Đang tải... (xem toàn văn)
... Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu đề tài: Tạo vật liệu khởi đầu in vitro bước đầu đánh giá sinh trưởng số giống cúc chất lượng cao thu làng hoa Mê Linh - Hà Nội ” kết nghiên cứu riêng ThS Lê Hoàng... tế bào thực vật 2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu -Tạo vật liệu in vitro giống hoa cúc chất lƣợng cao, tạo nguyên liệu cho nghiên cứu -Đánh giá số đặc điểm sinh trƣởng mộtsố giống hoa cúc in vitro Ý nghĩa... 2:ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu - Thí nghiệm đƣợc thực số giống cúc chất lƣợng cao thu làng hoa Mê Linh- Hà Nội Hình 2.1 Ruộng hoa cúc làng hoa Mê Linh- Hà Nội 2.2
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ------------------------ CAO THỊ HUYỀN TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU IN VITRO VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH TRƢỞNG CỦA MỘT SỐ GIỐNG CÚC CHẤT LƢỢNG CAO THU TẠI LÀNG HOA MÊ LINH - HÀ NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học ThS. Lê Hoàng Đức Viện công nghệ sinh học HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: ThS. Lê Hoàng Đức, Viện công nghệ sinh học là ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài và hoàn thành khoá luận này. ThS. La Việt Hồng, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã dành rất nhiều thời gian để hƣớng dẫn, chỉ bảo về kiến thức và phƣơng pháp nghiên cứu. Hơn nữa, thầy luôn động viên giúp tôi vƣợt qua khó khăn trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện đề tài. Ngoài ra, để hoàn thành đề tài này tôi cũng đã nhận đƣợc những sự chỉ bảo cả về kiến thức chuyên ngành cũng nhƣ phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm từ tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, khoa sinhKTNN; Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và chuyển giao công nghệ, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. Tôi xin đƣợc cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi giúp tôi có thể vƣợt qua những khó khăn để hoàn thành đƣợc đề tài này. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài:“Tạo vật liệu khởi đầu in vitro và bước đầu đánh giá sinh trưởng của một số giống cúc chất lượng cao thu tại làng hoa Mê Linh - Hà Nội ” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do ThS. Lê Hoàng Đức hƣớng dẫn và không trùng lặp với kết quả của các tác giả khác. Hà Nội, ngày 05 tháng 5 năm 2015 Sinh viên thực hiện Cao Thị Huyền DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Agar Thạch BAP 6 - Benzyl amino purin Ca(OCl)2 Calci hypochlorit IAA Beta - Indole - acetic acid IBA Indode - 3 - Butyric acid H202 Hydro peroxide (nƣớc oxy già) HgCl2 Thuỷ ngân Clorua MS Murashige and Skoog, 1962 ND Nƣớc dừa NaOCl Natri hypochlorit T1 Tuần 1 T2 Tuần 2 T3 Tuần 3 T4 Tuần 4 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.3. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (street (1974))..................... 7 Bảng 3.1. Tỷ lệ mẫu sống, sạch trên đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc23 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi của một số giống cúc ........ 26 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi của một số giống cúc....... 30 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của BAP đến tổng số lá trên các chồi của một số giống cúc................................................................................. 33 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Ruộng hoa cúc tại làng hoa Mê Linh- Hà Nội ............................... 20 Hình 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc .................................................................................. 24 Hình 3.2. Hình ảnh mẫu bị nhiễm khuẩn ...................................................... 25 Hình 3.3. Hình ảnh mẫu sạch nhƣng chết ..................................................... 25 Hình 3.4. Hình ảnh mẫu sạch, sống .............................................................. 25 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi của một số giống cúc ..... 26 Hình 3.6. Sự sinh trƣởng của giống cúc Phan vàng qua 4 tuần ..................... 27 Hình 3.7. Sự sinh trƣởng của giống cúc Mai vàng qua 4 tuần ....................... 28 Hình 3.8. Sự sinh trƣởng của giống cúc Chi xanh qua 4 tuần ....................... 29 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi của một số giống cúc .................................................................................. 30 Hình 3.10. Sự sinh trƣởng của giống cúc Pháo hoa qua 4 tuần ..................... 31 Hình 3.11. Sự sinh trƣởng của giống cúc Phan trắng qua 4 tuần ................... 32 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của BAP đến tổng số lá trên các chồi của một số giống cúc ............................................................................................ 33 Hình 3.13. Sự sinh trƣởng của giống cúc Lan tím qua 4 tuần ....................... 34 Hình 3.14. Sự sinh trƣởng của giống cúc Tím huế qua 4 tuần....................... 35 Hình 3.15. Sự sinh trƣởng của giống cúc Sao đỏ qua 4 tuần ......................... 36 Hình 3.16. Sự sinh trƣởng của giống cúc Trắng tuyết qua 4 tuần.................. 37 Hình 3.17. Sự sinh trƣởng của giống cúc Pha lê qua 4 tuần .......................... 38 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài. ....................................................................................... 1 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................. 2 2.1. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 2 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 2 3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn ............................................................ 4 NỘI DUNG .................................................................................................. 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................... 3 1.1. Giới thiệu về cây hoa cúc. ........................................................................ 3 1.1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc .................................................................. 3 1.1.2. Vị trí phân loại. ............................................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật học .................................................................... 4 1.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................................... 5 1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật........................... 5 1.2.2. Các giai đoạn nhân giống in vitro ................................................. 6 1.2.3. Ƣu điểm của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ................ 8 1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới nuôi cấy mô .......................................... 9 1.3. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam .................... 15 1.3.1. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc trên thế giới. ................ 15 1.3.2. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ở Việt Nam.................. 16 1.4. Tình hình nghiên cứu một số tác nhân khử trùng bề mặt sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô ......................................................................................... 18 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 20 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 20 2.2. Địa điểm và thời gian thí nghiệm........................................................... 20 2.3.Trang thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 20 2.4. Môi trƣờng nuôi cấy .............................................................................. 21 2.5. Điều kiện nuôi cấy................................................................................. 21 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu. ...................................................................... 21 2.6.1. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm...................................................... 21 2.6.