Đang tải... (xem toàn văn)
... Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Thị Thảo Nguyên TÓM LƢỢC Hai mươi tám dòng nấm Colletotrichum sp phân lập tuyển chọn từ mẫu bệnh thán thư ớt với dòng phân lập từ 24 dòng phân lập từ trái... thu mẫu nhiều địa điểm loại ớt nhằm tăng tính đa dạng dòng nấm Colletotrichum thu thập Kết phân lập 28 dòng nấm, có dòng nấm phân lập 24 dòng nấm phân lập trái Các dòng nấm đặt tên theo nguyên tắc... số phƣơng pháp phân lập nấm Kỹ thuật phân lập để tìm loài nấm hay nấm hữu ích quan trọng trình nghiên cứu Không có quy luật chung dùng cho phân lập vi sinh vật Phương pháp phân lập tốt phương
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP NẤM GÂY BỆNH THÁN THƢ TRÊN CÂY ỚT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: NGUYỄN THỊ LIÊN SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ THẢO NGUYÊN MSSV: 3103971 LỚP : VSVH K36 Cần Thơ, tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM COLLETOTRICHUM SP. GÂY BỆNH THÁN THƢ TRÊN CÂY ỚT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: NGUYỄN THỊ LIÊN SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ THẢO NGUYÊN MSSV: 3103971 LỚP : VSVH K36 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Thị Liên Nguyễn Thị Thảo Nguyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Kí tên) LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn không chỉ có sự nổ lực và cố gắng của bản thân mà còn có sự động viên và giúp đở rất nhiệt tình và chân thành của quý thầy cô, gia đình, bạn bè. Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến: Quý thầy cô Giảng viên viện NC và PT Công nghệ Sinh học của trường Đại học Cần Thơ đã truyền dạy cho tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báo trong quá trình học tập và nghiên cứu tại viện. Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập cô Nguyễn Thị Pha, thầy Võ Văn Song Toàn và tập thể lớp Vi sinh vật học khóa 36 đã động viên, chia sẽ và hỗ trợ nhiệt tình trong suốt quá trình học vừ qua. Đồng thời tôi xin cảm ơn các thầy cô phụ trách các phòng thí nghiệm của Viện đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng trang thiết bị để hoàn thành luận văn. Thành kính cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt tiến trình làm thí nghiệm để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân chân thành đến những người thân trong gia đình đã nuôi dưỡng, dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập. Xin chân thành cảm ơn tất cả! Cần Thơ, ngày 28 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Thị Thảo Nguyên TÓM LƢỢC Hai mươi tám dòng nấm Colletotrichum sp. đã được phân lập và tuyển chọn từ các mẫu bệnh thán thư trên ớt với 4 dòng được phân lập từ lá và 24 dòng phân lập từ trái ở các địa điểm ở huyện Phong Điền thuộc thành phố Cần Thơ; huyện Long Mỹ, huyện Châu Thành, huyện Châu Thành A tỉnh Hậu Giang; Tân Bình và Tân Quới thuộc huyện Bình Tân tỉnh Vĩnh Long. Kết quả quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường PDA đặc cho thấy: Nhóm 1 (chiếm 68%) có tốc độ mọc vừa và nhanh. Hầu hết mặt trên khuẩn lạc có màu trắng, từ tâm lan ra màu vàng hoa cau, tím hoặc xám trắng; mặt dưới có màu vàng hoa cau, hồng nhạt, đen hoặc tím;bề mặt khuẩn lạc dạng nhung mượt len xốp với độ nổi mô; bìa sợi, phẳng mỏng hoặc dày mô. Nhóm 2 (chiếm 32%) có tốc độ mọc chậm. Bề mặt các khuẩn lạc có dạng bột mịn, độ nổi mô và dạng bìa sợi. Mặt trên khuẩn lạc có màu xám trắng; mặt dưới khuẩn lạc có màu cam hoặc màu xám đen. Ngoài ra, các khuẩn lạc còn có các sắc tố hòa tan như màu vàng hoa cau (7.2%), hồng (3.6%), cam (21.4%), tím (3.6%) hay xám đen (3.6%). Về hình dạng bào tử: có dạng hình thoi, liềm hay hình trụ. Từ khóa: Colletotrichum sp., ITS1 và ITS4, ớt, thán thư. i MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT .......................................................................................................... LỜI CẢM TẠ................................................................................................................... TÓM LƢỢC .................................................................................................................... i MỤC LỤC ......................................................................................................................ii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... v TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................................. vi CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .....................................................................................................1 1.2. Mục tiêu đề tài .............................................................................................1 CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU..................................................................... 2 2.1. Giới thiệu về cây ớt ......................................................................................2 2.2. Bệnh thán thƣ trên cây ớt ...........................................................................3 2.2.1. Tác nhân gây bệnh...........................................................................4 2.2.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến bệnh thán thư ...................................5 2.2.3. Triệu chứng bệnh.............................................................................5 2.2.4. Cơ chế xâm nhiễm ...........................................................................6 2.2.5. Tình hình nhiễm bệnh .....................................................................8 2.3. Tổng quan về nấm Colletotrichum sp. .......................................................9 2.3.1. Phân loại ..........................................................................................9 2.3.2. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................10 2.3.3. Đặc điểm chung. ............................................................................12 2.4. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp phân lập nấm ...........................................13 ii CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 15 3.1. Thời gian.....................................................................................................15 3.2. Địa điểm......................................................................................................15 3.3. Phƣơng tiện ................................................................................................15 3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ..........................................................15 3.3.2. Vật liệu thí nghiệm ........................................................................16 3.3.3. Hóa chất .........................................................................................16 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..........................................................................16 3.4.1. Thu thập và xử lý mẫu ...................................................................16 3.4.2. Phân lập nấm bệnh ........................................................................17 CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 19 4.1. Nhận diện các dòng nấm bằng phƣơng pháp truyền thống ..................19 4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường đặc .........................19 4.1.2 Quan sát các đặc điểm hình thái .....................................................26 CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 32 5.1. Kết luận ......................................................................................................32 5.2. Kiến nghị ....................................................................................................32 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 33 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 37 Phụ lục 1: Thành phần môi trƣờng PDA .......................................................37 Phụ lục 2: Vị trí mẫu đƣợc phân lập của các dòng nấm Colletotrichum sp. trên lá và trái ớt ................................................................................................38 iii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1. Bảng báo cáo về tác nhân gây ra bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia. ...... 