Đang tải... (xem toàn văn)
... suất mía, từ cải thiện kinh tế cho người dân Do đó, đề tài: Phân lập, nhận diện nấm mốc gây bệnh thối đỏ mía tỉnh Hậu Giang đề nhằm tạo nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sâu nấm mốc gây bệnh. .. 12 3.4.2 Phân lập nấm mốc 13 3.4.3 Nhận diện nấm phương pháp truyền thống 13 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Kết phân lập nấm mốc từ mẫu mía bị thối đỏ tỉnh Hậu Gian... bệnh thối đỏ mía góp phần đáp ứng yêu cầu nêu 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập dòng nấm mốc gây bệnh thối đỏ mía 1.3 Mục đích đề tài Làm nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sâu nấm mốc gây bệnh thối
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM MỐC GÂY BỆNH THỐI ĐỎ TRÊN CÂY MÍA Ở TỈNH HẬU GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ LIÊN DƯƠNG ANH THƯ MSSV: 3103991 LỚP : VSVH K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP NẤM MỐC GÂY BỆNH THỐI ĐỎ TRÊN CÂY MÍA Ở TỈNH HẬU GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THỊ LIÊN DƯƠNG ANH THƯ MSSV: 3103991 LỚP : VSVH K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Dương Anh Thư Nguyễn Thị Liên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học đã nhận được rất nhiều sự đóng góp quý báu từ phía cán bộ hướng dẫn, Ban Giám Đốc viện, bạn bè và sự quan tâm ủng hộ của gia đình. Trước tiên tôi chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu nâng cao trình độ trong những năm qua. Xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã hết lòng dìu dắt, dạy dỗ và nâng đỡ trong suốt thời gian học đại học. Cảm ơn cô đã chỉ dẫn và đồng hành từ đầu quá trình thực hiện đến khi luận văn được hoàn thành một cách tốt đẹp. Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện NC & PT Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, máy móc, dụng cụ và hỗ trợ đắc lực trong quá trình thực hiện luận văn, cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai và cô Nguyễn Thị Pha phòng Công Nghệ Gen Thực Vật đã nhiệt tình chỉ bảo trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Tất cả các bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 và người bạn thân nhất của tôi đã luôn bên cạnh động viên, cổ vũ và giúp tôi trong suốt quá trình học và nhất là khoảng thời gian làm luận văn. Bên cạnh đó, gián tiếp tạo nên thành công của luận văn là sự động viên, cổ vũ của gia đình. Xin cảm ơn cha, mẹ và em gái đã chia sẻ và tiếp thêm sức mạnh cho tôi trong những lúc khó khăn và mệt mỏi nhất. Một lần nữa xin gửi lời tri ân đến tất cả mọi người, những người đã yêu thương, quan tâm và hết lòng giúp đỡ tôi trong hơn ba năm tôi học tập tại trường. TÓM LƯỢC Bệnh thối đỏ trên mía do nấm Colletotrichum falcatum gây ra. Trong phạm vi nghiên cứu này: Từ 120 mẫu lá mía bị bệnh thối đỏ được thu tại bốn địa điểm khác nhau thuộc huyện Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ và Thành phố Vị Thanh của tỉnh Hậu Giang; đã phân lập được 25 dòng nấm thuần chủng. Đa số khuẩn lạc có màu trắng đục ở ngoài và vàng nhạt từ tâm ra, dạng nhung mượt hoặc len xốp, độ nổi mô hoặc lài, bìa nguyên hoặc gợn sóng (chiếm 40%) và trắng xen tím nhạt, dạng len xốp, độ nổi phẳng hoặc lài, bìa nguyên hoặc chia thùy (chiếm 48%). Các dòng còn lại khuẩn lạc có màu trắng, dạng bột mịn hoặc len xốp, độ nổi phẳng, bìa nguyên (chiếm 4%); vàng nâu, dạng bột mịn, độ nổi phẳng, bìa nguyên (chiếm 8%). Từ khóa: Bệnh thối đỏ,Colletotrichum falcatum, Hậu Giang. i MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT .......................................................................................................... LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................... TÓM LƯỢC ................................................................................................................... i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................v TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................................. vi CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ...........................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1 1.2. Mục tiêu đề tài ....................................................................................................2 1.3. Mục đích đề tài ...................................................................................................2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................3 2.1. Sơ lược về cây mía (Saccharum) .......................................................................3 2.1.1. Nguồn gốc phân loại .....................................................................................3 2.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh học của cây mía.................................................3 2.2. Tỉnh Hậu Giang-vùng trồng mía trọng điểm ..................................................4 2.2.1. Giới thiệu chung về Hậu Giang ....................................................................4 2.2.2. Tình hình trồng mía ở Hậu Giang .................................................................5 2.3. Bệnh thối đỏ trên cây mía ..................................................................................5 2.3.1. Triệu chứng bệnh ..........................................................................................6 2.3.2. Đặc điểm phát sinh bệnh ...............................................................................6 2.3.3. Tác nhân gây bệnh ........................................................................................6 2.4. Nấm mốc Colletotrichum falcatum ....................................................................7 2.4.1. Vị trí phân loại ..............................................................................................7 ii 2.4.2. Đặc điểm hình thái – sinh lý .........................................................................7 2.5. Phương pháp phân lập nấm mốc ......................................................................8 2.5.1. Các dụng cụ cấy ............................................................................................8 2.5.2. Các thao tác vô trùng ....................................................................................8 2.5.3. Phương pháp dùng kim nhọn ........................................................................9 2.5.4. Phương pháp cấy đơn bào tử ........................................................................9 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................11 3.1. Thời gian ...........................................................................................................11 