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................ 22 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 23 3.1. Tạo vật liệu in vitro ............................................................................... 23 3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trƣởng của một số giốngcúc .................... 25 3.2.1. Chiều cao chồi .............................................................................. 25 3.2.2. Hệ số nhân nhanh ......................................................................... 30 3.2.3. Số lá/chồi...................................................................................... 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 39 Kết luận ........................................................................................................ 39 Kiến nghị...................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong thế giới các loài hoa thì hoa cúc là một trong những loài hoa đƣợc ƣa chuộng và phổ biến ở Việt Nam. Hoa cúc đại diện cho mùa thu trong bộ tứ quý Tùng - Trúc - Cúc- Mai, hoa đƣợc trang trí trong các nhà hàng, khách sạn, lễ cƣới, lễ hội… Một đặc điểm nữa của hoa cúc mà không phải loài hoa nào cũng có đƣợc đó là sự đa dạng về màu sắc và hình dạng, hơn nữa hoa cúc rất bền, mùi thơm dịu. Do những ƣu thế trên khía cạnh thẩm mĩ, cũng nhƣ giá trị kinh tế mà hoa cúc luôn là đối tƣợng thu hút các nhà vƣờn và đƣợc phát triển trên quy mô lớn. Một trong những vùng trồng hoa nổi tiếng là Mê Linh – Hà Nội. Mê Linh nằm ở phía bắc Hà Nôi, lại khá gần với trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2. Đây là nơi có truyền thống trồng hoa với nhiều loài hoa khác nhau: hoa cúc, hoa hồng, thƣợc dƣợc …Trong đó, hoa cúc là đƣợc trồng phổ biến nhất. Để đáp ứng nhu cầu hoa của xã hội thì các nhà vƣờn cần một lƣợng cây giống vô cùng lớn. Từ xƣa ông cha ta đã dùng nhiều biện pháp để nhân giống nhƣ gieo hạt, hay giâm, chiết, ghép…Tuy nhiên những biện pháp này vẫn có nhiều nhƣợc điểm và hệ số nhân giống không nhƣ mong muốn. Vì vậy, trong những năm gần đây một phƣơng pháp nhân giống hiện đại đang đƣợc ứng dụng rộng rãi đó là phƣơng pháp nhân giống in vitro. Phƣơng pháp nuôi cấy invtrođƣợc ứng dụng rộng rãi với nhiều ƣu điểm: nhân nhanh giống với số lƣợng lớn; có thể áp dụng với với nhiều loài thực vật; taọ ra giống sạch bệnh; đảm bảo đồng bộ về mặt di truyền; có thể sản xuất giống quanh năm; đạt hiệu quả kinh tế cao. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro gồm nhiều công đoạn. Trong đó, tạo vật liệu khởi đầu là giai đoạn quan trọng nhất nhằm cung cấp nguồn vật liệu in vitro cho các nghiên cứu tiếp theo. Đây là giai đoạn khó thực hiện 1 vì mẫu ngoài tự nhiên thƣờng không sạch, chứa nhiều khuẩn, nấm. Đã có nhiều nghiên cứu vềviệc tạo vật liệu khởi đầu in vitro với các chất khử trùng bề mặt khác nhau nhƣ: HgCl2, H202,NaClO…. Chính vì thế,tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tạo vật liệu khởi đầu in vitro và bước đầu đánh giá sinh trưởng của một số giống cúc chất lượng cao thu tại làng hoa Mê Linh - Hà Nội”. 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1. Mục đích nghiên cứu Nhằm tạo ra nguồn vật liệu in vitro cho việc nuôi cấy cây hoa cúc bằng Công nghệ tế bào thực vật. 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu -Tạo vật liệu in vitro các giống hoa cúc chất lƣợng cao, tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. -Đánh giá một số đặc điểm sinh trƣởng mộtsố giống hoa cúc in vitro. 3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn - Ý nghĩa lý luận: Bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro cây hoa cúc. - Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần vào xây dựng quy trình nhân giống một số giống hoa cúc để cung cấp lƣợng cây giống lớn đáp ứng nhu cầu sản xuất. 2 NỘI DUNG CHƢƠNG I:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 . Giới thiệu về cây hoa cúc 1.1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc Có giả thuyết cho rằng hoa cúc có nguồn gốc đồng thời từ hai nƣớc Nhật Bản và Trung Quốc. Họ cho rằng hoa cúc đã đƣợc con ngƣời trồng và thuần hóa cách đây hơn 5000 năm trƣớc công nguyên. Ngƣời Trung Quốc và Nhật Bản thuần hóa hoa cúc dại từ những cánh đồng hoang gần núi có nƣớc nguồn chảy qua. Ban đầu hoa cúc dại nhỏ bé thôi không to đƣợc nhƣ bây giờ. Và cũng đƣợc dùng để chữa bệnh trƣớc khi đƣợc coi là một loài hoa cảnh. Tại Trung Quốc hoa cúc nhƣ biểu tƣợng của sự trƣờng tồn. Đã có một thành phố ở Trung Quốc đƣợc mang tên Chu-Hsien (thành phố của hoa cúc) vì sự cao quý và vô giá của hoa cúc.Cho đến ngày nay, Trung Quốc, hoa cúc cũng đƣợc khắc trên đồng xu một Nhân dân tệ. Còn tại Nhật Bản, hoa cúc đƣợc tôn thờ nhƣ biểu tƣợng của quốc gia[37]. Tới thế kỉ thứ XVII, hoa cúc đƣợc mang tới Châu Âu. Ngày nay, hoa cúc đƣợc trồng rộng rãi trên thế giới nhƣ: Đức, Pháp, Nhật Bản, Mỹ, Nga, Singapore, Isarel…[4], [12]. Ở Việt Nam, hoa cúc đƣợc trồng ở khắp mọi nơi từ núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành phố nhƣng đƣợc trồng tập trung ở các vùng trồng hoa truyền thống: Nhật Tân, Mê Linh… 1.1.2. Vị trí phân loại Họ cúc thuộc: - Giới thực vật - Ngành Magnoliophyta (Angiospermae) - Ngọc Lan (hạt kín) - Lớp Mangnoliopsida (Diotyledonea) - Ngọc Lan (Hai lá mầm) - Bộ Asterales[3] Bộ cúc có một họ duy nhất là họ cúc (Asteraceae hay compositae) đƣợc xem là họ lớn nhất của ngành hạt kín và giới thực vật. Bao gồm 1000 chi, hơn 3 20000 loài, có những chi có tới 1000 loài. Họ cúc phân bố trên khắp nơi trên trái đất, sống đƣợc trong nhiều điều kiện khí hậu, môi trƣờng đất đai khác nhau. Dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhƣng thân gỗ thấp bé [2], [12]. Trong các chi của họ cúc, họ Chrysanthemum đƣợc trồng phổ biến nhƣ một loài hoa trồng trong chậu hay cắt cành. Hoa cúc là một loại hoa cắt cành, phổ biến trên toàn thế giới, nó đa dạng về các thứ có hàng ngàn kiểu dáng khác nhau (Cockshull, 1985). Ngoài ra, một số loài khác trong chi này đƣợc làm rau ăn, làm thuốc an thần, thuốc chữa bệnh nhƣ là: Cải cúc (C.coronarium L.), Bạch cúc(C.moriforium), Kim cúc (C.indicum L.). 1.1.3. Đặc điểm thực vật học -Rễ: Rễ của cây hoa cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang, phân bố ở tầng đất mặt từ5-20cm. Kích thƣớc các rễ trong bộ rễ cúc chênh lệch nhau không nhiều, số lƣợng rễ rất lớn do vậy khả năng hút nƣớc và dinh dƣỡng rất mạnh. Cúc chủ yếu trồng bằng nhân vô tính nên các rễ không phát sinh từ mầm rễ của hạt màtừ những rễ mọc ở mấu của thân(gọi là mắt) ở những phần ngay sát mặt đất. -Thân: Cây thuộc thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy càng lớn càng cứng, cây dạng đứng hoặc bò nên khi cây lớn phải làm giàn để đỡ cây khỏi đổ. Kích thƣớc thân cao hay thấp, to hay nhỏ, cứng hay mềm phụ thuộc vào từng giống và thời vụ trồng. Những giống nhập nội thân thƣờng to, mập, thẳng và giòn,ngƣợc lại những giống cúc dại hay giống cổ truyền Việt Namthân nhỏ mảnh và cong. Thân có ống tiết nhựa mủ trắng, mạchcó bản ngăn đơn. -Lá:Thƣờng là lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻthùy lông chim,phiến lá mềm mỏng có thể to hay nhỏ, màu sắcxanh đậm hay nhạt phụ thuộcvào từng giống. Mặt dƣới phiến lábao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng. Trongmột chu kì sinh trƣởng cây có từ 30-50 lá trên 4 thân, thƣờng là lá đơn. Mỗi giống cúc có đặc điểm khác nhau: hình dạng lá xẻ thùy nông hay sâu, phiến lá dày hay mỏng và màu sắc là khác nhau. -Hoa: Hoa cúc chủ yếu có 2 dạng: Hoa lƣỡng tính,hoa đơn tính. + Dạng lƣỡng tính: Trong hoa có cả nhị đực và nhuỵ cái. + Dạng đơn tính: Trong hoa chỉ có nhị đực hoặc nhuỵ cái, đôi khi có loại vô tính (không có cả nhụy, nhị, hoa này thƣờng ở phía ngoài đầu). Mỗi hoa gồm rất nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa, hình thành hoa tự đầu trạng mà mỗi đầu trạng là một bông hoa. Trong thực tế tuỳ theo mục đích sử dụng mà ngƣời ta để một bông trên một cành hay nhiều bông trên một cành Màu sắc của hoa cúc rất khác nhau, hầu nhƣ có tất cả các màu tự nhiên: Trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, nâu, xanh. Trong đó, trên mỗi bông hoa có thể có một màu duy nhất, có thể có vài màu riêng biệt hoặc có rất nhiều màu pha trộn, tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng. Tuỳ theo cách sắp xếp của cánh hoa mà ngƣời ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên bông) và nhóm hoa đơn (chỉ có một vòng hoa trên bông). Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắc đậm hơn, xếp nhiều tầng, sít nhau, chặt hay lỏng tuỳ từng giống, cánh hoa có nhiều hình dáng khác nhau: cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn, có loại cánh dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong. 1.2.Nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1.Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra 1902 [24].Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào thực vật là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cơ thể sinh vật đó, khi gặp điều kiện thuận lợi thì mỗi tế bào sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh. 5 Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào. Trong đó: - Sự phân hoá của tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức phận khác nhau. - Khi các tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng riêng biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình trong trƣờng hợp cần thiết, ở điều kiện thuận lợi chúng có thể trở thành tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó đƣợc gọi là phản phân hoá tế bào ngƣợc lại với sự phân hoá tế bào. Về bản chất, sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen. Tại một điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đƣợc hoạt hoá để biểu hiện tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Điều này xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hoá trong cấu trúc phân tử AND và mỗi tế bào, điều khiển quá trình sinh trƣởng của cơ thể thực vật luôn hài hoà. Nhƣ vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện vô trùng). Đây là một điểm rất quan trọng vì trên cơ sở mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [7], [10],[14]. 1.2.2.Các giai đoạn nhân giống in vitro Giai đoạn 1: Tạo vật liệu in vitro Đây là giai đoạn rất quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra đƣợc nguyên liệu thực vật vô trùng để đƣa vào nuôi cấy in vitro. Khử trùng mô thực vật ngƣời ta thƣờng dùng một số chất hoá học nhƣ HgCl2, Ca(OCl) 2, NaOCl, H202. Tuỳ thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp. 6 Bảng 1.3. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (street (1974)) Tác nhân vô trùng Nồng độ % Thời gian xử lý ( phút) Hiệu quả Calci hypochlorit 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Natri hypochlorit 2 5 – 30 Rất tốt Hydro peroxit 10 -12 5 – 15 Tốt Nƣớc Brom 1–2 2 – 10 Rất tốt 0.1 – 1 2 – 10 Trung bình 40 -50 mg/l 30 – 60 Khá tốt HgCl2 Chất kháng sinh Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thƣờng đƣợc sử dụng là chồi hoặc chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tuỳ từng đối tƣợng mà ngƣời ta còn có thể dùng mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa. Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh có định hƣớng các mô nuôi cấy: Quá trình này đƣợc điều khiển chủ yếu dựa tỉ lệ các hơp chất auxin/cytokinin ngoại sinh đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lí của mẫu cấy. Thƣờng các mô non chƣa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trƣởng thành đã chuyên hoá sâu. Theo Anolerson (1980) mẫu cấy của cây đƣợc lấy vào thời kỳ sinh trƣởng mạnh cho kết quả khả quan trong tái sinh chồi. Giai đoạn 3:Nhân nhanh Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân giống cao nhất. Chính vì vậy, giai đoạn này là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân ngƣời ta thƣờng phải đƣa thêm vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trƣởng (auxin, cytokinin, giberelin…). Các chất bổ sung khác nhƣ nƣớc dừa, nƣớc chiết nấm men, dịch thuỷ phân 7 casein…kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tuỳ thuộc vào từng đối tƣợng nuôi cấy ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. Giai đoạn 4:Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt kích thƣớc nhất định các chồi đƣợc chuyển từ môi trƣờng ở giai đoạn 3 sang môi trƣờng tạo rễ. Thƣờng sau từ một đến 2 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các auxin, vì auxin là hoocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này, các chất IAA, IBA, anpha - NAA và 2,4 - D đƣợc sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất. Giai đoạn 5:Đƣa cây ra đất Giai đoạn đƣa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất là bƣớc cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bƣớc quyết định khả năng ứng dụng quá trình này vào sản xuất. Cây lấy ra từ ống nghiệm phải đƣợc rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập cuả côn trùng và nấm mốc. Đây là giai đoạn chuyển cây non từ trạng thái sống dị dƣỡng sang sống hoàn toàn tự dƣỡng. Do đó, để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải đƣa cây ra vƣờn ƣơm, ƣơm trên các giá thể thích hợp từ 10 đến 15 ngày. Lúc này rễ mới đƣợc sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó, chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thƣờng. 1.2.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật - Hệ số nhân giống cao: Từ một mẫu vật sạch bệnh ban đầu, bằng con đƣờng nuôi cấy mô có thể nhân nhanh và cung cấp một lƣợng giống lớn trong thời gian ngắn trên một quy mô mặt bằng hạn chế. Đối với khoai tây chẳng 8 hạn, từ một cây sạch bệnh trong ống nghiệm (in vitro) trong vòng một năm có thể nhân lên hàng ngàn cây trong phòng thí nghiệm. - Chất lƣợng giống tốt: Mẫu cây ban đầu (có thể sạch hoặc không sạch bệnh) đƣợc nhập in vitro và nhân nhanh. Khi đạt một số lƣợng nhất định cần thiết, mẫu đƣợc kiểm tra bệnh virus bằng các phƣơng pháp huyết thanh (ELISA, ngƣng kết antigene - antibody), hoặc cây chỉ thị. Mẫu không nhiễm tiếp tục đƣợc nhân nhanh cho mục đích sử dụng (sản xuất giống hoặc phục vụ các nghiên cứu lai tạo giống). Mẫu đồng nhất về mặt di truyền, dòng cây mong muốn, có khả năng ra hoa và tạo quả sớm. Khả năng chủ động trong nhân giống: Trong điều kiện phòng thí nghiệm có kiểm soát, kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép nhân giống quanh năm. Vì vậy, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạch sản xuất, cung cấp giống. 1.2.4.Các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy mô 1.2.4.1.Mẫu cấy Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của việc lựa chọn mẫu cấy thích hợp và chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng nuôi cấy mô [30]. Điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm: Kiểu gen, cơ quan đƣợc chọn lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trƣởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu. - Kiểu gen: Ảnh hƣởng sâu sâu sắc tới quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá đƣợc sử dụng nhƣ kiểu cây mẫu, Cheng và Smith (1973) đã ghi nhận sự khác nhau giữa genom qua nuôi cấy sinh trƣởng mô lá. Hơn nữa, Jara milo & Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hƣởng đến số lƣợng và đƣờng kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà chua Lycopersycon esculentum Mill. - Chọn cơ quan: Murashige (1914) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau nhƣ ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, 9 theo Doersching & Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp cho làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt. - Tuổi sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy ảnh hƣởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác nhau về ảnh hƣởng của tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy, theo Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non mà không phát sinh trên lá già. - Mẫu invitro: Trong nhiều năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vƣờn ƣơm nhƣ cây Azalea (Economou & Read, 1986). Tuy nhiên, Luetal.