2,89% tổng sản lượng lúa, mặc dù đã có sự nỗ lực sử dụng thuốc hóa học trong Chuyên ngành Vi. .. nay bệnh đạo ôn đã gây thành dịch hại ở nhiều vùng trọng điểm thâm canh lúa thuộc Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long, các tỉnh duyên hải miền Trung và cả Tây Nguyên, một số vùng trung du miền núi phía bắc trên các giống lúa mẫn cảm.Vụ đông xuân năm 1979, có trên 15.000 ha lúa bị nhiễm đạo ôn Vụ xuân năm 1982 có trên 80.000 ha lúa bị nhiễm đạo ôn, vụ chiêm xuân năm 1985 có trên 160.000 ha lúa. .. bệnh đạo ôn là một trong những bệnh hại trên cây lúa có lịch sử xuất hiện rất lâu đời Đây là loại bệnh phổ biến, phạm vi phân bố rộng, chúng xuất hiện gây hại trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới bao gồm Châu Á, Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Phi,…Đã có rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về loại bệnh này Tại Vi t Nam bệnh đạo ôn được biết đến từ lâu với tên gọi là bệnh tiêm lụi hay bệnh cháy lá lúa. .. tình hình - Đối với những ruộng đã bị bệnh đạo ôn trên lá cần phải phun thuốc phòng bệnh đạo ôn cổ bông trước và sau khi trổ, nên phun vào lúc chiều tối để khỏi ảnh hưởng đến vi c trổ bông 2.4 Vi sinh vật đối kháng 2.4.1 Những nghiên cứu trong nước Hiện nay, tại Vi t Nam đã có nhiều nghiên cứu phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng sử dụng vi sinh vật đối kháng như: Một số chủng vi khuẩn đối kháng như Burkholderia,