3.2. Địa điểm ............................................................................................................11 3.3. Phương tiện .......................................................................................................11 3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm nuôi cấy .........................................................11 3.3.2. Vật liệu thí nghiệm......................................................................................12 3.3.3. Hóa chất ......................................................................................................12 3.4. Phương pháp .....................................................................................................12 3.4.1. Thu mẫu và xử lý mẫu ................................................................................12 3.4.2. Phân lập nấm mốc ......................................................................................13 3.4.3. Nhận diện nấm bằng phương pháp truyền thống ........................................13 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................17 4.1. Kết quả phân lập nấm mốc từ các mẫu lá mía bị thối đỏ ở tỉnh Hậu Gian ...................................................................................................................................17 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................28 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................29 PHỤ LỤC Phụ lục 1 . Thành phần và nồng độ các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Phụ lục 2. Môi trường nuôi cấy iii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1. Thuốc nhuộm Cotton blue........................................................................... 21 Bảng 2. Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine .................................................................... 22 Bảng 3. Dung dịch cố định mẫu Acid lactic ............................................................. 22 Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc của 25 dòng nấm mốc được phân lập........................ 19 Bảng 5. Đặc điểm khuẩn ty và bào tử của 25 dòng nấm mốc được phân lập .......... 24 iv DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Ruộng mía.................................................................................................... 3 Hình 2. Bản đồ hành chính tỉnh Hậu Giang .............................................................. 4 Hình 3. Bệnh thối đỏ trên lá mía ............................................................................... 5 Hình 4. Nấm Colletotrichum falcatum ...................................................................... 7 Hình 5. Đặc điểm của một số khuẩn lạc nấm mốc phân lập được. .......................... 18 Hình 6. Một số hình dạng bào tử của nấm mốc dưới độ phóng đại 1000 lần ......... 23 Hình 7. Hình dạng bào tử của nấm Colletotrichum sp. đối chứng chụp dưới độ phóng đại 1000 lần .............................................................................................................. 27 v TỪ VIẾT TẮT Bi-H2O Nước cất 2 lần ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long EB Extraction buffer H2 O2 Hydrogen peroxide H2 S Hydrogen sulfide Ha Hecta PDA Potato Dextrose Agar pH hydrogen power UV Ultra Violet V Voltaire vi Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, mía được biết đến là cây trồng đóng vai trò rất quan trọng trong đời sống xã hội. Trong công nghiệp mía được sử dụng để lấy đường. Đường là một loại thực phẩm cần có trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều quốc gia trên thế giới, cũng như là loại nguyên liệu quan trọng của nhiều ngành sản xuất công nghiệp nhẹ và hàng tiêu dùng như bánh kẹo... Ngoài sản phẩm chính là đường những phụ phẩm của cây mía cũng mang đến nhiều lợi ích như: Ngọn lá mía phơi khô có bổ sung urê được dùng làm thức ăn cho gia súc, bã mía có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp, mật rỉ dùng làm để sản xuất cồn 96o, sản xuất nhựa xêrin làm sơn, xi đánh giầy, phân bón. Thêm vào đó, mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt bởi vì mía đến mùa mưa, bộ lá mía giao nhau thành thảm lá xanh dày, diện tích lá gấp 4-5 lần diện tích đất làm cho mưa không thể rơi trực tiếp xuống mặt đất có tác dụng tránh xói mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa mía là cây rễ chum và phát triển mạnh trong tầng đất từ 0-60cm. Một ha mía tốt có thể có 13-15 tấn rễ, sau khi thu hoạch bộ rễ để lại trong đất cùng với bộ lá là chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất. Tuy nhiên, bên cạnh sự phát triển mạnh của ngành trồng mía thì tình hình dịch bệnh trên mía cũng bắt đầu xuất hiện nhiều và ngày một gia tăng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của cây mía. Trong đó phổ biến nhất là bệnh thối đỏ trên mía do nấm Colletotrichum falcatum gây ra gây hại trên thân, phiến lá, bẹ lá, mầm non và cả rễ cây. Đây là một trong những loại bệnh hại nguy hiểm trên cây mía, đặc biệt là ở những chân ruộng đất trũng, ẩm thấp, khó thoát nước, không khí nóng ẩm, mưa nhiều tạo ẩm độ không khí cao… Cây bị bệnh lá ngọn thường chuyển mầu vàng héo, nếu bị hại nặng, toàn cây có thể bị khô chết, mía gốc sẽ tái sinh kém. Bệnh không những làm giảm năng suất mía cây mà còn làm giảm hàm lượng đường của cây mía nguyên liệu rất nhiều, do đường đã chuyển hóa thành rượu. Ngoài ra, mía nguyên liệu bị bệnh làm cho nước ép dơ, gây khó khăn cho quá trình lắng lọc, chế biến. Nguồn bệnh tồn tại trong thân, lá, hom giống… của cây mía bị bệnh, trong đất ruộng. Hiện nay, vẫn chưa có các biện pháp phòng trừ đặc hiệu loại nấm này, các biện pháp phòng Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT trừ chủ yếu là sử dụng thuốc hóa học. Song, việc sử dụng các chất hóa học lại gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và làm hao tốn nhiều chi phí. Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải tìm ra phương pháp phòng trị bệnh hiệu quả, thân thiện với môi trường và ít tốn kém nhằm nâng cao năng suất mía, từ đó cải thiện kinh tế cho người dân. Do đó, đề tài: “Phân lập, nhận diện nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía ở tỉnh Hậu Giang” được đề ra nhằm tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía góp phần đáp ứng những yêu cầu nêu trên. 1.2. Mục tiêu đề tài Phân lập các dòng nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía. 1.3. Mục đích đề tài Làm nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về cây mía (Saccharum) 2.1.1. Nguồn gốc phân loại Theo phân loại khoa học hiện nay. Mía được xếp vào: Giới : Plantae Bộ : Poales Họ : Poaceae Phân họ : Panicoideae Tông : Andropogoneae Chi : Saccharum L. (*Nguồn:http://en.wikipedia.org/wiki/Sugarcane, 12/07/2013) 2.