(1991) ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên đồng ruộng. - Sức sống của mẫu: Điều cần thấy rằng mẫu của cây mẹ có ảnh hƣởng quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để loại virut sản xuất những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn lọc mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ tạo ra một số lƣợng lớn những cây bệnh đƣợc nhân lên. 1.2.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy - Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 20 0C - 270C. Theo Murashige (1974), nhiệt độ ảnh hƣởng sâu sắc đến sinh trƣởng và phát triển của cây in vitro qua những quá trình sinh lý nhƣ hô hấp hay hình thành tế bào và cơ quan. 1.2.4.3. Cường độ ánh sáng - Cƣờng độ ánh sáng là nhân tố quan trọng ảnh hƣởng đến nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hƣởng của ánh sáng có sự liên quan tới các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng yếu hoặc tối 10 (Papachatzi et al. (1981), Miller & Murashige (1976), Tharpe & Murashige(1970)). Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện 1000Lux [8] - Quang chu kỳ và chất lƣợng ánh sáng. + Thời gian chiếu sáng: Ảnh hƣởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý của cây trồng. + Chất lƣợng ánh sáng: Ảnh hƣởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hƣởng đến những biến đổi sinh lý nhƣ cây ra hoa, chế độ dinh dƣỡng và những hiện tƣợng khác nhƣ tăng sinh chồiin vitro. 1.2.4.4. Môi trường nuôi cấy Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trƣởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trƣờng nuôi cấy [10]. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy là rất cần thiết. Về mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lƣợng chất dinh dƣỡng khác nhau. Mặt khác, môi trƣờng còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ theo trƣờng hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, bộ phận nhƣng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trƣờng sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản, môi trƣờng nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và phát triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhƣng tất cả các loại môi trƣờng nuôi cấy đều bao gồm các thành phần: các nguyên tố khoáng đavi lƣợng, nguồn cacbon, vitamin và các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, agar (đối với môi trƣờng rắn) [14]. Ngoài ra, ngƣời ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác 11 định (amino acid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định nhƣ nƣớc dừa, dịch chiết nấm men… *Nƣớc:Phẩm chất nƣớc là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nƣớc sử dụng trong nuôi cấy thƣờng là nƣớc cất một lần. Trong một số trƣờng hợp ngƣời ta cũngsử dụng nƣớc cất hai lần hoặc nƣớc khử khoáng * Các nguyêntố khoáng đa lƣợng:Các nguyên tố khoáng đa lƣợng rất cần cho cây, có ảnh hƣởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Nhu cầu khoáng đa lƣợng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng tự nhiên.Các nguyên tố đa lƣợng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lƣu huỳnh (S), Sodium (Na+), Chloride(Cl-). Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọngnhƣ Mg2+là thành phần của phân tử diệp lục, Ca2+là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic. *Các nguyên tố vi lƣợng: Các nguyên tố vi lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng với lƣợng nhỏ, nhƣng đây là thành phần không thể thiếu trong môi trƣờng nuôi cấy. Các vi lƣợng thƣờng thêm vào môi trƣờng là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn),Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molybden (Mo), Cobalt (Co), Sắt (Fe). Nồng độ khoáng vi lƣợng sử dụng thƣờng thấp hơn 30 mg/l. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzym. * Nguồn cacbonhydrat: Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp rất thấp do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2. Ngoài ra, nguồn carbon còn có tác dụng điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trƣờng [15]. Vì vậy phải đƣa thêm hợp chất cacbonhydrat vào thành phần môi trƣờng nuôi cấy. Hai loại đƣờng mono và disaccharide đã đƣợc thí nghiệm. Đƣờng sucrose thƣờng đƣợc sử dụng trong khoảng 2-5%. 12 * Vitamin: Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dƣỡng khác nhau. Khi tế bào và mô đƣợc nuôi cấy thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn của chúng [10].Vitamin thƣờng đƣợc sử dụng nhất là Nicotinic acid, Pyridoxine (B6), Thiamin (B1), Myo inositol và vitamin C thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ là chất chống oxy hóa. *Nƣớc dừa: Nƣớc dừa là thành phần bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm làm tăng sinh trƣởng và phát triển của mô. Các loại khoáng, acid amin, myo-inositol, chất béo và các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ cytokinin đã đƣợc chứng minh có trong nƣớc dừa [15].Các thành phần này có hàm lƣợng thay đổi khác nhau giữa quả non, quả già, thậm chí khác nhau giữa những quả cùng độ tuổi. *Agar: Agar là một loại polysaccharide của tảo biển đƣợc sử dụng làm chất đệm cho môi trƣờng dinh dƣỡng đông cứng lại (tạo môi trƣờng đặc hay môi trƣờng bán đặc [1],làm giá thể cho mô tế bào thực vật nuôi cấy. Nồng độ agar đƣợc sử dụng sẽ ảnh hƣỡng đến thế năng nƣớc trong môi trƣờng nuôi cấy, độ cứng của môi trƣờng, sự sinh trƣởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy nhƣ sự thừa nƣớc, sự hoạt động của cytokinin trong môi trƣờng có agar. * pH: pH của môi trƣờng là một trong những yếu tố rất quan trọng ảnh hƣởng đến khảnăng hòa tan của các ion khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trƣởng của tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ một số chất phụ thuộc vào pH môi trƣờng, đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA, gibbrellin và các vitamin. Sự hấp thụ chất sắt cũng phụ thuộc vào pH [14]. Theo Murashige và Skoog (1962) nhận thấy rằng độ pH = 5,7-5,8 thích hợp duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trƣờng MS. 13 1.2.4.5.Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Phytohoocmon) Phytohoocmon là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) chúng có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Tuy nhiên, các phytohoocmon chỉ làm tăng cƣờng quá trình trao đổi chất mà không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất, nó không thể dùng thay thế chất dinh dƣỡng. Các phytohoocmon gây nên tác dụng mạnh mẽ với một hàm lƣợng vô cùng bé lên trao đổi chất cuả tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt động nhƣ chất kìm hãm. Trong thành phần môi trƣờng nuôi cấy, các chấtđiều hoà sinh trƣởng làm việc nhƣ một chiếc chìa khoá đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát sinh hình thái và tổng hợp các chất. Tác dụng của chất điều hoà sinh trƣởng liên quan đến hiện tƣợng kìm hãm và cảm ứng tổng hợp enzim trong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử AND. Mỗi chất điều hoà sinh trƣởng đều mang chức năng riêng, nhƣng trong cơ thể thực vật để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng tham gia vào thƣờng không phải một vài chất. Tuỳ vào mỗi giai đoạn nuôi cấy, mỗi giai đoạn phát triển của thực vật thì sự kết hợp của các chất này là khác nhau. Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô tế bào, hai nhóm chất điều hoà sinh trƣởng đƣợc sử dụng rộng rãi là cytokinin và auxin. - Auxin: + Auxin có tác dụng chủ yếu là làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trƣởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả. Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (Protein, cenllulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng. Auxin đƣợc xem là hoocmon thực vật quan trọng nhất vì nó có vai trò cơ bản trong quá trình sinh trƣởng và biệt hoá tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thƣờng của cơ thể. Auxin cùng với một 14 số chất điều chỉnh khác đảm bảo sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia tạo thành các cơ thể thực vật hoàn chỉnh. + Trong nuôi cấy sử dụng một số chất nhƣ: Indol acetic acid (IAA) Naphthyl acetic acid (NAA) 2,4- D Dichlorophenol acetic acid(2,4- D) Indol butyric acid (IBA) - Cytokinin + Nhóm cytokinin bao gồm các chất sau: 6- Benzylaminopurin (BAP) Kinetin (Ki) Zeatin(Z) Thidiazuron (TDZ) Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trƣởng của tế bào cấy mô và làm tăng tốc độ phân bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hoá rễ của mô nuôi cấy. Cytokinin có hiệu quả rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết song không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thƣờng cytokinin cao hơn auxin sẽ kích thích tạo chồi, và ngƣợc lại auxin cao hơn cytokinin sẽ kích thích tạo rễ. Trong cơ thể thực vật, cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cƣờng sự tổng hợp ADN và protein, kích thích quá trình trao đổi chất. 1.3.Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam 1.3.1. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc trên thế giới Tuy cây hoa cúc có nguồn gốc từ lâu đời nhƣng đến năm 1688 Jacob Layn ngƣời Hà Lan mới trồng, phát triển mang tính thƣơng mại trên đất nƣớc 15 của ông và đến tận thế kỷ XX nó mới có ý nghĩa thƣơng mại trên thế giới. Những năm 1961 - 1970 cúc đƣợc trồng rất nhiều và là cây hoa quan trọng nhất đối với Trung Quốc, Nhật Bản và là cây quan trọng đứng thứ hai sau hoa hồng ở Hà Lan. Hàng năm kim ngạch giao lƣu buôn bán về hoa Cúc trên thế giới ƣớc đạt tới 1,5 tỉ USD [13]. Một số nƣớc nhập và xuất khẩu hoa cúc trên thế giới nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Hà Lan, Pháp, Đức, Nga, Mỹ, Singapore, Isarel… Trong đó dẫn đầu là Hà Lan phục vụ cho thị trƣờng tiêu thụ rộng lớn gồm 80 nƣớc trên thế giới với diện tích trồng cúc chiếm tới 30% tổng diện tích trồng hoa tƣơi. Bốn nƣớc sản xuất chính là Hà Lan 80 triệu cành cúc mỗi năm, Colombia 600 triệu cành cúc mỗi năm, tiếp theo là Ý 500 triệu cành, và Mỹ 300 triệu cành [13].Năm 1982, Hà Lan đã sản xuất 3.119.000 cây cúc từ nuôi cấy trong ống nghiệm đến năm 1986 con số này đã tăng tới 73.650.000 cây. Công nhệ nhân giống tiên tiến này đã trở thành nền tảng cho ngành sản xuất hoa và cây cảnh của Hà Lan cũng nhƣ các nƣớc sản xuất hoa trên thế giới. Bằng phƣơng pháp này, ngƣời ta đã sản xuất đƣợc một lƣợng lớn cây giống khỏe, sạch bệnh và hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. Ở châu Á, Nhật Bản đang là nƣớc dẫn đầu về sản xuất hoa cúc, mỗi năm Nhật Bản sản xuất đƣợc khoảng 200 triệu cành phục vụ cho tiêu dùng nội địa và xuất khẩu (Yahe.H and Y.Tsukamoto (1985). Bên cạnh đó ƣớc tính năm 2007, sản lƣợng hoa cúc ở Trung Quốc có thể lên đến 35 triệu bông. Diện tích trồng cúc phát triển ở hơn 1.000mu(đơn vị diện tích ở Trung Quốc, 1mu= 1/15 ha). Ngoài ra phải kể đến Thái Lan, cúc trồng quanh năm với sản lƣợng cành cắt/năm là 50.841.500 cành. 1.3.2. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ở Việt Nam Ở nƣớc ta hiện nay hoa cúc có mặt ở khắp mọi nơi từ vùng núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị. Xét về chủng loại, trƣớc những năm 1997 diện tích trồng hoa hồng nhiều nhất (31%) nhƣng từ năm 1998 trở lại 16 đây với trên 15.000ha trồng hoa cúc trên cả nƣớc, diện tích trồng hoa cúc đã vƣợt lên (chiếm 42% trong đó hồng chỉ còn 29,4%). Hiện nay hoa cúc là loại hoa có kim ngạch xuất khẩu lớn nhất, chiếm gần 50% tổng kim ngạch xuất khẩu hoa cây cảnh của cả nƣớc (Những vùng sản xuất chính có thể kể đến: Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng, Lào Cai, Thành phố Hồ Chí Minh, trong đó Đà Lạt là nơi lý tƣởng cho việc sinh trƣởng và phát triển hầu hết các loại hoa cúc, diện tích trồng cúc nói chung trên 5.000ha chiếm 25 - 30% diện tích trồng hoa vùng này. Hoa cúc của Đà Lạt không chỉ tiêu thụ trong nƣớc mà còn đƣợc xuất khẩu sang Trung Quốc. Tháng 6 năm 2008, Hiệp hội hoa Đà Lạt đã cử một đoàn thanh niên của Hiệp hội đi thăm quan việc trồng và xuất khẩu hoa cúc ở cao nguyên Cameron - Malaysia. Đoàn thăm quan nhận thấy rằng với những điều kiện tự nhiên nhƣ độ cao, khí hậu và đầu tƣ cơ sở kỹ thuật của bạn tƣơng lai nhƣ Đà Lạt, họ đã sản xuất hoa cúc có chất lƣợng cao để xuất khẩu. Với diện tích canh tác 40ha trong năm 2006, họ xuất khẩu đƣợc 300 triệu cành hoa cúc các loại, trong đó 100 triệu cành xuất khẩu sang thị trƣờng khó tính là Nhật Bản (Bên cạnh đó, với địa hình đồi núi cao, chia cắt mạnh đã tạo nên những tiểu vùng khí hậu nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới, hoa là cây trồng đang trở thành ƣu thế trong sản xuất nông nghiệp tại tỉnh Lào Cai, đặc biệt là những loại hoa ôn đới có giá trị kinh tế cao nhƣ hoa cúc. Lào Cai có 97,5ha hoa các loại, đạt giá trị 16.033 triệu đồng, riêng hoa cúc các loại chiếm 5,1ha diện tích trồng và sản lƣợng đạt 1,53 triệu bông trồng tập trung tại thị xã Lào Cai và huyện Bảo Thắng. Ngoài ra, phải kể đến vùng Trung du và miền núi phía Bắc, trong tổng diện tích gần 136ha trồng hoa, diện tích trồng hoa cúc lớn thứ hai với 14,5ha với sản lƣợng 5 triệu cành/năm. Theo chƣơng trình phát triển sản xuất hoa của Bộ nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, đến năm 2010, Việt Nam sẽ xuất khẩu 1 tỷ cành hoa các loại trong đó hoa hồng, cúc và phong lan chiếm 85%. Theo chƣơng trình này diện tích trồng hoa của cả nƣớc 17 sẽ đạt 8.000ha cho sản lƣợng 4,5 triệu cành. Doanh thu từ xuất khẩu hoa đạt 60 triệu USD. Trong đó ngoài Đà Lạt, Lào Cai, Thành phố Hồ Chí Minh, Thanh Hóa, Hải Phòng, Thái Bình… Hà Nội sẽ là một trong những vùng tập trung trồng hoa chính với xã Tây Tựu dự kiến mở rộng diện tích lên 500ha trở thành làng hoa thay thế cho những vùng trồng hoa truyền thống đang bị đô thị hóa nhƣ Ngọc Hà, Nhật Tân. Thành phố Hồ Chí Minh không chỉ là vùng trồng hoa mà còn là thị trƣờng tiêu thụ hoa lớn của Việt Nam, nhu cầu hoa cắt trong ngày từ 25.000 - 30.000 cành. Hiện nay thành phố vẫn phải nhập những loại hoa cắt, trong đó có cúc chùm từ Hà Lan, Đài Loan, Singapore… đặc biệt là các loại cúc đơn từ Hà Nội vào với giá từ 400 - 600 đồng/cành [13]. Để đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu thụ hoa trong nƣớc cũng nhƣ trên thế giới đòi hỏi các nhà sản xuất hoa của Việt Nam phải có kế hoạch đầu tƣ và phát triển một cách thích hợp, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống và nhân giống… công nghệ đóng gói bảo quản để nâng cao năng xuất chất lƣợng hoa. 1.4. Tình hình nghiên cứu một số tác nhân khử trùng bề mặt sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô Việc khử trùng bề mặt ban đầu là không hiệu quả, nấm, nấm men và vi khuẩn có thể đi vào mẫu nuối cấy in vitro với cây nguyên liệu [18],[21]. Một số lƣợng lớn vi khuẩn và nấm hoại sinh trên mô cấy làm giảm hiệu quả khử trùng ban đầu. Mẫu cấy đƣợc lấy từ: (1) Mô thực vật tiếp xúc hoặc gần đất, (2) cây sinh trƣởng vùng nhiệt đới trên những cánh đồng thì thƣờng là khó hoặc có khi không thể khử trùng đƣợc [18], [19],[21],[25]. Hầu hết các phòng thí nghiệm sử dụng natri hypochlorite (NaOCl) hoặc canxi hypochlorite (Ca(OCl)2) hoặc chất tẩy trắng thƣơng mại để khử trùng bề mặt [18], [19], [23],[28],[34]. Tác động hoá học của chất tẩy trắng trong gia đình là hypochlorous acid (HOCl), chất mà có khả năng oxi hoá rất mạnh. HOCl không phân ly thành các phân tử trái dấu gấp 100 lần hoạt động chất 18 kháng sinh hơn sự điện ly hypochlorite (OCl+) [17]. Hoạt động diệt khuẩn của dung dịch Hypochlorite phụ thuộc vào pH. Nhiều chất hoá học khác nhƣ thuốc kháng sinh, HgCl2, thuốc diệt nấm cũng đƣợc sử dụng để khử trùng bề mặt mẫu cấy. Nồng độ và thời gian khử trùng các chất này thì khác nhau và phụ thuộc vào loại và kích thƣớc của mẫu, chúng ta có thể tìm thấy trong nhiều tài liệu [19], [28],[34]. Mặc dù nhiều tác giả[28] gợi ý rằng chỉ các mô thực vật ở bên ngoài tiếp xúc với hoá chất mới đƣợc tẩy độc. Điều đó là hiển nhiên, vì thế sự thành công của việc khử trùng chỉ có thể đạt đƣợc nếu mô khử trùng cái mà không tiếp xúc với hoá chất không chứa các yếu tố gây nhiễm. Có thể thấy sự đột ngột xuất hiện các vi khuẩn gây nhiễm phát triển mạnh ở giai đoạn sau trong nuôi cấy in vitro(sau một vài môi trƣờng hay trong khi bén rễ) chúng đƣợc quy là yếu tố gây nhiễm đƣợc đi theo nguyên liệu thực vật ban đầu. Nếu nuôi cấy không thể loại bỏ yếu tố gây nhiễm (ví dụ không thể làm sạch cây nguyên liệu ban đầu mà chúng có sẵn yếu tố gây nhiễm hoặc sự nhiễm chỉ đƣợc phát hiện khi một số lƣợng lớn cây đƣợc sản xuất). Tuy nhiên, có thể loại bỏ các yếu tố gây nhiễm bởi sự kết hợp chất kháng sinh vào trong môi trƣờng nuôi cấy. Nhiều tác giả khác nhau đã mô tả những kháng sinh nhạy cảm với vi khuẩn đã làm chúng bị tiêu diệt từ nuôi cấy mô thực vật [18],[27], [33] hoặc có thể thêm chất kháng sinh vào môi trƣờng nuôi cấy để khống chế và loại bỏ vi khuẩn gây nhiễm [18],[22], [26],[28], [31], [32]. 