4 Bảng 2. Bảng báo cáo một số loài Colletotrichum sp. nhiễm trên các cây trồng nhiệt đới. .................................................................................................................................10 Bảng 3. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng nấm Colletotrichum sp. sau khi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. ....................................................................................................20 Bảng 4. Đặc điểm khuẩn ty và hình dạng bào tử của các dòng nấm Colletotrichum sp. được phân lập. ...............................................................................................................27 iv DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1: Một số loại ớt ..................................................................................................... 3 Hình 2: Biểu hiện bệnh thán thư trên trái ớt. ................................................................... 4 Hình 3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp. ................................................ 7 Hình 4: Vùng và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện thường xuyên và nghiêm trọng. ......8 Hình 5. Bào tử một số loài Colletotrichum sp............................................................... 13 Hình 6. Sơ đồ quy trình phân lập nấm .......................................................................... 17 Hình 7. Khuẩn lạc nấm Colletotrichum sp. sau khi cấy 7 ngày trên môi trường PDA. 26 Hình 8. Các dạng bào tử nấm Colletotrichum sp. ở độ phóng đại 1000 lần ................. 31 v TỪ VIẾT TẮT bp Base pair, cặp bazo BSA Bovine Serum Albumin DNA Deoxyribo nucleic acid ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long Et.Br Ethidium Bromide H2O2 Hydrogen peroxide H2 S Hydrogen sulfide ITS Internal transcribed spacer Ha Hecta Kb Kilobase ng/ µl Nanogram/microliter PCR Polymerase Chain Reaction pH hydrogen power rpm round per minute TBE Tris – Boric acid - EDTA TE Tris EDTA UV Ultra Violet V Voltaire vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Ớt (Capsicum sp. ) là loại cây đã được con người trồng trọt và thu hái từ lâu đời. Với nhiều người, ớt được dùng làm gia vị nhằm làm tăng cảm giác ngon miệng hay dùng để trang trí bởi lẽ ớt cũng là loại cây cảnh đẹp. Bên cạnh đó, ớt còn có tác dụng rất tốt trong việc điều trị bệnh. Ngày nay, ớt là loại cây gia vị trồng được ở vùng nhiệt đới nhưng được tiêu thụ khắp thế giới do đó có giá trị cao ở thị trường trong nước và xuất khẩu, đem lại lợi nhuận kinh tế và là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số một trong các loại cây gia vị. Vì lí do đó mà ngày nay diện tích trồng ớt đã tăng lên rất nhiều nhưng năng xuất thật sự chưa cao. Là loại cây dễ trồng nhưng rất tốn công chăm sóc và luôn gặp những tổn thất lớn trong vấn đề về dịch bệnh đặc biệt là bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp. gây ra. Bệnh lây lan mạnh do bào tử nấm phát tán xa và nhiều theo gió. Vì vậy, đây là dịch bệnh nghiêm trọng và gần như bất trị dù có phun nhiều loại thuốc đặc trị. Bệnh xuất hiện trên lá, thân và đặc biệt là trên trái làm giảm năng xuất và chất lượng nông sản từ 28 – 35%, thiệt hại lên đến 70 – 80%. Theo Than et al. (2008) Colletotrichum sp. là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất trên toàn thế giới gây ra bệnh thán thư trên một loạt các cây trồng bao gồm ngũ cốc, các loại đậu, rau, cây lâu năm và cây ăn quả (Bailey et al., 1992). Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải có biện pháp phòng trừ bệnh hiệu quả nhằm nâng cao nâng xuất cũng như chất lượng ớt nhằm cải thiện kinh tế cho người dân. Đề tài: “Phân lập và nhận diện nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thƣ trên cây ớt” được thực hiện với mục đích là nhận diện chính xác các dòng nấm Colletotrichum sp. để tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm Colletotrichum sp. nhằm quản lí và kiểm soát nguồn dịch bệnh một cách hiệu quả, đồng thời có hướng phòng trị bệnh như: trồng các giống kháng hoặc bằng các biện pháp sinh học. 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập các dòng nấm Collectotrichum sp. gây bệnh thán thư trên cây ớt. Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây ớt Cây ớt (Capsicum ssp.) thuộc chi Capsicum của họ cà (Solanaceae) gồm 5 loài thuần hóa (C. annuum, C. baccatum, C. Chinense, C. frutescens, C. pubescens) với hơn 20 loài hoang dại. Là loài cây chịu nhiệt, nhiệt độ thích hợp tăng trưởng là 18 – 280C khi nhiệt độ cao trên 320C và thấp dưới 150C sẽ làm cây tăng trưởng kém và hoa dễ rụng. Phân loại: Giới Plantae Bộ Solanales Họ Solanaceae Chi Capsicum (Walsh và Hoot, 2001) Cây ớt là một cây nhỏ có thể sống vài năm, thân dưới hóa gỗ. Cây có nhiều cành, nhẵn. Lá mọc đơn, đôi khi mọc chùm thành hình hoa thị, lá nguyên có hình trứng đến bầu dục, phiến lá nhọn ở đầu. Hoa nhỏ, dài, hoa màu xanh có hình chén, lá đài nhỏ, hẹp và nhọn. Trái có 2 – 4 thùy, dạng trái rất thay đổi từ hình cầu đến hình nón, bề mặt trái có thể phẳng, gợn sóng có khía hay nhẵn; trái khi chín có màu đỏ, đen hoặc vàng. Trái không cay hay rất cay. Cho đến nay, ớt có rất nhiều công dụng. Với nhiều người, ớt là gia vị không thể thiếu trong các bữa ăn hằng ngày. Nếu ăn cay vừa phải sẽ giúp tăng tiết dịch vị, giúp tiêu hóa tốt hơn, ăn ngon miệng hơn, đồng thời tránh bị đầy hơi. Khi ăn ớt, vị cay kích thích thần kinh vị giác để được chuyền lên não bộ. Não bộ phản ứng bằng cách tăng nhịp tim, giãn mạch cục bộ, tăng tiết nước bọt, hắt hơi. Để giảm cảm giác đau nóng của ớt, não bộ sẽ tiết ra chất giảm đau là endorphin. Với nồng độ cao chất này gây cảm giác thoải mái. Theo Than et al. (2008) ớt có nhiều lợi thế ẩm thực. (http://giaoduc.net.vn/Utilities/PrintView.aspx?ID=282172, ngày 02/08/2013). Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Theo Than et al. (2008) trong trái ớt bao gồm nhiều chất hóa học bao gồm nhiều loại dầu dễ bay hơi, dầu béo, capsaicinoid, carotenoid, vitamin, protein, chất xơ và các chất khoáng (Bosland và Votava, 2003). Trong ớt có nhiều thành phần quan trọng có giá trị dinh dưỡng, hương vị, mùi thơm và màu sắc. Ớt có ít natri và cholesterol, giàu vitamin A và C và là một nguồn cung cấp kali, axit folic và vitamin E. Ớt xanh tươi chứa nhiều vitamin C hơn trái cam quýt và ớt đỏ tươi có nhiều vitamin A hơn cà rốt (Osuna-García et al., 1998; Marin et al., 2004). Hai nhóm hóa chất được sản xuất bởi ớt là capsaicinoid và carotenoids. Các capsaicinoid là alkaloid làm cho ớt có vị cay. Một số lượng lớn carotenoid cung cấp giá trị dinh dưỡng cao và màu sắc cho ớt (Britton và Hornero-Méndez, 1997; Hornero-Méndez et al., 2002; Pérez-Gálvez et al., 2003). Ngoài việc dùng trong thực phẩm, trái ớt còn được dùng trong y học và là cây cảnh đẹp với nhiều màu sắc như các loại ớt ngũ sắc. Hình 1: Một số loại ớt (*Nguồn: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/06/Capsicum_annuum1.jpg, ngày 02/08/2013) 2.2. Bệnh thán thƣ trên cây ớt Theo Than et al. (2008) bệnh thán thư, xuất phát từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “than”, còn gọi là bệnh đốm trái hay nổ trái. Thán thư là tên gọi phổ biến dùng chung cho cây trồng bị bệnh với triệu chứng bệnh là màu ngăm ngăm đen, tổn thương sâu