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh học của cây mía Hình 1. Ruộng mía (*Nguồn: http://phanhuucovisinh.vn/phan-huu-co-cho-cay-mia/, 12/07/2013) Mía có thân to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2-6 m, Trên cây mía, thông thường phần ngọn sẽ nhạt hơn phần gốc (trong chiết nước mía). Đó là đặc điểm chung của thực vật: chất dinh dưỡng (ở đây là hàm lượng đường) được tập trung nhiều Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT ở phần gốc (vừa để nuôi dưỡng cây vừa để dự trữ). Đồng thời, do sự bốc hơi nước của lá mía, nên phần ngọn cây lúc nào cũng phải được cung cấp nước đầy đủ để cung cấp cho lá, gây ra hàm lượng nước trong tỉ lệ đường/nước phần ngọn sẽ nhiều hơn phần gốc, làm cho ngọn cây mía nhạt hơn. 2.2. Tỉnh Hậu Giang-vùng trồng mía trọng điểm 2.2.1. Giới thiệu chung về Hậu Giang Hậu Giang là một tỉnh ở ĐBSCL. Hậu Giang là tỉnh ở trung tâm châu thổ sông MêKông, thành phố Vị Thanh là trung tâm hành chính của tỉnh cách Thành phố Hồ Chí Minh 240 km về phía tây nam, cách thành phố Cần Thơ 60 km theo Quốc lộ 61 và chỉ cách 40 km theo đường nối Vị Thanh – thành phố Cần Thơ. Hậu Giang là tỉnh thuộc khu vực nội địa của ĐBSCL. Trước năm 1945, Hậu Giang là tên gọi của sông Hậu. Vùng đất thuộc tỉnh Hậu Giang ngày nay nằm rải rác ở nhiều tỉnh khác nhau. Sau 30 tháng 04 năm 1975, tỉnh Hậu Giang được thành lập trên cơ sở sáp nhập hai tỉnh Phong Dinh và Ba Xuyên thời Việt Nam Cộng Hoà. Cuối năm 1991 tỉnh Hậu Giang được chia thành Cần Thơ và Sóc Trăng. Ngày 26 tháng 11 năm 2003, tỉnh Cần Thơ được chia thành thành phố Cần Thơ trực thuộc Trung ương và tỉnh Hậu Giang ngày nay. Hình 2. Bản đồ hành chính tỉnh Hậu Giang (*Nguồn: http://my.opera.com/HUYNHTUMAI/blog/t-nh-h-u-giang, 12/07/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.2.2. Tình hình trồng mía ở Hậu Giang Hậu Giang là tỉnh có diện tích trồng mía lớn nhất ĐBSCL hiện nay. Ở Hậu Giang mía là cây trồng đã được nông dân canh tác từ lâu đời. Tuy nhiên, trước đây diện tích và năng suất mía không ổn định do chưa được đầu tư đúng mức và đầu ra bấp bênh. Từ năm 2003 đến nay, được sự quan tâm đầu tư cơ sở hạ tầng, chuyển giao khoa học kỹ thuật, đầu tư lao động, thâm canh của nông dân, cùng với sự phối hợp của các doanh nghiệp mía đường nên diện tích mía của tỉnh đã tăng mạnh, lên đến 13.00015.000 ha/năm. Năng suất và chất lượng mía cũng được nâng cao (có nhiều hộ đạt năng suất 200 tấn/ha), duy trì sản lượng hàng năm trên 1 triệu tấn mía cây. Trong niên vụ mía 20102011, diện tích mía của tỉnh là 13.063 ha, năng suất bình quân 82,6 tấn/ha, sản lượng gần 1,1 triệu tấn. Trong đó, tập trung nhiều nhất là ở huyện Phụng Hiệp và thị xã Ngã Bảy với tổng diện tích lên đến 9.600 ha, chiếm trên 73% diện tích trồng mía của tỉnh. Còn lại trồng rải rác ở huyện Long Mỹ, Vị Thủy và thành phố Vị Thanh. Theo tính toán của các hộ trồng mía, chi phí bình quân sản xuất mía niên vụ 2010-2011 ở mức từ 600-700 đồng/kg. Niên vụ 2011-2012, diện tích mía của Hậu Giang tăng thêm 650 ha, nâng tổng diện tích toàn tỉnh lên 13.747 ha, dự kiến năng suất đạt từ 85-95 tấn/ha, sản lượng 1,2-1,3 triệu tấn. Các giống mía được nông dân trồng chủ yếu trong niên vụ này là ROC 16, ROC 18, ROC 13, ROC 11, ROC 22, QĐ 13, QĐ 11, QĐ 16, Suphanburi 7, K94- 2483, QĐ 11, QĐ 13, DLM 24, VD 86 - 368… (*Nguồn: http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/84627/Cay-mia-Hau-Giang.aspx, 30/07/2013) 2.3. Bệnh thối đỏ trên cây mía Hình 3. Bệnh thối đỏ trên lá mía (*Nguồn: http://vtc16.vn/news/55/5206/Phat-hien-va-phong-tru-benh-thoi-do-hai-mia, 13/07/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.1. Triệu chứng bệnh Bệnh thối đỏ có thể gây hại ở nhiều bộ phận của cây mía, từ thân lóng, phiến lá, bẹ lá cho đến mầm non và cả rễ của cây. Tuy nhiên, bệnh thường gây hại nhiều nhất là trong thân cây, phiến lá và bẹ lá của cây mía vào giai đoạn cây mía đã vươn lóng cao Cây bị bệnh lá ngọn thường vàng héo, nếu bị nặng toàn cây chết khô. Trên phiến lá: Bệnh thường xuất hiện ở gân chính trong lòng máng sống lá. Lúc đầu vết bệnh chỉ là những chấm nhỏ màu hồng. Sau đó phát triển dần lên phía trên và xuống phía dưới của sống lá thành những vệt dài hình bầu dục (đôi khi chỉ là những vệt dài khoảng 57cm) có màu đỏ huyết, giữa vết bệnh có màu nhạt hơn, quanh rìa có màu đỏ nâu. Trên vết bệnh cũng có những hạt đen nhỏ, đó là các ổ bào tử của nấm. Mô bị bệnh dễ bị nứt vỡ, nát ra, làm cho lá dễ bị gẫy gập xuống tại vị trí bị nứt vỡ (Vũ Triệu Mân, 2007). 2.3.2. Đặc điểm phát sinh bệnh Bệnh thối đỏ mía phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, mưa nhiều, trời nóng ẩm. Tuy nhiên, trong điều kiện nhiệt độ thấp 15-20°C mía sinh trưởng chậm, sức chống bệnh yếu thì nấm vẫn gây hại. Loại nấm gây bệnh thối đỏ sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ 27-32°C, pH 5-6. Khi nhiệt độ quá thấp (dưới 10°C) hoặc quá cao (trên 37°C) nấm sinh trưởng kém. Nấm xâm nhiễm dễ dàng qua vết thương xây xát, do đó mức độ bệnh còn liên quan tới mức độ sâu đục thân mía phá hại. Nếu sâu đục thân hại mía càng nhiều thì bệnh càng nặng. Mặt khác, mưa gió nhiều, nơi cất trữ mía không thoát nước cũng thúc đẩy sự phát sinh phát triển của bệnh. Mức độ phát sinh gây hại của nấm bệnh có liên quan chặt chẽ với cấu tạo hình thái, sinh lý của từng giống mía. Các giống mía vỏ xanh thường bị bệnh nhiều hơn giống mía vỏ vàng. Thực tế sản xuất cho thấy, Giống Roc.10 và 2714 POJ bị bệnh nặng. Giống 2883 POJ, 2678 POJ, F 103 bị bệnh nhẹ hơn. Các giống mía có hàm lượng phenol cao cũng có khả năng chống chịu bệnh cao hơn (Vũ Triệu Mân, 2007). 2.3.3. Tác nhân gây bệnh Bệnh thối đỏ, do nấm Colletotrichum falcatum gây ra. Nấm được phân lập vào năm 1892 trên một ruộng mía ở Tjomal, Java, Indonesia bởi Went. Sau đó von Arx và Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Müller (1954) phát hiện ra giai đoạn sinh sản hữu tính của Colletotrichum falcatum và đặt tên là Glomerella tucumanensis (Hyde et al., 2009). 2.4. Nấm mốc Colletotrichum falcatum 2.4.1. Vị trí phân loại Ngành : Deuteromycotina Lớp : Hypomycetes Bộ : Moniliales Họ : Tuberculariaceae Chi : Colletotrichum (Cao Ngọc Điệp, 2010) 2.4.2. Đặc điểm hình thái – sinh lý Hình 4. Nấm Colletotrichum falcatum (*Nguồn:(http://agropedia.iitk.ac.in/content/red-rot-sugarcane), (13/07/2013) Nấm Colletotrichum có hệ khuẩn ty thật, gồm có sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào. Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm. Khi già sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng. Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Colletotrichum nội sinh chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm nhiều lớp chất nền. Bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt. Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào. Bào tử có dạng liềm, cong, bào tử trong suốt có vách ngăn. Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ cứng (Cao Ngọc Điệp, 2010). 2.5. Phương pháp phân lập nấm mốc Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong quá trình nghiên cứu. Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật. Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh vật mà ta cần. Suy nghĩ một cách sáng tạo cho công việc và thành thạo với các kỹ thuật phân lập mới là yêu cầu chung của bất kỳ một nhà vi sinh vật nào. Các nhà nấm học Nhật Bản thường dùng các phương pháp sau để phân lập nấm sợi: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử; Phân lập bào tử đơn độc;... 2.5.1. Các dụng cụ cấy Que cấy móc: que cấy có đầu vuông góc, thường dùng để cấy khuẩn ty nấm Kim mũi mác: có đầu nhọn như mũi giáo dùng để cắt miếng khuẩn lạc nấm 2.5.2. Các thao tác vô trùng Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Ngọn lửa đèn cồn, đèn Bunsen có tác dụng oxy hóa không khí tạo không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm khi mở, đóng, nút bông, nắp nhựa,… Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, trong các thao tác, nhân viên cần mang găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay bằng cồn 70% hoặc các dung dịch diệt khuẩn. Tương tự như vậy tiến hành sát trùng mặt bàn thao tác trước khi bắt đầu thao tác vô trùng. Sau khi hoàn tất việc cấy chủng, tiến hành sát trùng tay, mặt bàn làm việc tương tự như trên trước khi rời phòng kiểm nghiệm. Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Nhiều loài nấm hoại sinh và vi khuẩn thường phát triển thứ sinh trên mô cây bị bệnh. Vì vậy, phải hết sức cẩn thận tránh phân lập các vi sinh vật thứ sinh bằng các phương pháp khử trừng. Tiệt trùng bề mặt các mô cây bệnh có thể giúp loại trừ các vi sinh vật hoại sinh thường phát triển trên bề mặt mô bệnh. Chọn lá có vết bệnh mới phát triển vì nấm thường đang phát triển mạnh ở các mô lá này. Cẩn thận dùng kéo hoặc dao cắt mẫu lá thành từng mẩu nhỏ tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh. Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch natri hypochlorite 10% khoảng 1 – 3 phút rồi rửa qua bằng nước vô trùng. Dùng kẹp đã khử trùng đặt miếng mẫu lên môi trường agar. 2.5.3. Phương pháp dùng kim nhọn Sử dụng phương pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển trên bất kỳ một cơ chất nào. Cách làm: 1) Đặt cơ chất cần phân lập (lá, cành cây mục,...) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ phóng đại 10 lần) hoặc lên kính lúp. 2) Chỉnh tiêu cự để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ chất. 3) Khử trùng que nhọn bằng ngọn lửa đèn cồn. 4) Đưa que nhọn vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử chuyển sang môi trường phân lập. 5) Nuôi cấy bào tử ở nhiệt độ 25o C, quan sát sự nảy mầm của bào tử hàng ngày đến khi hình thành khuẩn lạc thì chuyển sang môi trường thạch nghiêng. 2.5.4. Phương pháp cấy đơn bào tử Cấy đơn bào tử là quá trình cấy truyền một bào tử đã nảy mầm để tạo một mẫu nấm thuần. Phương pháp này thích hợp cho việc làm thuần những chi nấm tạo bào tử trên môi trường nhân tạo, như Fusarium, Colletotrichum, Alternaria, Stemphylium, Bipolaris, Verticillium và Phoma. Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Quy trình cấy đơn bào tử: 1. Khử trùng que cấy. 2. Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy lấy một lượng nhỏ sợi nấm trên mặt thạch có lẫn bào tử hoặc lấy một chút bào tử từ khối bào tử lớn của nấm rồi cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng. 3. Lắc ống nghiệm để phân tán các bào tử và kiểm tra mật độ bào tử bằng cách quan sát ống nghiệm trước ánh sáng hoặc kiểm tra một giọt dịch bào tử dưới kính lúp soi nổi. Tránh tạo dịch bào tử với mật độ bào tử quá cao. Bằng kinh nghiệm, mật độ bào tử có thể được đánh giá bằng mắt thường khi nhìn ống nghiệm. 4. Làm loãng với nước vô trùng nếu cần. 5. Đổ dịch bào tử vào một đĩa Petri có chứa một lớp mỏng môi trường thạch nước cất. 6. Đổ dịch bào tử thừa từ đĩa Petri đi. Một số bào tử sẽ nằm lại trên mặt thạch. 7. Để đĩa Petri trong khoảng 18 giờ cho đến khi bào tử nảy mầm. 8. Kiểm tra đĩa Petri dưới kính lúp soi nổi với nguồn sáng phía dưới. (Điều chỉnh nguồn sáng cẩn thận để có sự tương phản tốt giữa thạch, bào tử, và các ống mầm.) 9. Dùng kim mũi mác cắt lấy ra một bào tử nảy mầm và chuyển sang một đĩa môi trường mới (Nguồn: Cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam, 2009) Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian Từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2013. 3.2. Địa điểm Phòng Công nghệ gen thực vật và phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ. 3.3. Phương tiện 3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm nuôi cấy Eppendorf 1,5 ml; 2,2ml. Đĩa petri Kim cấy Kim mũi mác Dao mổ Lam Lamelle Bộ micropipet Đèn cồn Đầu col các loại Kéo Giấy lọc Bông gòn thấm nước 3.3.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm sinh học phân tử Kính hiển vi Olympus (Nhật) Kính lúp soi nổi Tủ cấy vô trùng Esco Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức) Máy ly tâm Eppendorf Chuyên ngành Vi sinh vật học 11 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Máy ly tâm chân không Eppendorf Máy trộn mẫu (votex) Cân điện tử Satorius Máy đo pH Orion model 420A Máy khuấy từ HB50 BIBBY Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan) Tủ lạnh trữ mẫu và hoá chất Alaska Tủ lạnh -20oC trữ hoá chất Akira 3.3.3. Vật liệu thí nghiệm - Các mẫu lá mía bị bệnh thối đỏ được thu tại một số địa điểm tại tỉnh Hậu Giang: Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ, Thành phố Vị Thanh. - Mẫu nấm đối chứng được cung cấp: Bộ môn Bảo vệ thực vật - Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng. 3.3.4. Hóa chất Hóa chất dùng để quan sát hình dạng bào tử, khuẩn ty và nhuộm màu nấm mốc: Nước cất khử trùng, thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine, thuốc nhuộm Cotton Blue. 3.4. Phương pháp 3.4.1. Thu mẫu và xử lý mẫu - Thu mẫu lá mía bị thối đỏ trên các ruộng mía tại một số địa điểm thuộc tỉnh Hậu Giang: Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ, Thành phố Vị Thanh. - Để đảm bảo phân bố chuẩn các mẫu lá bệnh ta sử dụng phương pháp thu mẫu ngẫu nhiên trên các ruộng mía. Mỗi một địa điểm thu 30 mẫu, cứ 1 liếp mía thu 5 mẫu lá mía bị thối đỏ, mỗi liếp mía thu cách nhau 2 – 3m. Cho các mẫu lá đã thu thập vào túi giữ ẩm và ghi ký hiệu mẫu. - Túi mẫu được đặt trong thùng xốp có chứa nước đá để giữ cho các mẫu không bị khô và vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm phân tích. - Trường hợp mẫu bệnh không được phân tích ngay, có thể bảo quản mẫu trong túi giữ ẩm và được trữ mát ở 4oC. Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.4.2. Phân lập nấm mốc Việc phân lập từ thân thường được cải thiện bằng cách gọt bỏ phần vỏ hoặc các mô thân bên ngoài trước khi khử trùng bề mặt. Chọn mô mới bị bệnh để phân lập. Không nên sử dụng các mô đã bị bệnh lâu bởi vì trên bề mặt các mô bệnh này thường có rất nhiều nấm và vi khuẩn hoại sinh phát triển. - Xử lý mẫu: Rửa mẫu lá trong nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác. Khử trùng bề mặt mẫu lá bằng cách dùng gòn đã nhúng cồn 70% lau mặt lá, nhúng mẫu lá vào dung dịch Javel (10-14% Clo) trong 1-3 phút sau đó rửa lại trong nước cất vô trùng và để khô trên giấy thấm đã khử trùng. - Cấy phân lập: Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt những miếng cấy nhỏ (khoảng 2 × 2 mm) từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh cấy lên môi trường PDA, đặt miếng mẫu gần mép đĩa. Ủ đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25oC. - Cấy truyền và làm thuần mẫu nấm: Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản nấm phát triển từ những miếng cấy, cấy truyền chúng (chú ý cắt ở mép ngoài tản nấm) sang môi trường PDA. Cấy truyền trên môi trường PDA cho đến khi khuẩn lạc xuất hiện đồng nhất với hình dạng và màu sắc đặc trưng của nấm Colletotrichum. - Làm tiêu bản quan sát mẫu: dưới kính hiển vi để khẳng định chính xác hình dạng bào tử và khuẩn ty của nấm Colletotrichum (Roger Shivas và Dean Beasley, 2005) - Phương pháp trữ mẫu: Theo Harris khi nấm đã ròng thì ta sẽ cấy lấy khuẩn ty và bào tử nấm vào các lọ Wheaton 5 ml hoặc lọ McCartney 20 ml có chứa 3-5ml nước cất đã được khử trùng để trữ giống. Nắp được vặn chặt và bọc nilon mỏng. Bảo quản lọ mẫu ở nhiệt độ phòng, nơi không có bụi bẩn. Phương pháp này giúp bảo quản mẫu nấm được vài năm và giúp tiết kiệm chi phí so với các phương pháp khác. Mỗi lọ mẫu được xem như là một dòng (isolate). 3.4.3. Nhận diện nấm bằng phương pháp truyền thống Khảo sát hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử nấm - Quan sát và mô tả đặc điểm các khuẩn lạc: Sau khi cấy chuyển phân lập nấm trên đĩa môi trường đặc, ta tiến hành quan sát và mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu sau: hình dạng, màu sắc, độ nổi và hình dạng bìa bằng mắt thường (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008). Chuyên ngành Vi sinh vật học 13 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Tuy nhiên đối với khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ ta có thể dùng kính lúp để quan sát. Sử dụng thước kẻ có vạch chia cm để đo đường kính và chiều cao khuẩn lạc trên đĩa petri. - Quan sát khuẩn ty và bào tử nấm: Sau khi phân lập và tách ròng nấm, tiến hành quan sát hình dạng bào tử và khuẩn ty của nấm bẳng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Có rất nhiều dạng nấm Colletotrichum trong tự nhiên từ hoại sinh đến kí sinh trên các kí chủ đặc hiệu. Các loài thường tồn tại thời gian dài trên các xác bã thực vật, trong hoặc trên mặt đất với các đặc điểm chung như sau: Sợi nấm: mảnh, phân nhánh, có vách ngăn, từ trong suốt đến nâu nhạt, bên trong tế bào chất có các giọt dầu. Đĩa cành: nằm trong biểu bì đến dưới biểu bì, có vách ngăn hoặc không, tạo thành màu trong suốt hoặc nâu, có vách mỏng hoặc dày, có dạng giả nhu mô. Lông cứng: có hoặc không có, hình thành không đồng đều, thẳng đứng hoặc hơi thẳng, không phân nhánh, đỉnh nhọn hoặc tù, nâu, mịn, vách dày, có vách ngăn. Cuống bào tử đính: có vách ngăn, phân nhánh, có màu từ trong suốt đến nâu nhạt, mịn, được hình thành trên tế bào giả nhu mô của đĩa cành. Bào tử đính: trong suốt, không có vách ngăn, có ít hoặc nhiều giọt dầu nhỏ, hình trụ, hình chùy dài, hình liềm, hình thoi, khi nảy mầm chuyển sang màu nâu nhạt có vách ngăn tạo thành dạng sợi áp (D.V. Singh et al., 2007). - Cách làm tiêu bản giọt ép: Nhỏ khoảng 20 µl nước cất vô trùng lên miếng lam sạch. Khử trùng kim mũi mác hoặc que cấy vòng bằng cách đốt cho nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng kim mũi mác đã khử trùng lấy một ít sinh khối nấm từ một khuẩn lạc đã được làm thuần rồi trải vào trong giọt nước trên lame. Sử dụng kim mũi mác đã khử trùng khác để tách rời đám khuẩn ty thật mỏng để dễ quan sát. Đậy lamelle lên giọt huyền phù nấm. Chuyên ngành Vi sinh vật học 14 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi để thấy được hình dạng bào tử và khuẩn ty của nấm. - Nhuộm màu nấm: Hầu hết nấm và vi khuẩn có thể quan sát được dưới kính hiển vi phương pháp làm tiêu bản giọt ép. Ngoài ra, có thể sử dụng acid lactic làm môi trường cố định nấm. Việc nhuộm màu thường áp dụng đối với các cấu trúc nấm không màu sắc. Hai hóa chất nhuộm màu thường dùng cho nấm là thuốc nhuộm bông xanh (cotton blue) và lacto-fushin. Bảng 1. Thuốc nhuộm Cotton blue Cotton blue (hay trypan blue) Cotton blue (Trypan blue) 0,1g Acid lactic 25ml Glycerol 50ml Nước cất 25ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013) Bảng 2. Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine Lacto-Fuchsine Acid Fuchsine 0,1g Acid lactic 100ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 15 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 3. Dung dịch cố định mẫu acid lactic Dung dịch cố định mẫu acid lactic Acid lactic 100ml Glycerol 200ml Nước cất 100ml (*Nguồn:http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_c ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013) Các bước thực hiện: Nhỏ khoảng 20 µl dung dịch nhuộm màu Lacto-Fuchsine, Cotton blue hoặc dung dịch cố định mẫu acid lactic lên miếng lam sạch. Khử trùng kim mũi mác hoặc que cấy vòng bằng cách đốt cho nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng kim mũi mác đã khử trùng lấy một phần nhỏ mô có bào tử và đặt vào giọt dung dịch thuốc nhuộm. Đậy lamelle lên giọt huyền phù nấm Quan sát mẫu nấm dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần. Chuyên ngành Vi sinh vật học 16 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập nấm mốc từ các mẫu lá mía bị thối đỏ ở tỉnh Hậu Giang. Từ 120 mẫu lá mía bị bệnh thối đỏ được thu tại bốn địa điểm khác nhau thuộc huyện Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ và Thành phố Vị Thanh của tỉnh Hậu Giang; đã phân lập được 25 dòng nấm thuần. Các dòng nấm được đặt tên theo nguyên tắc đối tượng kí chủ, nguồn gốc nơi thu mẫu và thứ tự từ nhỏ đên lớn. Các dòng này đều có đặc điểm về khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử đặc trưng của nấm Colletotrichum sp. Trong đó có 4 dòng từ huyện Phụng Hiệp, 7 dòng từ Thị xã Ngã Bảy, 6 dòng từ huyện Long Mỹ và 8 dòng từ Thành phố Vị Thanh. Kết quả cụ thể như sau: Về đặc điểm khuẩn lạc: + Trắng đục ở ngoài và vàng nhạt từ tâm ra, dạng nhung mượt hoặc len xốp, độ nổi mô hoặc lài, bìa sợi hoặc gợn sóng (chiếm 40%). + Trắng, dạng bột mịn hoặc len xốp, độ nổi phẳng, bìa sợi (chiếm 4%) + Vàng nâu, dạng bột mịn, độ nổi phẳng, bìa sợi (chiếm 8%) + Trắng xen tím nhạt, dạng len xốp, độ nổi phẳng hoặc lài, bìa sợi hoặc chia thùy (chiếm 48%). 