19 CHƢƠNG 2:ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu - Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên một số giống cúc chất lƣợng cao thu tại làng hoa Mê Linh- Hà Nội. Hình 2.1. Ruộng hoa cúc tại làng hoa Mê Linh- Hà Nội 2.2. Địa điểm và thời gian thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 3 năm 2015 tại phòng sinh lý thực vật,khoa Sinh-KTNN,trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 2.3.Trang thiết bị và dụng cụ Các trang thiết bị đƣợc sử dụng khi tiến hành thí nghiệm:Cân kỹ thuật,tủ lạnh,máy đo pH,nồi hấp khử trùng,máy nƣớc cất 2 lần,buồng cấy vô trùng,máy khuấy từ,cân phân tích,tủ sấy,pipet. Các dụng cụ sử dụng:Dao,panh,khay cấy,giấy thấm khử trùng,đèn cồn,bình tam giác,nút bông khử trùng,túi nilong khử trùng,… Các chất điều hòa sinh trƣởng:6 – Benzyl aminopurin (BAP),… 20 2.4. Môi trƣờng nuôi cấy -Môi trƣờng đƣợc sử dụng là môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản (Murashige & Skoog, 1962)[30]:MS + 30g/l đƣờng sacharose + 6,5 g/l agar + chất điều hoà sinh trƣởng. - PH môi trƣờng : 5,8 - Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc khử trùng ở nồi khử trùng nhiệt độ 1200C trong 15 phút. 2.5. Điều kiện nuôi cấy Các thí nghiệm đƣợc thực hiện ở điều kiện nhân tạo. - Ánh sáng: cƣờng độ chiếu sáng 3000 lux. - Quang chu kì: 16 giờ/ngày. - Nhiệt độ: 240C – 260C. - Độ ẩm trung bình: 60% - 70%. 2.6.Phƣơng pháp nghiên cứu 2.6.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm Theo La việt Hồng & cộng sự, 2014 [3]: * Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro Mẫu các giống cúc đƣợc trồng và chăm sóc trong chậu đất ở trong phòng thí nghiệm.Khi cây có chồi non từ 3-4cm thì chúng ta tiến hành cắt đỉnh sinh trƣởng.Sau đó ta cắt các đốt thân chứa đỉnh sinh trƣởng và xử lý sơ bộ bằng cách:rửa xà phòng dƣới vòi nƣớc chảy,rồi rửa lại bằng nƣớc cất khử trùng trong buồng cấy vô trùng. Lắc mẫu trong etanol 70% (v/v)/2 phút.Tiếp đến,rửa lại bằng nƣớc cất 3-4 lần. Mẫu cúc đã khử trùng sơ bộ đƣợc tiến hành khử trùng bằng javen 5%/15 phút. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên,với 3 lần nhắc lại,mỗi lần nhắc lại 15 bình,mỗi bình 2 mẫu Đánh giá kết quả qua 7 ngày theo dõi 21 Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: +Tỉ lệ mẫu bị nhiễm khuẩn,nấm(%) Số mẫu bị nhiễm khuẩn, nấm x 100 = Tổng số mẫu cấy +Tỉ lệ mẫu sống vô trùng(%) Số mẫu sống không bị nhiễm khuẩn, nấm = x 100 Tổng số mẫu cấy +Tỉ lệ mẫu vô trùng nhƣng chết(%) Số mẫu vô trùng nhƣng chết = x 100 Tổng số mẫu cấy Các thí nghiệm làm tƣơng tự lần lƣợt với các giống hoa cúc chất lƣợng cao nhằm tìm ra công thức tối ƣu để tạo vật liệu khởi đầu cho từng giống cúc. * Thí nghiệm 2: Tái sinh chồi các giống cúc in vitro Môi trƣờng thích hợp nhất cho quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi cúc là môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung 30 g/l saccharose+ 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP. Sau 7 ngày theo dõi nếu mẫu sạch ta tiến hành cấy chuyển mẫu sang môi trƣờng : MS+ 30 g/l saccharose+ 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP+ 100 ml/l ND. Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Sau 4 tuần theo dõi, ta tiến hành đánh giá các chỉ tiêu : - Chiều cao chồi (cm). - Số lá hình thành/chồi. - Số chồi trên một mẫu. 2.6.2. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu đƣợc xử lý thống kê trên chƣơng trình Excel 2007 [5], [6]. 22 CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1.Tạo vật liệu in vitro Có thể nói trong các giai đoạn của kỹ thuật nhân giống in vitro thì giai đoạn tạo vật liệu in vitro đóng vai trò hết sức quan trọng, nó quyết định đến sự thành công của công trình nghiên cứu. Nguồn mẫu ngoài tự nhiên khi đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao,… Các cây cúc khi đƣợc chăm sóc trong phòng thí nghiệm, khi ra chồi non ta tiến hành cắt và khử trùng theo công thức: xử lý sơ bộ + javen 5% (v/v)/15 phút thì ta thu đƣợc kết quả đƣợc trình bày trong bảng sau: Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Trắng tuyết 37,5 62,5 0,0 Pha lê 55,6 44,4 0,0 Mai vàng 0,0 83,3 16,7 Pháo hoa 11,1 77,8 11,1 Lan tím 13,4 58,4 28,2 Phan vàng 9,7 90,3 0,0 Phan trắng 15,3 84,7 0,0 Tím huế 6,4 57,7 35,9 Sao đỏ 23,8 60,0 16,2 Chi xanh 18,0 74,2 7,8 Giống Mẫu sạch 23 Hiệu quả khử trùng % 100 90.3 83.3 90 80 70 62.5 84.7 77.8 74.2 58.4 57.7 60 60 50 44.4 Hiệu quả khử trùng 40 30 20 10 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Trắng Pha Mai Pháo Lan Phan Phan Tím tuyết lê vàng hoa tím vàng trắng huế 9. 10. Sao Chi đỏ xanh Giống Hình 3.1. Tỷ lệ mẫu sống - sạch trên đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc Qua bảng số liệu và biểu đồ trên ta thấy khi sử dụng chất khử trùng là Javen đối với mẫu đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc thì chúng có hiệu quả tƣơng đối cao. Tuy nhiên, mỗi giống cúc lại có nhiều đặc điểm khác nhau về sinh lý, khả năng chống chịu,...vì thế mà hiệu quả khử trùng không đồng đều ở các giống cúc này. Cụ thể, với chất khử trùng là Javen có hiệu quả cao nhất đối với giống cúc Phan vàng (với hiệu quả khử trùng lên tới 90,3%), thứ hai là giống cúc Phan trắng (84,7 %). Có một số giống cúc thì khi khử trùng mẫu với công thức: xử lý sơ bộ + javen 5% (v/v)/15 phút thì tỉ lệ mẫu nhiễm rất thấp, tuy nhiên có thể do khả năng chống chịu với javen của mô kém nên dẫn đến mẫu chết.Ví dụ: Giống cúc Mai vàng có tỷ lệ mẫu nhiễm 0,0% tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết lại lên tới 16,7%, hay Tím huế chỉ có 6,4% mẫu nhiễm nhƣng tỷ lệ mẫu chết lại chiếm 35.9%. Với cùng một công thức khử trùng này, hiệu quả khử trùng thấp nhất với các giống: Pha lê (44,4%), Tím huế (57,7%). 24 Sau đây là một số kết quả sau 7 ngày theo dõi: Hình 3.2. Hình ảnh mẫu bị Hình 3.3. Hình ảnh mẫu sạch nhiễm khuẩn nhƣng chết Hình 3.4. Hình ảnh mẫu sống – sạch 3.2. Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trƣởng của một số giống cúc Các mẫu cúc sạch thu đƣợc trong thí nghiệm tạo vật liệu in vitro sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND. Tiến hành theo dõi mẫu trong 4 tuần thì thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 25 3.2.1. Chiều cao chồi Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi của một số giống cúc Chiều cao chồi Giống Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 1. Trắngtuyết 1,07 ± 0,10 1,45 ±0,02 2,53 ± 0,17 3,13 ± 0,89 2. Pha lê 1,02 ± 0,01 1,48 ± 0,03 2,10 ± 0,02 2,58 ± 0,01 3. Mai vàng 1,12 ± 0,04 2,01 ± 1,17 4,20± 0,25 5,50 ± 0,17 4. Pháo hoa 2,10± 0,03 2,73 ± 0,03 3,08 ± 0,05 3,80 ± 0,03 5. Lan tím 1,63 ± 0,01 2,01 ± 0,03 2,38 ± 0,02 2,73 ± 0,05 6. Phan vàng 1,23 ± 0,03 3,38 ± 0,11 5,38 ± 0,32 6,13 ± 0,02 7. Phan trắng 1,53 ± 0,03 1,85 ± 0,02 2,38 ± 0,01 3,00 ± 0,03 8. Tím huế 1,45 ± 0,07 2,18 ± 0,15 3,02 ± 0,06 4,10± 0,01 9. Sao đỏ 1,05 ± 0,02 2,05 ± 0,04 3,15 ± 0,04 3,40± 0,03 1,05 ± 0,01 1,28 ± 0,01 1,53 ± 0,02 1,73 ± 0,05 Chi xanh cm 7 6 5 4 Tuần 1 Tuần 2 3 Tuần 3 2 Tuần 4 1 0 Trắng Pha lê tuyết Mai vàng pháo Lan tím Phan hoa vàng Phan trắng Tím huế Sao đỏ Chi xanh Hình 3.5. Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi của một số giống cúc 26 Giống Từ kết quả trên ta thấy, môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND là môi trƣờng thích hợp cho sự sinh trƣởng của cây hoa cúc nói chung. Tuy nhiên, với mỗi loại giống cúc khác nhau thì sự sinh trƣởng lại không giống nhau. Từ biểu đồ, ta có thể dễ dàng nhận ra, trong 4 tuần thì giống cúc Phan vàng có sự tăng trƣởng chiều cao mạnh nhất (với tuần 1 là 1,23cm và đến tuần 4 là 6,13cm). T1 T2 T3 T4 Hình 3.6. Sự sinh trƣởng của giống cúc Phan vàng qua 4 tuần Xếp ở vị trí thứ 2 là giống Mai vàng ở tuần 1 với chiều cao 1,12cm, tuần 2 tăng lên 2,1cm, tiếp đó nó có sự tăng trƣởng mạnh vào tuần 3 (4,2 cm) và tuần 4 (5.5cm). 