và có chứa các bào tử (Isaac, 1992). Bệnh thán thư trên ớt lần đầu tiên được báo cáo ở New Jersey, Mỹ bởi Halsted. Trong năm 1890, Halsted đã mô tả nguyên nhân gây ra bệnh thán thư là hai loài Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum. Đơn vị Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT phân loại sau đó được xem xét như là từ đồng nghĩa của C. gloeosporioides bởi Arx (1957). Hình 2: Biểu hiện bệnh thán thƣ trên trái ớt. (*Nguồn: Jaw Fen Wang và Paul Gniffke, 2010) 2.2.1. Tác nhân gây bệnh Bệnh thán thư chủ yếu do nấm Colletotrichum sp. gây ra. Bảng 1. Bảng báo cáo về tác nhân gây ra bệnh thán thƣ trên ớt ở một số quốc gia. Quốc gia và khu vực Australia Tác nhân gây bệnh Colletotrichum acutatum, C. Trích dẫn Simmonds, 1965 atramentarium, C. dematium, C. gloeosporioides var. minor, C. gloeosporioides var. gloeosporioides India C. capsici Maiti and Sen, 1979; Paul and Behl, 1990 Indonesia C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides Voorrips et al., 2004 Korea C. acutatum, C. gloeosporioides, C. Park and Kim, 1992 coccodes, C. dematium Myanmar (Burma) Gloeosporium piperatum E. and E., C. Dastur, 1920 nigrum E. and Hals Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Quốc gia và khu vực Trường ĐHCT Tác nhân gây bệnh Trích dẫn Papua New Guinea C. capsici, C. gloeosporioides Pearson et al., 1984 New Zealand C. coccodes Johnston and Jones, 1997 Taiwan C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides Manandhar et al., 1995 Thailand C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides Than et al., 2008 UK C. acutatum, Glomerella cingulata Adikaram et al., 1983 USA C. acutatum Roberts et al., 2001 Vietnam C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides, Don et al., 2007 C. nigrum (*Nguồn: Than et al., 2008) 2.2.2. Những yếu tố ảnh hƣởng đến bệnh thán thƣ Theo Than et al. (2008) yếu tố môi trường góp phần quan trọng trong việc phát triển của dịch bệnh. Mối quan hệ giữa cường độ mưa, hình thái học cây trồng, sự phát tán nguồn bệnh có thể dẫn đến mức độ nặng khác nhau của bệnh (Dodd et al., 1992). Những ảnh hưởng của nhiệt độ thường tương tác với những yếu tố khác, chẳng hạn như ướt bề mặt lá, độ ẩm, ánh sáng hoặc vi sinh vật cạnh tranh (Royle và Butler, 1986). Tuy nhiên, bề mặt lá bị ướt dường như có ảnh hưởng trực tiếp lên sự nảy mầm, sự xâm nhiễm và tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh trên cây chủ. Nói chung là xâm nhiễm xảy ra trong thời tiết ấm áp, ẩm ướt. Nhiệt độ khoảng 270C và độ ẩm cao (trung bình 80%) là tối ưu cho sự phát triển bệnh thán thư (Roberts et al., 2001). 2.2.3. Triệu chứng bệnh Triệu chứng bệnh trên lá và thân: vết bệnh hình tròn hoặc không có hình dạng nhất định, xếp theo chiều dài của gân lá. Lúc đầu, đốm bệnh ở mặt dưới lá có màu nâu nhạt, sau chuyển màu nâu sậm, có viền đỏ, lan rộng và lõm sâu. Trên cuống lá và thân cây vết bệnh cũng lõm xuống tạo thành vết dọc màu nâu đen. Cây bị bệnh kém phát triển, lá vàng và rụng sớm. Trên trái: Vết bệnh lúc đầu là một đốm nhỏ hơi lõm, trên bề mặt vỏ trái. Vết bệnh, thường có hình bầu dục hoặc hình thoi, màu nâu đen hoặc màu vàng trắng, kích thước vết bệnh có thể trên dưới 1cm tuỳ thuộc vào giống ớt. Phần ranh giới giữa mô Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT bệnh và mô khoẻ thường có một đường vạch màu đen chạy dọc theo vết bệnh. Trên bề mặt mô bệnh có những chấm nhỏ màu đen đó là đĩa cành của nấm. 2.2.4. Cơ chế xâm nhiễm Theo Than et al. (2008) các loài Colletotrichum sp. sử dụng các cách khác nhau cho sự xâm chiếm các mô chủ, mà thay đổi từ bán ký sinh nội bào đến hoại dưỡng ở vách dưới biểu bì (Bailey et al., 1992). Loài Colletotrichum sp. sản xuất một loạt các cấu trúc xâm nhiễm chuyên hóa như đĩa áp và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm sơ cấp và khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Perfect và et al., 1999). Giai đoạn trước xâm nhiễm của cả hai rất giống nhau, trong đó bào tử bám chặt vào và nảy mầm trên bề mặt cây trồng, sản xuất đĩa áp và hình thành vòi xâm nhiễm sau đó thâm nhập vào các lớp biểu bì (Bailey et al., 1992). Sau khi xâm nhập, các mầm bệnh ở trong vùng vách bên dưới lớp biểu bì sống một cách hoại dưỡng và nhanh chóng lan rộng khắp các mô (O'Connell et al., 1985). Không có giai đoạn ký sinh phát hiện trong hình thức hoại sinh. Ngược lại, các mầm bệnh thán thư cho thấy sự nhiễm dinh dưỡng hoại sinh vào hình thức ký sinh bằng cách sống ở các màng sinh chất và thành tế bào trong tế bào. Sau khi ký sinh, khuẩn ty nấm trong tế bào sống ở trong một hoặc hai tế bào và sau đó sản sinh khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Bailey et al., 1992). Do đó các tác nhân gây bệnh được coi là bán ký sinh hoặc hoại dưỡng (Kim et al, 2004). Ví dụ, C. gloeosporioides trên bơ, ớt và chanh có thể sản xuất cả hai loại của sự xâm chiếm: ký sinh trong tế bào ở giai đoạn đầu và hoại dưỡng (O'Connell et al., 2000). Chỉ có một vài nghiên cứu chi tiết về cơ chế xâm nhiễm của nhiều loài Colletotrichum sp. trên ớt. Kim et al. (2004) nhận thấy rằng nhiễm hoại sinh được tìm thấy trong quá trình lây nhiễm của C. gloeosporioides trong ớt (C. annuum cv. jejujaerae). Biểu bì tế bào chất của cây chủ trở nên cô đặc và nhỏ, không bào tăng lên và phá hủy tế bào đến các tế bào dưới biểu bì của thực vật, trong đó có thể bị phá hủy bởi các enzyme của mầm bệnh. Ở các giai đoạn sau của bệnh, các mô đã bị xâm chiếm giữa và trong tế bào bởi các mầm bệnh. Đặc điểm cấu trúc này chỉ ra rằng xâm nhiễm bị chi phối bởi sự tăng trưởng nấm hoại sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Hình 3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp. (*Nguồn: Wharton và Diéguez-Uribeondo, 2004) C: Bào tử E: Mô biểu bì A: Đĩa áp M: Tế bào thịt lá Cu: Biểu bì N: Hoại sinh PP: Hình thành vòi xâm nhiễm SH: Sợi nấm thứ cấp ILS: Đốm sáng (Internal Light Spot) ScH: Dưới lớp biểu bì PH: Sợi nấm sơ cấp. Bào tử (C) mọc mầm và hình thành đĩa áp (A), đĩa áp hình thành vòi xâm nhiễm (PP) xâm nhập qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào chủ và trên đĩa áp xuất hiện đốm màu sáng (ILS). Ở hình A, với cách xâm nhiễm bán kí sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua tế bào biểu bì của tế bào chủ và phòng to lên tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nấm có kích thước lớn, được gọi là sợi nấm thứ cấp (PH). Sợi nấm này có thể định vị lan sang các mô biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế bên. Trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm này, sự tương tác giũa kí chủ và mầm bệnh là kí sinh bắt buộc. Tiếp theo là giai đoạn hoại sinh (N), sự tương tác được thể hiện qua sự hình thành sợi mầm thứ cấp (SH). Các sợi nấm thứ cấp này đâm xuyên vào trong tế bào và len lõi vào các ngã gian bào đồng thời tiết enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết tế bào chủ. Ở hình B, là cách xâm nhiễm hoại sinh, sự định cư bên dưới tế bào kí chủ bắt đầu ở bên dưới biểu bì (ScH) và thường không có giai đoạn kí sinh của sợi nấm bên trong vách hoặc nếu có Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT thì giai đoạn này rất ngắn. Nấm lây lan nhanh chóng qua các mô, đi vào trong tế bào và qua các gian bào (Wharton và Diéguez-Uribeondo, 2004). 