1 2 3 4 5 6 7 8 Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Hình 5. Đặc điểm của một số khuẩn lạc nấm mốc được phân lập Chú thích: Màu sắc mặt trước, mặt sau khuẩn lạc của các dòng nấm mốc trên môi trường PDA sau 7 ngày nuôi cấy: 1-2. MH1; 3-4. MB1; 5-6. MH2; 7-8. MM26; 9-10. MB12; 11-12. MB13; 13-14. MH18.2; 15-16. MB5.1; 17-18. MM19.3; 19-20. MT26; 21-22. MB7.1; 23-24. MT2.2. (Đường kính đĩa: 9 cm) Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc của 25 dòng nấm được phân lập Màu sắc khuẩn lạc Tên Đường kính dòng STT 1 nấm MH1 khuẩn Mặt trước Mặt sau Trắng đục, Trắng đục, có màu vàng từ tâm ra lạc (cm) Dạng Chiều cao Độ nổi (mm) bề mặt Dạng khuẩn bìa lạc Len Dày, vàng từ tâm xốp, có gợn ra, có vòng SNKS sóng tròn đồng tâm trên 8,5 7 Mô Tốc độ mọc Sắc tố hòa tan +++ vàng +++ - +++ vàng +++ Tím, toàn bề mặt khuẩn lạc 2 MH2 Trắng Trắng 8,4 1,5 Phẳng Bột, Mỏng, mịn, Phẳng có ít SNKS 3 4 5 MH3 Trắng đục, Trắng, vàng vàng nhạt từ tâm ra Len Dày nhạt từ tâm xốp, có gợn ra, có vòng nhiều sóng tròn đồng tâm SNKS MH18. Tím nhạt Vàng xen 2 xen trắng đục MB1 8,1 7 Mô Len Mỏng, tím, có vòng xốp, có sợi tròn đồng tâm nhiều màu đen SNKS Trắng đục, Trắng đục, vàng nhạt từ tâm ra 9 2 Lài nhạt Nhung Dày, vàng nhạt từ mượt, gợn tâm ra có ít sóng 7,1 6 Lài vàng ++ - ++ - SNKS 6 MB2 Trắng đục, Trắng đục, vàng nhạt từ tâm ra Len Dày, vàng nhạt từ xốp, có gợn tâm ra nhiều sóng 6,8 5 Mô SNKS Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Màu sắc khuẩn lạc Tên Trường ĐHCT Đường kính dòng STT 7 nấm Mặt trước MB5.1 Trắng nhạt ở Trắng đục ở ngoài, tím nhạt từ tâm khuẩn Mặt sau lạc (cm) Dạng Chiều cao Độ nổi (mm) MB7.1 Trắng đục Dạng khuẩn bìa lạc Len Mỏng, ngoài, tím xốp, có sợi nhạt từ tâm ra nhiều 8,6 1,5 Lài ra 8 bề mặt Tốc độ mọc Sắc tố hòa tan +++ Tím ++ - +++ - + Vàng SNKS Trắng đục, Len Dày, vàng nhạt từ xốp, có gợn tâm ra nhiều sóng 7,4 1,5 Lài SNKS 9 MB7.2 Trắng đục Trắng đục 8,5 2,5 Lài xen vàng nhạt Nhung Dày, mượt, gợn có ít sóng SNKK 10 MB12 Vàng nâu Bột, Mỏng, nhạt, có mịn, sợi vòng tròn không đồng tâm có Vàng 5,2 0,5 Phẳng nhạt SNSK 11 MB13 Vàng nâu Bột, Mỏng, nhạt, có mịn, sợi vòng tròn không đồng tâm có Vàng 6,5 0,5 Phẳng + Vàng nhạt SNSK 12 MM2 Trắng Trắng 9 5 Mô Nhung Dày, mượt, gợn có ít sóng +++ - SNKS Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Tên Màu sắc khuẩn lạc Trường ĐHCT Đường kính dòng STT 13 14 15 nấm khuẩn Mặt trước Mặt sau MM3. Trắng đục, Vàng nhạt từ 1 có vòng tròn lạc (cm) Dạng Chiều cao Độ nổi (mm) bề mặt Dạng khuẩn bìa lạc Lồi ở Len tâm ra, có giữa, xốp, có đồng tâm vòng tròn lài rất ít màu tím đồng tâm xung SNKS màu tím quanh 8,8 3 MM3. Trắng xen Hồng nhạt, 2 hồng nhạt và vòng ngoài có xốp, có tím, có ít màu xám nhạt rất ít SNKS có khía SNKS MM19 Trắng, tím Tím nhạt, tím .1 từ tâm ra sẫm từ tâm ra 8,7 3 5 0,5 Lài Phẳng Len Dày, sợi Tốc độ mọc +++ Sắc tố hòa tan Tím nhạt Dày, sợi +++ Hồng nhạt Len Mỏng, xốp, có chia ít thùy + Tím nhạt SNKS 16 MM19 Tín sẫm xen Tím đậm, có .3 trắng khía 5 0,5 Phẳng Len Mỏng, xốp, có chia ít thùy + Tím nhạt SNKS 17 MM26 Trắng đục, Trắng đục, có có nhiều nhiều vòng xốp, có vòng tròn tròn đồng tâm ít đồng tâm màu hồng rất SNKS 8,6 3 Phẳng Len Dày, sợi +++ - Len Mỏng, +++ - xốp, có sợi ++ - nhạt 18 MT2.2 Trắng đục Trắng xen xen tím nhạt vàng nhạt 8,5 2 Lài nhiều SNKS 19 MT3.2 Trắng đục , Trắng đục, tím nhạt từ vàng nhạt có xốp, có tâm ra vòng tròn ít đồng tâm rất SNKS 6,5 1,5 Phẳng Len Dày, sợi mờ Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Màu sắc khuẩn lạc Tên Trường ĐHCT Đường kính dòng STT 20 nấm MT4.2 khuẩn Mặt trước Mặt sau lạc (cm) Dạng Chiều cao Độ nổi (mm) bề mặt Dạng khuẩn bìa lạc Trắng đục Trắng đục, xen tím tím nhạt, có xốp, có nhiều vòng ít tròn đồng tâm SNKS 7,3 1,5 Lài Len Tốc độ mọc Sắc tố hòa tan Dày, sợi ++ - Dày, sợi +++ - Dày, sợi +++ - Dày, sợi ++ - Dày, sợi +++ - Dày, sợi + - màu tím nhạt 21 MT5 Trắng đục, Trắng đục, Lồi ở Len vàng nhạt từ vàng nhạt từ giữa, xốp, có tâm ra tâm ra lài nhiều xung SNKS 8,2 3 quanh 22 MT6 Trắng đục Trắng đục 8,3 2,5 Mô Len xốp 23 MT12 Trắng đục, Trắng, tím tím nhạt từ nhạt, có nhiều xốp, có tâm ra vòng tròn ít đồng tâm SNKS 7 1,5 Lài Len màu tím 24 MT16 Trắng Trắng 8,3 2 Phẳng Len xốp, có ít SNKS 25 MT26 Trắng, tím Trắng, tím nhạt từ tâm nhạt, có vòng xốp, có ra tròn đồng tâm ít màu tím SNKS 6,5 1,5 Len Tốc độ mọc: +++: Nhanh Chú thích: SNKS : sợi nấm khí sinh - Phẳng : không có ++ : Vừa + : Chậm Về đặc khuẩn ty và bào tử: Sau khi quan sát nấm trong tiêu bản giọt ép dưới độ phóng đại 400 lần và 1000 lần của kính hiển vi quang học Olympus thì tất cả 25 dòng nấm khuẩn ty đều có vách ngăn ngang. Tuy nhiên các dòng nấm có sự khác Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT biệt về hình dạng bào tử như sau: có 11 dòng nấm có bào tử dạng hình liềm, nhọn hai đầu và có nhiều giọt dầu trong tế bào chất (chiếm 44%); 11 dòng nấm có bào tử dạng hình thoi (chiếm 44%); các dòng còn lại có dạng bào tử hình trụ, tròn hai đầu (chiếm 12%). Kết quả này cũng tương tự như những nghiên cứu của một số tác giả khác (Damm et al., 2009; Meizhu Du et al., 2005) nghiên cứu về nấm Colletotrichum sp. trên các đối tượng khác nhau. A B C D A E F Hình 6. Một số hình dạng bào tử của nấm mốc chụp dưới độ phóng đại 1000 lần. Chú thích: A: MH1; B: MH6; C: MB12; D: MB13; E: MB1; F: MM3.1 Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 5. Đặc điểm khuẩn ty và bào tử của 25 dòng nấm mốc được phân lập. STT 1 2 3 4 Tên Hình dòng dạng bào nấm tử MH1 MH2 MH3 MH18.2 Kích thước Khuẩn ty bào tử (µm) Nguồn gốc thu mẫu Liềm, 15,4 - 20,5 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Liềm, 13,7-18.8 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Liềm, 16,2-20,5 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Hình thoi 3,4-5,9 x 1,71- Mảnh, phân nhánh, không màu, có 2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Tân Long, Phụng Hiệp Tân Long, Phụng