27 T1 T2 T3 T4 Hình 3.7. Sự sinh trƣởng của giống cúc Mai vàng qua 4 tuần Ngoài ra, giống Lan tím và Pháo hoa có tuần 1 phát triển rất mạnh (pháo hoa(2,1cm) và lan tím (1,63cm)) nhƣng đến 3 tuần tiếp theo thì tăng khá chậm. Trong 10 giống nghiên cứu, chúng tôi thấy giống cúc Chi xanh là có sự tăng trƣởng về chiều cao kém nhất ( tuần 1 là 1,05cm → tuần 2 là 1,28cm → tuần 3 là 1,53cm → tuần 4 là 1,73cm) 28 T1 T2 T3 T4 Hình 3.8. Sự sinh trƣởng của giống cúc Chi xanh qua 4 tuần 29 3.2.2. Hệ số nhân nhanh Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi của một số giống cúc Tổng số chồi Giống T1 T2 T3 T4 1. Trắng tuyết 1,25 ± 0,25 2,50 ± 0,33 2,75 ± 0,92 4,00 ± 3,33 2. Pha lê 1,50 ± 0,33 2,75 ± 0,25 4,50 ± 1,00 5,50 ± 0,33 3. Mai vàng 1,25 ± 0,25 4,25 ± 0,92 10,75 ± 0,92 12,50 ± 1,67 4. Pháo hoa 1,50± 0,33 2,75 ± 0,25 9,50 ± 1,67 16,50 ± 1,67 5. Lan tím 2,25 ± 0,91 3,50 ± 1,00 3,75 ± 0,92 4,00 ± 0,67 6. Phan vàng 2,00 ± 0,67 4,25 ± 0,92 4,75 ± 0,25 5,25 ± 0,25 7. Phan trắng 1,25 ± 0,25 3,25 ± 0,92 6,50± 0,10 7,00± 0,67 8. Tím huế 2,75 ± 0,25 5,00± 0,67 5,25 ± 0,67 6,25 ± 0,25 9. Sao đỏ 2,25 ± 0,92 4,25 ± 0,92 6,00± 0,67 7,50 ± 1,00 10.Chi xanh 2,75 ± 0,25 6,50 ± 1,67 7,00 ± 0,67 7,75 ± 0,92 Hệ số nhân 18 16 14 12 10 Tuần 1 8 Tuần 2 6 Tuần 3 4 Tuần 4 2 0 Trắng Pha lê Mai pháo tuyết vàng hoa Lan tím Phan Phan vàng trắng Tím huế Sao đỏ Chi xanh Giống Hình 3.9. Ảnh hƣởng của BAP đến hệ số nhân chồi của một số giống cúc 30 Nhƣ vậy, khi xét về ảnh hƣởng của môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND đến hệ số nhân chồi của một số giống cúc thì thấy rằng với hai giống cúc Mai vàng (Hình 3.7), Pháo hoa là có hiệu quả vƣợt trội. Sau 4 tuần hệ số nhân chồi trung bình của Pháo hoa là 16,5, Mai vàng là 12,5. T1 T2 T3 T4 Hình 3.10. Sự sinh trƣởng của giống cúc Pháo hoa qua 4 tuần Một số giống cũng có hệ số nhân chồi khá cao sau 4 tuần: Chi xanh (7,75 chồi), Sao đỏ (7,5 chồi), Phan trắng (7,00 chồi). 31 T1 T2 T3 T4 Hình 3.11. Sự sinh trƣởng của giống cúc Phan trắng qua 4 tuần Giống Phan vàng (Hình 3.6) thì có sự sinh trƣởng mạnh về hệ số nhân chồi ở 2 tuần đầu (tuần 1 là 2,25 chồi, tuần 2 là 4,25 chồi) nhƣng đến 2 tuần tiếp theo thì tổng số chồi tăng rất chậmvà sau 4 tuần là 5,25 chồi. Với giống Lan tím (Hình 3.13) thì ở tuần 1 có hệ số nhân chồi khá tốt là 2,25 chồi, tuy nhiên liên tiếp trong 3 tuần tiếp theo thì hệ số nhân chồi tăng chậm. Sau 4 tuần Lan tím, Trắng tuyết là giống có hệ số nhân chồi thấp nhất (4,00 chồi). Tuy các giống này có hệ số nhân là 4,00 chồi thấp hơn các giống khác, song hệ số này so với các loài khác vẫn là tƣơng đối cao.Qua phân tích trên, ta có thể khẳng định môi trƣờng trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND có tác dụng kích thích hệ số nhân chồi của các giống cúc nói chung, và ảnh hƣởng tối ƣu nhất cho giống cúc Mai vàng và Pháo hoa. 32 3.2.3. Số lá/chồi Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của BAP đến tổng số lá/chồi của một số giống cúc Số lá/chồi Giống T1 T2 T3 T4 Trắng tuyết 1,60 4,00 7,27 6,75 Pha lê 2,67 2,91 4,80 5,45 Mai vàng 2,40 3,29 3,16 5,20 Pháo hoa 8,00 7,27 3,89 4,12 5,71 6,13 6,50 Lan tím 7,30 Phan vàng 5,00 4,23 5,68 6,09 Phan trắng 4,00 3,69 3,84 4,28 Tím huế 6,54 5,80 7,24 7,36 Sao đỏ 3,56 7,77 8,00 6,93 Chi xanh 3,64 5,15 4,57 5,16 9 8 7 6 5 Tuần 1 4 Tuần 2 Tuần 3 3 Tuần 4 2 1 0 Trắng Pha lê tuyết Mai vàng pháo Lan tím Phan hoa vàng Phan trắng Tím Sao đỏ huế Chi xanh Giống Hình 3.12. Ảnh hƣởng của BAP đến số lá/chồi của một số giống cúc 33 Với chỉ tiêu là số lá trên một chồi, ta thấy môi trƣờng nuôi cấy MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l NDcó ảnh hƣởng tốt đến sự sinh trƣởng của lá trên các chồi. Tuy nhiên, sự sinh trƣởng này không đồng đều ở các giống. Nếu nhƣ, giống Pháo hoa (Hình 3.10) phát triển mạnh về hệ số nhân chồi và chiều cao chồi thì đến chỉ tiêu thứ ba này lại khá là thấp sau 4 tuần theo dõi. Có thể là do ƣu thế đỉnh, cụ thể là: ở tuần đầu khi số chồi còn ít thì số lá trung bình trên chồi rất cao 8 lá/chồi → tuần 2 là 7,27 lá/chồi → tuần 3 là 3,89 lá/chồi → tuần 4 là 4,12 lá/chồi. Bên cạnh đó, giống Lan tím cũng có số lá trung bình trên mẫu giảm khi số chồi tăng. T1 T2 T3 T4 Hình 3.13. Sự sinh trƣởng của giống cúc Lan tím qua 4 tuần 34 Còn các giống còn lại hầu nhƣ có số lá trung bình trên chồi tỷ lệ thuận viêc tăng số chồi. Có 2 giống có số lá tăng mạnh nhất là Tím huế, Sao đỏ. Với giống Tím huế có số lá trên một chồi qua từng tuần là: 6,54 → 5,8 →7,24→ 7,36 (lá/chồi), còn giống Sao đỏlà 3,56→ 7,77 → 8 → 6,93 (lá/chồi). T1 T2 T3 T4 Hình 3.14. Sự sinh trƣởng của giống cúc Tím huế qua 4 tuần 35 T1 T2 T3 T4 Hình 3.15. Sự sinh trƣởng của giống cúc Sao đỏ qua 4 tuần Ngoài ra, các giống có sự tăng trƣởng về số lƣợng lácũng tƣơng đối cao là: Trắng tuyết (6,75 lá/chồi lá sau 4 tuần), Pha lê (6,5 lá/chồi sau 4 tuần). 36 T1 T2 T3 T4 Hình 3.16. Sự sinh trƣởng của giống cúc Trắng tuyết qua 4 tuần 37 T1 T2 T3 T4 Hình 3.17. Sự sinh trƣởng của giống cúc Pha lê qua 4 tuần 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ những kết quả thu đƣợc từ đề tài này, chúng tôi đƣa ra một số kết luận sau: Thứ nhất, sử dụng chất khử trùng là javen với nồng độ 5%/15 phút có hiệu quả tƣơng đối cao đối với một số giống cúc. Trong đó, hiệu quả cao nhất ở giống cúc Phan vàng (với tỉ lệ mẫu sống vô trùng 90,3%). Thứ hai, môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND thích hợp cho sự sinh trƣởng của một số giống cúc về ba chỉ tiêu sinh trƣởng theo dõi: Chiều cao chồi, hệ số nhân nhanh, tổng số lá. Cụ thể: Về chiều cao chồi, môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND có tác dụng kéo dài chồi tƣơng đối tốt. Hai giống có chiều cao chồi trung bình cao nhất cúc Phan vàng (chiều cao trung bình 6,13cm),giống Mai vàng (5,50cm). Về hệ số nhân nhanh, hệ số nhân khá cao ở các giống cúc nghiên cứu khi sử dụng môi trƣờngMS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND. Song giống cúc Mai vàng, Pháo hoa là có hiệu quả vƣợt trội. Sau 4 tuần hệ số nhân chồi trung bình của Pháo hoa là 16,50, Mai vàng là 12,50. Về số lá/chồi, môi trƣờngMS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND kích thích sự phát triển lá trên các mẫu nuôi cấy. trong 10 giống thì hai giống có số lá trên một chồi sau 4 tuần là cao nhất là Tím huế(7,36 lá/ chồi) và Sao đỏ (6,93 lá/ chồi). Khi kết hợp các chỉ tiêu theo dõi: chiều cao chồi, hệ số nhân nhanh, số lá/chồi thì thấy rằng môi trƣờngMS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 39 mg/l BAP + 100 ml/l ND thích hợp cho sự sinh trƣởng của các giống hoa cúc. Tuy nhiên môi trƣờng này là tối ƣu nhất cho giống cúc Mai vàng. 2. Kiến nghị Từ kết quả nghiên cứu tạo vật liệu in vitro để hoàn thiện quy trình nhân giống cúc của các giống khác nhau đặc biệt là các giống chất lƣợng cao. Ứng dụng mô hình nhân giống in vitro hoa cúc vào thực tế sản xuất để cung cấp số lƣợng cây giống lớn, giá thành rẻ. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Tài liệu tiếng Việt [1]. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, (Giáo trình cao học nông nghiệp), Nxb nông nghiệp Hà Nội. [2]. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật (Thực vật bậc cao), Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp. [3]. La Việt Hồng, Phạm Thị Tƣơi, Dƣơng Thị Minh và cộng sự (2014), Xây dựng quy trình nhân giống hoa cúc CN01 (Chrysanthemum maximum seiun – 3), Tạp chí khoa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, 29 : 28 37 [4]. Trần Lan Hƣơng, Trần Tuấn Anh, Phạm Thanh Hƣơng ( 2006), Tìm hiểu về thế giới thực vật, Nxb Giáo dục. [5]. Nguyễn Quý Khang, Kiều Đức Thành (1993), Giáo trình tin học cơ sở, tập 1, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. [6]. Nguyễn Quý Khang, Kiều Đức Thành (1993), Giáo trình tin học cơ sở, tập 2, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. [7]. Nguyễn Nhƣ Khanh (2006), sinh học phát triển thực vật, Nxb Giáo dục Hà Nội [8]. Dƣơng Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Nxb Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [9]. Dƣơng Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô thực vật II, Nxb Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [10]. Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nxb Đại học Quốc gia TP. HCM. 41 [11].Nguyễn Văn Mã,La Việt Hồng,Ong Xuân Phong(2013),Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật,Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. [12]. Hoàng Thị Sản, Phan Nguyên Hồng (1986), Thực vật học phân loại, Nxb Giáo dục. [13]. Nguyễn Quang Thạch, Đặng Văn Đông (2002), Cây hoa Cúc và kỹ thuật trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. [14]. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội. [15]. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật và ứng dụng, Nxb Giáo dục. 2. Tài liệu tiếng Anh [ 16]. Abdu – Baki, A.A Hypochlorite and tissue sterilisation. Planta 115, 373 – 376. [17]. Brazis, A.R., Leslie, J.E., Kabler, P.W. & Woodward, B.L. (1958), “ The inactivation of spores of Bacillus globigii and Bacillus anthracis by free available chlorine”. Applied Microbiology 6: 338 – 342. [18]. Cornu, D & Michel, M.F. (1987), “Bacteria contaminant in shoot cultures of prunus avium L. choice and phytotoxicity of antibiotics”,Acta Horticulturae 212: 83 – 86. [19]. De Fossard, R.A. 1990 Micropropagation. Queensland: Xarama Pty Ltd. [20]. Duhem, K., Le Mercier, N. & Boxus, P.H (1988),“Difficulties in the establishment of axenic in vitro cultures of field collected coffee and cacao germ plasm”. Acta Horticulturae, 225: 67 – 77. [21]. Enjalric, F., Carron, M.P. & Lardet,L. (1988), “Contamination of primary cultures in tropical areas: The case of Hevea brasiliensis”. Acta Horticulturae,225: 57 – 65. [22]. Fisse, J., Batalle, A và Pera, J. (1987),“Endogenous bacteria elimination in ornamental plants”. Acta Horticulturae 212, 87 – 90. 42 [23]. George, E.F. & Sherrington, P.D. (1984)Plant Propagation by tissue culture, pp: 88 – 93. [24]. Haberlandt, G.; (1902), Culturversuche mit isolierten Pflanzenzellen, Stiz- Ber. Mat. Nat. Kl. Kais. Akad. Wiss. Wien, 111: 62 - 69. [25]. Knauss, J.F. & Miller, J.M. 1978 A contaminant, Erwinia carotovora, affecting commer – cial plant tissue cultures. In vitro 14, 754 – 756. [26]. Leifert C., Ritchie J.Y. and Waites W.M. (1991), World Journal of Microbiology and Biotechnology 7: 452 - 469. [27]. Leggatt, I., Waites, W.M., Leifert, C. & Nicholas J.R. 1988 “Characterisation of micro – organisms isolated from plants during micropropagation”. Acta Horticulturae 225: 93 – 102. [28]. Mathais, P.J., Alderson, P.G. & Leakey, R.R.B. (1987), “ Bacterial contamination in tropical hardwood cultures”. Acta Horticulturae 212: 43 – 49. [29]. Murashige, T. (1974), Plant Propagation through tissue cultures, Ann. Rev. Physiol. Plant, 25: 135-166. [30]. Murashige T. and Skoog F. (1962), “A revised medium for rupid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol. Plant 15: 473 - 479. [31]. Phillips, R., Arnott, S.N Kaptan, S.E. (1981)“Antibiotics in plant tissue culture: Rifampicin effectively controls bacterial contaminants without affecting the growth of short” – “term explant cultures of Helianthus tuberosus”. Plant Science Letters,21: 235 – 240. [32]. Podwyszynska, M. & Hempel, M. (1987) Identification and elimination of “slowly growing” Bacteria from a micropropagated Gerbera. Acta Horticulturae, 212: 112. 43 [33]. Poulsen, G.B. (1988),“Elimination of contaminating micro – organisms from meristem culture of apple rootstock M26”. Acta Horticulturae 225, 193 – 197. [34]. Wainwright, H. & England, N. (1987),“The micropropagation of Prosopis Juliflora: Establishment in vitro”. Acta Horticulturae 212, 49 – 54. 3.Tài liệu Internet [35].http://www.giongnongnghiep.com/nong-nghiep-nong-thon/392-mt-snguyen-tc-k-thut-ng-dng-trong-nuoi-cy-mo.html. [36]. http://hatgionghoa.net/chuyen-hoa/su-tich-hoa-cuc [37].http://www.khcnpy.gov.vn/trungtamud/news_detail.php?cid=3882 44 [...]... và loại bỏ vi khuẩn gây nhiễm [18],[22], [26],[28], [31], [32] 19 CHƢƠNG 2:ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu - Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên một số giống cúc chất lƣợng cao thu tại làng hoa Mê Linh- Hà Nội Hình 2.1 Ruộng hoa cúc tại làng hoa Mê Linh- Hà Nội 2.2 Địa điểm và thời gian thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 3 năm 2015 tại phòng sinh. .. mẫu sống – sạch 3.2 Đánh giá một số chỉ tiêu sinh trƣởng của một số giống cúc Các mẫu cúc sạch thu đƣợc trong thí nghiệm tạo vật liệu in vitro sẽ đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS + 30 g/l saccharose + 7,5 g agar + 0,7 mg/l BAP + 100 ml/l ND Tiến hành theo dõi mẫu trong 4 tuần thì thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 25 3.2.1 Chiều cao chồi Bảng 3.2 Ảnh hƣởng của BAP đến chiều cao chồi của một số giống cúc Chiều cao. .. Lan Phan Phan Tím tuyết lê vàng hoa tím vàng trắng huế 9 10 Sao Chi đỏ xanh Giống Hình 3.1 Tỷ lệ mẫu sống - sạch trên đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc Qua bảng số liệu và biểu đồ trên ta thấy khi sử dụng chất khử trùng là Javen đối với mẫu đỉnh sinh trƣởng của một số giống cúc thì chúng có hiệu quả tƣơng đối cao Tuy nhiên, mỗi giống cúc lại có nhiều đặc điểm khác nhau về sinh lý, khả năng chống chịu,... theo dõi, ta tiến hành đánh giá các chỉ tiêu : - Chiều cao chồi (cm) - Số lá hình thành/chồi - Số chồi trên một mẫu 2.6.2 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu đƣợc xử lý thống kê trên chƣơng trình Excel 2007 [5], [6] 22 CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 .Tạo vật liệu in vitro Có thể nói trong các giai đoạn của kỹ thu t nhân giống in vitro thì giai đoạn tạo vật liệu in vitro đóng vai trò... các nhà sinh vật học thực hiện kỹ thu t tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [7], [10],[14] 1.2.2.Các giai đoạn nhân giống in vitro Giai đoạn 1: Tạo vật liệu in vitro Đây là giai đoạn rất quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là tạo ra đƣợc nguyên liệu thực vật vô trùng để đƣa vào nuôi cấy in vitro Khử trùng mô thực vật. .. giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thƣờng cytokinin cao hơn auxin sẽ kích thích tạo chồi, và ngƣợc lại auxin cao hơn cytokinin sẽ kích thích tạo rễ Trong cơ thể thực vật, cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cƣờng sự tổng hợp ADN và protein, kích thích quá trình trao đổi chất 1.3.Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam 1.3.1 Tình hình sản xuất và phát... hoa cúc dại nhỏ bé thôi không to đƣợc nhƣ bây giờ Và cũng đƣợc dùng để chữa bệnh trƣớc khi đƣợc coi là một loài hoa cảnh Tại Trung Quốc hoa cúc nhƣ biểu tƣợng của sự trƣờng tồn Đã có một thành phố ở Trung Quốc đƣợc mang tên Chu-Hsien (thành phố của hoa cúc) vì sự cao quý và vô giá của hoa cúc. Cho đến ngày nay, Trung Quốc, hoa cúc cũng đƣợc khắc trên đồng xu một Nhân dân tệ Còn tại Nhật Bản, hoa cúc. .. của cơ thể Auxin cùng với một 14 số chất điều chỉnh khác đảm bảo sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia tạo thành các cơ thể thực vật hoàn chỉnh + Trong nuôi cấy sử dụng một số chất nhƣ: Indol acetic acid (IAA) Naphthyl acetic acid (NAA) 2,4- D Dichlorophenol acetic acid(2,4- D) Indol butyric acid (IBA) - Cytokinin + Nhóm cytokinin bao gồm các chất sau: 6- Benzylaminopurin (BAP) Kinetin... là cytokinin và auxin - Auxin: + Auxin có tác dụng chủ yếu là làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trƣởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (Protein, cenllulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng Auxin đƣợc xem là hoocmon thực vật quan trọng nhất vì nó có vai trò cơ bản trong quá trình sinh trƣởng và biệt hoá... thì giống cúc Phan vàng có sự tăng trƣởng chiều cao mạnh nhất (với tuần 1 là 1,23cm và đến tuần 4 là 6,13cm) T1 T2 T3 T4 Hình 3.6 Sự sinh trƣởng của giống cúc Phan vàng qua 4 tuần Xếp ở vị trí thứ 2 là giống Mai vàng ở tuần 1 với chiều cao 1,12cm, tuần 2 tăng lên 2,1cm, tiếp đó nó có sự tăng trƣởng mạnh vào tuần 3 (4,2 cm) và tuần 4 (5.5cm) 27 T1 T2 T3 T4 Hình 3.7 Sự sinh trƣởng của giống cúc Mai vàng