2.2.5. Tình hình nhiễm bệnh Bệnh thường phát triển trong thời tiết mưa nhiều và ẩm độ cao. Ở miền Nam, những tháng 7, 8 và tháng 9 trong năm là thời điểm bệnh thán thư phát triển mạnh nhất do ẩm độ không khí rất cao kết hợp với lượng mưa lớn. Trên thế giới bệnh thán thư gây hại mạnh ở các nước vùng nhiệt đới. Trong đó, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam, Indonesia và cả Trung Quốc là những nước chịu thiệt hại nặng nề, thất thoát về sản lượng có thể lên đến 80%. Bệnh không chỉ nhiễm trên trái chín mà còn có cả trên trái non hay trái sau khi thu hoạch được vận chuyển đi nơi khác vẫn bị nhiễm bệnh. Một số khu vực và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện được thể hiện trong hình 4. Hình 4: Vùng và mùa mà bệnh thán thƣ xuất hiện thƣờng xuyên và nghiêm trọng. (*Nguồn: Jaw-Fen Wang và Paul Gniffke, 2010) Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT 2.3. Tổng quan về nấm Colletotrichum sp. 2.3.1. Phân loại Giai đoạn vô tính : Giới Nấm Ngành Deuteromycotina Lớp Coelomycetes Bộ Melanconiales Họ Melaconiaceae Chi Colletotrichum Giới Nấm Ngành Ascomycota Lớp Sordariomycetes Bộ Glomerelalles Họ Glomerellaceae Chi Glomerella Giai đoạn hữu tính: (*Nguồn : Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010; Phoulivong, 2011) Giai đoạn hữu tính thường hiếm khi xuất hiện và không có ngoài tự nhiên nên tên Coletotrichum sp. vẫn được duy trì và thường sử dụng trong chi này. Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.2. Lịch sử nghiên cứu Theo Phoulivong (2001) Colletotrichum lần đầu tiên được báo cáo bởi Tode (1790) đặc tên là Vermicularia, nhưng sau đó đã được mô tả lại là Colletotrichum (Corda, 1837) trong họ Melanconiales; lớp Coelomycetes; ngành Deuteromycotina. Loài Colletotrichum sp. có đơn vị phân loại bao gồm chưa hoàn chỉnh hoặc nhóm vô tính trong đó có một giai đoạn hữu tính Glomerella (Sutton, 1992). Colletotrichum sp. bao gồm số lượng các loài gây bệnh sống trong mô thực vật, sống trên mô thực vật đã chết, gần đây bệnh xuất hiện phổ biến trên một loạt các cây trồng có giá trị kinh tế cao, cây cảnh (Cai et al., 2009; Hyde et al., 2009a; Prihastuti et al., 2009; Yang et al., 2009; Phoulivong et al., 2010). Bảng 2. Bảng báo cáo một số loài Colletotrichum sp. nhiễm trên các cây trồng nhiệt đới. Trái cây Một số loài Colletotrichum Tài liệu trích dẫn Lê tàu (avocado) C. acutatum, Hindorf et al., 2000; Peres et al., (Persea americana) C. gloeosporioides 2002; Everett, 2003; Giblin et al., 2010. Chuối C. musae Postmaster et al., 1997; Peres et al., (Musa spp.) 2002; Photita el al., 2004; Nuangmek et al., 2008. Ớt C. acutatum, Kanchana-udomkarn et al., 2004; (Capsicum annuum) C. capsici, Than et al., 2008a; Kim et al., 2009; C. gloeosporioides Ratanacherdchai et al., 2010. C. acutatum, Hindorf et al., 2000 ; Chen et al., C. gloeosporioides 2005 ; Fischer et al., 2009 ; Coffee C. acutatum, Nguyen et al., 2009; Prihastuti et (Coffea arabica) C. asianum, al., 2009; Van der Vossen & C. boninense, Walyaro 2009. Citrus spp. C. capsici, C. fructicola, C. kahawae, C. gloeosporioides, C. siamense Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Trái cây Một số loài Colletotrichum Tài liệu trích dẫn Dragon fruit C. gloeosporioides Masyahit et al., 2009. C. gloeosporioides Alahakoon & Brown 1994; (Hylocereus undatus) Sầu riêng (Durio zibethinus) Pongpisutta and Sangchote 1994; Freeman et al., 1996. Cây ổi C. acutatum, Hindorf et al., 2000 ; Alahakoon & (Psidium guajava) C. gloeosporioides Brown 1994, Peres et al., 2002; Amusa et al., 2006; Soares et al., 2008. Xoài C. acutatum, Peres et al., 2002; Alahakoon & (Mangifera indica) C. gloeosporioides Brown 1994., Kefialew & Ayalew 2008; Nelson 2008; Giblin et al., 2010. Măng cụt C. gloeosporioides Alahakoon & Brown 1994. Passion fruit C. acutatum, Hindorf et al., 2000; Peres et al., (Passiflora spp.) C. gloeosporioides 2002. Đu đủ (Carica papaya) C. acutatum, Peres et al., 2002; Rahman et al., C. capsici và 2008. (Garcinia mangostana) C. gloeosporioides Rose apple C. gloeosporioides Alahakoon & Brown 1994. C. gloeosporioides Farungsang et al., 1994; Sivakumar (Syzygium jambos) Chôm chôm (Nephelium lappaceum) et al., 1997; Wijeratnam et al., 2008. Dâu tây C. acutatum, Schiller et al., 2006; Jelev et al., (Fragria frageriae) C. gloeosporioides, 2008; Hyde et al., 2009a; C. fragariae MacKenzie et al., 2009. Therbroma cacao, Colletotrichum ignotum Rojas et al., 2010. Tetragastri panamensis Colletotrichum tropicale Rojas et al., 2010. (*Nguồn : Phoulivong, 2011) Chuyên ngành Vi sinh vật học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.3. Đặc điểm chung. Colletotrichum sp. là một trong những chi nấm gây bệnh thán thư trên nhiều loại cây trồng quan trọng, đặc biệt là các cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới ảnh hưởng đến nền kinh tế (Phoulivong, 2011). Theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010) hiện nay nấm Colletotrichum sp. được mô tả có 11 loài (Arx, 1957; Sutton, 1962). Nhưng Alexopoulos và Mins (1979) thì đề xuất trên 1000 loài hình thức trong giống này đã được mô tả trước đây, phần lớn chúng trùng tên. Theo ý kiến gần đây nhất của Baxter et al., (1985), Colletotrichum được giới thiệu có 11 loài: C. coccodes, C. gloeosprioides, C. graminicola, C. capsici… là những loài thường gây bệnh thán thư. Khuẩn ty: Hệ khuẩn ty có gian bào và nội bào và ở mỗi tế bào chứa nhiều nhân. Nhiều hạt dầu được sản xuất trong hệ khuẩn ty; khi chín khuẩn ty trở nên nhạt màu và xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ lớp ngoài cùng. Khuẩn ty già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử (Chlamydospore), nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa khuẩn ty nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành khuẩn ty mới. Nấm Colletotrichum sp. có hệ khuẩn ty thật, gồm có sự phát triển của khuẩn ty mảnh phân nhánh, không màu và có vách ngăn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010). Sinh sản: Collectotrichum sp. nội sinh, sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển trên cuống bào tử; cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt. Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ cứng. Frost (1964) mô tả một vài loài của Colletotrichum sp. có hoặc không có tơ cứng có thể được kiểm soát bởi sự thay đổi độ ẩm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010). Đặc điểm hình thái học được sử dụng để xác định các loài Colletotrichum sp. là hình dạng và kích thước của đĩa cành, bào tử, cuống bào tử đính, tơ cứng, giác bám và tơ cứng trong nuôi cấy (Sutton, 1992; Cai et al., 2009, Than et al., 2008). Các bào tử của Colletotrichum gloeosporioides có hình thuôn dài với đầu hơi nhọn và nói chung là rộng hơn so với bào tử của C. fragariae và C. acutatum (Gunell & Gubler, 1992). Nhìn chung, các bào tử của C. acutatum là hình elip đến hình thoi, trong khi bào tử của Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT C. gloeosporioides thuôn dài với đầu hơi nhọn (Freeman et al., 1998). Tuy nhiên đặc điểm hình thái giữa các loài thì chồng lên nhau và chỉ riêng hình thái học không cung cấp đầy đủ thông tin cho một nhận dạng chính xác, đặc biệt là đối với những loài trong phức hệ các loài C. gloeosporioides và C. dematium. Hình 5. Bào tử một số loài Colletotrichum sp. (*Nguồn: Jaw-Fen Wang và Paul Gniffke, 2010) 2.4. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp phân lập nấm Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu. Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật. Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh vật mà ta cần. Tùy điều kiện mà chúng ta chọn cách phân lập sao cho phù hợp. Có nhiều cách phân lập nấm như: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử, phân lập bào tử đơn độc, phương pháp pha loãng; phân lập từ bào tử đảm… Phƣơng pháp dùng kim nhọn: Sử dụng phương pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển trên bất kỳ một cơ chất nào. Cách thực hiện: Chuyên ngành Vi sinh vật học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Đặt cơ chất cần phân lập (lá, cành cây mục,...) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ phóng đại 10 lần) hoặc lên kính lúp. Chỉnh tiêu cự để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ chất. Khử trùng que nhọn trên ngọn lửa đèn cồn. Đưa que nhọn vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử chuyển sang môi trường phân lập. Nuôi cấy bào tử ở nhiệt độ 250C ngày đến khi hình thành khuẩn lạc thì chuyển sang môi trường thạch nghiêng. Phƣơng pháp phân lập bào tử đơn độc: Sử dụng phương pháp này để phân lập nấm gây bệnh thực vật. Cách thực hiện: Chuẩn bị dịch huyền phù bào tử: Dùng kim nhọn đánh bẹt 1 đầu, gắn vào một cái tay cầm chắc chắn, dùng que đó cào vào chỗ trên lá cây bệnh có xuất hiện đốm nấm, đặt sang lam kính đã có sẵn một giọt nước vô trùng, khuấy đều. Dùng đầu kim lấy một giọt nước có hoà tan bào tử đó vẽ một hình tam giác lên môi trường thạch nước (Water agar). Ủ 200C. Quan sát bằng kính hiển vi, tìm bào tử nảy mầm trên môi trường thạch đĩa theo đường viền tam giác trên. Đánh dấu điểm có bào tử nẩy mầm bằng bút viết kính ở mặt dưới đĩa thạch. Chuyển đĩa môi trường thạch có nuôi cấy các bào tử trên sang kính lúp. Quan sát vị trí đánh dấu bào tử nẩy mầm. Thanh trùng que cấy, dùng que cấy lấy bào tử nảy mầm ra, chuyển sang ống nghiệm môi trường thạch nghiêng để nuôi cấy. (Nguồn: Burgess et al., 2009) Chuyên ngành Vi sinh vật học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian Từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2013. 3.2. Địa điểm Phòng Công nghệ gen thực vật và phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ. 3.3. Phƣơng tiện 3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm Ống nghiệm Eppendorf 1,5 ml, 2.2ml. Đĩa petri Kim cấy Que trải thủy tinh Lam Lamelle Bộ micropipet Đèn cồn Đầu côn các loại Kéo Bông gòn thấm nước Kính hiển vi Olympus (Nhật) Tủ cấy vô trùng Esco Tủ ủ Binder Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức) Máy ly tâm Eppendorf Máy ly tâm chân không Eppendorf Máy trộn mẫu (votex) Chuyên ngành Vi sinh vật học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Cân điện tử Satorius Máy đo pH Orion model 420A Máy khuấy từ HB50 BIBBY Bộ điện di một chiều BIO-Rad Máy PCR của BIO-RAD Máy chụp gel BIORAD UV 2000 Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan) Tủ lạnh trữ mẫu và hoá chất Alaska Tủ lạnh -200C trữ hoá chất Akira 3.3.2. Vật liệu thí nghiệm Các mẫu lá và trái ớt bị bệnh thán thư được thu tại ruộng trồng ớt ở thành phố Cần Thơ, tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Hậu Giang. Mẫu nấm Colletotrichum sp. đối chứng được cung cấp từ bộ môn Bảo vệ thực vật thuộc Khoa nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ. 3.3.3. Hóa chất Hoá chất dùng để trích DNA của nấm: Lysis bufer, B- mercaptor, EB + beta mercaptoethanol, Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), NaOAc 3M, 100 mg/ml RNAse, CH3COONH4 7.5 M, iso propanol (C3H7OH), EtOH, TE buffer. Hoá chất dùng để thực hiện phản ứng PCR: Bi-H2O, Buffer, MgCl2, Taq DNA polymerase, dNTPs, primer, BSA, DNA. Hoá chất dùng để thực hiện phản ứng điện di phân tích sản phẩm PCR: agarose, buffer TBE, loading buffer, Ethidium Bromide 10µg/ml, thang chuẩn 100 bp của Fermentas. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Thu thập và xử lý mẫu Mẫu được thu ở ruộng trồng ớt trên 3 tỉnh. Ở mỗi địa điểm thu ít nhất 5 mẫu trái và lá ớt bị bệnh, mỗi lá và trái được lấy trên mỗi cây khác nhau, các cây cách nhau ít Chuyên ngành Vi sinh vật học 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT nhất 2 m. Cho các mẫu lá và trái đã thu thập vào từng túi riêng giữ ẩ m và ghi ký hi ệu mẫu như địa điểm và ngày lấy mẫu. Sử dụng túi giấy để lấy giữ mẫu bệnh. Không bao giờ sử dụng túi nilon để giữ mẫu tươi vì mẫu vẫn có thể hô hấp, làm ẩm túi tạo điều kiện cho vi sinh vật hoại sinh xâm nhập và phát triển nhanh, phá hủy các mô thực vật. Túi nilon chỉ có thể được sử dụng để giữ các mẫu ướt trong thời gian ngắn (Burgess et al., 2009). Nên phân lập mẫu trong thời gian sớm nhất có thể tránh để lâu mẫu bị khô và nhiễm. Trường hợp mẫu bệnh không được phân tích ngay, có thể bảo quản mẫu trong túi giấy và được trữ tủ lạnh ở 40C – 80C. 3.4.2. Phân lập nấm bệnh a. Phân lập nấm. Xử lí mẫu: trái hoặc lá ớt bị bệnh được rửa với vòi nước đang chảy sau đó lau khô. Tiếp theo thực hiện trong tủ vô trùng và được tiến hành như sau: Lau cồn 70% Ngâm trong Javel 25% Rửa với nước cất vô trùng Làm khô trên giấy thấm Cắt mẫu trái (lá) với kích thước khoảng 1 cm2 Cấy mẫu Hình 6. Sơ đồ quy trình phân lập nấm Cấy mẫu: dùng kẹp kẹp mẫu cho vào đĩa petri có sẵn môi trường PDA. Mỗi đĩa 2 miếng mẫu bệnh đã được cắt trước đó. Sau đó, đậy nắp đĩa lại và ủ. Quan sát mẫu các ngày sau đó nếu xuất hiện khuẩn ty thì đem cấy chuyển và quan sát dưới kính hiển vi nếu xuất hiện bào tử giống Colletotrichum sp. thì tiếp tục tiến hành làm ròng mẫu. Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT b. Khảo sát hình thái và tốc độ phát triển của khuẩn lạc Quan sát và mô tả các đặc điểm của khuẩn lạc: Khi cấy chuyển phân lập nấm trên đĩa môi trường đặc, ta tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc và khuẩn ty bao gồm các chỉ tiêu sau: hình dạng, kích thước và màu sắc. Kích thước của khuẩn lạc được đo bằng thước. Kích thước của khuẩn ty được đo bằng trắc vi thị kính ở độ phóng đại 400 lần. Quan sát hình dạng bào tử: Bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học bằng cách làm tiêu bản giọt ép ở độ phóng đại 400 lần. Sau đó mô tả hình dạng, kích thước của bào tử. Cách làm tiêu bản giọt ép: Nhỏ khoảng 20 µl nước cất vô trùng lên miếng lam sạch. Khử trùng kim mũi giáo bằng cách đốt cho nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít khuẩn ty nấm từ khuẩn lạc rồi trải vào trong giọt nước trên lame. Đậy lamelle lên giọt huyền phù nấm. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi để thấy được hình dạng và kích thước bào tử. Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nhận diện các dòng nấm bằng phƣơng pháp truyền thống Từ các mẫu trái và lá ớt bị bệnh thán thư được thu tại 6 địa điểm trên các vườn trồng ớt ở tỉnh Hậu Giang, Cần Thơ và Vĩnh Long với hai loại ớt là chỉ thiên và sừng vàng Châu Phi. Việc thu mẫu trên nhiều địa điểm và các loại ớt nhằm tăng tính đa dạng của các dòng nấm Colletotrichum thu thập được. Kết quả phân lập được 28 dòng nấm, trong đó có 4 dòng nấm được phân lập trên lá và 24 dòng nấm được phân lập trên trái. Các dòng nấm được đặt tên theo nguyên tắc nguồn gốc xuất xứ nơi thu mẫu cũng như trên các loại ớt khác nhau và thứ tự từ nhỏ đến lớn. Các dòng này đều có đặc điểm của khuẩn lạc và hình dạng bào tử đặc trưng của nấm Colletotrichum sp như bào tử có dạng hình trụ, hình thoi, hình liềm. Trong đó, Phụng Hiệp – Hậu Giang có 2 dòng; Châu Thành A – Hậu Giang 3 dòng; 2 dòng ở Châu Thành – Hậu Giang; 13 dòng ở Phong Điền – Cần Thơ, 1 dòng ở Tân Quới – Bình Tân – Vĩnh Long, 9 dòng ở Tân Bình – Bình Tân – Vĩnh Long. 4.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trƣờng đặc Khi cấy chuyển phân lập nấm trên đĩa môi trường đặc, tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc và khuẩn ty sau bảy ngày nuôi cấy (bảng 3). Về hình dạng, các khuẩn lạc nấm đều có dạng hình tròn. Xét về tốc độ mọc của khuẩn ty chia làm hai nhóm chính. Nhóm 1 có 9 dòng (chiếm 32%), khuẩn lạc có mặt trên màu xám trắng, mặt dưới tâm khuẩn lạc màu vàng hồng, cam hoặc xám đen; tốc độ mọc khuẩn ty chậm; bìa sợi dày mô, bề mặt khuẩn ty dạng bột mịn. Nhóm 2 có 19 dòng (68%) với tốc độ mọc của khuẩn ty nhanh và vừa; mặt trên khuẩn lạc có màu trắng tâm khuẩn lạc có màu vàng hoa cau, xám đen hay tím (1 dòng); mặt dưới khuẩn lạc có màu vàng hoa cau, hồng nhạt, xám đen hay tím; bìa sợi, dày mô hay mỏng phẳng; bề mặt khuẩn ty dạng len xốp mô. Hầu hết các khuẩn lạc có một hoặc nhiều vòng tròng đồng tâm, có 1 dòng không xuất hiện vòng tròn đồng tâm (hình 7). Bên cạnh đó, các khuẩn lạc còn có các sắc tố hòa tan như màu vàng hoa cau, hồng, cam, tím hay xám đen. Kết quả quan sát màu sắc của khuẩn lạc cũng tương tự như kết quả báo cáo của Lê Thị Kiều Oanh et al. (2003). Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 3. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng nấm Colletotrichum sp. sau khi cấy 7 ngày trên môi trƣờng PDA. Màu sắc khuẩn lạc STT 1 2 3 4 5 6 Mẫu PHS 1.1 Mặt trên Mặt dưới Màu trắng Từ tâm khuẩn lạc lan ra màu hồng nhạt, rìa có màu trắng Đường kính khuẩn lạc (cm) 9.0 Chiều cao khuẩn lạc (mm) Bề mặt khuẩn lạc Bìa khuẩn lạc Số vòng tròn đồng tâm Sắc tố hòa tan 6 Len xốp mô, SNKS +++ Bìa sợi, mỏng 2 Hồng nhạt 5 Len xốp mô, SNKS ++ Bìa sợi, dày 1 0 3 Len xốp mô, SNKS ++ Bìa sợi, mỏng 0 Tím ++ Bìa sợi, dày 1 Vàng hoa cau Tốc độ mọc khuẩn ty PHS 1.2 Màu trằng Màu trắng CTS 1.1 Từ tâm lan ra màu tím rìa có màu trắng Từ tâm lan ra màu tím rìa có màu trắng CTS 1.2 Màu trắng, tâm có màu vàng hoa cau Tâm có màu vàng hoa cau, giữa có màu vàng nhạt rìa màu trắng 7.2 6 Len xốp mô, SNKS Màu xám trắng Tâm có màu đen, giữa có màu cam được bao quanh bởi vòng tròn đồng tâm màu đen, rìa có màu trắng. 4.1 3 Bột mịn, SNKS + Bìa sợi, dày 1 Cam Xám trắng Tâm màu xám đen, giữa có màu cam nhạt và bao quanh bởi vòng tròn màu xám đen 4.2 2 Bột mịn, SNKS + Bìa sợi, dày 1 Cam CTA T1.1 CTA T1.2 Chuyên ngành Vi sinh vật học 7.4 7.5 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Màu sắc khuẩn lạc STT Mẫu Mặt trên Mặt dưới Màu xám trắng Có màu cam từ tâm lan ra 8 PDS 1.1 Màu trắng Có màu hồng nhạt từ tâm ra, rìa màu trắng 9 PDS 1.2 Màu trắng hồng Màu hồng nhạt 10 PDS 1.3 Màu trắng Màu hồng từ tâm lan ra 11 PDS 2.1 Màu trắng Màu trắng tâm có màu vàng lan ra PDS 2.2 Màu trắng, tâm có màu xám đen Màu trắng, tâm có màu xám trắng PDS 2.3 Màu trắng, có màu vàng từ tâm lan ra Có màu vàng từ tâm lan ra, rìa màu trắng Màu trắng Màu trắng, tâm có màu đen 7 12 13 14 CTA T1.3 PDS 2,4 Chuyên ngành Vi sinh vật học Trường ĐHCT Đường kính khuẩn lạc (cm) 4.1 9.0 7.9 8.6 9.1 9.1 7.1 8.9 21 Chiều cao khuẩn lạc (mm) Bề mặt khuẩn lạc 2 Bột mịn, SNKS 6 Len xốp mô, SNKS 6 Len xốp mô, SNKS 6 Len xốp mô, SNKS 6 Len xốp mô SNKS 6 Len xốp mô, SNKS 6 Len xốp mô, SNKS 6 Len xốp mô, SNKS Tốc độ mọc khuẩn ty Bìa khuẩn lạc Số vòng tròn đồng tâm Sắc tố hòa tan + Bìa sợi, mỏng 1 Cam +++ Bìa sợi, mỏng 4 0 +++ Bìa sợi, dày 1 0 +++ Bìa sợi, dày 3 0 +++ Bìa sợi, dày 2 0 +++ Bìa sợi, dày 1 0 ++ Bìa sợi, dày 1 0 +++ Bìa sợi, dày 1 0 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Màu sắc khuẩn lạc STT Mẫu Mặt trên Mặt dưới 15 PDS 2.5 Màu trắng Màu hồng nhạt từ tâm lan ra, rìa có màu trắng 16 PDS 2.6 Có màu vàng từ tâm lan ra Có màu vàng từ tâm lan ra, rìa màu trắng 17 PDS 2.7 Màu trắng Màu trắng, tâm có màu hồng nhạt 18 PDS 2.8 Màu trắng Màu trắng Màu trắng Màu hồng nhạt từ tâm ra, rìa màu trắng Màu xám trắng Giữa có màu xám cam từ tâm lan ra 19 20 21 TBS 1.1 TQS 1.1 TQS 1.2 Xám trắng Chuyên ngành Vi sinh vật học Màu cam từ tâm lan ra Trường ĐHCT Đường kính khuẩn lạc (cm) 6.8 9.1 8.2 9 9.2 4.1 5.6 22 Chiều cao khuẩn lạc (mm) Bề mặt khuẩn lạc Bìa khuẩn lạc Số vòng tròn đồng tâm Sắc tố hòa tan ++ Bìa sợi, dày 2 0 7 Len xốp mô, SNKS +++ Bìa sợi, dày 3 0 6 Len xốp mô, SNKS +++ Bìa sợi, dày 1 0 5 Len xốp mô, SNKS +++ Bìa sợi mỏng 2 0 7 Len xốp mô, SNKS +++ Bài sợi, mỏng 3 0 2 Bột mịn mô, SNKS + Bìa sợi, dày 2 Cam 2 Bột mịn mô, SNKS + Bìa sợi, dày 4 Cam Tốc độ mọc khuẩn ty 7 Len sợi mảnh, nhung mượt, giữa lõm, SNKS Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Màu sắc khuẩn lạc STT Mẫu Mặt trên Mặt dưới Vàng hoa cau từ tâm ra, rìa màu trắng 22 TQS 1.3 Vàng hoa cau từ tâm ra, rìa màu trắng 23 TQS 1.4 Trắng xám Từ tâm lan ra màu đen, giữa màu hồng 24 TQS 1.5 Xám trắng Tâm có màu xám đen lan ra ngoài TQS 1.6 Màu trắng với tâm màu xám trắng Màu trắng với tâm màu đen 25 26 TQS 1.7 Màu trắng Màu hồng nhạt từ tâm lan ra 27 TQS 1.8 Màu trắng Màu vàng từ tâm lan ra Xám trắng Tâm có màu cam, giữa có màu xám đen, rìa có màu trắng 28 TQS 1.9 Chú thích: SNKS : sợi nấm khí sinh Trường ĐHCT Đường kính khuẩn lạc (cm) 8.8 5.4 4.3 9.0 9.2 3.9 4.1 Chiều cao khuẩn lạc (mm) Bề mặt khuẩn lạc Tốc độ mọc khuẩn ty Bìa khuẩn lạc Số vòng tròn đồng tâm Sắc tố hòa tan 4 Len xốp mô, SNKS +++ Bìa sợi, dày 1 Vàng hoa cau 2 Bột mịn mô, SNKS + Bìa sợi dày 2 0 2 Bột mịn, SNKS + Bìa sợi, dày 3 Xám đen 6 Len xốp mô, SNKS +++ Bìa sợi, mỏng 1 0 6 Len xốp mô, SNKS ++ Bìa sợi, dày 1 0 2 Bột mịn, SNKS + Bìa sợi, dày 1 0 2 Bột mịn mô, SNKS + Bìa sợi, dày 1 Cam Tốc độ mọc: +++ : Nhanh ++ : Vừa + : Chậm Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Mặt trên Mặt dưới PHS1.1 PHS1.2 TQS1.6 TQS1.3 TQS1.5 Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Mặt trên Mặt dưới CTS1.1 CTAT1.1 CTAT1.2 CTAT1.3 PDS2.6 Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Mặt trên Mặt dưới PDS2.1 PDS2.2 PDS2.3 Hình 7. Khuẩn lạc nấm Colletotrichum sp. sau khi cấy 7 ngày trên môi trƣờng PDA. 4.1.2 Quan sát các đặc điểm hình thái Bào tử và khuẩn ty được quan sát dưới kính hiển vi quang học bằng cách làm tiêu bản giọt ép ở độ phóng đại 400 lần. Đặc điểm khuẩn ty và bào tử của các dòng nấm Colleletotrichum sp. được mô tả trong bảng 4. Đa số bào tử của các dòng nấm đều có hình trụ (15 dòng), hình liềm (11 dòng) hoặc hình thoi (2) (hình 8). Khuẩn ty mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, có nội bào và gian bào, có nhiều hạt dầu trong khuẩn ty nấm. Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 4. Đặc điểm khuẩn ty và hình dạng bào tử của các dòng nấm Colletotrichum sp. đƣợc phân lập. STT Tên dòng nấm Hình dạng bào tử Kích thước bào Nguồn gốc thu Khuẩn ty tử (µm) mẫu Mảnh, phân nhánh, không 1 Liềm PHS1.1 1.71 – 2.565 x màu có vách ngăn, có nội bào Phụng Hiệp, 11.97 – 13.68 và gian bào, có nhiều hạt dầu Hậu Giang trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 2 Trụ PHS1.2 1.71 – 2.565 x màu có vách ngăn, có nội bào Phụng Hiệp, 8.55 – 13.68 và gian bào, có nhiều hạt dầu Hậu Giang trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 3 CTS1.1 Thoi ngắn 1.71 – 2.565 x màu có vách ngăn, có nội bào Châu Thành, 5.15 – 8.55 và gian bào, có nhiều hạt dầu Hậu Giang trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 4 CTS1.2 Trụ 1.71 – 2.565 x màu có vách ngăn, có nội bào Châu Thành, 8.55 – 13.68 và gian bào, có nhiều hạt dầu Hậu Giang trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 5 CTAT1.1 Trụ 1.71 – 2.052 x màu có vách ngăn, có nội bào Châu Thành A 6.84 – 8.55 và gian bào, có nhiều hạt dầu Hậu Giang trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 6 CTAT1.2 Trụ 1.71 – 2.052 x màu có vách ngăn, có nội bào Châu Thành A 4.275 – 5.985 và gian bào, có nhiều hạt dầu Hậu Giang trong khuẩn ty Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 STT Tên dòng nấm Hình dạng bào tử Trường ĐHCT Kích thước bào Nguồn gốc thu Khuẩn ty tử (µm) mẫu Mảnh, phân nhánh, không 7 Trụ CTAT1.3 1.71 – 3.078 x màu có vách ngăn, có nội bào Châu Thành A 6.84 – 10.26 và gian bào, có nhiều hạt dầu Hậu Giang trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 8 PDS1.1 Thoi dài 1.71 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 8.55 – 11.97 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 9 PDS1.2 Liềm 1.71 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 15.39 – 18.81 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 10 PDS1.3 Liềm 1.71 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 15.39 – 18.81 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 11 PDS2.1 Liềm 1.71 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 10.26 – 15.39 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 12 PDS2.2 Trụ 1.71 – 3.078 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 8.55 – 10.26 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 STT Tên dòng nấm Hình dạng bào tử Trường ĐHCT Kích thước bào Nguồn gốc thu Khuẩn ty tử (µm) mẫu Mảnh, phân nhánh, không 13 PDS2.3 Trụ 1.71 – 2.565 