Hiệp Tân Long, Phụng Hiệp Tân Long, Phụng Hiệp gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm 5 6 7 MB1 MB2 MB5.1 Liềm, 29-30 x 2,6- Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 3,4 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Liềm, 29-30,7 x 2,6- Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 3,4 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Hình thoi 4,3-5,13 x 1,4- Mảnh, phân nhánh, không màu, có 2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Lái Hiếu, Ngã Bảy Lái Hiếu, Ngã Bảy Lái Hiếu, Ngã Bảy gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 STT 8 9 10 Trường ĐHCT Tên Hình dòng dạng bào nấm tử MB7.1 Liềm, 15,4-20,5 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và MB7.2 MB12 Kích thước Khuẩn ty bào tử (µm) Nguồn gốc thu mẫu nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Liềm, 15,4-18,8 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Hình trụ 9,4-10,3 x 2,6- Mảnh, phân nhánh, không màu, có tròn hai 3,4 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Lái Hiếu, Ngã Bảy Lái Hiếu, Ngã Bảy Lái Hiếu, Ngã Bảy gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm 11 MB13 Hình trụ, 5,9-8,5 x 2,6- Mảnh, phân nhánh, không màu, có tròn hai 3,4 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Lái Hiếu, Ngã Bảy gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm 12 13 MM2 MM3.1 Liềm, 15,4-17,1 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Hình thoi 4,3-5,13 x 1,4- Mảnh, phân nhánh, không màu, có 2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Vĩnh Viễn A, Long Mỹ Vĩnh Viễn A, Long Mỹ gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm 14 MM3.2 Hình thoi 5,13-6,8 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có 1,71-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Vĩnh Viễn A, Long Mỹ gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm 15 MM19.1 Hình trụ, 5,9-8,5 x 2,6- Mảnh, phân nhánh, không màu, có tròn hai 3,4 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và đầu Vĩnh Viễn A, Long Mỹ gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 STT 16 17 18 Tên Hình dòng dạng bào nấm tử MM19.3 MM26 MT2.2 Trường ĐHCT Kích thước Khuẩn ty bào tử (µm) Nguồn gốc thu mẫu Liềm, 15,4-18,8 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Liềm, 15,4-18,8 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Hình thoi 4,3-5,13 x 1,4- Mảnh, phân nhánh, không màu, có 2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Vĩnh Viễn A, Long Mỹ Vĩnh Viễn A, Long Mỹ Tân Tiến, Vị Thanh gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm 19 MT3.2 Hình thoi 6-6,8 x 1,71- Mảnh, phân nhánh, không màu, có 2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Tân Tiến, Vị Thanh gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm 20 MT4.2 Hình thoi 5,13-7,6 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có 1,71-2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Tân Tiến, Vị Thanh gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm 21 22 23 MT5 MT6 MT12 Liềm, 17,1-23,94 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-3,42 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Liềm, 15,4-25,7 x Mảnh, phân nhánh, không màu, có thuôn 2,6-3,42 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và nhọn hai gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế đầu bào khuẩn ty nấm Hình thoi 7,7-8,6 x 1,71- Mảnh, phân nhánh, không màu, có 2,5 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Tân Tiến, Vị Thanh Tân Tiến, Vị Thanh Tân Tiến, Vị Thanh gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 STT 24 Tên Hình dòng dạng bào nấm tử MT16 Hình thoi Trường ĐHCT Kích thước Khuẩn ty bào tử (µm) Nguồn gốc thu mẫu 4,2-5,9 x 1,4- Mảnh, phân nhánh, không màu, có 2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Tân Tiến, Vị Thanh gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm 25 MT26 Hình thoi 5,13-5,9 x 1,4- Mảnh, phân nhánh, không màu, có 2,9 vách ngăn, sợi nấm có nội bào và Tân Tiến, Vị Thanh gian bào, có nhiều hạt dầu trong tế bào khuẩn ty nấm Qua kết quả quan sát đặc điểm khuẩn ty và bào tử của 25 dòng nấm dưới kính hiển vi quang học Olympus ta nhận thấy: Tất cả 25 dòng nấm phân lập được đều có hình dạng khuẩn ty tương tự như hình dạng khuẩn ty của mẫu nấm đối chứng. Bên cạnh đó, trong 25 dòng nấm phân lập được có 11 dòng nấm có dạng bào tử hình liềm, thuôn nhọn hai đầu giống với dạng bào tử của mẫu nấm Colletotrichum sp. đối chứng. Ngoài ra, 14 dòng nấm còn lại có hình dạng bào tử khác biệt so với mẫu nấm đối chứng. Hình 7. Hình dạng bào tử nấm Colletotrichum sp. đối chứng chụp dưới độ phóng đại 1000 lần. Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đã phân lập được 25 dòng nấm thuần từ 120 mẫu lá mía bị bệnh thối đỏ được thu thập tại các địa điểm khác nhau ở huyện Phụng Hiệp, thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ và thành phố Vị Thanh thuộc tỉnh Hậu Giang. 5.2. Đề nghị Cần thu thập thêm nhiều mẫu bệnh thối đỏ trên lá mía, thân mía ở các huyện còn lại của tỉnh Hậu Giang cho việc thống kê tình hình dịch bệnh thối đỏ trên mía và có biện pháp phòng trừ hiệu quả. Nhận diện nấm mốc bằng kỹ thuật PCR Tận dụng nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm Colletotrichum sp. Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan Thúy Hiền. 2009. Cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Chuyên khảo ACIAR số 129a. Tr. 76-79. Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Hữu Hiệp. 2008. Giáo trình thực tập vi sinh vật học. Trường Đại học Cần Thơ. Tr 23-27. Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành. 2010. Giáo trình nấm học. Trường Đại Học Cần Thơ. Tr. 84-86. Vũ Triệu Mân. 2007. Giáo trình bệnh cây chuyên khoa. Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. Tr.100. Vũ Triệu Mân. 2007. Giáo trình bệnh cây đại cương. Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. Tr.15-17. Tài liệu tiếng Anh Bridge, Arora, Reddy, Elander. 1997. Applications of PCR in Mycology. University Press, Cambridge, pp. 65. Hyde, K.D., Cai, L., Cannon, P.F., Crouch, J.A., Crous, P.W., Damm, U., Goodwin, P.H., Chen, H., Johnston, P.R., Jones, E.B.G., Liu, Z.Y., McKenzie, E.H.C., Moriwaki, J., Noireung, P., Pennycook, S.R., Pfenning, L.H., Prihastuti, H., Sato, T., Shivas, R.G., Tan, Y.P., Taylor, P.W.J., Weir, B.S., Yang, Y.L. Zhang, J.Z. 2009. Colletotrichum –names in current use. Fungal and Diversity 39: 147-182. J. Webster and R. W. S. Weber. 