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 8.55 – 10.26 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 14 PDS2,4 Trụ 1.71 – 2.052 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 10.26 – 11.97 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 15 PDS2.5 Liềm 1.71 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 11.97 – 18.81 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 16 PDS2.6 Liềm 1.71 – 2.565 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 11.97 – 13.68 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 17 PDS2.7 Trụ 1.71 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 6.84 – 13.68 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Mảnh, phân nhánh, không 18 PDS2.8 Liềm 1.71 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào Phong Điền, 10.26 – 15.39 và gian bào, có nhiều hạt dầu Cần Thơ trong khuẩn ty Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 STT 19 20 21 22 23 24 Tên dòng nấm Hình dạng bào TBS1.1 TQS1.1 TQS1.2 TQS1.3 TQS1.4 TQS1.5 Chuyên ngành Vi sinh vật học tử Liềm Trụ Trụ Liềm Trụ Trụ Trường ĐHCT Kích thước bào Nguồn gốc thu Khuẩn ty tử (µm) mẫu Mảnh, phân nhánh, không Tân Bình 1.71 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 15.39 – 18.81 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 2.052 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 6.84 – 8.55 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 2.052 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 6.84 – 8.55 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 1.71 – 2.052 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 10.26 – 11.97 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 2.223 – 6.84 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 7.182 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 2.052 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 6.84 – 8.55 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 STT 25 26 27 28 Tên dòng nấm Hình dạng bào TQS1.6 TQS1.7 TQS1.8 TQS1.9 tử Liềm Liềm Liềm Trụ Trường ĐHCT Kích thước bào Nguồn gốc thu Khuẩn ty tử (µm) mẫu Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 1.71 – 2.052 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 10.26 – 11.97 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 1.71 – 2.052 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 10.26 – 11.97 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 1.71 – 2.052 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 10.26 – 11.97 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Mảnh, phân nhánh, không Tân Quới 2.052 – 3.42 x màu có vách ngăn, có nội bào huyện Bình 6.84 – 8.55 và gian bào, có nhiều hạt dầu Tân, Vĩnh trong khuẩn ty Long Hình 8. Các dạng bào tử nấm Colletotrichum sp. ở độ phóng đại 1000 lần Chuyên ngành Vi sinh vật học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Hai mươi tám dòng nấm Colletotrichum sp. thuần chủng được phân lập từ các mẫu ớt bị bệnh thán thư được thu tại các địa điểm khác nhau thuộc huyện Châu Thành, Châu Thành A, huyện Long Mỹ của tỉnh Hậu Giang; huyện Phong Điền của thành phố Cần Thơ và hai xã Tân Quới, Tân Bình thuộc huyện Bình Tân tỉnh Vĩnh Long. 5.2. Kiến nghị Cần thu thập thêm nhiều mẫu ở nhiều khu vực trong các tỉnh thành thuộc ĐBSCL nhằm phân lập thêm nhiều dòng nấm Colletotrichum sp. qua đó chúng ta có thể biết được chính xác số loài nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư ở khu vực ĐBSCL. Đồng thời thống kê được chính xác tình hình dịch bệnh thán thư và có những biện pháp phòng trừ hiệu quả. Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để nhận diện các dòng nấm phân lập được. Bên cạnh đó, thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về các dòng nấm phân lập được như: nghiên cứu các dòng đối kháng nấm thực hiện trong phòng thí nghiệm và nhà lưới. Chuyên ngành Vi sinh vật học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan Thúy Hiền. 2009. Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Chuyên khảo ACIAR số 129a, trang 18. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010. Giáo trình nấm học. Nxb Đại học Cần Thơ. Nguyễn Đức Lượng. 2006. Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2 thí nghiệm vi sinh vật học. Nxb Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, trang 446. Tài liệu tiếng Anh Arx JA. 1957. Die Arten der Gattung Colletotrichum Cda. Phytopathologische Zeitschrift, 29:414-468. Bailey JA, Jeger MJ. 1992. Colletotrichum: Biology, Pathology and Control. Commonwealth Mycological Institute, Wallingfoord, pp.338. Bosland P.W. and Votava E.J. 2003. Peepers: Vegetable and Spice Capsicums. CAB International, England, pp.233. Brian M. Walsh and Sara B. Hoot. 2001. Phylogenetic relationships of Casicum (Solanaceae) using DNA sequences from two noncoding regions: The chloroplast atpB-rbcL spacer region and nuclear waxy introns. Internarional journal of plant sciences, 162(6):1409-1418. Britton G. and Hornero-Méndez D. 1997. Carotenoids and Colour in Fruits and Vegetables. In: Tomás-Barberán, F.A., Robins, R.J. Photochemistry of Fruits and Vegetables. Clarendon Press, Oxford, England, pp.11-28. Cai L, Hyde KD, Taylor PWJ, Weir BS, Waller J, Abang MM, Zhang JZ, Yang YL, Phoulivong S, Liu ZY, Prihastuti H, Shivas RG, McKenzie EHC, Johnston PR. 2009. A polyphasic approach for studying Colletotrichum. Fungal Diversity, 39:183-204. Dodd JC, EstradamA, Jeger M.J. 1992. Epidemiology of Colletotrichum gloeosporioides in the Tropics. In: Bailey, J.A., Jeger, M.J. (Eds.), Colletotrichum: Biology, Pathology and Control. CAB International, Wallingford, pp.308-325. Hyde KD, Cai L, Cannon PF, Crouch JA, Crous PW, Damm U, Goodwin PH, Hl C, Johnston PR, Jones EBG, Liu ZY, McKenzie EHC, Moriwaki J, Chuyên ngành Vi sinh vật học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Noireung P, Pennycook SR, Pfenning LH, Prihastuti H, Sato T, Shivas RG, Tan YP, Taylor PWJ, Weir BS, Yang YL, Zhang JZ. 2009. Colletotrichumnames in current use. Fungal Diversity, 39:147-83. Hornero-Méndez D, Costa-García J, Mínguez-Mosquera MI. 2002. Characterization of carotenoids high-producing Capsicum annuum cultivars selected for paprika production. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(20):5711-5716. Jaw Fen Wang and Paul Gniffke. 2010. Characterization of Colletotrichum spp. causing pepper anthracnose and development of resistant pepper lines. The World Vegetable center, Asian seed congress. Isaac S. 1992. Fungal Plant Interaction. Chapman and Hall Press, London, pp.115. Kim KK, Yoon JB, Park HG, Park EW, Kim YH. 2004. Two strains of Colletotrichum gloeosporioides Penz. causing anthracnose of pepper fruits. Korean Journal of Plant Pathology, 2:107-113. Lê Thị Kiều Oanh. 2003. A Pathogenicity of Anthracnose Fungus, Colletotrichum spp., on various Thai Chilli Varieties. Dept. of Plant Pathology, Kasetsart University. Neal Stewart et al. 1993. A Rapid CTAB DNA Isolation Technique Useful for RAPD Fingerprinting and Other PCR Applications. BioTechniques 1993 article Vol. 14(5):748-749. O'Connell RJ, Bailey JA, Richmond DV. 1985. Cytology and physiology of infection of Phaseolus vulgaris by Colletotrichum lindemuthianum. Physiologial Plant Pathology, 27(1):75-98. O'Connell RJ, Perfect S, Hughes B, Carzaniga R, Bailey JA, Green J. 2000. Dissecting the Cell Biology of Colletotrichum Infection Processes. In: Bailey, JA., Jegar, MJ. (Eds.), Colletotrichum: Biology, Pathology, and Control. CAB International, Wallingfords, UK, pp.57-77. Osuna-García A, Wall MW, Waddell, CA. 1998. Endogenous levels of tocopherols and ascorbic acid during fruits ripening of New Mexican-type chilli (Capsicum annuum L.) cultivars. Journal of Agricultural and Food Chemystry, 46(12):5093-5096. Chuyên ngành Vi sinh vật học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Pérez-Gálvez A, Martin H.D, Sies H, Stahl W. 2003. Incorporation of carotenoids from paprika oleoresin into human chylomicron. British Journal of Nutrition, 89(6): 787-793. Perfect SE, Hughes HB, O’Connell RJ, Green JR. 1999. Colletotrichum: a model genus for studies on pathology and fungal-plant interactions. Fungal Genetics and Biology, 27(2-3):186-198. Phillip S. Wharton and Javier Diéguez-Uribeondo, 2004. The biology of Colletotrichum acutatum.. Anales del Jardín Botánico de Madrid, 61(1): 322. Phoulivong et al. 2010. A new species of Colletotrichum from Cordyline fruticosa and Eugenia javanica causing anthracnose disease. Mycotaxon, 114:247-257. Phoulivong. 2011. Colletotrichum, naming, control, resistance, biocontrol of weeds and current challenges. Current Research in Environmental & Applied Mycology, pp.53-68. Prihastuti H, Cai L, Chen H, McKenzie EHC, Hyde KD. 2009. Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in Chiang Mai, Thailand. Fungal Diversity 39:89-109. Roberts PD, Pernezny K, Kucharek TA. 2001. Anthracnose caused by Colletotrichum sp. on pepper. Journal of University of Florida/Institute of Food and Agricultural Sciences, pp.178. Royle D.J and Butler D.R. 1986. Epidemiological Significance of Liquid Water in Crop Canopies and its Role in Disease Forecasting. In: Ayres, P.G., Boddy, L. (Eds.). Water, Fungi and Plants. Cambridge University Press, Cambridge, pp.139-156. Sutton BC. 1992 – The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichum. In: JA Bailey, MJ Jeger. Colletotrichum biology, pathogenicity and control. CAB International, Wallingford, UK. Than PP, Prihastuti H, Phoulivong S, Taylor PWJ, Hyde KD. 2008. Chilli anthracnose disease caused by Colletotrichum species. Journal of Zhejiang University Science B, 764-778. Chuyên ngành Vi sinh vật học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT Wipornpan Photita et al. 2005. Morphological and molecular characterization of Colletotrichum species from herbaceous plants in Thailand. Fungal Diversity, 18: 117-128. Yang YL, Liu ZY, Cai L, Hyde KD, Yu ZN, McKenzie EHC. 2009. Colletotrichum anthracnose of Amaryllidaceae. Fungal Diversity, 39:123146. Yee M.F and M. Sarial. 1993. Comparative Morphology and Characterization of Colletotrichum Isolates Occurring on Cocoa in Malaysia. Universiti Pertanian Malaysia Press, 16(1):45-51. Trang web http://giaoduc.net.vn/Utilities/PrintView.aspx?ID=282172 ( ngày 02/08/2013). Chuyên ngành Vi sinh vật học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trƣờng PDA Thành phần môi trường PDA. Khoai tây..................................................280.0 g Dextrose .................................................... 20.0 g Agar ...........................................................15.0 g Thêm nước cất cho đủ 1000 ml pH = 6.5 (*Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006) Hoặc: Potato Dextrose Agar (BD 212800) ........................................ 39.0 g Thêm nước cất cho đủ ........................................................... 1000 ml (http://www.neogen.com/Acumedia/pdf/ProdInfo/7149_PI.pdf) (ngày 03/08/2013) Phụ lục 2: Vị trí mẫu đƣợc phân lập của các dòng nấm Colletotrichum sp. trên lá và trái ớt. STT Mẫu Vị trí mẫu được cấy 1 PHS1.1 Trái 2 PHS1.2 Trái 3 CTS1.1 Trái 4 CTS1.2 Trái 5 CTAT1.1 Trái 6 CTAT1.2 Trái 7 CTAT1.3 Trái 8 PDS1.1 Lá 9 PDS1.2 Lá 10 PDS1.3 Lá 11 PDS2.1 Trái 12 PDS2.2 Trái 13 PDS2.3 Trái 14 PDS2,4 Trái 15 PDS2.5 Trái 16 PDS2.6 Trái 17 PDS2.7 Trái 18 PDS2.8 Trái 19 TBS1.1 Lá STT Mẫu Vị trí mẫu được phân lập 20 TQS1.1 Trái 21 TQS1.2 Trái 22 TQS1.3 Trái 23 TQS1.4 Trái 24 TQS1.5 Trái 25 TQS1.6 Trái 26 TQS1.7 Trái 27 TQS1.8 Trái 28 TQS1.9 Trái [...]... http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/06/Capsicum_annuum1.jpg, ngày 02/08/2013) 2.2 Bệnh thán thƣ trên cây ớt Theo Than et al (2008) bệnh thán thư, xuất phát từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “than”, còn gọi là bệnh đốm trái hay nổ trái Thán thư là tên gọi phổ biến dùng chung cho cây trồng bị bệnh với triệu chứng bệnh là màu ngăm ngăm đen, tổn thư ng sâu và có chứa các bào tử (Isaac, 1992) Bệnh thán thư trên ớt lần đầu tiên được báo cáo ở New Jersey,... pháp phân lập nấm Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh vật mà ta cần Tùy điều kiện mà chúng ta chọn cách phân lập sao cho phù hợp Có nhiều cách phân lập nấm như: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử, phân. .. dòng nấm bằng phƣơng pháp truyền thống Từ các mẫu trái và lá ớt bị bệnh thán thư được thu tại 6 địa điểm trên các vườn trồng ớt ở tỉnh Hậu Giang, Cần Thơ và Vĩnh Long với hai loại ớt là chỉ thiên và sừng vàng Châu Phi Việc thu mẫu trên nhiều địa điểm và các loại ớt nhằm tăng tính đa dạng của các dòng nấm Colletotrichum thu thập được Kết quả phân lập được 28 dòng nấm, trong đó có 4 dòng nấm được phân lập. .. quả, đồng thời có hướng phòng trị bệnh như: trồng các giống kháng hoặc bằng các biện pháp sinh học 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập các dòng nấm Collectotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây ớt Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2010 - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây ớt Cây ớt (Capsicum ssp.) thuộc chi Capsicum... (1957) Hình 2: Biểu hiện bệnh thán thƣ trên trái ớt (*Nguồn: Jaw Fen Wang và Paul Gniffke, 2010) 2.2.1 Tác nhân gây bệnh Bệnh thán thư chủ yếu do nấm Colletotrichum sp gây ra Bảng 1 Bảng báo cáo về tác nhân gây ra bệnh thán thƣ trên ớt ở một số quốc gia Quốc gia và khu vực Australia Tác nhân gây bệnh Colletotrichum acutatum, C Trích dẫn Simmonds, 1965 atramentarium, C dematium, C gloeosporioides var minor,... phun nhiều loại thuốc đặc trị Bệnh xuất hiện trên lá, thân và đặc biệt là trên trái làm giảm năng xuất và chất lượng nông sản từ 28 – 35%, thiệt hại lên đến 70 – 80% Theo Than et al (2008) Colletotrichum sp là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất trên toàn thế giới gây ra bệnh thán thư trên một loạt các cây trồng bao gồm ngũ cốc, các loại đậu, rau, cây lâu năm và cây ăn quả (Bailey et al.,... tủ lạnh ở 40C – 80C 3.4.2 Phân lập nấm bệnh a Phân lập nấm Xử lí mẫu: trái hoặc lá ớt bị bệnh được rửa với vòi nước đang chảy sau đó lau khô Tiếp theo thực hiện trong tủ vô trùng và được tiến hành như sau: Lau cồn 70% Ngâm trong Javel 25% Rửa với nước cất vô trùng Làm khô trên giấy thấm Cắt mẫu trái (lá) với kích thư c khoảng 1 cm2 Cấy mẫu Hình 6 Sơ đồ quy trình phân lập nấm Cấy mẫu: dùng kẹp kẹp mẫu... phòng trừ bệnh hiệu quả nhằm nâng cao nâng xuất cũng như chất lượng ớt nhằm cải thiện kinh tế cho người dân Đề tài: Phân lập và nhận diện nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thƣ trên cây ớt được thực hiện với mục đích là nhận diện chính xác các dòng nấm Colletotrichum sp để tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm Colletotrichum sp nhằm quản lí và kiểm soát nguồn dịch bệnh một... Tuy nhiên, bề mặt lá bị ớt dường như có ảnh hưởng trực tiếp lên sự nảy mầm, sự xâm nhiễm và tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh trên cây chủ Nói chung là xâm nhiễm xảy ra trong thời tiết ấm áp, ẩm ớt Nhiệt độ khoảng 270C và độ ẩm cao (trung bình 80%) là tối ưu cho sự phát triển bệnh thán thư (Roberts et al., 2001) 2.2.3 Triệu chứng bệnh Triệu chứng bệnh trên lá và thân: vết bệnh hình tròn hoặc không... đầu, đốm bệnh ở mặt dưới lá có màu nâu nhạt, sau chuyển màu nâu sậm, có viền đỏ, lan rộng và lõm sâu Trên cuống lá và thân cây vết bệnh cũng lõm xuống tạo thành vết dọc màu nâu đen Cây bị bệnh kém phát triển, lá vàng và rụng sớm Trên trái: Vết bệnh lúc đầu là một đốm nhỏ hơi lõm, trên bề mặt vỏ trái Vết bệnh, thư ng có hình bầu dục hoặc hình thoi, màu nâu đen hoặc màu vàng trắng, kích thư c vết bệnh có