2007. “Introduction to fungi”. Cambridge University Press, pp. 387. P. Malathi, R. Viswanathan, A. Ramesh Sundar and N. Prakasam (2013). Keys to Identify Pathogen Variability in Colletotrichum Falcatum Went Causing Red Rot in Sugarcane, Division of Crop Protection, Sugarcane Breeding Institute, Coimbatore Tamil Nadu, India, 24 – 28. Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Meizhu Du, Christopher L. Schardl, Etta M. Nuckles and Lisa J. Vaillancourt (2005). Using mating-type gene sequences for improved phylogenetic resolution of Collectotrichum species complexes, Mycologia 97(3), pp. 641–658. Nova MX, Borges LR, de Sousa AC, Brasileiro BT, Lima EA, da Costa AF, de Oliveira NT (2011). Pathogenicity for onion and genetic diversity of isolates of the pathogenic fungus Colletotrichum gloeosporioides (Phyllachoraceae) from the State of Pernambuco, Brazil, Genetics and Molecular Research 10 (1): 311320. Roger Shivas, Dean Beasley. (2005). Mangement of plant pathogen collection. Australian Government Department of Agriculture, Fisheries and Forestry, pp. 21-29. Trang web http://agropedia.iitk.ac.in/content/red-rot-sugarcane, (ngày 13/07/2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Sugarcane, (ngày 12/07/2013) http://my.opera.com/HUYNHTUMAI/blog/t-nh-h-u-giang, (ngày 12/07/2013) http://nature.berkeley.edu/brunslab/picts/results/its-map.GIF,(ngày 02/8/2013) http://phanhuucovisinh.vn/phan-huu-co-cho-cay-mia/, (12/07/2013) http://openwetware.org/wiki/Filamentous_fungi_genomic_DNA_isolation_protocol, (ngày 30/07/2013) http://thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/di-truyen-phan-tu/460-dien-di-phantich- adn-va-arn, (ngày 24/07/2012) http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html, (ngày 20/07/2013) http://vtc16.vn/news/55/5206/Phat-hien-va-phong-tru-benh-thoi-do-hai-mia, (ngày 13/07/2013) http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/namsoi01.htm, (ngày 23/11/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 30 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT http://www.hardydiagnostics.com/articles/Saving-fungal-Cultures-Sterile-Water-By Harris.pdf, (ngày 24/07/2013) http://www.daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pat hogen_collections_vietnamese.pdf, (ngày 24/07/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 31 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1. Thành phần và nồng độ các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Hóa chất dùng để quan sát hình dạng bào tử, khuẩn ty và nhuộm màu nấm mốc Colletotrichum: Nước cất khử trùng, thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine, thuốc nhuộm Cotton Blue. Phụ lục 2. Môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường PDA Thành phần Nồng độ Khoai tây 200 g/l Dextrose (glucose) 20 g/l Agar 20 g/l Nước cất Chuyên ngành vi sinh vật học 1000 ml PL1 Viện NC&PT Công nghệ sinh học [...]... trị bệnh hiệu quả, thân thiện với môi trường và ít tốn kém nhằm nâng cao năng suất mía, từ đó cải thiện kinh tế cho người dân Do đó, đề tài: Phân lập, nhận diện nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía ở tỉnh Hậu Giang được đề ra nhằm tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía góp phần đáp ứng những yêu cầu nêu trên 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập. .. của ngành trồng mía thì tình hình dịch bệnh trên mía cũng bắt đầu xuất hiện nhiều và ngày một gia tăng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của cây mía Trong đó phổ biến nhất là bệnh thối đỏ trên mía do nấm Colletotrichum falcatum gây ra gây hại trên thân, phiến lá, bẹ lá, mầm non và cả rễ cây Đây là một trong những loại bệnh hại nguy hiểm trên cây mía, đặc biệt là ở những chân ruộng... dòng nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía 1.3 Mục đích đề tài Làm nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây mía (Saccharum) 2.1.1 Nguồn gốc phân loại Theo phân loại khoa học hiện nay Mía. .. Giang là tỉnh thuộc khu vực nội địa của ĐBSCL Trước năm 1945, Hậu Giang là tên gọi của sông Hậu Vùng đất thuộc tỉnh Hậu Giang ngày nay nằm rải rác ở nhiều tỉnh khác nhau Sau 30 tháng 04 năm 1975, tỉnh Hậu Giang được thành lập trên cơ sở sáp nhập hai tỉnh Phong Dinh và Ba Xuyên thời Việt Nam Cộng Hoà Cuối năm 1991 tỉnh Hậu Giang được chia thành Cần Thơ và Sóc Trăng Ngày 26 tháng 11 năm 2003, tỉnh Cần... Trung ương và tỉnh Hậu Giang ngày nay Hình 2 Bản đồ hành chính tỉnh Hậu Giang (*Nguồn: http://my.opera.com/HUYNHTUMAI/blog/t-nh-h-u -giang, 12/07/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.2.2 Tình hình trồng mía ở Hậu Giang Hậu Giang là tỉnh có diện tích trồng mía lớn nhất ĐBSCL hiện nay Ở Hậu Giang mía là cây trồng đã... VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập nấm mốc từ các mẫu lá mía bị thối đỏ ở tỉnh Hậu Giang Từ 120 mẫu lá mía bị bệnh thối đỏ được thu tại bốn địa điểm khác nhau thuộc huyện Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ và Thành phố Vị Thanh của tỉnh Hậu Giang; đã phân lập được 25 dòng nấm thuần Các dòng nấm được đặt tên theo nguyên tắc đối tượng kí chủ, nguồn gốc nơi thu mẫu và thứ tự từ nhỏ đên lớn Các dòng... cho đến mầm non và cả rễ của cây Tuy nhiên, bệnh thường gây hại nhiều nhất là trong thân cây, phiến lá và bẹ lá của cây mía vào giai đoạn cây mía đã vươn lóng cao Cây bị bệnh lá ngọn thường vàng héo, nếu bị nặng toàn cây chết khô Trên phiến lá: Bệnh thường xuất hiện ở gân chính trong lòng máng sống lá Lúc đầu vết bệnh chỉ là những chấm nhỏ màu hồng Sau đó phát triển dần lên phía trên và xuống phía dưới... ngọn cây mía nhạt hơn 2.2 Tỉnh Hậu Giang- vùng trồng mía trọng điểm 2.2.1 Giới thiệu chung về Hậu Giang Hậu Giang là một tỉnh ở ĐBSCL Hậu Giang là tỉnh ở trung tâm châu thổ sông MêKông, thành phố Vị Thanh là trung tâm hành chính của tỉnh cách Thành phố Hồ Chí Minh 240 km về phía tây nam, cách thành phố Cần Thơ 60 km theo Quốc lộ 61 và chỉ cách 40 km theo đường nối Vị Thanh – thành phố Cần Thơ Hậu Giang. .. thấp 15-20°C mía sinh trưởng chậm, sức chống bệnh yếu thì nấm vẫn gây hại Loại nấm gây bệnh thối đỏ sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ 27-32°C, pH 5-6 Khi nhiệt độ quá thấp (dưới 10°C) hoặc quá cao (trên 37°C) nấm sinh trưởng kém Nấm xâm nhiễm dễ dàng qua vết thương xây xát, do đó mức độ bệnh còn liên quan tới mức độ sâu đục thân mía phá hại Nếu sâu đục thân hại mía càng nhiều thì bệnh càng nặng... http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/84627/Cay-mia-Hau -Giang. aspx, 30/07/2013) 2.3 Bệnh thối đỏ trên cây mía Hình 3 Bệnh thối đỏ trên lá mía (*Nguồn: http://vtc16.vn/news/55/5206/Phat-hien-va-phong-tru-benh-thoi-do-hai-mia, 13/07/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.1 Triệu chứng bệnh Bệnh thối đỏ có thể gây hại ở nhiều bộ phận của cây mía, từ thân lóng,